DE60219801T2 - KOMPLEMENT-INHIBITOREN DIE AN C5 UND C5a BINDEN OHNE DIE BILDUNG VON C5b ZU HEMMEN - Google Patents

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Description

  • Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen U.S.-Anmeldung Nr. 60/313,137 , eingereicht am 17. August 2001.
  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft Entzündungsinhibitoren, welche an die Komplemente C5 und C5a binden, ohne die Bildung von C5b und C5b-9-Membranangriffkomplexen (MAC) zu inhibieren.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Das Komplementsystem spielt eine zentrale Rolle in der Clearance von Immunkomplexen und bei Immunantworten auf infektiöse Stoffe, fremde Antigene, mit Viren infizierte Zellen und Tumorzellen. Jedoch kann eine ungeeignete oder überschüssige Aktivierung des Komplementsystems aufgrund einer ernsthaften Entzündung zu gefährlichen und sogar potentiell lebensbedrohlichen Konsequenzen führen und in Gewebezerstörung resultieren. Diese Konsequenzen zeigen sich klinisch in verschiedenen Störungen, einschließlich septischem Schock, Myokard- sowie Darmischämie-Reperfusionsverletzung, Transplantatabstoßung, Organversagen, Nephritis, pathologischen Entzündungs- und Autoimmunerkrankungen. Sepsis ist zum Beispiel eine Hauptursache von Sterblichkeit, welche in über 200.000 Toten pro Jahr alleine in den Vereinigten Staaten resultiert. Trotz der großen Fortschritte bei der Behandlung von schwerwiegenden Infektionen in den vergangenen paar Jahren steigt das Auftreten und die Sterblichkeit von Sepsis weiter an. Deshalb kann eine Inhibierung der überschüssigen oder unkontrollierten Aktivierung der Komplementkaskade für Patienten mit solchen Erkrankungen und Zuständen einen klinischen Nutzen bereitstellen.
  • Das Komplementsystem besteht aus einer Gruppe von Proteinen, welche normalerweise im Serum in einem inaktiven Zustand vorhanden sind. Die Aktivierung des Komplementsystems umfasst hauptsächlich zwei unterschiedliche Wege, welche als der klassische und der alternative Weg bezeichnet werden (V.M. Holers, in Clinical Immunology: Principles and Practice, Herausg. R.R. Rich, Mosby Press; 1998, 363-391). Der klassische Weg ist eine Calcium/Magnesium-abhängige Kaskade, welche normalerweise durch die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes aktiviert wird. Sie kann auch in einer Antikörperunabhängigen Weise durch das Binden eines C-reaktiven Proteins, komplexiert mit Ligand, und durch viele Pathogene, einschließlich Gram-negativer Bakterien, aktiviert werden. Der alternative Weg ist eine Magnesium-abhängige Kaskade, welche durch Ablagerung und Aktivierung von C3 auf bestimmten empfindlichen Oberflächen (z.B. Zellwandpolysacchariden von Hefe und Bakterien und bestimmte Biopolymermaterialien) aktiviert wird.
  • Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass das Komplement auch durch den Lektinweg, welcher die anfängliche Bindung von Mannose-bindendem Lektin und die anschließende Aktivierung von C2 und C4, welche für den klassischen Weg allgemein bekannt sind, einbezieht, aktiviert werden kann (Matsushita, M. et al., J. Exp. Med. 176: 1497-1502 (1992); Suankratay, C. et al., J. Immunol. 160: 3006-3013 (1998)). Immer mehr Anzeichen weisen daraufhin, dass der alternative Weg an der Amplifizierung der Aktivität sowohl des klassischen Weges als auch des Lektinweges teilhat (Suankratay, C., ebenda; Farries, T.C. et al., Mol. Immunol. 27: 1155-1161 (1990)). Eine Aktivierung des Komplementweges erzeugt biologisch aktive Fragmente von Komplementproteinen, z.B. C3a-, C4a- und C5a-Anaphylatoxine und C5b-9-Membranangriffskomplexe (MAC), welche entzündliche Antworten durch Einbeziehen der Leukozytenchemotaxis, Aktivierung von Makrophagen, Neutrophilen, Plättchen, Mastzellen und Endothelzellen, erhöhte Gefäßdurchlässigkeit, Zytolyse und Gewebeverletzung vermitteln.
  • Das Komplement C5a ist einer der wirksamsten entzündungsfördernden Mediatoren des Komplementsystems. C5a ist die aktivierte Form von C5. Das Komplement C5 (190 kD, Molekulargewicht) ist in menschlichem Serum mit ungefähr 80 μg/ml vorhanden (Kohler, P.F. et al., J. Immunol. 99: 1211-1216 (1967)). Es ist aus zwei Polypeptidketten, α und β, mit ungefähren Molekulargewichten von 115 kD beziehungsweise 75 kD aufgebaut (Tack, B.F. et al., Biochemistry 18: 1490-1497 (1979)). Biosynthetisiert als ein Einzelketten-Promolekül wird C5 während dem Verarbeiten und der Sekretion enzymatisch in eine Zweikettenstruktur gespalten. Nach der Spaltung werden die zwei Ketten durch mindestens eine Disulfidbindung sowie nicht kovalente Wechselwirkungen zusammen gehalten (Ooi, Y.M. et al., J. Immunol. 124: 2494-2498 (1980)).
  • Primäre Aminosäurestrukturen von humanem und murinem C5 wurden aus cDNA-Sequenzierdaten erhalten (Wetsel, R.A. et al., Biochemistry 27: 1474-1482 (1988); Haviland, D.L. et al., J. Immunol. 146: 362-368 (1991); Wetsel, R.A. et al., Biochemistry 26: 737-743 (1987)). Die abgeleitete Aminosäuresequenz des humanen pre-pro-Vorläufer-C5 weist 1676 Aminosäuren auf. Die α- und β-Ketten von reifem C5 weisen 999 beziehungsweise 655 Aminosäuren auf. C5 ist in der C5-α-Kette glycosyliert, insbesondere das Asparagin am Rest 64.
  • C5 wird während der Aktivierung der Komplementwege in die C5a- und C5b-Fragmente gespalten. Die Konvertaseenzyme, welche für die C5-Aktivierung verantwortlich sind, sind Multikomplexe der Untereinheiten C4b, C2a und C3b für den klassischen Weg und (C3b)2, Bb und P für den alternativen Weg (Goldlust, M.B. et al., J. Immunol. 113: 998-1007 (1974); Schreiber, R.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sdi. 75: 3948-3952 (1978)). C5 wird durch die Spaltung an der Position 74-75 (Arg-Leu) in der α-Kette aktiviert. Nach der Aktivierung wird das 74 Aminosäure-Peptid C5a mit 11,2 kD vom Aminoterminusteil der α-Kette freigesetzt. Dieses C5a-Peptid teilt ähnliche Anaphylatoxineigenschaften wie jene, welche C3a aufweist, ist aber auf einer molaren Basis beim Auslösen von entzündlichen Antworten 100-fach wirksamer. Sowohl C5a als auch C3a sind wirksame Stimulatoren von Neutrophilen und Monozyten (Schindler, R. et al., Blood 76: 1631-1638 (1990); Haeffner-Cavaillon, N. et al., J. Immunol. 138: 794-700 (1987); Cavaillon, J.M. et al., Eur. J. Immunol. 20: 253-257 (1990)). Darüber hinaus wurde kürzlich in einem Mäusemodell gezeigt, dass der C3a-Rezeptor für den Schutz gegen einen durch Endotoxin induzierten Schock wichtig ist (Kildsgaard, J. et al., J. Immunol. 165: 5406-5409 (2000)).
  • Zusätzlich zu seinen anaphylatoxischen Eigenschaften induziert C5a die chemotaktische Migration von Neutrophilen (Ward, P.A. et al., J. Immunol. 102: 93-99 (1969)), Eosinophilen (Kay, A.B. et al., Immunol. 24: 969-976 (1973)), Basophilen (Lett-Brown, M.A. et al., J. Immunol. 117: 246-252 (1976)) und Monozyten (Snyderman, R. et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 138: 387-390 (1971)). Die Aktivität von C5a wird durch das Plasmaenzym Carboxypeptidase N (E.C. 3.4.12.7) geregelt, welches das Carboxy-terminale Arginin von C5a entfernt, wodurch das C5a-Derivat ohne Arg gebildet wird (Goetzl, E.J. et al., J. Clin. Invest. 53: 591-599 (1974)). Auf einer molaren Basis weist humanes C5a ohne Arg nur 1 % der anaphylaktischen Aktivität (Gerard, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 1833-1837 (1981)) und polymorphonukleären chemotaktischen Aktivität von nicht modifiziertem C5a auf (Chenoweth, D.E. et al., Mol. Immunol. 17: 151-161 (1980)). Sowohl C5a als auch C5b-9 aktivieren Endothelzellen, wobei Adhäsionsmoleküle exprimiert werden, welche zur Sequestrierung von aktivierten Leukozyten wesentlich sind, die Gewebeentzündung und -verletzung vermitteln (Foreman, K.D. et al., J. Clin. Invest. 94: 1147-1155 (1994); Foreman, K.E. et al., Inflammation 20: 1-9 (1996); Rollins, S.A. et al., Transplantation 69: 1959-1967 (2000)). C5a vermittelt auch entzündliche Reaktionen durch Verursachen einer Kontraktion von glatten Muskeln, Erhöhen der Gefäßdurchlässigkeit, Induzieren der Basophil- und Mastzellendegranulation und Induzieren einer Freisetzung von lysosomalen Proteasen und oxidativen freien Radikalen (Gerard, C. et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 775-808 (1994)). Darüber hinaus moduliert C5a die hepatische Akutphasen-Genexpression und verstärkt die Gesamtimmunantwort durch Erhöhen der Herstellung von TNFα, IL-1β, IL-6 und IL-8 (Lambris, J.D. et al., in: The Human Complement System in Health and Disease, Volanakis, J.E. Herausg., Marcel Dekker, New York, S. 83-118).
  • Der humane C5a-Rezeptor (C5aR) wurde kloniert (Gerard, N.P. et al., Nature 349: 614-617 (1991); Boulay, F. et al., Biochemistry 30: 2993-2999 (1991)). Er gehört zu einer Superfamilie von G-Protein gekoppelten Rezeptoren mit sieben Transmembrandomänen. C5aR wird an Neutrophilen, Monozyten, Basophilen, Eosinophilen, Hepatozyten, glatten Lungenmuskel- und Endothelzellen und glomerulärem Nierengewebe exprimiert (Van-Epps, D.E. et al., J. Immunol. 132: 2862-2867 (1984); Haviland, D.L. et al., J. Immunol. 154: 1861-1869 (1995); Wetsel, R.A., Immunol. Lett. 44: 183-187 (1995); Buchner, R.R. et al., J. Immunol. 155: 308-315 (1995); Chenoweth, D.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 3943-3947 (1978); Zwirner, J. et al., Mol. Immunol. 36: 877-884 (1999)). Die Ligandbindungsstelle von C5aR ist komplex und besteht aus mindestens zwei physikalisch trennbaren Bindungsdomänen. Eine bindet den C5a-Aminoterminus (Aminosäuren 1-20) und den Disulfidverknüpften Kern (Aminosäuren 21-61), wogegen die zweite das C5a-carboxyterminale Ende (Aminosäuren 62-74) bindet (Wetsel, R.A., Curr. Opin. Immunol. 7: 48-53 (1995)).
  • C5a spielt eine wichtige Rolle bei Entzündung und Gewebeverletzung. Bei einem kardiopulmonalem Bypass und Hämodialyse wird C5a als ein Ergebnis der Aktivierung des alternati ven Komplementweges gebildet, wenn menschliches Blut mit der künstlichen Oberfläche der Herz-Lungen-Maschine oder Nieren-Dialysemaschine in Kontakt kommt (Howard, R.J. et al., Arch. Surg. 123: 1496-1501 (1988); Kirklin, J.K. et al., J. Cardiovasc. Surg. 86: 845-857 (1983); Craddock, P.R. et al., N. Engl. J. Med. 296: 769-774 (1977)). C5a verursacht eine erhöhte Kapillardurchlässigkeit und Ödeme, Bronchokonstriktion, pulmonale Vasokonstriktion, Leukozyten- und Plättchenaktivierung und -infiltration in Gewebe, insbesondere die Lunge (Czermak, B.J. et al., J. Leukoc. Biol. 64: 40-48 (1998)). Es wurde gezeigt, dass die Verabreichung eines monoklonalen anti-C5a-Antikörpers eine durch einen kardiopulmonalen Bypass und Kardioplegie induzierte Koronarendothelialdysfunktion verringert (Tofukuji, M. et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 116: 1060-1068 (1998)).
  • C5a ist auch in das akute Atemnotsyndrom (ARDS) und multiple Organversagen (MOF) einbezogen (Hack, C.E. et al., Am. J. Med. 1989: 86: 20-26; Hammerschmidt D.E. et al. Lancet 1980; 1: 947-949; Heideman M. et al. J. Trauma 1984; 4: 1038-1043). C5a verstärkt die Monozytenherstellung von zwei wichtigen entzündungsfördernden Zytokinen, TNFα und IL-1. In Tiermodellen für septischen Schock wurde auch gezeigt, dass C5a eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Gewebeverletzung und insbesondere pulmonaler Verletzung spielt (Smedegard G. et al. Am. J. Pathol. 1989; 135: 489-497). Bei Sepsismodellen unter Verwendung von Ratten, Schweinen und nicht humanen Primaten resultierten anti-C5a-Antikörper, welche an Tiere vor einer Behandlung mit Endotoxin oder E. coli verabreicht wurden, in erniedrigter Gewebeverletzung sowie einer erniedrigten Herstellung von IL-6 (Smedegard, G. et al., Am. J. Pathol. 135: 489-497 (1989); Hopken, U. et al., Eur. J. Immunol. 26: 1103-1109 (1996); Stevens, J.H. et al., J. Clin. Invest. 77: 1812-1816 (1986)). Als wichtiger wurde gezeigt, dass eine Blockade von C5a mit polyklonalen anti-C5a-Antikörpern signifikant die Überlebensraten von Ratten in einem Blinddarmligatur/Punktions-Modell für Sepsis verbessert (Czermak, B.J. et al., Nat. Med. 5: 788-792 (1999)). Dieses Modell teilt viele Aspekte des klinischen Auftretens von Sepsis bei Menschen (Parker, S.J. et al., Br. J. Surg. 88: 22-30 (2001)). Im gleichen Sepsismodell wurde gezeigt, dass anti-C5a-Antikörper die Apoptose von Thymozyten inhibieren (Guo, R.F. et al., J. Clin. Invest. 106: 1271-1280 (2000)) und MOF verhindern (Huber-Lang, M. et al., J. Immunol. 166: 1193-1199 (2001)). Die anti-C5a-Antikörper hatten auch eine schützende Wirkung bei Ratten in einem C3-Proaktivator-Modell für Lungenverletzung und bei durch einen Immunkomplex induzierter Lungenverletzung (Mulligan, M.S. et al. J. Clin. Invest. 98: 503-512 (1996)). Die Wichtig keit von C5a bei einer durch einen Immunkomplex vermittelten Lungenverletzung wurde später in Mäusen bestätigt (Bozic, C.R. et al., Science 26: 1103-1109 (1996)).
  • Es wurde gefunden, dass C5a ein Hauptmediator bei Myokardischämie-Reperfusionsverletzung ist. Eine Komplementdepletion verringerte die Myokardinfarktgröße bei Mäusen (Weisman, H.F. et al., Science 249: 146-151 (1990)) und eine Behandlung mit anti-C5a-Antikörpern verringerte die Verletzung in einem Rattenmodell für untere Gliedmaßenischämie-Reperfusion (Bless, N.M. et al., Am. J. Physiol. 276: L57-L63 (1999)). Eine Reperfusionsverletzung während einem Myokardinfarkt wurde auch bei Schweinen beträchtlich verringert, welche mit einem monoklonalem anti-C5a IgG behandelt worden waren (Amsterdam, E.A. et al., Am. J. Physiol. 268: H448-H457 (1995)). Ein rekombinanter humaner C5aR-Antagonist verringert die Infarktgröße in einem Schweinemodell für chirurgische Revaskularisierung (Riley, R.D. et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 120: 350-358 (2000)).
  • Die Komplementlevels sind bei Patienten mit rheumatoider Arthritis und systemischem Lupus erythematodes erhöht. Die C5a-Levels korrelieren mit der Schwere des Erkrankungszustandes (Jose, P.J. et al., Ann. Rheum. Dis. 49: 747-752 (1989); Porcel, J.M. et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 74: 283-288 (1995)). Deshalb kann eine Inhibierung von C5a und/oder des C5a-Rezeptors (C5aR) bei der Behandlung dieser chronischen Erkrankungen nützlich sein.
  • Die C5aR-Expression wird an reaktiven Astrozyten, Mikroglia-Zellen und Endothelzellen im entzündeten menschlichen zentralen Nervensystem nach oben geregelt (Gasque, P. et al., Am. J. Pathol. 150: 31-41 (1997)). C5a könnte in neurodegenerative Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit, einbezogen sein (Mukherjee, P. et al., J. Neuroimmunol. 105: 124-130 (2000)). Eine Aktivierung des neuronalen C5aR kann Apoptose induzieren (Farkas I. et al. J. Physiol. 1998; 507: 679-687). Deshalb könnte eine Inhibierung von C5a und/oder C5aR auch bei der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen nützlich sein.
  • Es ist bekannt, dass Psoriasis eine T-Zellen-vermittelte Erkrankung ist (Gottlieb, E.L. et al., Nat. Med. 1: 442-447 (1995)). Jedoch können auch Neutrophile und Mastzellen in die Pathogenese der Erkrankung einbezogen sein (Terui, T. et al., Exp. Dermatol. 9: 1-10; (2000); Werfen, T. et al., Arch. Dermatol. Res. 289: 83-86 (1997)). Hohe Levels an C5a ohne Arg werden in Psoriasisschuppen gefunden, was darauf hinweist, dass Komplementaktivierung einbezogen ist. T-Zellen und Neutrophile sind durch C5a chemotaktisch (Nataf, S. et al., J. Immunol. 162: 4018-4023 (1999); Tsuji, R.F. et al., J. Immunol. 165: 1588-1598 (2000); Cavaillon, J.M. et al., Eur. J. Immunol. 20: 253-257 (1990)). Deshalb könnte C5a ein wichtiges therapeutisches Ziel für die Behandlung von Psoriasis sein.
  • Immunglobulin G-enthaltende Immunkomplexe (IC) tragen zur Pathophysiologie bei einer Anzahl von Autoimmunerkrankungen, wie systemischer Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis, Goodpasture-Syndrom und Hypersensitivitätspneumonitis, bei (Madaio, M.P., Semin. Nephrol. 19: 48-56 (1999); Korganow, A.S. et al., Immunity 10: 451-459 (1999); Bolten, W.K., Kidney Int. 50: 1754-1760 (1996); Ando, M. et al., Curr. Opin. Pulm. Med. 3: 391-399 (1997)). Das klassische Tiermodell für die entzündliche Antwort bei diesen IC-Erkrankungen ist die Arthus-Reaktion, welche mit der Infiltration von polymorphonukleären Zellen, Blutung und Plasmaexsudation zu tun hat (Arthus, M., C.R. Soc. Biol. 55: 817-824 (1903)). Neuere Untersuchungen zeigen, dass C5aR-defiziente Mäuse vor einer durch IC induzierten Gewebeverletzung geschützt sind (Kohl, J. et al., Mol. Immunol. 36: 893-903 (1999); Baumann, U. et al., J. Immunol. 164: 1065-1070 (2000)). Die Ergebnisse stehen im Einklang mit der Beobachtung, dass ein kleiner peptidischer anti-C5aR-Antagonist die durch IC-Ablagerung verursachte entzündliche Antwort inhibiert (Strachan, A.J. et al., J. Immunol. 164: 6560-6565 (2000)). Zusammen mit seinem Rezeptor spielt C5a eine wichtige Rolle in der Pathogenese von IC-Erkrankungen. Inhibitoren von C5a und C5aR könnten zur Behandlung dieser Erkrankungen nützlich sein.
  • WO 01/15731 A1 erörtert Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Sepsis unter Verwendung von Antikörpern für C5a. Diese Antikörper reagieren nur mit dem N-terminalen Bereich des C5a-Peptids und weisen keine Kreuzreaktion mit C5 auf.
  • WO 86/05692 erörtert die Behandlung von Schocklunge (ARDS) mit einem Antikörper, welcher für C5a oder dessen ohne Arg-Derivat spezifisch ist. Sie offenbart auch die Behandlung von Sepsis durch Verabreichung dieses Antikörpers. Dieser Antikörper wurde in Antwort auf das C5a ohne Arg-Derivat hergestellt, da es stärker immungen ist, es wird aber Antikörper hervorrufen, welche eine Kreuzreaktion mit C5a aufweisen. U.S. Patent Nr. 5,853,722 erörtert anti-C5-Antikörper, welche die Aktivierung von C5 blockieren und folglich die Bildung von C5a und C5b.
  • U.S. Patent Nr. 6,074,642 erörtert die Verwendung von anti-C5-Antikörpern zur Behandlung von Glomerulonephritis. Diese Antikörper blockieren auch die Erzeugung von C5a und C5b, wodurch die Wirkung von sowohl C5a als auch die Bildung von C5b-9 inhibiert wird. U.S. Patent Nr. 5,562,904 erörtert anti-C5-Antikörper, welche die Bildung von MAC vollständig blockieren.
  • In anderen Erörterungen über anti-C5-Antikörper blockieren die offenbarten Antikörper die Aktivierung von C5 und seine Spaltung bei der Bildung von C5a und C5b (Vakeva, A.P. et al., Circulation 97: 2259-2267 (1998); Thomas, T.C. et al., Mol. Immunol. 33: 1389-1401 (1996); Wang, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 8563-8568 (1996); Kroshus, T. et al., Transplantation 60: 1194-1202 (1995); Frei, Y. et al., Mol. Cell Probes 1: 141-149 (1987)).
  • Es wurde von monoklonalen Antikörpern, welche mit C5, C5a oder C5a ohne Arg eine Kreuzreaktion aufweisen, berichtet (Schulze, M. et al., Complement 3: 25-39 (1986); Takeda, J. et al., J. Immunol. Meth. 101: 265-270 (1987); Inoue, K., Complement Inflamm. 6: 219-222 (1989). Es wurde auch berichtet, dass monoklonale Antikörper, welche mit C5 und C5a eine Kreuzreaktion aufweisen, die C5a-vermittelte ATP-Freisetzung von Meerschweinchen-Plättchen inhibieren (Klos, A. et al., J. Immunol. Meth. 111: 241-252 (1988); Oppermann, M. et al., Complement Inflamm. 8: 13-24 (1991)).
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Eine C5-Aktivierung resultiert normalerweise in einer Spaltung von C5 zu C5a und C5b. Die Inhibitormoleküle der vorliegenden Erfindung binden an C5 und C5a mit hoher Affinität, inhibieren nicht die C5-Aktivierung und verhindern nicht die Bildung von oder inhibieren nicht die Aktivität von C5b. Ein Beispiel eines solchen Inhibitors ist der monoklonale Antikörper, der die Bezeichnung MAb 137-26 trägt, welcher an ein gemeinsames Eptiop an humanem C5 und C5a bindet. Das Hybridom, welches den monoklonalen Antikörper 137-26 herstellt, wurde bei der American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 unter der Zugangsnr. PTA-3650 am 17. August 2001 hinterlegt.
  • Die Inhibitormoleküle der Erfindung schließen auch ein: (i) andere Antikörper oder Fragmente davon, Peptide, Oligonucleotide oder Peptidmimetika, welche an C5 und C5a mit hoher Affinität binden, aber nicht die C5-Aktivierung inhibieren und nicht die Bildung verhindern von oder die Aktivität inhibieren von C5b, oder (ii) jeden Antikörper, welcher an das gleiche Epitop bindet wie der monoklonale Antikörper 137-26. Antikörperfragmente schließen Fab, F(ab')2, Fv oder Einzelketten-Fv ein und monoklonale Antikörper und Fragmente der Erfindung schließen chimäre, DeImmunizedTM, humanisierte oder humane Antikörper und Fragmente und andere Formen, welche für eine Verwendung beim Menschen akzeptabel sind, ein. Die Inhibitormoleküle können als Teil eines Arzneimittels enthalten sein.
  • Die Inhibitormoleküle der Erfindung sind für die Behandlung von Erkrankungen und Zuständen, welche eine überschüssige oder unkontrollierte Herstellung von C5a einbeziehen, oder für diagnostische Verwendung beim Nachweisen des Vorhandenseins oder der Menge von C5a nützlich.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 zeigt die Bindung von MAb 137-26 (anti-C5a, volle Quadrate) und MAb 137-76 (anti-C5 β-Kette, leere Kreise) an gereinigtem humanem C5a in ELISA. Ein Isotyp-angepasster irrelevanter monoklonaler Antikörper wurde als Negativkontrolle verwendet. Die Y-Achse stellt die Reaktivität der MAbs mit C5a, ausgedrückt als optische Dichte (OD) bei 450 nm, dar und die X-Achse stellt die Konzentration der MAbs dar. MAb 137-26 reagierte mit humanem C5a, wogegen MAb 137-76 und der irrelevante Kontrollantikörper dies nicht taten.
  • 2 zeigt die Bindung von MAb 137-26 (volle Quadrate) und MAb 137-76 (leere Kreise) an gereinigtem humanem C5 in ELISA. Ein Isotyp-angepasster irrelevanter monoklonaler Antikörper wurde als Negativkontrolle verwendet. Die Y-Achse stellt die Reaktivität der MAbs mit C5a, ausgedrückt als optische Dichte (OD) bei 450 nm, dar und die X-Achse stellt die Konzentration der monoklonalen Antikörper dar. Sowohl MAb 137-26 als auch MAb 137-76 reagierten mit humanem C5, wogegen der irrelevante Antikörper dies nicht tat.
  • 3 zeigt das Unvermögen von anti-C5a MAb 137-26 bei der Inhibierung von Komplement-vermittelter Hämolyse von empfindlich gemachten roten Blutkörperchen des Huhns über den klassischen Weg (CP). Anti-C2 MAb 175-62 inhibierte die Hämolyse wirksam. Ein Isotyp-angepasster irrelevanter monoklonaler Antikörper hatte keine Wirkung. Die Y-Achse stellt den Prozentsatz der Hämolyseinhibierung dar, wie ferner im Text beschrieben wird. Die X-Achse stellt die Konzentration der monoklonalen Antikörper dar.
  • 4 zeigt das Unvermögen von anti-C5a MAb 137-26 bei der Inhibierung von Komplement-vermittelter Hämolyse von roten Blutkörperchen des Kaninchens über den alternativen Weg (AP). Antifaktor D MAb 166-32 inhibierte die Hämolyse wirksam. Ein Isotypangepasster irrelevanter monoklonaler Antikörper hatte keine Wirkung. Die Y-Achse stellt den Prozentsatz der Hämolyseinhibierung dar, wie ferner im Text beschrieben wird. Die X-Achse stellt die Konzentration der monoklonalen Antikörper dar.
  • 5 zeigt die Inhibierung der Bindung von mit radioaktivem Iod markiertem (125I) humanem C5a an gereinigten humanen Neutrophilen. Die Positivkontrolle, gereinigtes rekombinantes humanes C5a (rHuC5a) inhibierte die Bindung. Ein Isotyp-angepasster irrelevanter monoklonaler Antikörper zeigte keine Wirkung. Die Y-Achse stellt den Prozentsatz der Inhibierung der 125I-C5a-Bindung dar, wie ferner im Text beschrieben wird. Die X-Achse stellt die Konzentration der kompetitiven Stoffe dar.
  • 6 zeigt das Bindungsepitop von MAb 137-26 an humanem C5a, gemappt durch überlappende synthetische Peptide auf einer Cellulosemembran.
  • 7A zeigt die CD11b-Expression an humanen Neutrophilen, welche durch opsonisierte E. coil stimuliert wurden, in einem mit Lepirudin anti-koagulierten Vollblutmodell. Anti-C5/C5a MAb137-26 (volle Kreise) inhibierten die CD11b-Expression wirksamer als anti-C5a MAb561 (Dr. Jurg Kohl, volle Quadrate) und anti-C5 MAb137-30 (volle Dreiecke). Der letzte Antikörper inhibierte die C5-Aktivierung. Der irrelevante MAb (volle umgedrehte Dreiecke) hatte keine Wirkung. Die Y-Achse stellt die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI), gemessen durch Immunofluorcytometrie, dar. Die X-Achse stellt die Konzentration der Antikörper (μg/ml) dar. T-0 = Grundlinie, Vollblutprobe bei der Zeit 0 min. T-10 = Vollblut, inkubiert nur mit PBS för 10 min ohne E.coli. Zu anderen Proben mit oder ohne Inhibitoren waren E. coli gegeben worden.
  • 7B zeigt die CD11b-Expression an humanen Neutrophilen, welche durch opsonisierte E. coli stimuliert wurden, in einem mit Lepirudin anti-koagulierten Vollblutmodell. Anti-C5/C5a MAb 137-26 (volle Kreise) inhibierte die CD11b-Expression wirksamer als ein peptidischer C5aR-Antagonist (Dr. Stephen Taylor) (volle Quadrate). Das irrelevante Peptid hatte keine Wirkung (volle umgedrehte Dreiecke). Die Y-Achse stellt die mittlere Fluoreszenzin tensität (MFI), gemessen durch Immunofluorcytometrie, dar. Die X-Achse stellt die Konzentration der Antikörper/Peptid (μg/ml) dar. T-0 = Grundlinie, Vollblutprobe bei der Zeit 0 min. T-10 = Vollblut, inkubiert nur mit PBS für 10 min ohne E.coli. Zu anderen Proben mit oder ohne Inhibitoren waren E. coli gegeben worden.
  • 7C zeigt den oxidativen Anstieg von humanen Neutrophilen, welche durch opsonisierte E. coli stimuliert wurden, in einem mit Lepirudin anti-koagulierten Vollblutmodell. Sowohl anti-C5/C5a MAb137-26 (volle Kreise) als auch anti-C5 MAb137-30 (volle Dreiecke) inhibierten den oxidativen Anstieg wirksamer als anti-C5a MAb561 (volle Quadrate). Der irrelevante Antikörper (volle umgedrehte Dreiecke) hatte keine Wirkung. Die Y-Achse stellt die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI), gemessen durch Immunofluorcytometrie, dar. Die X-Achse stellt die Konzentration der Antikörper (μg/ml) dar. T-0 = Grundlinie, Vollblutprobe bei der Zeit 0 min. T-10 = Vollblut, inkubiert nur mit PBS für 10 min ohne E.coli. Zu anderen Proben mit oder ohne Inhibitoren waren E. coli gegeben worden.
  • 7D zeigt den oxidativen Anstieg von humanen Neutrophilen, welche durch opsonisierte E. coli stimuliert wurden, in einem mit Lepirudin anti-koagulierten Vollblutmodell. Anti-C5/C5a MAb137-26 war wirksamer als ein peptidischer C5aR-Antagonist (volle Quadrate) bei der Inhibierung des oxidativen Anstiegs. Das irrelevante Peptid hatte keine Wirkung. Die Y-Achse stellt die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI), gemessen durch Immunofluorcytometrie, dar. Die X-Achse stellt die Konzentration der Antikörper in nM dar. T-0 = Grundlinie, Vollblutprobe bei der Zeit 0 min. T-10 = Vollblut, inkubiert nur mit PBS für 10 min ohne E. coli. Zu anderen Proben mit oder ohne Inhibitoren waren E. coli gegeben worden.
  • 8 zeigt das MAC-vermittelte Abtöten von Neisseria meningitides in einem mit Lepirudin anti-koagulierten Vollblutmodell. Die Bakterien wurden wirksam durch Inkubation mit dem menschlichen Vollblut in der Gegenwart von anti-C5/C5a MAb137-26 (volle Kreise), einem irrelevanten MAb (volle Dreiecke) oder PBS (leere Quadrate) abgetötet. Hingegen wurden die Bakterien nicht abgetötet, als das Vollblut mit anti-C5 MAb137-30 (leere Diamanten), welcher die C5-Aktivierung und folglich die MAC-Bildung inhibierte, behandelt wurde. Die Y-Achse stellt koloniebildende Einheiten (CFU) pro 100 μl Vollblut, inkubiert für 24 Stunden bei 37°C auf Blutagar, dar. Die X-Achse stellt unterschiedliche Zeitpunkte des Blutprobensammelns aus dem Vollblutkulturversuch dar.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • 1. Vorteile der Erfindung
  • Die Inhibitoren der Erfindung, einschließlich der monoklonale Antikörper MAb137-26, sind gegenüber bekannten monoklonalen Antikörperinhibitoren zur Behandlung von Komplementvermittelter Entzündung und Gewebebeschädigung vorteilhaft. MAb 137-26 kann an C5 binden, bevor es aktiviert wird. Nachdem C5 aktiviert wurde, um C5a zu bilden, kann der Antikörper C5a, welches ein Anaphylatoxin ist, neutralisieren. Nachdem C5a gebildet ist, bindet es normalerweise schnell an C5aR an Zellen, wobei die Signaltransduktionskaskade ausgelöst wird, was zu Entzündung führt. MAb137-26 inhibiert die Spaltung von C5, wobei C5a und C5b gebildet werden, nicht, C5a bleibt aber an MAb137-26 gebunden, nachdem es hergestellt wurde, und inhibiert das Binden von C5a an C5aR. Die Bildung von C5b-9 wird jedoch nicht beeinflusst und insoweit C5b-9 für die MAC-Bildung gebraucht wird, welches in das Abtöten von Bakterien einbezogen ist, ist das Aufrechterhalten der Herstellung von C5b-9 für eine schützende Immunantwort wichtig.
  • MAb 137-26 kann die Entzündungswirkungen von C5a wirksam neutralisieren, ermöglicht aber noch anderen Komponenten der Komplementkaskade, einschließlich C3 und C5b-9, antibakterielle Funktionen zu vermitteln. Diese pharmakologische Eigenschaft ist in Bezug auf die Behandlung von bakterieller Sepsis, chronischen IC-Erkrankungen und Psoriasis außerordentlich wichtig.
  • 2. Durchführen und Verwenden der Erfindung
  • A. Monoklonale Antikörper
  • Monoklonale Antikörper können unter Verwendung des Hybridomverfahrens, welches zuerst von Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) beschrieben wurde, hergestellt werden oder sie können durch rekombinante DNA-Verfahren ( U.S. Pat. Nr. 4,816,567 ) hergestellt werden.
  • Beim Hybridomverfahren werden eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier wie hier vorstehend beschrieben immunisiert, um Lymphozyten hervorzurufen, welche Antikörper, die spezifisch an das für die Immunisierung verwendete Protein binden, herstellen oder zu einer Herstellung davon in der Lage sind. Tiere können auch mit DNA-Konstrukten immunisiert werden, um die kodierenden Proteine in vivo zur Induzierung von spezifischen Antikörpern zu exprimieren. Alternativ können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Lymphozyten werden dann mit Myelomzellen unter Verwendung eines geeigneten Verschmelzungsmittels, wie Polyethylenglycol, verschmolzen, wobei eine Hybridomzelle gebildet wird (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, S. 59-103 (Academic Press, 1986)).
  • Die so hergestellten Hybridomzellen werden in einem geeigneten Kulturmedium ausgesät und gezüchtet, welches bevorzugt eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der nicht verschmolzenen Eltern-Myelomzellen inhibieren. Wenn die Eltern-Myelomzellen zum Beispiel das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) nicht aufweisen, wird das Kulturmedium für die Hybridoma typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium) aufweisen, wobei diese Substanzen das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen verhindern.
  • Bevorzugte Myelomzellen sind jene, welche wirksam verschmelzen, eine stabile Herstellung des Antikörpers in einem hohen Level durch die ausgewählten Antikörper-herstellenden Zellen unterstützen und gegenüber einem Medium, wie HAT-Medium, empfindlich sind. Unter diesen Myelomzelllinien gibt es murine Myelomlinien, wie jene, welche von MOPC-21- und MPC-11-Mäusetumoren, die vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA erhältlich sind, und SP2/0- oder X63-Ag8-653-Zellen, die von der American Type Culture Collection, Rockville, Md., USA erhältlich sind, abgeleitet sind. Humane Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyleomzelllinien wurden auch für die Herstellung von humanen monoklonalen Antikörpern (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, S. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)) beschrieben. Die Maus-Myelomzelllinie NS0 kann auch verwendet werden (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, UK).
  • Das Kulturmedium, in welchem die Hybridomzellen gezüchtet werden, wird für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern, welche gegen das Antigen gerichtet sind, getestet. Die Bindungsspezifität der durch die Hybridomzellen hergestellten monoklonalen Antikörper kann durch Immunpräzipitation oder durch einen in vitro-Bindungstest, wie Radioimmuntest (RIA) oder Enzym-verknüpfter Immunabsorbenztest (ELISA), bestimmt werden.
  • Nachdem Hybridomzellen identifiziert wurden, welche Antikörper der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität herstellen, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und durch Standardverfahren gezüchtet werden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, S. 59-103 (Academic Press, 1986)). Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck schließen zum Beispiel D-MEM- oder RPMI-1640-Medium ein. Zusätzlich können die Hybridomzellen in vivo als Aszitestumore in einem Tier gezüchtet werden.
  • Die monoklonalen Antikörper, welche von den Subklonen sezerniert werden, werden in geeigneter Weise von dem Kulturmedium, der Aszitesflüssigkeit oder dem Serum durch herkömmliche Immunglobulin-Reinigungsverfahren, wie zum Beispiel Protein A-Sepharose, Hydroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, abgetrennt.
  • DNA, welche die monoklonalen Antikörper kodiert, wird in einfacher Weise unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren isoliert und sequenziert (Innis M. et al. in PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic, San Diego, CA (1990), Sanger, F.S., et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 74:5463-5467 (1977)). Die Hybridomzellen dienen als eine Quelle für eine solche DNA. Nachdem sie isoliert wurde, kann die DNA in Expressionsvektoren platziert werden, welche dann in Wirtszellen, wie E. coli-Zellen, Affen-COS-Zellen, Chinesische Hamsterovarien (CHO)-Zellen oder Myelomzellen, welche ansonsten kein Immunglobulinprotein herstellen, transfiziert werden, um die Synthese der monoklonalen Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erhalten. Die rekombinante Herstellung der Antikörper wird nachstehend detaillierter beschrieben.
  • In einer weiteren Ausführungsform können Antikörper oder Antikörperfragmente aus Antikörper-Phagenbibliotheken, welche unter Verwendung der in McCaffery, et al., Nature 348:552-554 (1990) beschriebenen Techniken erzeugt wurden, isoliert werden. Clackson, et al., Nature 352:624-628 (1991) und Marks, et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) beschreiben die Isolierung von murinen beziehungsweise humanen Antikörpern unter Verwendung von Phagenbibliotheken. Darauffolgende Veröffentlichungen beschreiben die Herstellung von humanen Antikörpern mit hoher Affinität (nM-Bereich) durch Ketten-Shuffling (Marks, et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)) sowie kombinatorische Infizierung und in vivo-Rekombination als eine Strategie zum Aufbau von sehr großen Phagenbibliotheken (Waterhouse, et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Folglich sind diese Techniken ver wendbare Alternativen zu herkömmlichen monoklonalen Antikörper-Hybridomtechniken zur Isolierung von monoklonalen Antikörpern.
  • Die DNA kann auch modifiziert werden, zum Beispiel durch Substituieren der Kodiersequenz der homologen murinen Sequenzen mit humanen konstanten schweren und leichten Domanenketten ( US. Pat. Nr. 4,816,567 ; Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)) oder durch kovalentes Binden der gesamten oder eines Teils der Kodiersequenz für ein nicht-Immunglobulin-Polypeptid an die Immunglobulin-Kodiersequenz.
  • Typischerweise werden die konstanten Domänen eines Antikörpers mit solchen nicht-Immunglobulin-Polypeptiden substituiert oder die variablen Domänen von einer Antigenkombinierenden Stelle eines Antikörpers werden mit ihnen substituiert, wobei ein chimärer zweiwertiger Antikörper erzeugt wird, welcher eine Antigen-kombinierende Stelle mit einer Spezifität für ein Antigen und eine andere Antigen-kombinierende Stelle mit einer Spezifität für ein unterschiedliches Antigen umfasst.
  • Eine andere Alternative ist die Verwendung von elektrischer Verschmelzung als vielmehr chemische Verschmelzung, um Hybridoma zu bilden. Diese Technik ist gut etabliert. Anstelle von Verschmelzen kann man eine B-Zelle auch unter Verwendung von zum Beispiel eines Epstein-Barr-Virus oder eines transformierenden Gens transformieren, um sie unsterblich zu machen. (Siehe z.B. „Continuously Proliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody of Predetermined Specificity", Zurawaki, V.R. et al., in Monoclonal Antibodies, herausg. von Kennett R.H. et al., Plenum Press, N.Y., 1980, S. 19-33.)
  • B. Humanisierte und humane Antikörper
  • Ein humanisierter Antikörper weist einen oder mehrere Aminosäurereste, welche in ihn eingebracht sind, von einer Quelle, weiche nicht von Menschen stammt, auf. Diese nicht von Menschen stammenden Aminosäurereste werden oft als „Import"-Reste bezeichnet, welche typischerweise von einer variablen „Import"-Domäne abgeleitet werden. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter und Kollegen (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen, et al., Science, 239:1534-1536 (1988)) durch Substituieren der entsprechenden Sequenzen eines humanen Antikörpers mit Nager-CDRs oder CDR-Sequenzen durchgeführt werden. Demgemäß wurde in solchen „humanisierten" Antikörpern eine im Wesentlichen weniger als intakte humane variable Domäne mit der entsprechenden Sequenz von einer von Menschen verschiedenen Spezies substituiert. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise humane Antikörper, in welchen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste mit Resten von analogen Stellen in Nager-Antikörpern substituiert sind.
  • Die Wahl der humanen variablen Domänen, sowohl leichte als auch schwere, welche bei der Herstellung der humanisierten Antikörper verwendet werden, ist sehr wichtig, um die Antigeneigenschaft zu verringern. Gemäß dem so genannten „Best-fit"-Verfahren wird die Sequenz der variablen Domäne eines Nager-Antikörpers gegen die gesamte Bibliothek von bekannten humanen variablen Domänensequenzen durchgemustert (engl. screened). Die humane Sequenz, welche der des Nagers am nächsten kommt, wird dann als das humane Gerüst (FR) für den humanisierten Antikörper akzeptiert (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Ein anderes Verfahren verwendet ein besonderes Gerüst, welches von der Consensus-Sequenz von allen humanen Antikörpern einer besonderen Untergruppe von leichten und schweren Ketten abgeleitet ist. Das gleiche Gerüst kann für mehrere unterschiedliche humanisierte Antikörper verwendet werden (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).
  • Es ist ferner wichtig, dass Antikörper mit Retention von hoher Affinität für das Antigen oder anderen vorteilhaften biologischen Eigenschaften humanisiert sind. Um dieses Ziel gemäß einem bevorzugten Verfahren zu erreichen, werden humanisierte Antikörper durch ein Verfahren zur Analyse der Eltern-Sequenzen und von verschiedenen von dem Begriff umfassten humanisierten Produkten unter Verwendung von dreidimensionalen Modellen der Eltern- und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulin-Modelle sind allgemein verfügbar und dem Fachmann vertraut. Computerprogramme, welche wahrscheinliche dreidimensionale Konformationsstrukturen von ausgewählten potentiellen Immunglobulin-Sequenzen veranschaulichen und zeigen, sind verfügbar. Die Inaugenscheinnahme dieser Anzeigevorrichtungen ermöglicht eine Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste bei der Funktion der potentiellen Immunglobulin-Sequenz, d.h. die Analyse der Reste, welche das Vermögen des potentiellen Immunglobulins zur Bindung seines Antigens beeinflussen. In dieser Weise können die FR-Reste aus den Rezipienten- und Importsequenzen ausgewählt und kombiniert werden, so dass die gewünschte Antikörpercharakteristik, wie eine erhöhte Affinität für das Zielantigen(e), erreicht wird. Im Allgemeinen sind die CDR-Reste direkt und am stärksten wesentlich in die Beeinflussung der Antigenbindung einbezogen.
  • Alternativ kann der Fachmann transgene Tiere (z.B. Mäuse) herstellen, welche durch Immunisierung in der Lage sind, ein vollständiges Repertoire an humanen Antikörpern ohne endogene Immunglobulin-Herstellung herzustellen. Solche transgenen Mäuse sind von Abgenix, Inc., Fremont, Kalifornien und Medarex, Inc., Annandale, New Jersey erhältlich. Es wurde beschrieben, dass die homozygote Deletion des Gens mit dem verbindenden Bereich der schweren Kette (JH) des Antikörpers in chimären und Keimbahn-mutanten Mäusen in einer vollständigen Inhibierung der endogenen Antikörperherstellung resultiert. Ein Transfer der humanen Keimbahn-Immunglobulin-Genanordnung in solche Keimbahn-mutanten Mäuse wird durch einen Antigenreiz in der Herstellung von humanen Antikörpern resultieren. Siehe z.B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); und Duchosal et al., Nature 355:258 (1992). Humane Antikörper können auch von allgemeinen Schau-Phagenbibliotheken abgeleitet werden (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Vaughan, et al., Nature Biotech 14:309 (1996)).
  • C. DeImmunisedTM Antikörper
  • DeImmunisedTM Antikörper sind Antikörper, in welchen die wirksamen T-Zellepitope beseitigt wurden, wie in der Internationalen Patentanmeldung PCT/GB98/01473 beschrieben. Deshalb wird erwartet, dass die Immunogenität in Menschen beseitigt oder wesentlich verringert ist, wenn sie in vivo verabreicht werden.
  • Zusätzlich können Antikörper chemisch durch kovalente Konjugation an ein Polymer modifiziert werden, um zum Beispiel ihre Halbwertszeit im Blutkreislauf zu erhöhen. Bevorzugte Polymere und Verfahren zum Anbringen von ihnen an Peptide werden in U.S. Pat. Nr. 4,766,106 ; 4,179,337 ; 4,495,285 und 4,509,546 gezeigt. Bevorzugte Polymere sind polyoxyethylierte Polyole und Polyethylenglycol (PEG). PEG ist in Wasser bei Raumtemperatur löslich und weist ein bevorzugtes mittleres Molekulargewicht zwischen 1.000 und 40.000, stärker bevorzugt zwischen 2.000 und 20.000, am stärksten bevorzugt zwischen 3.000 und 12.000, auf.
  • D. Erzeugung von anti-C5/C5a MAbs
  • Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können durch herkömmliche Hybridomtechniken, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, erzeugt werden. Kurz, Mäuse werden mit aus humanen Sera aufgereinigtem C5 als ein Immunogen, welches in komplettem Freund-Adjuvans emulgiert ist, immunisiert und es wird subkutan oder intraperitoneal in Mengen im Bereich von 10 bis 100 μg injiziert. Zehn bis fünfzehn Tage später werden die immunisierten Tiere mit zusätzlichem C5, welches in nicht komplettem Freund-Adjuvans emulgiert ist, stimuliert. Die Mäuse werden danach periodisch nach einem wöchentlichen oder zweiwöchentlichen Immunisierungsschema stimuliert.
  • Für jede Verschmelzung wurden Einzelzellsuspensionen aus der Milz einer immunisierten Maus hergestellt und für die Verschmelzung mit SP2/0-Myelomzellen verwendet. SP2/0-Zellen (1 × 108) und Milzzellen (1 × 108) wurden in einem Medium, welches 50 % Polyethylenglycol (M.W. 1450) (Kodak, Rochester, NY) und 5 % Dimethylsulfoxid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthielt, verschmolzen. Die Zellen wurden dann auf eine Konzentration von 1,7 × 105 Milzzellen/ml der Suspension in DMEM-Medium (Gibco, Grand Island, NY), ergänzt mit 5 % fötalem Kälberserum und HAT (10 mM Natriumhypoxanthin, 40 μM Aminopterin und 1,6 mM Thymidin), eingestellt. Zweihundertfünfzig Mikroliter der Zellsuspension wurden in jede Vertiefung von ungefähr fünfzig Mikrotestplatten mit 96 Vertiefungen gegeben. Nach ungefähr zehn Tagen wurden die Kulturüberstände zum Durchmustern der Reaktivität mit gereinigtem humanem C5 durch ELISA abgezogen.
  • Die Vertiefungen von Immulon II (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA)-Mikrotestplatten wurden über Nacht mit humanem C5 mit 0,1 μg/ml (50 μl/Vertiefung) beschichtet. Die nicht spezifischen Bindungsstellen in den Vertiefungen wurden dann durch Inkubation mit 200 μl 5 % BLOTTO (Trockenmilch ohne Fett) in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) für eine Stunde gesättigt. Die Vertiefungen wurden dann mit PBST-Puffer (PBS, welche 0,05 % TWEEN® 20 enthält) gewaschen. Fünfzig Mikroliter des Kulturüberstandes von jeder Verschmelzungsvertiefung wurden in die beschichtete Vertiefung zusammen mit 50 μl BLOTTO für eine Stunde bei Raumtemperatur gegeben. Die Vertiefungen wurden mit PEST gewaschen. Die gebundenen Antikörper wurden dann durch Reaktion mit verdünntem Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgG (Fc-spezifisch) (Jackson ImmunoRe search Laboratories, West Grove, PA) für eine Stunde bei Raumtemperatur nachgewiesen. Die Vertiefungen wurden dann mit PEST gewaschen. Peroxidase-Substratlösung, welche 0,1 3,3,5,5-Tetramethylbenzidin (Sigma, St. Louis, MO) und 0,003 % Wasserstoffperoxid (Sigma, St. Louis, MO) in 0,1 M Natriumacetat, pH-Wert 6,0 enthielt, wurde in die Vertiefungen für 30 Minuten zur Farbentwicklung gegeben. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 μl 2 M 142504 pro Vertiefung abgestoppt. Die optische Dichte (OD) wurde bei 450 nm mit einem ELISA-Lesegerät (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) ausgelesen.
  • Die Hybridoma in den Vertiefungen, welche eine positive C5-Reaktivität zeigten, wurden durch ein Grenzverdünnungsverfahren Einzelzellen-kloniert. Monoklonale Hybridoma wurden dann expandiert und die Kulturüberstände wurden zur Reinigung durch Protein A-Chromatographie gesammelt. Die gereinigten Antikörper wurden dann über die Reaktivität mit humanem C5 und C5a durch ELISA, über die Bestimmung der Affinität und kinetischen Bindungskonstanten durch B1Acore, über die Wirkungen bei Komplement-vermittelter Hämolyse über sowohl den klassischen als auch den alternativen Weg und über die Inhibierung der 125I-C5a-Bindung an gereinigten humanen Neutrophilen charakterisiert.
  • Die Antikörper können auch durch Durchtesten (engl. panning) einer Bibliothek von humanen scFv auf jene, welche C5 binden, ausgewählt werden (Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)). Die Spezifität und Aktivität von speziellen Klonen können unter Verwendung von bekannten Tests bewertet werden (Griffiths et al.; Clarkson et al., Nature, 352: 642-648 (1991)). Nach einem ersten Schritt des Durchtestens erhält man eine Phagenbibliothek, welche eine Vielzahl von unterschiedlichen Einzelketten-Antikörpern enthält, die die Phagen mit verbesserter Bindung für C5 aufweisen. Anschließende Schritte des Durchtestens stellen zusätzliche Bibliotheken mit höheren Bindungsaffinitäten bereit. Wenn Aviditätswirkungen ein Problem sind, können Bibliotheken, welche einwertige Phagen aufweisen, verwendet werden, wobei weniger als 20 %, weniger als 10 % oder weniger als 1 % der Phagen mehr als eine Kopie eines Antikörpers auf der Oberfläche des Phagen aufweisen. Das Aufweisen von Einwertigkeit kann mit der Verwendung von Phagemid und Helferphagen erreicht werden. Geeignete Phagen schließen M13-, fl- und fd-Filamentphagen ein. Das Aufweisen eines Verschmelzungsproteins mit Virenumhüllungsproteinen ist auch bekannt und kann in dieser Erfindung verwendet werden.
  • MAb137-26, welcher sowohl C5 als auch C5a mit vergleichbarer Affinität bindet, wurde ferner charakterisiert. MAb 137-26 inhibiert die C5-Aktivierung nicht, inhibiert aber die Bindung von C5a an C5aR an gereinigten humanen Neutrophilen mit sehr hoher Wirksamkeit. Versuche, welche diese Eigenschaften zeigen, werden ferner nachstehend in den Beispielen erläutert.
  • Zum Durchmustern nach Antikörpern, welche an ein besonderes Epitop an dem Antigen von Interesse binden (z.B. jene, welche das Binden von jedem der hier offenbarten Antikörpern an C5 blockieren), kann ein Routinetest auf Kreuzblockierung, wie der, der in Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow und David Lane (1988) beschrieben wird, durchgeführt werden. Alternativ kann ein Epitop-Mapping, z.B. wie in Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995) beschrieben, durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob der Antikörper ein Epitop von Interesse bindet.
  • E. Herstellung von anderen Inhibitoren der Erfindung
  • Andere Moleküle, welche zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, können aus Verbindungsbibliotheken durch herkömmliche Mittel isoliert oder durchgemustert werden, zum Beispiel durch Bestimmen, ob sie an C5/C5a binden, und dann wird eine funktionale Durchmusterung durchgeführt, um zu bestimmen, ob sie die Aktivität von C5b inhibieren. Ein automatisiertes System zur Erzeugung und Durchmusterung einer Verbindungsbibliothek wird in den U.S. Patenten mit den Nr. 5,901,069 und 5,463,564 beschrieben. Stärker fokussierte Herangehensweisen beziehen eine kompetitive Durchmusterung gegen den MAb 137-26 oder die Herstellung eines dreidimensionalen Modells der Bindungsstelle und dann die Herstellung einer Familie von Molekülen, welche zu dem Modell passen, ein. Diese werden dann nach jenen mit optimalen Bindungscharakteristika durchgemustert. Zusätzlich können andere Moleküle durch einen Kompetitionstest oder eine funktionale Durchmusterung nach Inhibitoren mit den gleichen Eigenschaften wie MAb137-26 identifiziert werden.
  • F. Verwendung der Inhibitoren der Erfindung
  • Die Moleküle der vorliegenden Erfindung können über jedweden einer Anzahl von Wegen verabreicht werden und werden in einer Konzentration verabreicht, welche bei der Indikation oder für den gewünschten Zweck therapeutisch wirksam ist. Um dieses Ziel zu erreichen, können die Antikörper unter Verwendung einer Vielzahl von auf dem Fachgebiet bekannten verträglichen Exzipienten formuliert werden. Typischerweise werden die Antikörper durch Injektion verabreicht. Verfahren, welche diese Verabreichung erreichen, sind dem Fachmann bekannt. Es kann auch möglich sein, Zusammensetzungen zu erhalten, welche topisch oder oral verabreicht werden können, oder welche zu Transmission durch Schleimhäute in der Lage sind.
  • Die Dosierung und die Art der Verabreichung werden von dem Individuum und dem Mittel, welches verabreicht wird, abhängen. Die Dosierung kann durch Routineversuche in klinischen Studien oder durch Extrapolation von Tiermodellen, in welchen der Antikörper wirksam war, bestimmt werden.
  • Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können bei der Behandlung von Erkrankungen und Zuständen verwendet werden, welche durch eine überschüssige oder unkontrollierte Herstellung von C5a vermittelt werden. Der Nachweis der Nützlichkeit der Inhibitoren der Erfindung bei der Behandlung dieser Erkrankungen und Zustände wird nachstehend dargelegt.
  • Beispiel 1: Reaktivität von MAb137-26 mit humanem C5 und C5a
  • MAb 137-26 wurde auf die Reaktivität mit gereinigtem humanem C5 und rekombinantem C5a (Sigma, St. Louis, MO) getestet. Die Verfahren des ELISA sind vorstehend beschrieben. MAb 137-26 bindet an C5a in einer dosisabhängigen Weise mit hoher Wirksamkeit (1). Ein anderer anti-C5 MAb 137-76, welcher spezifisch für die β-Kette von humanem C5 ist, bindet C5a nicht, da C5a an der α-Kette von C5 sitzt. Ein Isotyp-angepasster irrelevanter Antikörper, welcher als eine Negativkontrolle verwendet wurde, reagiert auch nicht mit C5a. Auf der anderen Seite binden sowohl MAbs 137-26 als auch 137-76 an C5 (2).
  • Die Affinitätsgleichgewichtskonstante und die kinetischen Bindungskonstanten (Assoziation und Dissoziation) von MAb 137-26 mit C5a und C5 wurden auch mit einem B1Acore-Gerät (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Schweden) bestimmt. Alle Bindungsmessungen wurden in HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS) (10 mM HEPES, pH-Wert 7,4, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA, 0,005 % Surfactant P20) bei 25°C durchgeführt. Zur Messung der Bindungsgeschwindigkeitskonstanten von C5 und C5a an MAb137-26 wurden Kaninchen-anti-Maus-IgG(Fc)-Antikörper auf einem CM5-Sensorchip durch Aminkuppeln unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimid und N-Ethyl-N'-(3-diethylaminopropyl)carbodiimid immobilisiert.
  • MAb137-26 wurde dann vor der Injektion von C5 in unterschiedlichen Konzentrationen auf dem beschichteten Sensorchip angelagert. Die Daten sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
  • MAb137-26 weist eine hohe Bindungsaffinität für sowohl Lösungsphasen-C5a als auch -C5 auf. Die Ergebnisse zeigen auch, dass MAb137-26 an ein Epitop bindet, welches C5a und C5 gemeinsam aufweisen. Tabelle 1 Kinetische Konstanten der C5- und C5a-Bindung an MAb137-26
    kon (M–1S–1) koff (S–1) KD (M)
    C5 1,42 × 105 6,97 × 10–5 4,92 × 10–10
    C5a 3,7 × 106 2,25 × 10–4 6,09 × 10–11
    • kon kinetische Assoziationskonstante
    • koff kinetische Dissoziationskonstante
    • KD Dissoziationsgleichgewichtskonstante = koff/kon
  • Beispiel 2: Komplement-vermittelte Hämolyse Um die Wirkungen von MAb 137-26 auf die Aktivierung von C5 in menschlichem Serum zu untersuchen, wurde der Antikörper auf eine Inhibierung der Hämolyse, welche durch den klassischen und den alternativen Komplementweg vermittelt wird, getestet.
  • Für die Versuche des klassischen Weges wurden Huhn-RBCs (5 × 107 Zellen/ml) in Gelatine/Veronal-gepufferter Salzlösung (GVB++), welche 0,5 mM MgCl2 und 0,15 mM CaCl2 enthielt, mit gereinigten Kaninchen-anti-Huhn-RBC-Immunglobulinen bei 8 μg/ml (Inter-Cell Technologies, Hoperwell, NJ) für 15 Minuten bei 4°C sensibilisiert. Die Zellen wurden dann mit GVB++ gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden wieder in dem gleichen Puffer mit 1,7 × 108 Zellen/ml suspendiert. In jeder Vertiefung einer Mikrotestplatte mit 96 Vertiefungen mit rundem Boden wurden 50 μl normales menschliches Serum (5,2 %) mit 50 μl GVB++ von reihenverdünntem MAb137-26 oder einem anti-C2 MAb 175-62 als eine Positivkontrolle gemischt. Dann wurden 30 μl der Suspension der gewaschenen sensibilisierten Huhn-RBCs in die Vertiefungen, welche die Gemische enthielten, gegeben. Fünfzig Mik roliter normales menschliches Serum (5,2 %) wurden mit 80 μl GVB++ gemischt, wobei der Serumfarbleerwert erhalten wurde. Ein Isotyp-angepasster anti-HIV-1 gp120 MAb wurde als Negativkontrolle verwendet. Die verwendete Endkonzentration des menschlichen Serums war 2 %. Das Gemisch wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die Platte wurde auf einer Mikrotestplattenschüttelvorrichtung für 15 Sekunden geschüttelt. Die Platte wurde dann bei 300 × g für 3 Minuten zentrifugiert. Die Überstände (80 μl) wurden gesammelt und in Vertiefungen in Mikrotestplatten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden zur Messung der OD bei 405 nm mit einem ELISA-Plattenlesegerät überführt. Die prozentuale Inhibierung der Hämolyse ist definiert als: 100 × [(ODohne MAb – ODSerumfarbleerwert) – (ODmit MAb – ODSerumfarbleerwert)]/(ODohne MAb – ODSerumfarbleerwert).
  • 3 zeigt, dass MAb137-26 und die irrelevante Kontrolle MAb G3-519 die Hämolyse des klassischen Weges der sensibilisierten Huhn-RBCs nicht inhibieren, wogegen die Positivkontrolle, anti-C2 MAb 175-62, die Hämolyse wirksam inhibiert. C2 ist speziell in den klassischen Komplementweg einbezogen.
  • Für den alternativen Weg wurden nicht sensibilisierte Kaninchen-RBCs dreimal mit Gelatine/Veronal-gepufferter Salzlösung (GVB/Mg-EGTA), welche 2 mM MgCl2 und 1,6 mM EGTA enthielt, gewaschen. EGTA in einer Konzentration von 10 mM wurde zur Inhibierung des klassischen Weges verwendet (K. Whaley et al., in A.W. Dodds (Herausg.), Complement: A Practical Approach. Oxford University Press, Oxford, 1997, S. 19-47). Die Testverfahren sind ähnlich zu jenen des vorstehend beschriebenen Tests auf Hämolyse des klassischen Weges. Die in dem Test verwendete Endkonzentration des menschlichen Serums war 10 %. Anti-Faktor D MAb 166-32 wurde als Positivkontrolle verwendet. Der gleiche, vorstehend beschriebene Isotyp-angepasste irrelevante anti-HIV-1 gp120 MAb wurde als Negativkontrolle verwendet.
  • 4 zeigt, dass MAb137-26 die Hämolyse des alternativen Weges von nicht sensibilisierten Kaninchen-RBCs nicht inhibiert, wogegen anti-Faktor D MAb166-32 die Hämolyse stark inhibiert. Faktor D ist für den alternativen Komplementweg spezifisch. Der Antikörper der Negativkontrolle hat keine Wirkung.
  • Zusammengenommen bestätigen die Ergebnisse, dass MAb 137-26 nicht die C5-Aktivierung inhibiert und deshalb die Bildung von C5a und C5b-9 nicht inhibiert wird. MAb137-26 inhibiert die Aktivierung des alternativen und des klassischen Komplementweges nicht.
  • Beispiel 3: Inhibierung der 125I-C5a-Bindung an gereinigten humanen Neutrophilen durch MAb 137-26
  • Humane Neutrophile wurden aus menschlichem Vollblut aufgereinigt und mit Dextran T-500/Salz-Lösung verdünnt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für ungefähr 20 Minuten oder bis eine klar definierte Oberflächenschicht erschien inkubiert. Diese Oberflächenschicht wurde in ein 50 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen überführt. Nach dem Zentrifugieren wurde das Zellpellet in 30 ml kaltem PBSB (1 % BSA in PBS) suspendiert. 10 ml Histopaque-1077 (Sigma, St. Louis, MO) in einem 50 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen wurden mit der Zellsuspension überschichtet. Nach einer weiteren Zentrifugation wurde das Zellpellet dann wieder in 20 ml kalter 0,2 %iger NaCl für 30 Sekunden suspendiert, um die RBCs zu lysieren. Dann wurden 20 ml kalte 1,6 %ige NaCl zu der Zellsuspension gegeben, es wurde wieder zentrifugiert und die Neutrophile wurden in PBSB wieder suspendiert. Die Neutrophile wurden auf Eis vorgehalten, bis sie für die 125I-C5a-Bindung verwendet wurden.
  • MAb137-26 wurde in 1,5 ml-Eppendorf-Zentrifugenröhrchen mit einem Bindungspuffer (1 % BSA in RPMIl640-Medium) reihenverdünnt, wobei Endkonzentrationen im Bereich von 640 nM bis 0,04 nM erhalten wurden. Vier Mikroliter 4 nM 125I-C5a (NEN Life Science Products, Inc., Boston, MA) wurden zu 36 μl verdünntem MAb 137-26 zur Inkubation bei Raumtemperatur für 15 Minuten gegeben. Gereinigtes rekombinantes humanes C5a (Sigma, St. Louis, MO) wurde als Positivkontrolle verwendet, wogegen ein Isotyp-angepasster irrelevanter monoklonaler Antikörper als Negativkontrolle verwendet wurde. Für die maximale Bindung von 125I-C5a wurden anstelle 36 μl des Bindungspuffers ohne die Antikörper oder C5a verwendet. Fünfzig Mikroliter der Neutrophilsuspension wurden in jedes Röhrchen zur Inkubation auf Eis gegeben. Am Ende der 40-minütigen Inkubationsdauer wurde das Gemisch aus jedem Röhrchen auf 800 μl eines Trennungspuffers (6 % BSA in PBS) in einem anderen Eppendorf-Röhrchen überschichtet. Die Röhrchen wurden dann bei 2000 × g für 3 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nachdem der Überstand abgesaugt worden war, wurde das Zellpellet wieder in 0,5 ml deionisiertem Wasser suspendiert, um die Zellen zu lysieren. Das Zelllysat wurde dann mit 3 ml Ultima Gold-Szintillationsflüssigkeit (Packard Instrument, Meriden, CT) zur Radioaktivitätszählung gemischt.
  • Die prozentuale Inhibierung der 125I-C5a-Bindung ist definiert als: [Cpmmax – Cpmbkg] – [Cpmca – Cpmbkg]/[Cpmmax – Cpmbkg] × 100wobei:
    • Cpmmax
    = maximale Zählrate pro Minute ohne kompetitive Stoffe;
    Cpmbkg
    = Leerwert cpm ohne Zugabe von 125I-C5a; und
    Cpmca
    = cpm mit kompetitiven Stoffen.
  • 5 zeigt die Inhibierung der Bindung des mit radioaktivem Iod markiertem (125I) humanem C5a an gereinigten humanen Neutrophilen. MAb 137-26 ist bei der Inhibierung der Bindung von 125I-C5a an gereinigten humanen Neutrophilen wirksamer als nicht markiertes C5a. Die Dosis für eine 50 %ige Inhibierung (ID50) für MAb 137-26 war 0,45 nM verglichen zu 30 nM C5a.
  • Beispiel 4: Mapping des Bindungsepitops von MAb137-26 an humanem C5a durch SPOTs-Peptide auf einer Cellulosemembran
  • Das Bindungsepitop von MAb 137-26 an humanem C5a wurde durch eine Technik unter Verwendung von SPOTs-Peptiden, welche von Sigma Genosys (the Woodlands, TX) synthetisiert worden waren, gemappt. Überlappende Peptide (12-mer), welche das gesamte humane C5a umfassten, wurden auf einer Cellulosemembran synthetisiert. Bei dem Test wurde die Membran zuerst mit einer Blockierlösung TBSTB (10 mM Tris-Chlorid, 250 mM Natriumchiorid, 1 % Rinderserumalbumin und 0,05 % TWEEN® 20) für 1 Stunde bei Raumtemperatur behandelt, um alle nicht-spezifischen Bindungsstellen abzusättigen. MAb 136-26 mit 1 μg/ml in der Blockierlösung wurde dann zu der Membran für 1 Stunde bei Raumtemperatur gegeben. Die Membran wurde dann gründlich mit einem Waschpuffer TEST (10 mM Tris-Chlorid, 250 mM Natriumchlorid und 0,05 % TWEEN® 20) gewaschen. Die Membran wurde dann mit HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG (Fc)-Antikörper (1:5.000 in dem Blockierpuffer verdünnt) (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) für 1 Stunde bei Raumtemperatur behandelt. Die Membran wurde dann wieder gewaschen. Das Binden von MAb137-26 an den einzelnen SPOTs-Peptiden von C5a wurde durch Inkubation mit chemolumineszentem Supersignal West Pico-Substrat (Pierce, Rockford, IL) nachgewiesen. Die Intensität der Chemolumineszenz wurde dann durch Einwirkung auf einen Kodak X-OMAT AR-Film (Rochester, NY) nachgewiesen. 6 zeigt die Sequenz des durch MAb 137-26 gebundenen Epitops.
  • Beispiel 5: Ein ex vivo-humanes Vollblut-Modell zur Untersuchung von Komplementvermittelter Entzündung: Wirkung von MAb137-26 auf die Neutrophilaktivierung durch E. coli und auf das Abtöten von Neisseria meningtidis
  • Zur Untersuchung der Rolle des Komplements im komplexen Netzwerk der Entzündung müssen alle potentiellen zellulären und Flüssigphase-Mediatoren vorhanden sein und deshalb zur gleichzeitigen Wechselwirkung in der Lage sein. Für das Entwickeln einer solchen Versuchsbedingung in vitro wurde menschliches Vollblut verwendet. In diesem Modell wurde Lepirudin (REFLUDAN®), ein Thrombin-spezifisches Hirudinanalogon, als ein Antikoagulans anstelle von Heparin verwendet. Im Gegensatz zu Heparin beeinflusst Lepirudin die Komplementaktivierung nicht.
  • In diesem Modellsystem blockierte MAb 137-26 die Entzündungswirkungen von C5a, welche als ein Ergebnis der Komplementaktivierung durch E. coli gebildet wurden. Der Antikörper inhibierte das MAC-vermittelte Abtöten von N. meningitidis nicht. Deshalb neutralisiert MAb137-26 C5a ohne Inhibierung der C5-Aktivierung und die anschließende Bildung von MAC. Dies ist ein wichtiges Merkmal der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung.
  • Vollblut wurde in Polypropylen-Röhrchen, welche Lepirudin (50 μg/ml) enthielten, gesammelt. Das anti-koagulierte Vollblut wurde mit PBS oder anti-C5-Inhibitoren für 4 Minuten bei 37°C vorinkubiert. Für die Untersuchungen der CD11b-Expression und des oxidativen Anstiegs an Neutrophilen wurde der opsonisierte E. coli-Stamm LE392 (ATCC 33572) zu den Vollblutproben für 10 Minuten bei 37°C gegeben. Die E. coli-Konzentration betrug 1 × 107/ml Blut in den CD11b-Versuchen und 1 × 108/ml in den Versuchen des oxidativen Anstiegs. Die Grundlinienprobe T-0 wurde sofort verarbeitet. Nach der Inkubation wurden 100 μl der Proben zur Messung der CD11b-Expression an Neutrophilen durch Immunofluorcytometrie verwendet. Der oxidative Anstieg der aktivierten Neutrophile wurde unter Verwendung des Substrats Dihydrorhodamin 123 gemessen und wie im Burst-Testverfahren (ORPEGEN Pharma, Heidelberg, Deutschland) beschrieben durchgefüht.
  • Die 7A bis 7D zeigen die Ergebnisse der Durchflusszytometrietests der Neutrophilaktivierung für die CD11b-Expression und den oxidativen Anstieg. Anti-C5/C5a MAb137-26 inhibierte wirksam die durch E. coli induzierte Neutrophilaktivierung im menschlichen Vollblut-Modell für Entzündung. In diesen Tests ist MAb137-26 wirksamer als anti-C5a MAb561 (Dr. Jurg Kohl) und ein peptidischer C5aR-Antagonist (Dr. Stephen Taylor).
  • Für die bakteriziden Tests wurden N. meningitidis H44/76-1 über Nacht auf BHI-Agaar gezüchtet, subkultiviert und man ließ bis zur log-Phase 4 Stunden wachsen. 5000 bis 10000 koloniebildende Einheiten (CFUs) wurden zu 1,1 ml mit Lepirudin anti-koagulierten Vollblutproben, welche für 5 Minuten mit PBS oder Antikörper vorinkubiert worden waren, gegeben. Zu jeder Zeitdauer wurden 100 μl Vollblut in mikrobiologische Petri-Schalen, welche Blutagar enthielten, ausgesät und für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Bakterienwachstum wurde als CFU/100 μl zugegebenes Vollblut ausgedrückt. Die Probe T-0 wurde sofort nach dem Zugeben der Bakterien erhalten.
  • 8 zeigt, dass MAb137-26 nicht das MAC-vermittelte Abtöten von Neisseria meningitides inhibierte. Hingegen inhibierte MAb137-30 das Abtöten von Neisseria meningitides durch menschliches Vollblut. Dieser Antikörper inhibiert die C5-Aktivierung. SEQUENZAUFLISTUNG
    Figure 00280001
    Figure 00290001
    Figure 00300001
    Figure 00310001

Claims (23)

  1. Antikörper oder Fragment davon, welche an C5 und C5a binden, aber nicht die Aktivierung von C5 verhindern und nicht die Bildung verhindern von oder die Aktivität inhibieren von C5b.
  2. Antikörper oder Fragment gemäß Anspruch 1, welche an freies C5a mit gleicher oder besserer Affinität als an C5 binden.
  3. Antikörper oder Fragment gemäß Anspruch 1, welche das Binden von C5a an C5aR inhibieren.
  4. Antikörper oder Fragment davon, welche an das selbe Epitop von C5 wie der monoklonale Antikörper 137-26 binden, der aus dem Hybridom hergestellt ist, welches bei ATCC hinterlegt ist und die Bezeichnung PTA-3650 trägt.
  5. Antikörper oder Fragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
  6. Antikörperfragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fab, F(ab')2, Fv und Einzelketten-Fv besteht.
  7. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 5, wobei der Antikörper ein Chimärenantikörper, ein Antikörper, bei welchem die potentiellen T-Zellepitope beseitigt wurden, ein humanisierter Antikörper oder ein humaner Antikörper ist.
  8. Monoklonaler Antikörper 137-26, hergestellt aus dem Hybridom, welches bei ATCC hinterlegt ist und die Bezeichnung PTA-3650 trägt.
  9. Hybridomzelllinie, welche in Anspruch 8 aufgeführt ist.
  10. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Antikörper oder das Fragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, das Fragment gemäß Anspruch 6 oder den Antikörper gemäß Anspruch 7 oder 8 und einen pharmakologisch verträglichen Träger, Exzipienten, Stabilisator oder Verdünnungsmittel.
  11. Verwendung des Antikörpers oder Fragments gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Aktivität von C5a.
  12. Verwendung des Antikörpers oder Fragments gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustandes, welche durch überschüssige oder unkontrollierte Herstellung von C5a vermittelt werden.
  13. Verwendung gemäß Anspruch 11 oder 12, wobei das Medikament durch intravenöse Infusion, intravenöse Bolusinjektion, intraperitoneal, intradermal, intramuskulär, subkutan, intranasal, intratracheal, intraspinal, intrakranial oder oral verabreicht wird.
  14. Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei die Erkrankung oder der Zustand akutes Atemnotsyndrom (ARDS) ist.
  15. Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei die Erkrankung oder der Zustand Myokardischämie-Reperfusionsverletzung ist.
  16. Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei die Erkrankung oder der Zustand Sepsis ist.
  17. Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei die Erkrankung oder der Zustand eine Autoimmunerkrankung ist.
  18. Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematodes oder Psoriasis ist.
  19. Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei die Erkrankung oder der Zustand Gewebeverletzung oder eine entzündliche Antwort, induziert durch Immunkomplexe (IC), sind.
  20. Diagnostisches Verfahren, umfassend Nachweisen der Menge an C5 oder C5a, welche in einer Probe vorhanden ist, mit dem Antikörper oder Fragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8.
  21. Diagnostisches Verfahren von Anspruch 20, wobei der Antikörper der monoklonale Antikörper 137-26 ist, der aus dem Hybridom hergestellt ist, welches bei ATCC hinterlegt ist und die Bezeichnung PTA-3650 trägt.
  22. Ex vivo-Verfahren zur Identifizierung eines Inhibitors, welcher an C5 und C5a bindet, aber nicht die Aktivierung von C5 verhindert und nicht die Bildung verhindert von oder die Aktivität inhibiert von C5b, wobei das Verfahren umfasst: (i) Bestimmen, ob eine Testverbindung an C5 und C5a bindet; und (ii) Bestimmen, ob die Testverbindung die Aktivität von C5b inhibiert.
  23. Verfahren zur Herstellung eines Medikaments, umfassend das Verfahren von Anspruch 22 und ferner Kombinieren der Testverbindung mit einem pharmakologisch verträglichen Träger, Exzipienten, Stabilisator oder Verdünnungsmittel.
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