ES2283594T3 - Inhibidores de la via del complemento que se une a c5 y c5a sin inhibir la formacion de c5b. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo o uno de sus fragmentos que se une al C5 y C5a, pero no evita la activación de C5 ni evita la formación ni inhibe la actividad de C5b.
Description
Inhibidores de la vía del complemento que se
unen a C5 y C5a sin inhibir la formación de C5b.
Esta solicitud reivindica la prioridad de la
Solicitud Provisional de Patente de EE.UU. Nº 60/313,137 presentada
el 17 de agosto de 2001.
Esta invención se refiere a inhibidores de la
inflamación que se unen a las proteínas C5 y C5a del sistema del
complemento sin inhibir la formación de los complejos de ataque a la
membrana (en lo sucesivo abreviadamente MAC, por la expresión
inglesa Membrane Attack Complexes) denominados C5b y
C5b-9.
El sistema del complemento juega un papel
central en la eliminación de los complejos inmunes y en las
respuestas inmunes a agentes infecciosos, antígenos extraños,
células infectadas por virus y células tumorales. Sin embargo, una
activación inapropiada o excesiva del sistema del complemento puede
conducir a consecuencias perjudiciales, incluso potencialmente
letales, debido a una inflamación grave que da como resultado la
destrucción de tejidos. Estas consecuencias se manifiestan
clínicamente en diversos trastornos que incluyen choque septicémico,
lesiones miocárdicas así como lesiones intestinales por
isquemia/reperfusión, rechazo de injertos, insuficiencia orgánica,
nefritis, inflamación patológica y enfermedades autoinmunes. La
septicemia, por ejemplo, es la causa principal de mortalidad
produciendo, sólo en Estados Unidos, más de 200.000 muertes al año.
A pesar de los importantes avances en los últimos años en el
tratamiento de las infecciones graves, continúa aumentando la
prevalencia y mortalidad por septicemia. Por consiguiente, la
inhibición de la activación excesiva o no controlada de la cascada
del sistema del complemento podría proporcionar ventajas clínicas a
pacientes con dichas enfermedades y estados.
El sistema del complemento está compuesto por un
grupo de proteínas que normalmente están presentes en el suero en
estado inactivo. La activación del sistema del complemento se
realiza principalmente por dos vías distintas, denominadas vía
clásica y vía alternativa (V.M. Holers, en Clinical Immunology:
Principles and Practice, ed. R.R. Rich, Mosby Press; 1996,
363-391). La vía clásica es una cascada dependiente
del calcio/magnesio, que es activada normalmente por la formación
de complejos antígeno-anticuerpo. También puede ser
activada de manera independiente de los anticuerpos por la unión de
proteína C reactiva, complejada con un ligando, y por muchos
agentes patógenos incluyendo las bacterias
gram-negativas. La vía alternativa es una cascada
dependiente del magnesio que es activada por deposición y activación
de C3 sobre ciertas superficies sensibles (por ejemplo,
polisacáridos de paredes celulares de levaduras y bacterias y
ciertos materiales polímeros).
Estudios recientes han mostrado que el
complemento también puede ser activado por la vía de la lectina, que
implica la unión inicial de la lectina unida a la manosa y la
posterior activación de C2 y C4, que son comunes a la vía clásica
(Matsushlta, M. et al., J. Exp. Med.
176:1497-1502(1992); Suankratay. C. et
al., J. Immunol. 160: 3006-3013 (1998)).
Las pruebas acumuladas indican que la vía alternativa participa en
el aumento de la actividad tanto de la vía clásica como de la vía de
la lectina (Suankratay, C., ibid; Farries, T.C. et
al., Mol. Immunol. 27:
1155-1161(1990)). La activación de la vía del
complemento genera fragmentos biológicamente activos de las
proteínas del complemento, por ejemplo anafitotoxinas C3a, C4a y
C5a y complejos de ataque a la membrana (MAC) C5b-9,
que median las respuestas inflamatorias a través de la implicación
de la quimiotaxia de los leucocitos, la activación de macrófagos,
neutrófilos, plaquetas, mastocitos y células endoteliales, el
aumento de la permeabilidad vascular, la citolisis y las lesiones de
tejidos.
La proteína C5a del complemento es uno de los
mediadores pro-inflamatorios más potentes del
sistema del complemento. C5a es la forma activada de C5. La
proteína C5 del complemento (peso molecular 190 kD) está presente en
el suero humano en una cantidad de aproximadamente 80 \mug/ml
(Kohler, P.F. et al., J. Immunol. 99:
1211-1216 (1967)). Está compuesta por dos cadenas
polipeptídicas, \alpha y \beta, con pesos moleculares
aproximados de 115 kD y 75 kD, respectivamente (Tack, B.F. et
al., Biochemistry 18: 1490-1497 (1979)).
Biosintetizada como una pro-molécula monocatenaria,
la proteína C5 se escinde enzimáticamente en una estructura
bicatenaria durante el tratamiento y la secreción. Después de la
escisión, las dos cadenas se mantienen juntas por al menos un
enlace disulfuro, así como por interacciones no covalentes (Ooi,
Y.M. et al., J. Immunol. 124:
2494-2498(1980)).
Las estructuras primarias de aminoácidos de C5
de seres humanos y múridos se obtuvieron a partir de los datos de
secuenciación del cDNA (Wetsel, R.A. et al., Biochemistry
27: 1474-1482 (1988); Haviland, D.L. et
al., J. Immunol. 146: 362-368 (1991);
Wetsel, R.A. et al., Biochemistry 26:
737-743 (1987)). La secuencia de aminoácidos
deducida de la pre-pro-C5 humana
precursora tiene 1676 aminoácidos. Las cadenas \alpha y \beta
de la C5 madura tienen 999 y 655 aminoácidos, respectivamente. C5
está glicosilada en su cadena \alpha, en particular la asparagina
del residuo 64.
La C5 se escinde en los fragmentos C5a y C5b
durante la activación de las vías del complemento. Las enzimas
convertasas responsables de la activación de C5 son complejos de
múltiples subunidades de C4b, C2a y C3b para la vía clásica y de
(C3b)_{2}, Bb y P para la vía alternativa (Goldlust, M.B.
et al., J. Immunol. 113: 998-1007
(1974); Schreiber, R.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
75: 3948-3952 (1978)). La C5 es activada por
escisión en la posición 74-75
(Arg-Leu) en la cadena \alpha. Después de la
activación, se libera la proteína C5a, de 74 aminoácidos y 11,2 kD,
procedente de la porción del extremo amino de la cadena \alpha.
Esta proteína C5a presenta propiedades anafilatoxínicas similares a
las presentadas por C3a, pero es 100 veces más potente, sobre una
base molar, en desencadenar respuestas inflamatorias. Tanto C5a como
C3a son potentes estimuladores de neutrófilos y monocitos
(Schindler, R. et al., Blood 76:
1631-1638 (1990));
Haeffner-Cavaillon, N. et al., J.
Immunol. 138: 794-700 (1987); Cavaillon, J.M.
et al., Eur. J. Immunol 20: 253-257
(1990)). Además, se ha demostrado recientemente que el receptor C3a
es importante para la protección contra el choque inducido por
endotoxinas en un modelo de ratón (Kildsgaard, J. et al.,
J. Immunol. 165: 5406-5409 (2000)).
Además de sus propiedades anafilatóxicas, la C5a
induce la migración quimiotáctica de neutrófilos (Ward, P.A. et
al., J. Immunol. 102: 93-99 (1969)),
eosinófilos (Kay, A.B. et al., Immunol. 24:
969-976(1973)), basófilos
(Lett-Brown, M.A. et al., J. Immunol.
117: 246-252 (1976)) y monocitos (Snyderman, R.
et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 138:
387-390 (1971)). La actividad de C5a está regulada
por la enzima plasmática carboxipeptidasa N (E.C. 3.4.12.7) que
elimina la arginina del extremo carboxi de la C5a formando el
derivado C5a desArg (Goetzl. E.J. et al., J. Clin.
Invest. 53: 591-599 (1974)). Sobre una base
molar, el C5a desArg humano sólo presenta el 1% de la actividad
anafiláctica (Gerard, C. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 78: 1833-1837 (1981)) y la actividad
quimiotáctica polimorfonuclear como la de C5a sin modificar
(Chenoweth, D.E. et al., Mol. Immunol. 17:
151-161 (1980)). Tanto C5a como
C5b-9 activan las células endoteliales para expresar
las moléculas de adhesión esenciales para el secuestro de los
leucocitos activados, que intervienen en la inflamación y lesión de
tejidos (Foreman, K.E. et al., J. Clin. Invest. 94:
1147-1155 (1994); Foreman, K.E. et al.,
Inflammation 20:1-9(1996); Rollins,
S.A. et al., Transplantation 69:
1959-1967 (2000). La C5a también interviene en
reacciones inflamatorias provocando la contracción de la musculatura
lisa, aumentando la permeabilidad vascular, induciendo la
desgranulación de basófilos y mastocitos e induciendo la liberación
de proteasas lisosómicas y radicales libres oxidantes (Gerard, C.
et al., Ann. Rev. Immunol.. 12:
775-808 (1994)). Además, la C5a modula la expresión
génica hepática en fase aguda y aumenta la respuesta inmune global
aumentando la producción de TNF\alpha,
IL-1\beta e IL-8 (Lambris, J. D.
et al., en: The Human Complement System in Health and
Disease, Volanakis, J. E. ed., Marcel Dekker, New York, pp.
83-118).
Ha sido clonado el receptor de C5a humano (C5aR)
(Gerard, N.P. et al., Nature 349:
614-617 (1991); Boulay, F. et al.,
Biochemistry 30: 2993-2999 (1991)). Pertenece
a una superfamilia de receptores unidos a la proteína G de siete
dominios transmembranales. El C5aR se expresa en neutrófilos,
monocitos, basófilos, eosinófilos, hepatocitos, células de la
musculatura lisa del pulmón y endoteliales y tejidos glomerulares
renales (Van-Epps, D.E. et al., J.
Immunol. 132: 2862-2867 (1984); Haviland, D.L.
et al., J. Immunol. 154: 1861-1869
(1995); Wetsel, R.A., Immunol. Lett. 44:
183-187 (1995); Buchner, R.R. et al., J.
Immunol. 155: 308-315 (1995); Chenoweth, D.E.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75:
3943-3947 (1978); Zwimer, J. et al., Mol.
Immunol. 36: 877-884 (1999)). El sitio de unión
al ligando de C5aR es complejo y consiste en al menos dos dominios
de unión físicamente separables. Uno une el extremo amino de C5a
(aminoácidos 1-20) y el núcleo unido por disulfuro
(aminoácidos 21-61), mientras que el segundo une el
extremo carboxi de C5a (aminoácidos 62-74) (Wetsel,
R.A., Curr. Opin. Immunol. 7: 48-53
(1995)).
La C5a desempeña importantes funciones en la
inflamación y lesión de tejidos. En la circulación extracorpórea y
hemodiálisis, se forma C5a como resultado de la activación de la vía
alternativa del complemento cuando la sangre humana se pone en
contacto con la superficie artificial de la máquina
corazón-pulmón o la máquina de diálisis renal
(Howard, R.J. et al., Arch. Surg. 123:
1496-1501 (1988); Kirklin, J. K. et al.,
J. Cardiovasc. Surg. 86: 845-857 (1983);
Craddock, P.R. et al., N. Engl. J. Med. 296:
769-774 (1977)). El C5a provoca un aumento de la
permeabilidad y edema capilar, broncoconstricción, vasoconstricción
pulmonar, activación de leucocitos y plaquetas e infiltración en
los tejidos, en particular en el pulmón (Czermak, B.J. et
al., J. Leukoc. Biol. 64: 40-48 (1998).
Se demostró que la administración de un anticuerpo monoclonal
anti-C5a reduce la circulación extracorpórea y la
disfunción endotelial coronaria inducida por cardioplejía (Tofukuji,
M. et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 116:
1060-1068
(1998)).
(1998)).
La C5a está también implicado en el síndrome de
dificultad respiratoria aguda (en los sucesivo abreviadamente ARDS,
por la expresión inglesa Acute Respiratory Distress Syndrome)
e insuficiencia multiorgánica (en lo sucesivo abreviadamente MOF,
por la expresión inglesa Multiple Organ Failure) (Hack. C.E.
et al., Am. J. Med. 1989: 86: 20-26;
Hammerschmidt DE et al., Lancet 1980; 1:
947-949; Heideman M. et al., J. Trauma
1984; 4: 1038-1043). La C5a aumenta la producción
de monocitos de dos importantes citoquinas
pro-inflamatorias, TNF\alpha e
IL-1. También se ha demostrado que la C5a juega un
importante papel en el desarrollo de la lesión de tejidos y
particularmente la lesión pulmonar, en modelos animales del choque
séptico (Smedegard G et al., Am. J. Pathol. 1989; 135:
489-487). En los modelos de septicemia que utilizan
ratas, cerdos y primates no humanos, los anticuerpos
anti-C5a administrados a los animales antes del
tratamiento con endotoxina o E. coli dieron como resultado
una disminución de la lesión de tejidos, así como la disminución de
la producción de IL-6 (Smedegard, G. et al.,
Am. J. Pathol. 135: 489-497(1989);
Hopken, U. et al., Eur. J. Immunol. 26:
1103-1109 (1996); Stevens, J.H. et al., J.
Clin. Invest. 77: 1812-1818 (1986)). Más
importantemente, se ha demostrado que el bloqueo de C5a con
anticuerpos policlonales anti-C5a mejora
significativamente las tasas de supervivencia en un modelo de
ligamiento/punción cecal de septicemia en ratas (Czermak. B.J.
et al., Nat. Med. 5: 788-792 (1999)).
Este modelo presenta muchos aspectos de la manifestación clínica de
la septicemia en seres humanos (Parker, S.J. et al., Br.
J. Surg. 88: 22-30 (2001)). En el mismo modelo
de septicemia, se demostró que los anticuerpos
anti-C5a inhiben la apoptosis de timocitos (Guo,
R.F. et al., J. Clin. Invest. 106:
1271-1280 (2000)) y evita la MOF
(Huber-Lang, M. et al., J. Immunol.
166: 1193-1199 (2001)). Los anticuerpos
anti-C5a eran también protectores en un modelo con
factor del veneno de cobra de lesión pulmonar en ratas y en lesión
pulmonar inducida por un complejo inmune (Mulligan, M.S. et
al., J. Clin. Invest. 98: 503-512
(1996)). La importancia de la C5a en la lesión pulmonar mediada por
un complejo inmune fue confirmada posteriormente en ratones (Bozic,
C.R. et al., Science 26: 1103-1109
(1996)).
Se encontró que la C5a era una importante
mediadora en la lesión por isquemia
miocárdica-reperfusión. El agotamiento del
complemento redujo el tamaño del infarto de miocardio en ratones
(Weisman, H.F. et al., Science 249:
146-151 (1990)) y el tratamiento con anticuerpos
anti-C5a redujo la lesión en un modelo de ratas de
la isquemia-reperfusión de la pata trasera (Bless,
N.M. et al., Am. J. Physiol. 276:
L57-L63 (1999)). La lesión por reperfusión durante
un infarto de miocardio se redujo también notablemente en cerdos que
habían sido tratados de nuevo con una IgG monoclonal
anti-C5a (Amsterdam, E.A. et al., Am. J.
Physiol. 268:H448-H457 (1995)). Un antagonista
humano recombinante C5aR redujo el tamaño de un infarto en un modelo
porcino de revascularización quirúrgica (Riley, R.D. et al.,
J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 120: 350-358
(2000)).
Los niveles del complemento son elevados en
pacientes con artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico.
Los niveles de C5a están relacionados con la gravedad del estado
morboso (Jose, P.J. et al., Ann. Rheum. Dis. 49:
747-752 (1989)); Porcel, J.M. et al.,
Clin. Immunol. Immunopathol. 74: 283-288
(1995)). Por consiguiente, la inhibición de la C5a y/o el C5aR
podría ser útil en el tratamiento de estas enfermedades
crónicas.
La expresión del C5aR está
sobre-regulada en astrocitos reactivos, células
microgliales y endoteliales en un sistema nervioso central humano
inflamado (Gasque, P. et al., Am. J. Pathol. 150:
31-41(1997)). La C5a podría estar implicada
en enfermedades neurodegenerativas, tal como la enfermedad de
Alzheimer (Mukherjee, P. et al., J. Neuroimmunol.
105: 124-130 (2000)). La activación del C5aR
neuronal puede inducir apoptosis (Farkas I et al., J.
Physiol. 1998; 507: 679-687). Por consiguiente,
la inhibición de C5a y/o C5aR también podría ser útil en el
tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
Actualmente se sabe que la psoriasis en una
enfermedad mediada por los linfocitos T (Gottlieb, E.L. et
al., Nat. Med. 1: 442-447(1995)).
Sin embargo, los neutrófilos y mastocitos pueden estar también
implicados en la patogénesis de la enfermedad (Terui, T. et
al., Exp. Dermatol. 9: 1-10; 2000);
Werfel, T. et al., Arch. Dermatol. Res. 289:
83-86 (1997)). En las escamas psoriásicas se
encuentran altos niveles de C5a desArg, lo que indica que está
implicada la activación del complemento. Los linfocitos T y los
neutrófilos son atraídos químicamente por C5a (Nataf, S. et
al., J. Immunol. 162: 4018-4023 (1999);
Tsuji, R.F. et al., J. Immunol. 165:
1588-1598 (2000); Cavaillon, J.M. et al.,
Eur. J. Immunol. 20: 253-257 (1990)). Por
consiguiente, la C5a podría ser una importante diana terapéutica
para el tratamiento de la psoriasis.
Los complejos inmunes (en lo sucesivo
abreviadamente IC, Immune Complexes) que contienen la
inmunoglobulina G contribuyen a la patofisiología en un número de
enfermedades autoinmunes, tales como lupus eritematoso sistémico,
artritis reumatoide, síndrome de Goodpasture y alveolitis alérgica
(Madaio, M.P., Semin. Nephrol. 19: 48-56
(1999); Korganow, A.S. et al., Immunity 10:
451-459 (1999); Bolten, W.K., Kidney Int. 50:
1754-1760 (1996); Ando, M. et al., Curr.
Opin. Pulm. Med. 3: 391-399 (1997)). El modelo
animal clásico para la respuesta inflamatoria en estas enfermedades
por IC es la reacción de Arthus, que pone de relieve la infiltración
de células polimorfonucleares, hemorragias y exudación plasmática
(Arthus, M., C.R. Soc. Biol. 55:817-824
(1903)). Estudios recientes muestran que los ratones deficientes en
C5aR están protegidos de la lesión de tejidos inducida por IC (Kohl,
J. et al., Mol. Immunol. 36: 893-903
(1999); Baumann, U. et al., J. Immunol. 164:
6560-6565 (2000)). Los resultados están de acuerdo
con la observación final de que un pequeño péptido antagonista
anti-C5aR inhibe la respuesta inflamatoria causada
por la deposición de IC (Strachan, A. J. et al., J.
Immunol. 164:6560-6565 (2000)). Junto con su
receptor, C5a juega un importante papel en la patogénesis de
enfermedades causada por IC. Los inhibidores de C5a y C5aR podrían
ser útiles en el tratamiento de estas enfermedades.
El documento WO 01/15731A1 describe
composiciones y métodos para el tratamiento de septicemia usando
anticuerpos para C5a. Estos anticuerpos reaccionan sólo con la
región del extremo N del péptido C5a y no presentan reacción
cruzada con C5.
El documento WO 86/05692 describe el tratamiento
del síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) con un
anticuerpo específico para C5a o su derivado desArg. También
describe el tratamiento de la septicemia por administración de este
anticuerpo. Este anticuerpo se produjo en respuesta al derivado C5a
desArg debido a ser más inmunógeno, pero se obtendrán anticuerpos
de reacción cruzada con C5a. La Patente de EE.UU. Nº 5.853.722
describe anticuerpos anti-C5 que bloquean la
activación de C5 y por consiguiente, la formación de C5a y C5b.
La Patente de EE.UU. Nº 6.074.642 describe el
uso de anticuerpos anti-C5 en el tratamiento de la
glomerulonefritis. Estos anticuerpos bloquean también la generación
de C5a y C5b, inhibiendo tanto el efecto de C5a como la formación
de C5b-9. La Patente de EE.UU. Nº 5.562.904 describe
anticuerpos anti-C5a que bloquean completamente la
formación de MAC.
En otros estudios de anticuerpos
anti-C5, los anticuerpos descritos bloquean la
activación de C5 y su escisión formando C5a y C5b (Vakeva, A.P.
et al., Circulation 97:2259-2267
(1998); Thomas, T.C. et al., Mol. Immunol.
33:1389-1401 (1996); Wang, Y. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8563-8568 (1996);
Kroshus, T. et al., Transplantation
60:1194-1202 (1995); Frei, Y. et al., Mol.
Cell Probes 1:141-149 (1987)).
Se han estudiado anticuerpos monoclonales de
reacción cruzada con C5, C5a o C5a desArg (Schulze, M. et
al., Complement 3: 25-39 (1986); Takeda,
J. et al., J. Immunol. Meth.
101:265-270 (1987); Inoue, K., Complement
Inflamm. 6: 219-222 (1989). También se ha
descrito que los anticuerpos monoclonales de reacción cruzada con
C5 y C5a inhibían la liberación de ATP mediada por C5a de las
plaquetas de cobaya (Klos, A. et al., J. Immunol.
Meth. 111: 241-252 (1988); Oppermann, M. et
al., Complement Inflamm. 8: 13-24
(1991)).
La activación de C5 normalmente da como
resultado la escisión de C5 en C5a y C5b. Las moléculas inhibidoras
de la presente invención se unen con gran afinidad a C5 y C5a, no
inhiben la activación de C5 ni evitan la formación de C5b ni
inhiben su actividad. Un ejemplo de dicho inhibidor es el anticuerpo
monoclonal denominado MAb 137-26, que se une a un
epítopo compartido por C5 y C5a humanas. El hibridoma que produce el
anticuerpo monoclonal 137-26 ha sido depositado en
The American Type Culture Collection, 10801 University Bivd.,
Manassas, VA 20110-2209, con el Nº de Registro
PTA-3650 el 17 de agosto de 2001.
Las moléculas inhibidoras de la invención
incluyen también: (i) otros anticuerpos o sus fragmentos, péptidos,
oligonucleótidos o peptidomiméticos que se unen con gran afinidad a
C5 y C5a, pero no inhiben la activación de C5 ni evitan la
formación de C5b ni inhiben su actividad, o (ii) cualquier
anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal
137-26. Los fragmentos de anticuerpos incluyen Fab,
F(ab')_{2}, Fv, o Fv monocatenario, y los anticuerpos y
fragmentos monoclonales de la invención incluyen anticuerpos y
fragmentos quiméricos, Delmmunized™, anticuerpos y fragmentos
humanos o humanizados y otras formas aceptables para uso humano.
Las moléculas inhibidoras pueden constituir parte de una composición
farmacéutica.
Las moléculas inhibidoras de la invención son
útiles en el tratamiento de enfermedades y estados que impliquen
una producción excesiva o descontrolada de C5a, o para uso
diagnóstico en la detección de la presencia, o cuantificación, de
C5a.
La Fig. 1 muestra la unión de MAb
137-26 (anti-C5a, cuadrados negros)
y MAb 137-76 (cadena \beta de
anti-C5, círculos blancos) a la C5a humana
purificada por ELISA. Como control negativo se usó un anticuerpo
monoclonal irrelevante de isotipo similar. El eje Y representa la
reactividad de los MAb con C5a expresada en densidad óptica (DO) a
450 nm y el eje X representa la concentración de los MAb. El MAb
137-26 reaccionó con C5a humana mientras que no
reaccionaron el MAb 137-76 y el anticuerpo control
irrelevante.
La Fig. 2 muestra la unión de MAb
137-26 (cuadrados negros) y MAb
137-76 (círculos blancos) a C5 humano purificado
por ELISA. Se usó como control negativo un anticuerpo monoclonal
irrelevante de isotipo similar. El eje Y representa la reactividad
del MAb con C5 expresada en densidad óptica (DO) a 450 nm y el eje X
representa la concentración de los anticuerpos monoclonales. Tanto
MAb 137-26 como MAb 137-76
reaccionaron con C5 humano, mientras que no lo hizo el anticuerpo
irrelevante.
La Fig. 3 muestra la incapacidad del MAb
137-26 anti-C5a para inhibir la
hemolisis mediada por el complemento de eritrocitos de pollo
sensibilizados por la vía clásica (abreviadamente en lo sucesivo CP
por la expresión inglesa Classical Pathway). El MAb
175-62 anti-C2 inhibía eficazmente
la hemolisis. Un anticuerpo monoclonal irrelevante de isotipo
similar no producía ese efecto. El eje Y representa el porcentaje de
inhibición de la hemolisis, como ya se ha descrito en el texto. El
eje X representa la concentración de los anticuerpos
monoclonales.
La Fig. 4 muestra la incapacidad del MAb
137-26 anti-C5a para inhibir la
hemolisis mediada por el complemento de eritrocitos de conejo por
la vía alternativa (abreviadamente en lo sucesivo AP por la
expresión inglesa Alternative Pathway). El MAb
166-32 anti-factor D inhibía
eficazmente la hemolisis. Un anticuerpo monoclonal irrelevante de
isotipo similar no producía ese efecto. El eje Y representa el
porcentaje de inhibición de la hemolisis, como ya se ha descrito en
el texto. El eje X representa la concentración de anticuerpos
monoclonales.
La Fig. 5 muestra la inhibición de la unión de
C5a humana radioyodada con (^{125}I) a neutrófilos humanos
purificados. El control positivo, C5 humana recombinante (rHuC5a)
purificada, inhibía la unión. Un anticuerpo monoclonal irrelevante
de isotipo similar no producía ese efecto. El eje Y representa el
porcentaje de inhibición de la unión de
^{125}I-C5a, como ya se ha descrito en el texto.
El eje X representa la concentración de los agentes
competidores.
La Fig. 6 muestra el epítopo de unión de MAb
137-26 en C5a humano cartografiado solapando
péptidos sintéticos sobre una membrana de celulosa.
La Fig. 7A muestra la expresión de CD11b sobre
neutrófilos humanos estimulada por E. coli opsonizada en un
modelo de sangre completa anti-coagulada con
lepirudina. El MAb 137-26
anti-C5/C5a (círculos negros) inhibía la expresión
de CD11b más eficazmente que el MAb561 anti-C5a (del
Dr. Jurg Kohl, cuadrados negros) y que el MAb
137-30 anti-C5 (triángulos negros).
Este último anticuerpo inhibía la activación de C5. El MAb
irrelevante (triángulos negros invertidos) no producía ese efecto.
El eje Y representa la intensidad media de fluorescencia
(abreviadamente en lo sucesivo MFI por la expresión inglesa Mean
Fluorescence Intensity) medida por inmunofluorocitometría. El
eje X representa la concentración de los anticuerpos (\mug/ml).
T-0 = muestra de sangre completa en el minuto 0
(línea base). T-10 = sangre completa incubada sólo
con PBS durante 10 min sin E. coli. A otras muestras, con o
sin inhibidores, se les había añadido E. coli.
La Fig 7B muestra la expresión de CD11b en
neutrófilos humanos estimulada por E. coli opsonizada en un
modelo de sangre completa anti-coagulada con
lepirudina. El MAb 137-26
anti-C5/C5a (círculos negros) inhibía la expresión
de CD11b más eficazmente que un antagonista peptídico C5aR (del Dr.
Stephen Taylor) (cuadrados negros). El péptido irrelevante
(triángulos negros invertidos) no producía ese efecto. El eje Y
representa la intensidad media de fluorescencia (MFI) medida por
inmunofluorocitometría. El eje X representa la concentración de los
anticuerpos/péptido (\mug/ml). T-0 = muestra de
sangre completa en el minuto 0 (línea base). T-10 =
sangre completa incubada sólo con PBS durante 10 min sin E.
coli. A otras muestras, con o sin inhibidores, se les había
añadido E. coli.
La Fig. 7C muestra la aparición súbita
(burst) oxidante de neutrófilos humanos estimulada por E.
coli opsonizada en un modelo de sangre completa
anti-coagulada con lepirudina. Tanto el MAb
137-26 anti-C5/C5a (círculos negros)
como el MAb 137-30 anti-C5
(triángulos negros) inhibía la aparición súbita oxidante más
eficazmente que el MAb561 anti-C5a (cuadrados
negros). El anticuerpo irrelevante (triángulos negros invertidos) no
producía ese efecto. El eje Y representa la intensidad media de
fluorescencia (MFI) medida por inmunofluorocitometría. El eje X
representa la concentración de los anticuerpos (\mug/ml).
T-0 = muestra de sangre completa en el minuto 0
(línea base). T-10 = sangre completa incubada sólo
con PBS durante 10 min sin E. coli. A otras muestras, con o
sin inhibidores, se les había añadido E. coli.
La Fig. 7D muestra la aparición súbita oxidante
de neutrófilos humanos estimulada por E. coli opsonizada en
un modelo de sangre completa anti-coagulada con
lepirudina. El MAb 137-26
anti-C5/C5a inhibía más eficazmente la aparición
súbita oxidante que un antagonista peptídico C5aR (cuadrados
negros). El péptido irrelevante no producía ese efecto. El eje Y
representa la intensidad media de fluorescencia (MFI) medida por
inmunofluorocitometría. El eje X representa la concentración de los
anticuerpos en nM. T-0 = muestra de sangre completa
en el minuto 0 (línea base). T-10 = sangre completa
incubada sólo con PBS durante 10 min sin E. coli. A otras
muestras, con o sin inhibidores, se les había añadido E.
coli.
La Fig. 8 muestra la eliminación mediada por MAC
de Neisseria meningitides en un modelo de sangre completa
anti-coagulada por lepirudina. Las bacterias fueron
eliminadas eficazmente por incubación con la sangre humana completa
en presencia de MAb 137-26
anti-C5/C5a (círculos negros), un MAb irrelevante
(triángulos negros) o PBS (cuadrados blancos). En contraste, las
bacterias no fueron eliminadas cuando la sangre completa fue
tratada con MAb 137-30 anti-C5
(rombos blancos) que inhibían la activación de C5 y por consiguiente
la formación de MAC. El eje Y representa las unidades formadoras de
colonias (UFC) por 100 \mul de sangre completa incubada durante
24 horas a 37ºC en agar-sangre. El eje X representa
diferentes tiempos en la recogida de muestras de sangre en el
experimento de cultivo de sangre completa.
Los inhibidores de la invención, incluyendo el
anticuerpos monoclonal MAb 137-26, son ventajosos
con relación a los inhibidores a base de anticuerpos monoclonales
conocidos en el tratamiento de inflamación y lesión de tejidos
mediadas por el complemento. El MAb 137-26 es capaz
de unirse a C5 antes de que sea activado. A continuación es
activada la C5 formando la C5a y el anticuerpo puede neutralizar
C5a, que es una anafilatoxina. Normalmente, una vez que se ha
formado C5a, se une rápidamente a C5aR en las células,
desencadenando con ello la cascada de transducción de señales que
conduce a inflamación. El MAb 137-26 no inhibe la
escisión de C5 para formar C5a y C5b, sino que C5a permanece unida
a MAb 137-26 después de producirse e inhibe la unión
de C5a a C5aR. La formación de C5b-9 no se ve
afectada, sin embargo, y debido a que C5b-9 es
necesario para la formación del MAC, que está implicado en la
eliminación de las bacterias, es importante mantener la producción
de C5b-9 para una respuesta inmune protectora.
El MAb 137-26 puede neutralizar
eficazmente los efectos inflamatorios de C5a, e incluso permitir que
otros componentes de la cascada del complemento, incluyendo C3 y
C5b-9, medien en las funciones
anti-bacterianas. Esta propiedad farmacológica es
excepcionalmente importante en el tratamiento de la septicemia
bacteriana, las enfermedades por CI crónicas y la psoriasis.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse
utilizando el método del hibridoma descrito en primer lugar por
Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden
prepararse por métodos de DNA recombinante (Patente de EE.UU. Nº
4.816.567).
En el método del hibridoma, se inmuniza un ratón
u otro animal hospedador apropiado como se ha descrito anteriormente
para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir
anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada
para la inmunización. Los animales pueden también inmunizarse con
construcciones de DNA que expresan las proteínas codificadoras
in vivo para inducir anticuerpos específicos.
Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in
vitro. Los linfocitos que se fusionan con las células del
mieloma utilizan un agente de fusión adecuado, tal como
polietilenglicol, para formar una célula del hibridoma (Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.
59-103 (Academic Press, 1986)).
Las células del hibridoma así preparadas se
siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene
preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o
supervivencia de las células de mieloma parenterales no fusionadas.
Por ejemplo, si a las células de mieloma parenterales les falta la
enzima
hipoxantina-guanina-fosforribosilo-transferasa
(HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluiría
típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), las
cuales evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Las células de mieloma preferidas son las que se
fusionan eficazmente, soportan una producción estable de alto nivel
de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos
seleccionadas y son sensibles a un medio, tal como medio HAT. Entre
estas líneas de células de mieloma están las líneas de mieloma de
múridos, tales como las derivadas de tumores de ratón
MOPC-21 y MPC-11 proporcionadas por
The Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA,
y las células SP2/0 o X63-Ag8-653
proporcionadas por The American Type Culture Collection, Rockville,
Md. USA. También están descritas las líneas de células de mieloma
humano y heteromieloma ratón-humano para la
producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J.
Immunol. 133-3001 (1984); Brodeur et
al., Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc.,
New York, 1987)). También pueden usarse la línea de célula de
mieloma de ratón NS0 (European Collection of Cell Cultures,
Salisbury, Wiltshire UK).
Se valora la producción de anticuerpos
monoclonales dirigidos contra el antígeno del medio de cultivo en el
que se cultivan las células de hibridoma. La especificidad de unión
de los anticuerpos monoclonales producidos por las células del
hibridoma puede determinarse por inmunoprecipitación o por una
valoración in vitro de la unión, tal como radioinmunoensayo
(RIA) o ensayo inmunoenzimático (ELISA).
Después de identificar las células del hibridoma
que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o
actividad deseadas, los clones pueden subclonarse por métodos de
dilución limitante y cultivarse por métodos estándar (Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.
59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de
cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, el medio
D-MEM o PRMI-1640. Además, las
células del hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores
ascíticos en un animal.
Los anticuerpos monoclonales segregados por los
subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido
ascítico o suero por procedimientos convencionales de purificación
de inmunoglobulinas, tales como por ejemplo, proteína
A-Sepharose, cromatografía en hidroxilapatito,
electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
El DNA que codifica los anticuerpos monoclonales
se aísla y secuencia fácilmente por procedimientos convencionales
(Innis M. et al., en PCR Protocols. A Guide to Methods and
Applications, Academic, San Diego, CA (1990), Sanger, F.S.
et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 74:
5463-5467 (1977)). Las células del hibridoma sirven
como fuente de dicho DNA. Una vez aislado, el DNA puede ser
colocado en vectores de expresión, que son transfectados a
continuación a células hospedadoras, tales como células de E.
coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino
(CHO) o células del mieloma que de otra manera no producen la
proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos
monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. A
continuación se describirá con más detalle la producción
recombinante de anticuerpos.
En una realización adicional, pueden aislarse
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de colección de anticuerpos
de fagos generados usando las técnicas descritas en McCafferty,
et al., Nature 348: 552-554 (1990).
Clackson, et al., Nature 352: 624-628
(1991) y Marks, et al., J. Mol. Biol. 222:
581-597 (1991) describen el aislamiento de
anticuerpos humanos y de múridos, respectivamente, usando
colecciones de fagos. Publicaciones posteriores describen la
producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM)
por mezclamiento de las cadenas (Marks, et al.,
Bio/Tecnology 10:779-783 (1992)), así como
infección combinatoria y recombinación in vivo como
estrategia para la construcción de colecciones muy amplias de fagos
(Waterhouse, et al., Nucl. Acids. Res.
21:2265-2266 (1993)). Así, estas técnicas son
alternativas viables a las técnicas de hibridomas de anticuerpos
monoclonales tradicionales para el aislamiento de anticuerpos
monoclonales.
El DNA también puede modificarse, por ejemplo,
sustituyendo la secuencia codificadora de los dominios constantes
humanos de cadenas pesada y ligera en lugar de las secuencias de
múridos homólogas (Pat. de EE.UU. Nº 4.816.567; Morrison, et
al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)) o uniendo
covalentemente a la secuencia codificadora de la inmunoglobulina
todo o parte de la secuencia codificadora de un polipéptido no
inmunoglobulina.
Típicamente, los dominios constantes de un
anticuerpo son sustituidos por dichos polipéptidos que no son
inmunoglobulinas o son sustituidos por los dominios variables de un
sitio de un anticuerpo en el que se combina con el antígeno para
crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de
combinación con el antígeno que tiene especificidad para un
antígeno y otro sitio en de combinación con el antígeno que tiene
especificidad por un antígeno diferente.
Otra alternativa es utilizar una fusión
eléctrica en lugar de una fusión química para formar hibridomas.
Esta técnica está bien establecida. En lugar de fusión, también se
puede transformar una célula B para hacerla inmortal usando, por
ejemplo, un virus de Epstein Barr, o un gen transformante. (Véase,
por ejemplo, "Continuously Proliferating Human Cell Lines
Synhesizing Antibody of Predetermined Specificity", Zurawaki,
V.R. et al., en Monoclonal Antibodies, ed. por
Kennett R.H. et al., Plenum Press, N.Y. 1980, pp
19-33).
Un anticuerpo humanizado tiene uno o más
residuos de aminoácidos introducidos en él a partir de una fuente,
que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se
denominan con frecuencia residuos "de importación", que son
obtenidos típicamente de un dominio variable "de importación".
La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método
de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature
321:522-525 (1986); Riechmann et al.,
Nature 332:323-327 (1988); Verheyen, et
al., Science, 239:1534-1536 (1988)),
sustituyendo las secuencias correspondientes de un anticuerpo
humano por las secuencias CDR o CDR de roedores. En consecuencia, en
dichos anticuerpos "humanizados", ha sido sustituido un
dominio variable humano sustancialmente menor que el intacto por la
secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica,
los anticuerpos humanizados son anticuerpos típicamente humanos en
los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR
están sustituidos por residuos procedentes de sitios análogos en
anticuerpos de roedores.
La elección de los dominios variables humanos,
tanto ligeros como pesados, que se usan para formar los anticuerpos
humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De
acuerdo con el método denominado "mejor ajuste", se selecciona
la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor de la
colección completa de secuencias humanas de dominio variable
conocidas. A continuación se acepta la secuencia humana que esté
más próxima a la del roedor como el marco (FR) humano para el
anticuerpos humanizado (Sims et al., J. Immunol.,
151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol.,
196:901 (1987)). Otro método utiliza un marco particular derivado de
la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un
subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Puede usarse el
mismo marco para diversos anticuerpos humanizados diferentes (Carter
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);
Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).
Además es importante que los anticuerpos sean
humanizados de forma que mantengan la alta afinidad por el antígeno
y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este
objetivo, de acuerdo con un método preferido, se preparan
anticuerpos humanizados por un procedimiento de análisis de las
secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales
usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y
humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas están
fácilmente disponibles y son familiares a los expertos en la
técnica. Existen programas de ordenador que ilustran y presentan
probables estructuras conformacionales tridimensionales de
secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La
inspección de estas presentaciones permite el análisis del probable
papel de los residuos en la función de la secuencia de
inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que
influyen sobre la capacidad de la inmunoglobulina candidata a unirse
a su antígeno. De este modo, pueden seleccionarse los residuos de
FR y combinarse a partir de las secuencias receptoras y de
importación para conseguir la característica deseada del anticuerpo,
tal como mayor afinidad por el(los) antígeno(s)
diana. En general, los residuos de CDR están directamente y más
sustancialmente implicados en la unión con el antígeno.
Alternativamente, el experto puede producir
animales transgénicos (por ejemplo ratones) que sean capaces, por
inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos
humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulina.
Dichos ratones transgénicos son proporcionados por Abgenix, Inc.,
Fremont, California y Medarex, Inc., Annandale, New Jersey. Se ha
descrito que la supresión (deleción) homozigótica del gen de la
región de unión (JH) de cadena pesada del anticuerpo en ratones
mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la
inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La
transferencia de la disposición de genes de inmunoglobulina humanos
de línea germinal en dichos ratones mutantes de línea germinal dará
como resultado la producción de anticuerpos humanos por inoculación
de antígenos. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et
al., Nature 362:255-258 (1993);
Bruggermann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); y
Duchosal et al., Nature 355:258 (1992). De las
colecciones que presentan fagos también pueden derivarse
anticuerpos humanos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol.
227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.
222:581-597 (1991); Vaughan, et al.,
Nature Biotech 14:309 (1996)).
Los anticuerpos desinmunizados™ son anticuerpos
en los que han sido eliminados los epítopos potenciales del
linfocito T, como se ha descrito en la Solicitud de Patente
PCT/GB98/01473. Por consiguiente, se espera que sea eliminada o
sustancialmente reducida la inmunogenicidad en seres humanos cuando
se multiplican in vivo.
Adicionalmente, los anticuerpos pueden
modificarse químicamente por conjugación covalente a un polímero
para aumentar su semivida en circulación. Los polímeros y métodos
para unirlos a los péptidos preferidos se muestran en las Patentes
de EE.UU. N^{os} 4.766.106; 4.179.337; 4.495.255; y 4.509.546. Los
polímeros preferidos son polioles polioxietilados y
polietilenglicol (PEG). El PEG es soluble en agua a la temperatura
ambiente y tiene un peso molecular medio preferido entre 1000 y
40.000, más preferiblemente entre 2000 y 20.000, más
preferiblemente entre 3.000 y 12.000.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
ser generados por métodos de hibridoma tradicionales muy conocidos
en la técnica. En resumen, los ratones son inmunizados con C5
purificada procedente de sueros humanos como inmunógeno emulsionado
en coadyuvante completo de Freund e inyectado subcutánea e
intraperitonealmente en cantidades que varían entre
10-100 \mug. Después de 10 a 15 días, los
animales inmunizados son revacunados con más C5, emulsionado en
coadyuvante completo de Freund. A continuación los animales son
periódicamente revacunados en un programa de inmunización semanal a
bisemanal.
Para cada fusión, se prepararon suspensiones de
una sola célula a partir del bazo de un ratón inmunizado y se
usaron para fusión con células de mieloma SP2/0. Las células SP2/0
(1 x 10^{8}) y las células de bazo (1 x 10^{8}) se fusionaron
en un medio que contenía polietilenglicol al 50% (Peso molecular =
1450) (Kodak, Rochester, NY) y dimetilsulfóxido al 5% (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO). A continuación se ajustaron las
células hasta una concentración de 1,7 x 10^{5} células de bazo/ml
de la suspensión en medio DMEM (Gibco, Grand Island, NY),
complementado con suero bovino fetal al 5% y HAT (hipoxantina sódica
10 nM, aminopterina 40 \muM y timidina 1,6 mM). Se añadieron 250
\mul de la suspensión celular a cada pocillo de aproximadamente
50 microplacas de 96 pocillos. Después de aproximadamente 10 días se
retiraron los líquidos sobrenadantes del cultivo para clasificar la
reactividad con C5 humano purificado por ELISA.
Pocillos de microplacas de ensayo Immulon II
(Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) se revistieron durante una
noche con C5 humano a 0,1 \mug/ml (50 \mul/pocillo). A
continuación se saturaron los sitios de unión no específicos en los
pocillos por incubación con 200 \mul de BLOTTO al 5% (leche
desnatada en polvo) en solución salina tamponada con fosfato (PBS)
durante una hora. A continuación se lavaron los pocillos con tampón
PBST (PBS que contiene TWEEN® 20 al 0,05%). Se añadieron 50 \mul
de líquido sobrenadante de cada pocillo de fusión al pocillo
revestido junto con 50 \mul de BLOTTO durante una hora a la
temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron con PBST. A
continuación se detectaron los anticuerpos unidos por reacción con
IgG (Fc específico) anti-ratón de cabra conjugada
con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson ImmunoResearch
Laboratories, West Grove, PA) durante una hora a la temperatura
ambiente. A continuación se lavaron los pocillos con PBST. Se
añadió a los pocillos disolución de sustrato de peroxidasa que
contenía 3,3,5,5-tetrametilbencidina al 0,1%
(Sigma, St. Louis, MO) y peróxido de hidrógeno al 0,003% (Sigma, St.
Louis, MO) en acetato de sodio 0,1M a pH 6,0 para el desarrollo de
color durante 30 minutos. Se terminó la reacción por adición de 50
\mul de H_{2}SO_{4} 2M por pocillo. Se leyó la densidad
óptica (DO) a 450 nm con un lector ELISA (Dynatech Laboratories,
Chantilly, VA).
Los hibridomas en pocillos positivos a la
reactividad de C5 se clonaron en una sola célula por un método de
dilución limitante. A continuación se ampliaron los hibridomas
monoclonales y se recogieron los líquidos sobrenadantes del cultivo
para purificación por cromatografía con la proteína A. A
continuación se caracterizó la reactividad de los anticuerpos
purificados con C5 y C5a humanos por ELISA, para la determinación de
las constantes de afinidad y unión cinética por BIACORE, para los
efectos sobre la hemolisis mediada por el complemento, tanto por la
vía clásica como por la vía alternativa y para la inhibición de la
fijación de ^{125}I-C5a a neutrófilos humanos
purificados.
Los anticuerpos también pueden seleccionarse por
el método de selección o clonación (denominado panning) de
una colección de scFv humanos a los que se une C5 (Griffiths et.
al., EMBO J. 12:725-734 (1993)). La
especificidad y actividad de clones específicos pueden evaluarse
por ensayos conocidos (Griffiths et al.; Clarkson et.
al., Nature, 352: 642-648 (1991)).
Después de una primera etapa de exploración, se obtiene una
colección de fagos que contienen una pluralidad de diferentes
anticuerpos monocatenarios sobre el fago mejorando la unión al C5.
Etapas de exploración subsiguientes proporcionan más colecciones con
mayores afinidades de unión. Cuando los efectos de avidez son un
problema, pueden usarse colecciones que presentan fagos monovalentes
en las que menos del 20%, menos del 10% o menos del 1% del fago
presenta más de una copia de un anticuerpo sobre la superficie del
fago. La presentación monovalente puede realizarse con el uso de un
fagémido y un fago auxiliar. El fago adecuado incluye el fago
filamentoso M13, fl y fd. También se conoce la presentación de la
proteína de fusión con las proteínas del revestimiento del virus y
pueden usarse en esta invención.
Adicionalmente se caracterizó el MAb
137-26, que se une tanto a la C5 como a la C5a con
afinidad comparable. El MAb 137-26 no inhibe la
activación de C5, pero inhibe con gran potencia la unión de C5a a
C5aR en neutrófilo humanos purificados. Los experimentos que
demuestran estas propiedades se explican con más detalle en los
Ejemplos siguientes.
Para seleccionar anticuerpos que se unen a un
epítopo particular en el antígeno de interés (por ejemplo, los que
bloquean la unión de cualquiera de los anticuerpos descritos en la
presente memoria al C5), puede realizarse una valoración habitual
de bloqueo cruzado, tal como la descrita en Antibodies, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and
David Lane (1988). Alternativamente, puede realizarse la cartografía
del epítopo, por ejemplo como describen Champe et al., en
J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995) para
determinar si el anticuerpo se une al epítopo de interés.
Pueden aislarse o seleccionarse otras moléculas
adecuadas para uso en la invención de colecciones (quimiotecas) de
compuestos por medios convencionales, por ejemplo, determinando si
se unen a C5/C5a, y realizar a continuación una selección funcional
para determinar si inhiben la actividad de C5b. Las Patentes de
EE.UU. Nº 5.901.069 y 5.463.564 describen un sistema automatizado
para generar y seleccionar una colección de compuestos. Métodos más
centrados implican una selección competitiva frente al MAb
137-26, o realizar un modelo tridimensional del
sitio de unión y a continuación preparar una familia de moléculas
que se adaptan al modelo. Se seleccionan entonces las que presentan
características de unión óptimas. Además, pueden identificarse otras
moléculas por valoración de la competición o una selección
funcional de inhibidores con las mismas propiedades que MAb
137-26.
Las moléculas de la presente invención pueden
administrarse por cualquier vía y a una concentración que sea
terapéuticamente eficaz para la indicación o finalidad buscada. Para
conseguir este objetivo, los anticuerpos pueden formularse
empleando una variedad de excipientes aceptables conocidos en la
técnica. Típicamente, los anticuerpos se administran por inyección.
Los métodos para realizar esta administración son conocidos por los
expertos en la técnica. También puede ser posible obtener
composiciones que puedan ser administradas por vía tópica u oral, o
que puedan ser capaces de transmitirse por las membranas
mucosas.
La dosificación y modo de administración
dependerá del paciente y del agente que se va a administrar. La
dosificación puede determinarse por experimentación habitual en
ensayos clínicos o extrapolación de modelos animales en los que fue
eficaz el anticuerpo.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
usarse en el tratamiento de enfermedades y estados mediados por la
producción excesiva o no controlada de C5a. A continuación se
describe la prueba de la utilidad de los inhibidores de la
invención en el tratamiento de estas enfermedades y estados.
Se analizó la reactividad de MAb
137-26 con C5 y C5a recombinante humanas purificadas
(Sigma, St. Louis, MO). Los procedimientos del ELISA se
describieron anteriormente. MAb 137-26 se une a C5a
de manera dependiente de la dosis con gran potencia (Fig. 1). Otro
MAb 137-76 anti-C5, específico de la
cadena \beta de C5 humano, no se une a C5a, debido a que C5a
reside en la cadena \alpha de C5. Un anticuerpo irrelevante de
isotipo similar usado como control negativo tampoco reacciona con
C5a. Por otro lado, tanto MAb 137-26 como MAb
137-76 se unen a C5 (Fig. 2).
La constante de equilibrio de afinidad y las
constantes cinéticas de unión (asociación y disociación) de MAb
137-26 con C5a y C5 se determinaron también por un
instrumento BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden).
Todas las medidas de unión se realizaron en solución salina
tamponada de HEPES (HBS) (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA
3,4 mM, Tensioactivo P20 al 0,005%) a 25ºC. Para medir las
constantes del índice de unión de C5 y C5a a MAb
137-26, se inmovilizaron anticuerpos IgG(Fc)
anti-ratón de conejo en un chip sensor CM5 por
acoplamiento amínico usando N-hidroxisuccínico y
N-etil-N'-(3-dietilaminopropil)carbodiimida.
A continuación el chip sensor recubierto capturó MAb
137-26 antes de la inyección de C5 a concentraciones
diferentes. Los datos se resumen en la Tabla 1. El MAb
137-26 tiene una alta afinidad de unión tanto para
la C5a como para la C5 en solución. Los resultados también indican
que MAb 137-26 se une a un epítopo compartido tanto
por C5a como por C5.
Para estudiar los efectos de MAb
137-26 sobre la activación de C5 en suero humano, se
analizó el anticuerpo para determinar la inhibición de la hemolisis
mediada por las vías clásica y alternativa del complemento.
Para los experimentos por la vía clásica, se
sensibilizaron eritrocitos de pollo (5 x 10^{7} células/ml) en
solución salina tamponada de gelatina/veronal (GVB^{++}) que
contenía MgCl_{2} 0,5 mM y CaCl_{2} 0,15 mM con
inmunoglobulinas purificadas de eritrocitos
anti-pollo de conejo a 8 \mug/ml
(Inter-Cell Technologies, Hoperwell, NJ) durante 15
minutos a 4ºC. A continuación se lavaron las células con GVB^{++}.
Las células lavadas se volvieron a poner en suspensión en el mismo
tampón a 1,7 x 10^{8} células/ml. En cada pocillo de una
microplaca de fondo redondo de 96 pocillos, se mezclaron 50 \mul
de suero humano normal (5,2%) con 50 \mul de GVB^{++} de MAb
137-26 diluido en serie o un MAb
175-62 anti-C2 como control
positivo. A continuación se añadieron a los pocillos que contenían
las mezclas 30 \mul de la suspensión de eritrocitos de pollo
sensibilizados y lavados. Se mezclaron 50 \mul de suero humano
normal (5,2%) con 80 \mul de GVB^{++} para obtener el fondo de
color del suero. Como control negativo se empleó un MAb
anti-VIH-1 gp 120 de isotipo
similar. La concentración final en el suero humano usada fue 2%. Se
incubó la mezcla a 37ºC durante 30 minutos. Se agitó la placa en un
microagitador de placas durante 15 segundos. A continuación se
centrifugó la placa a 300 x g durante 3 minutos. Se recogieron los
líquidos sobrenadantes (80 \mul) y se transfirieron a pocillos de
una microplaca de fondo plano de 96 pocillos para medir la DO a 405
nm por un lector de placas ELISA. El porcentaje de inhibición de la
hemolisis se define como:
La Fig. 3 muestra que MAb 137-26
y el MAb G3-519 control irrelevante no inhiben la
hemolisis por la vía clásica de eritrocitos de pollo
sensibilizados, mientras que el control positivo, MAb
175-62, inhibe eficazmente la hemolisis. La C2 está
implicada específicamente en la vía clásica del complemento.
Para la vía alternativa, se lavaron tres veces
eritrocitos de conejo no sensibilizados con solución salina
tamponada de gelatina/veronal (GVB/Mg-EGTA) que
contenía MgCl_{2} 2mM y EGTA 1,6 mM. Se usó EGTA a una
concentración de 10 mM para inhibir la vía clásica (K. Whaley et
al., en A.W. Dodds (Ed.), Complement: A Practical
Approach. Oxford University Press, Oxford, 1997, pp
19-47). Los procedimientos de valoración son
similares a los de la valoración de la hemolisis por la vía clásica
antes descritos. La concentración final del suero humano utilizado
en la valoración era del 10%. Se usó MAb 166-32
anti-factor D como control positivo. Como control
negativo se uso el mismo MAb
anti-VIH-1 gp 120 irrelevante del
mismo isotipo antes descrito.
La Fig. 4 muestra que MAb 137-26
no inhibe la hemolisis por la vía alternativa de eritrocitos de
conejo no sensibilizados, mientras que el MAb
166-32 anti-factor D inhibe
fuertemente la hemolisis. El factor D es específico para la vía
alternativa del complemento. El anticuerpo control negativo no
produce ningún efecto.
Considerados juntos, los resultados verifican
que MAb 137-26 no inhibe la activación de C5 y por
consiguiente no es inhibida la formación de C5a y
C5b-9. el MAb-137-26
no inhibe la activación de las vías clásica y alternativa del
complemento.
Se purificaron neutrófilos humanos a partir de
sangre completa humana y se diluyeron con Dextran
T-500/solución salina. La mezcla se incubó a la
temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos o hasta que
apareció una capa superficial claramente definida. Esta capa
superficial se transfirió a un tubo de centrífuga de polipropileno
de 50 ml. Después de la centrifugación, el sedimento celular se puso
en suspensión en 30 ml de PBSB frío (BSA al 1% en PBS). La
suspensión celular se extendió en capas sobre la parte superior de
10 ml de Histopaque-1077 (Sigma, St. Louis, MO) en
un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml. Después de otra
centrifugación, el sedimento celular se volvió a poner en
suspensión en 20 ml de NaCl al 0,2% frío durante 30 segundos para
lisar los eritrocitos. A continuación, se añadieron 20 ml de NaCl al
1,6% frío a la suspensión celular, se volvió a centrifugar y a
continuación se volvieron a poner en suspensión los neutrófilos en
PBSB. Se mantuvieron los neutrófilos en hielo hasta que se
utilizaron para la unión ^{125}I-C5a.
El MAb 137-26 se diluyó en serie
en tubos de centrífuga Eppendorf de 1,5 ml con un tampón de unión
(medio BSA al 1% en RPMI1640) obteniendo concentraciones finales
que variaban de 640 nM a 0,04 nM. Se añadieron 4 \mul de
^{125}I-C5a 4 nM (NEN Life Science Products, Inc.,
Boston, MA) a 36 \mul de MAb 137-26 diluido para
incubación a la temperatura ambiente durante 15 minutos. Como
control positivo se usó C5a humana recombinante purificada (Sigma,
St. Louis, MO), mientras que como control negativo se usó anticuerpo
monoclonal irrelevante de isotipo similar. Para la unión máxima de
^{125}I-C5a, se usaron en cambio 36 \mul del
tampón de unión sin los anticuerpos o C5a. Para incubación en hielo
se añadieron a cada tubo 50 \mul de la suspensión de neutrófilos.
Al final de un periodo de incubación de 40 minutos, se transfirió la
mezcla de cada tubo a la parte superior de un otro tubo Eppendorf
que contenía 800 \mul de un tampón de separación (BSA al 6% en
PBS). A continuación se centrifugaron los tubos a 2000 x g durante 3
minutos a la temperatura ambiente. Después que se aspiró el líquido
sobrenadante, el sedimento celular se volvió a poner en suspensión
en 0,5 ml de agua desionizada para lisar las células. A
continuación se mezcló el lisado celular con 3 ml de fluido de
centelleo Ulmina Gold (Packard Instrument, Meriden, CT) para
recuento radiactivo.
El porcentaje de inhibición de la unión de
^{125}I-C5a se define como:
[Cpm_{max} - Cpm_{fondo}]
- [Cpm_{ac} - Cpm_{fondo}] \ x \
100
en
donde:
Cpm_{max} = recuento máximo por minuto sin
agentes competidores;
Cpm_{fondo} = recuento máximo del fondo sin
adición de ^{125}I-C5a; y
Cpm_{ac} = recuento máximo con agentes
competidores.
La Fig. 5 muestra la inhibición de la unión de
(^{125}I)-C5a humana radioyodada a neutrófilos
humanos purificados. El MAb 137-26 es más potente
que la C5a no marcada para inhibir la unión de
^{125}I-C5a a neutrófilos humanos purificados. La
dosis para inhibir el 50% (DI_{50}) para el MAb
137-26 fue 0,45 nM en comparación con C5a 30
nM.
El epítopo de unión del MAb
137-26 a la C5a humana se cartografió por una
técnica que usaba péptidos SPOT sintetizados por Sigma Genosys (The
Woodlands, TX). Se sintetizaron péptidos solapantes
(12-mero) que abarcan la C5a humana completa sobre
una membrana de celulosa. En la misma valoración, se trató en primer
lugar la membrana con una solución de bloqueo TBSTB
(Tris-cloruro 10 mM, cloruro de sodio 250 mM,
albúmina de suero bovino al 1% y TWEEN 20 al 0,05%) durante 1 hora
a la temperatura ambiente para saturar todos los sitios de unión no
específicos. A continuación se añadió MAb 136-26 a 1
\mug/ml en la solución de bloqueo a la membrana durante 1 hora a
la temperatura ambiente. A continuación se lavó completamente la
membrana con un tampón de lavado TBST (Tris-cloruro
10 mM, cloruro de sodio 250 mM y TWEEN® 20 al 0,05%). A continuación
se trató la membrana con anticuerpo IgG (Fc)
anti-ratón de cabra conjugado con HRP (diluido
1:5.000 en el tampón de bloqueo) (Jackson Immunoresearch, West
Grove, PA) durante 1 hora a la temperatura ambiente. La membrana se
lavó de nuevo. La unión de MAb 137-26 a cada uno de
los péptidos SPOT de C5a se detectó por incubación con sustrato
quimioluminiscente Supersignal West Pico (Pierce, Rockford, IL). La
intensidad de la quimioluminiscencia se detectó a continuación por
exposición a una película Kodak X-OMAT AR
(Rochester, NY). La Figura 6 muestra la secuencia del epítopo unido
por MAb 137-26.
Para investigar el papel del complemento en el
retículo inflamatorio complejo, necesitan estar presentes todos los
potenciales mediadores celulares de la fase fluida y por
consiguiente poder interactuar simultáneamente. Para idear dicho
estado experimental in vitro, se utilizó sangre completa
humana. En este modelo, se usó como anticoagulante lepirudina
(REFLUDAN®), un análogo de hirudina específico de la trombina, en
lugar de heparina. Igual que la heparina, la lepirudina no
interfiere con la activación del complemento.
En este sistema modelo, el MAb
137-26 bloqueó los efectos inflamatorios de la C5a
formada como resultado de la activación del complemento por E.
coli. El anticuerpo no inhibía la eliminación de N.
meningitidis mediada por MAC. Por consiguiente, el MAb
137-26 neutraliza C5a sin inhibir la activación de
C5 y la formación subsiguiente de MAC. Esto es un aspecto
importante de los anticuerpos monoclonales de la presente
invención.
Se recogió sangre completa en tubos de
polipropileno que contenían lepirudina (50 \mug/ml). La sangre
completa anticoagulada se incubó previamente con PBS o inhibidores
anti-C5 durante 4 minutos a 37ºC. Para los estudios
de la expresión de CD11b y la aparición súbita oxidante en los
neutrófilos, se añadió la cepa de E. coli opsonizada LE392
(ATCC 33572) a las muestras de sangre completa durante 10 minutos a
37ºC. La concentración de E. coli era 1 x 10^{7}/ml de
sangre en los experimentos de CD11b y 1 x 10^{8}/ml en los
experimentos de la aparición súbita oxidante. Se trató
inmediatamente la muestra en la línea base T-0.
Después de incubación, se utilizaron 100 \mul de las muestras
para medir la expresión de CD11b en neutrófilos por
inmunofluorocitometría. La aparición súbita oxidante de los
neutrófilos activados se midió usando el sustrato
dihidro-rodamina 123 y procediendo como se ha
descrito en el método de ensayo de aparición súbita (ORPEGEN Pharma,
Heidelberg, Germany).
Las figuras 7A - 7D representan los resultados
del las valoraciones por citometría de flujo de la activación de
neutrófilos para la expresión de CD11b y la aparición súbita. El MAb
137-26 anti-C5/C5a inhibía
eficazmente la activación de neutrófilos inducida por E.
coli en el modelo de inflamación con sangre completa humana. En
estas valoraciones, el MAb 137-26 es más potente que
el Mab561 anti-C5a (Dr. Jurg Kohl) y un antagonista
C5aR peptídico (Dr. Stephen Taylor).
Para las valoraciones bactericidas, se cultivó
N. meningitidis H44/76-1 durante una noche
sobre BHI-agar, se subcultivó y se desarrolló en
fase logarítmica durante 4 horas. Se añadieron 5000 - 10000 unidades
formadoras de colonias (UFC) a 1,1 ml de muestras de sangre
completa anti-coagulada con lepirudina incubadas
previamente durante 5 minutos con PBS o anticuerpo. En cada periodo
de tiempo, se sembraron 100 \mul de sangre completa sobre placas
microbiológicas de Petri que contenían agar con sangre y se
incubaron durante 24 horas a 37ºC. El desarrollo bacteriano se
expresó como UFC/100 \mul de sangre completa añadida. Se obtuvo la
muestra T-0 inmediatamente después de añadir la
bacteria.
La Fig. 8 muestra que el MAb
137-26 no inhibía la supresión de Neisseria
meningitidis mediada por MAC. En contraste, el MAb
137-30 inhibía la supresión de Neisseria
meningitidis por la sangre completa humana. Este anticuerpo
inhibe la activación de C5.
<110> TANOX, INC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> INHIBIDORES DE LA VÍA DEL
COMPLEMENTO QUE SE UNEN A C5 Y C5a SIN IMPEDIR LA FORMACIÓN DE
C5b
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<130> P26272EP-PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP02768574.2
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 17 de agosto de 2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US60313137
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 17 de agosto de 2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
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<222> (1) .. (74)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de C5a humana desde el aa
29 hasta el aa 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de C5a humana desde el aa
32 hasta el aa 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de C5a humana desde el aa
35 hasta el aa 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragmento de C5a humana desde el aa
29 hasta el aa 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de C5a humana desde el aa
32 hasta el aa 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile Lys Ala Phe
Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de C5a humana desde el aa
35 hasta el aa 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Arg Cys Ile Lys Ala Phe Thr Glu Cys
Cys}
Claims (23)
1. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos que se
une al C5 y C5a, pero no evita la activación de C5 ni evita la
formación ni inhibe la actividad de C5b.
2. Un anticuerpo o fragmento de acuerdo con la
reivindicación 1, que se une a C5a libre con igual o mejor afinidad
que a C5.
3. Un anticuerpo o fragmento de acuerdo con la
reivindicación 1, que inhibe la unión de C5a a C5aR.
4. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos que se
une al mismo epítopo de C5 que el anticuerpo monoclonal
137-26 que se produce a partir del hibridoma
depositado en ATCC y denominado PTA-3650.
5. Un anticuerpo o fragmento de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo
es un anticuerpo monoclonal.
6. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se selecciona del
grupo que consiste en Fab, F(ab')_{2}, Fv y Fv
monocatenario.
7. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que el anticuerpo es un anticuerpo
quimérico, un anticuerpo en el que han sido eliminados los epítopos
potenciales de los linfocitos T, un anticuerpo humanizado o un
anticuerpo humano.
8. El anticuerpo monoclonal
137-26 producido a partir del hibridoma depositado
en ATCC y denominado PTA-3650.
9. La línea celular del hibridoma que se cita en
la reivindicación 8.
10. Una composición farmacéutica que comprende
el anticuerpo o fragmento de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, el fragmento de acuerdo con la
reivindicación 6 o el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7
u 8, y un vehículo, excipiente, estabilizador o diluyente
farmacológicamente aceptable.
11. El uso del anticuerpo o fragmento de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la preparación
de un medicamento para inhibir la actividad de C5a.
12. El uso del anticuerpo o fragmento de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la fabricación
de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o estado que
está mediado por la producción excesiva o no controlada de C5a.
13. El uso de acuerdo con la reivindicación 11 ó
12, en el que el medicamento ha de administrarse por infusión
intravenosa, inyección intravenosa rápida, intraperitoneal,
intradérmica, intramuscular, subcutánea, intranasal, intratraqueal,
intraespinal, intracraneal o por vía oral.
14. El uso de acuerdo con la reivindicación 12,
en el que la enfermedad o estado es el síndrome de dificultad
respiratoria aguda (ARDS).
15. El uso de acuerdo con la reivindicación 12,
en el que la enfermedad o estados es lesión por isquemia
miocárdica-reperfusión.
16. El uso de acuerdo con la reivindicación 12,
en el que la enfermedad o estado es septicemia.
17. El uso de acuerdo con la reivindicación 12,
en el que la enfermedad o estado es una enfermedad autoinmune.
18. El uso de acuerdo con la reivindicación 17,
en el que la enfermedad autoinmune es artritis reumatoidea, lupus
eritematoso sistémico o psoriasis.
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 12,
en el que la enfermedad o estado es lesión de los tejidos o una
respuesta inflamatoria inducida por complejos inmunes (IC).
20. Un método de diagnóstico que comprende
detectar la cantidad de C5 o C5a que está presente en una muestra
con el anticuerpo o fragmento de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8.
21. El método de diagnóstico de la
reivindicación 20, en el que el anticuerpo es el anticuerpo
monoclonal 137-26 que se produce a partir del
hibridoma depositado en ATCC y denominado
PTA-3650.
22. Un procedimiento ex vivo para
identificar un inhibidor que se une a C5 y C5a, pero no evita la
activación de C5 ni evita la formación ni inhibe la actividad de
C5b, comprendiendo dicho procedimiento:
- (i)
- determinar si un compuesto se une a C5 y C5a; y
- (ii)
- determinar si el compuesto de ensayo inhibe la actividad de C5b.
23. Un procedimiento para preparar una
composición farmacéutica que comprende el procedimiento de la
reivindicación 22 y además combinar el compuesto de ensayo con un
vehículo, excipiente, estabilizador o diluyente.
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