ES2613352T3 - Unidades estructurales de unión anti-C5a con actividad bloqueadora alta - Google Patents

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Abstract

Una unidad estructural de unión que se une a un epítopo conformacional formado por las secuencias de aminoácidos NDETCEQRA (SEQ ID NO: 2) y SHKDMQL (SEQ ID NO: 3) de C5a, en donde la unidad estructural de unión se une a al menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 y a al menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3; en donde dicha unidad estructural de unión tiene una constante de unión a C5a con un valor de Kd de 10 nM o menos y exhibe al menos 80% de actividad de bloqueo para un efecto biológico inducido por C5a; y en donde dicha estructural de unión se selecciona del grupo que consiste en: (a) anticuerpos o fragmentos de los mismos de unión al antígeno; y (b) proteínas similares al anticuerpo, en donde dichas proteínas similares al anticuerpos se seleccionan del grupo que consiste en aficuerpos, anticalinas, y proteínas diseñadas de repeticiones de anquirina.

Description

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Los métodos para humanización de anticuerpos explicados anteriormente son preferidos cuando se generan anticuerpos humanizados que se unen específicamente a los epítopos conformacionales descritos en la presente memoria. No obstante, la presente invención no se limita a los métodos antes mencionados para humanización de anticuerpos.
Algunos de los métodos de humanización antes mencionados pueden realizarse sin información sobre las secuencias de FR en el anticuerpo donante, concretamente el "método de FR fijo" (una variante del injerto de CDR), superhumanización, transposición del marco y humanización de anticuerpos. Las variaciones del "método de FR fijo" fueron llevadas a cabo con éxito por Qin y colaboradores, 2007 y Chang y colaboradores, 2007. En particular, Qin y colaboradores construyeron un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada humana en la que las tres regiones CDR fueron reemplazadas por péptidos antigénicos, que se derivaron de las secuencias de CDR de un anticuerpo murino. Chang y colaboradores continuaron estos experimentos y construyeron un fragmento scFv, en el que todas las CDR de la parte VH y CDR3 de la parte VL fueron reemplazadas por péptidos antigénicos, que se derivaron de las secuencias de CDR de un anticuerpo murino.
Tal como se usa en la presente memoria, los "anticuerpos humanos" incluyen anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo). Los anticuerpos humanos de la invención incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describe por ejemplo en la patente estadounidense No. 5.939.598 de Kucherlapati y Jakobovits.
El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Un anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular. En una realización, los anticuerpos monoclonales se producen mediante un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano, por ejemplo ratón, fusionado a una célula inmortalizada.
El término "anticuerpo recombinante", tal como se utiliza aquí, incluye todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico con respecto a los genes de inmunoglobulina o un hibridoma preparado a partir de los mismos, (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados a partir de una biblioteca combinatoria recombinante de anticuerpos, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina a otras secuencias de ADN.
El término "transfectoma", tal como se usa en la presente memoria, incluye células huésped eucariotas recombinantes que expresan un anticuerpo, tales como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HEK293T, células vegetales u hongos, incluyendo células de levadura.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un "anticuerpo heterólogo" se define en relación con un organismo transgénico que produce tal anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos
o una secuencia de ácido nucleico codificante correspondiente a la encontrada en un organismo que no consiste en un organismo transgénico, y que generalmente se deriva de una especie distinta del organismo transgénico.
Como se usa en la presente memoria, un "anticuerpo heterohíbrido" se refiere a un anticuerpo que tiene cadenas ligera y pesada de diferentes orígenes de organismos diferentes. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una cadena pesada humana asociada con una cadena ligera de murino es un anticuerpo heterohíbrido.
Por lo tanto, "anticuerpos y fragmentos de los mismos de unión al antígeno" adecuados para uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpo policlonales, monoclonales, monovalentes, biespecíficos, heteroconjugados, multiespecíficos, recombinantes, heterólogos, heterohíbridos, quiméricos, humanizados (en particular injertados a CDR), desinmunizados, o humanos, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, Fd, Fv, Fv unidos a disulfuro (dsFv), anticuerpos de una sola cadena (por ejemplo, ScFv), diacuerpos o tetracuerpos (Holliger P. y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (14), 64446448), nanocuerpos (también conocidos como anticuerpos de un solo dominio), anticuerpos antiidiotípicos (anti-id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-id a anticuerpos de la invención), y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores.
Los anticuerpos descritos en la presente memoria están preferiblemente aislados. Un "anticuerpo aislado" tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a C5a está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de C5a). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de C5a humana puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo de otras especies (por ejemplo, homólogos de especies C5a,
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tales como C5a de rata). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos. En una realización de la invención, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" se refiere a anticuerpos que tienen diferentes especificidades y que se combinan en una composición bien definida.
El término "de origen natural", tal como se usa en la presente memoria, aplicado a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o de polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede ser aislada de una fuente en la naturaleza y que no ha sido intencionalmente modificada por el hombre en el laboratorio, es de origen natural.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "proteína similar a un anticuerpo" se refiere a una proteína que ha sido modificada genéticamente (por ejemplo por mutagénesis de bucles) para unirse específicamente a una molécula objetivo. Típicamente, tal proteína similar a un anticuerpo comprende al menos un bucle peptídico variable unido en ambos extremos a un andamiaje de proteína. Esta doble restricción estructural aumenta en gran medida la afinidad de unión de la proteína similar a anticuerpo a niveles comparables a los de un anticuerpo. La longitud del bucle peptídico variable típicamente consiste en 10 a 20 aminoácidos. La proteína de andamiaje puede ser cualquier proteína que tenga buenas propiedades de solubilidad. Preferiblemente, la proteína de andamiaje es una proteína globular pequeña. Las proteínas similares a anticuerpos incluyen, sin limitación, aficuerpos, anticalinas y proteínas diseñadas de repeticiones de anquirina (para revisión véase: Binz HK y colaboradores (2005). Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains. Nat. Biotechnol. 23 (10): 1257-1268). Las proteínas similares a anticuerpos pueden derivarse de grandes bibliotecas de mutantes, por ejemplo, se pueden extraer de grandes bibliotecas de expresión en fagos y se pueden aislar en analogía con anticuerpos regulares. También, se pueden obtener proteínas de unión similares a anticuerpos mediante mutagénesis combinatoria de residuos expuestos de la superficie en proteínas globulares. Las proteínas similares a anticuerpos se denominan a veces "aptámeros peptídicos".
Las "sustituciones conservadoras" pueden hacerse, por ejemplo, con base en la similitud en polaridad, carga, tamaño, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o naturaleza anfipática de los residuos de aminoácidos implicados. Los aminoácidos pueden agruparse en los siguientes seis grupos de aminoácidos estándar:
(1)
hidrófobo: Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2)
hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3)
ácido: Asp, Glu;
(4)
básico: His, Lys, Arg;
(5)
residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y
(6)
aromático: Trp, Tyr, Phe.
Como se usa en la presente memoria, las "sustituciones conservadoras" se definen como intercambios de un aminoácido por otro aminoácido listado dentro del mismo grupo de los seis grupos de aminoácidos estándar mostrados anteriormente. Por ejemplo, el intercambio de Asp por Glu retiene una carga negativa en el polipéptido así modificado. Además, la glicina y la prolina pueden sustituirse entre sí con base en su capacidad para interrumpir las hélices α. Algunas sustituciones conservadoras preferidas dentro de los seis grupos anteriores son intercambios dentro de los siguientes subgrupos: (i) Ala, Val, Leu e Ile; (ii) Ser y Thr; (iii) Asn y Gln; (iv) Lys y Arg; y (v) Tyr y Phe. Dado el conocimiento del código genético y las técnicas de ADN recombinante y sintético, el experto en la materia puede fácilmente construir ADN que codifiquen las variantes conservadoras de aminoácidos.
Tal como se usa en la presente memoria, las "sustituciones no conservadoras" o "intercambios no conservadores de aminoácidos" se definen como intercambios de un aminoácido por otro aminoácido listado en un grupo diferente de los seis grupos de aminoácidos estándar (1) a (6) mostrados anteriormente.
Una "actividad biológica" tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier actividad que un polipéptido pueda exhibir, incluyendo sin limitación: actividad enzimática; actividad de unión a otro compuesto (por ejemplo, unión a otro polipéptido, en particular unión a un receptor, o unión a un ácido nucleico); actividad inhibidora (por ejemplo actividad inhibidora de la enzima); actividad activadora (por ejemplo actividad activadora de enzimas); o efectos tóxicos. Con respecto a las variantes y derivados de un polipéptido, no se requiere que la variante o derivado exhiba tal actividad en la misma extensión que el polipéptido progenitor. Una variante se considera como una variante dentro del contexto de la presente solicitud, si exhibe la actividad relevante hasta un grado de al menos 10% de la actividad del polipéptido progenitor. Del mismo modo, un derivado se considera como un derivado dentro del contexto de la presente solicitud, si exhibe la actividad biológica relevante hasta un grado de al menos 10% de la actividad del polipéptido progenitor. La "actividad biológica" relevante en el contexto de la presente invención es una actividad de unión a un epítopo conformacional de C5a humana formado por las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3. Preferiblemente, la "actividad biológica" relevante en el contexto de la presente invención es una actividad de unión a un epítopo conformacional de C5a humana formado por las secuencias de aminoácidos DETCEQR (SEQ ID NO: 4) y KDM. Los ensayos para determinar la actividad de unión son conocidos por una persona experta en la técnica e incluyen ELISA tales como el descrito en la sección de Ejemplos.
Como se usa en la presente memoria, un "paciente" significa cualquier mamífero o ave que pueda beneficiarse de un tratamiento con la unidad estructural de unión al objetivo descrita en el presente documento. Preferiblemente, un
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"paciente" se selecciona del grupo que consiste en animales de laboratorio (por ejemplo, ratón o rata), animales domésticos (incluyendo, por ejemplo, conejillo de indias, conejo, pollo, pavo, cerdo, oveja, cabra, camello, vaca, caballo, asno, gato o perro), o primates incluyendo chimpancés y seres humanos. Se prefiere particularmente que el "paciente" sea un ser humano.
De acuerdo con el American College of Chest Physicians y la Society of Critical Care Medicine (Bone RC y colaboradores, 1992), "Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine". Chest 101 (6): 1644-55)), hay diferentes niveles de sepsis:
Síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS): Definido por la presencia de dos o más de los siguientes hallazgos:
-Temperatura corporal <36°C (97°F) o > 38°C (hipotermia o fiebre). -Frecuencia cardíaca > 100 latidos por minuto (taquicardia). -Frecuencia respiratoria > 20 respiraciones por minuto o, en gas de la sangre, una Pa de CO2 menor de 32 mm Hg (4,3 kPa) (taquipnea o hipocapnia por hiperventilación). -Recuento de glóbulos blancos < 4.000 células/mm3 o > 12.000 células/mm3 (< 4 x 109 o 12 x 109 células/L), o mayor de 10% de formas de bandas (glóbulos blancos inmaduros) (Leucopenia, leucocitosis o bandemia).
Sepsis: Se define como SIRS en respuesta a un proceso infeccioso confirmado. Se puede sospechar o probar la infección (por cultivo, tinción o reacción en cadena de la polimerasa (PCR)), o un síndrome clínico patognomónico para la infección. La evidencia específica de la infección incluye los glóbulos blancos (WBC) en fluidos normalmente estériles (como la orina o el líquido cefalorraquídeo (CSF), la evidencia de una víscera perforada (aire libre en la radiografía abdominal o tomografía computarizada, signos de peritonitis aguda), rayos X anormales del pecho (CXR) consistente con neumonía (con opacificación focal), o petequias, púrpura o púrpura fulminante.
Sepsis severa: Se define como sepsis con disfunción orgánica, hipoperfusión o hipotensión.
Choque séptico: Se define como sepsis con hipotensión arterial refractaria o anomalías de hipoperfusión a pesar de una reanimación con fluido adecuada. Los signos de hipoperfusión sistémica pueden ser o bien disfunción de órganos terminales o lactato sérico mayor de 4 mmol/dL. Otros signos incluyen oliguria y alteración del estado mental. Los pacientes se definen por tener shock séptico si tienen sepsis más hipotensión después de la resucitación agresiva del fluido (típicamente más de 6 litros o 40 mL/kg de cristaloide).
Por "tumor" se entiende un grupo anormal de células o tejido que crece por medio de una proliferación celular rápida no controlada y continúa creciendo después de que cesen los estímulos que iniciaron el nuevo crecimiento. Los tumores muestran parcial o total falta de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal, y por lo general forman una masa distinta de tejido, que puede ser benigno o maligno.
Por "metástasis" se entiende la diseminación de células cancerosas desde su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende del desprendimiento de células malignas del tumor primario, la invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas basales endoteliales para entrar en la cavidad corporal y los vasos sanguíneos, y luego, después de ser transportadas por la sangre, la infiltración de los órganos objetivo. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor en el sitio objetivo depende de la angiogénesis. La metástasis tumoral a menudo ocurre incluso después de la extirpación del tumor primario porque las células tumorales o componentes pueden permanecer y desarrollar potencial metastásico. En una realización, el término "metástasis" de acuerdo con la invención se refiere a "metástasis a distancia" que se refiere a una metástasis que está alejada del tumor primario y del sistema de ganglios linfáticos regionales.
Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, "tratar", "creación" o "tratamiento" de una enfermedad o trastorno significa lograr uno o más de lo siguiente: (a) reducción de la gravedad y/o duración del trastorno; (b) limitar o prevenir el desarrollo de síntomas característicos del trastorno o los trastornos que están siendo tratados; (c) inhibición del empeoramiento de los síntomas característicos del trastorno o los trastornos que están siendo tratados; (d) limitar o prevenir la recurrencia del trastorno o los trastornos en pacientes que han tenido previamente el trastorno o los trastornos; y (e) limitar o prevenir la recurrencia de los síntomas en pacientes que anteriormente eran sintomáticos para el trastorno o los trastornos.
Tal como se usa en la presente memoria, "prevenir", "que previene", "prevención" o "profilaxis" de una enfermedad o trastorno significa impedir que se produzca un trastorno en el sujeto.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la "administración" incluye la administración in vivo, así como la administración directamente al tejido ex vivo, tal como injertos de venas.
Una "cantidad eficaz" es una cantidad de un agente terapéutico suficiente para lograr el propósito pretendido. La cantidad eficaz de un agente terapéutico determinado variará con factores tales como la naturaleza del agente, la vía de
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administración, el tamaño y la especie del animal para recibir el agente terapéutico, y el propósito de la administración. La cantidad eficaz en cada caso individual puede ser determinada empíricamente por un experto en la técnica según métodos establecidos en la técnica.
"Farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por un organismo regulador del gobierno federal o estatal o listado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en seres humanos.
El término "portador", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como soluciones salinas en agua y aceites, incluyendo los de petróleo, origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Una solución salina es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra en forma intravenosa. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada seca, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, puede contener también cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes reguladores de pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos. Los compuestos de la invención se pueden formular como formas neutras o de sales. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos amino libres tales como los derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y los formados con grupos carboxilo libres tales como los derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por EW Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador para proporcionar la forma para la administración apropiada al paciente. La formulación debe adecuarse al modo de administración.
Los métodos generalmente conocidos y practicados en los campos de biología molecular, biología celular, química de proteínas y técnicas de anticuerpos se describen completamente en las publicaciones actualizadas continuamente "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Sambrook y colaboradores, Cold Spring Harbor); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel y colaboradores, Eds., Wiley & Sons); Current Protocols in Protein Science (J. E. Colligan y colaboradores eds., Wiley & Sons); Current Protocols in Cell Biology (J.S. Bonifacino y col., Wiley & Sons) y Current Protocols in Immunology (J. E. Colligan y colaboradores, Eds., Wiley & Sons). Se describen técnicas conocidas relacionadas con cultivo y los medios celulares en "Large Scale Mammalian Cell Culture" (Hu y colaboradores, Curr. Opin., Biotechnol., 8: 148, 1997), "Serum free Media" (K. Kitano, Biotechnol. 17:73, 1991) y "Suspension Culture of Mammalian Cells" (Birch y colaboradores, Bioprocess Technol. 19: 251, 1990).
Realizaciones de la invención
La presente invención se describirá ahora con más detalle. En los pasajes siguientes se definen diferentes aspectos de la invención con más detalle. Cada aspecto así definido puede ser combinado con cualquier otro aspecto o aspectos a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada como preferida o ventajosa puede combinarse con cualquier otra característica o características indicadas como preferidas o ventajosas.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una unidad estructural de unión que se une a un epítopo conformacional formado por las secuencias de aminoácidos NDETCEQRA (SEQ ID NO: 2) y SHKDMQL (SEQ ID NO: 3) de C5a, (secuencias de Homo sapiens y Pan troglodytes) en donde la unidad estructural de unión se une al menos a un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 y con al menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3; en donde dicha unidad estructural de unión tiene una constante de unión con C5a con un valor de Kd de 10 nM o menor y exhibe al menos 80% de actividad de bloqueo para un efecto biológico inducido por C5a; y en donde dicha unidad estructural de unión se selecciona del grupo que consiste de: (a) anticuerpos o fragmentos de los mismos de unión al antígeno; y (b) proteínas similares al anticuerpo, en donde dichas proteínas similares al anticuerpo se seleccionan del grupo que consiste de aficuerpos, anticalinas, y proteínas diseñadas de repeticiones de anquirina.
En realizaciones preferidas del primer aspecto, la unidad estructural de unión se une a al menos un aminoácido de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con DETCEQR (SEQ ID NO: 4).
En realizaciones preferidas del primer aspecto, la unidad estructural de unión se une a al menos un aminoácido de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con HKDMQ (SEQ ID NO: 5), preferiblemente KDM.
En realizaciones particularmente preferidas del primer aspecto, la C5a es C5a humana. Por lo tanto, se prefiere que la unidad estructural de unión se una a un epítopo conformacional formado por los aminoácidos NDETCEQRA (SEQ ID
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NO: 2) y SHKDMQL (SEQ ID NO: 3) de C5a humana. En otras palabras, una unidad estructural de unión de acuerdo con esta realización preferida del primer aspecto se une al mismo tiempo a al menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 y a al menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3. La SEQ ID NO: 2 corresponde a los aminoácidos 30-38 de C5a humana. La SEQ ID NO: 3 corresponde a los aminoácidos 66-72 de C5a humana. La secuencia de aminoácidos de C5a humana se representa en la SEQ ID NO: 1. En realizaciones más preferidas del primer aspecto, la unidad estructural de unión se une a al menos uno de los aminoácidos DETCEQR (SEQ ID NO: 4). La SEQ ID NO: 4 corresponde a los aminoácidos 31-37 de C5a humana. En realizaciones más preferidas del primer aspecto, la unidad estructural de unión se une a al menos uno de los aminoácidos HKDMQ (SEQ ID NO: 5), más preferiblemente a al menos uno de los aminoácidos KDM. La SEQ ID NO: 5 corresponde a los aminoácidos 67-71 de C5a humana; la secuencia KDM corresponde a los aminoácidos 68-70 de C5a humana. En realizaciones particularmente preferidas, la unidad estructural de unión se une al mismo tiempo a al menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos DETCEQR (SEQ ID NO: 4) y a al menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos KDM.
En las realizaciones preferidas del primer aspecto, las dos secuencias que forman el epítopo conformacional (por ejemplo, pares de secuencias de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 y 3) están separadas por 1-50 aminoácidos contiguos que no participan en la unión la unidad estructural de unión de la invención. A continuación, dichos aminoácidos que no participan en la unión con la unidad estructural de unión de la invención se denominarán como "aminoácidos que no participan de la unión". Las dos secuencias que forman el epítopo conformacional están preferiblemente separadas por 6-45 aminoácidos contiguos que no participan en la unión, más preferiblemente por 12-40 aminoácidos contiguos que no participan en la unión, más preferiblemente por 18-35 aminoácidos contiguos que no participan en la unión, más preferiblemente por 24-30 aminoácidos contiguos que no participan en la unión, más preferiblemente por 25-29 aminoácidos contiguos que no participan en la unión, aún más preferiblemente por 26-28 aminoácidos contiguos que no participan en la unión, y lo más preferiblemente por 27 aminoácidos contiguos que no participan en la unión.
En las realizaciones preferidas del primer aspecto, la unidad estructural de unión tiene una constante de unión a C5a, preferiblemente C5a humana, con un valor de Kd de 9 nM o menos, preferiblemente 8 nM o menos, más preferiblemente 7 nM o menos, más preferiblemente 6 nM o menos, más preferiblemente 5 nM o menos, más preferiblemente 4 nM o menos, más preferiblemente 3 nM o menos, más preferiblemente 2 nM o menos, e incluso más preferiblemente 1 nM o menos.
En realizaciones preferidas del primer aspecto, una unidad estructural de unión presenta al menos 85% de actividad de bloqueo, preferiblemente al menos 90% de actividad de bloqueo, más preferiblemente al menos 95% de actividad de bloqueo, para efectos biológicos inducidos por una molécula de C5a, preferiblemente C5a humana. Estas actividades de bloqueo preferidas se refieren a aquellas realizaciones, en donde la unidad estructural de unión comprende un único parátopo que se une a C5a, preferiblemente C5a humana. En realizaciones, en donde la unidad estructural de unión comprende dos o más parátopos específicos de C5a, se logran dichas actividades de bloqueo de al menos 80%, preferiblemente al menos 85%, etc., cuando una molécula de la unidad estructural de unión se pone en contacto con una cantidad de moléculas de C5a igual a la cantidad de parátopos específicos de C5a presentes en la unidad estructural de unión. En otras palabras, cuando los parátopos de la unidad estructural de unión del primer aspecto y C5a están presentes en concentraciones equimolares, la unidad estructural de unión de acuerdo con el primer aspecto exhibe al menos 80% de actividad de bloqueo, más preferiblemente al menos 85% de actividad de bloqueo, más preferiblemente al menos 90% de actividad de bloqueo, y más preferiblemente al menos 95% de actividad de bloqueo para efectos biológicos inducidos por C5a. Un efecto biológico preferido para ser bloqueado es la liberación de lisozima inducida por C5a de células de sangre humana. Los ensayos para determinar esta liberación de lisozima inducida por C5a y su bloqueo se describen en la sección de ejemplos.
En realizaciones preferidas del primer aspecto, la unidad estructural de unión no inhibe la actividad de CH50 en plasma humano. Los ensayos para determinar la actividad de CH50 son conocidos por el experto en la materia y se describen a continuación en la sección de ejemplos.
En las realizaciones preferidas del primer aspecto, la unidad estructural de unión no exhibe una actividad de bloqueo sobre al menos un efecto biológico inducido por C5b, preferiblemente la unidad estructural de unión no exhibe una actividad de bloqueo sobre ningún efecto biológico inducido por C5b.
En realizaciones preferidas del primer aspecto, la unidad estructural de unión es capaz de reducir la producción de IL-8 inducida por E. coli en sangre humana completa. Los ensayos para medir la producción de IL-8 en sangre completa son conocidos por el experto en la materia y se describirán más adelante en la sección de ejemplos.
Como se mencionó anteriormente, la unidad estructural de unión se selecciona del grupo que consiste de:
(a) anticuerpos o fragmentos de los mismos de unión al antígeno; y (b) proteínas similares al anticuerpo.
En realizaciones preferidas del primer aspecto, la unidad estructural de unión es un anticuerpo o un fragmento del mismo de unión al antígeno, siendo dicho anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos monovalentes, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos heteroconjugados,
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anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos desinmunizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados (en particular injertados en CDR), y anticuerpos humanos.
En realizaciones preferidas del primer aspecto, la unidad estructural de unión es un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo, siendo dicho fragmento seleccionado del grupo que consiste en fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd , Fragmentos Fv, Fs enlazados por disulfuro (dsFv), anticuerpos de un solo dominio (también conocidos como nanocuerpos) y anticuerpos Fv de cadena sencilla (scFv).
En una realización particularmente preferida del primer aspecto, la unidad estructural de unión es un anticuerpo o un fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende: (i) una secuencia de CDR3 de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 6; o (ii) una secuencia CDR3 de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 7; en donde la secuencia de CDR3 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, preferiblemente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2 o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2 o 3 adiciones de aminoácidos.
Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende además: (i) una secuencia de CDR3 de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 8; o (ii) una secuencia de CDR3 de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 9; en el donde la secuencia de CDR3 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, preferiblemente intercambios de aminoácidos conservados, 1, 2 o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2 o 3 adiciones de aminoácidos.
Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento comprende además al menos una de las siguientes secuencias: (i) una secuencia de CDR2 de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 10; (ii) una secuencia CDR2 de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 11; (iii) una secuencia CDR2 de cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 12; (iv) una secuencia CDR2 de cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 13; (v) una secuencia de CDR1 de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 14; (vi) una secuencia CDR1 de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 15; (vii) una secuencia de CDR1 de cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 16; o (viii) una secuencia de CDR1 de cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 17; en donde la secuencia de CDR2 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, preferiblemente intercambios de aminoácidos conservados, 1, 2 o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2 o 3 adiciones de aminoácidos; en donde la secuencia de CDR2 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, preferiblemente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2 o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2 o 3 adiciones de aminoácidos; en donde la secuencia CDR1 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, preferentemente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2 o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2 o 3 adiciones de aminoácidos; en donde la secuencia de CDR1 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, preferiblemente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2 o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2 o 3 adiciones de aminoácidos. Preferiblemente, el número total de estos cambios opcionales en cada una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17, es decir, el número total de intercambios, supresiones y adiciones en cada secuencia, es 1 o 2.
En algunas realizaciones del primer aspecto, la unidad estructural de unión es una proteína similar a un anticuerpo, por ejemplo, una proteína similar a un anticuerpo como se ejemplificó anteriormente en la sección "Definiciones".
Una realización preferida del primer aspecto está dirigida a la unidad estructural de unión para la prevención y/o tratamiento de diversas enfermedades que implican inflamación aguda tales como síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis, sepsis grave, choque séptico, lesiones relacionadas con isquemia/reperfusión tales como cardiopatía isquémica, lesión pulmonar aguda, neumonía, rechazo agudo y crónico de injerto en pacientes trasplantados, reacciones de injerto contra huésped, pero también enfermedades que implican tipos crónicos de inflamación tales como enfermedades glomerulares renales tales como glomerulonefritis y otras entidades de insuficiencia renal, Artritis reumatoide y enfermedades autoinmunes similares tales como la enfermedad de Bechterew, enfermedades tipo lupus, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, crecimiento de tumores o cáncer de órganos sólidos.
En una realización particularmente preferida del primer aspecto, la unidad estructural de unión es un anticuerpo o un fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende: (i) una secuencia de CDR3 de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 8; o (ii) una secuencia de CDR3 de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 9; en donde la secuencia de CDR3 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, 1, 2 o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2 o 3 adiciones de aminoácidos. Preferiblemente, el número total de estos cambios opcionales en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, es decir, el número total de intercambios, supresiones y adiciones, es 1 o 2. Preferiblemente, el número total de estos cambios opcionales en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, es decir, el número total de intercambios, supresiones y adiciones, es 1 o 2.
Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento del mismo de unión al antígeno comprende además al menos una de las siguientes secuencias: (i) una secuencia de CDR2 de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 10; (ii) una secuencia de CDR2 de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 11; (iii) una secuencia de CDR2 de cadena ligera
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de acuerdo con la SEQ ID NO: 12; (iv) una secuencia de CDR2 de cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 13; (v) una secuencia de CDR1 de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 14; (vi) una secuencia de CDR1 de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 15; (vii) una secuencia de CDR1 de cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 16; o (viii) una secuencia de CDR1 de cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 17; en donde la secuencia de CDR2 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, preferiblemente intercambios de aminoácidos conservados, 1, 2 o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2 o 3 adiciones de aminoácidos; en donde la secuencia de CDR2 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, preferiblemente intercambios de aminoácidos conservados, 1, 2 o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2 o 3 adiciones de aminoácidos; en donde la secuencia CDR1 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, preferiblemente intercambios de aminoácidos conservados, 1, 2 o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2
o 3 adiciones de aminoácidos; en donde la secuencia de CDR1 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, preferiblemente intercambios de aminoácidos conservados, 1, 2 o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2 o 3 adiciones de aminoácidos. Preferiblemente, el número total de estos cambios opcionales en cada una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17, es decir, el número total de intercambios, supresiones y adiciones en cada secuencia, es 1 o 2.
En realizaciones preferidas del primer aspecto, un anticuerpo o fragmento del mismo de unión al antígeno exhibe al menos 85% de actividad de bloqueo, preferiblemente al menos 90% de actividad de bloqueo, más preferiblemente al menos 95% de actividad de bloqueo, para efectos biológicos inducidos por una molécula de C5a, preferiblemente C5a humana. Estas actividades de bloqueo preferidas se refieren a aquellas realizaciones, en donde el anticuerpo (o el fragmento del mismo de unión al antígeno) comprende un único parátopo que se une a C5a, preferiblemente C5a humana. En realizaciones, en donde el anticuerpo (o fragmento del mismo de unión al antígeno) comprende dos o más parátopos específicos de C5a, dichas actividades de bloqueo de al menos 80%, preferiblemente al menos 85%, etc., se logran cuando se pone en contacto una molécula de una unidad estructural de unión con una cantidad de moléculas C5a igual al número de parátopos específicos de C5a presentes en el anticuerpo (o el fragmento del mismo de unión al antígeno). Por ejemplo, un anticuerpo anti-C5a típico del tipo IgG comprende dos parátopos capaces de unirse a C5a, mientras que un anticuerpo anti-C5a típico del tipo IgM comprende diez parátopos capaces de unirse a C5a. Por lo tanto, la actividad de bloqueo de un anticuerpo del tipo IgG debe determinarse poniendo en contacto dicho anticuerpo con C5a en una relación molar de 1:2. La actividad de bloqueo de un anticuerpo del tipo IgM debe determinarse poniendo en contacto dicho anticuerpo con C5a en una relación molar de 1:10. Al elegir estas relaciones molares, los parátopos dentro del anticuerpo y C5a están presentes en concentraciones equimolares. En otras palabras, cuando los parátopos de un anticuerpo (o fragmento del mismo de unión al antígeno) de acuerdo con el primer aspecto y C5a están presentes en concentraciones equimolares, el anticuerpo o fragmento del mismo de unión al antígeno exhibe al menos 80% de actividad de bloqueo, preferiblemente al menos 80% de actividad de bloqueo, más preferiblemente al menos 90% de actividad de bloqueo, y más preferiblemente al menos 95% de actividad de bloqueo para efectos biológicos inducidos por C5a. Un efecto biológico preferido que se bloquea es la liberación de lisozima inducida por C5a de células de sangre humana entera. Los ensayos para determinar esta liberación de lisozima inducida por C5a y su bloqueo se describen en la sección de ejemplos.
Una realización preferida del primer aspecto está dirigida al anticuerpo o fragmento del mismo de unión al antígeno para la prevención y/o el tratamiento de diversas enfermedades que involucran inflamación aguda tal como síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis, sepsis grave, choque séptico, lesiones relacionadas con isquemia/reperfusión tales como cardiopatía isquémica, lesión pulmonar aguda, neumonía, rechazo agudo y crónico de injerto en pacientes trasplantados, reacciones de injerto contra huésped, pero también enfermedades que implican tipos crónicos de inflamación tales como enfermedades glomerulares renales tales como glomerulonefritis y otras entidades de insuficiencia renal, artritis reumatoide y enfermedades autoinmunes similares tales como enfermedad de Bechterew, enfermedades tipo lupus, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, crecimiento de tumores o cáncer de órganos sólidos.
En las realizaciones preferidas del primer aspecto, el anticuerpo o fragmento del mismo de unión al antígeno comprende uno de los conjuntos de secuencias de CDR3 de cadena pesada, CDR2 de cadena pesada y de CDR1 de cadena pesada como se enumera a continuación en la Tabla 1, en donde cada secuencia de CDR3 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, preferiblemente intercambios de aminoácidos conservados, 1, 2 o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2 o 3 adiciones de aminoácidos; en donde cada secuencia de CDR2 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, preferiblemente intercambios de aminoácidos conservados, 1, 2 o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2 o 3 adiciones de aminoácidos; y en donde cada secuencia de CDR1 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, preferiblemente intercambios de aminoácidos conservados, 1, 2 o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2
o 3 adiciones de aminoácidos:
Tabla 1: Conjuntos de secuencias CDR de cadena pesada adecuadas para uso en los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la presente invención
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En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la unidad estructural de unión de acuerdo con el primer aspecto, y además comprende uno o más portadores, diluyentes, excipientes, rellenos, aglutinantes, lubricantes, deslizantes, desintegrantes, adsorbentes y/o conservantes farmacéuticamente aceptables.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere al uso de una unidad estructural de unión de acuerdo con el primer aspecto, para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de diversas enfermedades que implican inflamación aguda tal como síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis, sepsis grave, choque séptico, lesiones relacionadas con isquemia/reperfusión tales como cardiopatía isquémica, lesión pulmonar aguda, neumonía, rechazo crónico y agudo de injerto en pacientes trasplantados, reacciones de injerto contra huésped, pero también enfermedades que implican tipos crónicos de inflamación tales como enfermedades glomerulares renales tales como glomerulonefritis y otras entidades de insuficiencia renal, artritis reumatoide y enfermedades autoinmunes similares tales como enfermedad de Bechterew, enfermedades del tipo lupus, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, crecimiento tumoral o cáncer de órganos sólidos.
En la práctica de cualquier aspecto de la presente invención, se puede administrar a un paciente una composición farmacéutica como la descrita anteriormente o una unidad estructural de unión (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo de unión al antígeno) mediante cualquier ruta establecida en la técnica que proporcione un nivel suficiente de la unidad estructural de unión en el paciente. Se puede administrar sistémica o localmente. Dicha administración puede ser en forma parenteral, transmucosa, por ejemplo, en forma oral, nasal, rectal, intravaginal, sublingual, submucosa, transdérmica o por inhalación. Preferiblemente, la administración es parenteral, por ejemplo, mediante inyección intravenosa o intraperitoneal, y también incluye, pero no se limita a, administración intraarterial, intramuscular, intradérmica y subcutánea. Si la composición farmacéutica de la presente invención se administra localmente, se puede inyectar directamente en el órgano o tejido a tratar, por ejemplo, en el órgano afectado por un tumor.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración oral pueden proporcionarse como cápsulas o tabletas; como polvos o gránulos; como soluciones, jarabes o suspensiones (en líquidos acuosos o no acuosos); como espumas
o batidos comestibles; o como emulsiones. Los comprimidos o cápsulas de gelatina dura pueden comprender lactosa, almidón o derivados del mismo, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, ácido esteárico o sus sales. Las cápsulas de gelatina blanda pueden comprender aceites vegetales, ceras, grasas, polioles semisólidos o líquidos, etc. Las soluciones y jarabes pueden comprender agua, polioles y azúcares.
Un agente activo destinado a la administración oral puede ser recubierto o mezclado con un material que retrasa la desintegración y/o absorción del agente activo en el tracto gastrointestinal (por ejemplo, se pueden utilizar monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo). De este modo, la liberación sostenida de un agente activo se puede conseguir durante muchas horas y, si es necesario, el agente activo puede protegerse de ser degradado dentro del estómago. Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden formularse para facilitar la liberación de un agente activo en una localización gastrointestinal particular debido al pH específico o a condiciones enzimáticas.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración transdérmica pueden proporcionarse como parches discretos destinados a permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un período de tiempo prolongado. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica pueden proporcionarse como ungüentos, cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, geles, atomizadores, aerosoles o aceites. Para la administración tópica a la piel, boca, ojos u otros tejidos externos se usa preferentemente un ungüento o crema tópica. Cuando se formula en un ungüento, el ingrediente activo se puede emplear ya sea con una base de ungüento parafínico o miscible con agua. Alternativamente, el ingrediente activo puede formularse en una crema con una base de aceite en agua o una base de agua en aceite. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica a los ojos incluyen gotas para los ojos. En estas composiciones, el ingrediente activo puede disolverse o suspenderse en un portador adecuado, por ejemplo, en un disolvente acuoso. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica en la boca incluyen grageas, pastillas y enjuagues bucales.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración nasal pueden comprender portadores sólidos tales como polvos (preferiblemente con un tamaño de partícula en el intervalo de 20 a 500 micrómetros). Los polvos se pueden administrar en la forma en que se aspira el rapé, es decir, por inhalación rápida a través de la nariz desde un contenedor para polvo mantenido cerca de la nariz. Alternativamente, las composiciones adoptadas para administración nasal pueden comprender portadores líquidos, por ejemplo, aerosoles nasales o gotas nasales. Estas composiciones pueden comprender soluciones acuosas u oleosas del ingrediente activo. Las composiciones para la administración por inhalación pueden suministrarse en dispositivos especialmente adaptados que incluyen, pero no limitados a, aerosoles presurizados, nebulizadores o insufladores, que pueden construirse de manera que proporcionen dosificaciones predeterminadas del ingrediente activo. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran a través de la cavidad nasal a los pulmones.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración rectal pueden proporcionarse como supositorios o enemas. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración vaginal pueden proporcionarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en aerosol.
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Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración parenteral incluyen soluciones o suspensiones inyectables estériles acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, reguladores, bacteriostáticos y solutos que hacen que las composiciones sean sustancialmente isotónicas con la sangre de un receptor deseado. Otros componentes que pueden estar presentes en tales composiciones incluyen agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales, por ejemplo. Las composiciones adaptadas para administración parenteral pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o múltiples, por ejemplo ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en una condición secada por congelación (liofilizada) que requiere solamente la adición de un vehículo líquido estéril, por ejemplo, solución salina estéril para inyecciones, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones inyectables extemporáneas pueden prepararse a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles.
En una realización preferida, la composición se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en reguladores acuosos isotónicos estériles. Cuando sea necesario, la composición puede incluir también un agente de solubilización y un anestésico local tal como lidocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o se mezclan juntos en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo seco liofilizado o concentrado sin agua en un recipiente sellado herméticamente tal como una ampolla o bolsita que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contiene agua estéril de calidad farmacéutica o solución salina. Cuando la composición se administra por inyección, se puede proporcionar una ampolla de solución salina estéril para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.
En otra realización, por ejemplo, puede administrarse un inhibidor de quimioatracción en un sistema de liberación controlada. Por ejemplo, el inhibidor puede administrarse mediante infusión intravenosa, una bomba osmótica que puede ser implantada, un parche transdérmico, liposomas u otros modos de administración. En una realización, se puede usar una bomba (véase Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed Eng. 14: 201 Buchwald y colaboradores (1980) Surgery 88: 507 Saudek. y colaboradores (1989) N. Eng. J. Med. 321: 574). En otra realización, el compuesto puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer (1990) Science 249: 1527-1533, Treat y colaboradores, (1989) en liposomes in the therapy of infectious disease and cancer, López-Berestein y Fidler (eds.), Liss, NY, 353-365, el documento WO 91/04014, patente estadounidense No. 4.704.355). En otra realización, se pueden usar materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release(1974) Langer y Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton, FL., Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, (1984) Smolen y Ball (eds.), Wiley: N.Y.; Ranger y Peppas (1953) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; véase también Levy y colaboradores (1985) Science 228:190; During y colaboradores (1989) Ann. Neurol. 25: 351; Howard y colaboradores (1989) J. Neurosurg. 71: 105).
En aún otra realización, se puede colocar un sistema de liberación controlada en la proximidad del objetivo terapéutico, es decir, las células, tejido u órgano objetivo, requiriendo de este modo sólo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson (1984) 115-138 en Medical Applications of Controlled Release, vol. 2). Otros sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión de Langer (1990, Science 249: 1527-1533).
En una realización específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente a la zona que necesita tratamiento; esto puede lograrse, por ejemplo, y no a manera de limitación, por infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, junto con un vendaje para heridas después de la cirugía, por inyección, mediante un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas silásticas, o fibras.
La selección de la dosis eficaz preferida será determinada por un experto en la materia con base en la consideración de diversos factores que serán conocidos por un experto en la técnica. Tales factores incluyen la forma particular de la composición farmacéutica, por ejemplo, un polipéptido o vector, y sus parámetros farmacocinéticos tales como biodisponibilidad, metabolismo, semivida, etc., que se habrán establecido durante los procedimientos habituales de desarrollo empleados típicamente en la obtención de la aprobación reguladora para un compuesto farmacéutico. Otros factores en la consideración de la dosis incluyen la afección o enfermedad que debe prevenirse o tratarse o el beneficio que se debe conseguir en un individuo normal, la masa corporal del paciente, la vía de administración, si la administración es aguda o crónica, medicamentos concomitantes, y otros factores bien conocidos que afectan la eficacia de los agentes farmacéuticos administrados. Por lo tanto, la dosis precisa debe decidirse de acuerdo con el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente, por ejemplo, dependiendo de la condición y el estado inmunitario del paciente individual, de acuerdo con técnicas clínicas estándar.
En la práctica de cualquier aspecto de la presente invención en relación con la prevención y/o el tratamiento del crecimiento de tumores o cáncer de órganos sólidos, el sujeto al que se le administra la unidad estructural de unión o anticuerpo de la invención se trata adicionalmente con un agente quimioterapéutico, radiación, o un agente que modula, por ejemplo, aumenta o inhibe, la expresión o actividad de un receptor de Fc, por ejemplo un receptor de Fc-gamma, tal como una citoquina. Las citoquinas típicas para la administración durante el tratamiento incluyen factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), interferón γ
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sobrenadantes se leyeron a 542 nm en un lector de placas. Para determinar el efecto de los anticuerpos anti-C5a sobre la activación de C5, se incubaron previamente volúmenes iguales de anticuerpo anti-C5a y plasma durante 1 hora antes de la adición de sRBC sensibilizado.
5 1.7 Producción de IL-8 en el modelo de sangre entera de infección por E. coli:
Para evaluar la eficacia de los anticuerpos anti-C5a en el entorno cercano a la sepsis clínica, se colocaron anticuerpos anti-C5a en 250 μL de sangre entera de voluntarios sanos y se añadieron luego 250 μL de E. coli diluido en regulador salino con una concentración de 1x107/ml. Después de 4 horas de incubación a 37ºC, se centrifugaron los
10 sobrenadantes y se recogieron para análisis mediante ELISA de IL-8. Se analizaron los niveles de IL-8 en los sobrenadantes mediante el kit de ELISA para IL-8 (BioLegend, EE.UU.).
1.8 Ensayo para cribar anticuerpos que se unen al nuevo epítopo conformacional:
15 En la estructura tridimensional de C5a obtenida a partir del método de modelación informática, se pueden observar los epítopos espaciales que contienen al péptido C5a 28-40 (VNNDETCEQRAAR, SEQ ID NO: 67) y al péptido C5a 65-70 (ISHKDM, SEQ ID NO: 68) como espirales aleatorias. Cuando los dos péptidos están enlazados por medio de un enlazador peptídico flexible, GGGGS (SEQ ID NO: 69), se reconstruyen los epítopos espaciales asemejándose a la conformación del antígeno progenitor, ya que la interacción hidrófoba débil de los dos péptidos asegura una
20 conformación con forma de bolsillo. El análisis por modelación informática del péptido NH2-28-40-Enlazador(GGGGS)-65-70-COOH mantiene la misma conformación que el antígeno progenitor. Este nuevo péptido 24-AA puede ser sintetizado y conjugado con hemocianina de lapa (KLH) para formar un inmunógeno para inmunizar ratones, y puede aplicarse la tecnología de hibridoma tradicional posteriormente para obtener INab308 e INab708 usando el ELISA con base en el nuevo péptido 24-AA como herramienta de cribado.
25 Se recubre una placa de ELISA de 96 pozos con 1-2 µg/mL de péptidos sintéticos con el epítopo conformacional a 4ºC durante la noche. Después de haber sido bloqueado con leche desnatada al 5% en PBS a 37ºC durante 1 h, se añaden 50 µL de medio de cultivo de los clones de cultivo de hibridoma a cada pozo y se incubó a 37ºC durante 1 h, seguido de 100 µL de anticuerpo antirratón de cabra marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 h. La reacción de
30 peroxidasa se desarrolla con una solución para desarrollo de color que contiene clorhidrato de o-fenilendiamina (OPD) 5,5 mM y H2O2 8,5 mM. La absorbancia de luz se mide a 492 nm con un lector de ELISA.
2. Resultados
35 2.1 Identificación de aminoácidos relevantes para la actividad de C5a
Varios aminoácidos dentro de la molécula de C5a que constituyen epítopos de anticuerpos posibles se mutaron en alanina. En particular, los mutantes de C5a incluyen mutaciones en el sitio en 24, 29, 30, 31, 32, 35, 36, 37, mutación doble 30/37, 40, 53, 64, 65, 66, 68, 64/68, 66/68, 69, 70 y C-del (se suprimieron 12 aminoácidos del extremo terminal C
40 de C5a). Los mutantes C5a se ensayaron en cuanto a su bioactividad para inducir la liberación de lisozima de células de sangre entera humana (Figura 1).
La mutación en el sitio de C5a que resulta en una pérdida de bioactividad de más del 50% en comparación con la C5a humana se consideró como un sitio crítico para la función biológica de C5a. Así, los residuos de aminoácidos 24, 29, 31,
45 37, 68 y 69 se identificaron como sitios críticos para la función (Figura 1).
2.2 Caracterización de los epítopos sobre C5a unido mediante los anticuerpos INab308 e INab708
Se cribaron 2000 clones de células que secretan anticuerpos contra C5a humana con el ensayo funcional (liberación de 50 enzima. Únicamente dos anticuerpos exhibieron actividad superior.
Estos dos anticuerpos, INab308 e INab708, fueron después caracterizados con respecto a los aminoácidos particulares sobre C5a reconocidos por los dos anticuerpos.
55 En particular, se generaron varios mutantes de C5a en los cuales se reemplazaron uno o más aminoácidos por alanina. Los anticuerpos INab308 e INab708 se pusieron en contacto con estos mutantes y se determinó el grado de unión mediante ELISA (véase la sección 1.5 anterior). Se consideró significativa una pérdida de capacidad de unión superior al 50% (en comparación con C5a de tipo silvestre).
60 Los datos indican que INab308 se une a dos regiones, 31-37 y 68-69 (Figura 2). Del mismo modo, INab708 se une a dos regiones, 31-37 y 68-70 (Fig. 3).
Notablemente, las regiones identificadas para ambos anticuerpos cubren cuatro residuos de aminoácidos (31, 37, 68 y 69) que se identificaron como sitios críticos para la función de C5a en la sección 2.1 anterior.
65
2.3 Efecto de los anticuerpos INab308, INab708 y F20 en la actividad hemolítica en plasma humano
El título de complemento hemolítico total (CH50) es un método convencional para la determinación de la activación de la vía clásica del complemento (véase la sección 1.6).
5 Los anticuerpos monoclonales para C5a (INab708, INab308 y F20) se incubaron previamente con plasma humano a una concentración de aproximadamente 5 μM, y luego se realizó el ensayo de CH50. Entre estos anticuerpos, F20 inhibe fuertemente la actividad de CH50, mientras que INab708 e INab308 no tienen influencia (Fig. 4).
Estos resultados demuestran que INab708 e INab308 no interfieren con la activación del complemento mediada por 10 C5b.
2.4 Efecto de los anticuerpos INab308, INab708 y L2B23 sobre la bioactividad de C5a
La actividad de bloqueo de los anticuerpos INab308, INab708 y L2B23 en C5a se evaluó mediante ensayo de liberación
15 de lisozima inducida por C5a (véase la sección 1.4). La relación molar de anticuerpo con respecto a C5a se ajustó en 1: 2 para evaluar la actividad de bloqueo de un anticuerpo con respecto al efecto biológico provocado por dos moléculas de C5a. Estos anticuerpos son anticuerpos bivalentes. Por consiguiente, eligiendo la relación molar anterior de 1:2, los parátopos de los anticuerpos, por una parte, y C5a, por otra parte, están presentes en concentraciones equimolares.
20 Los datos de la Fig. 5 muestran que INab308 e INab708 poseen una actividad de bloqueo muy alta con respecto a la bioactividad de C5a (94% y 100%, respectivamente), mientras que L2B23 sólo muestra un efecto mínimo (aproximadamente 12%).
2.5 Efecto de los anticuerpos INab308 e INab708 sobre la producción de IL-8 inducida por E. coli en sangre entera 25 humana
Para evaluar la eficacia de anticuerpos anti-C5a en un entorno cercano a la sepsis clínica, se determinó la producción de IL-8 inducida por E. coli en sangre entera. Este ensayo puede considerarse como un modelo de infección por E. coli (véase también la sección 1.7).
30 En presencia de INab308 e INab708 durante la incubación, los niveles de IL-8 se atenuaron significativamente (P <0,01), mientras que no hubo reducción significativa en presencia de L2B23 (Figura 6).
3. Resumen
35 Las propiedades importantes de los anticuerpos preferidos de la invención INab308 e INab708 se resumen en la Tabla 3 a continuación. Se incluyen además anticuerpos comparativos 8g8, MAb 137-26, Ab11876, G57, F20, L2B23 y G13 que no se unen simultáneamente a ambas secuencias amino del epítopo conformacional identificado en la presente invención, es decir, secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3. Los anticuerpos comparativos
40 8g8, MAb 137-26, F20, G57, L2B23 y G13 se unen a sólo una de estas dos secuencias de aminoácidos (8g8, MAb 13726, F20, G57 y G13) o a una secuencia de aminoácidos diferente (L2B23). El epítopo objetivo de Ab11876 no se conoce. Tabla 3: Los anticuerpos neutralizantes para C5a y los epítopos
Los anticuerpos monoclonales para C5a humana se generaron usando tecnología clásica de hibridomas. Los sitios de unión de Mab a la C5a humana se determinaron por el método de cribado de alanina. Las actividades de bloqueo de Mab se cuantificaron mediante la inhibición de las liberaciones de lisozima inducidas por C5a de células de sangre entera humana.
Anticuerpo
Sitios de unión Afinidad (Kd: nM) Relación de Ab respecto a C5a Actividad de bloqueo
INab308
31-37,68-69 0,50 1/2:1 ≥ 90%
INab708
31-37, 68-70 0,51 1/2:1 ≥ 90%
8g8
69-74 0,27 1/2:1 60%
MAb 137-26*
35-46 0,06 1/2:1 55%
Ab11876**
ND ND 4:1 40%
G57
31-37 ND 4:1 40%
F20
68-69 7,06 10:1 70%
L2B23
64-66 ND 10:1 50%
G13
53, 66-68 ND 10:1 60%
ND: No determinado; *ATCC clon No. PTA-3650 con respecto a un anticuerpo divulgado en la solicitud de patente europea 1 878 441 A2; **Ab11876 es un anticuerpo monoclonal anti-C5lC5a obtenido a través de ABCAM (Cambridge, RU).
Como se muestra en la Tabla 3, algunos anticuerpos comparativos (8g8, MAb 137-26) muestran mayores afinidades de
45 unión a C5a que los anticuerpos preferidos de la invención, INab308 e INab708. Sin embargo, INab308 e INab708 exhiben mayores actividades de bloqueo que cualquier anticuerpo comparativo estudiado. Más específicamente, cada uno de INab308 e INab708 exhibe una actividad de bloqueo muy alta (≥ 90%), incluso cuando se usa en cantidades
estequiométricas, es decir, en una relación de 1 parátopo por 1 epítopo; es decir 0,5 moléculas de anticuerpo por 1 molécula objetivo. Los anticuerpos de la técnica anterior (MAb 137-26, Ab11876) alcanzaron actividades de bloqueo razonables solamente cuando se usan en cantidades superestequiométricas. Estos hallazgos demuestran que una alta afinidad de unión no siempre se puede equiparar con alta actividad de bloqueo.
5
Resumiendo, la presente invención proporciona por primera vez anticuerpos que exhiben una actividad de bloqueo extremadamente alta, incluso cuando se utiliza sólo en cantidades estequiométricas.
Las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad de las cadenas pesada y ligera 10 de los anticuerpos INab308 e INab708 se enumeran a continuación en la Tabla 4.
Tabla 4: Secuencias de CDR y FR de los anticuerpos INab308 e INab708 (modo de clasificación de Chothia)
INab308:
INab708:
Cadena pesada:
Cadena pesada:
FR1: QVQLQQSGPQLVRPGTSVKIS (= SEQ ID NO: 51)
FR1: VQLLESGAELMKPGASVKIS (SEQ ID NO: 59)
CDR1: CKASGYSFTTFWMD (= SEQ ID NO: 14)
CDR1: CKATGNTFSGYWIE (= SEQ ID NO: 15)
FR2: WVKQRPGQGLEWIGR (SEQ ID NO: 52)
FR2: WVKQRPGHGLEWIGE (SEQ ID NO: 60)
CDR2: IDPSDSESRLDQ (= SEQ ID NO: 10)
CDR2: ILPGSGSTNYNE (= SEQ ID NO: 11)
FR3:
FR3:
(SEQ ID NO: 53)
(SEQ ID NO: 61)
CDR3: CARGNDGYYGFAY (= SEQ ID NO: 6)
CDR3: CTRRGLYDGSSYFAY (= SEQ ID NO: 7)
FR4: WGQGTLVTVSSA (SEQ ID NO: 54)
FR4: WGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 62)
Cadena ligera:
Cadena ligera:
FR1: DIVLTQSPASLAVSLGQRATIS (SEQ ID NO: 55)
FR1: DIVLTQSPASLAVSLGQRATIS (SEQ ID NO: 63)
CDR1: CKASQSVDYDGDSYMK (= SEQ ID NO: 16)
CDR1: CKASQSVDYDGDSYMN (= SEQ ID NO: 17)
FR2: WYQQKPGQPPKLL (SEQ ID NO: 56)
FR2: WYQQKPGQPPKLL (SEQ ID NO: 64)
CDR2: IYAASNL (= SEQ ID NO: 12)
CDR2: IYAASNL (= SEQ ID NO: 13)
FR3:
FR3:
(SEQ ID NO: 57)
(SEQ ID NO: 65)
CDR3: CQQSNEDPYT (= SEQ ID NO: 8)
CDR3: CQQNNEDPLT (= SEQ ID NO: 9)
FR4: FGGGTKLEIK
FR4: FGAGTLLELK
(SEQ ID NO: 58)
(SEQ ID NO: 66)
Referencias
15
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