ES2391334T3 - Anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a la IL-1beta - Google Patents

Anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a la IL-1beta Download PDF

Info

Publication number
ES2391334T3
ES2391334T3 ES10179088T ES10179088T ES2391334T3 ES 2391334 T3 ES2391334 T3 ES 2391334T3 ES 10179088 T ES10179088 T ES 10179088T ES 10179088 T ES10179088 T ES 10179088T ES 2391334 T3 ES2391334 T3 ES 2391334T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
amino acid
antibodies
fragment
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10179088T
Other languages
English (en)
Inventor
Linda Masat
Mary Haak-Frendscho
Gang Chen
Arnold Horwitz
Marina Roell
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xoma Technology Ltd USA
Original Assignee
Xoma Technology Ltd USA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xoma Technology Ltd USA filed Critical Xoma Technology Ltd USA
Application granted granted Critical
Publication of ES2391334T3 publication Critical patent/ES2391334T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/245—IL-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Abstract

Anticuerpo que se une a la IL-1ß o fragmento del mismo que se une a la IL-1ß, en donde dicho anticuerpo o fragmento se une a la IL-1ß con una constante de disociaci ónde menos de 1pM, siendo dicho anticuerpo o fragmento del mismo seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de: * una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 9 o de la ID SEC Nº: 9 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 8 o de la ID SEC Nº: 8 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos; * una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 10 o de la ID SEC Nº: 10 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 14 o de la ID SEC Nº: 14 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos; * una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 11 o de la ID SEC Nº: 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 15 o de la ID SEC Nº: 15 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos; * una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 10 o de la ID SEC Nº: 10 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 25 o de la ID SEC Nº: 25 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos; * una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 11 o de la ID SEC Nº: 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 26 o de la ID SEC Nº: 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos.

Description

Anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a la IL-l
Ámbito de la invención
[0001] La invención se refiere a los anticuerpos que se unen a la IL-1�, incluyendo a fragmentos de los mismos, y a los ácidos nucleicos que codifican tales anticuerpos, asi como a vectores, celulas y composiciones que comprenden los anticuerpos o acidos nucleicos, y a los usos de los mismos.
Antecedentes de la invención
[0002] La familia de las citoquinas de las interleuquinas-1 (IL-1) ha venido estando implicada en estados de enfermedad tales como la artritis reumatoidea (RA), la osteoartritis, la enfermedad de Crohn la colitis ulcerosa (UC), el shock septico, la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COP0), el asma, la enfermedad de injerto versus huesped, la aterosclerosis, la leucemia de celulas T del adulto, el mieloma multiple, la esclerosis multiple, la crisis fulminante y la enfermedad de Alzheimer. Los miembros de la familia de las 1L-1 incluyen a la IL-1a, la 1L-1� y la 1L-1Ra. A pesar de que estan emparentadas por su capacidad para fijarse a los receptores de 1L-1 (IL-1R1 e IL-1R2), cada una de estas citoquinas es expresada por un gen distinto y tiene una distinta secuencia de aminoacidos primarios. Ademas pueden distinguirse unas de otras las actividades fisiologicas de estas citoquinas.
[0003] Se han investigado compuestos que trastornan la señalización de los receptores de IL-1 como agentes terapeuticos para tratar las enfermedades mediadas por 1L-1. Estos compuestos incluyen a la 1L-1Ra recombinante (Amgen 1nc., Thousand Oaks, CA) y el peptido "trampa" de receptores de 1L-1 (Regeneron 1nc., Tarrytown, NY). Tambien han sido investigados anticuerpos monoclonales derivados de animales que se unen a las citoquinas 1L-1. Sin embargo, su valor clinico puede ser limitado debido a su inmunogenicidad. Por ejemplo, ha llegado a ser sabido que sujetos humanos a los que se les administran anticuerpos monoclonales de raton producen anticuerpos anti-ratón humanos (HAMA). Se ha descrito que los HAMA reducen la eficacia de la terapia con anticuerpos monoclonales y producen reacciones adversas entre las que se incluyen las lesiones renales. Otros anticuerpos para 1L-1� pueden quedar limitados por su afinidad de fijacion y/o su potencia. En consecuencia, se necesitan compuestos adicionales que trastornen la señalización de los receptores de IL-1. La invencion aporta tales compuestos, asi como metodos para preparar y usar tales compuestos.
Breve sumario
[0004] La invención aporta un anticuerpo que se une a la IL-1� o un fragmento del mismo que se une a la 1L-1�, en donde dicho anticuerpo o fragmento se une a la IL-1� con una constante de disociacion de menos de 1pM, siendo dicho anticuerpo o fragmento del mismo seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de: una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9 o de la 10
SEC N°: 9 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos y una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 8 o de la 10 SEC N°: 8 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos;
una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 10 o de la 10 SEC N°: 10 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 14 o de la 10 SEC N°: 14 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos;
una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 11 o de la 10 SEC N°: 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos y una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 15 o de la 10 SEC N°: 15 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos;
una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 10 o de la 10 SEC N°: 10 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 25 o de la 10 SEC N°: 25 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos;
una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 11 o de la 10 SEC N°: 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos y una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 26 o de la 10 SEC N°: 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos.
Tambien se aporta aqui un acido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento del anticuerpo, asi como un vector que comprende el acido nucleico, una celula que comprende el acido nucleico o el vector, y una composición que comprende el anticuerpo, el acido nucleico o el vector.
[0005] En el contexto se describe un metodo que es para tratar o prevenir una enfermedad en un mamifero y comprende el paso de administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, acido nucleico o
vector de la invencion a un mamifero que tenga necesidad de ello, con lo cual se trata o previene una enfermedad en el mamifero.
[0006] En el contexto de la presente invencion se describe un metodo de preparacion de un polipeptido madurado por afinidad que se une a la IL-1�, comprendiendo dicho metodo los pasos de: (a) prever un primer acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido que se une a la 1L-1� y comprende la secuencia de aminoacidos de cualquiera de los 10 SEC NOMS.: 1-26 y un segundo acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que se diferencia de la primera secuencia de acido nucleico en al menos un nucleotido, (b) llevar a cabo una mezcla de ácidos nucleicos para asi contar con dos o mas acidos nucleicos mutados, (c) seleccionar un acido nucleico mutado que codifique un polipeptido que (1) se una a la 1L-1 con una afinidad mayor que la del polip
eptido codificado por el primer acido nucleico, (11) tenga una selectividad para la 1L-1� con preferencia sobre la 1L-1a que sea mayor que la del polipeptido codificado por el primer acido nucleico, (111) tenga una constante de disociacion de la union en equilibrio (K0) para IL-1� que sea mas baja que la del polipeptido codificado por el primer acido nucleico, o (1V) inhiba la expresión inducida por IL-1 de 1L-6 serica en un animal en mayor grado que el polipeptido codificado por el primer acido nucleico, y (d) expresar el acido nucleico mutado seleccionado, con lo cual se produce un polipeptido madurado por afinidad que se une a la IL-1�.
[0007] La invención aporta nuevos anticuerpos que se unen a la IL-1 o fragmentos de los mismos que se unen a la 1L1�, los cuales se unen a la 1L-1� humana con una constante de disociaci
on de menos de 3pM, como alternativa de aproximadamente 2pM o menos, y preferiblemente de poco mas o menos 1pM o menos. Tales anticuerpos de alta afinidad se contemplan como utiles para varios metodos para tratar o prevenir enfermedades o condiciones relacionadas con las IL-1. Adicionalmente, los anticuerpos que se unen a la 1L-1� o los fragmentos que se unen a la IL1� pueden unirse a un epitope de 1L -1 de forma tal que el anticuerpo o fragmento unido no impida considerablemente que la IL-1� se fije al receptor tipo 1 de 1L-1. Adicionalmente, los anticuerpos que se unen a la 1L-1 o los fragmentos que se unen a la IL-1� pueden unirse a en sustancia el mismo epitope como uno o varios de los anticuerpos indicados como ejemplos que aqui se describen, tales como el anticuerpo denominado AB7, que comprende una region variable de cadena pesada. Adicionalmente, los anticuerpos que se unen a la 1L-1� o los fragmentos que se unen a la 1L-1� pueden competir con la union de un anticuerpo que tenga la region variable de cadena liviana de la 10 SEC N°: 11 y la region variable de cadena pesada de la 10 SEC N°: 15. Adicionalmente, la presente invencion incluye a los anticuerpos que se unen a la IL-1 o los fragmentos que se unen a la 1L-1� y pueden unirse a un epitope contenido en la secuencia ESV0PKNYPKKKMEKRFVFNK1E (10 SEC N°: 36). Los ejemplos de anticuerpos que se unen a la IL-1� incluyen al anticuerpo que aqui se ha denominado AB7.
[0008] La invencion tambien aporta anticuerpos que se unen a las 1L-1 o fragmentos de los mismos que se unen a la IL1� y tienen una constante de disociacion de menos de 3pM, y com o alternativa de aproximadamente 1pM o menos, y comprenden una region variable de cadena pesada que comprende una de las secuencias de aminoacidos de las 10 SEC NOMS.: 8, 14, 15, 25 o 26 o de las 10 SEC NOMS.: 8, 14, 15, 25 o 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos. El anticuerpo que se une a la 1L-1 o el fragmento que se une a la 1L-1� puede tambien comprender una region variable de cadena liviana que comprenda la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9, la 10 SEC N°: 10 o la 10 SEC N°: 11 o la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos.
[0009] En el contexto de la presente invencion se describen anticuerpos que se unen a la 1L-1� o fragmentos de los mismos que se unen a la IL-1�, los cuales se unen a la 1L-1 con una constante de disociación de entre aproximadamente 6pM y aproximadamente 50pM, como alternativa de entre aproximadamente 13pM y aproximadamente 25pM, y como alternativa de aproximadamente 19pM, en donde el anticuerpo o fragmento tiene una 1C50 de menos de 0,5nM (500pM), como alternativa de entre aproximadamente 5pM y aproximadamente 200pM, como alternativa de entre aproximadamente 10pM y aproximadamente 100pM, y como alternativa de aproximadamente 30pM, para inhibir la liberación estimulada por IL-1 de 1L-6 desde fibroblastos humanos. La expresion 1C50 para inhibir la liberación estimulada por IL-1� de 1L-6 desde fibroblastos humanos se refiere a la concentracion requerida para inhibir el 50% de la liberación de IL-6 por estimulacion de los fibroblastos humanos con IL-1 �. Los ejemplos de anticuerpos incluyen al anticuerpo al que aqui se denomina AB1.
[0010] En el contexto de la presente invencion se describen anticuerpos que se unen a las 1L-1 o fragmentos de los mismos que se unen a la IL-1 y tienen una constante de disociacion de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 50pM y comprenden una región variable de cadena pesada que comprende una de las secuencias de aminoácidos delas 10 SEC NOMS. 4, 5 o 6, como alternativa una de las secuencias de aminoacidos de las 10 SEC NOMS.: 4 o 5, y como alternativa las secuencias de aminoacidos de la 10 SEC N°: 4. Se contempla que en algunas circunstancias puede ser deseable un anticuerpo que se una a la IL-1 o un fragmento que se una a la 1L-1� y tenga una constante de disociacion relativamente mas alta, por ejemplo para algunos metodos de tratamiento o prevencion de enfermedades o condiciones relacionadas con las IL-1 donde sea deseable un relativamente mas bajo grado de afinidad.
0011] Los anticuerpos que se describen en el contexto de la invencion incluyen a los anticuerpos denominados AB1, AB2, AB3, AB4, AB5, AB6, AB7, AB8 y AB9, formando los anticuerpos AB5, AB6, AB7, AB8 y AB9 parte del objeto de la
reivindicacion 1. El AB1 comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la 10 SEC N°: 4 y una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9. El AB2 comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 5 y una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9. El AB3 comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 6 y una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9. El AB4 comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 7 y una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9. El AB5 comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 8 y una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de la I0 SEC N°: 9. El AB6 comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 14 y una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 10. El AB7 comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 15 y una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 11. El AB8 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 25 y una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 10. El AB9 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la 10 SEC N°: 26 y una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 11.
[0012] La presente invención incluye a los anticuerpos que se unen a la IL-1� o a los fragmentos que se unen a la 1L-1� y tienen una region variable de cadena pesada que comprende cualquiera de las secuencias que se exponen en la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 25 o 26 o en la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 25 o 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos.
[0013] La invencion tambien incluye a los anticuerpos que se unen a la 1L-1� o a los fragmentos que se unen a la 1L-1 y tienen una región variable de cadena liviana que comprende cualquiera de las secuencias que se exponen en la 10 SEC N°: 9, 10 u11 o en la 10 SEC N°: 9, 10 u11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos.
[0014] La presente tambien incluye a los anticuerpos para 1L-1 o a los fragmentos que se unen a la IL-1 y comprenden una de las regiones variables de cadena pesada de las secuencias que se exponen en la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 25 o 26 o en la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 25 o 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos y la region variable de cadena liviana de las secuencias que se exponen en la 10 SEC N°: 9, 10 u11 o en la 10 SEC N°: 9, 10 u11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos.
[0015] La presente invencion tambien incluye a los anticuerpos que se unen a la IL-1� o a los fragmentos que se unen a la IL-1 y comprenden partes que no se unen a la 1L-1 pero en lugar de ello son responsables de otras funciones, tales como la vida media circulante, el efecto citotoxico directo, el etiquetado detectable, o la activacion de la cascada del complemento endogena de un receptor o la citotoxicidad celular endogena. Los anticuerpos de la invencion pueden comprender la totalidad o una parte de una region constante de un anticuerpo. La region constante puede ser seleccionada de entre cualesquiera isotipos, incluyendo los 1gA (p. ej. 1gA1 o 1gA2), 1g0, 1gE, 1gG (p. ej. 1gG1, 1gG2, 1gG3 o 1gG4), o 1gM. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender una region 1gG2. Adicionalmente a o en lugar de comprender una region constante, los anticuerpos y fragmentos de la invencion pueden incluir una marca de epitope, un epitope del receptor de salvamento, una mitad etiqueta a efectos diagnosticos o de purificacion, o una mitad citotoxica tal como un radionuclido o una toxina.
[0016] En el contexto de la presente invencion se describen composiciones farmaceuticas que comprenden cualesquiera de los anticuerpos que se unen a la IL-1� o fragmentos que se une a la 1L-1� y un soporte, excipiente o diluyente farmaceuticamente adecuado. Preferiblemente, los anticuerpos y compuestos de la invencion pueden serle administrados en una cantidad terapeuticamente eficaz, es decir, en una cantidad suficiente para mejorar un signo o sintoma clinico de una condicion o de un trastorno asociada(o) a la expresion de la proteina diana, a un sujeto que tenga necesidad de tal tratamiento. En una realizacion afin, la composicion farmaceutica adicionalmente comprende un segundo agente activo. En aun otra realizacion afin, se aporta la composicion farmaceutica en la que el segundo agente activo es un anticuerpo para o un antagonista del factor de crecimiento o una citoquina. En otra realizacion el segundo agente activo es otro anticuerpo.
[0017] En el contexto de la presente invencion se describe el uso de los anticuerpos para 1L-1� o de los fragmentos que se unen a la IL-1� en la fabricación de un medicamento para prevenir o reducir una condición o un trastorno asociada(o) a las IL-1. En cualquiera de los usos, el medicamento puede ser coordinado con un tratamiento realizado usando un segundo agente activo. En otra realizacion de la invencion se contempla el uso de una combinacion sinergica de un anticuerpo de la invencion para la preparacion de un medicamento para tratar a un paciente que presente sintomas de una condición o de un trastorno relacionada(o) con las IL-1 de los que aqui se describen, en donde el medicamento es coordinado con un tratamiento realizado usando un segundo agente activo. En una realizacion afin, el segundo agente activo es un anticuerpo para citoquina o antagonista de citoquina o un factor de crecimiento. Se contemplan realizaciones de cualquiera de los usos anteriormente mencionados en donde la cantidad del anticuerpo o fragmento que se une a la IL-1� en el medicamento está al nivel de una dosis efectiva para reducir la dosificación de segundo agente activo requerido para lograr un efecto terapeutico.
[0018] Tambien se describen kits (kits = conjuntos de materiales y utensilios) en el contexto de la presente invencion. En una realizacion, un kit comprende una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de un compuesto o una composicion de la invencion (tal como un anticuerpo, un fragmento, un acido nucleico, un vector o una celula) envasada en un envase, tal como un vial o una botella, y comprendiendo adicionalmente una etiqueta unida al envase o envasada con el mismo, describiendo la etiqueta el contenido del envase y dando la etiqueta indicaciones y/o instrucciones relativas al uso del contenido del envase para prevenir o reducir una condición o enfermedad asociada a la expresión de la proteina diana.
Breve descripción de las distintas vistas del dibujo (de los dibujos)
[0019] La Fig. 1 es un par de secuencias de aminoacidos que corresponden a las cadenas livianas y las cadenas pesadas de la region variable de algunos de los anticuerpos que aqui se describen. Las partes subrayadas de las secuencias de aminoácidos indican regiones determinantes complementarias (C0Rs).
[0020] La Fig. 2 es un conjunto de secuencias de aminoacidos que corresponden a las regiones variables de cadena liviana y cadena pesada de los anticuerpos AB1, AB2, AB3 y AB4. Las partes subrayadas de las secuencias de aminoacidos indican regiones determinantes complementarias (C0Rs).
[0021] La Fig. es un conjunto de secuencias de aminoacidos que corresponden a las regiones variables de cadena liviana y cadena pesada de los anticuerpos AB5, AB5.1 y AB5.2. Las partes subrayadas de las secuencias de aminoacidos indican regiones determinantes complementarias (C0Rs).
[0022] La Fig. 4 es un conjunto de secuencias de aminoacidos que corresponden a las regiones variables de cadena liviana y cadena pesada de los anticuerpos AB5.3 y AB5.4. Las partes subrayadas de las secuencias de aminoacidos indican regiones determinantes complementarias (C0Rs).
[0023] La Fig. 4A es un conjunto de secuencias de aminoacidos que corresponden a las regiones variables de cadena liviana y cadena pesada de los anticuerpos AB6 y AB7. Las partes subrayadas de las secuencias de aminoacidos indican regiones determinantes complementarias (C0Rs).
[0024] La Fig. 4B es un conjunto de secuencias de aminoacidos que corresponden a las regiones variables de cadena liviana y cadena pesada de los anticuerpos AB8 y AB9. Las partes subrayadas de las secuencias de aminoacidos indican regiones determinantes complementarias (C0Rs).
[0025] La Fig. 5 es un grafico que muestra los resultados de un experimento de estimulación con IL-1� in vitro.
[0026] La Fig. 6 es un histograma que muestra los resultados de un experimento con estimulacion con 1L-1� in vivo.
[0027] La Fig. 7 es un grafico que muestra los resultados de un ensayo cinetico de exclusion para el anticuerpo denominado AB1.
[0028] La Fig. 8 es un grafico que muestra los resultados de un ensayo cinetico de exclusion para el anticuerpo denominado AB5.
[0029] La Fig. 9 es un grafico que muestra los resultados de un ensayo cinetico de exclusion para el anticuerpo denominado AB7.
[0030] La Fig. 10 es un grafico que muestra los resultados de un experimento de estimulacion con IL-1 in vitro para los anticuerpos denominados AB1, AB2 y AB3.
[0031] La Fig. 11 es un grafico que muestra los resultados de un experimento de estimulacion con 1L-1 in vitro para los anticuerpos denominados AB1 y AB7.
[0032] La Fig. 12 es un grafico que muestra los resultados de un experimento de estimulación con IL-1 in vitro para los anticuerpos denominados AB5 y AB7, asi como para Kinerett.
[0033] La Fig. 13 es un histograma que muestra los resultados de un experimento de estimulacion con 1L-1� in vivo para los anticuerpos denominados AB5 y AB1.
[0034] La Fig. 14 es un histograma que muestra los resultados de un experimento de estimulacion in vivo para los anticuerpos denominados AB5 y AB7.
[0035] La Fig. 15 es un Western blot que muestra los resultados de experimentos de reactividad cruzada para el anticuerpo denominado AB7 con IL-1� de mono cynomolgus y macaco rhesus.
[0036] La Fig. 16 es un Western blot que muestra los resultados de experimentos de reactividad cruzada para el anticuerpo denominado AB7 con 1L-1� de perro, cobayo, cerdo y conejo.
[0037] La Fig. 17 es un Western blot que muestra los resultados de experimentos de reactividad cruzada para el anticuerpo denominado AB7 con 1L-1� recombinante humana, de raton y de rata.
[0038] La Fig. 18 es un grafico que muestra los resultados de un experimento in vitro para el anticuerpo denominado AB7 y para Kineret que implica la produccion de 1L-8 inducida por 1L-1.
[0039] La Fig. 19 es un grafico que muestra los resultados de un ensayo efectuado para examinar si los presentes anticuerpos impiden que la IL-1� se fije al receptor tipo I de IL-1.
[0040] La Fig. 20 es una ilustracion de un ensayo realizado para examinar si los presentes anticuerpos impiden que la IL-1� se fije al receptor tipo 1 de 1L-1.
Descripción detallada
[0041] La presente invención incluye a nuevos anticuerpos y fragmentos para IL-1 que tienen una deseable afinidad y potencia. Como un aspecto de la presente invencion, se aportan anticuerpos que se unen a la 1L-1� y tienen una inesperadamente alta afinidad e inesperadamente bajas constantes de disociacion (por ejemplo de menos de 3pM, y como alternativa de aproximadamente 1pM o menos) en comparación con los conocidos anticuerpos que se unen a la
IL-1�. Los ejemplos de anticuerpos incluyen a los anticuerpos que aqui se denominan AB5 y AB7.
[0042] La presente invencion tambien incluye a los anticuerpos que se unen a la 1L-1� o a los fragmentos que se unen a la IL-1� uniendose selectivamente a la 1L-1� de forma tal que se unen a la 1L-1� con una afinidad mayor que aquella con la que lo hacen a otros antigenos. Los anticuerpos que se unen a la IL-1� o los fragmentos que se unen a la 1L-1� pueden unirse selectivamente a la IL-1� humana, pero tambien se unen de manera detectable a 1L -1� no humana. Como alternativa o adicionalmente, los anticuerpos o fragmentos pueden unirse a la IL-1� humana y a la 1L-1� de al menos otro mamifero (un primer mamifero) y no unirse a la 1L-1 de al menos otro mamifero (un segundo mamifero). Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos pueden unirse a uno o varios de los miembros del grupo que consta de IL-1 de roedor, 1L-1� de primate, 1L-1� de perro e 1L-1� de conejo, y/o pueden no unirse a la 1L-1� de cobayo. Como alternativa o adicionalmente, los anticuerpos o fragmentos pueden unirse a la 1L-1 de ratón con una afinidad mayor que aquella con la que lo hacen a la IL-1� de rata. Como alternativa o adicionalmente, los anticuerpos que se une a la 1L-1
o los fragmentos que se unen a la IL-1 pueden tener la misma o pr-1�
ácticamente la misma potencia contra la IL humana y la IL-1� de primate. Como alternativa o adicionalmente, los anticuerpos que se unen a la 1L-1� o los fragmentos que se unen a la IL-1� pueden tener la misma o prácticamente la misma potencia contra la IL -1� humana recombinante y la IL-1� humana endogena. Como alternativa o adicionalmente, los anticuerpos que se unen a la 1L-1� o los fragmentos que se unen a la IL-1� pueden neutralizar la 1L-1� de raton.
[0043] En el sentido que se le da en la presente, la expresion "un anticuerpo o fragmento que se une especificamente a un antigeno diana" se refiere a un anticuerpo que se une al antigeno diana con una afinidad mayor que aquella con la que lo hace a antigenos similares. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento es especifico de su antigeno afin cuando las regiones variables del anticuerpo o fragmento reconocen al antigeno afin y se unen al mismo con una preferencia detectable (distinguiendo al antigeno de otros conocidos polipeptidos de la misma familia, en virtud de diferencias mensurables de la afinidad de fijacion, a pesar de la posible existencia de identidad, homologia o similitud secuencial localizada entre miembros de la familia). Se comprendera que especificos anticuerpos y fragmentos pueden tambien interactuar con otras proteinas (como por ejemplo la proteina A de S. aureus u otros anticuerpos en tecnicas de EL1SA) mediante interacciones con secuencias situadas fuera de la region variable de los anticuerpos, y en particular en la region constante del anticuerpo o fragmento. Son perfectamente conocidos y se ponen rutinariamente práctica en la tecnica ensayos de cribaje para determinar la especificidad de fijacion de un anticuerpo. Para una amplia discusion de tales ensayos, vease Harlow et al. (redactores en jefe), Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988), Capitulo 6.
[0044] Un aspecto de la presente invencion incluye a los anticuerpos que se unen a la IL-1� y a los fragmentos de los mismos que se unen a la IL-1 y tienen inesperadamente bajas constantes de disociación (K 0), por ejemplo de menos de 3pM, como alternativa de 2pM o menos, como alternativa de 1pM o menos, como alternativa de 0,8pM o menos, como alternativa de 0,74pM o menos, como alternativa de 0,72pM o menos, como alternativa de 0,7pM o menos, como alternativa de 0,6pM o menos, como alternativa de 0,56pM o menos, como alternativa de 0,5pM o menos, como alternativa de 0,3pM o menos, como alternativa de 0,26pM o menos, como alternativa de 0,24pM o menos, y como alternativa de 0,2pM o menos. Asi, en algunas realizaciones de la presente invencion, los anticuerpos y fragmentos que se unen a la IL-1� pueden describirse haciendo referencia a un alto extremo de una gama de constantes de disociacion.
Adicionalmente o como alternativa, en algunas realizaciones de la presente invencion, los anticuerpos y fragmentos que se unen a la IL-1� pueden describirse haciendo referencia a un bajo extremo de una gama de constantes de disociacion, tal como por ejemplo un anticuerpo o fragmento que tenga una constante de disociacion de 0,07pM o mas, como alternativa de 0,1pM o mas, como alternativa de 0,11pM o mas, como alternativa de 0,15pM o mas, como alternativa de 0,2pM o mas, como alternativa de 0,24pM o mas, como alternativa de 0,26pM o mas, como alternativa de 0,3pM o mas, como alternativa de 0,5pM o mas, o como alternativa de 0,7pM o mas. Pueden combinarse cualquier constante de disociacion mas alta y cualquier constante disociacion mas baja, segun lo especificado anteriormente, para definir una gama de constantes de disociacion, siempre que el valor mas bajo seleccionado sea igual al valor mas alto seleccionado o menor que el mismo.
[0045] Los presentes anticuerpos y fragmentos se unen a la IL-1� con alta afinidad, como la indicada por las constantes de disociacion que aqui se exponen. Las constantes de afinidad que caracterizan las afinidades de los anticuerpos para los antigenos pueden ser constantes de asociacion medidas por medio de la cinetica de formacion de complejos antigeno-anticuerpo. Como alternativa, la afinidad de fijacion puede ser caracterizada por una constante de disociacion que es la inversa de la constante de asociacion. En el sentido en el que se la usa en la presente, la expresión K0 se refiere a la constante de disociación de una interacción de anticuerpo-antigeno.
[0046] La presente invencion tambien incluye a los anticuerpos neutralizantes o a los fragmentos neutralizantes de los mismos que se unen a la IL-1� para neutralizar la actividad biol-1 �. La neutralización de la actividad
ógica de la IL biológica de la IL-1� puede ser valorada mediante ensayos para la detección de uno o varios indicadores de la actividad biológica de la IL-1�, tales como la liberación estimulada por IL-1� de 1L-6 de fibroblastos humanos u otras celulas humanas, la liberacion inducida por 1L-1 de 1L-8 de celulas de la sangre, o la proliferacion inducida por 1L-1 de celulas T colaboradoras. Preferiblemente, los anticuerpos y fragmentos de la presente invención que se unen a la IL-1 neutralizan la actividad biológica de la IL-1 que está en conexión con la función de señalización del receptor tipo I de IL-1 (IL-RI) al que se une la IL-1�.
[0047] En general, los anticuerpos y fragmentos neutralizantes de la presente invención pueden neutralizar la actividad biológica de la IL-1� independientemente de si esta bloqueada la fijacion de la 1L -1� al receptor tipo 1 de 1L-1. Mas preferiblemente, los anticuerpos que se unen a la 1L-1 o los fragmentos que se unen a la IL-1 neutralizan la actividad biológica de la IL-1� uniendose a la 1L-1� sin practicamente impedir la fijacion de la 1L-1� unida al receptor tipo 1 de 1L-1. Una potencial ventaja de tales anticuerpos y fragmentos es la de que los mismos pueden unirse a la IL-1� y neutralizarla permitiendo aun al mismo tiempo que la 1L-1� se fije al 1L-1R1. Esto puede redundar en una efectiva reduccion de la actividad biológica de la IL-1a asi como la de actividad biologica de la 1L-1�, puesto que hay menos sitios IL-1RI para que la IL-1a se fije a los mismos. Asi, los anticuerpos y fragmentos de la presente invencion que se unen a la 1L -1� son utiles en los metodos en los que es deseable neutralizar la actividad biologica de las 1L-1 in vitro e in vivo.
[0048] Los presentes anticuerpos o fragmentos pueden ser anticuerpos o fragmentos neutralizantes que se unan especificamente a epitope de 1L-1� que afecte a la actividad biol-1 �. Los presentes anticuerpos o
ógica de la IL fragmentos pueden unirse a un epitope de 1L-1� sensible a la neutralizacion. Cuando un epitope de 1L -1� sensible a la neutralizacion es fijado por uno de los presentes anticuerpos o fragmentos, el resultado es una perdida de actividad biológica de la IL-1� que contiene al epitope.
[0049] En algunas realizaciones, los anticuerpos que se unen a la 1L-1� o los fragmentos que se unen a la 1L-1 pueden tener una 1C50 para inhibir la liberación estimulada por IL-1 de 1L-1� de celulas de la sangre que sea de menos de 50pM, como alternativa de aproximadamente 25pM o menos, como alternativa de aproximadamente 10pM o menos, o como alternativa de aproximadamente 2pM o menos. La expresion "1C50 para inhibir la liberación estimulada por IL-1� de IL-1� de celulas de la sangre" se refiere a la co ncentración requerida para inhibir el 50% de la liberación de IL-8 mediante la estimulacion de las celulas de la sangre con 1L-1 �. Los ejemplos de anticuerpos incluyen al anticuerpo al que aqui se denomina AB7.
[0050] La presente invencion tambien describe a un anticuerpo que se une a la IL-1 o un fragmento del mismo que se une a la IL-1� y comprende una secuencia de aminoacidos modificada, en donde el aminoacido modificado tiene una o al menos una sustitucion, adicion o delecion de una secuencia de aminoácidos de partida de la región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 o de la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos, o de una secuencia de aminoacidos de partida de la region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 25 o 26 o de la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 25 o 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos, donde el anticuerpo o fragmento modificado tiene la misma o practicamente la misma afinidad y especificidad de union al epitope como la secuencia de aminoacidos de partida. Se contempla que pueden hacerse una o varias sustituciones, deleciones o adiciones a los anticuerpos que se unen a la IL-1� o los fragmentos que se unen a la 1L-1� y que aqui se preven, tales como anticuerpos o fragmentos que comprendan a una región variable de cadena liviana que comprenda la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 o de la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos, y una region de cadena pesada que comprenda la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 15 o 26 o de la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 15 o 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos,
manteniendo al mismo tiempo la misma o practicamente la misma la afinidad y especificidad de union al epitope del anticuerpo o fragmento de partida. Por ejemplo, la presente invencion incluye a un anticuerpo que se une a la 1L-1� o un fragmento del mismo que se une a la IL-1 y comprende una secuencia de amino
acidos modificada, en donde la secuencia de aminoácidos modificada tiene una o al menos una sustitucion, adicion o delecion de una secuencia de aminoacidos de partida que comprende la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 o la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos, o la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 15 o 26 o de la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 15 o 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos, donde el anticuerpo o fragmento modificado tiene la misma o practicamente la misma afinidad y especificidad de union al epitope como la secuencia de aminoacidos de partida que comprende la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 o la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos, o la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 15 o 26 o la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 15 o 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos. Se entiende por la frase "practicamente la misma" afinidad que la constante de afinidad o de disociacion segun determinacion efectuada como aqui se describe no se ve incrementada o decrementada en más de una variación inherente en el ensayo para un anticuerpo o fragmento que comprende una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 o de la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos y una region de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 15 o 26 o de la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 15 o 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos, tal como la variacion que se observa cuando el ensayo es llevado a cabo independientemente tres o mas veces. Se entiende por la frase "practicamente la misma" especificidad de union al epitope que la union a una secuencia de aminoacidos que contiene al epitope segun determinacion efectuada como aqui se describe esta dentro de la variación inherente en el ensayo para un anticuerpo o fragmento que comprende una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 o de la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos y una región de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 15 o 26 o de la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 15 o 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos, tal como la variacion que se observa cuando el ensayo es efectuado independientemente tres o mas veces. Cuando se habla de efectuar una comparacion con un anticuerpo o fragmento que comprende una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de la I0 SEC N°: 9, 10 u 11 o de la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos y una region de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 25 o 26 o de la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 15 o 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos, ello significa que la comparación debe hacerse entre la secuencia de aminoácidos modificada y la secuencia de aminoacidos de partida en la cual se hicieron una o varias sustituciones, deleciones o adiciones, siendo tal secuencia de partida identica a todos los otros aminoacidos.
[0051] Anticuerpos, Anticuerpos Humanizados y Anticuerpos Manipulados Para No Presentar Inmunogenicidad en los Humanos
[0052] Los anticuerpos de la presente invención que se unen a la IL-1 pueden preverse en forma de anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos recombinantes, anticuerpos quimericos, anticuerpos injertados con C0R, anticuerpos plenamente humanos, anticuerpos de cadena unica y/o anticuerpos biespecificos, asi como fragmentos, incluyendo variantes y derivados de los mismos, obtenidos mediante tecnicas conocidas entre las cuales se incluyen, aunque sin caracter limitativo, la escision enzimatica, la sintesis de peptidos o las tecnicas recombinantes.
[0053] Los anticuerpos comprenden en general dos polipeptidos de cadena pesada y dos polipeptidos de cadena liviana, si bien tambien se contemplan anticuerpos de dominio unico que tengan una cadena pesada y una cadena liviana y anticuerpos de cadena pesada desprovistos de cadenas livianas. Hay cinco tipos de cadenas pesadas que se denominan alfa, delta, epsilon, gamma y mu, sobre la base de la secuencia de aminoacidos del dominio constante de cadena pesada. Estos distintos tipos de cadenas pesadas dan lugar a cinco clases de anticuerpos, que son las 1gA (incluyendo las IgA1 e IgA2), 1g0, 1gE, 1gG e 1gM, respectivamente, incluyendo cuatro subclases de 1gG, que son concretamente las 1gG1, 1gG2, 1gG3 e 1gG4. Hay tambien dos tipos de cadenas livianas, que son las llamadas kappa (K) o lambda (A) sobre la base de la secuencia de amino
acidos de los dominios constantes. Un anticuerpo de longitud completa incluye un dominio constante y un dominio variable. La region constante no tiene que estar presente en un fragmento de un anticuerpo que se une al antigeno. Los fragmentos de un anticuerpo aqui descrito que se unen al antigeno pueden incluir a los fragmentos de anticuerpo Fab, Fab', F(ab')2 y F(v). Como se trata mas detalladamente acerca del tema a continuacion, los fragmentos que se unen a la 1L-1� incluyen a fragmentos de anticuerpo y polipeptidos fijadores de antigeno que se unen a la 1L-1�.
[0054] Cada una de las secuencias de cadena pesada y cadena liviana de un anticuerpo o fragmento del mismo que se une al antigeno incluye una region variable con tres regiones determinantes complementarias (C0Rs) asi como regiones de entramado (FRs) que no son C0R. En el sentido en el que se las usa en la presente, las expresiones "cadena pesada" y "cadena liviana" significan la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena liviana, respectivamente, a no ser que se indique otra cosa. A las C0Rs de cadena pesada se las denomina aqui C0R-H1, C0R-H2 y C0R-H3. A las C0Rs de cadena liviana se las denomina aqui C0R-L1, C0R-L2 y C0R-L3. Las regiones variables y las C0Rs en una secuencia de anticuerpo pueden ser identificadas (1) segun las reglas generales que han
sido desarrolladas en la tecnica, o bien (11) alineando las secuencias contra una base de datos de regiones variables conocidas. Los metodos para identificar estas regiones estan descritos en Kontermann and 0ubel, redactores en jefe, Antibody Engineering, Springer, Nueva York, NY, 2001, y 0inarello et al., Current Protocols in 1mmunology, John Wiley and Sons 1nc., Hoboken, NJ, 2000. Las bases de datos de las secuencias de anticuerpos estan descritas en y puede accederse a las mismas a traves de la base de datos "The Kabatman" en www.bioinf.org.uk/abs (mantenida por A.C. Martin del 0epartamento de Bioquimica y Biologia Molecular del University College de Londres, Londres, 1nglaterra) y VBASE2 en www.vbase2.org, como se describe en Retter et al., Nucl. Acids Res., 33 (edicion de la base de datos): 0671-0674 (2005). El sitio de la red de la base de datos "Kabatman" tambien incluye reglas empiricas generales para identificar las C0Rs. La expresion "C0R", en el sentido en el que se la usa en la presente, es como se define en Kabat et al., Sequences of 1mmunological 1nterest, 5a ed., U.S. 0epartment of Health and Human Services, 1991, a no ser que se indique otra cosa.
[0055] La presente invención incluye a los anticuerpos que se unen a la IL-1� e incluyen dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas livianas de longitud completa. Como alternativa, los anticuerpos que se unen a la 1L-1� pueden ser constructos tales como anticuerpos de cadena unica o "mini" anticuerpos que conservan actividad de union a la IL-1 �. Tales constructos pueden ser preparados por metodos conocidos en la tecnica tales como, por ejemplo, la clonacion y ensamblaje mediados por PCR (PCR = reaccion en cadena de la polimerasa) de anticuerpos de cadena unica para expresion en E. coli (como se describe en Antibody Engineering. The practical approach series, J. McCafferty, H. R. Hoogenboom y 0. J. Chiswell, redactores en jefe, Oxford University Press, 1996). En este tipo de constructo, las partes variables de las cadenas pesadas y livianas de una molecula de anticuerpo son amplificadas por PCR a partir de c0NA. Los amplicones resultantes son entonces ensamblados, por ejemplo, en un segundo paso de PCR, por medio de un 0NA enlazador (0NA = acido desoxirribonucleico) que codifica un enlazador proteina flexible que se compone de los aminoacidos Gly y Ser. Este enlazador permite que las partes variables de cadena pesada y cadena liviana se plieguen de forma tal que la bolsa de fijacion del antigeno es regenerada y el antigeno es fijado con afinidades que son a menudo equiparables a las de la molecula progenitora de inmunoglobulina dimerica de longitud completa.
[0056] Los anticuerpos y fragmentos de la presente invención que se unen a la IL-1 incluyen a variantes de los ejemplos de anticuerpos, fragmentos y secuencias que aqui se dan a conocer. Las variantes incluyen a peptidos y polipeptidos que comprenden una o varias sustituciones, deleciones y/o adiciones de secuencias de aminoácidos que tienen la misma o practicamente la misma afinidad y especificidad de union al epitope como uno o varios de los ejemplos de anticuerpos, fragmentos y secuencias que aqui se dan a conocer. Asi, las variantes incluyen a peptidos y polipeptidos que comprenden una o varias sustituciones, deleciones y/o adiciones de secuencias de aminoacidos en los ejemplos de anticuerpos, fragmentos y secuencias que aqui se dan a conocer, donde tales sustituciones, deleciones y/o adiciones no ocasionan considerables variaciones de la afinidad y especificidad de union al epitope. Por ejemplo, una variante de un anticuerpo o fragmento puede ser resultado de una o varias variaciones de un anticuerpo o fragmento que comprenda una o varias de las secuencias de aminoacidos de las 10 SEC NOMS.: 9, 10 u 11 o de las 10 SEC NOMS.: 9, 10 u 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos de las 10 SEC NOMS.: 8, 14, 15, 15 o 26 o de las 10 SEC NOMS.: 8, 14, 15, 15 o 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos, donde el anticuerpo o fragmento modificado tiene la misma o practicamente la misma afinidad y especificidad de union al epitope como la secuencia de partida. Las variantes pueden darse de forma natural, tal como es el caso de las variantes alelicas
o de corte y empalme, o bien pueden ser construidas artificialmente. Las variantes pueden prepararse a partir de las correspondientes moleculas de acido nucleico que codifican dichas variantes. Las variantes de los presentes anticuerpos y fragmentos que se unen a la IL-1� pueden tener modificaciones en secuencias de aminoácidos de cadena liviana y/o pesada que se den de manera natural o sean introducidas mediante manipulacion in vitro de secuencias nativas usando tecnicas de 0NA recombinante. Las variantes que se dan de manera natural incluyen a las variantes "somaticas" que son generadas in vivo en las correspondientes secuencias nucleotidicas de la linea germinal durante la generacion de la respuesta de un anticuerpo a un antigeno foraneo.
[0057] Las variantes de los anticuerpos que se unen a la IL-1� y de los fragmentos que se unen a la 1L-1� pueden tambien ser preparadas mediante tecnicas de mutagenesis. Por ejemplo, pueden introducirse cambios de aminoacidos aleatoriamente en toda la región codificadora de un anticuerpo y las variantes resultantes pueden ser cribadas con respecto a la afinidad de unión para la IL-1 o con respecto a otra propiedad. Como alternativa, pueden introducirse cambios de aminoácidos en regiones seleccionadas de un anticuerpo para IL-1�, tal como en las C0Rs de cadena liviana y/o pesada, y/o en las regiones de entramado, y los anticuerpos resultantes pueden ser cribados con respecto a la unión a la IL-1� o con respecto a alguna otra actividad. Los cambios de aminoncluyen a una o varias
ácidos i sustituciones de aminoacidos en una C0R, yendo desde una unica diferencia de aminoacido hasta la introduccion de una pluralidad de permutaciones de aminoacidos dentro de una C0R dada, tal como la C0R3. En otro metodo, la contribución de cada residuo dentro de una C0R a la union a la 1L-1� puede ser valorada sustituyendo al menos un residuo dentro de la C0R por alanina. Lewis et al. (1995), Mol. 1mmunol. 32: 1065-72. Los residuos que no sean optimos para la unión a la IL-1� pueden ser entonces cambiados a fin de determinar una secuencia mas optima. Tambien estan incluidas las variantes generadas mediante insercion de aminoacidos para incrementar el tamafo de una C0R, tal como la C0R3. Por ejemplo, las de la mayoria de las secuencias C0R3 de cadena liviana tienen una longitud de nueve aminoacidos. Las secuencias de cadena liviana en un anticuerpo que sean mas cortas que nueve residuos pueden ser optimizadas para la unión a la IL-1� mediante la inserción de apropiados aminoácidos para incrementar la longitud de la
C0R.
[0058] Tambien pueden prepararse variantes mediante "mezcla de cadenas" realizada con cadenas livianas o pesadas. Marks et al. (1992), Biotechnology 10: 779.83. Una unica cadena liviana (o pesada) puede ser combinada con una biblioteca que tenga un repertorio de cadenas pesadas (o livianas), y la poblacion resultante se somete a cribaje con respecto a una actividad deseada, tal como la union a la 1L-1�. Esto permite el cribaje de una mayor muestra de distintas cadenas pesadas (o livianas) en combinacion con una unica cadena liviana (o pesada) en comparacion con la que es posible con bibliotecas que comprendan repertorios de cadenas tanto pesadas como livianas.
[0059] Los anticuerpos y fragmentos de la presente invención que se unen a la IL-1 incluyen a derivados de los ejemplos de anticuerpos, fragmentos y secuencias que aqui se dan a conocer. Los derivados incluyen a polipeptidos o peptidos o variantes, fragmentos o derivados de los mismos que han sido modificados quimicamente. Los ejemplos incluyen a la union covalente de uno o varios polimeros, tales como polimeros hidrosolubles, carbohidratos enlazados a N o enlazados a O, azucares, fosfatos y/u otras moleculas de este tipo. Los derivados son modificados de una manera que es distinta de los peptidos o polipeptidos de partida que se dan de manera natural, radicando la diferencia ya sea en el tipo o bien en la ubicacion de las moleculas unidas. Los derivados adicionalmente incluyen la delecion de uno o varios grupos quimicos que esten de manera natural presentes en el peptido o polipeptido.
[0060] Los anticuerpos y fragmentos de la presente invención que se unen a la IL-1 pueden ser biespecificos. Los anticuerpos o fragmentos biespecificos pueden ser de varias configuraciones. Por ejemplo, los anticuerpos biespecificos pueden parecerse a los anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo) individuales, pero pueden tener dos sitios de union a distintos antigenos (regiones variables). Los anticuerpos biespecificos pueden producirse mediante tecnicas quimicas (Kranz et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 78: 5807), mediante tecnicas de "polidoma" (Pat. U.S. N° 4.474.893)
o mediante tecnicas de 0NA recombinante. Los anticuerpos biespecificos de la presente invencion pueden tener especificidades de union para al menos dos distintos epitopes, al menos uno de los cuales es un epitope de 1L-1�. Los anticuerpos y fragmentos que se unen a la IL-1� pueden tambien ser heteroanticuerpos. Los heteroanticuerpos son dos
o más anticuerpos o fragmentos de fijacion de anticuerpo (Fab) unidos mutuamente, teniendo cada anticuerpo o fragmento una distinta especificidad.
[0061] Se contemplan para los presentes anticuerpos y fragmentos que se unen a la IL-1 tecnicas para crear versiones de 0NA recombinante de las regiones de union al antigeno de moleculas de anticuerpos que evitan la generacion de anticuerpos monoclonales. El 0NA es clonado en un sistema de expresion bacteriano. Un ejemplo de una tecnica de este tipo que es adecuada para la puesta en práctica de esta invención hace uso de un sistema vector lambda bacteriofago que tiene una secuencia guia que hace que la proteina Fab expresada migre al espacio periplasmico (entre la membrana de la celula bacteriana y la pared celular) o sea secretada. Pueden generarse y cribarse rápidamente grandes numeros de fragmentos Fab funcionales para seleccionar aquellos que se unan a la 1L-1�. Tales agentes que se unen a la IL-1� (fragmentos Fab con especificidad para un polip-1�) quedan especincluidos
eptido 1L ificamente dentro de los anticuerpos y fragmentos de la presente invención que se unen a la IL-1 .
[0062] Los presentes anticuerpos y fragmentos que se unen a la IL-1� pueden ser anticuerpos humanizados o anticuerpos manipulados para no presentar inmunogenicidad en los humanos. En el sentido que se le da en la presente, un anticuerpo humanizado, o un fragmento del mismo que se une al antigeno, es un polipeptido recombinante que comprende una parte de un sitio de un anticuerpo no humano que se une al antigeno y una parte de las regiones constantes y/o de entramado de un anticuerpo humano. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo manipulado para no presentar inmunogenicidad en los humanos es un anticuerpo no humano (p. ej. de raton) que ha sido manipulado modificando (p. ej. delecionando, insertando o sustituyendo) aminoacidos en posiciones especificas para asi reducir o eliminar toda detectable inmunogenicidad del anticuerpo modificado en un humano.
[0063] Los anticuerpos humanizados incluyen a anticuerpos quimericos y anticuerpos injertados con C0R. Los anticuerpos quimericos son anticuerpos que incluyen una region variable de anticuerpo no humano enlazada a una region constante humana. Asi, en los anticuerpos quimericos la region variable es en la mayoria de los casos no humana, y la region constante es humana. Se describen anticuerpos quimericos y metodos para hacerlos en Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 81: 6841-6855 (1984), Boulianne et al., Nature 312: 643-646 (1984) y en la Publicacion de Solicitud al Amparo del PCT WO 86/01533. A pesar de que pueden ser menos inmunogenicos que un anticuerpo monoclonal de raton, las administraciones de anticuerpos quimericos han venido siendo asociadas a las respuestas inmunes humanas (HAMA) a la parte no humana de los anticuerpos. Los anticuerpos quimericos pueden ser producidos cortando y empalmando los genes de una molecula de anticuerpo de raton de apropiada especificidad de union al antigeno junto con genes de una molecula de anticuerpo humano de apropiada actividad biologica, tal como la capacidad de activar el complemento humano y mediar en la A0CC (A0CC = citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). Morrison et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851; Neuberger et al. (1984), Nature, 312:604. Un ejemplo es la sustitucion de una region Fc por la de un distinto isotipo.
[0064] Los anticuerpos injertados con C0R son anticuerpos que incluyen las C0Rs de un anticuerpo "donante" no humano enlazadas a la region de entramado de un anticuerpo "receptor" humano. En general, los anticuerpos injertados
con C0R incluyen mas secuencias de anticuerpo humano que los anticuerpos quimericos porque incluyen tanto secuencias de región constante como secuencias de región variable (de entramado) de anticuerpos humanos. Asi por ejemplo, un anticuerpo humanizado injertado con C0R de la invencion puede comprender una cadena pesada que comprenda una secuencia de aminoacidos contiguos (p. ej. de aproximadamente 5 o mas, 10 o mas o incluso 15 o mas residuos de aminoácidos contiguos) de la region de entramado de un anticuerpo humano (como p. ej. la FR-1, la FR-2 o la FR-3 de un anticuerpo humano) u opcionalmente la mayor parte o la totalidad de toda la región de entramado de un anticuerpo humano. Se describen anticuerpos injertados con C0R y metodos para hacerlos en Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986), Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988) y Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988). Metodos que pueden ser usados para producir anticuerpos humanizados tambien estan descritos en las Patentes U.S. 4.816.567, 5.721.367, 5.837.243 y 6.180.377. Se considera que en comparacion con los anticuerpos quimericos los anticuerpos injertados con C0R es menos probable que induzcan una reaccion inmune contra partes de anticuerpos no humanos. Sin embargo se ha descrito que las secuencias de entramado de los anticuerpos donantes son requeridas para la afinidad y/o especificidad de union del anticuerpo donante, presumiblemente porque estas secuencias de entramado afectan al plegamiento de la parte de union al antigeno del anticuerpo donante. Por consiguiente, cuando secuencias de C0R no humanas donantes son injertadas a secuencias de entramado humanas inalteradas, el resultante anticuerpo injertado con C0R puede presentar, en algunos casos, perdida de avidez de union con respecto al anticuerpo donante no humano original. Veanse, p. ej., Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988) y Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988).
[0065] Los anticuerpos manipulados para no presentar inmunogenicidad en los humanos incluyen a los anticuerpos "revestidos" y a los anticuerpos preparados usando la tecnologia HUMAN ENG1NEER1NGMF (MF = marca de fabrica) (XOMA (US) LLC, Berkeley, CA). La tecnologia HUMAN ENG1NEER1NGMF está disponible comercialmente y supone alterar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo quimerico o de raton, haciendo cambios especificos en la secuencia de aminoacidos del anticuerpo para producir un anticuerpo modificado con inmunogenicidad reducida en un humano, que sin embargo conserve las deseables propiedades de union de los anticuerpos no humanos originales. En general, la tecnica supone clasificar los residuos de aminoácidos de un anticuerpo no humano (p. ej. de raton) como residuos "de bajo riesgo", "de riesgo moderado" o "de alto riesgo". La clasificacion se lleva a cabo usando un calculo de riesgo/recompensa global que evalua los beneficios previstos de hacer una determinada sustitucion (p. ej. para inmunogenicidad en humanos) contra el riesgo de que la sustitucion afecte a las propiedades de plegamiento y/o fijacion de antigeno del anticuerpo resultante. Asi, una posicion de bajo riesgo es una para la cual se prevea que una sustitucion sera beneficiosa porque se preve que reducira la inmunogenicidad sin afectar mucho a las propiedades de union al antigeno. Una posicion de riesgo moderado es una para la cual se prevea que una sustitucion reducira la inmunogenicidad, pero es mas probable que afecte al plegamiento de la proteina y/o a la union al antigeno. Las posiciones de alto riesgo contienen residuos que es sumamente probable que esten implicados en el correcto plegamiento o en la union al antigeno. En general, las posiciones de bajo riesgo en un anticuerpo no humano son sustituidas con residuos humanos, las posiciones de alto riesgo son raramente sustituidas, y a veces se hacen, aunque no indiscriminadamente, sustituciones humanizantes en posiciones de riesgo moderado. Las posiciones con prolinas en la secuencia de región variable de anticuerpo no humano son habitualmente clasificadas como posiciones de riesgo al menos moderado.
[0066] El residuo de aminoacido humano a ser sustituido en particular en una determinada posicion de bajo riesgo o de riesgo moderado de una secuencia de anticuerpo no humano (p. ej. de raton) puede ser seleccionado alineando una secuencia de aminoácidos de las regiones variables del anticuerpo no humano con la correspondiente región de una secuencia de anticuerpo humano especifica o de consenso. Los residuos de aminoacidos en posiciones de bajo riesgo
o de riesgo moderado en la secuencia no humano pueden usarse en sustitución de los correspondientes residuos en la secuencia de anticuerpo humano segun la alineacion. Las tecnicas para hacer proteinas manipuladas humanas se describen mas detalladamente en Studnicka et al., Protein Engineering, 7: 805-814 (1994), en las Patentes U.S. 5.766.886, 5.770.196, 5.821.123 y 5.869.619, y en la Publicacion de Solicitud WO 93/11794 al amparo del PCT.
[0067] Los anticuerpos "revestidos" son anticuerpos no humanos o humanizados (como p. ej. anticuerpos quimericos o injertados con C0R) que han sido manipulados para sustituir ciertos residuos de aminoacidos expuestos al solvente para reducir adicionalmente su inmunogenicidad o acrecentar su funcion. Puesto que se presume que los residuos superficiales de un anticuerpo quimerico es menos probable que afecten al correcto plegamiento del anticuerpo y es mas probable que provoquen una reaccion inmune, el revestimiento de un anticuerpo quimerico puede incluir, por ejemplo, los pasos de identificar los residuos expuestos al solvente en la region de entramado no humana de un anticuerpo quimerico y sustituir al menos a uno de ellos con los correspondientes residuos superficiales de una región de entramado humana. El revestimiento puede llevarse a cabo mediante cualquier adecuada tecnica de manipulacion, incluyendo el uso de la tecnologia HUMAN ENG1NEER1NGMF anteriormente descrita.
[0068] En un enfoque distinto, puede lograrse una recuperacion de avidez de union "deshumanizando" un anticuerpo injertado con C0R. La deshumanizacion puede incluir la restitucion de residuos de regiones de entramado del anticuerpo donante al anticuerpo injertado con C0R, restituyendo con ello el correcto plegamiento. Puede lograrse una "deshumanizacion" similar a base de (1) incluir partes de la region de entramado "donante" en el anticuerpo "receptor" o
(11) injertar partes de la region de entramado del anticuerpo "donante" en el anticuerpo receptor (junto con las C0Rs
donantes injertadas).
[0069] Para una adicional discusion de anticuerpos, anticuerpos humanizados, anticuerpos manipulados para no presentar inmunogenicidad en los humanos y metodos para su preparacion, vease Kontermann y 0ubel, redactores en jefe, Antibody Engineering, Springer, Nueva York, NY, 2001.
[0070] Los ejemplos de anticuerpos humanizados o manipulados para no presentar inmunogenicidad en los humanos incluyen a los anticuerpos 1gG, 1gM, 1gE, 1gA e 1g0. Los presentes anticuerpos pueden ser de cualquier clase (1gG, 1gA, 1gM, 1gE, 1g0, etc.) o isotipo y pueden comprender una cadena liviana kappa o lambda. Por ejemplo, un anticuerpo humano puede comprender una cadena pesada o un fragmento definido de 1gG, tal como al menos uno de los isotipos 1gG1, 1gG2, 1gG3 o 1gG4. Como ejemplo adicional, los presentes anticuerpos o fragmentos pueden comprender una cadena pesada de 1gG1 y una cadena liviana de 1gG1.
[0071] Los presentes anticuerpos y fragmentos pueden ser anticuerpos humanos tales como anticuerpos que se unan a los polipeptidos 1L-1� y sean codificados por secuencias deácido nucleico que sean variantes somáticas que se den de manera natural de secuencia de acido nucleico de inmunoglobulina de la linea germinal, y fragmentos, variantes sinteticas, derivados y fusiones de los mismos. Tales anticuerpos pueden ser producidos por cualquier metodo conocido en la tecnica, tal como mediante el uso de mamiferos transgenicos (tales como ratones transgenicos) en los cuales el repertorio de inmunoglobulinas nativas ha sido sustituido con genes V humanos del cromosoma del mamifero. Tales mamiferos parecen realizar recombinacion V0J e hipermutacion somatica de los genes de anticuerpo de la linea germinal de manera normal, produciendo asi anticuerpos de alta afinidad con secuencias completamente humanas.
[0072] Los anticuerpos humanos pueden tambien ser generados mediante el cribaje in vitro de bibliotecas de anticuerpos de presentacion en fagos. Veanse Hoogenboom et al. (1991), J. Mol. Biol. 227: 381 y Marks et al. (1991), J. Mol. Biol. 222: 581. Han sido descritas y pueden ser preparadas facilmente varias bibliotecas de presentacion en fagos que contienen anticuerpos. Las bibliotecas pueden contener una diversidad de secuencias de anticuerpos humanos, tales como fragmentos Fab, Fv y scFv humanos, que pueden ser cribadas contra una diana apropiada. Las bibliotecas de presentacion de fagos pueden comprender peptidos o proteinas que no sean anticuerpos, que pueden ser cribados para identificar agentes de unión selectiva a la IL-1�.
[0073] Los anticuerpos y fragmentos que se unen a la IL-1 pueden comprender una o varias partes que no se unan a la IL-1 pero que en lugar de ello sean responsables de otras funciones tales como la vida media circulante, el efecto citotoxico directo, el etiquetado detectable o la activacion de la cascada del complemento endogena del receptor o la citotoxicidad celular endogena. Los anticuerpos o fragmentos pueden comprender la totalidad o una parte de la región constante y pueden ser de cualquier isotipo, incluyendo los 1gA (p. ej. 1gA1 o 1gA2), 1g0, 1gE, 1gG (p. ej. 1gG1, 1gG2, 1gG3 o 1gG4) o 1gM. Ademas o en lugar de comprender una region constante, los compuestos de la invencion que se unen al antigeno pueden incluir una marca de epitope, un epitope del receptor de salvamento, una mitad etiqueta a efectos diagnosticos o de purificacion, o una mitad citotoxica tal como un radionuclido o una toxina.
[0074] La region constante (cuando este presente) de los presentes anticuerpos y fragmentos puede ser del tipo y1, y2, y3, y4, 1, 2 o 5 o E, preferiblemente del tipo y, y más preferiblemente del tipo 1, mientras que la parte constante de una cadena liviana humana puede ser del tipo K o A (lo cual incluye a los subtipos A1, A2 y A3), pero es preferiblemente del tipo K.
[0075] Las variantes tambien incluyen a los anticuerpos o fragmentos que comprenden una region Fc modificada, donde la region Fc modificada comprende al menos una modificacion de aminoacido con respecto a la region Fc de tipo salvaje. La region Fc variante puede estar disefada, con respecto a una molecula equiparable que comprenda la region Fc de tipo salvaje, para fijarse a los receptores Fc con mayor o menor afinidad.
[0076] Por ejemplo, los presentes anticuerpos y fragmentos que se unen a la IL-1� pueden comprender una region Fc modificada. La expresion "region Fc" se refiere a los polipeptidos sinteticos o que se dan de manera natural y son homologos al dominio C-terminal de 1gG que es producido al tener lugar la digestion con papaina de la 1gG. El Fc de las 1gG tiene un peso molecular de aproximadamente 50 k0. En los presentes anticuerpos y fragmentos puede usarse una region Fc entera, o solamente una parte acrecentadora de la vida media. Adicionalmente son aceptables muchas modificaciones de la secuencia de aminoacidos, puesto que no en todos los casos es necesaria o deseada la actividad nativa.
[0077] La region Fc puede ser mutada, si se desea, para inhibir su capacidad para fijar el complemento y fijarse al receptor Fc con alta afinidad. Para Fc de 1gG murina, la sustitucion de Glu 318, Lys 320 y Lys 322 por Ala hace que la proteina sea incapaz de dirigir la A0CC. La sustitucion de Leu 235 por Glu inhibe la capacidad de la proteina para fijarse al receptor Fc con alta afinidad. Tambien son conocidas varias mutaciones para las 1gG humanas (veanse, p. ej., Morrison et al., 1994, The 1mmunologist 2: 119 124 y Brekke et al., 1994, The 1mmunologist 2: 125).
[0078] En algunas realizaciones, los presentes anticuerpos o fragmentos estan provistos de una region Fc modificada
donde una region Fc que se da de manera natural es modificada para incrementar la vida media del anticuerpo o fragmento en un ambiente biologico, tal como por ejemplo la vida media en suero o una vida media medida mediante un ensayo in vitro. Tambien se describen en la Patente U.S. N° 6.998.253 metodos para alterar la forma original de una region Fc de una 1gG.
[0079] En ciertas realizaciones puede ser deseable modificar el anticuerpo o fragmento a fin de incrementar su vida media en suero, por ejemplo afadiendo moleculas tales como PEG u otros polimeros hidrosolubles, incluyendo polimeros polisacaridos, a fragmentos de anticuerpo para incrementar la vida media. Esto puede tambien lograrse, por ejemplo, mediante la incorporacion de un epitope de union del receptor de salvamento al fragmento de anticuerpo (p. ej. mediante mutacion de la region apropiada del fragmento de anticuerpo o bien incorporando el epitope a una marca peptidica que es entonces fusionada con el fragmento de anticuerpo en cualquier extremo o en el centro, p. ej. mediante sintesis de peptidos o de 0NA) (vease la Publicacion 1nternacional N° WO 96/32478). La expresion "epitope de union del receptor de salvamento" se refiere a un epitope de la region Fc de una molecula de 1gG (p. ej. de 1gG1, 1gG2, 1gG3 o 1gG4) que es responsable de incrementar la vida media en suero in vivo de la molecula de 1gG.
[0080] Un epitope de union del receptor de salvamento puede incluir una region en la que cualquier residuo de aminoácido o varios residuos de aminoacidos cualesquiera de uno o dos bucles de un dominio Fc son transferidos a una posicion analoga del fragmento de anticuerpo. Aun mas preferiblemente, son transferidos tres o mas residuos de uno o dos bucles del dominio Fc. Aun mas preferiblemente, el epitope se toma del dominio CH2 de la region Fc (p. ej. de una 1gG) y se transfiere a la region CH1, CH3 o VH, o a mas de una region de este tipo, del anticuerpo. Como alternativa, el epitope se toma del dominio CH2 de la region Fc y se transfiere a la region CL o a la region VL, o a ambas, del fragmento del anticuerpo. Veanse tambien las solicitudes internacionales WO 97/34631 y WO 96/32478, que describen variantes de Fc y su interaccion con el receptor de salvamento.
[0081] La mutacion de residuos dentro de sitios de fijacion del receptor Fc puede redundar en una funcion efectora alterada, tal como una actividad de A0CC o de C0C (C0C = citotoxicidad dependiente del complemento) alterada, o una vida media alterada. Las potenciales mutaciones incluyen la insercion, delecion o sustitucion de uno o varios residuos, incluyendo la sustitucion con alanina, una sustitucion conservadora, una sustitucion no conservadora o una sustitución con un correspondiente residuo de aminoácido en la misma posicion de una distinta subclase de 1gG (como
p. ej. la sustitucion de un residuo de 1gG1 con un correspondiente residuo de 1gG2 en esa posicion). Por ejemplo se ha descrito que la mutacion de la serina en la posicion de aminoacido 241 en la 1gG4 a prolina (que se encuentra en esa posicion en la 1gG1 y en la 1gG2) condujo a la produccion de un anticuerpo homogeneo, asi como a una prolongacion de la vida media en suero y a un mejoramiento de la distribucion tisular en comparacion con la 1gG4 quimerica original. (Angal et al., Mol 1mmunol. 30:105-8, 1993).
[0082] Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invencion no reacciona cruzadamente con diana alguna que no sea la IL-1�. Por ejemplo, los presentes anticuerpos y fragmentos preferiblemente no se unen de manera detectable a la IL-1a.
[0083] Anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a la IL-11
[0084] Los fragmentos de anticuerpo son partes de un anticuerpo intacto de longitud completa tales como una región variable o de union al antigeno del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen a los miembros del grupo que consta de fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moleculas de anticuerpo de cadena unica (como p. ej. scFv); fragmentos de anticuerpo multiespecifico tales como anticuerpos biespecificos, triespecificos y multiespecificos (como p. ej. diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos); minicuerpos; anticuerpos recombinantes quelantes; tricuerpos o bicuerpos; intracuerpos; nanocuerpos; pequeños productos inmunofarmaceuticos modulares (SM1P), proteinas de fusion de inmunoglobulina de dominio de union; anticuerpos camelizados; anticuerpos con contenido de VHH; y cualesquiera otros polipeptidos hechos a base de fragmentos de anticuerpo.
[0085] La invención aporta un anticuerpo que se une a la IL-1� o un fragmento del mismo que se une a la 1L-1 y comprende una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 o de la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos y una región de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 25 o 26 o de la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 25 o 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos.
[0086] La Fig. 1 ilustra la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 2. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de los que se describen en el contexto de la presente invencion comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 21, y más preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de la 10 SEC N°: 4, de la 10 SEC N°: 5, de la 10 SEC N°: 6, de la 10 SEC N°: 7 o de la 10 SEC N°: 8. Los anticuerpos que se describen dentro del contexto de la presente invencion tambien pueden comprender la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 12 o de la 10 SEC N°: 13, y preferiblemente comprenden la 10 SEC N°: 14 o la 10 SEC N°: 15. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de los que se describen en el contexto de la invención comprende una región variable de cadena liviana y una región variable de cadena pesada, y la region variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 2 (p. ej. comprende la secuencia de aminoacidos de las 10 SEC NOMS.:4-8, 12-15 o 21). La cadena liviana del anticuerpo preferiblemente comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 1 o consta esencialmente o bien consta de la misma. Asi por ejemplo, la cadena liviana del anticuerpo puede comprender, constar esencialmente de o bien constar de la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9, de la 10 SEC N°: 10 o de la 10 SEC N°: 11. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (como p. ej. una region variable de cadena pesada de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) de los que se describen en el contexto de la presente invencion comprende, consta esencialmente de o bien consta de la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 23 o de la 10 SEC N°: 24 (como p. ej. la 10 SEC N°: 25 o la 10 SEC N°: 26).
[0087] La invención describe un anticuerpo que se une a la IL-1 o un fragmento del mismo que se une a la 1L-1 y comprende una region variable de cadena pesada que comprende una de las secuencias de aminoacidos de la 10 SEC N°: 2, 23 o 24, como alternativa una de las secuencias de aminoacidos de la 10 SEC N°: 12, 13, 21, 23 o 24, o como alternativa la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 12, 13 o 21, o como alternativa la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 13 o 21, o como alternativa la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 8, 14 o 15, o como alternativa la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 8 o 15. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de los que se describen en el contexto de la presente invención comprende una región variable de cadena liviana que preferiblemente consta de la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9, de la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 10 o de la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 11. A titulo de ejemplo, un anticuerpo preferido comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 8 y una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 11.
[0088] La invencion tambien describe un anticuerpo que se une a la 1L-1 o un fragmento del mismo que se une a la 1L1� y comprende una de las secuencias de aminoacidos de la 10 SEC N°: 28. Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento comprende ademas una de las secuencias de aminoacidos de la 10 SEC N°: 27.
[0089] La invención tambien describe un anticuerpo que se une a la 1L-1 o un fragmento del mismo que se une a la 1L1� y comprende, consta esencialmente de o bien consta de la 10 SEC N°: 29. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de los que se describen en el contexto de la presente invencion comprende, consta esencialmente de o bien consta de la 10 SEC N°: 31-35, o bien como alternativa la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 31, 32 o 33, o como alternativa la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 32 o 33. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de los que se describen en el contexto de la presente invención comprende además una región variable de cadena liviana que comprende una de las secuencias de aminoacidos de la 10 SEC N°: 27. Un anticuerpo preferido comprende una de las secuencias de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9, de la 10 SEC N°: 10 o de la 10 SEC N°: 11.
[0090] Las Figs. 2, 3 y 4 exponen las regiones variables de cadena pesada y de cadena liviana de los anticuerpos que se describen en el contexto de la invencion, cuyas secuencias corresponden a anticuerpos que aqui se denominan AB1, AB2, AB3, AB4, AB5, AB5.1, AB5.2, AB5.3 y AB5.4. Las secuencias AB5.1, AB5.2, AB5.3 Y AB5.4 contienen posiciones variables, designadas como X1 y X2, en la region C0R3 de cadena pesada. Estas posiciones variables pueden ser cualesquiera de los aminoacidos indicados. Preferiblemente, X1 y X2 son respectivamente alanina y arginina, valina y arginina, fenilalanina y arginina, lisina y lisina, o asparagina y arginina.
[0091] El AB5.1 comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 12 y una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°:
10. El AB5.2 comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 13 y una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 11. El AB5.3 comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 23 y una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 10. El AB5.4 comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 24 y una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 11.
[0092] La presente invención incluye a fragmentos de anticuerpo que se unen a la IL-1 que comprenden las secuencias de cadena pesada o liviana de las 10 SEC NOMS.: 9, 10 u 11 o de las 10 SEC NOMS.: 9, 10 u 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos o de las 10 SEC NOMS.: 8, 14, 15, 25 o 26 o de las 10 SEC NOMS.: 8, 14, 15, 25 o 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos y se unen la IL-1�. En el sentido en el que se le usa en la presente, el vocablo "fragmentos" se refiere a cualesquiera 3 o mas aminoacidos contiguos (como p. ej. 4 o mas, 5 o mas, 6 o mas, 8 o mas, o incluso 10 o mas aminoacidos contiguos) del anticuerpo e incluye a los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y F(v) o a las individuales regiones variables de cadena liviana o pesada o partes de las mismas. Los fragmentos que se unen a la 1L-1� incluyen, por ejemplo, a los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, F(v) y scFv. Estos fragmentos carecen del fragmento Fc de un anticuerpo intacto, se eliminan mas rapidamente de la circulacion, y pueden tener menos fijacion tisular inespecifica que un anticuerpo intacto. Vease Wahl et al. (1983), J. Nucl. Med. 24: 316-25. Estos fragmentos pueden producirse a partir de anticuerpos intactos usando metodos perfectamente conocidos, como por ejemplo mediante fragmentacion proteolitica con enzimas tales como papaina (para producir fragmentos Fab)
o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2).
[0093] La presente invención incluye a anticuerpos que se unen a la IL-1� y fragmentos de los mismos que se unen a la IL-1� y comprenden una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 o de la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos, o de la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 25 o 26 o de la 10 SEC N°: 8, 14, 15, 25 o 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos que se unen selectivamente al ligando IL-1� pero permiten o permiten considerablemente la fijaci
ón del ligando IL-1 unido al receptor tipo 1 de 1L-1 (IL-1R1) (veanse el Ejemplo 14 y las Figs. 19 y 20). En contraste con muchos anticuerpos, entre los que se incluyen varios anticuerpos conocidos que se unen a la IL-1�, los anticuerpos denominados AB5 y AB7 se unen selectivamente al ligando 1L-1 �, pero no bloquean o prácticamente no bloquean la unión de IL-1 a 1L-1R1, como se demuestra en la Ejemplo 14. Por ejemplo, el anticuerpo denominado AB7 se une a un epitope de 1L-1 pero aun permite a la 1L -1 unida unirse al 1L-1R1. Asi, la presente invencion incluye a anticuerpos o fragmentos que se unen a la IL-1� uniendose a un epitope de 1L-1� de forma tal que el anticuerpo o fragmento unido permite o permite considerablemente que la IL-1� se fije al receptor 1 de 1L-1 (IL-1R1), y el anticuerpo o fragmento se une a la IL-1� humana con una constante de disociacion de menos de 3pM.
[0094] Estan perfectamente descritos en la tecnica ensayos in vitro y basados en celulas que estan destinados a ser usados para determinar la fijacion de 1L-1 al receptor tipo 1 de 1L-1, incluyendo ensayos para efectuar dicha determinacion en presencia de moleculas (tales como anticuerpos, antagonistas u otros inhibidores) que se unen a la IL1� o al 1L-1R1 (veanse, por ejemplo, Evans et al., (1995), J. Biol. Chem. 270:11477-11483; Vigers et al., (2000), J. Biol. Chem. 275:36927-36933; Yanofsky et al., (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93:7381.7386; Fredericks et al., (2004), Protein Eng. 0es. Sel. 17:95-106; Slack et al., (1993), J. Biol. Chem. 268:2513-2524; Smith et al., (2003), 1mmunity 18:87-96; Vigers et al., (1997), Nature 386:190-194; Ruggiero et al., (1997), J. 1mmunol. 158:3881-3887; Guo et al., (1995), J. Biol. Chem. 270:27562-27568; Svenson et al., (1995), Eur. J. 1mmunol. 25:2842-2850; Arend et al., (1994), J. 1mmunol. 153:4766-4774). El receptor tipo 1 de 1L-1 recombinante, incluyendo al receptor tipo 1 de 1L-1 humana, para tales ensayos puede ser fácilmente obtenido de las de una variedad de fuentes comerciales (vease, por ejemplo, R&0 Systems, S1GMA). El receptor tipo 1 de 1L-1 tambien puede ser expresado a partir de un vector o constructo de expresion introducido en una apropiada celula huesped usando tecnicas de transfeccion y biologia molecular estandar que son conocidas en el ramo. El receptor tipo 1 de 1L-1 expresado puede ser luego aislado y purificado para ser usado en ensayos de fijacion, o para ser como alternativa usado directamente en una forma asociada a una celula.
[0095] Por ejemplo, la fijacion de 1L-1� al receptor tipo 1 de 1L-1 puede determinarse inmovilizando un anticuerpo que se una a la IL-1� , poniendo a la 1L-1� en contacto con el anticuerpo inmovilizado y determinando si la 1L-1� se fijó al anticuerpo, y poniendo a una forma soluble de 1L-1R1 en contacto con el complejo anticuerpo/1L-1� fijado y determinando si el IL-1R1 soluble se fijo al complejo. El protocolo puede tambien incluir el paso de poner al 1L-1RI soluble en contacto con el anticuerpo inmovilizado antes del contacto con la IL-1 �, para confirmar que el 1L-1RI soluble no se una al anticuerpo inmovilizado. Este protocolo puede ser llevado a cabo usando una maquina de medida Biacoret para analisis cineticos de interacciones de union. Un protocolo de este tipo puede tambien ser empleado para determinar si un anticuerpo u otra molecula permite o bloquea la fijacion de 1L-1� al receptor tipo 1 de 1L-1.
[0096] Para otros ensayos de fijacion de 1L-1� / 1L-1R1, puede determinarse si se permite o se bloquea la fijacion de la IL-1� al receptor tipo 1 de 1L-1 comparando la unión de IL-1 a 1L-1RI en presencia o en ausencia de anticuerpos para IL-1� o fragmentos de los mismos que se unen a la 1L-1�. El bloqueo se identifica en la lectura del ensayo como una reduccion designada de la fijacion de 1L-1 al receptor tipo 1 de 1L-1 en presencia de anticuerpos anti-IL-1� o de fragmentos de los mismos que se unen a la IL-1 �, en comparación con una muestra de control que contiene el correspondiente tampón o diluyente pero no un anticuerpo para IL-1 o un fragmento del mismo que se una a la 1L-1�. La lectura del ensayo puede verse cualitativamente como indicacion de la presencia o ausencia de bloqueo, o puede verse cuantitativamente como indicación de una reduccion porcentual o numerica de la fijacion debida a la presencia del anticuerpo o fragmento.
[0097] Como alternativa o adicionalmente, cuando un anticuerpo que se une a la 1L-1� o un fragmento que se une a la IL-1� bloquea considerablemente la fijación de IL-1 al 1L-1R1, la fijacion de la 1L-1� al 1L-1RI es reducida en al menos 10 veces, como alternativa en al menos aproximadamente 20 veces, como alternativa en al menos aproximadamente 50 veces, como alternativa en al menos aproximadamente 100 veces, como alternativa en al menos aproximadamente 1000 veces, o como alternativa en al menos aproximadamente 10000 veces o mas, en comparacion con la fijacion de las mismas concentraciones de IL-1 e 1L-1R1 en ausencia del anticuerpo o fragmento. Como otro ejemplo, cuando un anticuerpo que se une a la IL-1� o un fragmento que se une a la 1L-1� permite considerablemente la fijación de IL -1 al IL-1R1, la fijacion de 1L-1 al 1L-1R1 es al menos aproximadamente un 90%, como alternativa de al menos aproximadamente un 95%, como alternativa de al menos aproximadamente un 99%, como alternativa de al menos aproximadamente un 99,9%, como alternativa de al menos aproximadamente un 99,99%, como alternativa de al menos aproximadamente un 99,999%, o como alternativa de al menos aproximadamente un 99,9999% de la fijacion de las mismas concentraciones de IL-1� e 1L-1R1 en ausencia del anticuerpo o fragmento, o bien y como alternativa es practicamente identica a la misma.
[0098] La presente invencion tambien describe anticuerpos que se unen a la IL-1� o fragmentos que se unen a la 1L-1 y se unen al mismo epitope o practicamente al mismo epitope como uno o varios de los ejemplos de anticuerpos que
aqui se describen. Como alternativa o bien adicionalmente, los anticuerpos que se unen a la IL-1� o los fragmentos que se unen a la IL-1� compiten con la union de un anticuerpo que tenga la region variable de cadena liviana de la 10 SEC N°: 11 y la region variable de cadena pesada de la 10 SEC N°: 15. Como alternativa o bien adicionalmente, la presente invención incluye anticuerpos y fragmentos que se unen a la IL-1 y se unen a un epitope contenido en la secuencia de aminoacidos ESV0PKNYPKKKMEKRFVFNK1E (10 SEC N°: 36), un epitope al que se unen los anticuerpos denominados AB5 y AB7. Como aqui se contempla, puede determinarse facilmente si un anticuerpo o fragmento que se une a la IL-1 se une al mismo epitope o a practicamente el mismo epitope como uno o varios de los ejemplos de anticuerpos, tales como por ejemplo el anticuerpo denominado AB7, usando cualesquiera de los varios metodos que son conocidos en la tecnica.
[0099] Los residuos de aminoacidos clave (epitope) que son fijados por un anticuerpo o fragmento que se une a la 1L-1 pueden determinarse usando un conjunto de peptidos de manera similar al metodo que se describe en el Ejemplo 11. Se sintetiza directamente sobre una membrana un conjunto de peptidos, tal como por ejemplo un conjunto de peptidos PepSpotFM (JPT Peptide Technologies, Berlin, Alemania), donde un registro de doce peptidos de aminoacidos abarca toda la secuencia de aminoácidos de la IL-1�, solapandose cada peptido en 11 aminoacidos con el anterior. La membrana que lleva los peptidos es luego explorada con el anticuerpo para el cual se busca la informacion de fijación al epitope, por ejemplo a una concentracion de 2 ón del
1g/ml, por espacio de 2 h a temperatura ambiente. La fijacianticuerpo a los peptidos unidos a la membrana puede ser detectada usando un anticuerpo secundario anti-humano de cabra (o de raton, cuando ello sea apropiado) conjugado con HRP (HRP = peroxidasa de rabano), seguido por quimioluminiscencia mejorada (ECL). La (las) mancha(s) peptidica(s) que corresponden a determinados residuos o secuencias de aminoacidos de la proteina 1L-1� madura y puntu an positivamente para la fijacion del anticuerpo son indicativas del epitope fijado por el anticuerpo particular.
[0100] Pueden llevarse a cabo experimentos de competicion de anticuerpos, y tales ensayos son perfectamente conocidos en la tecnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo o fragmento se fija a un epitope contenido en una secuencia peptidica que comprende los aminoacidos ESV0PKNYPKKKMEKRFVFNK1E, que corresponde a los residuos 83-105 de la proteina 1L-1 madura, un anticuerpo de especificidad desconocida puede ser comparado con cualquiera de los ejemplos de anticuerpos (como p. ej. el anticuerpo AB7) de la presente invencion, de los que se sabe que se fijan a un epitope contenido dentro de esta secuencia. Los ensayos de competicion por la fijacion pueden ser llevados a cabo por ejemplo usando un aparato de medida Biacoret para analisis cineticos de las interacciones de fijacion, o bien por EL1SA. En un ensayo de este tipo, el anticuerpo de desconocida especificidad para el epitope es evaluado en cuanto a su capacidad para competir por la fijacion contra el anticuerpo comparador conocido (como p. ej. el AB7). La competicion por la fijacion a un epitope en particular es determinada mediante una reduccion de la fijacion al epitope de IL-1� de al menos aproximadamente un 50%, o de al menos aproximadamente un 70%, o de al menos aproximadamente 80%, o de al menos aproximadamente un 90%, o de al menos aproximadamente un 95%, o de al menos aproximadamente un 99% o de al menos aproximadamente un 100% para el anticuerpo comparador conocido (como p. ej. el AB7) y es indicativa de la fijacion a practicamente el mismo epitope.
[0101] En vista de la identificacion en esta publicacion de regiones que se unen a la 1L-1� en ejemplos de anticuerpos y/o epitopes que son reconocidos por los anticuerpos que se publican, se contempla que pueden generarse adicionales anticuerpos con similares caracteristicas de fijacion y utilidad terapeutica o diagnostica que igualen a las realizaciones de esta publicacion.
[0102] Ademas, los anticuerpos y fragmentos para 1L-1� de la presente invenci
ón incluyen a cualesquiera de las precedentes secuencias de aminoácidos de las cadenas livianas o pesadas con una o varias sustituciones conservadoras (p. ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 sustituciones conservadoras). A la luz de la presente exposicion, pueden determinarse las posiciones de una secuencia de aminoácidos que sean candidatos para sustituciones conservadoras, y pueden seleccionarse aminoacidos sinteticos y que se den de manera natural que efectuen sustituciones conservadoras para cualesquiera aminoacidos en particular. Las consideraciones para seleccionar las sustituciones conservadoras incluyen el contexto en el cual se haga cualquier sustitución de aminoacidos en particular, la hidrofobicidad o polaridad de la cadena lateral, el tamafo general de la cadena lateral y el valor pK de las cadenas laterales con caracter acido o basico bajo condiciones fisiologicas. Por ejemplo, la lisina, la arginina y la histidina son a menudo usadas adecuadamente en sustitucion unas de otras. Como es sabido en la tecnica, esto es debido al hecho de que los tres aminoacidos tienen las cadenas laterales basicas, mientras que los valores pK para las cadenas laterales de la lisina y de la arginina son mucho mas proximos entre si (de aproximadamente 10 y 12) que a la histidina (de aproximadamente 6). Analogamente, la glicina, la alanina, la valina, la leucina y la isoleucina son a menudo adecuadamente usadas en sustitucion unas de otras, con la salvedad de que la glicina frecuentemente no es usada en adecuada sustitucion de los otros miembros del grupo. Esto es debido al hecho de que cada uno de estos aminoacidos es relativamente hidrofobico al ser incorporado a un polipeptido, pero la carencia de un carbono a de la glicina les deja a los a) tanta libertad
ángulos phi y psi de rotación (en torno al carbono conformacional que los residuos glicinilo pueden provocar cambios de conformación o estructura secundaria que no se producen a menudo cuando los otros aminoacidos son usados en sustitucion unos de otros. Otros grupos de aminoácidos que frecuentemente son usados en adecuada sustitucion unos de otros incluyen, aunque sin caracter limitativo, al grupo que consta de los acidos glutamico y aspartico, al grupo que consta de fenilalanina, tirosina y triptofano, y al grupo que consta de serina, treonina y opcionalmente tirosina.
[0103] Haciendo modificaciones conservadoras de la secuencia de aminoácidos o correspondientes modificaciones de los nucleotidos codificadores, pueden producirse anticuerpos que se unen a la 1L-1� o fragmentos que se unen a la 1L1� y tienen caracteristicas funcionales y quimicas similares a las de los ejemplos de anticuerpos y fragmentos que aqui se dan a conocer. Por contraste, pueden lograrse considerables modificaciones de las caracteristicas funcionales y/o quimicas de los anticuerpos que se unen a la IL-1� o de los fragmentos que se unen a la 1L-1 seleccionando sustituciones que se diferencien mucho en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal molecular en la zona de la sustitucion, por ejemplo como conformacion laminar o helicoidal, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molecula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral.
[0104] Los fragmentos de un anticuerpo que se fijan al antigeno incluyen a los fragmentos que conservan la capacidad de fijarse especificamente a un antigeno, generalmente reteniendo la parte del anticuerpo que se fija al antigeno. Esta perfectamente establecido que la funcion de fijacion al antigeno de un anticuerpo puede ser desempefada por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de las partes que se fijan al antigeno incluyen (1) un fragmento Fab, que es un fragmento monovalente que consta de los dominios VL, VH, CL y CH1; (11) un fragmento F(ab')2, que es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la region bisagra; (111) un fragmento Fd que es los dominios VH y CH1; (1V) un fragmento Fv que es los dominios VL y VH de un unico brazo de un anticuerpo; (V) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que es un dominio VH; y (V1) una region determinante complementaria aislada (C0R). Los anticuerpos de cadena unica estan tambien comprendidos dentro de la expresion "parte de un anticuerpo que se fija al antigeno". Los anticuerpos y fragmentos de la presente invención que se unen a la IL-1 tambien incluyen a dominios de fijacion monovalentes o multivalentes o monomericos o multimericos (p. ej. tetramericos) derivados de C0R con o sin un andamio (como por ejemplo un andamiaje de proteina o carbohidrato).
[0105] Los presentes anticuerpos o fragmentos que se unen a la IL-1 pueden ser parte de mayores mol
eculas de inmunoadhesión formadas por la asociación covalente o no covalente del anticuerpo o de la parte del anticuerpo con uno o varios otros peptidos o proteinas. Los ejemplos de tales moleculas de inmunoadhesion incluyen el uso de la region central de la estreptavidina para hacer una molecula scFv tetramerica (Kipriyanov, S. M. et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de un residuo de cisteina, un peptido marcador y una marca de polihistidina C-terminal para hacer moleculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S. M. et al. (1994) Mol. 1mmunol. 31:1047-1058). Los anticuerpos y fragmentos que comprenden moleculas de inmunoadhesión pueden ser obtenidos usando tecnicas de 0NA recombinante, como aqui se describe. Las preferidas partes que se fijan al antigeno son dominios completos o parejas de dominios completos.
[0106] Los anticuerpos y fragmentos de la presente invención que se unen a la IL-1� tambien incluyen a fragmentos de anticuerpo de dominio (dAb) (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989) que constan de un dominio VH. Los anticuerpos y fragmentos de la presente invención que se unen a la IL-1� tambien incluyen a d iacuerpos, que son anticuerpos bivalentes en los cuales son expresados dominios VH y VL en una unica cadena polipeptidica, pero usando un enlazador que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, obligando con ello a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de fijacion al antigeno (veanse, p. ej., la EP 404.097; la WO 93/11161; Holliger et al., Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 90:64444-6448, 1993, y Poljak et al., Structure 2:1121-1123, 1994). Los diacuerpos pueden ser biespecificos o monoespecificos.
[0107] Los anticuerpos y fragmentos de la presente invención que se unen a la IL-1� tambien incluyen a fragmentos de anticuerpo de cadena unica (scFv) que se unen a la IL-1 �. Un scFv comprende una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) enlazada operativamente a una region variable de cadena liviana de anticuerpo (VL) donde la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena liviana forman junta o individualmente un sitio de fijacion que fija la 1L-1�. Un scFv puede comprender una regiH en el extremo aminoterminal y una region VL en el extremo
on V carboxiterminal. Como alternativa, el scFv puede comprender una region VL en el extremo aminoterminal y una región VH en el extremo carboxiterminal. Ademas, a pesar de que los dos dominios del fragmento Fv, o sea el VL y VH, son codificados por genes independientes, los mismos pueden ser unidos, usando metodos recombinantes, por un enlazador sintetico que permite hacerlos como una unica cadena de proteina en la cual las regiones VL y VH se emparejan para formar moleculas monovalentes (lo que se conoce como Fv de cadena unica (scFv); veanse, p. ej. Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85:5879-5883).
[0108] Un scFv puede de manera opcional comprender adicionalmente un enlazador polipeptidico entre la region variable de cadena pesada y la region variable de cadena liviana. Tales enlazadores polipeptidicos en general comprenden entre 1 y 50 aminoacidos, como alternativa entre 3 y 12 aminoacidos, y como alternativa 2 aminoacidos. Un ejemplo de un peptido enlazador para enlazar las cadenas pesada y liviana en un scFv comprende la secuencia de 5 aminoacidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (10 SEC N°: 37). Otro ejemplos comprenden una o varias repeticiones en tandem de esta secuencia (como por ejemplo un polipeptido que comprende de dos a cuatro repeticiones de Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (10 SEC N°: 37)) para crear enlazadores.
[0109] Los anticuerpos y fragmentos de la presente invención que se unen a la IL-1 tambien incluyen a anticuerpos de cadena pesada (HCAb). Se dan excepciones a la estructura H2L2 de los anticuerpos convencionales en algunos tipos de las inmunoglobulinas que se encuentran en los camelidos (camellos, dromedarios y llamas; Hamers-Casterman et al., 1993 Nature 363: 446; Nguyen et al., 1998 J. Mol. Biol. 275: 413), en los tiburones alfombra (Nuttall et al., Mol 1mmunol. 38:313-26, 2001), en los tiburones nodriza (Greenberg et al., Nature 374:168-73, 1995; Roux et al., 1998 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 11804), y en el pez rata moteado (Nguyen, et al., "Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation", 2002 1mmunogenetics 54(1): 39-47). Estos anticuerpos pueden aparentemente formar regiones de union al antigeno usando solamente regiones variables de cadena pesada, por cuanto que estos anticuerpos funcionales son dimeros de cadenas pesadas solamente (a los que se denomina "anticuerpos de cadena pesada" o "HCAbs"). En consecuencia, algunas realizaciones de los presentes anticuerpos y fragmentos que se unen a la IL-1 pueden ser anticuerpos de cadena pesada (HCAb) que se unen especificamente a la 1L-1�. Por ejemplo, anticuerpos de cadena pesada que son una clase de 1gG y estan exentos de cadenas livianas son producidos por animales del genero Camelidae, que incluye a los camellos, los dromedarios y las llamas (Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)). Los HCAbs tienen un peso molecular de aproximadamente 95 k0a en lugar del peso molecular de aproximadamente 160 k0a de los anticuerpos y 1gG convencionales. Sus dominios de union constan solamente de los dominios variables de cadena pesada, a los que a menudo se denomina VHH para distinguirlos de los VH convencionales. Muyldermans et al., J. Mol. Recognit. 12: 131-140 (1999). Al dominio variable de los anticuerpos de cadena pesada se le denomina a veces nanocuerpo (Cortez-Retamozo et al., Cancer Research 64:2853-57, 2004). Una biblioteca de nanocuerpos puede ser generada a partir de un dromedario inmunizado como se describe en Conrath et al., (Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-12, 2001) o usando metodos recombinantes.
[0110] Puesto que el primer dominio constante (CH1) está ausente (eliminado por corte durante el procesamiento de mRNA debido a la perdida de una sefal consenso de corte y empalme), el dominio variable (VHH) va inmediatamente seguido por la region bisagra y por los dominios CH2 y CH3 (Nguyen et al., Mol. 1mmunol. 36:515-524 (1999); Woolven et al., 1mmunogenetics 50:98-101 (1999)). El VHH de camelido segun se informa se recombina con regiones constantes de 1gG2 y de 1gG3 que contienen dominios bisagra, CH2 y CH3 y carecen de un dominio CH1 (Hamers-Casterman et al., supra). Por ejemplo, la 1gG1 de llama es un isotipo de anticuerpo convencional (H2L2) en el cual el VH se recombina con una region constante que contiene dominios bisagra, CH1, CH2 y CH3, mientras que la 1gG2 y la 1gG3 de llama son isotipos solo de cadena pesada que carecen de dominios CH1 y no contienen cadenas livianas.
[0111] A pesar de que los HCAbs estan desprovistos de cadenas livianas, tienen un repertorio de union al antigeno. El mecanismo de generacion genetica de los HCAbs se estudia en Nguyen et al. Adv. 1mmunol 79:261-296 (2001) y en Nguyen et al., 1mmunogenetics 53:39-47 (2002). Los tiburones, incluyendo al tiburon nodriza, presentan similares dominios V monomericos unicos con contenido de receptores del antigeno. 1rving et al., J. 1mmunol. Methods 248:31-45 (2001); Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:11804 (1998).
[0112] Los VHHs comprenden pequefos fragmentos intactos de union al antigeno (como por ejemplo fragmentos que son de aproximadamente 15 k0a y de 118-136 residuos). Se ha descubierto que los dominios VHH de camelido se unen al antigeno con alta afinidad (0esmyter et al., J Biol. Chem. 276:26285-90, 2001), con afinidades de VHH que están tipicamente dentro de la gama nanomolar y son equiparables a las de los fragmentos Fab y scFv. Los VHHs son altamente solubles y mas estables que los correspondientes derivados de fragmentos scFv y Fab. Los fragmentos VH han venido siendo relativamente dificiles de producir en forma soluble, pero pueden obtenerse mejoramientos de la solubilidad y de la union especifica cuando los residuos de entramado son alterados para ser mas tipo VHH. Vease, por ejemplo, Reichmann et al., J 1mmunol Methods 1999, 231:25-38). Los VHHs llevan sustituciones de aminoácidos que los hacen mas hidrofilicos e impiden la prolongada interaccion con la BiP (proteina de union a la cadena pesada de la inmunoglobulina), que normalmente se une a la cadena pesada en el Reticulo Endoplasmico (ER) durante el plegamiento y ensamblaje, hasta ser desplazada por la cadena liviana. 0ebido a la incrementada hidrofilicidad de los VHHs, se ve mejorada la secrecion desde el ER.
[0113] Pueden obtenerse VHHs funcionales mediante fragmentacion proteolitica de HCAb de un camelido inmunizado, mediante clonacion directa de genes VHH desde celulas B de un camelido inmunizado redundando en VHHs recombinantes, o a partir de bibliotecas nativas o sinteticas. Pueden tambien obtenerse VHHs con la especificidad antigenica deseada mediante la metodologia de presentacion de fagos. El uso de VHHs en presentación de fagos es mucho mas sencillo y mas eficaz en comparacion con los Fabs o con los scFvs, puesto que solamente tiene que clonarse y expresarse un dominio para obtener un fragmento funcional de union al antigeno. Muyldermans, Biotechnol. 74:277-302 (2001); Ghahroudi et al., FEBS Lett 414:521-526 (1997); y van der Linden et al., J. Biotechnol. 80:261-270 (2000). Tambien se describen metodos para generar anticuerpos que tengan cadenas pesadas de camelido en las Publicaciones de Patente U.S. Nums. 200500136049 y 20050037421.
[0114] Pueden usarse metodos de presentacion de ribosomas para identificar y aislar moleculas de scFv y/o VHH que tengan la deseada actividad y afinidad de union. 1rving et al., J. 1mmunol. Methods 248:31-45 (2001). La presentacion y selección de ribosomas tiene el potencial de generar y presentar grandes bibliotecas (1014).
[0115] Otras realizaciones aportan moleculas tipo VHH generadas por medio del proceso de camelizacion, a base de modificar VHs no de Camelidae, tales como VHHs humanos, para mejorar su solubilidad e impedir la union no especifica. Esto se logra sustituyendo residuos en el lado VLs de los VHs por residuos tipo VHH, imitando con ello a los fragmentos VHH mas solubles. Los fragmentos VH camelizados, y en particular los basados en el entramado humano, se preve que presenten una respuesta inmune reducida en gran medida al ser administrados in vivo a un paciente, y en consecuencia se preve que tengan importantes ventajas para aplicaciones terapeuticas. 0avies et al., FEBS Lett. 339:285-290 (1994); 0avies et al., Protein Eng. 9:531-537 (1996); Tanha et al., J. Biol. Chem. 276:24774-24780 (2001); y Riechmann et al., 1mmunol. Methods 231:25-38 (1999).
[0116] Estan disponibles los de una amplia variedad de sistemas de expresion para la produccion de fragmentos de 1L1�, incluyendo fragmentos Fab, scFv y VHHs. Por ejemplo, pueden usarse sistemas de expresión de origen tanto procariotico como eucariotico para la produccion a gran escala de fragmentos de anticuerpos y proteinas de fusion de anticuerpos. Son particularmente ventajosos los sistemas de expresion que permiten la secrecion de grandes cantidades de fragmentos de anticuerpo al medio de cultivo.
[0117] La produccion de Fab-scFv biespecificos ("bicuerpos") y Fab-(scFv)(2) triespecificos ("tricuerpos") esta descrita en Schoonjans et al. (J 1mmunol. 165:7050-57, 2000) y Willems et al. (J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786:161-76, 2003). Para bicuerpos o tricuerpos, se fusiona una molecula scFv con una o ambas cadenas VL-CL (L) y VH-CH1 (Fd), p. ej.; para producir un tricuerpo se fusionan dos scFvs con el C-terminal de Fab, mientras que en un bicuerpo se fusiona un scFv con el C-terminal de Fab. Un "minicuerpo" que consta de scFv fusionado con CH3 por medio de un enlazador peptidico (sin bisagra) o por medio de una bisagra de 1gG ha sido descrito en Olafsen et al., Protein Eng 0es Sel. 2004 abr.; 17(4):315-23.
[0118] Los intracuerpos son anticuerpos de cadena unica que manifiestan expresion intracelular y pueden manipular la funcion proteinica intracelular (Biocca, et al., EMBO J 9:101-108, 1990; Colby et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101:17616-21, 2004). Los intracuerpos, que comprenden secuencias sefal celulares que mantienen al constructo de anticuerpo en las regiones intracelulares, pueden ser producidos como se describe en Mhashilkar et al (EMBO J 14:1542-51. 1995) y Wheeler et al. (FASEB J 17:1733-5. 2003). Los transcuerpos son anticuerpos que permean la celula y en los cuales un dominio de transduccion de proteinas (PT0) esta fusionado con anticuerpos de fragmento variable de cadena unica (scFv). Heng et al., (Med Hypotheses, 64:1105-8, 2005).
[0119] Los anticuerpos y fragmentos de la presente invención que se unen a la IL-1 tambien incluyen a anticuerpos que son SM1Ps o proteinas de fusion de inmunoglobulina con dominio de union especificas de la proteina diana. Estos constructos son polipeptidos de cadena unica que comprenden dominios de union al antigeno fusionados con dominios de inmunoglobulina necesarios para realizar funciones efectoras de anticuerpo. Veanse, p. ej., la WO 03/041600, la Publicacion de Patente U.S. 20030133939 y la Publicacion de Patente U.S. 20030118592.
[0120] Los anticuerpos y fragmentos de la presente invención que se unen a la IL-1� tambien incluyen a inmunoadhesinas. Una o varias C0Rs pueden ser incorporadas a una molecula ya sea covalentemente o bien no covalentemente para convertirla a una inmunoadhesina. Una inmunoadhesina puede incorporar la(s) C0R(s) como parte de una mayor cadena polipeptidica, puede enlazar covalentemente la(s) C0R(s) a otra cadena polipeptidica, o bien puede incorporar la(s) C0R(s) no covalentemente. Las C0Rs que aqui se dan a conocer permiten que la inmunoadhesina se una especificamente a la 1L-1�.
[0121] Los anticuerpos y fragmentos de la presente invención que se unen a la IL-1 tambien incluyen a mimeticos de anticuerpos que comprenden una o varias partes que se unen a la IL-1 y están construidas sobre un andamio orgánico
o molecular (tal como un andamio de proteina o carbohidrato). Pueden usarse como reactivos para el disefo de mimeticos de anticuerpos proteinas que tienen estructuras tridimensionales relativamente definidas, a las que comunmente se denomina andamios de proteina. Estos andamios tipicamente contienen una o varias regiones que se prestan a variacion de secuencia especifica o aleatoria, y tal aleatorizacion de secuencia es a menudo realizada para producir bibliotecas de proteinas de las cuales pueden seleccionarse los productos deseados. Por ejemplo, un mimetico de anticuerpo puede comprender un polipeptido quimerico de union no inmunoglobulina que tenga un dominio tipo inmunoglobulina que contenga andamio que tenga dos o más bucles expuestos al solvente que contenga una distinta C0R de un anticuerpo progenitor insertadas en cada uno de uno de los bucles y que presenten actividad de unión selectiva hacia un ligando fijado por el anticuerpo progenitor. Han sido propuestos andamios de proteina no inmunoglobulina para obtener proteinas con nuevas propiedades de union. (Tramontano et al., J. Mol. Recognit. 7:9, 1994; McConnell y Hoess, J. Mol. Biol. 250:460, 1995). Otras proteinas han sido probadas como andamios y han sido usadas para presentar residuos aleatorizados en superficies helicoidales alfa (Nord et al., Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nord et al., Protein Eng. 8:601, 1995), bucles entre helices alfa en haces en helice alfa (Ku and Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 92:6552, 1995), y bucles constrefidos por puentes disulfuro, tales como los de los pequeños inhibidores de proteasa (Markland et al., Biochemistry 35:8045, 1996; Markland et al., Biochemistry 35:8058, 1996; Rottgen and Collins, Gene 164:243, 1995; Wang et al., J. Biol. Chem. 270:12250, 1995). Se dan a conocer metodos para emplear andamios para mimeticos de anticuerpos en la Patente US 5.770.380 y en las Publicaciones de patente US 2004/0171116, 2004/0266993 y 2005/0038229.
[0122] Asi, puede generarse una variedad de anticuerpos y fragmentos que se unan a la 1L-1� y comprendan una, dos y/o tres C0Rs de una region variable de cadena pesada de la 10 SEC N°: 8, 14, 15 o 26 o de la 10 SEC N°: 8, 14, 15 o 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos o una region variable de cadena liviana de la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 de la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos.
[0123] Los anticuerpos o fragmentos que se describen en el contexto de la presente invención se unen a la IL-1� con (1) una 1C50 de aproximadamente 0,5nM o menos (p. ej. de aproximadamente 0,4 o menos, aproximadamente 0,3 o menos,
o incluso aproximadamente 0,2 o menos), segun determinacion efectuada por inmunoanalisis ligados a enzimas (EL1SA), (11) una afinidad al menos aproximadamente 100 veces (p. ej. al menos aproximadamente 150 veces, al menos aproximadamente 200 veces, o incluso al menos aproximadamente 250 veces) mayor con respecto a su union a la 1L1a (es decir que tienen una selectividad para IL-1� con preferencia sobre la 1L-1a de al menos aproximadamente 100 veces (p. ej. de al menos aproximadamente 150 veces, de al menos aproximadamente 200 veces, o incluso de al menos aproximadamente 250 veces)), y/o (111) una constante de disociación de la unión en equilibrio (K0) para IL-1 de aproximadamente 20pM o menos (p. ej. de aproximadamente 15pM o menos, de aproximadamente 10pM o menos, o incluso de aproximadamente 5pM o menos). Tambien son preferidos anticuerpos o fragmentos de la invención que pueden inhibir la expresión de IL-6 serica inducida por 1L-1 en un animal en al menos un 50% (p. ej. en al menos un 60%, en al menos un 70%, o incluso en al menos un 80%) en comparacion con el nivel de 1L-6 serica en un animal estimulado con IL-1� al que no le ha sido administrado un anticuerpo o fragmento de la invencion. En consecuencia, la invencion aporta, en un aspecto afin, un anticuerpo que se une a la 1L-1� o un fragmento de anticuerpo que se une a la IL-1� y tiene al menos una de las caracteristicas anteriormente mencionadas.
[0124] A pesar de que la invencion ha sido aqui descrita con respecto a los anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a la IL-1� (que comprenden p. ej. una cadena liviana y pesada), la invencion tambien describe polipeptidos que no son anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen a la IL-1 �, tales como polipeptidos de cadena unica (incluyendo polipeptidos de fusion, polipeptidos quimericos, conjugados y polipeptidos similares). Asi, en el contexto de la invencion se describe un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de cualquiera de las 10 SEC NOMS.: 8, 14, 15, 25 o 26 o de la 10 SEC N°: .: 8, 14, 15, 25 o 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos, o de la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 o de la 10 SEC N°: 9, 10 u 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos, o un fragmento o una variante de las mismas funcionalmente equivalente.
[0125] Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que aqui se describen pueden ser preparados por cualquier metodo adecuado. Son conocidos en la tecnica los metodos adecuados para preparar tales anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. Otros metodos para preparar los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos son como aqui se describe como parte de la invencion. El anticuerpo, fragmento de anticuerpo o polipeptido de la invencion, como aqui se describe, puede ser aislado o purificado en cualquier grado. En el sentido que aqui se le da, un compuesto aislado es un compuesto que ha sido separado de su ambiente natural. Un compuesto purificado es un compuesto cuya pureza ha sido incrementada, de forma tal que el compuesto existe en una forma que es mas pura que aquella en la que existe (1) en su ambiente natural o (II) al ser inicialmente sintetizado y/o amplificado bajo condiciones de laboratorio, siendo el vocablo "pureza" un termino relativo que no necesariamente significa "pureza absoluta".
[0126] Cualesquiera de los anteriores anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o polipeptidos de la invencion pueden ser humanizados o manipulados para ser de tipo humano, como aqui se describe.
[0127] Métodos de Preparación de los Anticuerpos o Fragmentos que se Unen a la IL-11
[0128] En el contexto de la invencion se describe un metodo de preparacion de un polipeptido madurado por afinidad que se une a la IL-1�, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (incluyendo una region de anticuerpo (como p. ej. una region variable de cadena pesada o cualquier parte de la misma, tal como una C0R)), cuyo metodo comprende los pasos de (a) prever un primer ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipeptido que se une a la 1L-1� y comprende la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las 10 SEC NOMS.: 1-26 y un segundo ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que se diferencia de la primera secuencia de acido nucleico en al menos un nucleotido, (b) llevar a cabo mezcla de acidos nucleicos para proporcionar dos o mas ácidos nucleicos mutados, y (c) seleccionar un acido nucleico que codifique un polipeptido que (1) se una a la 1L-1� con una afinidad mayor que la del polipeptido codificado por el primer acido nucleico, (11) tenga una selectividad para 1L-1 con preferencia sobre la IL-1a que sea mayor que la del polipeptido codificado por el primer acido nucleico, (111) tenga una constante de disociación de la unión en equilibrio (K0) para IL-1� que sea menor que la del polipeptido codificado por el primer acido nucleico, o bien (1V) inhiba la expresión inducida por IL-1� de 1L-6 serica en un animal en mayor grado que el polipeptido codificado por el primer acido nucleico, y (d) expresar el acido nucleico mutado seleccionado para proporcionar un polipeptido madurado por afinidad que se una a la IL-1�. Preferiblemente, el polipeptido es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de los que aqui se describen como parte de la invencion.
[0129] El metodo de preparacion de un polipeptido madurado por afinidad para IL-1 de manera opcional comprende adicionalmente la operacion de repetir los pasos (b) y (c) una o varias veces, donde la mezcla de acidos nucleicos del
paso (b) es llevada a cabo usando (I) al menos un ácido nucleico mutado seleccionado del paso (c) y (II) al menos un ácido nucleico que tenga una secuencia de ácido nucleico que se diferencie del ácido nucleico mutado seleccionado en al menos un nucleotido. Preferiblemente se repiten los pasos (b) y (c) hasta haber sido seleccionado un acido nucleico optimizado. Una acido nucleico optimizado es seleccionado cuando ya no es posible seleccionar un acido nucleico que codifique un polipeptido que tenga caracteristicas de union con respecto a la IL-1� (como p. ej. las caracteristicas (1)-(1V) del paso (c)) que sean superiores a las de un polipeptido codificado por un acido nucleico anteriormente seleccionado.
[0130] Segun lo deseable, se repiten los pasos (b) y (c) hasta haber sido seleccionado un ácido nucleico que codifique un polipeptido que tenga al menos una de las propiedades siguientes: (1) que se una a la 1L-1� con una 1C50 de aproximadamente 0,5nM o menos (p. ej. de aproximadamente 0,4 o menos, de aproximadamente 0,3 o menos, o incluso de aproximadamente 0,2 o menos), segun determinacion efectuada por inmunoanalisis ligado a enzimas (EL1SA), (11) que se una a la 1L-1 con una afinidad al menos aproximadamente 100 veces (p. ej. al menos aproximadamente 150 veces, al menos aproximadamente 200 veces, o incluso al menos aproximadamente 250 veces) mayor con respecto a su unión a la IL-1a (es decir, que tenga una selectividad para 1L-1 con preferencia sobre la 1L-1a de al menos aproximadamente 100 veces (p. ej. de al menos aproximadamente 150 veces, al menos aproximadamente 200 veces, o incluso de al menos aproximadamente 250 veces)), (111) que se una a la 1L-1� con una constante de disociación de la unión en equilibrio (K0) para la IL-1 de aproximadamente 20pM o menos (p. ej. de aproximadamente 15pM o menos, de aproximadamente 10pM o menos, 5pM o menos, 3pM o menos, 2pM o menos, 1pM o menos, 0,7pM
o menos, 0,5pM o menos, 0,3pM o menos, o 0,2pM o menos), o (1V) inhiba la expresion inducida por 1L-1� de 1L-6 serica en un animal en al menos un 50% (p. ej. en al menos un 60%, en al menos un 70%, o incluso en al menos un 80%) en comparacion con el nivel de 1L-6 serica en un animal estimulado con 1L-1� al que no se le haya administrado un anticuerpo o fragmento de la invencion.
[0131] La seleccion de un acido nucleico mutado que codifique un polipeptido que tenga las propiedades deseadas puede ser llevada a cabo por cualquier metodo adecuado. Se dan a conocer aqui (veanse los Ejemplos) procedimientos para expresar polipeptidos codificados y someter a ensayo a los polipeptidos con respecto a la afinidad de union, la selectividad de union, las constantes de union en equilibrio y la inhibicion de la expresion inducida por IL-1� de 1L-6. Son conocidos en la tecnica otros metodos adecuados. Cuando el polipeptido codificado por el acido nucleico mutado que se obtiene en el paso (b) no sea un anticuerpo o fragmento de anticuerpo completo (como p. ej. Fab), puede ser necesario prever un anticuerpo que comprenda al polipeptido a fin de determinar si el polipeptido satisface los criterios de seleccion. Asi, el metodo de preparacion de un polipeptido madurado por afinidad para 1L-1� puede comprender adicionalmente un paso de prever un anticuerpo que comprenda al polipeptido codificado por el acido nucleico mutado, donde el paso de seleccionar el acido nucleico mutado que codifique a un polipeptido que tenga las propiedades deseadas es llevado a cabo sometiendo al anticuerpo a ensayo.
[0132] En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresion "mezcla de acidos nucleicos" significa fragmentar dos o mas secuencias de acido nucleico para asi obtener una combinacion de fragmentos aleatorios de acido nucleico y reensamblar los fragmentos para crear dos o mas acidos nucleicos mutados. A este respecto, un acido nucleico mutado es meramente un acido nucleico que tiene una secuencia de acido nucleico que ha sido modificada. La mezcla de ácidos nucleicos puede ser llevada a cabo por cualquier metodo adecuado. Son conocidos en la tecnica muchos metodos adecuados, tales como los que se describen en las Patentes U.S. 6.489.145; 6.773.900; 6.764.835; 6.740.506; 6.713.282; 6.713.281; 6.713.279; 6.709.841; 6.696.275; 6.677.115; 6.673.552; 6.656.677; 6.605.449; 6.566.050; 6.562.294; 6.555.315; 6.537.776; 6.528.249; 6.479.258; 6.455.254; 6.440.668; 6.368.798; 6.361.974; 6.358.709; 6.352.842; 6.344.328; 6.335.179; 6.280.926; 6.238.884; 6.174.673; 6.171.820; 6.168.919; 6.057.103; 6.054.267;
6.030.779 6.001.574; 5.965.408; 5.958.672; 5.939.250; 5.763.239; 6.395.547; 6.376.246; 6.372.497; 6.368.861; 6.365.408; 6.365.377; 6.358.740; 6.358.742; 6.355.484; 6.344.356; 6.337.186; 6.335.160; 6.323.030; 6.319.714; 6.319.713; 6.303.344; 6.297.053; 6.291.242; 6.287.861; 6.277.638; 6.180.406; 6.165.793; 6.132.970; 6.117.679; 5.834.252; 5.830.721; 5.811.238; 5.605.793.
[0133] Ácidos Nucleicos
[0134] Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invencion pueden ser codificados por un unico acido nucleico (como p. ej. un unico acido nucleico que comprenda secuencias de nucleotidos que codifiquen los polipeptidos de cadena liviana y pesada del anticuerpo), o por dos o mas acidos nucleicos independientes que codifiquen cada uno de ellos una parte distinta del anticuerpo fragmento de anticuerpo. A este respecto, la invencion aporta uno o varios acidos nucleicos que codifican cualquiera de los anteriores anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o polipeptidos (p. ej. cualquiera de las anteriores regiones variables de cadena liviana o pesada).
[0135] Segun un aspecto de la invencion, la invencion aporta un acido nucleico que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo o de una parte del mismo. Se aportan ejemplos de secuencias de acido nucleico en las 10 SEC NOMS.: 39 y 40, que respectivamente codifican la region variable de cadena pesada de la 10 SEC N°: 15 y la region variable de cadena liviana de la 10 SEC N°: 11. A este respecto, la invencion describe un acido nucleico que codifica un polipeptido (como p. ej. una region variable de cadena pesada de un anticuerpo) que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 2, o como alternativa la secuencia de la 10 SEC N°: 28, y que segun lo
deseable codifica un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 21 1 (como p. ej. un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las 10 SEC NOMS.: 4-8). La invencion tambien aporta secuencias de acido nucleico que codifican un polipeptido (como p. ej. una región variable de cadena pesada) que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 12 o de la 10 SEC N°: 13, como p. ej. un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las 10 SEC NOMS.: 14-15, o que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 23, de la 10 SEC N°: 24, como p. ej. de la 10 SEC N°: 25 o de la 10 SEC N°: 26.
[0136] Como alternativa o adicionalmente, el acido nucleico de la invencion describe una secuencia de acido nucleico que codifica una region variable de cadena liviana de un anticuerpo o de una parte del mismo. A este respecto, la invencion describe un acido nucleico que codifica un polipeptido (p. ej. una region variable de cadena liviana) que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 1. Por ejemplo, la secuencia de acido nucleico puede codificar un polipeptido que comprenda la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9. Mas preferiblemente, el acido nucleico codifica un polipeptido (p. ej. una region variable de cadena liviana) que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 10 u 11.
[0137] Estan tambien incluidos en la invencion acidos nucleicos que codifican cualesquiera de las anteriores secuencias de aminoácidos de las cadenas livianas o pesadas que comprenden una o varias sustituciones conservadoras (p. ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 sustituciones conservadoras), como se ha expuesto con respecto al anticuerpo y al fragmento de anticuerpo de la invencion, donde el anticuerpo o fragmento que comprende la sustitución tiene la misma o practicamente la misma afinidad y especificidad de union al epitope como uno o varios de los ejemplos de anticuerpos, fragmentos y secuencias que aqui se dan a conocer.
[0138] Las secuencias de ácido nucleico pueden determinarse a partir de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos, los fragmentos de anticuerpo y las regiones variables de cadena liviana o pesada que aqui se describen por cualquier metodo adecuado, tal como convirtiendo tales secuencias de aminoácidos en las correspondientes secuencias de acido nucleico usando el codigo genetico. Los acidos nucleicos que codifican esas secuencias de aminoacidos (tales como las secuencias de aminoacidos que aqui se describen) pueden ser preparados (p. ej. las secuencias de acido nucleico pueden ser aisladas o sintetizadas) usando metodos de los que son conocidos en la tecnica, tales como los que se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory manual, 3a edicion, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Ausubet et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, Nueva York, NY, 1994; y Herdewijn, ed., Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (Methods in Molecular Biology), Humana Press; Totowa, NJ, 2004. Los acidos nucleicos que aqui se describen pueden ser aislados o purificados en cualquier grado. En el sentido que se le da en la presente, un compuesto aislado es un compuesto que ha sido separado de su ambiente natural. Un compuesto purificado es un compuesto cuya pureza ha sido incrementada, de forma tal que el compuesto existe en una forma que es mas pura que aquella en la que existe (1) en su ambiente natural o (11) al ser inicialmente sintetizado y/o amplificado bajo condiciones de laboratorio, siendo el vocablo "pureza" un termino relativo que no necesariamente significa "pureza absoluta".
[0139] Los acidos nucleicos pueden ser purificados usando las de una variedad de tecnicas entre las que se incluyen, aunque sin caracter limitativo, la electroforesis en gel preparativa o la concentracion isoelectrica, la cromatografia de afinidad, de inmunoafinidad o de intercambio ionico, la cromatografia de tamices moleculares, la cromatoconcentracion
o la cromatografia de liquidos de alta presion.
[0140] Vectores
[0141] Los acidos nucleicos que aqui se describen pueden ser insertados en vectores, como p. ej. vectores de expresion de acido nucleico y/o vectores de direccionamiento. Tales vectores pueden ser usados de varias maneras, p. ej. para la expresion de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se una a la 1L-1 en una celula o en un animal transgenico. En consecuencia, la invencion aporta un vector que comprende cualquiera o varios de los acidos nucleicos de la invencion. Un "vector" es toda molecula o composicion que tenga la capacidad de llevar una secuencia de acido nucleico al interior de una adecuada celula huesped donde pueda tener lugar la sintesis del polipeptido codificado. Tipicamente y con preferencia, un vector es un acido nucleico que ha sido manipulado, usando tecnicas de 0NA recombinante que son conocidas en el ramo, para incorporar una deseada secuencia de acido nucleico (p. ej. un acido nucleico de la invencion). Segun lo deseable, el vector consta de 0NA. Los ejemplos de adecuados vectores de transferencia genica basados en 0NA incluyen a plasmidos y vectores virales. Los adecuados vectores virales incluyen, por ejemplo, a los miembros del grupo que consta de vectores basados en parvovirus (como p. ej. vectores basados en virus adenoasociados (AAV)), vectores retrovirales, vectores basados en virus herpes simplex (HSV), vectores quimericos adenovirales-AAV, vectores basados en virus H1V y vectores basados en adenovirus. Cualesquiera de estos vectores pueden ser preparados usando tecnicas de 0NA recombinante estandar que se describen, p. ej., en Sambrook et al., supra y en Ausubel et al., supra. Sin embargo son tambien conocidos en la tecnica y pueden ser usados en conexión con la invención vectores que no estan basados en acidos nucleicos, tales como liposomas. El vector inventivo puede estar basado en un unico tipo de acido nucleico (como p. ej. un plasmido) o de molecula que no sea acido
nucleico (como p. ej. un lipido o un polimero). Como alternativa, el vector puede ser una combinacion de un acido nucleico y un acido no nucleico (es decir, un vector "quimerico"). Por ejemplo, un plasmido que albergue al acido nucleico puede ser combinado con un lipido o un polimero como vehiculo de aporte. A un vector de este tipo se le denomina aqui "complejo plasmido-lipido" y complejo "plasmido-polimero", respectivamente. El vector de transferencia genica inventivo puede estar integrado en el genoma de la celula huesped o puede estar presente en la celula huesped en forma de un episoma.
[0142] Los acidos nucleicos de la invencion pueden ser insertados en vectores de expresion de inmunoglobulina, como por ejemplo los vectores que se describen en McLean et al., Mol. 1mmunol., 37: 837-45 (2000); Walls et al., Nucleic Acids Res., 21: 2921-9 (1993); y Norderhaug et al., J. 1mmunol. Meth., 204: 77-87 (1997).
[0143] Los vectores son tipicamente seleccionados para que sean funcionales en la celula huesped en la cual se usara el vector (para que el vector sea compatible con la maquinaria de la celula huesped de forma tal que pueda producirse una amplificacion del gen y/o la expresion del gen). Una molecula de acido nucleico que codifique un anticuerpo o fragmento que se una a la IL-1� puede ser amplificada/expresada en celulas huesped procarioticas, de levadura, de insecto (sistemas de baculovirus) y/o eucarioticas. La seleccion de la celula huesped dependera en parte de si el anticuerpo o fragmento que se une a la IL-1� debe ser modificado post-transicionalmente (de si debe ser p. ej. glicosilado y/o fosforilado). En caso afirmativo, son preferibles las celulas huesped de levadura, de insecto o de mamifero. Puede encontrarse adicional informacion acerca de los vectores de expresion en Meth. Enz. v. 185 (1990; Goeddel, ed.), Academic Press 1nc., San 0iego, Calif.
[0144] Los vectores de expresion tipicamente contienen uno o varios de los componentes siguientes: un promotor, una
o varias secuencias amplificadoras, un origen de replicacion, una secuencia de terminacion transcripcional, una secuencia intron completa que contenga un sitio de corte y empalme de dador y aceptor, una secuencia guia para la secrecion, un sitio de union de ribosomas, una secuencia de poliadenilacion, una region polienlazadora para insertar el ácido nucleico que codifica el polipeptido a expresar, y un elemento marcador seleccionable.
[0145] Los componentes vector pueden ser homologos (de la misma especie y/o cepa como la celula huesped), heterólogos (de una especie distinta de la especie o cepa de la celula huesped), hibridos (una combinacion de distintas secuencias de mas de una fuente), sinteticos, o secuencias nativas que normalmente funcionen regulando la expresion de inmunoglobulina. Las fuentes de componentes vector pueden ser cualquier organismo procariotico o eucariotico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado o cualquier planta, siempre que los componentes sean funcionales y puedan ser activados por la maquinaria de la celula huesped.
[0146] Un origen de replicacion se selecciona sobre la base del tipo de celula huesped que se use para la expresion. A titulo de ejemplo, el origen de replicacion del plasmido pBR322 (Producto N° 303-3s, New England Biolabs, Beverly, Mass.) es util para la mayoria de las bacterias gram-negativas, mientras que varios origenes de SV40, polioma, adenovirus, virus de la estomatitis vesicular (VSV) o papillomavirus (tales como HPV o BPV) son utiles para clonar vectores en celulas de mamifero. Generalmente no se necesita el componente origen de replicacion para vectores de expresion en mamiferos (por ejemplo, el origen SV40 se usan a menudo porque contiene el promotor inicial).
[0147] Una secuencia de terminacion de la transcripcion esta tipicamente situada en la posicion 3' del extremo de un polipeptido que codifica regiones y sirve para terminar la transcripcion. Las secuencias de terminacion de la transcripcion en celulas procarioticas a menudo comprenden un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia poli
T. Las secuencias de terminacion de la transcripcion pueden ser clonadas a partir de una biblioteca, pueden ser adquiridas comercialmente como parte de un vector, o pueden ser sintetizadas usando metodos para la sintesis de acidos nucleicos tales como los anteriormente descritos.
[0148] Un elemento que es un gen marcador seleccionable codifica una proteina que es necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una celula huesped cultivada en un medio de cultivo selectivo. Los tipicos genes marcadores de seleccion codifican proteinas que (a) confieren resistencia a los antibioticos o a otras toxinas, como p. ej. la ampicilina, la tetraciclina o la canamicina para las celulas huesped procarioticas, (b) complementan las deficiencias auxotropicas de la celula, o bien (c) aportan nutrientes criticos que no proporciona el medio complejo. Son marcadores seleccionables preferidos el gen de resistencia a la canamicina, el gen de resistencia a la ampicilina y el gen de resistencia a la tetraciclina. Puede tambien usarse un gen de resistencia a la neomicina para la seleccion en celulas huesped procarioticas y eucarioticas.
[0149] Pueden usarse otros genes de seleccion para amplificar el gen que sera expresado. La amplificacion es un proceso en el que los genes de los que hay mayor demanda para la producción de una proteina decisiva para el crecimiento son reiterados en tandem dentro de los cromosomas de sucesivas generaciones de celulas recombinantes. Los ejemplos de marcadores seleccionables para celulas de mamifero incluyen la dihidrofolato reductasa (0HFR) y la timidina quinasa. Los transformantes de celulas de mamifero son puestos bajo una presion de seleccion a la que solamente los transformantes están singularmente adaptados para sobrevivir en virtud del marcador que está presente en el vector. La presion de seleccion se impone cultivando las celulas transformadas bajo condiciones en las cuales la
concentracion de agente de seleccion en el medio es sucesivamente variada, conduciendo con ello a la amplificacion tanto del gen de seleccion como del 0NA que codifica un anticuerpo o fragmento para IL-1�. Como resultado de ello, a partir del 0NA amplificado son sintetizadas cantidades incrementadas de un anticuerpo.
[0150] Generalmente esta presente un sitio de union de ribosomas para iniciar la traduccion de mRNA. Por ejemplo, un sitio de este tipo está caracterizado por una secuencia Shine-0algarno (procariotas) o una secuencia Kozak (eucariotas). El elemento esta tipicamente situado en posicion 3' con respecto al promotor y en posicion 5' con respecto a la secuencia codificadora del polipeptido a expresar. La secuencia Shine-0algarno es variada pero es tipicamente una polipurina (que tiene un alto contenido de A-G). Han sido identificadas muchas secuencias Shine-0algarno, pudiendo ser cada una de ellas sintetizada facilmente usando los metodos que se han expuesto anteriormente y usada en un vector procariotico.
[0151] Puede usarse una secuencia guia o sefal para dirigir la secrecion de un polipeptido. Una secuencia sefal puede estar posicionada dentro o directamente en el extremo 5' de una region codificadora del polipeptido. Muchas secuencias sefal han sido identificadas y pueden ser seleccionadas sobre la base de la celula huesped usada para la expresion. Una secuencia sefal puede ser homologa (que se da de manera natural) o heteróloga para una secuencia de ácido nucleico que codifique la proteina a expresar (tal como un fragmento de union al anticuerpo antigeno). Una secuencia señal heteróloga seleccionada deberá ser una que sea reconocida y procesada (escindida por una peptidasa señal) por la celula huesped. Para celulas huesped procarioticas que no reconozcan ni procesen a una secuencia sefal de anticuerpo nativo, la secuencia sefal es sustituida por una secuencia sefal procariotica seleccionada, por ejemplo, de entre los miembros del grupo que consta de fosfatasa alcalina, penicilinasa o guias de enterotoxina 11 termoestable. Para la secrecion de levadura, una secuencia sefal de anticuerpo nativo puede ser sustituida por invertasa de levadura, factor alfa o guias de acido fosfatasa. En expresion en celulas de mamifero es generalmente satisfactoria la secuencia sefal nativa, si bien pueden ser adecuadas otras secuencias sefal de mamifero.
[0152] En la mayoria de los casos, la secrecion de un anticuerpo o fragmento de union al antigeno desde una celula huesped redundara en la eliminacion del peptido sefal del anticuerpo o fragmento. Asi, el anticuerpo o fragmento maduro carecera de toda secuencia guia o sefal.
[0153] En algunos casos, tal como cuando se desee glicosilacion en el sistema de expresion de una celula huesped eucariotica, pueden manipularse las distintas presecuencias para mejorar la glicosilacion o produccion. Por ejemplo, puede alterarse el sitio de corte para la peptidasa de un peptido sefal, o pueden afadirse prosecuencias, lo cual tambien puede afectar la glicosilacion. El anticuerpo o fragmento final puede tener en la posicion -1 (con respecto al primer aminoacido de la proteina madura) uno o varios aminoacidos adicionales que incidan en la expresión y que pueden no haber sido totalmente eliminados. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento final puede tener uno o dos aminoacidos que se encuentren en el sitio de corte para la peptidasa, unidos al N-terminal. Como alternativa, el uso de algunos sitios de corte para enzimas puede redundar en una forma ligeramente truncada del anticuerpo o fragmento deseado, si la enzima efectua el corte en una zona de este tipo dentro del anticuerpo o fragmento maduro.
[0154] Los vectores de expresion tipicamente contendrán un promotor que es reconocido por el organismo huesped y esta operativamente enlazado a una molecula de acido nucleico que codifica un anticuerpo que se une a la 1L-1 o fragmento que se une al antigeno. Puede usarse un promotor nativo o heterologo, en dependencia de la celula huesped que se use para la expresion y de la produccion que se desee.
[0155] Los promotores destinados a ser usados con huespedes procarioticos incluyen a los miembros del grupo que consta de sistemas promotores de beta-lactamasa y lactosa; fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofano (trp); y promotores hibridos tales como el promotor tac. Son tambien adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias han sido publicadas, y los mismos pueden ser ligados a una secuencia de acido nucleico deseada o a las deseadas secuencias de acido nucleico, usando los enlazadores o adaptadores que sean deseables para proporcionar sitios de restriccion.
[0156] Son tambien conocidos en la tecnica promotores destinados a ser usados con huespedes de levadura. Se usan ventajosamente potenciadores de levadura con promotores de levadura. Son perfectamente conocidos promotores que son adecuados para ser usados con celulas huesped de mamifero, y los mismos incluyen a los obtenidos de los genomas de virus tales como poliomavirus, virus de la viruela aviar, adenovirus (tales como el Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y con la maxima preferencia el Virus de Simio 40 (SV40). Otros adecuados promotores de mamifero incluyen a promotores heterologos de mamifero, como p. ej. promotores de shock termico y el promotor de actina.
[0157] Los adicionales promotores que pueden ser usados para expresar los agentes de unión selectiva de la invención incluyen, aunque sin caracter limitativo, a los siguientes: la region promotora inicial de SV40 (Bemoist y Chambon, Nature, 290:304-310, 1981); el promotor CMV; el promotor contenido en la repeticion terminal larga 3' del virus del sarcoma del Rous (Yamamoto et al. (1980), Cell 22: 787-97); el promotor de timidina quinasa del herpes (Wagner et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1444-5); las secuencias reguladoras del gen de metalotionina (Brinster et al.,
Nature, 296; 39-42, 1982); vectores de expresión procariótica tales como el promotor de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75; 3727-3731, 1978); o el promotor tac (0eBoer et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-5). Tambien son de interes las siguientes regiones de control transcripcional animal que presentan especificidad tisular y han sido utilizadas en animales transgenicos: la region de control del gen de elastasa 1 que es activa en celulas acinares pancreaticas (Swift et al. (1984), Cell 38: 639-46; Omitz et al. (1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; Mac0onald (1984), Hepatology 7: 425-515); la región de control del gen de insulina que es activa en celulas beta pancreaticas (Hanahan (1985), Nature 315: 115-22); la región de control del gen de inmunoglobulina que es activa en celulas linfoides (Grosschedl et al. (1984), Cell 38; 647-58; Adames et al. (1985), Nature 318; 533-8; Alexander et al. (1987), Mol. Cell. Biol. 7: 1436-44); la región de control del virus del tumor mamario de raton que es activa en celulas testiculares, de mama, linfoides y troncales (Leder et al. (1986), Cell 45: 485-95), la region de control del gen de albumina que es activa en el higado (Pinkert et al. (1987), Genes y 0evel. 1: 268-76); la region de control del gen de alfafetoproteina que es activa en el higado (Kumlauf et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 5: 163948; Hammer et al. (1987), Science, 235: 53-8); la region de control del gen de alfa 1-antitripsina que es activa en el higado (Kelsey et al. (1987), Genes y 0evel. 1: 161-71), la region de control del gen de beta-globina que es activa en la celulas mieloides (Mogram et al., Nature, 315 338-340, 1985; Kollias et al. (1986), Cell 46: 89-94); la region de control del gen de la proteina basica mielina, que es activa en celulas oligodendrociticas en el cerebro (Readhead et al. (1987), Cell, 48: 703-12); la region de control del gen de la cadena liviana 2 de miosina, que es activa en el musculo esqueletico (Sani (1985), Nature, 314: 283-6); y la region de control del gen de la hormona de liberacion gonadotropica, que es activa en el hipotalamo (Mason et al. (1986), Science 234: 1372-8).
[0158] Puede insertarse una secuencia potenciadora en el vector para incrementar la transcripcion en celulas huesped eucarioticas. Son conocidas varias secuencias potenciadoras que pueden ser obtenidas de genes de mamifero (como p. ej. globina, elastasa, albumina, alfa-feto-proteina e insulina). Sin embargo, tipicamente se usara un potenciador de un virus. El potenciador de SV40, el potenciador del promotor inicial de citomegalovirus, el potenciador de polioma y potenciadores de adenovirus son ejemplos de elementos potenciadores para activacion de promotores eucarioticos.
[0159] Mientras que un potenciador puede ser empalmado en el vector en una posicion 5' o 3' con respecto a la region codificadora del polipeptido, el mismo esta tipicamente situado en un sitio 5' con respecto al promotor.
[0160] Los vectores para expresar ácidos nucleicos incluyen a los que son compatibles con celulas huesped bacterianas, de insecto y de mamifero. Tales vectores incluyen, inter alia, a los miembros del grupo que consta de pCR11, pCR3 y pc0NA3.1 (1nvitrogen Company, San 0iego, Calif.), pBS11 (Stratagene Company, La Jolla, Calif.), pET15 (Novagen, Madison, Wis.), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Calif.), pETL (BlueBac11; 1nvitrogen), p0SR-alfa (Publicacion PCT N° WO 90/14363) y pFastBac0ual (Gibco/BRL, Gran 1sland, N.Y.).
[0161] Los posibles vectores adicionales incluyen, aunque sin caracter limitativo, a los miembros del grupo que consta de cosmidos, plasmidos o virus modificados, pero el sistema vector debe ser compatible con la celula huesped seleccionada. Tales vectores incluyen, aunque sin caracter limitativo, a plasmidos tales como derivados de plasmido Bluescriptt (un fagemido basado en Co1E1 de alto numero de copias, Stratagene Cloning Systems 1nc., La Jolla Calif.), plasmidos de clonacion para PCR disefados para clonar productos de PCR amplificados con Taq (como p. ej. TOPOMF . TA Cloningt Kit, derivados de plasmido PCR:1, 1nvitrogen, Carlsbad, Calif.) y vectores de mamifero, levadura o virus tales como un sistema de expresion de baculovirus (derivados de plasmido pBacPAK, Clontech, Palo Alto, Calif.). Las moleculas recombinantes pueden ser introducidas en celulas huesped mediante tecnicas de transformacion, transfeccion, infeccion o electroporacion u otras tecnicas conocidas.
[0162] Células Huésped y Usos de las Mismas
[0163] La invencion adicionalmente aporta una celula (como p. ej. una celula aislada o purificada) que comprende un acido nucleico o vector de la invencion. La celula puede ser cualquier tipo de celula, con la excepcion de una celula ovarica fertilizada humana o una celula troncal embrionica humana, siendo la celula capaz de ser transformada con el acido nucleico o vector de la invencion para asi producir un polipeptido codificado por el mismo. La celula es preferiblemente la celula de un mamifero, tal como un humano, y es mas preferiblemente una celula de hibridoma, una celula troncal embrionica o un ovulo fertilizado.
[0164] Para expresar el anticuerpo o fragmento que se une a la 1L-1 �, 0NAs que codifican cadenas livianas y pesadas de longitud parcial o completa, obtenidos como se ha descrito anteriormente, son insertados en vectores de expresion de forma tal que los genes queden operativamente enlazados a secuencias de control transcripcional y traduccional. En este contexto, la expresion "operativamente enlazado" tiene el significado de que un gen de anticuerpo es ligado en un vector de forma tal que las secuencias de control transcripcional y traduccional dentro del vector sirven para desempeñar su pretendida función de regular la transcripción y traducción del gen de anticuerpo. Las secuencias de vector de expresion y de control de expresion se eligen para que sean compatibles con la celula huesped de expresion que se use. El gen de cadena liviana de anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo pueden ser insertados en vectores independientes, o mas tipicamente ambos genes son insertados en el mismo vector de expresion. Los genes de anticuerpo son insertados en el vector de expresion mediante metodos estandar (como p. ej. la ligacion de sitios de restricción complementarios en el vector y fragmento de gen de anticuerpo, o la ligacion de extremos romos si no estan presentes sitios de restriccion). Antes de la insercion de las secuencias de cadena liviana o pesada, el vector de expresión puede ya llevar secuencias de region constante de anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque para convertir las secuencias VH y VL seleccionadas en genes de anticuerpo de longitud completa es el de insertarlas en vectores de expresión que ya codifiquen regiones constantes de cadena pesada y regiones constantes de cadena liviana, respectivamente, de forma tal que el segmento VH quede enlazado operativamente al segmento o a los segmentos CH dentro del vector y que el segmento VL quede enlazado operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicionalmente o como alternativa, el vector de expresion recombinante puede codificar un peptido sefal que facilite la secrecion de la cadena de anticuerpo desde una celula huesped. El gen de la cadena de anticuerpo puede ser clonado en el vector de forma tal que el peptido sefal quede enlazado en marco al terminal amino del gen de la cadena de anticuerpo. El peptido sefal puede ser un peptido sefal de inmunoglobulina o un peptido sefal heterologo (es decir, un peptido sefal de una proteina no inmunoglobulina).
[0165] Ademas de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresion recombinante de la invencion pueden llevar secuencias reguladoras que controlen la expresion de los genes de cadena de anticuerpo en una celula huesped. En la expresion "secuencia reguladora" se pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresion (como p. ej. sefales de poliadenilacion) que controlan la transcripcion o traduccion de los genes de cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras estan descritas, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San 0iego, Calif. (1990). Se comprendera que el disefo del vector de expresion, incluyendo la seleccion de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la celula huesped a transformar, el nivel de expresion de proteina deseado y otras consideraciones. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresion en celulas huesped de mamifero incluyen a elementos virales que dirigen altos niveles de expresion de proteina en celulas de mamifero.
[0166] Ademas de los genes de cadena de anticuerpo y de las secuencias reguladoras, los vectores de expresion recombinante de la invención pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulen la replicacion del vector en celulas huesped (como p. ej. origenes de replicacion) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la seleccion de celulas huesped en las cuales ha sido introducido el vector (veanse, p. ej., las Patentes U.S. Nums. 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, que son todas de Axel et al.). Por ejemplo, tipicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a farmacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una celula huesped en la cual ha sido introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen al gen de dihidrofolato reductasa (0HFR) (para su uso en celulas huesped 0HFR con amplificacion/seleccion de metotrexato) y el gen neo (para seleccion para G418).
[0167] Los metodos para introducir acidos nucleicos y vectores en celulas aisladas y el cultivo y la seleccion de celulas huesped transformadas in vitro son conocidos en la tecnica e incluyen el uso de transformacion mediada por cloruro calcico, transduccion, conjugacion, apareamiento triparental, 0EAE, transfeccion mediada por dextrano, infeccion, fusion de membranas con liposomas, bombardeo de alta velocidad con microproyectiles recubiertos con 0NA, microinyeccion directa en celulas individuales y electroporacion (veanse, p. ej., Sambrook et al., supra; 0avis et al., Basic Methods en Molecular Biology, 2a ed., McGraw-Hill Professional, 1995; y Neumann et al., EMBO J., 1: 841 (1982)).
[0168] La celula que comprende el acido nucleico o vector de la invención puede ser usada para producir el anticuerpo o fragmento del mismo que se une a la IL-1 �, o una parte del mismo (como p. ej. una secuencia de cadena pesada o una secuencia de cadena liviana codificada por el ácido nucleico o vector). Tras haber introducido el acido nucleico o vector de la invencion en la celula, la celula es cultivada bajo condiciones adecuadas para la expresion de la secuencia codificada. El anticuerpo, el fragmento de union al antigeno o la parte del anticuerpo puede ser luego aislado(a) de la celula.
[0169] En ciertas realizaciones pueden ser introducidos en la celula dos o mas vectores que juntamente codifiquen un anticuerpo que se une a la IL-1� o un fragmento del mismo que se una al antigeno. Por ejemplo, puede ser introducido en una celula huesped un primer vector que codifique una region variable de cadena pesada o una secuencia de cadena pesada completa, y tambien se introduce en la celula huesped un segundo vector que codifique una region variable de cadena liviana o una secuencia de cadena liviana completa. La celula es luego cultivada bajo condiciones adecuadas para la expresión de las dos secuencias codificadas por los vectores primero y segundo, y los polipeptidos codificados pueden ser aislados de la celula huesped. 0e ser necesario, los polipeptidos aislados pueden ser luego combinados bajo condiciones que promuevan su asociacion y organizacion para constituir un anticuerpo que se una a la IL-1� o un fragmento del mismo que se una al antigeno. Como alternativa, los vectores primero y segundo pueden ser introducidos en celulas independientes, y los productos pueden ser aislados de las respectivas celulas y combinados para asi obtener un anticuerpo que se una a la IL-1� o un fragmento del mismo que se una al ant
igeno. Han sido descritos en la tecnica metodos para promover la asociacion y organizacion de constituyentes de anticuerpos para formar polipeptidos que se unen a antigenos. Analogamente son conocidos para los expertos en la materia metodos para aislar un anticuerpo, un fragmento de union al antigeno del mismo o fragmentos de cadena pesada y de cadena liviana.
[0170] Pueden usarse para generar un animal no humano transgenico celulas troncales embriónicas u óvulos fertilizados (con la excepcion de las celulas troncales embrionicas humanas o los ovulos fertilizados humanos) que comprendan un acido nucleico o vector de la invencion. Metodos para hacer animales transgenicos estan descritos en Hofker et al., Transgenic Mouse: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press, Clifton, NJ, 2002. Los animales no humanos transgenicos que comprendan un acido nucleico o vector de los que aqui se dan a conocer pueden ser usados para expresar el anticuerpo codificado, el fragmento de union al antigeno o la parte del anticuerpo. El anticuerpo, el fragmento de union al antigeno o la parte pueden ser luego aislados del animal. Partes de un anticuerpo pueden posteriormente ser reconstituidas (en combinacion con adicionales partes del anticuerpo) para asi obtener un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención que se una a la IL-1 �.
[0171] Las celulas huesped pueden ser celulas huesped procarioticas (tales como E. coli) o celulas huesped eucarioticas (tales como una celula de levadura, una celula de insecto o una celula de vertebrado). La celula huesped, al ser cultivada bajo condiciones apropiadas, expresa un anticuerpo o fragmento que se une a la 1L-1�, que puede posteriormente ser recogido del medio de cultivo (si la celula huesped lo secreta al medio) o directamente de la celula huesped que lo produzca (si el mismo no es secretado). La seleccion de una celula huesped apropiada dependera de varios factores tales como los deseados niveles de expresion, las modificaciones polipeptidicas que sean deseables o necesarias para la actividad, tal como la glicosilacion o la fosforilacion, y la facilidad de plegamiento para formar una molecula biologicamente activa. Las de una serie de adecuadas celulas huesped son conocidas en la tecnica y muchas pueden ser obtenidas de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC), de Manassas, Va. Los ejemplos incluyen a celulas de mamifero, tales como celulas de ovario de hamster chino (CHO) (N° CCL61 de la ATCC), celulas CHO 0HFR (Urlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 4216-4220 (1980)), celulas renales embrionicas humanas (HEK) 293 o 293T (N° CRL1573 de la ATCC), celulas 3T3 (N° CCL92 de la ATCC) o celulas PER.C6. Son conocidos en la tecnica la seleccion de adecuadas celulas huesped de mamifero y los metodos de transformacion, cultivo, amplificacion, cribaje y produccion y purificacion de productos. Otras adecuadas lineas celulares de mamifero son las lineas celulares COS-1 (N° CRL1650 de la ATCC) y COS-7 de mono (N° CRL1651 de la ATCC) y la linea celular CV-1 (N° CCL70 de la ATCC). Adicionales ejemplos de celulas huesped de mamifero incluyen a los miembros del grupo que consta de lineas celulares de primate, lineas celulares aviares y lineas celulares de roedor, incluyendo las lineas celulares transformadas. Son tambien adecuadas celulas diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario y explantes primarios. Las celulas candidatas pueden ser genotipicamente deficientes en el gen de seleccion, o pueden contener un gen de seleccion de accion dominante. Otras adecuadas lineas celulares de mamifero incluyen, aunque sin caracter limitativo, a los miembros del grupo que consta de celulas N2A de neuroblastoma de raton, celulas L-929 de raton, HeLa, lineas 3T3 derivadas de ratones suizos, Balb-c o N1H o lineas celulares de hamster HaK o BHK, que pueden ser obtenidas de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo, de Manassas, Va. Cada una de estas lineas celulares es conocida y esta a disposicion de los expertos en la tecnica de la expresion de proteinas.
[0172] Son analogamente utiles como celulas huesped adecuadas para la presente invencion las celulas bacterianas. Por ejemplo, las distintas cepas de E. coli (como p. ej. la HB101 (N° 33694 de la ATCC), la 0H5a, la 0H10 y la MC1061 (N° 53338 de la ATCC)) son perfectamente conocidas como celulas huesped en el campo de la biotecnologia. Pueden tambien emplearse en este metodo varias cepas de B. subtillis, Pseudomonas spp., otros Bacillus spp., Streptomyces spp. y organismos similares.
[0173] Para la expresion de las cadenas livianas y pesadas, el (los) vector(es) de expresion que codifica(n) las cadenas pesadas y livianas es (son) transfectados en una celula huesped mediante tecnicas estandar. La transfeccion incluye a las de una amplia variedad de tecnicas que se usan comunmente para la introduccion de 0NA exogeno en una celula huesped procariotica o eucariotica, como p. ej. la electroporacion, la precipitacion de fosfato calcico, la transfeccion con 0EAE-dextrano y tecnicas similares. A pesar de que es teoricamente posible expresar los anticuerpos o fragmentos que se unen a la IL-1� en celulas huesped procarioticas o eucarioticas, la expresion de los anticuerpos o fragment os en celulas eucarioticas, y con la maxima preferencia en celulas huesped de mamifero, es la mas preferida porque tales celulas eucarioticas, y en particular las celulas de mamifero, es mas probable que ensamblen y secreten un anticuerpo correctamente plegado e inmunologicamente activo en comparacion con las celulas procarioticas. Las celulas huesped de mamifero para expresar los anticuerpos recombinantes de la invencion incluyen a los miembros del grupo que consta de celulas de Ovario de Hamster Chino (celulas CHO) (incluyendo a celulas 0HFR-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:42164220, usadas con un marcador seleccionable de 0HFR, p. ej. como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), celulas de mieloma NS0, celulas COS y celulas SP2. Cuando vectores de expresion recombinante que codifican genes de anticuerpo son introducidas en celulas huesped de mamifero, los anticuerpos son producidos cultivando las celulas huesped por espacio de un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresion del anticuerpo en las celulas huesped, o mas preferiblemente, la secrecion del anticuerpo al medio de cultivo en el cual se cultivan las celulas huesped. Los anticuerpos pueden ser recuperados a partir del medio de cultivo usando metodos de purificacion de proteinas estandar.
[0174] Muchas cepas de celulas de levadura que son conocidas en la tecnica estan tambien disponibles como celulas huesped para la expresion de los anticuerpos y fragmentos. Las celulas de levadura preferidas, incluyen por ejemplo, a las Saccharomyces cerivisae. Adicionalmente, cuando se desee pueden utilizarse sistemas celulares de insectos. Tales sistemas estan descritos por ejemplo en Kitts et al. (Biotechniques, 14.810-817 (1993)), Lucklow (Curr. Opin.
Biotechnol., 4, 564-572 (1993) y Lucklow et al. (J. Virol., 67, 4566-4579 (1993)). Son celulas de insecto preferidas las Sf9 y Hi5 (1nvitrogen, Carlsbad, Calif.).
[0175] La transformacion o transfeccion de una molecula de acido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento que se une a la IL-1 en una celula huesped seleccionada puede ser llevada a cabo por metodos perfectamente conocidos entre los que se incluyen los metodos que hacen uso de cloruro calcico, los metodos de electroporacion, los metodos de microinyeccion, los metodos de lipofeccion o los metodos que emplean 0EAE-dextrano. El metodo que se seleccione dependera en parte del tipo de celula huesped a usar. Estos metodos y otros metodos adecuados son perfectamente conocidos y se exponen, por ejemplo, en Sambrook et al. supra.
[0176] Pueden tambien usarse animales transgenicos para expresar anticuerpos y fragmentos glicosilados. Por ejemplo, puede usarse un animal transgenico productor de leche (una vaca o una cabra, por ejemplo) y pueden obtenerse agentes de union glicosilados en la leche animal. Como alternativa, pueden usarse plantas para producir agentes de union selectiva glicosilados.
[0177] Celulas huesped que comprendan un vector de expresion que codifique un anticuerpo o fragmento que se una a la IL-1� pueden ser cultivadas usando medios conocidos en la tecnica. Los medios habitualmente contendran todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia de las celulas. Los ejemplos de medios para cultivar celulas
E. coli incluyen el Caldo de Luria (LB) y/o el Caldo Terrific (TB). Son medios adecuados para cultivar celulas eucarioticas los RPM1 1640, MEM y 0MEM, que pueden ser suplementados con suero y/o factores de crecimiento segun se desee para la especifica linea celular que se cultive. Un ejemplo de medio para cultivos de celulas de insecto es el medio de Grace suplementado con yeastolato, hidrolizado de lactalbumina y/o suero bovino fetal, segun sea necesario.
[0178] Puede ser afadido como suplemento a los medios un antibiotico u otro compuesto que sea util para el crecimiento selectivo de celulas transfectadas o transformadas. El compuesto sera elegido sobre la base del elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el cual fue transformada la celula huesped. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable es la resistencia a la canamicina, el compuesto que se afadira al medio de cultivo sera canamicina. Otros compuestos para crecimiento selectivo incluyen a la ampicilina, la tetraciclina y la neomicina.
[0179] La cantidad de anticuerpo o fragmento que se une a la IL-1 producido por una celula huesped puede ser evaluada usando metodos conocidos en la tecnica. Tales metodos incluyen, sin caracter limitativo, el analisis Western blot, la electroforesis en gel de S0S-poliacrilamida, la electroforesis en gel no desnaturalizante, la separacion por HPLC, la inmunoprecipitacion y/o los analisis de actividad.
[0180] La purificación de un anticuerpo o fragmento que se une a la IL-1 y ha sido secretado al medio celular puede llevarse a cabo usando las de una variedad de tecnicas entre las que se incluyen la cromatografia de afinidad, de inmunoafinidad o de intercambio ionico, la cromatografia de tamices moleculares, la electroforesis en gel preparativa o concentracion isoelectrica, la cromatoconcentracion y la cromatografia de liquidos de alta presion. Por ejemplo, los anticuerpos que comprenden una region Fc pueden ser purificados por cromatografia de afinidad con Proteina A, que se une selectivamente a la region Fc. Formas modificadas de un anticuerpo o fragmento de union al antigeno pueden ser preparadas con marcas de afinidad tales como hexahistidina u otro pequefo peptido tal como FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.) o myc (1nvitrogen) en su terminal carboxilo o amino, y pueden ser purificadas mediante una columna de afinidad de un solo paso. Por ejemplo, la polihistidina se une con gran afinidad y especificidad al niquel, y por consiguiente puede usarse una columna de afinidad de niquel (tal como las columnas de niquel Qiagent) para la purificacion de agentes de union selectiva marcados con polihistidina. (Vease, por ejemplo, Ausubel et al. eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York (1993)). En algunos casos puede emplearse mas de un paso de purificacion.
[0181] Los anticuerpos o fragmentos que se unen a la IL-1 y son expresados en celulas huesped procarioticas pueden estar presentes en forma soluble ya sea en el espacio periplásmico o bien en el citoplasma o en forma insoluble como parte de cuerpos de inclusión intracelular. Los anticuerpos o fragmentos que se unen a la 1L-1� pueden ser extraidos de la celula huesped usando cualquier tecnica apropiada de las que son conocidas en el ramo. Por ejemplo, las celulas huesped pueden ser lisadas para liberar el contenido del periplasma/citoplasma mediante prensa de French, homogeneizacion y/o sonicacion seguida por centrifugacion.
[0182] Las formas solubles de un anticuerpo o fragmento que se une a la IL-1� y está presente en el citoplasma o es liberado desde el espacio periplasmico pueden ser purificadas adicionalmente usando metodos conocidos en la tecnica, como por ejemplo la liberacion de fragmentos Fab desde el espacio periplasmico bacteriano mediante tecnicas de shock osmotico.
[0183] Si se han formado cuerpos de inclusion que comprenden un anticuerpo o fragmento, los mismos pueden a menudo unirse a las membranas celulares interiores y/o exteriores y por consiguiente se encontraran primariamente en el material pelletizado tras centrifugacion. El material pelletizado puede ser luego tratado a pH extremos o con agente caotropico tal como un detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea o derivados de urea en presencia de un
agente reductor tal como ditiotreitol a pH alcalino o tris-carboxietil-fosfina a pH ácido para liberar, disgregar y solubilizar los cuerpos de inclusion. El anticuerpo o fragmento soluble puede ser luego analizado usando electroforesis en gel, inmunoprecipitacion o tecnicas similares. Si se desea aislar un anticuerpo o fragmento de union al antigeno solubilizado, el aislamiento puede ser llevado a cabo usando metodos estandar tales como los que se exponen a continuacion y en Marston et al. (Meth. Enz., 182:264-275 (1990)).
[0184] En algunos casos, un anticuerpo o fragmento que se une a la 1L-1 puede no ser biológicamente activo tras el aislamiento. Pueden usarse para restablecer la actividad biologica varios metodos para "replegar" o convertir un polipeptido para darle su estructura terciaria y generar enlaces disulfuro. Tales metodos incluyen el de exponer al polipeptido solubilizado a un pH de habitualmente mas de 7 y en presencia de una determinada concentracion de un caotropo. La seleccion de caotropo es muy similar a las elecciones que se usan para la solubilizacion de cuerpos de inclusión, pero habitualmente el caotropo es usado a una concentracion mas baja y no es necesariamente el mismo como los caotropos que se usan para la solubilizacion. En la mayoria de los casos la solucion de replegamiento/oxidacion tambien contendra un agente reductor o el agente reductor más su forma oxidada en una proporcion especifica para generar un determinado potencial de redox que permita que se produzca mezcla de disulfuros en la formacion del (de los) puente(s) de cisteina de la proteina. Algunas de las parejas redox que se usan comunmente incluyen a los miembros del grupo que consta de cisteina/cistamina, glutationa (GSH)/ditiobis GSH, cloruro cuprico, ditiotreitol (0TT)/ditiano 0TT y 2-mercaptoetanol (bME)/di- tio.b(ME). En muchos casos puede usarse un cosolvente para incrementar el rendimiento del replegamiento, y los reactivos comunes que se usan con esta finalidad incluyen a los miembros del grupo que consta de glicerina, polietilenglicol de varios pesos moleculares, ariginina y reactivos similares.
[0185] Los anticuerpos o fragmentos de la presente invención que se unen a la IL-1 pueden tambien ser preparados por metodos de sintesis quimica (tales como la sintesis de peptidos en fase solida) usando tecnicas conocidas en el ramo tales como las expuestas por Merrifield et al. (1963), J. Am. Chem. Soc., 85: 2149, Houghten et al. (1985), Proc. Natl Acad. Sci. USA, 82: 5132, y Stewart and Young (1984), Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Cl., Rockford, 111. Tales anticuerpos o fragmentos pueden ser sintetizados con o sin una metionina en el terminal amino. Los anticuerpos y fragmentos de union al antigeno sintetizados quimicamente pueden ser oxidados usando metodos que se exponen en estas referencias para formar puentes disulfuro. Los anticuerpos y fragmentos asi preparados conservaran al menos una actividad biológica asociada a un anticuerpo o fragmento de unión a la IL-1� nativo o recombinante.
[0186] Composiciones Farmacéuticas
[0187] Con los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, acidos nucleicos o vectores de la invención que se unen a la IL1� pueden hacerse composiciones, y especialmente composiciones farmac
euticas. Tales composiciones comprenden una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invención que se une a la IL-1 en mezcla con un soporte adecuado, como p. ej. un agente farmac
euticamente aceptable. Tipicamente, los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, acidos nucleicos o vectores de la invencion que se unen a la IL-1 son purificados suficientemente para la administración a un animal antes de hacerse con los mismos una composicion farmaceutica.
[0188] Los agentes farmaceuticamente aceptables destinados a ser usados en las composiciones farmaceuticas incluyen a los miembros del grupo que consta de soportes, excipientes, diluyentes, antioxidantes, conservantes, colorantes, agentes saborizantes y diluyentes, agentes emulsionantes, agentes de suspension, solventes, cargas, agentes voluminizantes, tampones, vehiculos de aporte, agentes de tonicidad, cosolventes, agentes mojantes, agentes complejantes, agentes tamponantes, antimicrobianos y agentes superficiactivos.
[0189] Son ejemplos de soportes apropiados la salina tamponada neutra o la salina mezclada con albumina serica. Las composiciones farmaceuticas pueden incluir antioxidantes tales como acido ascorbico; polipeptidos de bajo peso molecular; proteinas tales como albumina serica, gelatina o inmunoglobulinas; polimeros hidrofilicos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina; glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como E0TA; alcoholes de azucar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o agentes superficiactivos no ionicos tales como Tween, pluronicos o polietilenglicol (PEG). Tambien a modo de ejemplo, los adecuados agentes acrecentadores de la tonicidad incluyen a los miembros del grupo que consta de halogenuros metálicos (preferiblemente cloruro sodico o potasico), manitol, sorbitol y agentes similares. Los conservantes adecuados incluyen a los miembros del grupo que consta de cloruro de benzalconio, timerosal, fenetilalcohol, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, acido sorbico y sustancias similares. Tambien puede usarse como conservante peroxido de hidrogeno. Los cosolventes adecuados incluyen a los miembros del grupo que consta de glicerina, propilenglicol y PEG. Los agentes complejantes adecuados incluyen a los miembros del grupo que consta de cafeina, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina. Los agentes superficiactivos o agentes mojantes adecuados incluyen a los miembros del grupo que consta de esteres de sorbitano, polisorbatos tales como polisorbato 80, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal y sustancias similares. Los tampones pueden ser tampones convencionales tales como acetato, borato, citrato, fosfato, bicarbonato o Tris-HCl. El tampon de acetato puede ser aproximadamente de pH 4-5,5, y el tampon de Tris puede ser
aproximadamente de pH 7-8,5. Se exponen adicionales agentes farmaceuticos en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edicion, A. R. Gennaro, redactor en jefe, Pack Publishing Company, 1990.
[0190] La composicion puede estar en forma liquida o en una forma liofilizada o secada por congelacion y puede incluir uno o varios lioprotectores, excipientes, agentes superficiactivos, aditivos estructurales de alto peso molecular y/o agentes voluminizantes (veanse por ejemplo las Patentes US 6.685.940, 6.566.329 y 6.372.716). En una realizacion se incluye un lioprotector, que es un azucar no reductor tal como sucrosa, lactosa o trehalosa. La cantidad de lioprotector que en general se incluye es tal que, tras la reconstitucion, la formulacion resultante sera isotonica, si bien tambien pueden ser adecuadas formulaciones hipertonicas o ligeramente hipotonicas. Adicionalmente, la cantidad de lioprotector deberá ser suficiente para impedir una inaceptable cantidad de degradacion y/o agregacion de la proteina tras liofilizacion. Los ejemplos de las concentraciones de lioprotector para azucares (como p. ej. sucrosa, lactosa y trehalosa) en la formulación preliofilizada son de aproximadamente 10mM a aproximadamente 400mM. En otra realizacion se incluye un agente superficiactivo tal como, por ejemplo, agentes superficiactivos no ionicos y agentes superficiactivos ionicos tales como polisorbatos (como p. ej. polisorbato 20 y polisorbato 80); poloxameros (como p. ej. el poloxamero 188); poli(etilenglicol)fenileteres (como p. ej. Triton); dodecilsulfato sodico (S0S); laurelsulfato sodico; octilglicosido sódico; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sulfobetaina; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- o cetilbetaina; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidipropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropilbetaina (como p. ej. lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-dimetilamina; metilcocoil-taurato sódico o metiloleil-taurato disodico; y la serie MONAQUATMF (Mona 1ndustries, 1n., Paterson, N.J.), polietilglicol, polipropilglicol y copolimeros de etilenglicol y propilenglicol (como p. ej. Pluronics, PF68, etc.). Los ejemplos de las cantidades de agente superficiactivo que pueden estar presentes en la formulación preliofilizada son de aproximadamente un 0,001-0,5%. Los aditivos estructurales de alto peso molecular (como p. ej. cargas y aglutinantes) pueden incluir, por ejemplo, a los miembros del grupo que consta de acacia, albumina, acido alginico, fosfato calcico (dibasico), celulosa, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sodica, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, dextrano, dextrina, dextratos, sucrosa, tilosa, almidon pregelatinizado, sulfato calcico, amilosa, glicina, bentonina, maltosa, sorbitol, etilcelulosa, fosfato disodico de hidrogeno, fosfato disodico, pirosulfito disodico, polivinilalcohol, gelatina, glucosa, goma guar, glucosa liquida, azucar compresible, silicato de aluminio y magnesio, maltodextrina, oxido de polietileno, polimetacrilatos, povidona, alginato sodico, tragacanto, celulosa microcristalina, almidon y ceina. Los ejemplos de las concentraciones de aditivos estructurales de alto peso molecular son de un 0,1% a un 10% en peso. En otras realizaciones puede incluirse un agente voluminizante (como p. ej. manitol o glicina).
[0191] Las composiciones pueden ser adecuadas para administracion parenteral. Los ejemplos de composiciones son adecuados para inyeccion o infusion a un animal por cualquier ruta de las que estan disponibles para el trabajador especializado, tales como las rutas intraarticular, subcutanea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional. Una formulacion parenteral tipicamente sera una solucion acuosa isotonica esteril y exenta de pirogenos, que opcionalmente contendra conservantes farmaceuticamente aceptables.
[0192] Son ejemplos de solventes no acuosos los miembros del grupo que consta de propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo. Los soportes acuosos incluyen a los miembros del grupo que consta de agua, soluciones alcoholicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo a la salina y a medios tamponados. Los vehiculos parenterales incluyen a los miembros del grupo que consta de solucion de cloruro sodico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sodico, Ringer lactato, o aceites fijados. Los vehiculos intravenosos incluyen a los miembros del grupo que consta de fluidos y nutrientes rellenadores, electrolitos rellenadores tales como los basados en dextrosa de Ringer, y sustancias similares. Pueden tambien estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y sustancias similares. Vease en general la publicacion Remington's Pharmaceutical Science, 16a Ed., Mack Eds., 1980.
[0193] Las composiciones farmaceuticas que aqui se describen pueden hacerse para aporte controlado o sostenido de una manera que proporcione una concentracion local del producto (como p. ej. bolo o efecto de deposito) y/o una incrementada estabilidad o vida media en un determinado ambiente local. Las composiciones pueden incluir la formulacion de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, acidos nucleicos o vectores de la invención que se unen a la IL1� con preparaciones particuladas de compuestos polimericos tales como acido polilactico, acido poliglicolico, etc., asi como con agentes tales como una matriz biodegradable, microesferas inyectables, particulas microcapsulares, microcapsulas, perlas de particulas bioerosionables, liposomas y dispositivos de aporte implantables que proporcionen la liberacion controlada o sostenida del agente activo, que entonces puede ser aportado en forma de inyeccion de deposito. Las tecnicas para hacer tales medios de aporte sostenido o controlado son conocidas, y han sido desarrollados y usados para la liberacion y el aporte controlada(o) de farmacos los de una variedad de polimeros. Tales polimeros son tipicamente biodegradables y biocompatibles. Hidrogeles de polimero, incluyendo a los formados por complejacion de segmentos de polimeros o polipeptidos enantiomericos, e hidrogeles con propiedades de sensibilidad a la temperatura o al pH pueden ser deseables para proporcionar un afecto de depósito de fármaco debido a las condiciones suaves y acuosas que intervienen en el atrapamiento de agentes proteinicos bioactivos (como p. ej.
anticuerpos). Vease, por ejemplo, la descripcion de microparticulas polimericas porosas de liberacion controlada para el aporte de composiciones farmaceuticas en la Publicacion de Solicitud WO 93/15722 al amparo del PCT.
[0194] Los materiales adecuados con esta finalidad incluyen a los miembros del grupo que consta de polilactidas (vease, p. ej., la Patente U.S. 3.773.919), polimeros de poli-(a-acidos hidroxicarboxilicos), tales como acido poli-0-(-)-3hidroxibutirico (EP 133.988A), copolimeros de acido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers,
22: 547-556 (1983)), poli(2-hidroxietilmetacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), vinilacetato de etileno, o acido poli-0(-)-3-hidroxibutirico. Otros polimeros biodegradables incluyen a los miembros del grupo que consta de poli(lactonas), poli(acetales), poli(ortoesteres) y poli(ortocarbonatos). Las composiciones de liberacion sostenida tambien pueden incluir liposomas, que pueden ser preparados por cualesquiera de varios metodos que son conocidos en la tecnica (vease, p. ej., Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-92 (1985)). El propio soporte o sus productos de degradacion debera(n) ser atoxico(s) en el tejido diana y no debera(n) agravar adicionalmente la condicion. Esto puede determinarse mediante cribaje de rutina en modelos animales del trastorno diana, o bien, si tales modelos no estan disponibles, en animales normales.
[0195] La microencapsulacion de proteinas recombinantes para liberacion sostenida ha sido llevada a cabo con exito con hormona del crecimiento humana (rhGH), interferón-(rh1FN--), interleuquina-2 y MN rgp 120. Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology. 8:755-758 (1990); Cleland, "0esign and Production of Single 1mmunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," en Vaccine 0esign: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, redactores en jefe (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072. WO 96/07399; y U.S. Pat. N° 5.654.010. Las formulaciones de liberacion sostenida de estas proteinas fueron desarrolladas usando polimero de acido poli-lácticocoglicolico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y a su amplia gama de propiedades de biodegradacion. Los productos de degradacion de los acidos PLGA, lactico y glicolico pueden ser eliminados rapidamente dentro del cuerpo humano. Ademas, la degradabilidad de este polimero puede ser dependiente de su composicion y peso molecular. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," en: M. Chasin and R. Langer (Redactores en jefe.), Biodegradable Polymers as 0rug 0elivery Systems (Marcel 0ekker: New York, 1990), pp. 1-41. Los adicionales ejemplos de composiciones de liberacion sostenida incluyen, por ejemplo, a la EP 58.481A, la Pat. U.S. N° 3.887.699, la EP 158.277A, la Patente Canadiense N° 1176565, U. Sidman et al., Biopolymers 22,547 [1983], R. Langer et al., Chem. Tech. 12, 98 [1982], Sinha et al., J. Control. Release 90, 261 [2003], Zhu et al., Nat. Biotechnol. 18, 24 [2000], y 0ai et al., Colloids Surf B Biointerfaces 41, 117 [2005].
[0196] Se contemplan tambien polimeros bioadhesivos para ser usados en o con composiciones de la presente invencion. Los bioadhesivos son materiales sinteticos y que se dan de manera natural que son capaces de adherirse a sustratos biologicos por espacio de prolongados periodos de tiempo. Por ejemplo, el Carbopol y el Policarbofil son ambos derivados reticulados sinteticos de poli(acido acrilico). Los sistemas de aporte bioadhesivos basados en sustancias que se dan de manera natural incluyen, por ejemplo, al acido hialuronico, que es tambien conocido como hialuronano. El acido hialuronico es un mucopolisacarido que se da de manera natural y consta de residuos de 0glucuronico y N-acetil-0-glucosamina. El acido hialuronico se encuentra en la matriz tisular extracelular de los vertebrados, e inclusive en tejidos conectivos, asi como en el fluido sinovial y en el humor vitreo y acuoso del ojo. 0erivados esterificados de acido hialuronico han sido usados para producir microesferas que están destinadas a ser usadas para el aporte y son biocompatibles y biodegradables (veanse, por ejemplo, Cortivo et al., Biomaterials (1991) 12:727-730; la Publicacion Europea N° 517.565, la Publicacion 1nternacional N° WO 96/29998; 1llum et al., J. Controlled Rel. (1994) 29:133-141). Los ejemplos de composiciones de la presente invencion con contenido de acido hialuronico comprenden un polimero de ester de acido hialuronico en una cantidad de aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 40% (en peso) de un anticuerpo o fragmento para IL-1� referido al polimero de acido hialuronico.
[0197] Pueden usarse para aportar composiciones de la presente invencion matrices polimericas tanto biodegradables como no biodegradables, y tales matrices polimericas pueden comprender polimeros naturales o sinteticos. Se prefieren las matrices biodegradables. El periodo de tiempo por espacio del cual se produce la liberacion esta basado en la seleccion del polimero. Tipicamente la mas deseable es una liberación a lo largo de un periodo de entre unas pocas horas y tres a doce meses. Los ejemplos de polimeros sinteticos que pueden ser usados para formar el sistema de aporte biodegradable incluyen a los siguientes: polimeros de acido lactico y acido glicolico, poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polialquilenglicoles, oxidos de polialquileno, tereftalatos de polialquileno, alcoholes polivinilicos, eteres polivinilicos, esteres polivinilicos, halogenuros polivinilicos, polivinilpirrolidona, poliglicolidos, polisiloxanos, polianhidridos, poliuretanos y copolimeros de los mismos, poli(acido butico), poli(acido valerico), alquilcelulosa, hidroxialquilcelulosas, eteres de celulosa, esteres de celulosa, nitrocelulosas, polimeros de esteres acrilicos y metacrilicos, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxibutilmetilcelulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, butirato de acetato de celulosa, ftalato de acetato de celulosa, carboxiletilcelulosa, triacetato de celulosa, sal sodica sulfato de celulosa, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo), poli(acrilato de octadecilo), polietileno, polipropileno, poli(etilenglicol), poli(oxido de etileno), poli(tereftalato de etileno), poli(alcoholes vinilicos), acetato de polivinilo, cloruro de polivinilo, poliestireno y polivinilpirrolidona. Los ejemplos de
polimeros naturales incluyen a los miembros del grupo que consta de alginato y otros polisacaridos incluyendo dextrano y celulosa, colageno, derivados quimicos de los mismos (sustituciones, adiciones de grupos quimicos, como por ejemplo alquilo, alquileno, hidroxilaciones, oxidaciones y otras modificaciones de las que son hechas rutinariamente por los expertos en la materia), albumina y otras proteinas hidrofilicas, ceina y otras prolaminas y proteinas hidrofobicas, y copolimeros y mezclas de los mismos. En general, estos materiales se degradan ya sea por hidrolisis enzimatica o bien por exposicion a agua in vivo, por erosion superficial o en masa. El polimero opcionalmente esta en forma de un hidrogel (veanse, por ejemplo, la WO 04/009664, la WO 05/087201 y Sawhney et al., Macromolecules, 1993, 26, 581587) que puede absorber hasta aproximadamente un 90% de su peso en agua y esta opcionalmente reticulado con iones multivalentes u otros polimeros.
[0198] Los sistemas de aporte tambien incluyen a sistemas no polimeros que son lipidos, incluyendo esteroles tales como colesterol, esteres de colesterol y acidos grasos de grasas neutras tales como mono-, di- y tri-gliceridos; sistemas de liberacion en forma de hidrogel; sistemas silasticos; sistemas basados en peptidos; recubrimientos de cera; tabletas comprimidas que usan aglutinantes y excipientes convencionales; implantes parcialmente fusionados y sistemas similares. Los ejemplos especificos incluyen, aunque sin caracter limitativo, a los siguientes: (a) sistemas erosionales en los cuales el producto esta contenido en una forma dentro de una matriz tal como las que se describen en las Pat. U.S. Nums. 4.452.775, 4.675.189 y 5.736.152, y (b) sistemas difusionales en los cuales un producto permea a una velocidad controlada desde un polimero tal como se describe en las Pat. U.S. Nums. 3.854.480, 5.133.974 y 5.407.686. Los liposomas que contienen el producto pueden ser preparados por metodos conocidos tales como, por ejemplo, (0E 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77: 4030-4034 (1980); EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; solicitud de patente japonesa 83118008; Pat. U.S. Nums. 4.485.045 y 4.544.545; y EP 102.324).
[0199] Como alternativa o adicionalmente, las composiciones pueden ser administradas localmente mediante implantación en la zona afectada de una membrana, una esponja u otro material apropiado en el cual hay sido absorbido o encapsulado un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invencion que se une a la IL-1�. Cuando se use un dispositivo de implantacion, el dispositivo puede ser implantado en cualquier tejido u organo adecuado, y el aporte de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invencion que se une a la IL-1� puede ser directamente a traves del dispositivo mediante bolo o mediante administracion continua o mediante cateter usando infusion continua.
[0200] Una composicion farmaceutica que comprenda un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invención que se una a la IL-1� puede hacerse para inhalacion, tal como por ejemplo en forma de un polvo seco. Pueden tambien hacerse soluciones para inhalacion en un propelente licuado para aporte como aerosol. En aun otra formulacion, las soluciones pueden ser nebulizadas. Adicionales composiciones farmaceuticas para administracion pulmonar incluyen a las descritas, por ejemplo, en la Publicacion de Solicitud WO 94/20069 al amparo del PCT, que da a conocer el aporte pulmonar de proteinas modificadas quimicamente. Para aporte pulmonar, el tamafo de particulas debera ser adecuado para el aporte al pulmon distal. Por ejemplo, el tamafo de particulas puede ser de 11m a 5 1m; si bien pueden usarse particulas de mayor tamafo, por ejemplo si cada particula es bastante porosa.
[0201] Ciertas formulaciones con contenido de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, acidos nucleicos o vectores de la invención que se unen a la IL-1� pueden ser administradas oralmente. Las formulaciones administradas de esta manera pueden hacerse con o sin los soportes que son habitualmente usados para hacer formas posológicas sólidas tales como tabletas y capsulas. Por ejemplo, una capsula puede ser disefada para liberar la parte activa de la formulacion en el punto del tracto gastrointestinal en el que es maximizada la biodisponibilidad y es minimizada la degradación presistemica. Pueden incluirse agentes adicionales para facilitar la absorcion de un agente de union selectiva. Tambien pueden emplearse diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de fusion, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspension, agentes de desintegracion de tabletas y aglutinantes.
[0202] Otra preparacion puede comprender una cantidad eficaz de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invención que se una a la IL-1� en mezcla con excipientes atóxicos que sean adecuados para la fabricacion de tabletas. 0isolviendo las tabletas en agua esteril o en otro vehiculo apropiado, pueden prepararse soluciones en forma de dosis unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, aunque sin caracter limitativo, a los miembros del grupo que consta de diluyentes inertes, tales como carbonato calcico, carbonato o bicarbonato sodico, lactosa o fosfato calcico; o agentes aglutinantes, tales como almidon, gelatina o acacia; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, acido estearico o talco.
[0203] Las formulaciones farmaceuticas adecuadas y/o preferidas pueden determinarse en vista de la presente publicación y de los conocimientos generales del campo de la tecnologia de la realizacion de formulaciones, en dependencia de la ruta de administracion prevista, del formato de aporte y de la dosificacion deseada. 1ndependientemente de la forma de administracion, una dosis eficaz puede calcularse segun el peso corporal del paciente, el area superficial del cuerpo o el tamafo del organo. El adicional afinamiento de los calculos para determinar la dosificacion apropiada para el tratamiento con respecto a cada una de las formulaciones que aqui se describen se hace rutinariamente en la tecnica y queda dentro del ambito de las tareas que se llevan a cabo rutinariamente en la
tecnica. Las dosificaciones apropiadas pueden ser determinadas mediante el uso de los apropiados datos de dosisrespuesta.
[0204] Adicionales formulaciones seran obvias a la luz de la presente exposicion, incluyendo las formulaciones que comprenden anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, acidos nucleicos o vectores de la invencion que se unen a la 1L-1 en combinación con uno u otros varios agentes terapeuticos. Por ejemplo, en algunas formulaciones se usa un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invencion que se une a la 1L-1� en combinación con un segundo inhibidor de una ruta de señalización de IL-1. Los segundos inhibidores representativos incluyen, aunque sin caracter limitativo, a los miembros del grupo que consta de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, peptidos, polipeptidos, compuestos, acidos nucleicos, vectores y composiciones farmaceuticas tales como por ejemplo los que se describen en los documentos US 6899878, US 2003022869, US 200660094663, US 20050186615, US 20030166069, WO/04022718, WO/05084696 y WO/05019259. Por ejemplo, una composicion puede comprender un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invencion que se una a la 1L-1� en combinación con un anticuerpo, fragmento, acido nucleico o vector que se una a la 1L-1� y codifique tal anticuerpo o fragmento.
[0205] Las composiciones farmaceuticas pueden comprender anticuerpos o fragmentos que se unan a la IL-1 en combinacion con otros agentes activos. Tales combinaciones son las utiles para su finalidad perseguida. Los agentes activos que se exponen a continuación lo son a efectos ilustrativos y no pretenden constituir limitaciones. Las combinaciones que son parte de esta invención pueden ser los presentes anticuerpos y fragmentos y al menos un agente adicional seleccionado de entre los que se enumeran a continuacion. La combinacion puede tambien incluir mas de un agente adicional, como p. ej. dos o tres agentes adicionales, si la combinacion es tal que la composicion formada pueda desempefar su funcion prevista.
[0206] Los agentes activos o combinaciones con los presentes anticuerpos o fragmentos incluyen a los miembros del grupo que consta de un farmaco antiinflamatorio no esteroide (NSA10) tal como aspirina, ibuprofeno y otros derivados del acido propionico (alminoprofeno, benoxaprofeno, acido bucloxico, carboprofeno, fenbufeno, fenoprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, indoprofeno, cetoprofeno, miroprofeno, naproxeno, oxaprocina, pirprofeno, pranoprofeno, suprofeno, acido tiaprofenico y tioxaprofeno), derivados de acido acetico (indometacina, acemetacina, alclofenaco, clidanaco, diclofenaco, fenclofenaco, acido fenclocico, fentiazaco, fuirofenaco, ibufenaco, isoxepaco, oxpinaco, sulindaco, tiopinaco, tolmetina, cidometacina y zomepiraco), derivados de acido fenamico (acido flufenamico, acido meclofenamico, acido mefenamico, acido niflumico y acido tolfenamico), derivados de acido bifenilcarboxilico (diflunisal y flufenisal), oxicams (isoxicam, piroxicam, sudoxicam y tenoxicam), salicilatos (acido acetilsalicilico, sulfasalacina) y las pirazolonas (apazona, bezpiperilona, feprazona, mofebutazona, oxifenbutazona, fenilbutazona). Otras combinaciones incluyen inhibidores de ciclooxigenasa-2 (COX-2). Otros agentes activos para ser usados en combinacion incluyen a esteroides tales como prednisolona, prednisona, metilprednisolona, betametasona, dexametasona o hidrocortisona. Una combinación de este tipo puede ser especialmente ventajosa, puesto que uno o varios efectos secundarios del esteroide pueden ser reducidos o incluso eliminados graduando la dosis de esteroide requerida al tratar pacientes en combinación con los presentes anticuerpos y fragmentos.
[0207] Los adicionales ejemplos de agentes activos para combinaciones con anticuerpos o fragmentos que se unen a la IL-1� para la artritis reumatoidea incluyen a los miembros del grupo que consta de fs)
ármaco(s) antiinflamatorio( supresor(es) de citoquina (CSA10s); anticuerpos para o antagonistas de otras citoquinas o factores de crecimiento humanos, como por ejemplo TNF, LT, 1L-1� 1L-2, 1L-6, 1L-7, 1L-8, 1L-15, 1L-16, 1L-18, EMAP-11, GM-CSF, FGF o P0GF. Los anticuerpos y fragmentos que se unen a la IL-1� pueden ser combinados con anticuerpos para mol
eculas de superficie celular tales como C02, C03, C04, C08, C025, C028, C030, C040, C045, C069, C080 (B7.1), C086 (B7.2), C090, o sus ligandos, incluyendo al C0 154 (gp39 o C040L).
[0208] Las preferidas combinaciones de agentes activos pueden interferir en distintos puntos en la cascada autoinmune y subsiguiente cascada inflamatoria; incluyendo los ejemplos preferidos a los miembros del grupo que consta de antagonistas TNF como anticuerpos TNF quimericos, humanizados o humanos, 02E7, cA2 (RemicadeMF), C0P 571, fragmentos de anticuerpo anti-TNF (p. ej. C0P870), y receptores p55 o p75TNF, derivados de los mismos (p75TNFR1gG (EnbrelMF) o p55TNFR1gG (Lenercept), receptor 1L-13 soluble (sIL-13), y tambien inhibidores de enzima de conversion de TNFa (TACE); y análogamente pueden ser eficaces por la misma razón inhibidores de IL -1 (como p. ej. inhibidores de la enzima convertidora de interleuquina-1, tales como Vx740 o 1L-1RA, etc.). Otras combinaciones preferidas incluyen 1nterleuquina 11, anti-P7s y ligando de glicoproteina p-selectina (PSGL). Aun otra combinacion es la que se forma con otros agentes clave de la respuesta autoinmune que pueden actuar paralelamente a la función de IL-1� o en dependencia o en concierto con la misma.
[0209] Los agentes activos para la enfermedad de Crohn en los cuales puede combinarse un anticuerpo o una parte de union al antigeno incluyen a los miembros del grupo que consta de antagonistas TNF, como por ejemplo anticuerpos anti-TNF, 02E7, cA2 (RemicadeMF), C0P 571, fragmentos de anticuerpo anti-TNF (como p. ej. C0P870), constructos TNFR-1g (p75TNFR1gG (EnbrelMF) y p55TNFR1gG (Lenercept)), anti-P7s, ligando glicoproteina p-selectina (PSGL), receptor IL-13 soluble (sIL-13) e inhibidores P0E4. Los anticuerpos o fragmentos que se unen a la 1L-1� pueden ser combinados con corticosteroides, como por ejemplo budenosida y dexametasona. Los anticuerpos o fragmentos que se
unen a la IL-1 pueden tambien ser combinados con agentes tales como sulfasalacina, acido 5-aminosalicilico y olsalacina, y con agentes que interfieren en la sintesis o accion de citoquinas proinflamatorias tales como 1L-1, como por ejemplo inhibidores de la enzima convertidora de 1L-1 (p. ej. Vx740) e 1L-1ra. Los anticuerpos o fragmentos que se unen a la IL-1 pueden tambien ser usados con inhibidores de la sefalizacion de las celulas T, como por ejemplo inhibidores de tirosina quinasa 6-mercaptopurinas. Los anticuerpos o fragmentos que se unen a la 1L-1 pueden ser combinados con IL-11.
[0210] Otros ejemplos de agentes activos para esclerosis multiple con los cuales los anticuerpos o fragmentos que se unen a la IL-1 pueden ser combinados incluyen a los miembros del grupo que consta de corticosteroides; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4-aminopiridina; tizanidina; interferón-�1a (Avonex; Biogen); interferón-1b (Betaseron; Chiron/Berlex); Copolimero 1 (Cop -1; Copaxona; Teve Pharmaceutical Industries, 1nc.); oxigeno hiperbarico; inmunoglobulina intravenosa; clabribina; anticuerpos para o antagonistas de otras citoquinas u otros factores de crecimiento humanos, como por ejemplo TNF, LF, 1L-1, 1L-2, 1L-6, 1L-7, 1L-8, 1L-15, 1L-16, IL-18, EMAP-11, GM-CSF, FGF y P0GF. Los anticuerpos o fragmentos que se unen a la 1L-1 pueden ser combinados con anticuerpos para moleculas de la superficie celular tales como C02, C03, C04, C08, C025, C028, C030, C040, C045, C069, C080, C086, C090 o sus ligandos,. Los anticuerpos o fragmentos que se unen a la IL-1� pueden ser combinados con agentes tales como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetil, leflunomida, NSA10s, como por ejemplo ibuprofeno, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitromboticos, inhibidores del complemento, agentes adrenergicos, agentes que interfieren en la sefalizacion de las citoquinas proinflamatorias tales como TNFa o 1L -1 (como p. ej. inhibidores de 1RAK, N1K, 1KK, p38 o quinasa MAP), inhibidores de la enzima convertidora de 1L-1� (como p. ej. Vx740), anti-P7s, ligando glicoproteina p-selectina (PSGL), inhibidores de TACE, inhibidores de la sefalizacion de celulas T tales como inhibidores de quinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalacina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina, receptores de citoquina solubles y derivados de los mismos (como p. ej. receptores p55 o p75 TNF solubles, s1L-1 R1, s1L-1 R11, s1L-6R, receptor 1L-13 soluble (sIL-13)) y citoquinas antiinflamatorias (como p. ej. 1L-4, 1L-10, 1L-13 y TGF�).
[0211] Los ejemplos preferidos de agentes activos para esclerosis multiple en los cuales los anticuerpos o fragmentos que se unen a la IL-1 pueden ser combinados incluyen a los miembros del grupo que consta de interferón -�, como por ejemplo 1FN�1a e 1FN�1b; copaxona, corticosteroides, inhibidores de 1L-1, inhibidores TNF y anticuerpos para ligando C040 y C080.
[0212] Las composiciones farmaceuticas pueden incluir una cantidad terapeuticamente eficaz o una cantidad profilácticamente eficaz de los presentes anticuerpos o fragmentos que se unen a la IL-1�. La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que con las dosificaciones y por espacio de los periodos de tiempo necesarios es eficaz para lograr el resultado terapeutico deseado. Una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo
o de la parte de anticuerpo puede variar segun factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo y la capacidad del anticuerpo o de la parte del anticuerpo para provocar la respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapeuticamente eficaz es tambien una cantidad con la cual los efectos terapeuticamente beneficiosos pesan mas que cualesquiera efectos toxicos o perjudiciales del anticuerpo o de la parte del anticuerpo. La expresion "cantidad profilacticamente eficaz" se refiere a una cantidad que con las dosificaciones y por espacio de los periodos de tiempo necesarios es eficaz para lograr el resultado profilactico deseado. Tipicamente, puesto que una dosis profilactica se usa en los sujetos antes de una fase de enfermedad o en una fase inicial de enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz sera menor que la cantidad terapeuticamente eficaz.
[0213] Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, acidos nucleicos o vectores de la invencion que se unen a la 1L-1� pueden ser empleados en solitario o en combinacion con otros agentes activos, que pueden estar en la misma composicion farmaceutica o en una distinta composicion farmaceutica. Por ejemplo, tales otros agentes activos pueden comprender (I) un antagonista de IL-1 (como p. ej. 1L-1Ra recombinante o una trampa de 1L), (11) un antagonista de receptor de interleuquina-1, (111) un receptor de TNF soluble, (1V) un receptor 2 de TNF soluble (como p. ej. etanercept), (1V) inhibidor de TNF (como p. ej. un anticuerpo tal como 02E7), y/o (V) un agente de terapia del cancer. Asi por ejemplo, uno o varios de estos componentes pueden incluirse en la composicion de la invencion con un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invencion que se une a la 1L-1�.
[0214] Puede ser deseable en algunos casos usar una composicion farmaceutica que comprenda un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invencion que se una a la 1L-1� de una manera ex vivo. En este caso, celulas, tejidos u organos que han sido retirados de un paciente son expuestos a composiciones farmaceuticas que comprenden un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invencion que se une a la 1L-1 �, despues de lo cual las celulas, los tejidos y/o los organos le son posteriormente reimplantados al paciente.
[0215] En ciertas situaciones, una composicion que comprenda un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, acido nucleico
o vector que se una a la IL-1 puede ser aportada implantandoles a los pacientes celulas que hayan sido manipuladas geneticamente como aqui se describe para expresar y secretar los polipeptidos, agentes de union selectiva, fragmentos, variantes o derivados. Tales celulas pueden ser celulas animales o humanas, y pueden derivarse del propio tejido del
paciente o de otra fuente ya sea humana o bien no humana. Opcionalmente, las celulas pueden ser celulas inmortalizadas. Sin embargo, a fin de reducir la probabilidad de una respuesta inmunologica, se prefiere que las celulas sean encapsuladas para evitar la infiltracion de los tejidos circundantes. Los materiales de encapsulación son tipicamente membranas o encerramientos polimericos semipermeables biocompatibles que permiten la liberacion del (de los) producto(s) proteico(s) pero impiden la destruccion de las celulas por parte del sistema inmune del paciente o de otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.
[0216] Son conocidos metodos que se usan para la encapsulacion de celulas en membranas, y la preparacion de celulas encapsuladas y su implantacion en pacientes han sido descritas, por ejemplo, en las Patentes U.S. 4.892.538,
5.011.472 y 5.106.627. En la Publicacion de Solicitud WO 91/10425 al amparo de PCT se describe un sistema para encapsular celulas vivientes. Estan descritas y son tambien conocidas para los expertos en la materia tecnicas para hacer los de una variedad de otros medios de aporte sostenido o controlado, tales como soportes liposomicos, particulas bioerosionables o perlas. Las celulas, con o sin encapsulacion, pueden ser implantadas en los adecuados tejidos corporales u organos del paciente.
[0217] Una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de una composicion farmaceutica que comprenda un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invencion que se una a la 1L-1� dependera, por ejemplo, de los objetivos terapeuticos tales como la indicacion para la cual se use la composicion, la ruta de administracion y la condicion del sujeto. Las composiciones farmaceuticas se administran en una cantidad terapeutica o profilácticamente eficaz para tratar una condición relacionada con las IL-1. Una "cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz" de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invencion que se une a la 1L-1 es aquella cantidad que puede tratar o prevenir uno o varios sintomas de una enfermedad relacionada con las IL-1 en su sujeto.
[0218] En consecuencia, puede ser deseable valorar la dosificacion del anticuerpo, fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invención que se une a la IL-1 y modificar la ruta de administracigun se requiera para
ón se obtener el efecto terapeutico optimo. Las gamas de dosificaciones incluyen a la que va desde aproximadamente 0,1 ng/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o mas (en terminos de la cantidad de agente activo por unidad de peso corporal del sujeto a quien se le administre el agente activo), en dependencia de los factores que se han mencionado anteriormente. En otras realizaciones, la dosificacion va desde aproximadamente 0,1 1g/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg, desde aproximadamente 1 1g/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg, desde aproximadamente 5 1g/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg, desde aproximadamente 0,5 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg, o desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg. Pueden ser apropiadas otras dosificaciones. La composicion puede ser administrada como dosis unica, o como dos o mas dosis (que pueden contener o pueden no contener la misma cantidad de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invencion que se fije a la 1L-1�) a lo largo del tiempo, o como infusi
on continua mediante dispositivo de implantacion o cateter, por ejemplo.
[0219] Métodos de Uso
[0220] Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, acidos nucleicos, vectores, celulas y composiciones de la invencion (denominados colectivamente "los compuestos y composiciones de la invencion") pueden ser usados con cualquier finalidad. Por ejemplo, los compuestos y composiciones de la invencion pueden ser usados para investigar mecanismos relacionados con las IL-1, asi como las enfermedades y condiciones asociadas a mecanismos relacionados con las IL-1. Sin embargo, los compuestos y composiciones de la invencion son especialmente utiles para tratar a un sujeto (como p. ej. un mamifero o un humano) que tenga necesidad de tratamiento para una condición relacionada con las IL-1, como p. ej. un trastorno o enfermedad autoinmune o inflamatorio(a). En consecuencia, en el contexto de la invencion se describe un metodo para tratar o prevenir una enfermedad en un mamifero, comprendiendo dicho metodo el paso de administrarle a un mamifero que tenga necesidad de ello una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invencion, con lo cual se trata o previene la enfermedad en el mamifero. La expresión "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de anticuerpo o fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invencion que es necesaria para establecer un efecto profilactico o terapeutico. En el sentido que se le da en la presente, el concepto de tratar una enfermedad o condición está definido como la acción de reducir temporal o permanentemente o eliminar los sintomas o la progresion de una enfermedad o condicion. Analogamente, el concepto de prevenir una enfermedad o condición significa inhibir, enlentecer o prevenir temporal o permanentemente el inicio de una enfermedad o condicion (o los sintomas de una enfermedad o condicion).
[0221] El metodo que se describe en el contexto de la invencion puede ser usado para tratar o prevenir cualquier enfermedad o condición relacionada con las IL-1. Por ejemplo, se contempla el uso de los presentes anticuerpos y fragmentos en la profilaxis y en el tratamiento de enfermedades o condiciones medicas mediadas por 1L-1, como p. ej. condiciones inflamatorias, alergias y condiciones alergicas, canceres, reacciones de hipersensibilidad, enfermedades autoinmunes, infecciones severas y rechazo al trasplante de organos o tejidos. Las condiciones relacionadas con las 1L1 incluyen a los miembros del grupo que consta de artritis reumatoidea (RA), osteoartritis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa (UC), shock septico, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COP0), asma, enfermedad de injerto versus huesped, aterosclerosis, leucemia de las celulas T del adulto, mieloma multiple, esclerosis multiple, crisis fulminante y enfermedad de Alzheimer. Los presentes anticuerpos y fragmentos pueden tambien ser usados para tratar o prevenir el Trastorno 1nflamatorio Multisistemico de 1nicio Neonatal (NOM10/C1NCA), la artritis idiopatica juvenil de inicio sistemico, la enfermedad de Stills, el CAPS o el sindrome de Muckle-Wells.
[0222] En general, una enfermedad o condicion puede ser considerada como una enfermedad o condicion relacionada con la IL-1 si la misma va asociada a elevados niveles de 1L-1 elulas o tejidos
en tejido o fluidos corporales o si csacados del cuerpo producen elevados niveles de IL-1� en cultivo.
[0223] Por ejemplo, los metodos que se describen en el contexto de la invención pueden ser usados para tratar o prevenir el Trastorno 1nflamatorio Multisistemico de 1nicio Neonatal (NOM10/C1NCA), la artritis idiopatica juvenil de inicio sistemico, los Sindromes Periodicos Asociados a C1AS1 (CAPS), la enfermedad de Stills o el sindrome de Muckle-Wells.
[0224] Como otro ejemplo, los presentes metodos pueden ser usados para tratar o prevenir la artritis reumatoidea, la osteoartritis, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, el shock septico, la enfermedad pulmonar obstructiva cronica, el asma, la enfermedad de injerto versus huesped, la aterosclerosis, la leucemia de las celulas T del adulto, el mieloma multiple, la esclerosis multiple, la crisis fulminante o la enfermedad de Alzheimer.
[0225] Como aun otro ejemplo, los presentes metodos pueden ser usados para tratar o prevenir la artritis idiopatica juvenil de inicio sistemico, la artritis reumatoidea, la osteoartritis, la aterosclerosis o la miastenia gravis.
[0226] Otros ejemplos de condiciones relacionadas con la IL-1� son la pancreatitis aguda; el ALS; la caquexia/anorexia, incluyendo la caquexia inducida por el S10A; el asma y otras enfermedades pulmonares; la vasculitis autoinmune; los Sindromes Periodicos Asociados a C1AS1 (CAPS); el sindrome de fatiga crónica; las enfermedades asociadas a Clostridium, incluyendo la diarrea asociada a Clostridium; las indicaciones y las condiciones coronarias, incluyendo el fallo cardiaco congestivo, la reestenosis coronaria, el infarto de miocardio, la disfuncion miocardica (p. ej. relacionada con sepsis) y el injerto de bypass de arteria coronaria; canceres tales como el mieloma multiple y las leucemias mielogenas (como p. ej. AML y CML) y otras, asi como la metastasis tumoral; la diabetes (como p. ej. la diabetes insulinica); la endometriosis; el Sindrome Autoinflamatorio Familiar por Frio (FCAS); la fiebre mediterranea familiar (FMF); la fiebre; la fibromialgia; la glomerulonefritis; la enfermedad de injerto versus huesped/rechazo de trasplante; el shock hemorragico; la hiperalgesia; la enfermedad intestinal inflamatoria; las condiciones inflamatorias de una articulacion, incluyendo la artritis psoriatica (asi como la osteoartritis y la artritis reumatoidea); la enfermedad ocular inflamatoria como la que puede ir asociada a trasplante corneal, por ejemplo; la isquemia, incluyendo la isquemia cerebral (como p. ej. una lesion cerebral como resultado de trauma, epilepsia, hemorragia o crisis fulminante, cada uno de los cuales puede conducir neurodegeneración); la enfermedad de Kawasaki; el deterioro del aprendizaje; las enfermedades pulmonares (como p. ej. el AR0S); las miopatias (como p. ej. el metabolismo de la proteina muscular, especialmente en sepsis); la neurotoxicidad (p. ej. la inducida por H1V); la osteoporosis; el dolor, incluyendo al dolor relacionado con el cancer; la enfermedad de Parkinson; la enfermedad periodontal; el parto pretermino; la psoriasis; la lesión de reperfusión; los efectos secundarios de la terapia con radiación; la perturbación del sueño; la enfermedad de la articulacion mandibular temporal; el sindrome de fiebre periodica asociada al receptor del factor de necrosis tumoral (TRAPS); la uveitis; o una condicion inflamatoria resultante de esguince, distension, dafo de un cartilago, trauma, cirugia ortopedica, infeccion u otros procesos de enfermedad.
[0227] Tambien se contempla el uso de los presentes anticuerpos y fragmentos en el tratamiento de receptores de trasplantes de corazon, pulmon, corazon y pulmon en combinacion, higado, rifon, pancreaticos, de piel o corneales, incluyendo el rechazo de un aloinjerto o el rechazo de un xenoinjerto, o para la prevencion de la enfermedad de injerto versus huesped, tal como a continuacion de un trasplante de medula osea, o la arterioesclerosis asociada a un trasplante de organo.
[0228] Se contempla el uso de los presentes anticuerpos y fragmentos en el tratamiento o la prevención de la enfermedad autoinmune o de las condiciones inflamatorias, y en particular de las condiciones inflamatorias con una etiologia que incluye un componente autoinmune tal como artritis (como por ejemplo la artritis reumatoidea, la artritis cronica progrediente y la artritis y las enfermedades reumaticas, incluyendo las condiciones inflamatorias y las enfermedades reumáticas que suponen perdida de hueso, el dolor inflamatorio, la hipersensibilidad (incluyendo tanto la hipersensibilidad de las vias aereas como la hipersensibilidad dermica) o las alergias. Las enfermedades autoinmunes especificas para las cuales pueden emplearse los presentes anticuerpos y fragmentos incluyen a los trastornos hematologicos autoinmunes (incluyendo p. ej. la anemia hemolitica, la anemia aplasica, la anemia de celulas rojas puras y la trombocitopenia idiopatica), el lupus eritematoso sistemico, la policondritis, el esclerodoma, la granulomatosis de Wegener, la hepatitis activa cronica, la miastenia gravis, la psoriasis, el sindrome de Steven-Johnson, la esprue idiopatica, la enfermedad intestinal inflamatoria autoinmune (incluyendo p. ej. la colitis ulcerosa, la enfermedad de Crohn y el Sindrome del 1ntestino 1rritable), la enfermedad endocrina de Graves, la sarcoidosis, la esclerosis multiple, la cirrosis biliar primaria, la diabetes juvenil (la diabetes mellitus tipo 1), la uveitis (anterior y posterior), la queratoconjuntivitis sicca y la queratoconjuntivitis vernal, la fibrosis pulmonar intersticial, la artritis psoriatica o la glomerulonefritis (con y sin sindrome nefrotico, p. ej. incluyendo el sindrome nefrotico idiopatico o la nefropatia de cambio minimo).
[0229] Tambien se contempla el uso de los presentes anticuerpos y fragmentos en el tratamiento, la prevencion o el mejoramiento del asma, de la bronquitis, de la neumoconiosis, del enfisema pulmonar y de otras enfermedades obstructivas o inflamatorias de las vias aereas. Los anticuerpos o fragmentos para tratar indeseables reacciones inflamatorias agudas e hiperagudas que son mediadas por IL-1 pueden ser usados para tratar estados que suponen la producción especialmente o la promoción de la liberación de TNF por 1L-1, como p. ej. infecciones agudas, como por ejemplo el shock septico (como p. ej. el shock endotoxico y el sindrome de distres respiratorio del adulto), la meningitis, la neumonia y las quemaduras severas; y para el tratamiento de la caquexia o sindrome de consuncion asociado a liberacion morbida de TNF, consiguiente a infeccion, cancer o disfuncion organica, y especialmente caquexia asociada al S10A, p. ej. asociada o consiguiente a infeccion por H1V.
[0230] Tambien se contempla el uso de los presentes anticuerpos y fragmentos para tratar enfermedades del metabolismo oseo incluyendo la osteoartritis, la osteoporosis y otras artritis inflamatorias y la perdida osea en general, incluyendo la perdida osea relacionada con la edad, y en particular la enfermedad periodontal.
[0231] Tambien se contempla el uso de los presentes anticuerpos y fragmentos en el tratamiento o la prevencion de Sindromes Periodicos Asociados a C1AS1 (CAPS), incluyendo a cada uno de los miembros del grupo que consta del Trastorno 1nflamatorio Multisistemico de 1nicio Neonatal (NOM10), Sindrome de Muckle-Wells (MWS) y Sindrome Autoinflamatorio Familiar por Frio (FCAS). (Hoffman et al. 2001 Naure 29:301-305; Feldmann et al. 2002 Am J Hum Genet 71:198-203; Aksentijevich et al. 2002 Arthritis Rheum 46:3340-3348). En conjunto, estas condiciones son conocidas como "CAPS". El C1AS1 codifica una proteina llamada NALP3 que es un componente del "inflamasoma", que es un complejo enzimatico subcelular que regula la actividad de caspasa 1. La caspasa 1 es la enzima que corta la proforma inactiva de la citoquina proinflamatoria IL-1 transformandola en su forma biologicamente activa (Agostini et al. 2004 supra). Las mutaciones en el C1AS1 conducen a una incrementada produccion de 1L-1.
[0232] El anticuerpo o fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invencion es tipicamente administrado al mamifero o humano en forma de una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invencion y un soporte farmaceuticamente aceptable. Las composiciones farmaceuticas que son adecuadas para ser usadas en conjuncion con el metodo para tratar o prevenir una enfermedad son como se ha descrito aqui anteriormente.
[0233] El anticuerpo o fragmento de anticuerpo, acido nucleico o vector de la invencion puede ser administrado al mamifero en calidad de unico agente activo, o en conjuncion con uno u otros varios agentes que perturben la señalización de los receptores de IL-1. Un agente que perturbe la señalización de los receptores de IL-1 puede ser cualquier compuesto o composición que inhiba una interacción entre la IL-1 y el receptor de 1L-1. Por ejemplo, los agentes que perturban la señalización de los receptores de IL-1 incluyen a anticuerpos que se unen a la IL-1� o al receptor de IL-1, 1L-1Ra recombinante (p. ej. de Amgen 1nc., Thousand Oaks, CA), y peptidos "trampa" de receptor de IL-1 (p. ej. de Regeneron 1nc., Tarrytown, NY). Cuando se usen dos o mas agentes que perturben la sefalizacion de los receptores de IL-1, los mismos podran ser administrados juntamente (p. ej. en una unica composicion farmaceutica), o bien pueden ser administrados por separado (p. ej. en composiciones farmaceuticas independientes).
[0234] El anticuerpo, fragmento, acido nucleico o vector de la invencion puede ser administrado a un mamifero en combinacion o en conjuncion con uno u otros varios agentes activos para tratar o prevenir enfermedades o condiciones mediadas por IL-1 como las expuestas anteriormente.
[0235] Usos Diagnósticos
[0236] Además de los usos terapeuticos, los presentes anticuerpos y fragmentos pueden ser usados en metodos diagnósticos para detectar IL-1� (por ejemplo en una ogica tal como suero o plasma), usando
muestra biolun inmunoensayo convencional tal como inmunoanalisis ligados a enzimas (EL1SA), un radioinmunoensayo (R1A) o inmunohistoquimica tisular. Un metodo para detectar 1L-1� en una muestra biológica puede comprender los pasos de poner a la muestra biológica en contacto con uno o varios de los presentes anticuerpos o fragmentos y detectar ya sea el anticuerpo o fragmento unido a la IL-1 o el anticuerpo o fragmento no unido, para con ello detectar la 1L-1� en la muestra biologica. El anticuerpo o fragmento puede ser directa o indirectamente etiquetado con una sustancia detectable para facilitar la deteccion del anticuerpo unido o no unido. Las adecuadas sustancias detectables incluyen a varias enzimas, grupos prosteticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen a los miembros del grupo que consta de peroxidasa de rabano, fosfatasa alcalina, �- galactosidasa o acetilcolinesterasa; y los ejemplos de adecuados complejos de grupos prosteticos incluyen a los miembros del grupo que consta de estreptavidina/biotina y avidina/biotina; y los ejemplos de adecuados materiales fluorescentes incluyen a los miembros del grupo que consta de umbeliferona, fluoresceina, fluoresceina isotiocianato, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; y un ejemplo de un material luminiscente incluye al luminol; y los ejemplos de adecuado material radiactivo incluyen a los miembros del grupo que consta de 1251,1311, 35S o 3H.
[0237] En lugar de etiquetar el anticuerpo, el analisis de 1L-1� en fluidos biológicos puede efectuarse mediante un inmunoensayo de competición utilizando patrones de IL-1 etiquetados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-IL-1 no etiquetado. En este ensayo se combinan la muestra biologica, los patrones de 1L-1 etiquetados y el anticuerpo anti-IL-1� y se determina la cantidad de patr-1�
ón de IL etiquetado unida al anticuerpo no etiquetado. La cantidad de IL-1� en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de patrón de IL-1� etiquetado unido al anticuerpo anti-IL-1�.
Ejemplos
[0238] Los ejemplos siguientes ilustran adicionalmente la invencion.
[0239] En los Ejemplos siguientes se hace referencia a varios anticuerpos entre los que se incluyen los anticuerpos denominados AB1, AB5 y AB7. Como se ha mencionado anteriormente, el AB1 comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 4 y una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9. El AB5 comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 8 y una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de la 10 SEC N°: 9. El AB7 comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 15 y una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 11.
[0240] Para varias comparaciones en los Ejemplos siguientes, se hace referencia a un anticuerpo denominado ABcontrol, que es un anticuerpo que esta disponible comercialmente y tiene una relativamente alta afinidad para la 1L-1� . El AB-control es un anticuerpo murino del que se cree que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de la 10 SEC N°: 40 y una cadena liviana que comprende la secuencia de la 10 SEC N°: 41. Estas secuencias murinas estan expuestas en la Publicacion de Solicitud de Patente U.S. N° 2003/0026806, en las Figuras 6A y 6B.
[0241] En varios de los Ejemplos que se dan a continuacion se demuestra que el AB5 y el AB7 tienen una afinidad inesperadamente más alta para la IL-1� humana que el AB-control.
Ejemplo 1
[0242] Este ejemplo ilustra las afinidades de union de ciertos anticuerpos de los que se describen en el contexto de la invención a la IL-1�.
[0243] Los anticuerpos denominados AB1 y AB5 fueron sometidos a ensayo para determinar sus propiedades de union a la IL-1 usando un dispositivo K1NEXAMF (de la Sapidyne 1nstruments 1nc., Boise, 10). Se presentan en las Figs. 2 y 3 las secuencias de aminoacidos de las regiones variables de cadena pesada y liviana de los anticuerpos AB1 y AB5. Fue sometido a ensayo a efectos comparativos un anticuerpo que está disponible comercialmente y tiene una relativamente alta afinidad para la IL-1� (denominado aqui AB-control).
[0244] Estan resumidos en la Tabla 1, los resultados de los ensayos de union a la 1L-1 �. Los valores K0 representan las constantes de disociación de la unión para los respectivos complejos anticuerpo-IL-1 . La K0 fue calculada como la relacion del "porcentaje de moleculas disociadas" (porcentaje de disociacion para el complejo anticuerpo-IL-1 �) al "porcentaje de moleculas asociadas" (porcentaje de asociacion para el complejo anticuerpo-IL-1 �). Una K0 mas baja es indicativa de una mas alta afinidad del anticuerpo.
Tabla 1: Resultados de Union a la 1L-1�
Anticuerpo
K0 (pM)
AB-control
3,06
AB1
18,63
AB5
0,261
[0245] Los resultados de estos experimentos demuestran que el AB1 y el AB5 se unen con alta afinidad a la 1L-1�. Las afinidades de los anticuerpos de la invención para IL-1 son equiparables a la afinidad de union del AB -control para la IL-1� o mejores que la misma.
Ejemplo 2
[0246] Este ejemplo ilustra la inhibicion in vitro de la IL-1 usando los anticuerpos que se describen en el contexto de la invencion.
[0247] Las potencias inhibitorias de los anticuerpos AB! y AB5 para la 1L-1� (vease el Ejemplo 1) fueron evaluadas usando un bioensayo que mide la liberación estimulada por IL-1 de 1L-6 desde fibroblastos humanos. Como en el Ejemplo 1, se uso como muestra comparativa a AB-control. Los detalles del ensayo estan descritos en 0inarello et al.,
Current Protocols in 1mmunobiogy, Ch 6.2.1-6.2.7, John Wiley and Sons 1nc., Hoboken, NJ, 2000. 0icho brevemente, fibroblastos MRC5 humanos de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC) de Manassas, VA (N° CCL-171 de la ATCC) fueron cultivados hasta la confluencia en placas multipocillos. Las celulas fueron tratadas con dosis titradas de anticuerpo AB5. Las celulas fueron a continuacion puestas en contacto con (1) 100 pg/ml de 1L-1� o (11) 100 pg/ml de 1L1� y anticuerpo AB1 o AB5 (del Ejemplo 1). Las celulas de control negativo no fueron estimuladas con 1L -1 �. Las cantidades de IL-6 liberada en cada grupo de celulas tratadas fueron medidas usando un kit 1L-6 EL1SA de la B0 Pharmingen (Franklin Lakes, NJ) segun las instrucciones del fabricante. Los resultados de los analisis EL1SA estan representados en la Fig. 5 y resumidos en la Tabla 2. La 1C50 es la concentración de anticuerpo requerida para inhibir el 50% de la IL-6 liberada por la estimulacion con 1L-1�.
Tabla 2: Resultados de EL1SA
Anticuerpo
1C50 (pM)
AB-control
0,017
AB1
0,15
AB5
0,014
[0248] Estos resultados demuestran la potencia in vitro de los anticuerpos para inhibir la IL-1 . Además se ha demostrado que la inhibición de la liberación de citoquina estimulada por IL-1� en MRC 5 guarda correlación con la capacidad del agente para inhibir la actividad mediada por IL-1 in vivo. Asi, estos resultados indican que los anticuerpos tendrán eficacia inhibitoria de la IL-1� in vivo.
Ejemplo 3
[0249] Este ejemplo ilustra la inhibicion in vivo de IL-1 usando anticuerpos como los que se describen en el contexto de la invencion.
[0250] Para confirmar la eficacia in vivo del anticuerpo AB5, su capacidad para bloquear la actividad biologica de la 1L1� humana fue sometida a ensayo en ratones. Los detalles del ensayo se describen en Economides et al., Nature Med.,
9: 47-52 (2003). 0icho brevemente, a ratones C57/B16 macho (Jackson Laboratory Bar Harbor, Maine) les fueron inyectadas intraperitonealmente dosis titradas de AB5 (Ejemplo 1), AB-control (Ejemplo 1) o 1gG de control (Jackson 1mmunoRessearch Laboratories, West Grove, PA). Veinticuatro horas despues de la inyeccion de los anticuerpos les fue inyectada a los ratones por via subcutanea 1L-1� humana recombinante (rh1L-1�) (de la PeproTech 1nc., Rocky Hill, NJ) a razón de una dosis de 1 1g/ kg. A las dos horas postinyección de rhIL -1� (tiempo para la respuesta máxima de IL-6) los ratones fueron sacrificados y la sangre fue recogida y procesada para la obtencion del suero. Los niveles de 1L-6 en suero fueron analizados mediante EL1SA (B0 Pharmingen, Franklin Lakes, NJ) segun el protocolo del fabricante. La inhibición porcentual fue calculada a partir de la relación de IL-6 detectada en el suero de los animales experimentales a la IL-6 detectada en el control (multiplicada por 100).
[0251] Los resultados se exponen en la Fig. 6. La capacidad para inhibir la actividad in vivo de la IL-1 es evaluada en función de los niveles de IL-6 por estimulacion con 1L-1 en suero. Como se ilustra en la Fig. 6, el anticuerpo AB5 fue tan eficaz como, sino mas eficaz que el AB-control para inhibir la actividad in vivo de la IL-1� humana. 3 1g de AB5 fueron en este ensayo tan eficaces como 10 1g de AB-control.
[0252] Asi, los resultados indican que los anticuerpos sometidos a ensayo son utiles para la inhibicion de la actividad de IL-1� in vivo. Estos resultados tambien demuestran que una unica inyeccion de AB5 puede bloquear la accion sistemica frente a la estimulación con IL-1� a lo largo de un prolongado periodo de tiempo.
Ejemplo 4
[0253] El ejemplo siguiente ilustra la preparacion de un anticuerpo como los que se describen en el contexto de la invencion.
[0254] Fueron generadas las de una serie de secuencias de anticuerpos manipulados para no presentar inmunogenicidad en los humanos usando la tecnologia HUMAN ENG1NEERNGMF como se describe en Studnicka et al., Protein Engineering, 7: 805-814 (1994) y en las Patentes U.S. 5.766.886, 5.770.196, 5.821.123 y 5.869.619 y en la Publicacion de Solicitud WO 93/11794 al amparo del PCT. Las secuencias de anticuerpos manipulados para no presentar inmunogenicidad en los humanos que fueron generadas incluyen las denominadas AB5.1, AB5.2, AB5.3 y AB5.4. Como se muestra en las Figs. 3 y 4, cada una de estas secuencias comprende dos posiciones variables en la region C0R-3H que están indicadas con X1 y X2. Asi, en ciertos ejemplos de cada uno de estos anticuerpos manipulados para no presentar inmunogenicidad en los humanos, X1 y X2 de la region C0R3 corresponden a alanina y arginina, valina y arginina, fenilalanina y arginina, lisina y lisina o asparagina y arginina, respectivamente.
Ejemplo 5
[0255] Los anticuerpos denominados ABR5 y AB7 (una secuencia de anticuerpo manipulado para no presentar
inmunogenicidad en los humanos) fueron sometidos a ensayo para determinar sus propiedades de unión a la IL-1 usando un ensayo cinetico de exclusion llevado a cabo en un dispositivo K1NEXAMF de una manera como la que se describe en el Ejemplo 1. Una adicional descripcion acerca de los dispositivos K1NEXAMF y su funcionamiento para la caracterización de anticuerpos puede ser obtenida del fabricante y puede encontrarse en la literatura publicada, y por ejemplo en la Patente U.S. N° 6.664.114 (Sapidyne, 1nc.) y en 0arling et al., "Kinetic Exclusion Assay Technology: Characterization of Molecular 1nteractions" ASSAY and 0rug 0evelopment Technologies, 2004, 2, 647-657. El dispositivo K1NEXAMF realiza un ensayo cinetico de exclusion y ajusta los datos a varias curvas teoricas y asi determina la K0 asi como otras propiedades tales como los intervalos de confianza del 95% para K0. El dispositivo K1NEXAMF es en general mas sensible que otros dispositivos (como p. ej. un dispositivo BiaCore) para el analisis de caracteristicas de afinidad tales como las constantes de disociacion y los porcentajes de moleculas disociadas.
[0256] Se presentan en las Figs. 3 y 4A respectivamente las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y liviana del AB5 y del AB7. Estan resumidos en la Tabla 3 los resultados de los ensayos de union a la IL-1�. Como en el Ejemplo 1, la K0 fue calculada como la relacion del "porcentaje de moleculas disociadas" al "porcentaje de moleculas asociadas", y una K0 mas baja es indicativa de una mas alta afinidad del anticuerpo.
Tabla 3
Anticuerpo
K0 (pM)
AB5
0,24
AB7
0,30
[0257] Los resultados de estos experimentos demuestran que el AB5 (en consonancia con los resultados observados en el Ejemplo 1) y el AB7 se unen a la 1L-1� con inesperadamente alta afinidad, lo cual est
á representado por los inesperadamente bajos valores de sus constantes de disociacion.
[0258] Las Figs. 7, 8 y 9 muestran las afinidades de union de los anticuerpos denominados AB1, AB5 y AB7, respectivamente, segun determinacion efectuada a partir de un experimento representativo para cada uno usando el analisis K1NEXA. La Fig. 7 refleja los resultados que se han expuesto en la Tabla 1, mientras que las Figs. 8 y 9 reflejan los resultados que se exponen en la Tabla 3.
[0259] Ademas de los valores que se exponen en la Tabla 3, los resultados de los ensayos K1NEXA tambien indican los intervalos de confianza del 95% bajos y altos (K0 baja y K0 alta). Para AB5, la K0 baja era 0,07pM, y la K0 alta era 0,72pM. Para el AB7, la K0 baja era 0,11pM, y la K0 alta era 0,74pM. [0260] Fueron hallados similares valores de K0 baja y de K0 alta en el ensayo que se expone en el Ejemplo 1. Para el AB-control, la K0 baja era 1,62pM, y la K0 alta era 5,23pM. Para AB1, la K0 baja era 13,38pM, y la K0 alta era 24,84pM. Para Ab5, la K0 baja era 0,11pM, y la K0 alta era 0,56pM.
[0261] Los resultados de los ensayos K1NEXA indican que los anticuerpos AB5 y AB7 tenian una constante de disociacion inesperadamente mas baja que la del AB-control.
Ejemplo 6
[0262] Este ejemplo ilustra la inhibicion in vitro de la liberación de IL-6 estimulada por 1L-1�. Fue analizada para varios anticuerpos de la presente invencion como se indica a continuacion la 1C50 para inhibir la liberación de IL-6 desde fibroblastos humanos estimulada por IL-1�.
[0263] La potencia inhibitoria de IL-1 de los anticuerpos AB5 y AB7 fue evaluada de una manera como la que se describe en el Ejemplo 2, usando un bioensayo que mide la liberacion de 1L-6 desde fibroblastos humanos estimulada por IL-1 �. Las Figs. 10-12 muestran las curvas de union para ensayos individuales efectuados con varios anticuerpos. La Fig. 10 muestra la inhibicion de la liberación de IL-6 desde fibroblastos humanos producida por los anticuerpos denominados AB1, AB2 y AB3, y los resultados de estos tres ensayos individuales indicaron que el AB1 tenia una 1C50 de 0,029nM (29pM), el AB2 tenia una 1C50 de 0,76nM (76pM), y el AB3 tenia una 1C50 de 0,214nM (214pM). La Fig. 11 muestra la inhibición de la liberación de IL-6 desde fibroblastos humanos producida por los anticuerpos denominados AB1 y AB7 en un ensayo adicional. La Fig. 12 muestra la inhibicion de la liberacion de IL-6 desde fibroblastos humanos producida por los anticuerpos AB5 y AB7, asi como por el Kinerett que esta disponible comercialmente. Los resultados indicaron que el AB5 y el AB7 tenian con respecto a la 1L-1 inhibitoria una potencia considerablemente mejor que la del Kinerett, sobre la base de las determinaciones de la 1C50 en los ensayos. El producto llamado Kinerett es una proteina hecha por el hombre que es similar a una proteina que se da de manera natural y se llama antagonista del receptor de interleuquina-1 (IL-1ra) y se encuentra en el cuerpo. Las Figs. 10-12 muestran resultados de ensayos individuales para la potencia de los anticuerpos o del Kinerett en terminos de la inhibicion porcentual de la 1L-6 sin el anticuerpo, y la Tabla 4 indica la IC50 calculada a partir de estos ensayos individuales. La 1C50 es la concentracion de anticuerpo o de Kinerett requerida para inhibir el 50% de la IL-6 liberada por estimulacion con 1L-1 �.
Tabla 4
Anticuerpo
1C50 (pM)
AB5
0,0049 (4,9pM)
AB7
0,0044 (4,4pM)
Kineret
0,0454 (45,4pM)
[0264] Ademas de los resultados de los ensayos individuales que se indican en las Tablas 2 y 4 y que se muestran en las Figuras 6, 10, 11 y 12, fueron llevados a cabo otros ensayos individuales para cada uno de los miembros del grupo que consta de AB1, AB7 y AB-control. A partir de los resultados de los ensayos individuales puede calcularse una 1C50 media. Fue calculada una 1C50 media para el AB1 de 66,7pM a partir de los resultados de los ensayos individuales de 35pM, 30pM, 150pM (este valor esta tambien indicado en la Tabla 2) y 52pM. Fue calculada una 1C50 media para el AB7 de 5,6pM a partir de los resultados de los ensayos individuales de 7,3pM, 4,2pM, 4,5pM, 4,4pM (este valor esta tambien indicado en la Tabla 4), 6,0pM, 5,0pM y 7,8pM. fue calculada una 1C50 media para AB-control de 8,9pM a partir de los resultados de los ensayos individuales de 5,0pM, 17,0pM (este valor esta tambien indicado en la Tabla 2) y 4,9pM.
[0265] Estos resultados demuestran la potencia in vitro de los anticuerpos AB1, AB5 y AB7 para inhibir la 1L-�. Además se ha demostrado que la inhibición de la liberación de citoquina estimulada por IL-1 en fibroblastos humanos está en correlación con la capacidad del agente inhibidor para inhibir la actividad mediada por IL-1 in vivo. Asi, estos resultados indican que los anticuerpos de la invención tendrán eficacia inhibitoria de la IL-1� in vivo.
Ejemplo 7
[0266] Este ejemplo ilustra la inhibicion in vivo de IL-1� usando anticuerpos que se unen a la 1L-1�.
[0267] La eficacia in vivo de los anticuerpos AB5, AB1 y AB7 y su capacidad para bloquear la actividad biologica de la IL-1� humana fueron sometidas a ensayo en ratones de una manera como la que se describe en el Ejemplo 3. Los resultados de los ensayos efectuados con AB5 y AB1 se exponen en la Fig. 13, y los resultados de los ensayos efectuados con AB5 y AB7 se exponen en la Fig. 14. La capacidad para inhibir la actividad in vivo de la IL-1 fue evaluada en función de los niveles de IL-6 en suero por estimulación con IL-1�. Como se ilustra en las Figs. 13 y 14, los anticuerpos AB1, AB5 y AB7 fueron eficaces para inhibir la actividad in vivo de la IL-1� humana.
[0268] Estos resultados indican que los anticuerpos sometidos a ensayo son utiles para la inhibicion de la actividad de IL-1� in vivo.
Ejemplo 8
[0269] Este Ejemplo ilustra que al menos algunos de los anticuerpos que se unen a la 1L-1� segun la presente invencion son capaces de experimentar reacción cruzada con IL-1� de algunos mamiferos distintos de los humanos y no son capaces de experimentar reacción cruzada con IL-1 de otros mamiferos no humanos. El anticuerpo denominado AB7 (un anticuerpo que se une a la IL-1� humana con alta afinidad) fue sometido a ensayo para determinar su unión a la IL 1� de mamiferos no humanos que eran concretamente el macaco rhesus, el mono cynomolgus, el perro, el cobayo y el conejo.
[0270] Fue obtenida de Charles River Labs. sangre entera heparinizada reciente de macaco rhesus, mono cynomolgus, perro, cobayo y conejo. La sangre entera fue separada por centrifugacion por gradiente de densidad Ficoll y fueron aisladas las celulas mononucleares de la sangre periferica (PBMC's). Para las PBMC de cada especie fueron incubadas 2,5 x 105 celulas/ml en medio RPM1 con y sin 50 ng/ml de Lipopolisacarido LPS (E. coli 055:B5), y los supernatantes fueron recogidos a las 24 horas post-estimulacion. El LPS esta destinado a estimular la produccion de 1L-1� por parte de las PBMC's. 2 ml de cada supernatante fueron incubados por espacio de 3 horas con 2 1g de AB7, efectu
ándose a continuación la adición de 50 1l de lechada de perlas de proteina A -Sefarosa para inmunoprecipitar el complejo AB7/1L
1�. Fue fadida a RPM1 1L -1� humana (Peprotech) y la i fue ascomo controles de
amisma usada inmunoprecipitacion/Western blot. Tras centrifugacion y lavado de las perlas de Proteina A-Sefarosa, todas las muestras fueron cargadas en un gel para S0S-PAGE y cicladas a 120 V por espacio de 1 hora. A continuacion de transferencia a membrana Immobilon-P a 22 V durante la noche y bloqueo con leche desnatada al 5%, el AB7 fue incubado a razon de 2 1g/ml con la membrana por espacio de 2 horas. Un anticuerpo 1gG anti-humana de cabra secundaria conjugado con peroxidasa de rabano (HRP) fue afadido a continuacion de pasos de lavado y la detección se hizo con solución de tetrametilbencidina (TMB) monocomponente.
[0271] Las Figs. 15 y 16 muestran los Western blots obtenidos a base de este procedimiento. En el lado izquierdo del blot que se muestra en la Fig. 15 (carriles 1-3) estan los controles en los cuales fueron afadidas a los medios RPM1 cantidades variables (5 ng, 10 ng y 20 ng) de 1L-1� humana. Cerca del fondo del blot pueden verse bandas en cada uno de los carriles en una región que corresponde a un peso molecular de aproximadamente 17 k0a. Estas bandas son indicativas de la union de AB7 a la 1L-1� humana. El carril central (carril 4) es el medio RPM1. En el lado derecho del blot que se muestra en la Fig. 15 (carriles 5-8) aparecen los resultados para las muestras de mono cynomolgus y macaco
rhesus. Los carriles 5 y 6 son las muestras de mono cynomolgus sin LPS y con 50 ng de LPS afadidos al medio RPM1, respectivamente. Los carriles 7 y 8 son las muestras de macaco rhesus sin LPS y con 50 ng de LPS afadidos al medio RPM1, respectivamente. Cerca del fondo del Western blot pueden verse bandas en los Carriles 6 y 8 (las muestras a las cuales les fue afadido LPS) en una region que corresponde a un peso molecular de aproximadamente 17 k0a. Estas bandas en los Carriles 6 y 8 son indicativas de reactividad cruzada del AB7 con la 1L-1 de primate, y concretamente con la IL-1� de mono cynomolgus y macaco rhesus.
[0272] La Fig. 16 muestra Western blots para controles y muestras de PBMC's de perro, cobayos y conejos. En el lado izquierdo de los blots que se muestran en la Fig. 16 (carriles 1-4) están los controles en los cuales fueron añadidas a los medios RPM1 cantidades variables (5 ng, 10 ng, 50 ng y 200 ng) de 1L-1 humana. Cerca del fondo del blot pueden verse bandas en cada uno de los carriles en una region que corresponde a un peso molecular de aproximadamente 17 k0a. Estas bandas son indicativas de la union de AB7 a la 1L-1� humana. El carril 5 en la Fig. 15 es el medio RPM1. Los carriles 6-8 son los resultados para las muestras de PBMC's de perro sin LPS y con 50 ng de LPS y 200 ng de LPS, respectivamente. Los carriles 9 y 10 son los resultados para las muestras de PBMC's de cobayo, sin LPS y con 50 ng de PLS, respectivamente. Los carriles 11 y 12 son los resultados para las muestras de PBMC's de conejo sin LPS y con 50 ng, respectivamente. Cerca del fondo del Western blot pueden verse bandas en los Carriles 7, 8 y 12 (las muestras de perro y conejo a las cuales les fue afadido LPS) en una region que corresponde a un peso molecular de aproximadamente 17 k0a. Estas bandas en los Carriles 7, 8 y 12 son indicativas de reactividad cruzada de AB7 con 1L1� de perro y con 1L-1� de conejo. La ausencia de una banda visible en el Carril 10 (PBMC de cobayo con adición de 50 ng de LPS) indica que el AB7 no experimentaba reaccion cruzada con la 1L-1� de cobayo.
[0273] Estos resultados indican que el AB7 reacciona cruzadamente con la 1L-1� de varios mamiferos no humanos, y concretamente de macaco rhesus, mono cynomolgus, perro y conejo, pero no reacciona cruzadamente con la 1L-1 de al menos otro mamifero no humano, y concretamente de cobayo.
Ejemplo 9
[0274] Este Ejemplo ilustra adicionalmente que al menos algunos anticuerpos segun la presente invencion que se unen a la IL-1 reaccionan cruzadamente con IL-1� de otros mamiferos no humanos. El anticuerpo AB7 fue sometido a ensayo para determinar su unión a la IL-1� de mamiferos no humanos, y concretamente de raton y de rata.
[0275] IL-1� de rata, de raton y humanas recombinantes (Pepr otech) fueron cargadas en condición reductora y no reductora en un gel para S0S-PAGE y cicladas a 120 V por espacio de 1 hora. A continuacion de transferencia a membrana Immobilon-P a 22 V durante la noche y bloqueo con leche desnatada al 5%, el AB7 fue incubado a razón de 2 1g/ml con la membrana por espacio de 2 horas. Un anticuerpo secundario de cabra anti-1gG humana conjugado con HRP fue afadido a continuacion de pasos de lavado y la deteccion se hizo con solucion de TMB (TMB = tetrametilbencidina) monocomponente.
[0276] La Fig. 17 muestra el Western blot obtenido mediante los procedimientos anteriormente indicados. Los carriles 1 y 2 son para IL-1� humana no reducida y reducida, respectivamente. Los carriles 3 y 4 son para 1L-1� de ratón no reducida y reducida, respectivamente. Los carriles 5 y 6 son para 1L-1 de rata no reducida y reducida, respectivamente. En el fondo del blot pueden verse bandas en cada uno de los carriles en una region que corresponde a un peso molecular de aproximadamente 17 k0a. Estas bandas son indicativas de la presencia de IL-1 �, la cual es a su vez indicativa de la union del AB7 a la 1L-1� humana, a la 1L-1� de ratón y a la IL-1� de rata. Estos resultados indican que el AB7 reacciona cruzadamente con 1L-1� de roedor.
Ejemplo 10
[0277] Este Ejemplo ilustra adicionalmente que al menos algunos anticuerpos segun la presente invencion que se unen a la IL-1� son inhibidores de 1L-1� de humanos y de al menos algunos mamiferos no humanos. El anticuerpo AB7 fue sometido a ensayo para determinar la inhibicion de la proliferacion de celulas 010 estimulada por 1L-1 de humano, de macaco rhesus, de raton y de rata.
[0278] Las celulas 010.G4.1 (010) son celulas colaboradoras T murinas con especificidad para el antigeno conalbumina de la clara de huevo. Esta linea celular fue obtenida del raton AKR/J (haplotipo H-2k MHC) y requiere activacion del receptor del antigeno e 1L-1 para su crecimiento, proliferacion y supervivencia. La linea celular 010 es altamente sensible a las IL-1 y puede responder a las IL-1 de varias especies (incluyendo los humanos, el mono, el raton y la rata), lo cual permite someter a ensayo el potencial neutralizante en reacción cruzada de un anticuerpo o fragmento que se una a la IL-1 �, tal como el AB7. La proliferacion de las celulas 010 no se ve afectada por el LPS ni por citoquinas de derivadas de macrófagos tales como la IL-6 y el TNF-a. Como resultado de ello, los ensayos con celulas 010 pueden ser usados para valorar la actividad de IL-1 especifica de fuentes endogenas (es decir, macrofagos activados por LPS).
[0279] Celulas 010 fueron activadas con Concanavalina A (Con A) y un nivel constante de fuente recombinante o nativa de IL-1 en presencia o en ausencia de varias concentraciones de AB7. Las celulas fueron cultivadas en placas a razon
de 2x104/pocillo y estimuladas con 2,5 1g/ml de Con A y distintas concentraciones de 1L-1�. Las celulas fueron cultivadas por espacio de 72 horas y la proliferacion fue medida afadiendo el colorante de viabilidad redox Alamar Blue durante las al menos 8-14 horas de cultivo y evaluando la O.0.570-600.
[0280] Para someter a ensayo la potencia y la reactividad cruzada entre las especies de AB7, fue llevado a cabo el bioensayo con celulas 010 usando las siguientes concentraciones de 1L-1� recombinante o nativa: 10 pg/ml de IL-1 humana recombinante; 10 pg/ml de 1L-1 de rhesus recombinante; 10 pg/ml de 1L-1 de raton y 100 pg/ml de 1L-1� de rata. Para el ensayo con celulas 010 empleando 1L-1� humana endogena fue usada una dilucion 1:360 de supernatante de PBMC's humanas activadas con LPS. 0istintas concentraciones de AB7 fueron sometidas a ensayo con cada 1L-1 �. Las mediciones de la 1C50 fueron determinadas usando Graphpad Prism. La media, la desviacion caracteristica (S0) y el error caracteristico (SEM) para la 1C50 fueron calculados usando Microsoft Excel.
[0281] Los resultados del ensayo con celulas 010 estan resumidos en la Tabla 5, que incluye la 1C50 media y el SEM (sobre la base de 4 experimentos para IL-1� humana recombinante y 3 experimentos para la 1L-1 de otras fuentes). El AB7 era altamente potente para neutralizar la 1L-1� humana recombinante y la 1L-1� humana producida de manera endogena (nativa). El AB7 era tambien altamente potente para neutralizar la 1L-1� de macaco rhesus recombinante. El Ab7 tambien neutralizaba la IL-1� de raton recombinante con una potencia mas baja, teniendo una 1C 50 que era 1000 veces mas alta en comparacion con la humana. El AB7 no tuvo actividad significativa alguna contra la 1L-1� de rata en este ensayo.
Tabla 5: Resultados de ELISA
1C50 (pM)
SEM (pM)
IL-1� humana recombinante
2,4 ± 0,52
IL-1� humana de producción endógena (nativa)
2,6 ± 0,11
IL-1� de macaco rhesus recombinante
2,7 ± 0,73
IL-1� de ratón recombinante
2618 ± 60,9
[0282] Estos resultados indican que el AB7 es un anticuerpo neutralizante altamente potente contra la IL-1� humana, con potencia similar contra formas recombinantes y nativas de la citoquina. La actividad contra la 1L-1 del primate no humano macaco rhesus era similar a la actividad contra la IL-1 humana. Asi, al menos algunos anticuerpos y fragmentos de la presente invención incluyen a anticuerpos y fragmentos que tienen prácticamente la misma potencia contra IL-1� humana y contra 1L-1� ácticamente la misma potencia contra humana
de primate y/o tienen prIL-1� recombinante y contra IL-1 humana endogena. Estos resultados tambien indican que el AB7 tambien neutraliza la 1L 1� de raton.
Ejemplo 11
[0283] Este Ejemplo ilustra el mapeo del epitope de 1L-1� al cual se unen al menos algunos anticuerpos de la presente invencion (como por ejemplo el anticuerpo denominado AB7).
[0284] Se uso un conjunto de peptidos PepSpotMF (JPT Peptide Technologies, Berlin, Alemania) para identificar los residuos de aminoácidos clave de IL-1� (epitope) que intervienen en la union del AB7. Fueron sintetizados directamente sobre una membrana los de una gama de doce peptidos de aminoacidos que abarcaba toda la secuencia de aminoácidos de la IL-1 �, solapandose cada peptido en 11 aminoacidos con el anterior. La membrana que llevaba los peptidos fue explorada con AB7 a razon de una concentracion de 2 1g/ml por espacio de 2 h a temperatura ambiente. La union de los anticuerpos AB7 a los peptidos unidos a la membrana fue detectada usando un anticuerpo secundario anti-humano de cabra conjugado con HRP, efectuandose a continuacion quimioluminiscencia mejorada (ECL). Las manchas de peptidos correspondientes a los residuos 83-105 de la IL-1 dieron positivo para la union al AB7.
[0285] Este mapeo indica que el AB7 se une a un epitope dentro de la secuencia correspondiente a los residuos 83-105 de la proteina 1L-1� madura. La secuencia comprende los aminoacidos ESV0PKNYPKKKMEKRFVFNK1E, y el AB7 es ejemplo de anticuerpos que se unen a un epitope dentro de esta secuencia. Se preve que tambien se fijen a un epitope contenido en esta secuencia los anticuerpos denominados AB6, AB8, AB9 y otros, tales como anticuerpos que tengan la cadena pesada de la 10 SEC N°: 29 y la cadena liviana de la 10 SEC N°: 27.
Ejemplo12
[0286] Este ejemplo ilustra la inhibición in vitro de IL-1� usando un anticuerpo de la invención en un ensayo basado en celulas con 1L-8.
[0287] Se tomo de donantes sanos sangre periferica heparinizada reciente. 180 1l de sangre entera fueron cultivados en una placa de 96 pocillos e incubados con varias concentraciones del anticuerpo AB7 y rh1L-1 100pM. Para muestras tratadas con Kinerett se combinaron 1.1 Kinerett y rh1L-1 antes de la mezcla con la sangre. Las muestras fueron incubadas por espacio de 6 horas a 37°C con CO2 al 5%. Las celulas de sangre entera fueron luego lisadas con 50 1l de Triton X-100 al 2,5%. La concentracion de interleuquina-8 (1L-8) en los lisados clarificados fue analizada mediante EL1SA (Quantikine human 1L-8 EL1SA kit, R&0 Systems) segun las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de IL-8 en las muestras tratadas con AB7 y con Kinerett fueron comparadas con una muestra de control tratada con control anti-KLH. Los resultados estan representados en la Fig. 18 y resumidos en la Tabla 6. La 1C50 es la concentración de anticuerpo requerida para inhibir un 50% de la IL-8 liberada por estimulacion con 1L-1�.
Tabla 6
1C50 (pM)
AB7
1,9 pM
Kinerett
53,4 pM
[0288] Estos resultados demuestran la potencia in vitro del AB7, segun medicion efectuada mediante la inhibicion de la liberación de IL-8 estimulada por 1L-1 . Estos resultados, que ponen en evidencia una mayor potencia en comparación con Kinerett, indican que los anticuerpos de la invencion tendran eficacia inhibitoria de la 1L-1� in vivo.
Ejemplo 13
[0289] Este ejemplo ilustra que los anticuerpos de la invención tienen una afinidad sorprendentemente alta en comparacion con un anticuerpo que tenga una secuencia similar.
[0290] El AB5 fue comparado con el AB-control en cuanto a la secuencia y a la afinidad de union. El AB5 comprende la region variable de cadena pesada que se expone en la 10 SEC N°: 8 y la region variable de cadena liviana que se expone en la 10 SEC N°: 9. Se cree que el AB-control comprende la región variable de cadena pesada que se expone en la 10 SEC N°: 38 y la region variable de cadena liviana que se expone en la 10 SEC N°: 39. Esas secuencias se exponen en la Publicacion de Solicitud de Patente U.S. N° 2003/0026806, en las Figuras 6A y 6B. El AB5 y el AB-control tienen las mismas regiones determinantes complementarias en sus regiones variables de cadena pesada y liviana. Sus cadenas pesadas se diferencian en tres residuos de aminoacidos en la region de entramado 3, situada en las posiciones 68, 74 y 86 en las 10 SEC NOMS.: 8 y 38. Sus respectivas cadenas livianas se diferencian en un residuo de aminoácido en la region de entramado 3, situada en la posicion 72 en las 10 SEC NOMS.: 9 y 39. A pesar de sus similitudes en las secuencias de sus regiones variables de cadena pesada y liviana, que incluyen las mismas C0Rs, el AB5 y el ABcontrol se diferencian significativa e inesperadamente en cuanto a su afinidad de union. Como se ha dicho en los anteriores Ejemplos 1 y 5, se comprobo que el AB5 tiene una constante de disociacion de menos de 0,3pM (con una K0 baja de 0,11pM y una K0 alta de 0,56pM), y se comprobo que el AB-control tiene una constante de disociación de 3pM (con una K0 baja de 1,62pM y K0 alta de 5,23pM). 0adas las similitudes de la secuencia de aminoacidos, es sorprendente que el AB5 tenga una afinidad mas alta en un orden de magnitud.
[0291] Fue generado AB7 usando tecnologia HUMAN ENG1NEER1NGMF, como se describe en el Ejemplo 4. Las regiones variables de cadena liviana y pesada del AB7 incluyen posiciones de riesgo bajo y moderado en las secuencias de las regiones variables de cadena liviana y pesada AB5. El AB7 comprende la region variable de cadena pesada que se expone en la 10 SEC N°: 15 y la region variable de cadena liviana que se expone en la 10 SEC N°: 11.
[0292] El AB7 fue comparado con el AB-control y con el AB5 en cuanto a la secuencia y a la afinidad de union. El AB7 y el AB-control tienen las mismas regiones determinantes complementarias en sus regiones variables de cadena pesada y liviana. Sus cadenas pesadas se diferencian en dos de las tres posiciones en la region de entramado 3 (posiciones 74 y 86 en las 10 SEC NOMS.: 15 y 38) donde el AB5 se diferenciaba del AB-control; si bien en la posicion 68 en la 10 SEC N°: 15 el AB7 tiene el mismo aminoacido como el AB-control. En la cadena liviana del AB7, la posicion 72 en la 10 SEC N°: 12 se diferencia tanto del AB-control como del AB5. El AB7 incluye otras varias diferencias en las regiones variables de cadena liviana y pesada al ser comparado con el AB-control y con el AB5 en virtud del proceso HUMAN ENG1NEER1NGMF. A pesar de la inclusion de cambios en posiciones de riesgo moderado, y particularmente en vista de los cambios en AB7 en comparacion con AB5 en la posicion 68 en la region variable de cadena pesada y en la posicion 72 en la region variable de cadena liviana, el AB7 y el AB5 tienen similares constantes de disociacion, y el AB7 se diferencia significativa e inesperadamente del AB-control con respecto a la afinidad de union. Como se ha dicho en el anterior Ejemplo 5, se comprobo que el AB7 tiene una constante de disociacion de 0,3pM (con una K0 baja de 0,11pM y una K0 alta de 0,74pM). Se comprobo que el AB5 tiene una constante de disociacion de 0,24pM (con una K0 baja de 0,07pM y una K0 alta de 0,72pM). 0ados los cambios hechos en posiciones de riesgo moderado y en vista de las similitudes generales de la secuencia de aminoacidos, particularmente en las C0Rs, es sorprendente que el AB7 tenga una afinidad asimilar a la del AB5 y una afinidad mas alta que la del AB-control en un orden de magnitud.
Ejemplo 14
[0293] Este ejemplo demuestra que al menos un anticuerpo de la presente invencion se une a un epitope de 1L-1 de forma tal que el anticuerpo unido prácticamente no impide que la IL-1� unida al anticuerpo se una al receptor tipo I de IL-1. En este Ejemplo se emplea un aparato de analisis cinetico Biacoret para examinar si la 1L-1 unida a uno de los presentes anticuerpos (AB7) puede aun unirse al receptor tipo 1 de 1L-1.
[0294] Para este Ejemplo fue inmovilizado AB7 sobre la superficie de un chip sensor CM-5 en un aparato de medida Biacore como se indica a continuacion. Usando HBS-EP (Biacoret, 1nc.) como tampon de desplazamiento, la temperatura fue ajustada a 25°C, el caudal fue ajustado a 10 1l/min., y la trayectoria de flujo fu e dirigida a la celda de flujo 2 solamente. Fueron mezclados 135 1l de cada una de las soluciones de NHS y de EC0 (Biacoret, 1nc.), y fueron inmediatamente inyectados en la trayectoria de flujo 70 1l de la solucion de NHS/EC0. Luego fueron inyectados 91 1l de una solucion de AB7 (-20 en on de acetato sodico 10mM (Biacoret, 1nc.)), seguidos por 70 1l de
1g/ml tampEtanolamina 1M (Biacoret, 1nc.). Fueron asi inmovilizadas aproximadamente 5650 RU (RU = unidades relativas) de AB7. Para preparar una superficie de referencia, la trayectoria de flujo fue cambiada a la celda de flujo 1 solamente. Fueron mezclados 135 1l de cada una de las soluciones de NHS y de EC0 (Biacoret, 1nc.), y fueron inmediatamente inyectados en la trayectoria de flujo 70 1l de la solución de NHS/EC0, seguidos por 70 1l de Etanolamina 1M (Biacoret, 1nc.).
[0295] El aparato de medida Biacoret estaba entonces listo para el analisis de si la 1L-1� unida a AB7 seguir
ia uniendose al receptor tipo 1 de 1L-1. Para este analisis fue usado receptor tipo I de IL-1 soluble (IL-1 sR1), y la union del IL-1 sR1 a un complejo de AB7/1L-1� fue sometida a ensayo como se indica a continuacion. 1L -1 sR1 (N° de cat 269-1R100/CF de Rn0Systems) e 1L-1� (Peprotech, N° cat 200-01B) fueron diluidos por separado hasta 10 1g/ml en HBS-EP. El caudal fue ajustado a 10 1l/min. La trayectoria de flujo para el aparato de medida Biacoret fue ajustada a las celdas de flujo 1 y 2 y se uso resta de referencia de la celda de flujo 2 de la celda de flujo 1 para determinar un diferencial de respuesta. La Fig. 19 muestra el diferencial de respuesta medido del aparato de medida Biacoret a lo largo del curso del analisis. La Fig. 20 proporciona una ilustracion de los pasos usados en el analisis, indicando las adiciones por separado a la celda de flujo de (A) 1L-1 sR1, (B) 1L-1� y (C) 1L-1 sR1, en ese orden.
[0296] A los 200 segundos fueron inyectados 20 1l de 1L-1 sR1 para verificar la ausencia de union directamente al AB7 inmovilizado (inyeccion A en las Figs. 19 y 20). Como se muestra en la Fig. 19, el 1L-1 sRI no incrementó las unidades de respuesta, lo cual indica que el IL-1 sR1 no se unia directamente al AB7 inmovilizado.
[0297] A los 600 segundos, aproximadamente 1000 RU de 1L-1b estaban unidas al AB7, formando un complejo AB7/1L1 sobre la superficie del chip (inyeccion B en las Figs. 19 y 20) El incremento de unidades de respuesta indica que la IL-1� se unio al AB7 inmovilizado. A continuacion fueron inyectados 201l de 1L -1 sRI a los 1200 segundos para verificar la unión del IL-1 sR1 al complejo de AB7 e 1L-1�. Aproximadamente 1500 RU de 1L-1 sR1 se unieron al complejo AB7/1L1� (inyeccion C en las Figs. 19 y 20). Este incremento de unidades de respuesta indica que el 1L -1 sR1 se unia al complejo 1L-1�/AB7.
[0298] Este Ejemplo indica que el IL-1 sRI se une a la IL-1 pero no se une al AB7, y que el AB7 se une a un epitope de IL-1� de forma tal que el AB7 unido prácticamente no impide que la IL-1 se una al 1L-1 sR1.
[0299] El uso de los vocablos "un" ("uno") y "una" y "el" ("la") y de referentes similares en el contexto de la descripcion de la invención (y especialmente en el contexto de las reivindicaciones siguientes) deberá interpretarse que cubre tanto el singular como el plural, a no ser que se indique otra cosa o que ello este en clara contradiccion con el contexto. Las expresiones "que comprende(n)", "que tiene(n)", "que incluye(n)" y "que contiene(n)" deberan interpretarse como expresiones de significado abierto (es decir, como expresiones que significan "que incluye(n), aunque sin caracter limitativo"), a no ser que se indique otra cosa. Alli donde se use una expresion de significado abierto para describir una caracteristica o un elemento de la invencion, se contempla especificamente que puede usarse una expresion de significado cerrado en lugar de la expresion de significado abierto sin por ello salir fuera del alcance de la invencion. Las enumeraciones de gamas de valores que aqui se hacen pretenden meramente servir de metodo abreviado para referirse individualmente a cada valor individual que queda situado dentro de la gama, a no ser que se indique aqui otra cosa, y cada valor individual queda incorporado en la descripcion como si fuese aqui enumerado individualmente. Todos los metodos que aqui se describen pueden ejecutarse en cualquier orden adecuado a no ser que aqui se indique otra cosa o que ello este de otro modo en clara contradiccion con el contexto. El uso de cualesquiera y todos los ejemplos o de lenguaje ejemplificativo (como p. ej. "tal como") que aqui se hace esta meramente destinado a mejor ilustrar la invencion y no establece limitacion alguna del alcance de la invencion, a no ser que se reivindique otra cosa. Ninguna de las formas de expresión que se usan en la descripción deberá ser interpretada como una indicación de que cualquier elemento no reivindicado sea esencial para la puesta en practica de la invencion.
[0300] Se describen aqui realizaciones preferidas de esta invencion, incluyendo el mejor modo conocido para los inventores para realizar la invencion. A los expertos en la materia podran resultarles obvias variaciones de esas realizaciones preferidas tras haber procedido a la lectura de la anterior descripcion. Los inventores preven que los expertos en la materia estarán en condiciones de emplear aquellas variaciones que sean apropiadas, y los inventores preven que la invencion podra ser puesta en practica de otras maneras distintas de las que aqui se describen especificamente. En consecuencia, esta invencion incluye todas las modificaciones y todos los equivalentes del objeto que se expone en las reivindicaciones adjuntas segun lo permitido por la legislacion aplicable. Ademas queda incluida en la invención cualquier combinación de los elementos anteriormente descritos en todas las posibles variaciones de los mismos a no ser que aqui se indique otra cosa o que ello este claramente en contradiccion con el contexto.
[0301] Algunas realizaciones de la invención se refieren a:
1.
Un anticuerpo que se une a la 1L-1� o un fragmento del mismo que se une a la 1L-1� y comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 28.
2.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de 1.,en donde dicho anticuerpo o fragmento comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 2, la 10 SEC N°: 23 o la 10 SEC N°: 24.
3.
Un anticuerpo que se une a la 1L-1� o un fragmento del mismo que se une a la 1L-1�, en donde dicho anticuerpo o fragmento se une a la IL-1� humana con una constante de disociación de aproximadamente 1pM o menos.
4.
El anticuerpo o fragmento de cualquiera de los subpárrafos 1.-3., en donde dicho anticuerpo o fragmento se une a la IL-1� humana con una constante de disociacion de aproximadamente 0,3pM o menos.
5.
El anticuerpo o fragmento de cualquiera de los subpárrafos 1.-3., en donde dicho anticuerpo o fragmento se une a la IL-1� humana con una constante de disociacion de aproximadamente 0,24pM.
6.
El anticuerpo o fragmento de cualquiera de los subpárrafos 1.-3., en donde dicho anticuerpo o fragmento se une a la IL-1� humana con una constante de disociacion de aproximadamente 0,11pM.
7.
Un anticuerpo que se une a la 1L-1 o un fragmento del mismo que se une a la 1L-1�, en donde el anticuerpo o fragmento se une a un epitope de 1L-1 de forma tal que el anticuerpo o fragmento unido permite considerablemente la unión de IL-1 al receptor tipo 1 de 1L-1 (IL-1R1), y el anticuerpo o fragmento se une a la 1L-1 humana con una constante de disociacion de menos de 1pM.
8.
Un anticuerpo que se une a la IL-1 o un fragmento del mismo que se une a la 1L-1�, en donde el anticuerpo o fragmento se une a la IL-1� humana con una constante de disociacion de menos de 1pM, y el anticuerpo o fragmento se une a practicamente el mismo epitope como aquel al que se une un anticuerpo que tenga la región variable de cadena liviana de la 10 SEC N°: 11 y la region variable de cadena pesada de la 10 SEC N°: 15.
9.
Un anticuerpo que se une a la 1L-1 o un fragmento del mismo que se une a la 1L-1�, en donde el anticuerpo o fragmento se une a la IL-1 humana con una constante de disociacion de menos de 1pM, y el anticuerpo o fragmento compite con la union de un anticuerpo que tenga la region variable de cadena liviana de la 10 SEC N°: 11 y la region variable de cadena pesada de la 10 SEC N°: 15.
10.
El anticuerpo o fragmento de 8., en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a un epitope contenido en la secuencia BSV0PKNYPKKKMBKRFVFN1E (10 SEC N°: 36).
11.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-9., en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es humanizado o ha sido manipulado para no presentar inmunogenicidad en los humanos.
12.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-9., en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es humano.
13.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-12., en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo neutralizante.
14.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-13., en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena liviana lambda
15.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-13., en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una region 1gG2.
16.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-13., en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un Fab, un F(ab')2, un Fv, un fragmento de anticuerpo de cadena unica, o una variante o un derivado de cualquiera de estos anticuerpos o fragmentos.
17.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-13., en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo multiespecifico, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, un minicuerpo, un anticuerpo lineal, un anticuerpo recombinante quelante, un tricuerpo, un bicuerpo, un intracuerpo, un nanocuerpo, un pequefo producto inmunofarmaceutico modular (SM1P), una proteina de fusion de inmunoglobulina de dominio de union, un anticuerpo camelizado, un anticuerpo con contenido de VHH, o una variante o un derivado de cualquiera de estos anticuerpos o fragmentos.
18.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-17., en donde el anticuerpo o fragmento comprende una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 27.
19.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-17., en donde el anticuerpo o fragmento comprende una region variable de cadena pesada que comprende una de las secuencias de aminoacidos de las 10 SEC NOMS.: 8, 14 y 15, y una region variable de cadena liviana que comprende una de las secuencias de aminoacidos de las 10 SEC NOMS.: 9, 10 y 11.
20.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-17., en donde el anticuerpo o fragmento comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 8, y una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9.
21.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-17., en donde el anticuerpo o fragmento comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 15, y una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 11.
22.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-17., en donde el anticuerpo o fragmento comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 14, y una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 10.
23.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de 1. o 2., en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una constante de disociacion de menos de 3pM.
24.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de 1. o 2., en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una constante de disociacion de aproximadamente 2pM o menos.
25.
Un anticuerpo que se une a la 1L-1� o un fragmento del mismo que se une a la 1L-1�, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo (1) tiene una 1C50 de aproximadamente 0,5nM o menos para inhibir la liberacion estimulada por IL-1� de 1L-6 desde fibroblastos humanos, (11) se une a la 1L-1� con una constante de disociación de aproximadamente 1pM o menos, y (111) inhibe la expresion inducida por 1L-1� de 1L-6 serica en un animal en al menos un 50% cuando el anticuerpo o fragmento de anticuerpo le es administrado al animal en una cantidad eficaz, en comparacion con el nivel de IL-6 serica en un animal estimulado con 1L-1� al que no se le ha administrado un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
26.
Un anticuerpo que se une a la 1L-1� o un fragmento del mismo que se une a la IL-1�, en donde el anticuerpo o fragmento se une a la IL-1� humana con una constante de disociacion de entre aproximadamente 6pM y aproximadamente 50pM, y en donde el anticuerpo tiene una 1C50 para inhibir la liberación estimulada por IL-1� de 1L-6 desde fibroblastos humanos de entre aproximadamente 5pM y aproximadamente 200 pM.
27.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de 26., en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a la 1L-1 con una constante de disociación de entre aproximadamente 13pM y aproximadamente 25pM.
28.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de 26.-27., en donde la region variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 4.
29.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de 26.-28., en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9.
30.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-28., en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo no se une de manera detectable a la IL-1a.
31.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-30., en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo no reacciona cruzadamente con diana alguna distinta de IL-1�.
32.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-31., en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a uno o varios de los miembros del grupo que consta de IL-1� de roedor, 1L-1� de primate, 1L-1� de perro e IL-1� de conejo.
33.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-31., en donde el anticuerpo o fragmento se une a la IL-1� de ratón con más alta afinidad que a la IL-1� de rata.
34.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-33., en donde el anticuerpo o fragmento no se une a la IL-1� de cobayo.
35.
Un anticuerpo que se une a la 1L-1� o un fragmento del mismo que se une a la 1L-1�, en donde el anticuerpo o fragmento comprende una o varias sustituciones, deleciones o adiciones a la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 28, y el anticuerpo o fragmento tiene la misma o practicamente la misma afinidad y especificidad de union al epitope
como dicha secuencia de aminoácidos que se expone en la 10 SEC N°: 28.
36. Un anticuerpo que se une a la 1L-1� o un fragmento del mismo que se une a la 1L-1�, en donde el anticuerpo o fragmento comprende una o varias sustituciones, deleciones o adiciones a la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 27, y el anticuerpo o fragmento tiene la misma o practicamente la misma afinidad y especificidad de union al epitope como dicha secuencia de aminoacidos que se expone en la 10 SEC N°: 27.
37.Un acido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-35.
38.
El acido nucleico de 37., en donde el acido nucleico comprende la secuencia de la 10 SEC N°: 38.
39.
El acido nucleico de 37., en donde el acido nucleico comprende la secuencia de la 10 SEC N°: 39.
40.
Un acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo, en donde la region variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 28.
41.
El acido nucleico de 40., en donde el acido nucleico codifica una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 2, 23 o 24.
42.
Un acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una región variable de cadena liviana de un anticuerpo, en donde la region variable de cadena liviana comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 27.
43.
Un vector que comprende el acido nucleico de cualquiera de los subpárrafos 37.-41.
44.
Una celula que comprende el ácido nucleico de cualquiera de los subpárrafos 37.-41. o el vector de 42.
45.
La celula de 44, en donde la celula es una celula troncal embrionica o un ovulo fertilizado.
46.
Una composicion que comprende la celula de 44. o 45.
47.
Un hibridoma que produce el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-34.
48.
Una composicion que comprende (a) el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.34., el acido nucleico de cualquiera de los subpárrafos 37.-41. o el vector de 42. y (b) un soporte adecuado.
49.
La composicion de 48., en donde el soporte es un soporte farmaceuticamente aceptable.
50.
La composicion de 49., en donde la composicion esta en una forma adecuada para la administracion intraarticular, subcutanea, intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intralesional, oral o por inhalacion.
51.
La composicion de 49., en donde la composicion comprende un lioprotector, un agente superficiactivo, una carga, un aglutinante y/o un agente voluminizante.
52.
La composicion de 49., en donde la composicion es una composicion farmaceutica de liberacion controlada o de liberacion sostenida.
53.
Un metodo que es para tratar o prevenir una enfermedad o condicion relacionada con las 1L-1 en un mamifero y comprende el paso de administrar una cantidad eficaz de (a) el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de los subpárrafos 1.-34., (b) el ácido nucleico de cualquiera de los subpárrafos 37.-41., el vector de (42), o (d) la composicion de 48.-54. a un mamifero que tenga necesidad de ello, con lo cual se trata o se previene una enfermedad en el mamifero.
54.
El metodo de 53., en donde la enfermedad o condición relacionada con las IL-1 es una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune o un cancer.
55.
El metodo de 53. o 54., en donde la enfermedad o condicion relacionada con las 1L-1 es seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de artritis reumatoidea, la osteoartritis, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, el shock septico, la enfermedad pulmonar obstructiva cronica, el asma, la enfermedad de injerto versus huesped, la aterosclerosis, la leucemia de celulas T del adulto, el mieloma multiple, la esclerosis multiple, la crisis fulminante o la enfermedad de Alzheimer.
56.
El metodo de cualquiera de los subpárrafos 53.-55., en donde la enfermedad o condicion relacionada con las 1L-1 es el Trastorno 1nflamatorio Multisistemico de 1nicio Neonatal (NOM10/C1NCA), la artritis idiopatica juvenil de inicio sistemico, los Sindromes Periodicos Asociados a C1AS1 (CAPS), la enfermedad de Stills o el sindrome de Muckle-Wells.
57.
El metodo de cualquiera de los subpárrafos 53.-56., en donde la enfermedad o condicion relacionada con las 1L-1 es la artritis idiopatica juvenil de inicio sistemico, la artritis reumatoidea, la osteoartritis, la aterosclerosis o la miastenia gravis.
58.
El metodo de cualquiera de los subpárrafos 53.-56., en donde el mamifero es un humano.
59.
El metodo de cualquiera de los subpárrafos 53.-58., en donde la cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de anticuerpo es eficaz para inhibir la expresión inducida por IL-1� de 1L-6 serica en un animal en al menos un 50% en comparación con el nivel de IL-6 serica en ausencia del anticuerpo.
60.
Un metodo para preparar un polipeptido madurado por afinidad que se une a la 1L-1 , comprendiendo dicho metodo los pasos de:
(a)
prever un primer ácido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido que se une a la IL-1� y comprende la secuencia de amino
acidos de la 10 SEC N°: 22 y un segundo acido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que se diferencia de la primera secuencia de ácido nucleico en al menos un nucleotido,
(b)
llevar a cabo una mezcla de acidos nucleicos para asi contar con dos o mas acidos nucleicos mutados,
(c)
seleccionar un acido nucleico mutado que codifique un polipeptido que (1) se una a la 1L-1� con una afinidad mayor que la del polipeptido codificado por el primer acido nucleico, (11) tenga una selectividad para la 1L-1 con preferencia sobre la IL-1a que sea mayor que la del polipeptido codificado por el primer acido nucleico, (111) tenga una cons tante de disociación de la unión en equilibrio para IL-1 que sea mas baja que la del polipeptido codificado por el primer acido nucleico, o (1V) inhiba la expresion inducida por 1L-1 de 1L-6 serica en un animal en mayor grado que el polipeptido codificado por el primer acido nucleico, y
(d)
expresar el acido nucleico mutado seleccionado, con lo cual se produce un polipeptido madurado por afinidad que se une a la 1L-1.
61.
El metodo de 60. Que comprende ademas el paso de prever un anticuerpo que comprenda al polipeptido codificado por el (los) acido(s) nucleico(s) mutado(s) antes de seleccionar el acido nucleico mutado, en donde el paso de seleccionar el acido nucleico es llevado a cabo sometiendo al anticuerpo a ensayo.
62.
El metodo de 60. o 61., en donde se repiten los pasos (b) y (c), en donde la mezcla de acidos nucleicos del paso (b) es llevada a cabo usando (I) al menos un ácido nucleico mutado seleccionado del paso (c) y (II) al menos un ácido nucleico que tenga una secuencia de ácido nucleico que se diferencie del ácido nucleico mutado seleccionado en al menos un nucleotido.
63.
El metodo de cualquiera de los subpárrafos 60.-62., en donde se repiten los pasos (b) y (c) hasta ser seleccionado un acido nucleico optimizado.
64.
El metodo de cualquiera de los subpárrafos 60.-63., en donde el primer acido nucleico codifica un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las 10 SEC NOMS.: 1-26.
65.
El metodo de cualquiera de los subpárrafos 60.-64., en donde el primer acido nucleico codifica un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las 10 SEC NOMS.: 27-35 o 42-57.
66.
El metodo de cualquiera de los subpárrafos 60.-65., en donde se repiten los pasos (b) y (c) hasta ser seleccionado un ácido nucleico que codifique un polipeptido que (1) tenga una 1C50 de aproximadamente 0,5nM o menos para inhibir la liberación estimulada por IL-1� de 1L-6 desde fibroblastos humanos, (11) se una a la 1L-1� con una constante de disociación para IL-1�j de menos de 3pM, y (111) inhiba la expresion inducida por 1L-1� de 1L-6 serica en un animal en al menos un 50% en comparación con el nivel de IL-6 serica en un animal estimulado con 1L-1� al que no se le ha administrado un anticuerpo o fragmento.
Listado de secuencias
[0302]
<110> XOMA Technology Ltd.
<120> ANT1CUERPOS Y FRAGMENTOS 0E LOS M1SMOS QUE SE UNEN A LA 1L-1�
<130> 17646WO02
<160> 57
<170> Patent1n version 3.3
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (7)..(7)
<223> "Xaa" es Thr o Ser
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (15)..(15)
<223> "Xaa" es Leu o Val
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (22)..(22)
<223> "Xaa" es Thr o Ser
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (41)..(41)
<223> "Xaa" es Asp o Gly
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (42)..(42)
<223> "Xaa" es Gly o Lys
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (43)..(43)
<223> "Xaa" es Thr o Ala
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (72)..(72)
<223> "Xaa" es Thr o Ser
<400> 1 <210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (3)..(3)
<223> "Xaa" es Thr o Gln
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (5)..(5)
<223> "Xaa" es Lys o Gln
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (11)..(11)
<223> "Xaa" es 1le o Leu
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (12)..(12)
<223> "Xaa" es Leu o Val
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (67)..(67)
<223> "Xaa" es Thr o Ser
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (68)..(68)
<223> "Xaa" es Gln o Arg
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (77)..(77)
<223> "Xaa" es Arg o Lys
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (81)..(81)
<223> "Xaa" es Phe o Ser
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (88)..(88)
<223> "Xaa" es Asp o Thr
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (89)..(89)
<223> "Xaa" es Thr o Ala
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (90)..(90)
<223> "Xaa" es Val o Ala
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (94)..(94)
<223> "Xaa" es Thr o Val
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (100)..(100)
<223> "Xaa" es Ala, Val, Phe, Lys, o Asn
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (101)..(101)
<223> "Xaa" es Arg o Lys
<400> 2 <210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (1)..(1)
<223> "Xaa" es Ala, Val, Phe, Lys, o Asn
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (2)..(2)
<223> "Xaa" es Arg o Lys
<400> 3
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 4 <210> 5
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 5 <210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 6
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 7
<210> 8
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 8 <210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 9 <210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 10
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 11 <210> 12
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (100)..(100)
<223> "Xaa" es Ala, Val, Phe, Lys, o Asn
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (101)..(101)
<223> "Xaa" es Arg o Lys
<400> 12 <210> 13
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (100)..(100)
<223> "Xaa" es Ala, Val, Phe, Lys, o Asn
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (101)..(101)
<223> "Xaa" es Arg o Lys
<400> 13 <210> 14
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 14 <210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 15 <210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 16
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 17 <210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 18
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 19
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 20
<210> 21
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (100)..(100)
<223> "Xaa" es Ala, Val, Phe, Lys, o Asn
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (101)..(101)
<223> "Xaa" es Arg o Lys
<400> 21
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 22 <210> 23
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (100)..(100)
<223> "Xaa" es Ala, Val, Phe, Lys, o Asn
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (101)..(101)
<223> "Xaa" es Arg o Lys
<400> 23
<210> 24
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220> <223> Sintetica
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (100)..(100)
<223> "Xaa" es Ala, Val, Phe, Lys, o Asn
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (101)..(101)
<223> "Xaa" es Arg o Lys
<400> 24
<210> 25
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 25 <210> 26
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 26 <210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (7)..(7)
<223> "Xaa" es Thr o Ser
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (15)..(15)
<223> "Xaa" es Leu o Val
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (22)..(22)
<223> "Xaa" es Thr o Ser
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (41)..(41)
<223> "Xaa" es Asp o Gly
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (42)..(42)
<223> "Xaa" es Gly o Lys
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (43)..(43)
<223> "Xaa" es Thr o Ala <220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (72)..(72)
<223> "Xaa" es Thr o Ser
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (77)..(77)
<223> "Xaa" es Asn o Ser
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (79)..(79)
<223> "Xaa" es Glu o Gln
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (83)..(83)
<223> "Xaa* es 1le o Phe
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (100)..(100)
<223> *Xaa* es Gly o Gln
<400> 27
<210> 28
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (3)..(3)
<223> "Xaa" es Thr o Gln
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (5)..(5)
<223> "Xaa" es Lys o Gln
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (11)..(11)
<223> "Xaa" es 1le o Leu
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (12)..(12)
<223> "Xaa" es Leu o Val
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (67)..(67)
<223> "Xaa" es Thr o Ser
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (68)..(68)
<223> "Xaa" es Gln o Arg
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (74)..(74)
<223> "Xaa" es Asp o Asn
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (77)..(77)
<223> "Xaa" es Arg o Lys
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (81)..(81)
<223> "Xaa" es Phe o Ser
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (88)..(88)
<223> "Xaa" es Asp o Thr
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (89)..(89)
<223> "Xaa" es Thr o Ala <220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (90)..(90)
<223> "Xaa" es Val o Ala
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (94)..(94)
<223> "Xaa" es Thr o Val
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (100)..(100)
<223> "Xaa" es Ala, Val, Phe, Lys, o Asn
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (101)..(101)
<223> "Xaa" es Arg o Lys
<400> 28
<210> 29
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (3)..(3)
<223> "Xaa" es Thr o Gln
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (5)..(5)
<223> "Xaa" es Lys o Gln
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (11)..(11)
<223> "Xaa" es 1le o Leu
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (12)..(12)
<223> "Xaa" es Leu o Val
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (67)..(67)
<223> "Xaa" es Thr o Ser
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (68)..(68)
<223> "Xaa" es Gln o Arg
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (74)..(74)
<223> "Xaa" es Asp o Asn
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (77)..(77)
<223> "Xaa" es Arg o Lys
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (81)..(81)
<223> "Xaa" es Phe o Ser
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (88)..(88)
<223> "Xaa" es Asp o Thr
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (89)..(89)
<223> "Xaa" es Thr o Ala <220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (90)..(90)
<223> "Xaa" es Val o Ala
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (94)..(94)
<223> "Xaa" es Thr o Val
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (100)..(100)
<223> "Xaa" es Ala, Val, Phe, Lys, o Asn
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (101)..(101)
<223> "Xaa" es Arg o Lys, pero no es Lys si la posición (100) es Lys
<400> 29
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (1)..(1)
<223> "Xaa" es Ala, Val, Phe, Lys, o Asn
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (2)..(2)
<223> "Xaa" es Arg o Lys, pero no es Lys si la posicion (1) es Lys
<400> 30
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (100)..(100)
<223> "Xaa" es Ala, Val, Phe, Lys, o Asn
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (101)..(101)
<223> "Xaa" es Arg o Lys, pero no es Lys si la posición (100) es Lys
<400> 31 <210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (100)..(100)
<223> "Xaa" es Ala, Val, Phe, Lys, o Asn
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (101)..(101)
<223> "Xaa" es Arg o Lys, pero no es Lys si la posición (100) es Lys
<400> 32 <210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (100)..(100)
<223> "Xaa" es Ala, Val, Phe, Lys, o Asn
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (101)..(101)
<223> "Xaa" es Arg o Lys, pero no es Lys si la posición (100) es Lys
<400> 33 <210> 34
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (100)..(100)
<223> "Xaa" es Ala, Val, Phe, Lys, o Asn
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (101)..(201)
<223> "Xaa" es Arg o Lys, pero no es Lys si la posicion (100) es Lys
<400> 34 <210> 35
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (100)..(100)
<223> "Xaa" es Ala, Val, Phe, Lys, o Asn
<220>
<221> CARACTERiST1CA M1SC
<222> (101)..(101)
<223> "Xaa" es Arg o Lys, pero no es Lys si la posicion (100) es Lys
<400> 35 <210> 36
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 36
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia Enlazadora
<400> 37
<210> 38
<211> 360
<212> 0NA
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 38
<210> 39
<211> 321
<212> 0NA
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 39 <210> 40
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 40 <210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 41
<210> 42
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 42
<210> 43
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 43 <210> 44
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 44 <210> 45
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 45
<210> 46
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 46 <210> 47
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 47 <210> 48
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 48 <210> 49
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 49 <210> 50
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 50 <210> 51
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 51 <210> 52
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 52
<210> 53
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 53
<210> 54
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 54 <210> 55
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 55 <210> 56
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 56 <210> 57
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintetica
<400> 57

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Anticuerpo que se une a la IL-1� o fragmento del mismo que se une a la 1L-1�, en donde dicho anticuerpo o fragmento se une a la IL-1� con una constante de disociaci
    on de menos de 1pM, siendo dicho anticuerpo o fragmento del mismo seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de:
    una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9 o de la 10 SEC N°: 9 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos y una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 8 o de la 10 SEC N°: 8 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos;
    una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 10 o de la 10 SEC N°: 10 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos y una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 14 o de la 10 SEC N°: 14 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos;
    una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 11 o de la 10 SEC N°: 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos y una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 15 o de la 10 SEC N°: 15 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos;
    una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 10 o de la 10 SEC N°: 10 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos y una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 25 o de la 10 SEC N°: 25 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos;
    una region variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 11 o de la 10 SEC N°: 11 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 26 o de la 10 SEC N°: 26 con una o varias sustituciones conservadoras de aminoacidos.
  2. 2.
    El anticuerpo o fragmento de union del mismo segun la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un Fab, un F(ab')2, un Fv, un fragmento de anticuerpo de cadena unica, un anticuerpo multiespecifico, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, un minicuerpo, un anticuerpo lineal, un anticuerpo recombinante quelante, un tricuerpo, un bicuerpo, un intracuerpo, un nanocuerpo, un pequefo producto inmunofarmaceutico modular (SM1P), una proteina de fusion de inmunoglobulina de dominio de union, un anticuerpo camelizado o un anticuerpo con contenido de VHH.
  3. 3.
    Acido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicacion 1 o 2.
  4. 4.
    Ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de un anticuerpo, en donde la region variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 8, 12, 13, 14, 15, 23, 24, 25 o 26.
  5. 5.
    Ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena liviana de un anticuerpo, en donde la region variable de cadena liviana comprende la secuencia de aminoacidos de la 10 SEC N°: 9, 10 u 11.
  6. 6.
    Vector que comprende la secuencia de acido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.
  7. 7.
    Celula que comprende el acido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o el vector de la reivindicacion 6.
  8. 8.
    Composicion que comprende (a) el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2, el acido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o el vector de la reivindicacion 6, y (b) un soporte adecuado.
  9. 9.
    Composicion farmaceutica que es para ser usada para tratar o prevenir una enfermedad o condicion relacionada con las IL-1 en un mamifero y comprende una cantidad eficaz de (a) el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2, (b) el acido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 3-5, (c) el vector de la reivindicacion 6, o (d) la composicion de la reivindicacion 7, en donde dicha enfermedad o condición relacionada con las IL-1 es seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune y un cancer.
ES10179088T 2005-06-21 2006-06-21 Anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a la IL-1beta Active ES2391334T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US69283005P 2005-06-21 2005-06-21
US692830P 2005-06-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2391334T3 true ES2391334T3 (es) 2012-11-23

Family

ID=37595818

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES06773749T Active ES2335232T3 (es) 2005-06-21 2006-06-21 Anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a la il-1 beta.
ES10179089.7T Active ES2569917T3 (es) 2005-06-21 2006-06-21 Anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a IL-1beta
ES09174190.0T Active ES2439709T3 (es) 2005-06-21 2006-06-21 Anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a la IL-1beta
ES10179088T Active ES2391334T3 (es) 2005-06-21 2006-06-21 Anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a la IL-1beta
ES16154804T Active ES2827247T3 (es) 2005-06-21 2006-06-21 Anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a IL-1beta

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES06773749T Active ES2335232T3 (es) 2005-06-21 2006-06-21 Anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a la il-1 beta.
ES10179089.7T Active ES2569917T3 (es) 2005-06-21 2006-06-21 Anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a IL-1beta
ES09174190.0T Active ES2439709T3 (es) 2005-06-21 2006-06-21 Anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a la IL-1beta

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16154804T Active ES2827247T3 (es) 2005-06-21 2006-06-21 Anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a IL-1beta

Country Status (24)

Country Link
US (11) US7531166B2 (es)
EP (5) EP2314623B1 (es)
JP (2) JP4931919B2 (es)
KR (3) KR101502920B1 (es)
CN (2) CN101228188A (es)
AT (1) ATE446972T1 (es)
AU (1) AU2006262179B2 (es)
BR (1) BRPI0612273C1 (es)
CA (2) CA2612760C (es)
CY (3) CY1109715T1 (es)
DE (1) DE602006010072D1 (es)
DK (4) DK1899378T3 (es)
ES (5) ES2335232T3 (es)
HK (3) HK1158218A1 (es)
HU (1) HUE029021T2 (es)
IL (2) IL188094A (es)
MX (2) MX348154B (es)
NZ (1) NZ565138A (es)
PL (4) PL2314623T3 (es)
PT (3) PT2314623E (es)
RU (1) RU2518295C2 (es)
SI (4) SI2314623T1 (es)
WO (1) WO2007002261A2 (es)
ZA (1) ZA200800555B (es)

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2314623E (pt) 2005-06-21 2012-10-02 Xoma Technology Ltd Anticorpos de ligação a il-1β e os seus fragmentos
BRPI0617830B8 (pt) 2005-10-26 2021-05-25 Novartis Ag uso de um anticorpo de ligação il-1beta e composições farmacêuticas compreendendo o mesmo
US20080118496A1 (en) * 2006-04-10 2008-05-22 Medich John R Uses and compositions for treatment of juvenile rheumatoid arthritis
WO2008021237A1 (en) * 2006-08-10 2008-02-21 Arubor Corporation Localized therapy of lower airways inflammatory disorders with proinflammatory cytokine inhibitors
CN101616690B (zh) * 2006-12-20 2015-11-25 爱克索马美国有限责任公司 用于治疗IL-1β相关疾病的方法
MX2009006709A (es) * 2006-12-20 2009-07-02 Xoma Technology Ltd Tratamiento de enfermedades relacionadas con il-1beta.
RU2009148597A (ru) 2007-05-29 2011-07-10 Новартис АГ (CH) Новые показания к применению при лечении антителами против il-1-бета
US8999337B2 (en) * 2007-06-11 2015-04-07 Abbvie Biotechnology Ltd. Methods for treating juvenile idiopathic arthritis by inhibition of TNFα
JP5536666B2 (ja) * 2007-12-20 2014-07-02 ゾーマ （ユーエス） リミテッド ライアビリティ カンパニー 痛風の治療のための方法
EP2293816B1 (en) * 2008-06-06 2012-11-07 XOMA Technology Ltd. Methods for the treatment of rheumatoid arthritis
JP2012502058A (ja) 2008-09-05 2012-01-26 ゾーマ テクノロジー リミテッド β細胞機能の改善のための方法
WO2010077422A2 (en) * 2008-10-29 2010-07-08 Wyeth Llc Formulations of single domain antigen binding molecules
WO2010087972A2 (en) * 2009-01-29 2010-08-05 Abbott Laboratories Il-1 binding proteins
US9265834B2 (en) 2009-03-05 2016-02-23 Ablynx N.V. Stable formulations of polypeptides and uses thereof
EP2403873A1 (en) 2009-03-05 2012-01-11 Ablynx N.V. Novel antigen binding dimer-complexes, methods of making/avoiding and uses thereof
WO2010128092A1 (en) * 2009-05-06 2010-11-11 Novartis Ag ANTI-IL1-β ANTIBODY COMBINATION THERAPY
US20100316651A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-16 Xoma Technology Ltd. Cardiovascular related uses of il-1beta antibodies and binding fragments thereof
US8389474B1 (en) * 2009-07-14 2013-03-05 Alan Anson Wanderer Rationale for IL-1 β targeted therapy to improve harvested organ viability, allograft tolerance, replant success and for conditions characterized by reduced or absent arterial perfusion
DK2473527T3 (en) 2009-09-03 2017-03-06 Ablynx Nv STABLE FORMULATIONS OF POLYPEPTIDES AND APPLICATIONS THEREOF
JP5885664B2 (ja) * 2009-09-25 2016-03-15 ゾーマ テクノロジー リミテッド スクリーニング法
WO2011047266A1 (en) * 2009-10-15 2011-04-21 Abbott Laboratories Il-1 binding proteins
DE102009047243A1 (de) 2009-11-27 2011-06-01 Orgentec Diagnostika Gmbh Monospezifische Polypeptidreagenzien
SG185473A1 (en) * 2010-05-07 2012-12-28 Xoma Technology Ltd METHODS FOR THE TREATMENT OF IL-1ß RELATED CONDITIONS
JP5866130B2 (ja) 2010-09-10 2016-02-17 アペクシジェン， インコーポレイテッド 抗ＩＬ−１β抗体およびその使用方法
RU2015134562A (ru) * 2011-02-08 2018-12-24 Эббви Инк. Лечение остеоартрита и боли
US20140308294A1 (en) 2011-04-15 2014-10-16 Merck Patent Gmbh Anti-IL-1R1 Inhibitors For Use in Cancer
CA2837895C (en) 2011-06-03 2021-07-27 Mesoblast, Inc. Methods of treating or preventing neurological diseases
US9707272B2 (en) 2011-07-12 2017-07-18 Universitat Zurich Method for the treatment of acne by administering IL-1β antibody
TWI461192B (zh) * 2011-07-20 2014-11-21 Twi Biotechnology Inc 降低血脂異常病患之糖化血色素的醫藥組成物
DE102011083595A1 (de) * 2011-09-28 2013-03-28 Bayer Pharma AG Inhibition der Wirkung von Interleukin 1 beta zur Behandlung der Endometriose
WO2013049278A1 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Novartis Ag USE OF IL-1 ß BINDING ANTIBODIES
EP3050900A1 (en) 2011-12-19 2016-08-03 Xoma (Us) Llc Methods for treating acne
ES2534782T3 (es) * 2012-02-02 2015-04-28 Baylor College Of Medicine Sistema biológico de administración y expresión basado en adenovirus para uso en el tratamiento de la osteoartritis
US10167335B2 (en) * 2012-02-13 2019-01-01 Agency For Science, Technology And Research IL-1β neutralizing human monoclonal antibodies
US20150203840A1 (en) * 2012-08-31 2015-07-23 Argen-X N.V. Method for producing antibody molecules having inter-species, intra-target cross-reactivity
RU2711118C2 (ru) * 2012-11-05 2020-01-15 Деленекс Терапьютикс Аг Элементы, связывающиеся с ил-1 бета
EP2931750B8 (en) * 2012-12-17 2021-11-03 Cell Medica Inc. Antibodies against il-1 beta
EA033269B1 (ru) * 2013-02-15 2019-09-30 Р-Фарм Интернешнл, Ооо (Общество С Ограниченной Ответственностью) СОСТАВ ИНГИБИТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-1 БЕТА (IL-1β) И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
US20160120941A1 (en) * 2013-05-31 2016-05-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of using il-1 antagonists to treat alzheimer's disease
CN104341501B (zh) * 2013-07-29 2019-08-30 上海睿智化学研究有限公司 抗IL-1β人源化单克隆抗体及其制备方法和应用
AU2014370883B2 (en) 2013-12-26 2020-09-24 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody
WO2016008851A1 (en) * 2014-07-14 2016-01-21 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-il-1b antibodies
EP3417863A1 (en) 2015-05-18 2018-12-26 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Selective progesterone receptor modulator (sprm) for use in the treatment of heavy menstrual bleeding
JP6501650B2 (ja) * 2015-06-25 2019-04-17 田辺三菱製薬株式会社 ヒト抗ｉｌ−３３中和モノクローナル抗体
CA3045296A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity, Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
CN108218978B (zh) * 2016-12-13 2020-05-12 沈阳何氏眼产业集团有限公司 一种重组白细胞介素18及其制备方法与应用
EP3554343A1 (en) 2016-12-14 2019-10-23 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-1 inhibitor
WO2018234879A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novartis Ag USE OF IL-1β BINDING ANTIBODIES IN THE TREATMENT OF CANCER
WO2018235056A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novartis Ag IL-1BETA BINDING ANTIBODIES FOR USE IN THE TREATMENT OF CANCER
US20200158716A1 (en) * 2017-07-17 2020-05-21 Massachusetts Institute Of Technology Cell atlas of healthy and diseased barrier tissues
CA3074421A1 (en) 2017-08-31 2019-02-07 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Il-33 antagonist-containing therapeutic agent for endometriosis
WO2019053591A1 (en) 2017-09-13 2019-03-21 Novartis Ag USE OF IL-1B BINDING ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF ALCOHOLIC HEPATITIS
CA3081602A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Novartis Ag Combination therapies
GB2575853A (en) * 2018-07-25 2020-01-29 Robert Wotherspoon Hugh IL-1ß binding antibody
WO2020035482A1 (en) 2018-08-13 2020-02-20 Iltoo Pharma Combination of interleukin-2 with an interleukin 1 inhibitor, conjugates and therapeutic uses thereof
CN110818793A (zh) * 2018-08-14 2020-02-21 中山康方生物医药有限公司 抗IL-1β的抗体、其药物组合物及其用途
WO2020039401A1 (en) 2018-08-24 2020-02-27 Novartis Ag Treatment comprising il-1βeta binding antibodies and combinations thereof
WO2020106757A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
WO2020128613A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Novartis Ag Use of il-1beta binding antibodies
EP4073115A1 (en) 2019-12-09 2022-10-19 Novartis AG Anti-interleukin 1 beta antibodies for treatment of sickle cell disease
WO2021119482A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
WO2021123902A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novartis Ag Combination of anti tim-3 antibody mbg453 and anti tgf-beta antibody nis793, with or without decitabine or the anti pd-1 antibody spartalizumab, for treating myelofibrosis and myelodysplastic syndrome
TWI793503B (zh) * 2020-01-20 2023-02-21 美商美國禮來大藥廠 抗IL-1β抗體
EP4093430A4 (en) * 2020-01-21 2024-01-24 Tavotek Biotherapeutics (Hong Kong) Limited AGENTS THAT INTERFERE WITH IL-1 RECEPTOR SIGNALING?
WO2022167916A1 (en) 2021-02-03 2022-08-11 Novartis Ag Use of il-1b binding antibodies for treating neuroinflammatory disorders
CN114524875B (zh) * 2021-11-11 2023-07-25 江苏莱森生物科技研究院有限公司 偶联IL-1β单克隆抗体的纳米硅球及应用

Family Cites Families (152)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US493543A (en) * 1893-03-14 Lap-ring
US3887699A (en) 1969-03-24 1975-06-03 Seymour Yolles Biodegradable polymeric article for dispensing drugs
US3854480A (en) 1969-04-01 1974-12-17 Alza Corp Drug-delivery system
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
EP0052322B1 (de) 1980-11-10 1985-03-27 Gersonde, Klaus, Prof. Dr. Verfahren zur Herstellung von Lipid-Vesikeln durch Ultraschallbehandlung, Anwendung des Verfahrens und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
US4675189A (en) 1980-11-18 1987-06-23 Syntex (U.S.A.) Inc. Microencapsulation of water soluble active polypeptides
PH19942A (en) 1980-11-18 1986-08-14 Sintex Inc Microencapsulation of water soluble polypeptides
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
JPS58118008A (ja) 1982-01-06 1983-07-13 Nec Corp デ−タ処理装置
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
DE3218121A1 (de) 1982-05-14 1983-11-17 Leskovar, Peter, Dr.-Ing., 8000 München Arzneimittel zur tumorbehandlung
EP0102324A3 (de) 1982-07-29 1984-11-07 Ciba-Geigy Ag Lipide und Tenside in wässriger Phase
US4452775A (en) 1982-12-03 1984-06-05 Syntex (U.S.A.) Inc. Cholesterol matrix delivery system for sustained release of macromolecules
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
EP0142641B1 (de) 1983-09-26 1991-01-16 Udo Dr. Ehrenfeld Mittel und Erzeugnis für die Diagnose und Therapie von Tumoren sowie zur Behandlung von Schwächen der zelligen und humoralen Immunabwehr
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
DE3413608A1 (de) 1984-04-11 1985-10-24 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Implantierbare zubereitungen von regulatorischen peptiden mit gesteuerter freisetzung und verfahren zu ihrer herstellung
EP0161901B1 (en) 1984-05-18 1993-12-01 New England Medical Center Hospitals, Inc. Human il-1 cDNA sequences encoding biologically-active human il-1 proteins
US4762914A (en) * 1984-05-18 1988-08-09 Auron Philip E Truncated protein of interleukin-1
US5077219A (en) * 1984-05-18 1991-12-31 New England Medical Center Hospitals Human IL-1 cDNA sequences encoding biologically-active human IL-1 proteins
EP0569687B1 (en) * 1984-05-18 2002-08-21 New England Medical Center Hospitals, Inc. Human IL-1 cDNA sequences encoding biologically-active human IL-1 proteins
US5484887A (en) * 1984-06-19 1996-01-16 Immunex Corporation Homogeneous interleukin 1
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US5122459A (en) * 1984-12-31 1992-06-16 Immunex Corporation Gene encoding biologically active human interleukin 1
US4772685A (en) * 1985-10-02 1988-09-20 Merck & Co., Inc. Immunogenic peptides of human interleukin-1 and the corresponding anti-peptide antibodies
US4935343A (en) * 1986-08-08 1990-06-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Monoclonal antibodies for interleukin-1β
DK590387A (da) 1986-11-13 1988-05-14 Otsuka Pharma Co Ltd Antistoffer mod interleukin-1
US5474899A (en) * 1987-05-13 1995-12-12 Cistron Biotechnology, Inc. Selective immunoassay for IL-1 β
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5158881A (en) 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US5106627A (en) 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US5077218A (en) * 1988-05-05 1991-12-31 Oregon Lions Sight And Hearing Foundation Inc. Eye transport apparatus
US5011472A (en) 1988-09-06 1991-04-30 Brown University Research Foundation Implantable delivery system for biological factors
DE68925935T2 (de) * 1988-10-01 1996-08-14 Otsuka Pharma Co Ltd Antikörper gegen Interleukin-1-beta
IL162181A (en) * 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
ES2113856T3 (es) * 1989-02-27 1998-05-16 New England Medical Center Inc Inhibidores de actividad biologica de il-1.
US5133974A (en) 1989-05-05 1992-07-28 Kv Pharmaceutical Company Extended release pharmaceutical formulations
WO1990014363A1 (en) 1989-05-19 1990-11-29 Amgen Inc. Metalloproteinase inhibitor
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5612205A (en) 1990-08-29 1997-03-18 Genpharm International, Incorporated Homologous recombination in mammalian cells
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
IT1247472B (it) 1991-05-31 1994-12-17 Fidia Spa Processo per la preparazione di microsfere contenenti componenti biologicamente attivi.
MX9204374A (es) * 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
EP1136556B1 (en) 1991-11-25 2005-06-08 Enzon, Inc. Method of producing multivalent antigen-binding proteins
US5407686A (en) 1991-11-27 1995-04-18 Sidmak Laboratories, Inc. Sustained release composition for oral administration of active ingredient
PT1024191E (pt) * 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
CA2103887C (en) 1991-12-13 2005-08-30 Gary M. Studnicka Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
WO1993015722A1 (en) 1992-02-07 1993-08-19 Syntex (Usa) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous microparticles
WO1994000470A1 (en) * 1992-06-30 1994-01-06 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology DEVELOPMENTAL EMBRYONIC MOUSE cDNA LIBRARIES
US6664114B1 (en) 1992-08-03 2003-12-16 Sapidyne Instruments, Inc. Solid phase assay for detection of ligands
ES2151541T3 (es) 1992-12-02 2001-01-01 Alkermes Inc Microesferas que contienen hormona del crecimiento de liberacion prolongada.
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
WO1995001997A1 (en) 1993-07-09 1995-01-19 Smithkline Beecham Corporation RECOMBINANT AND HUMANIZED IL-1β ANTIBODIES FOR TREATMENT OF IL-1 MEDIATED INFLAMMATORY DISORDERS IN MAN
US5959085A (en) * 1993-11-23 1999-09-28 Schering Corporation Human monoclonal antibodies against human cytokines and methods of making and using such antibodies
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US6395547B1 (en) 1994-02-17 2002-05-28 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US6165793A (en) 1996-03-25 2000-12-26 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US6372716B1 (en) 1994-04-26 2002-04-16 Genetics Institute, Inc. Formulations for factor IX
PT779806E (pt) 1994-09-09 2001-02-28 Takeda Chemical Industries Ltd Preparacao de libertacao sustentada contendo um sal metalico de um peptido
EP0787179A4 (en) * 1994-10-20 1999-05-19 Merck & Co Inc TRANSGENIC ANIMALS WITH INTERLEUKIN-1-g (b) DEFICIENCY
CZ298790B6 (cs) * 1994-10-21 2008-01-30 Kishimoto@Tadamitsu Farmaceutický prípravek pro prevenci nebo lécení kachexie
ES2170853T3 (es) 1995-03-28 2002-08-16 Fidia Advanced Biopolymers Srl Nanosferas que comprenden un polisacarido biocompatible.
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
US5817476A (en) 1995-06-07 1998-10-06 Genetics Institute, Inc. Polynucleotides encoding interleukin-1 receptor intracellular ligand proteins
EP0831787B1 (en) 1995-06-07 2001-08-22 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition for sustained release of human growth hormone
ZA965368B (en) 1995-07-14 1997-01-14 Novo Nordisk As A pharmaceutical formulation
US6030779A (en) 1995-07-18 2000-02-29 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
US6004788A (en) 1995-07-18 1999-12-21 Diversa Corporation Enzyme kits and libraries
US6455254B1 (en) 1995-07-18 2002-09-24 Diversa Corporation Sequence based screening
US6168919B1 (en) 1996-07-17 2001-01-02 Diversa Corporation Screening methods for enzymes and enzyme kits
US5958672A (en) 1995-07-18 1999-09-28 Diversa Corporation Protein activity screening of clones having DNA from uncultivated microorganisms
US6057103A (en) 1995-07-18 2000-05-02 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
US6685940B2 (en) 1995-07-27 2004-02-03 Genentech, Inc. Protein formulation
US5736152A (en) 1995-10-27 1998-04-07 Atrix Laboratories, Inc. Non-polymeric sustained release delivery system
US5965408A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Diversa Corporation Method of DNA reassembly by interrupting synthesis
US6171820B1 (en) 1995-12-07 2001-01-09 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US20030215798A1 (en) 1997-06-16 2003-11-20 Diversa Corporation High throughput fluorescence-based screening for novel enzymes
US5939250A (en) 1995-12-07 1999-08-17 Diversa Corporation Production of enzymes having desired activities by mutagenesis
US6713279B1 (en) 1995-12-07 2004-03-30 Diversa Corporation Non-stochastic generation of genetic vaccines and enzymes
US6562594B1 (en) 1999-09-29 2003-05-13 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US6479258B1 (en) 1995-12-07 2002-11-12 Diversa Corporation Non-stochastic generation of genetic vaccines
US6537776B1 (en) 1999-06-14 2003-03-25 Diversa Corporation Synthetic ligation reassembly in directed evolution
US6358709B1 (en) 1995-12-07 2002-03-19 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6238884B1 (en) 1995-12-07 2001-05-29 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6740506B2 (en) 1995-12-07 2004-05-25 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6489145B1 (en) 1996-07-09 2002-12-03 Diversa Corporation Method of DNA shuffling
US6764835B2 (en) 1995-12-07 2004-07-20 Diversa Corporation Saturation mutageneis in directed evolution
US6352842B1 (en) 1995-12-07 2002-03-05 Diversa Corporation Exonucease-mediated gene assembly in directed evolution
US6361974B1 (en) 1995-12-07 2002-03-26 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
US6344328B1 (en) 1995-12-07 2002-02-05 Diversa Corporation Method for screening for enzyme activity
US6368798B1 (en) 1995-12-07 2002-04-09 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
US5830696A (en) 1996-12-05 1998-11-03 Diversa Corporation Directed evolution of thermophilic enzymes
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
US5763239A (en) 1996-06-18 1998-06-09 Diversa Corporation Production and use of normalized DNA libraries
US5770380A (en) 1996-09-13 1998-06-23 University Of Pittsburgh Synthetic antibody mimics--multiple peptide loops attached to a molecular scaffold
DE69633463T2 (de) * 1996-10-31 2006-02-23 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Ice inhibierende peptide
CA2287254A1 (en) * 1997-04-21 1998-10-29 Schering Corporation Mammalian cytokines; related reagents and methods
WO1999065927A2 (en) 1998-06-17 1999-12-23 Maxygen, Inc. Method for producing polynucleotides with desired properties
US6365408B1 (en) 1998-06-19 2002-04-02 Maxygen, Inc. Methods of evolving a polynucleotides by mutagenesis and recombination
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6368861B1 (en) 1999-01-19 2002-04-09 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US6376246B1 (en) 1999-02-05 2002-04-23 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
AU3719500A (en) 1999-03-05 2000-09-21 Maxygen, Inc. Recombination of insertion modified nucleic acids
US6566329B1 (en) 1999-06-28 2003-05-20 Novo Nordisk A/S Freeze-dried preparation of human growth hormone
US6475220B1 (en) 1999-10-15 2002-11-05 Whiteside Biomechanics, Inc. Spinal cable system
GB0001448D0 (en) * 2000-01-21 2000-03-08 Novartis Ag Organic compounds
EP1282435A2 (en) * 2000-05-12 2003-02-12 Immunex Corporation Interleukin-1 inhibitors in the treatment of diseases
GB0020685D0 (en) * 2000-08-22 2000-10-11 Novartis Ag Organic compounds
US20030026806A1 (en) * 2000-10-27 2003-02-06 Amgen Inc. Antibodies and other selective IL-1 binding agents that allow binding to IL-1 receptor but not activation thereof
US20030166069A1 (en) 2000-11-28 2003-09-04 Amgen, Inc. Interleukin-1 receptor antagonist-like molecules and uses thereof
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US6864047B2 (en) * 2001-03-29 2005-03-08 Mayo Foundation For Medical Education And Research IL1-β: a new target for myeloma therapy
US6727234B2 (en) 2001-04-03 2004-04-27 University Of Iowa Research Foundation Isoprenoid analog compounds and methods of making and use thereof
US20050075488A1 (en) * 2001-07-26 2005-04-07 Bright Stuart Willis Interleukin-1 beta antibodies
JP4213586B2 (ja) 2001-09-13 2009-01-21 株式会社抗体研究所 ラクダ抗体ライブラリーの作製方法
CA2842429A1 (en) 2001-10-19 2003-05-01 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of inflammatory bowel disorders
US6673552B2 (en) 2002-01-14 2004-01-06 Diversa Corporation Methods for purifying annealed double-stranded oligonucleotides lacking base pair mismatches or nucleotide gaps
US20050070692A1 (en) 2002-02-28 2005-03-31 Beals John Michael Anti-interleukin-1 beta analogs
US7572770B2 (en) 2002-06-27 2009-08-11 University Of Zurich Use of an interleukin 1 receptor antagonist and/or pyrrolidinedithiocarbamate for the treatment or prophylaxis of type 2 diabetes
EP1531757B1 (en) 2002-07-19 2016-09-07 Omeros Corporation Biodegradable triblock copolymers, synthesis methods therefor, and hydrogels and biomaterials made there from
NZ605429A (en) 2002-09-06 2014-08-29 Amgen Inc Therapeutic human anti-il-1r1 monoclonal antibody
WO2004039834A2 (en) 2002-11-01 2004-05-13 Alk-Abelló A/S Recombinant protein variants
WO2004067568A2 (en) * 2003-01-24 2004-08-12 Applied Molecular Evolution, Inc Human il-1 beta antagonists
GB0303337D0 (en) 2003-02-13 2003-03-19 Celltech R&D Ltd Biological products
US20040266993A1 (en) 2003-06-30 2004-12-30 Evans Glen A. Non-immunoglobulin binding polypeptides
US20050159590A1 (en) 2003-08-25 2005-07-21 Galit Rotman Variants of interleukin-1 receptor antagonist: compositions and uses thereof
US20050152850A1 (en) * 2004-01-09 2005-07-14 Engebretson Steven P. Methods and compositions for facilitating metabolic control
US7732478B2 (en) * 2004-01-09 2010-06-08 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for facilitating metabolic control
WO2005084696A1 (en) 2004-03-08 2005-09-15 Universita'degli Studi Di Milano Methods and agents for controlling intestinal inflammation and mucosal immunity using agents interacting with tir8/sigirr
EP1576952A1 (en) 2004-03-18 2005-09-21 OctoPlus Technologies B.V. Hydrogel microspheres with improved release profile
US8618054B2 (en) * 2004-05-05 2013-12-31 Valorisation-Rechereche Société en Commandite Interleukin-1 receptor antagonists, compositions, and methods of treatment
WO2006081139A2 (en) 2005-01-26 2006-08-03 Abgenix, Inc. Antibodies against interleukin-1 beta
PT2314623E (pt) 2005-06-21 2012-10-02 Xoma Technology Ltd Anticorpos de ligação a il-1β e os seus fragmentos
FR2895611B1 (fr) 2005-12-23 2008-02-22 Thales Sa Architecture et procede pour controler le transfert d'informations entre utilisateurs
US8479265B2 (en) * 2008-07-02 2013-07-02 Oracle International Corporation Usage based authorization

Also Published As

Publication number Publication date
US20140004125A1 (en) 2014-01-02
EP2163562A3 (en) 2010-10-20
DK2314623T3 (da) 2012-09-17
US20080044414A1 (en) 2008-02-21
IL188094A0 (en) 2008-03-20
CN101228188A (zh) 2008-07-23
US20090214568A1 (en) 2009-08-27
DK2322552T3 (en) 2016-04-25
US7988968B2 (en) 2011-08-02
RU2518295C2 (ru) 2014-06-10
US7531166B2 (en) 2009-05-12
AU2006262179B2 (en) 2011-05-12
ES2827247T3 (es) 2021-05-20
CN102775493B (zh) 2015-10-28
KR20140139618A (ko) 2014-12-05
HK1158218A1 (zh) 2012-07-13
ES2569917T3 (es) 2016-05-13
EP2322552A3 (en) 2011-07-20
JP2011254835A (ja) 2011-12-22
CY1113153T1 (el) 2016-04-13
NZ565138A (en) 2012-02-24
PL2163562T3 (pl) 2014-03-31
EP2322552B1 (en) 2016-02-10
MX2007016032A (es) 2008-03-10
DK2163562T3 (da) 2013-12-09
US7744865B2 (en) 2010-06-29
US20090060918A1 (en) 2009-03-05
CA2612760C (en) 2015-05-12
AU2006262179A1 (en) 2007-01-04
US7829093B2 (en) 2010-11-09
PT2314623E (pt) 2012-10-02
MX348154B (es) 2017-05-30
US20090246210A1 (en) 2009-10-01
EP2322552A2 (en) 2011-05-18
PL2314623T3 (pl) 2012-11-30
BRPI0612273B8 (pt) 2020-01-14
HK1157351A1 (en) 2012-06-29
SI2163562T1 (sl) 2014-01-31
HUE029021T2 (en) 2017-02-28
ZA200800555B (en) 2009-09-30
EP3056511A2 (en) 2016-08-17
US7943121B2 (en) 2011-05-17
EP3056511A3 (en) 2016-11-23
CN102775493A (zh) 2012-11-14
US7695717B2 (en) 2010-04-13
US20090060923A1 (en) 2009-03-05
ES2335232T3 (es) 2010-03-23
US20090226461A1 (en) 2009-09-10
BRPI0612273B1 (pt) 2019-02-05
ATE446972T1 (de) 2009-11-15
EP2314623B1 (en) 2012-07-04
US20120014967A1 (en) 2012-01-19
JP4931919B2 (ja) 2012-05-16
SI2314623T1 (sl) 2012-11-30
KR101502920B1 (ko) 2015-03-17
US8377442B2 (en) 2013-02-19
EP1899378A2 (en) 2008-03-19
WO2007002261A3 (en) 2007-07-12
HK1140781A1 (en) 2010-10-22
CY1114851T1 (el) 2016-12-14
US20100055110A1 (en) 2010-03-04
ES2439709T3 (es) 2014-01-24
DK1899378T3 (da) 2010-02-01
IL202630A (en) 2011-01-31
JP2008543340A (ja) 2008-12-04
EP1899378B1 (en) 2009-10-28
PL2322552T3 (pl) 2016-08-31
CA2873914A1 (en) 2007-01-04
BRPI0612273C1 (pt) 2021-05-25
US7829094B2 (en) 2010-11-09
BRPI0612273A2 (pt) 2009-01-27
SI2322552T1 (sl) 2016-07-29
CY1109715T1 (el) 2014-08-13
SI1899378T1 (sl) 2010-02-26
PT1899378E (pt) 2010-01-26
US20100061998A1 (en) 2010-03-11
RU2008102135A (ru) 2009-07-27
EP2163562B1 (en) 2013-09-18
EP3056511B1 (en) 2020-08-05
US7582742B2 (en) 2009-09-01
DE602006010072D1 (de) 2009-12-10
KR101366450B1 (ko) 2014-03-14
PT2163562E (pt) 2013-12-19
KR20080039875A (ko) 2008-05-07
US20090214545A1 (en) 2009-08-27
EP2163562A2 (en) 2010-03-17
WO2007002261A2 (en) 2007-01-04
KR20130076901A (ko) 2013-07-08
CA2612760A1 (en) 2007-01-04
IL188094A (en) 2011-01-31
US7744866B2 (en) 2010-06-29
PL1899378T3 (pl) 2011-03-31
US9206252B2 (en) 2015-12-08
EP2314623A1 (en) 2011-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2391334T3 (es) Anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a la IL-1beta
AU2011205166A1 (en) IL-1beta, binding antibodies and fragments thereof