PT2314623E

PT2314623E - Anticorpos de ligação a il-1β e os seus fragmentos

Info

Publication number: PT2314623E
Application number: PT10179088T
Authority: PT
Inventors: Linda Masat; Mary Haak-Frendscho; Gang Chen; Arnold Horwitz; Marina Roell
Original assignee: Xoma Technology Ltd
Priority date: 2005-06-21
Filing date: 2006-06-21
Publication date: 2012-10-02
Also published as: KR20130076901A; EP1899378A2; EP1899378B1; PL2314623T3; US20140004125A1; EP2163562A2; US7744865B2; KR20140139618A; EP2163562B1; EP3056511B1; CY1114851T1; MX2007016032A; EP2322552A2; EP2163562A3; CA2612760C; DK2314623T3; US20090060923A1; JP4931919B2; US7943121B2; JP2011254835A

Description

DESCRIÇÃO

ANTICORPOS DE LIGAÇÃO A IL-Ιβ E OS SEUS FRAGMENTOS

DOMÍNIO DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto anticorpos de ligação a IL-Ιβ incluindo os seus fragmentos e ácidos nucleicos que codificam esses anticorpos, assim como vectores, células e composições que compreendem os anticorpos ou os ácidos nucleicos e as respectivas utilizações.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A familia das citocinas a que pertence a interleucina-1 (IL-1) tem sido implicada em estados de doença, tais como artrite reumatóide (AR), osteoartrite, doença de Crohn, colite ulcerosa (CU), choque séptico, doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), asma, doença do hospedeiro versus o enxerto, aterosclerose, leucemia das células T do adulto, mieloma múltiplo, esclerose múltipla, acidente vascular e doença de Alzheimer. Os elementos da familia de IL-1 incluem IL-la, IL-Ιβ e IL-lRa. Embora relacionados pela sua capacidade para se ligarem aos receptores de IL-1 (IL-1R1 e IL-1R2) , cada uma destas citocinas é expressa por um gene diferente e tem uma sequência primária de aminoácidos diferente. Além disso, podem distinguir-se as actividades fisiológicas destas citocinas.

Os compostos que interrompem a sinalização do receptor de IL-1 já foram investigados como agentes terapêuticos para tratar doenças mediadas por IL-1. Estes compostos incluem IL-lRa recombinante (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) e o péptido que "retém" o receptor de IL-1 (Regeneron Inc., Tarrytown, 1 ΝΥ) . Os anticorpos monoclonais derivados de animais que se ligam às citocinas IL-1 também já foram investigados. Contudo, o seu valor clinico pode ser limitado devido à sua imunogeneicidade. Por exemplo, seres humanos a que se administrou anticorpos monoclonais de murganhos produziram anticorpos humanos anti-murganho (HAMA). Os HAMA têm sido referidos por reduzirem a eficácia da terapêutica com anticorpos monoclonais e por produzirem reacções adversas, incluindo lesões no rim. Outros anticorpos de IL-Ιβ podem estar limitados pela sua afinidade de ligação e/ou pela sua potência. De acordo com isto, são necessários outros compostos que interrompam a sinalização do receptor de IL-1. A presente invenção tem por objecto esses compostos, assim como os processos para a preparação e a utilização desses compostos.

BREVE SUMÁRIO A presente invenção tem por objecto um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um fragmento desse anticorpo de ligação a IL-Ιβ em que o referido anticorpo ou o referido fragmento se ligam a uma IL-Ιβ humana com uma constante de dissociação inferior a 1 pM, seleccionado no grupo que consiste em: • uma região variável de cadeia leve que compreende a

sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 9 ou da SEQ ID N°. 9 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 8 ou da SEQ ID N°. 8 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos; • uma região variável de cadeia leve que compreende a

sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 10 ou da SEQ ID 2 Ν°. 10 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 14 ou da SEQ ID N°. 14 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos; • uma região variável de cadeia leve que compreende a

sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 11 ou da SEQ ID N°. 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 15 ou da SEQ ID N°. 15 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos; • uma região variável de cadeia leve que compreende a

sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 10 ou da SEQ ID N°. 10 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 25 ou da SEQ ID N°. 25 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos; • uma região variável de cadeia leve que compreende a

sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 11 ou da SEQ ID N°. 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 26 ou da SEQ ID N°. 26 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos.

Também tem por objecto um ácido nucleico que codifica o anticorpo ou o fragmento do anticorpo, assim como um vector que compreende o ácido nucleico, uma célula que compreende o 3 ácido nucleico ou o vector e uma composição que compreende o anticorpo, o ácido nucleico ou o vector.

Neste contexto, descreve-se um processo de tratamento ou de prevenção de uma doença num mamífero que compreende a administração, de uma quantidade eficaz de um anticorpo ou de um fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vector da presente invenção, a um mamífero que dele necessite, sendo assim tratada ou prevenida uma doença nesse mamífero.

No contexto da presente invenção descreve-se um processo de preparação de um polipéptido de ligação a IL-Ιβ desenvolvido por afinidade, compreendendo (a) providenciar um primeiro ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipéptido de ligação a IL-Ιβ que compreende a sequência de aminoácidos de uma qualquer das SEQ ID N°s. 1-26 e um segundo ácido nucleico que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que difere da primeira sequência de ácidos nucleicos por pelo menos um nucleótido, (b) realizar o arrastamento dos ácidos nucleicos para providenciar dois ou mais ácidos nucleicos mutados, (c) seleccionar um ácido nucleico mutado que codifica um polipéptido que (i) se liga a IL-Ιβ com uma afinidade maior do que o polipéptido codificado pelo primeiro ácido nucleico, (ii) tem uma selectividade para IL-Ιβ, em relação a IL-la, que é superior à do polipéptido codificado pelo primeiro ácido nucleico, (iii) tem uma constante de dissociação da ligação em equilíbrio (KD) para IL-Ιβ que é inferior à do polipéptido codificado pelo primeiro ácido nucleico ou (iv) inibe a expressão induzida por IL-Ιβ, de IL-6 no soro, num animal, em maior grau do que o polipéptido codificado pelo primeiro ácido nucleico e (d) expressar o ácido nucleico mutado seleccionado, em que se produz um polipéptido desenvolvido por afinidade de ligação a IL-Ιβ. 4 A presente invenção tem por objecto novos anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou os seus fragmentos de ligação a IL-Ιβ, que ligam IL-Ιβ humana com uma constante de dissociação inferior a 3 pM, alternativamente cerca de 2 pM ou menos, preferencialmente cerca de 1 pM ou menos. Esses anticorpos de elevada afinidade são considerados como sendo úteis para vários processos de tratamento ou de prevenção de doenças ou estados clinicos relacionados com IL-1. Além disso, os anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem ligar-se a um epitopo de IL-Ιβ de tal modo que o anticorpo ou o fragmento ligados não previnem significativamente a ligação de IL-Ιβ ao receptor de IL-1 do tipo 1. Além disso, os anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem ligar-se praticamente ao mesmo epitopo que um ou mais dos exemplos de anticorpos aqui descritos, tal como o anticorpo designado por AB7, que contém uma região variável de cadeia pesada. Adicionalmente, os anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem competir com a ligação de um anticorpo que tenha uma região variável de cadeia leve da SEQ ID N°. 11 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID N°. 15. Além disso, a presente invenção engloba anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou fragmentos de ligação a IL-Ιβ que se possam ligar-se a um epitopo contido na sequência ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE (SEQ ID N°. 36) . Exemplos de anticorpos de ligação a IL-Ιβ incluem o anticorpo designado aqui por AB7. A presente invenção também tem por objecto anticorpos de ligação a IL-1 ou os seus fragmentos que se ligam a IL-Ιβ com uma constante de dissociação inferior a 3 pM, alternativamente cerca de 1 pM ou menos e contendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° . 8, 14, 15, 25 ou 26 ou as SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 com uma ou mais substituições 5 conservadoras de aminoácidos. 0 anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou o fragmento de ligação a IL-Ιβ também podem conter uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 9, 10 ou 11 ou as SEQ ID N°. 9, 10 ou 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos.

No contexto da presente invenção, os anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou os seus fragmentos de ligação a IL-Ιβ, são descritos de forma que se ligam a IL-Ιβ com uma constante de dissociação entre cerca de 6 pM e cerca de 50 PM, alternativamente entre cerca de 13 pM e cerca de 25 pM, alternativamente cerca de 19 pM e em que o anticorpo < ou o fragmento têm uma Cl só inferior a 0,5 nM (500 pM) , alternativamente entre cerca de 5 pM e cerca de 200 pM, alternativamente entre cerca de 10 pM e cerca de 100 pM, alternativamente cerca de 30 pM, para a inibição da libertação, estimulada por IL-Ιβ, de IL-6, a partir de fibroblastos humanos. A CI5o para a inibição da libertação de IL-6, a partir de fibroblastos humanos, estimulada por IL-Ιβ, refere-se à concentração necessária para inibir 50 % da libertação de IL-6 de fibroblastos humanos, pela estimulação de IL-Ιβ. Exemplos de anticorpos incluem o anticorpo designado aqui por ABI.

No contexto da presente invenção, os anticorpos de ligação a IL-1 ou os seus fragmentos de ligação a IL-Ιβ são descritos como tendo uma constante de dissociação entre cerca de 6 e cerca de 50 pM e compreendem uma região variável de cadeia pesada contendo uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID N°s. 4, 5 ou 6, alternativamente uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID N°s. 4 ou 5, alternativamente a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 4. Considera-se que, em certas circunstâncias, pode ser desejável que um anticorpo 6 de ligação a IL-Ιβ ou um fragmento de ligação a IL-Ιβ tenham uma constante de dissociação relativamente mais elevada, por exemplo, para alguns processos de tratamento ou de prevenção de doenças ou estados clínicos relacionados com IL-1, em que é desejável um grau de afinidade relativamente mais baixo.

Os anticorpos descritos no contexto da presente invenção incluem os anticorpos designados por ABI, AB2, AB3, AB4, AB5, AB6, AB7, AB8 e AB9 com AB5, AB6, AB7, AB8 e AB9 que fazem parte da matéria da reivindicação 1. ABI compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 4 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 9. AB2 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 5 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 9. AB3 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 6 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 9. AB4 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 9. AB5 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 8 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 9. AB6 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 14 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 10. AB7 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 15 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7 11. ΑΒ8 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 25 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 10. AB9 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 26 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 11. A presente invenção engloba os anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ com uma região variável de cadeia pesada que compreende qualquer uma das sequências estabelecidas nas SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 ou as SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos. A presente invenção também engloba anticorpos de IL-Ιβ ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ com uma região variável de cadeia pesada que compreende uma qualquer das sequências estabelecidas nas SEQ ID N°. 9, 10 ou 11 ou as SEQ ID N°. 9, 10 ou 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos. A presente invenção também engloba anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou os fragmentos de ligação IL-Ιβ compreendendo uma das regiõeso variáveis de cadeia pesada das sequências estabelecidas nas SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 ou as SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos e a região variável de cadeia leve que compreende qualquer uma das sequências estabelecidas nas in SEQ ID N°. 9, 10 ou 11 ou as SEQ ID N°. 9, 10, ou 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos. A presente invenção também engloba os anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou fragmentos de ligação a IL-Ιβ que compreendem porções que não se ligam a IL-Ιβ mas, em vez disso, são responsáveis por outras funções, tais como o semi-período de vida em circulação, o efeito citotóxico directo, a marcação detectável ou a activação de uma cascata de complemento endógeno de um receptor ou a citotoxicidade celular endógena. Os anticorpos da presente invenção podem compreender toda ou uma parte de uma região constante de um anticorpo. A região constante pode ser seleccionada entre qualquer isotipo, incluindo IgA (por exemplo, IgAl ou IgA2), IgD, IgE, IgG (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4) ou IgM. Por exemplo, o anticorpo pode compreender uma região de IgG2. Para além de compreendem uma região constante ou, em vez dela, os anticorpos ou os fragmentos da presente invenção podem incluir um marcador de epitopo, um epitopo de um receptor de recuperação, uma parte de marcador para fins de diagnóstico ou purificação ou uma parte citotóxica tal como um radionuclideo ou uma toxina.

No contexto da presente invenção, descrevem-se composições farmacêuticas que compreendem qualquer um dos anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou dos fragmentos de ligação a IL-Ιβ e um veiculo, excipiente ou diluente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Preferencialmente, os anticorpos ou os compostos da presente invenção podem ser administrados numa quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico, isto é, uma quantidade suficiente para melhorar um sinal ou um sintoma clinico de um estado clinico ou de um distúrbio associado com a expressão da proteina-alvo, a um indivíduo que necessite desse tratamento. Numa modalidade relacionada, a composição farmacêutica ainda contém um segundo agente activo. Ainda noutra modalidade relacionada, a composição farmacêutica é providenciada de forma que o segundo agente 9 activo seja um anticorpo ou um antagonista de um factor de crescimento ou uma citocina. Noutra modalidade, o segundo agente activo é outro anticorpo.

No contexto da presente invenção, a utilização de anticorpos de IL-Ιβ ou de fragmentos de ligação a IL-Ιβ está descrita no fabrico de um medicamento para a prevenção ou a redução de um estado clinico ou de um distúrbio associado com IL-1. Em qualquer uma das utilizações, o medicamento pode ser coordenado com um tratamento utilizando um segundo agente activo. Noutra modalidade da presente invenção, considera-se a utilização de uma combinação sinérgica de um anticorpo da presente invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento de um doente que exibe sintomas de um estado clinico ou de um distúrbio relacionados com IL-1 aqui descritos, em que o medicamento é coordenado com um tratamento que utiliza um segundo agente activo. Numa modalidade relacionada, o segundo agente activo é um anticorpo ou um antagonista de citocina ou um factor de crescimento. Consideram-se modalidades de qualquer uma das utilizações mencionadas antes em que a quantidade de anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou de um fragmento de ligação a IL-Ιβ no medicamento se situa numa dose eficaz para reduzir a dose do segundo agente activo, necessária para se atingir um efeito terapêutico.

No contexto da presente invenção também se descrevem estojos (kits). Numa modalidade, um estojo compreende uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico ou profiláctico, de um composto ou de uma composição da presente invenção (tal como um anticorpo, fragmento, ácido nucleico, vector ou célula), embalada num recipiente, tal como num frasco ou numa garrafa e compreendendo ainda um rótulo afixado ou embalado com o recipiente, descrevendo esse rótulo 10 o conteúdo do recipiente e dando indicações e/ou instruções, tendo em vista a utilização do conteúdo do recipiente, para prevenir ou reduzir um estado clinico ou uma doença associados com a expressão da proteína-alvo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS VÁRIAS VISTAS DOS DESENHOS A fig. 1 representa um par de sequências de aminoácidos correspondente às cadeias leves e às cadeias pesadas da região variável de alguns dos anticorpos aqui descritos. As porções sublinhadas das sequências de aminoácidos indicam regiões de determinação de complementaridade (RDC). A fig. 2 representa um conjunto de sequências de aminoácidos que correspondem a regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada dos anticorpos ABI, AB2, AB3 e AB4. As porções sublinhadas das sequências de aminoácidos indicam regiões de determinação de complementaridade (RDC). A fig. 3 representa um conjunto de sequências de aminoácidos que correspondem a regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada dos anticorpos AB5, AB5.1 e AB5.2. As porções sublinhadas das sequências de aminoácidos indicam regiões de determinação de complementaridade (RDC). A fig. 4 representa um conjunto de sequências de aminoácidos que correspondem a regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada dos anticorpos AB5.3 e AB5.4. As porções sublinhadas das sequências de aminoácidos indicam regiões de determinação de complementaridade (RDC). A fig. 4A representa um conjunto de sequências de aminoácidos que correspondem a regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada dos anticorpos AB6 e AB7. As porções 11 sublinhadas das sequências de aminoácidos indicam regiões de determinação de complementaridade (RDC). A fig. 4B representa um conjunto de sequências de aminoácidos que correspondem a regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada dos anticorpos AB8 e AB9. As porções sublinhadas das sequências de aminoácidos indicam regiões de determinação de complementaridade (RDC). A fig. 5 representa um gráfico que mostra os resultados de uma experiência de estimulação, in vitro, de IL-Ιβ. A fig. 6 representa um histograma que mostra os resultados de uma experiência de estimulação, in vivo, de IL-1β. A fig. 7 representa um gráfico que mostra os resultados do ensaio de exclusão cinética para o anticorpo designado por ABI . A fig. 8 representa um gráfico que mostra os resultados do ensaio de exclusão cinética para o anticorpo designado por AB5. A fig. 9 representa um gráfico que mostra os resultados do ensaio de exclusão cinética para o anticorpo designado por AB7 . A fig. 10 representa um gráfico que mostra os resultados de uma experiência de estimulação, in vivo, de IL-Ιβ, para os anticorpos designados por ABI, AB2 e AB3. 12 A fig. 11 representa um gráfico que mostra os resultados de uma experiência de estimulação, in vivo, de IL-Ιβ, para os anticorpos designados por ABI e AB7. A fig. 12 representa um gráfico que mostra os resultados de uma experiência de estimulação, in vivo, de IL-Ιβ, para os anticorpos designados por AB5 e AB7, assim como para Kineret®.

Fig. 13 representa um histograma que mostra os resultados de uma experiência de estimulação, in vivo, de IL-Ιβ, para os anticorpos designados por AB5 e ABI. A fig. 14 representa um histograma que mostra os resultados de uma experiência de estimulação, in vivo, de IL-Ιβ, para os anticorpos designados por AB5 e AB7. A fig. 15 representa uma análise de Western blot que mostra os resultados de experiências de reticulação para o anticorpo designado por AB7 com IL-Ιβ de macacos cinomolgos e macacos rhesus. A fig. 16 representa uma análise de "Western blot" que mostra os resultados de experiências de reticulação para o anticorpo designado por AB7 com IL-Ιβ de cães, porquinhos-da-índia, porcos e coelhos. A fig. 17 representa uma análise de "Western blot" que mostra os resultados de experiências de reticulação para o anticorpo designado por AB7 com IL-Ιβ recombinante de seres humanos, murganhos e ratos. A fig. 18 representa um gráfico que mostra os resultados de uma experiência, in vitro, para o anticorpo designado por 13 ΑΒ7 e para Kineret®, envolvendo a produção de IL-8 induzida por IL-1. A fig. 19 representa um gráfico que mostra os resultados de um ensaio para examinar se os anticorpos da presente invenção evitam que IL-Ιβ se ligue ao receptor de IL-1 do tipo I. A fig. 20 é uma ilustração de um ensaio para examinar se os anticorpos da presente invenção evitam a ligação IL-Ιβ ao receptor de IL-1 do tipo I.

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção engloba novos anticorpos e fragmentos de IL-Ιβ com a afinidade e a potência desejáveis. Num dos aspectos da presente invenção providenciam-se anticorpos de ligação a IL-Ιβ que têm uma afinidade inesperadamente elevada e constantes de dissociação baixas (por exemplo, inferiores a 3 pM, alternativamente cerca de 1 pM ou menos) comparadas com as dos anticorpos conhecidos de ligação a IL-Ιβ. Exemplos de anticorpos incluem os anticorpos designados aqui por AB5 e AB7. A presente invenção também engloba anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou fragmentos de ligação a IL-Ιβ que se ligam selectivamente a IL-Ιβ, em que se ligam a IL-Ιβ com uma afinidade maior do que outros antigénios. Os anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem ligar-se selectivamente a IL-Ιβ humana, mas também se ligam, de forma detectável, a IL-Ιβ não humana. Alternativamente ou adicionalmente, os anticorpos ou os fragmentos podem ligar-se a IL-Ιβ humana e a IL-Ιβ de pelo menos um outro mamifero (um primeiro mamifero) e não se ligarem a IL-Ιβ de pelo menos um 14 outro mamífero (um segundo mamífero). Por exemplo, os anticorpos ou os fragmentos podem ligar-se a uma ou mais IL-Ιβ de roedores, IL-Ιβ de primatas, IL-Ιβ de cães e IL-Ιβ de coelhos e/ou não se ligarem a IL-Ιβ de porquinhos-da-índia. Alternativamente ou adicionalmente, os anticorpos ou os fragmentos podem ligar-se a IL-Ιβ de murganho com uma afinidade maior do que a IL-Ιβ de rato. Alternativamente ou adicionalmente, os anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem ter a mesma potência ou praticamente a mesma potência contra IL-Ιβ de seres humanos e IL-Ιβ de primatas. Alternativamente ou adicionalmente, os anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem ter a mesma potência ou praticamente a mesma potência contra IL-Ιβ recombinante de seres humanos e IL-Ιβ endógena de seres humanos. Alternativamente ou adicionalmente, os anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem neutralizar IL-Ιβ de murganhos.

Tal como se utiliza aqui, um anticorpo ou um fragmento que se liga especificamente a um antigénio-alvo refere-se a um anticorpo que se liga ao antigénio-alvo com uma afinidade maior do que antigénios similares. Por exemplo, um anticorpo ou um fragmento é específico do seu antigénio cognato quando as regiões variáveis do anticorpo ou do fragmento reconhecem ou se ligam ao antigénio cognato com uma preferência detectável (distinguindo o antigénio de outros polipéptidos conhecidos da mesma família, em virtude das diferenças mensuráveis da afinidade de ligação, apesar da possível existência de identidade, homologia ou semelhança de sequências localizadas entre elementos da família). Deve entender-se que anticorpos e fragmentos específicos podem também interagir com outras proteínas (por exemplo, proteína A de S. aureus ou outros anticorpos, em técnicas de ELISA) 15 através de interacções com sequências externas à região variável dos anticorpos e, em particular, na região constante do anticorpo ou do fragmento. Ensaios de rastreio para determinar a especificidade de ligação de um anticorpo são bem conhecidos e são praticados por rotina nesta técnica. Para uma discussão elucidativa desses ensaios ver Harlow et al. (Eds), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), capitulo 6.

Um dos aspectos da presente invenção engloba anticorpos de ligação a IL-Ιβ e os seus fragmentos de ligação a IL-Ιβ que têm constante de dissociação (KD) inesperadamente baixas, por exemplo, inferiores a 3 pM, alternativamente 2 pM ou menos, alternativamente 1 pM ou menos, alternativamente 0,8 pM ou menos, alternativamente 0,74 pM ou menos, alternativamente 0,72 pM ou menos, alternativamente 0,7 pM ou menos, alternativamente 0,6 pM ou menos, alternativamente 0,56 pM ou menos, alternativamente 0,5 pM ou menos, alternativamente 0,3 pM ou menos, alternativamente 0,26 pM ou menos, alternativamente 0,24 pM ou menos, alternativamente 0,2 pM ou menos. Assim, nalgumas modalidades da presente invenção, os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem ser descritos com referência a uma extremidade elevada de uma gama de constantes de dissociação. Adicionalmente ou alternativamente, nalgumas modalidades da presente invenção, os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem ser descritos com referência à extremidade menor de uma gama de constantes de dissociação, tal como, por exemplo, um anticorpo ou um fragmento com uma constante de dissociação de 0,07 pM ou superior, alternativamente 0,1 pM ou superior, alternativamente 0,11 pM ou superior, alternativamente 0,15 pM ou superior, alternativamente 0,2 pM ou superior, alternativamente 0,24 pM ou superior, alternativamente 0,26 pM ou superior, alternativamente 0,3 pM ou superior, 16 alternativamente 0,5 pM ou superior, alternativamente 0,7 pM ou superior. Qualquer constante de dissociação mais elevada e qualquer constante de dissociação mais baixa, tal como especificado antes, pode ser combinada para definir um intervalo de constantes de dissociação, desde que o valor mais baixo seleccionado seja iqual ou menor do que o valor mais alto seleccionado.

Os anticorpos e fragmentos da presente invenção ligam-se a IL-Ιβ com elevada afinidade, conforme indicado pelas constantes de dissociação indicadas aqui. As constantes de afinidade que caracterizam as afinidades dos anticorpos com os antigénios podem ser constantes de dissociação medidas pela cinética da formação de complexos de antigénio-anticorpo. Alternativamente, a afinidade de ligação pode ser caracterizada por uma constante de dissociação que é o inverso da constante de associação. O termo KD, tal como se utiliza aqui, entende-se que se refere à constante de dissociação de uma interacção de anticorpo-antigénio. A presente invenção também engloba anticorpos de neutralização ou os seus fragmentos de neutralização que se ligam a IL-Ιβ para neutralizar a actividade biológica da IL-1β. A neutralização da actividade biológica de IL-Ιβ pode ser avaliada por ensaios para um ou mais indicadores da actividade biológica de IL-Ιβ, tal como a libertação de IL-6 de fibroblastos humanos ou de outras células, estimulada por IL-Ιβ, a libertação de IL-8 de células sanguíneas induzida por IL-Ιβ ou a proliferação de células T auxiliares induzida por IL-1. Preferencialmente, os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ da presente invenção neutralizam a actividade biológica de IL-Ιβ ligada à função de sinalização do receptor de IL-1 do tipo I (IL-1RI) ligado por IL-Ιβ. 17

Em geral, os anticorpos de neutralização e os fragmentos de neutralização da presente invenção podem neutralizar a actividade biológica de IL-Ιβ, independentemente da ligação de IL-Ιβ ao receptor de IL-1 do tipo I estar bloqueada. Mais preferencialmente, os anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ neutralizam a actividade biológica de IL-Ιβ por meio da ligação a IL-Ιβ, sem evitarem praticamente a ligação da IL-Ιβ ligada ao receptor de IL-1 do tipo I. Uma vantagem potencial desses anticorpos e fragmentos é que eles podem ligar-se e neutralizar IL-Ιβ ao mesmo tempo que permitem ainda que IL-Ιβ se ligue a IL-1RI. Isto pode resultar numa redução efectiva da actividade biológica de IL-lcx assim como da actividade biológica de IL-Ιβ, dado que há menos sitios de IL-1RI não ligados para a ligação de IL-la. Assim, os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ da presente invenção são úteis em processos em que é desejável neutralizar a actividade biológica de IL-1 in vitro e in vi vo.

Os anticorpos ou os fragmentos da presente invenção podem ser anticorpos ou fragmentos de neutralização que se ligam especificamente ao epítopo de IL-Ιβ que afecta a actividade biológica de IL-Ιβ. Os anticorpos ou os fragmentos da presente invenção podem ligar-se a um epitopo de IL-Ιβ sensível à neutralização. Quando um epítopo de IL-Ιβ sensível à neutralização está ligado por um dos anticorpos ou fragmentos da presente invenção, o resultado é uma perda da actividade biológica da IL-Ιβ que contém o epítopo.

Nalgumas modalidades, os anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem ter uma CI5o para a inibição da libertação de IL-Ιβ de células sanguíneas, estimulada por IL-Ιβ que é inferior a 50 pM, alternativamente cerca de 25 pM ou menos, alternativamente cerca de 10 pM ou 18 menos, alternativamente cerca de 2 pM ou menos. A CI50 para a inibição da libertação de IL-Ιβ de células sanguíneas, estimulada por IL-Ιβ, refere-se à concentração necessária para inibir 50 % da libertação de IL-8 de células sanguíneas estimulada por IL-Ιβ. Exemplos de anticorpos incluem o anticorpo designado aqui por AB7. A presente invenção também descreve um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um seu fragmento de ligação a IL-Ιβ compreendendo uma sequência de aminoácidos alterada, em que o aminoácido alterado tem uma ou pelo menos uma substituição, adição ou eliminação,o numa sequência de aminoácidos inicial, de região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 9, 10, ou 11 ou das SEQ ID N°. 9, 10, ou 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos ou de uma sequência inicial de aminoácidos da região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 ou das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos, em que o anticorpo ou o fragmento alterado têm a mesma ou praticamente a mesma afinidade e especificidade de ligação do epítopo que a sequência inicial de aminoácidos. Considera-se que se pode fazer uma ou mais substituições, eliminações ou adições aos anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ aqui providenciados, compreendendo esses anticorpos ou fragmentos uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 9, 10, ou 11 ou das SEQ ID N°. 9, 10, ou 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos e região de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 ou das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos, embora mantendo a mesma ou praticamente afinidade e 19 especificidade de ligação do epítopo do anticorpo ou fragmento inicial. Por exemplo, a presente invenção engloba um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um seu fragmento de ligação a IL-Ιβ, que compreende uma sequência de aminoácidos alterada, em que os aminoácidos alterados têm uma ou pelo menos uma substituição, adição ou eliminação em relação a uma sequência de aminoácidos inicial compreendendo a SEQ ID N° . 9, 10 ou 11 ou a SEQ ID N°. 9, 10, ou 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos, ou a SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 ou a SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos, em que o anticorpo ou fragmento alterados têm a mesma ou praticamente a mesma afinidade ou especificidade da ligação do epitopo que a sequência de aminoácidos inicial que compreende a SEQ ID N°. 9, 10, ou 11 ou a SEQ ID N°. 9, 10, ou 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos, ou a SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 ou a SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos. Pela frase "praticamente a mesma" afinidade entende-se que a afinidade ou a constante de dissociação, conforme determinada de acordo com os ensinamentos dados aqui, não aumentou nem diminuiu mais do que a variação inerente ao ensaio para um anticorpo ou fragmento compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 9, 10, ou 11 ou das SEQ ID N°. 9, 10, ou 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos e uma região de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 ou das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 2 6 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos, tal como a variação observada quando o ensaio é realizado três ou mais vezes de forma independente. Pela frase "praticamente a mesma" especificidade do epitopo, entende-se que a ligação a uma sequência de aminoácidos 20 contendo o epítopo, tal como determinado pelos ensinamentos dados aqui, está dentro da variação inerente ao ensaio para o anticorpo ou fragmento que compreenda uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 9, 10, ou 11 ou das SEQ ID N°. 9, 10, ou 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos e uma região de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 ou das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos, tal como a variação observada quando o ensaio é realizado três ou mais vezes de forma independente. Quando se compara com um anticorpo ou um fragmento que compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 9, 10, ou 11 ou das SEQ ID N°. 9, 10, ou 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos e uma região de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 ou das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos, significa que a comparação deve ser feita entre a sequência de aminoácidos alterada e a sequência de aminoácidos inicial na qual foram feitas uma ou mais substituições, eliminações ou adições, sendo essa sequência inicial idêntica em todos os outros aminoácidos

Anticorpos, anticorpos Humanizados e anticorpos Humanos tratados por engenharia genética

Os anticorpos de ligação a IL-Ιβ da presente invenção podem ser providenciados como anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (Acm, em inglês mAbs), anticorpos recombinantes, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados em RDC, anticorpos completamente humanos, anticorpos de cadeia simples e/ou anticorpos bi-especificos, assim como 21 fragmentos, incluindo as suas variantes e derivados, providenciados por técnicas conhecidas incluindo, mas não se limitando a clivagem enzimática, sintese de péptidos ou técnicas recombinantes.

Os anticorpos geralmente compreendem dois polipéptidos de cadeia pesada e dois polipéptidos de cadeia leve, embora os anticorpos de domínio único tenham uma cadeia pesada e uma cadeia leve e os anticorpos de cadeia pesada que não têm cadeias leves também sejam considerados. Há cinco tipos de cadeias pesadas, designadas por alfa, delta, épsilon, gama e mu, com base na sequência de aminoácidos do domínio constante de cadeia pesada. Estes diferentes tipos de cadeias pesadas dão origem a cinco classes de anticorpos, IgA (incluindo IgAi e IgA2) , IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluindo quatro subclasses de IgG, nomeadamente IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4. Há também dois tipos de cadeias leves designadas por kappa (k) ou lambda (λ) com base na sequência de aminoácidos dos domínios constantes. Um anticorpo de comprimento completo inclui um domínio constante e um domínio variável. A região constante não precisa de estar presente num fragmento de um anticorpo de ligação ao antigénio. Os fragmentos de ligação ao antigénio de um anticorpo aqui descrito podem incluir fragmentos de anticorpos Fab, Fab', F(ab')2 e F (v) . Tal como se discute com mais detalhe a seguir, os fragmentos de ligação a IL-Ιβ englobam fragmentos de anticorpos e polipéptidos de ligação a antigénios que se irão ligar a IL-1β.

Cada uma das sequências de um anticorpo de cadeia pesada e de cadeia leve ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio inclui uma região variável com três regiões de determinação de complementaridade (RDC), assim como regiões estruturais (RE, em inglês FR) não RDC. As expressões "cadeia 22 pesada" e "cadeia leve", tal como se utilizam aqui, significam a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve, respectivamente, a menos que seja indicado de outra forma. AS RDC de cadeia pesada são referidas aqui como RDC-P1, RDC-P2 e RDC-P3. As RDC de cadeia leve são referidas aqui como RDC-L1, RDC-L2 e RDC-L3. As regiões variáveis e as RDC numa sequência de anticorpo podem ser identificadas (i) de acordo com regras gerais que tenham sido desenvolvidas na técnica ou (ii) por alinhamento das sequências em função de uma base de dados de regiões variáveis conhecidas. Os processos para a identificação destas regiões estão descritos em Kontermann e Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, Nova Iorque, NY, 2001 e Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000. As bases de dados das sequências de anticorpos estão descritas e podem ser acedidas através da base-de-dados "The Kabatman" no sitio www.bioinf.org.uk/abs (mantido por A.C. Martin no Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London, Londres, Inglaterra) e na VBASE2 no www.vbase2.org, tal como descrito em Retter et al., Nucl. Acids Res., 33 (Database issue): D671-D674 (2005). 0 sitio na net da base de dados "Kabatman" inclui regras gerais práticas para identificar as RDC. 0 termo "RDC", tal como se utiliza aqui, tem o significado dado em Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th ed., U.S. Department of Health and Human Services, 1991, salvo indicação em contrário. A presente invenção engloba anticorpos de ligação a IL-1β que incluem duas cadeias pesadas de comprimento completo e duas cadeias leves de comprimento completo. Alternativamente, os anticorpos de ligação a IL-Ιβ podem ser vectores, tais como anticorpos de cadeia simples ou "mini" anticorpos que retêm a actividade de ligação a IL-Ιβ. Esses vectores podem 23 ser preparados por processos conhecidos na técnica tal como, por exemplo, clonagem e montagem, mediadas por RCP, de anticorpos de cadeia simples para expressão em E. coli (tal como descrito em Antibody Engineering, The practical approach series, J. McCafferty, H. R. Hoogenboom, e D. J. Chiswell, editors, Oxford University Press, 1996). Neste tipo de vector, as porções variáveis das cadeias pesada e leve de uma molécula de anticorpo são amplificadas por RCP a partir do ADNc. Os amplicões resultantes são então unidos, por exemplo, numa segunda etapa de RCP, através de um ADN ligante que codifica um ligante flexivel de proteína composto pelos aminoácidos Gli e Ser. Este ligante permite que as porções variáveis das cadeias pesada e leve se dobrem de tal maneira que a bolsa de ligação do antigénio é regenerada e o antigénio liga-se com afinidades muitas vezes comparáveis às da molécula parental dimérica de comprimento completo da imunoglobulina.

Os anticorpos de ligação a IL-Ιβ e os seus fragmentos, da presente invenção, englobam variantes dos exemplos de anticorpos, fragmentos e sequências aqui descritos. As variantes incluem péptidos e polipéptidos que compreendem uma ou mais substituições, eliminações e/ou adições nas sequências de aminoácidos que têm a mesma ou praticamente a mesma afinidade e especificidade da ligação do epítopo, tal como um ou mais dos exemplos de anticorpos, fragmentos e sequências aqui descritos. Assim, as variantes incluem péptidos e polipéptidos que compreendem uma ou mais substituições, eliminações e/ou adições nas sequências de aminoácidos dos anticorpos, fragmentos e sequências dos exemplos aqui descritos em que essas substituições, eliminações e/ou adições não causam alterações substanciais na afinidade e na especificidade da ligação do epítopo. Por exemplo, uma variante de um anticorpo ou de um fragmento pode 24 resultar de uma ou mais alterações a um anticorpo ou a um fragmento que compreende uma ou mais sequências de aminoácidos das SEQ ID N°. 9, 10, ou 11 ou das SEQ ID N°. 9, 10, ou 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos ou das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 ou das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos, em que o anticorpo ou o fragmento alterado tem a mesma ou praticamente a mesma afinidade e especificidade da ligação do epítopo que a sequência inicial. As variantes podem ocorrer naturalmente tal como variantes alélicas ou de excisão-união ou podem ser construídas artificialmente. As variantes podem ser preparadas a partir das correspondentes moléculas de ácidos nucleicos correspondentes que codificam as referidas variantes. As variantes dos anticorpos da presente invenção e dos fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem ter alterações nas sequências de aminoácidos de cadeia leve e/ou pesada que ocorrem naturalmente ou são introduzidas por engenharia genética, in vitro, em sequências naturais utilizando técnicas de ADN recombinante. As variantes de ocorrência natural incluem variantes "somáticas" que são geradas in vivo na linha germinal correspondente de sequências de nucleótidos durante a geração de uma resposta do anticorpo a um antigénio exógeno.

As variantes dos anticorpos de ligação a IL-Ιβ e dos fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem também ser preparadas por técnicas de mutagénese. Por exemplo, as alterações de aminoácidos podem ser introduzidas aleatoriamente através de uma região de codificação do anticorpo e as variantes resultantes podem ser rastreadas quanto à afinidade de ligação para IL-Ιβ ou para outra propriedade. Alternativamente, podem introduzir-se alterações de aminoácidos em regiões seleccionadas de um anticorpo de IL- 25 1β, tal como as RDC de cadeia leve e/ou pesada e/ou nas regiões estruturais e os anticorpos resultantes podem ser rastreados quanto à ligação a IL-Ιβ ou qualquer outra actividade. As alterações de aminoácidos englobam uma ou mais substituições de aminoácidos numa RDC, variando de uma única diferença de aminoácido até à introdução de múltiplas permutações de aminoácidos dentro de uma dada RDC, tal como a RDC3. Noutro processo, a contribuição de cada resíduo, dentro de uma RDC, para a ligação de IL-Ιβ pode ser avaliada substituindo pelo menos um resíduo, dentro da RDC, por uma alanina. Lewis et al. (1995), Mol. Immunol. 32: 1065-72. Os resíduos que não são óptimos para a ligação a IL-Ιβ podem então ser alterados de modo a determinar a sequência óptima. Também estão englobadas variantes geradas pela inserção de aminoácidos para aumentar a dimensão de uma RDC, tal como a RDC3. Por exemplo, as sequências da RDC3 com mais cadeias leves têm nove aminoácidos de comprimento. As sequências de cadeias leves num anticorpo que são mais curtas do que nove resíduos podem ser optimizadas para a ligação a IL-Ιβ por inserção dos aminoácidos apropriados para aumentar o comprimento da RDC.

Também se podem preparar variantes por "arrastamento de cadeia" de cadeias leves ou pesadas. Marks et al. (1992), Biotechnology 10: 779-83. Uma cadeia única leve (ou pesada) pode ser combinada com uma biblioteca que tenha um reportório de cadeias pesadas (ou leves) e pode-se rastrear a população resultante para uma determinada actividade, tal como a ligação a IL-Ιβ. Isto permite rastrear uma amostra maior de cadeias pesadas (ou leves) diferentes em combinação com uma única cadeia leve (ou pesada) e isso é possível com bibliotecas que compreendem reportórios tanto de cadeias pesadas como de leves. 26

Os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ da presente invenção englobam derivados dos anticorpos, fragmentos e sequências exemplificados aqui descritos. Os derivados incluem polipéptidos ou péptidos ou variantes, os seus fragmentos ou os seus derivados, que tenham sido quimicamente modificados. Os exemplos incluem ligação covalente de um ou mais polímeros, tal como polímeros solúveis em água, hidratos de carbono ligados a N ou ligados a 0, açúcares, fosfatos e/ou outras dessas moléculas. Os derivados são modificados de uma forma diferente das modificações de ocorrência natural ou dos péptidos ou polipéptidos iniciais, quer no tipo ou na localização das moléculas ligadas. Os derivados ainda incluem a eliminação de um ou mais grupos químicos que estão naturalmente presentes no péptido ou no polipéptido.

Os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ da presente invenção podem ser bi-específicos. Os anticorpos ou fragmentos bi-específicos podem ter várias configurações. Por exemplo, os anticorpos bi-específicos podem parecer anticorpos simples (ou fragmentos de anticorpos), mas têm dois sítios diferentes de ligação do antigénio (regiões variáveis). Os anticorpos bi-específicos podem ser produzidos por técnicas químicas (Kranz et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78: 5807), por técnicas de "polidoma" (patente norte-americana N°. 4.474.893) ou por técnicas de ADN recombinante. Os anticorpos bi-específicos da presente invenção podem ter especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes, pelo menos um dos quais é um epítopo de IL-Ιβ. Os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem também ser hetero-anticorpos. Os hetero-anticorpos são dois ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação de anticorpos (Fab) ligados em conjunto, tendo cada anticorpo ou fragmento uma especificidade diferente. 27

As técnicas para a criação de versões de ADN recombinante das regiões de ligação do antigénio das moléculas do anticorpo que ultrapassam a geração de anticorpos monoclonais estão contempladas para os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ da presente invenção. 0 ADN é clonado num sistema de expressão bacteriano. Um exemplo dessa técnica, apropriado para a prática da presente invenção utiliza um sistema de vector lambda bacteriófago com uma sequência lider que faz com que a proteína Fab expressa migre para o espaço periplásmico (entre a membrana da célula bacteriana e a parede da célula) ou seja segregada. Pode-se gerar rapidamente e rastrear um grande número de fragmentos funcionais Fab para avaliar os que se ligam a IL-Ιβ. Esses agentes de ligação a IL-Ιβ (fragmentos Fab com especificidade para um polipéptido de IL-Ιβ) estão especificamente englobados nos anticorpos e nos fragmentos de ligação de IL-Ιβ da presente invenção.

Os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ da presente invenção podem ser humanizados ou anticorpos humanos tratados por engenharia genética. Tal como se utiliza aqui, um anticorpo humanizado ou um seu fragmento de ligação ao antigénio é um polipéptido recombinante que compreende uma porção de um sítio de ligação ao antigénio de um anticorpo não humano e uma porção da estrutura e/ou das regiões constantes de um anticorpo humano. Um anticorpo humano tratado por engenharia genética ou um fragmento desse anticorpo é um anticorpo não humano (por exemplo, de murganho) que tenha sido tratado por engenharia genética por meio da modificação de aminoácidos (por exemplo, eliminação, inserção ou substituição), em posições específicas, de modo a reduzir ou a eliminar qualquer imunogenicidade detectável do anticorpo modificado, num ser humano. 28

Os anticorpos humanizados incluem anticorpos quiméricos e anticorpos enxertados em RDC. Os anticorpos quiméricos são anticorpos que incluem uma região variável de um anticorpo não humano ligada a uma região constante humana. Assim, nos anticorpos quiméricos, a região variável, na maioria das vezes, não é humana e a região constante é humana. Os anticorpos quiméricos e os processos para os preparar estão descritos em Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 6841-6855 (1984), Boulianne, et al., Nature, 312: 643-646 (1984) e na publicação do pedido de patente PCT WO 86/01533. Embora possam ser menos imunogénicos do que um anticorpo monoclonal de murganho, a administração de anticorpos quiméricos tem sido associada a respostas imunitárias humanas (HAMA) àa porções não humanas dos anticorpos. Os anticorpos quiméricos também podem ser produzidos por combinação de os genes de uma molécula de anticorpo de murganho com uma especificidade apropriada de ligação ao antigénio, em conjunto com genes de uma molécula de anticorpo humano com uma actividade biológica apropriada, tal como a capacidade para activar o complemento humano e mediar a CCDA. Morrison et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sei., 81: 6851; Neuberger et al. (1984), Nature, 312: 604. Um exemplo é a substituição de uma região Fc por a de um isotipo diferente.

Os anticorpos enxertados em RDC são anticorpos que incluem as RDC de um anticorpo "dador" não humano ligado à região estrutural de um anticorpo "receptor" humano. Geralmente, os anticorpos enxertados em RDC incluem mais sequências de anticorpos humanos do que os anticorpos quiméricos porque incluem tanto as sequências da região constante como as sequências da região variável (estruturas) dos anticorpos humanos. Assim, por exemplo, um anticorpo humanizado enxertado numa RDC da presente invenção pode compreender uma cadeia pesada que compreende uma sequência de 29 aminoácidos contíguos (por exemplo, cerca de 5 ou mais, 10 ou mais ou mesmo 15 ou mais resíduos de aminoácidos contíguos) da região estrutural de um anticorpo humano (por exemplo, RE-1, RE-2 ou RE-3 de um anticorpo humano) ou, eventualmente, a maior parte ou toda a região estrutural de um anticorpo humano. Os anticorpos enxertados em RDC e os processos para a sua produção estão descritos em Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986), Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988) e Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)). Os processos que podem ser utilizados para produzir anticorpos humanizados também estão descritos nas patentes norte-americanas 4.816.567, 5.721.367, 5.837.243 e 6.180.377. Considera-se que é menos provável que os anticorpos enxertados em RDC induzam uma reacção imunitária contra porções de anticorpos humanos, do que os anticorpos quiméricos. Contudo, já foi relatado que as sequências estruturais de anticorpos dadores são necessárias para a afinidade de ligação e/ou a especificidade do anticorpo dador, presumivelmente porque estas sequências estruturais afectam a dobragem da porção de ligação ao antigénio por parte do anticorpo dador. Por isso, quando sequências de RDC nãohumanas de dador são enxertadas em sequências estruturais humanas não alteradas, o anticorpo enxertado na RDC resultante pode exibir, nalguns casos, uma perda da avidez de ligação relativamente ao anticorpo original do dador não humano. Ver, por exemplo, Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988) e Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988) .

Os anticorpos humanos tratados por engenharia genética incluem anticorpos "folheados" e anticorpos preparados utilizando a tecnologia HUMAN ENGINEERING™ (XOMA (US) LLC, Berkeley, CA) . A tecnologia HUMAN ENGINEERING™ está comercialmente disponível e envolve a alteração de um 30 anticorpo não humano ou de um fragmento de anticorpo, tal como um anticorpo de murganho ou quimérico ou um fragmento de anticorpo, fazendo alterações especificas na sequência de aminoácidos do anticorpo de modo a produzir um anticorpo modificado com uma imunogenicidade reduzida num ser humano que, apesar disso, retém as propriedades de ligação desejáveis dos anticorpos originais não humanos. Geralmente, a técnica envolve a classificação dos residuos de aminoácidos de um anticorpo não humano (por exemplo, de murganho) como residuos de "baixo risco", "risco moderado" ou "alto risco". A classificação é feita utilizando um cálculo global de risco/beneficio que avalia os benefícios previstos da substituição particular feita (por exemplo, para a imunogenicidade em seres humanos) em função do risco que a substituição irá afectar na dobragem do anticorpo resultante e/ou nas propriedades de ligação ao antigénio. Assim, uma posição de baixo risco é aquela para qual se prevê que uma substituição que seja benéfica porque se prevê que reduza a imunogenicidade sem afectar significativamente as propriedades de ligação ao antigénio. Uma posição de risco moderado é aquela para a qual se prevê que uma substituição reduza a imunogenicidade mas que seja provável que afecte a dobragem da proteína e/ou a ligação do antigénio. Posições de alto risco contêm resíduos que, muito provavelmente, vão estar envolvidos numa dobragem apropriada ou na ligação do antigénio. Geralmente, as posições de baixo risco num anticorpo não humano estão substituídas por resíduos humanos, as posição de elevado risco raramente são substituídas e as substituições de humanização, em posições de risco moderado, são feitas algumas vezes, embora não de forma indiscriminada. As posições com prolinas nas sequências da região variável de anticorpos humanos são normalmente classificadas como as posições pelo menos de risco moderado. 31 0 resíduo particular de aminoácido humano que vai ser substituído numa dada posição de risco baixo ou moderado de uma sequência de um anticorpo não humano (por exemplo, de murganho) pode ser seleccionado por alinhamento de uma sequência de aminoácidos de regiões variáveis de anticorpos não humanos com a região correspondente de uma sequência de anticorpo humano específico ou de consenso. Os resíduos de aminoácidos nas posições de risco baixo ou moderado, numa sequência não humana, podem ser substituídos pelos correspondentes resíduos na sequência do anticorpo humano, de acordo com o alinhamento. As técnicas para a produção de proteína humanas tratadas por engenharia genética estão descritas, com mais detalhe, em Studnicka et al., Protein Engineering, 7: 805-814 (1994), patentes norte-americanas 5.766.886, 5.770.196, 5.821.123 e 5.869.619 e publicação do pedido de patente PCT WO 93/11794.

Os anticorpos "folheados" são anticorpos não humanos ou humanizados (por exemplo, anticorpos quiméricos ou anticorpos enxertados em RDC) que tenham sido tratados por engenharia genética para substituir certos resíduos de aminoácidos expostos a dissolventes, de modo a reduzir mais a sua imunogenicidade ou a aumentar a sua função. Como se presume que os resíduos de superfície de um anticorpo quimérico sejam menos prováveis de afectar a dobragem apropriada do anticorpo e mais prováveis de provocar uma reacção imunitária, o folheamento de um anticorpo quimérico pode incluir, por exemplo, a identificação dos resíduos expostos ao dissolvente numa região estrutural não humana de um anticorpo quimérico e a substituição de pelo menos um deles pelos correspondentes resíduos de superfície de uma região estrutural humana. O folheamento pode ser conseguido por qualquer técnica apropriada de engenharia incluindo a utilização da tecnologia HUMAN ENGINEERING™ descrita antes. 32

Numa abordagem diferente, pode conseguir-se uma recuperação da avidez de ligação por "desumanização" de um anticorpo enxertado numa RDC. A desumanização pode incluir a restauração de resíduos a partir das regiões estruturais do anticorpo dador para o anticorpo enxertado na RDC, restaurando assim apropriadamente a dobragem. Pode conseguir-se uma "desumanização" similar por (i) inclusão de porções da região estrutural do "dador" no anticorpo "receptor" ou (ii) enxertando porções da região estrutural do anticorpo "dador" no anticorpo receptor (em conjunto com as RDC enxertadas do dador) .

Para uma discussão alargada sobre anticorpos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos tratados por engenharia e processos para a sua preparação, ver Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, Nova Iorque, NY, 2001.

Exemplos de anticorpos humanizados ou anticorpos humanos tratados por engenharia genética incluem os anticorpos IgG, IgM, IgE, IgA, e IgD. Os anticorpos da presente invenção podem ser de qualquer classe (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, etc.) ou um isotipo e podem compreender uma cadeia leve kapa ou lambda. Por exemplo, um anticorpo humano pode compreender uma cadeia pesada de IgG ou um fragmento definido, tal como pelo menos um dos isotipos IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Como outro exemplo, os anticorpos ou os fragmentos da presente invenção podem compreender uma cadeia pesada de IgGl e uma cadeia leve de IgGl.

Os anticorpos e os seus fragmentos da presente invenção podem ser anticorpos humanos, tais como anticorpos que se ligam aos polipéptidos de IL-Ιβ e são codificados por sequências de ácidos nucleicos que são variantes somáticas de ocorrência natural da sequência de ácidos nucleicos da linha 33 germinal da imunoglobulina humana e os seus fragmentos, variantes sintéticas, os seus derivados e as suas fusões. Esses anticorpos podem ser produzidos por qualquer processo conhecido na técnica, tal como através da utilização de mamíferos transgénicos (tais como, ratos transgénicos) em que o reportório original da imunoglobulina tenha sido substituído por genes V humanos no cromossoma do mamífero. Esses mamíferos parecem ser portadores da recombinação de VDJ e da hipermutação somática dos genes dos anticorpos da linha germinal humana, de uma forma normal, produzindo assim anticorpos de elevada afinidade com sequências completamente humanas.

Os anticorpos humanos também podem ser gerados através do rasteio in vitro de bibliotecas de anticorpos que exibem fagos. Ver Hoogenboom et al. (1991), J. Mol. Biol. 227: 381; e Marks et al. (1991), J. Mol. Biol. 222: 581. Já foram descritas várias bibliotecas contendo anticorpos que exibem fagos e podem também ser facilmente preparadas. As bibliotecas podem conter uma diversidade de sequências de anticorpos humanos, tais como os fragmentos Fab, Fv e scFv, que podem ser rastreados em função de um alvo apropriado. As bibliotecas que exibem fagos podem compreender péptidos ou proteínas para além dos anticorpos que podem ser rastreados para identificar agentes de ligação selectivos de IL-Ιβ.

Os anticorpos de ligação a IL-Ιβ e os seus fragmentos podem compreender uma ou mais porções que não se ligam a IL- 1β mas, em vez disso, são responsáveis por outras funções, tais como o semi-período de vida em circulação, efeito citotóxico directo, marcação detectável ou activação da cascata do complemento endógeno do receptor ou a citotoxicidade celular endógena. Os anticorpos ou os fragmentos podem conter toda ou uma porção da região 34 constante e podem ser de qualquer isotipo incluindo IgA (por exemplo, IgAl ou IgA2), IgD, IgE, IgG (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4) ou IgM. Além disso ou em vez disso podem compreender uma região constante, os compostos de ligação ao antigénio da presente invenção podem incluir um marcador de epitopo, um epitopo de recuperação de receptor, uma parte de marcador para fins de diagnóstico ou purificação ou uma parte citotóxica tal como um radionuclideo ou toxina. A região constante (quando presente) dos anticorpos e fragmentos da presente invenção podem ser do tipo γΐ, γ2, γ3, γ4, μ, β2 ou δ ou ε, preferencialmente do tipo γ, mais preferencialmente do tipo y, tipo em que a parte constante de uma cadeia leve humana pode ser do tipo κ ou λ (o que inclui os subtipos λι, À2 e λ3) mas é preferencialmente do tipo κ.

As variantes também incluem anticorpos ou fragmentos que compreendem uma região Fc modificada, em que a região Fc modificada compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativamente à região Fc de tipo selvagem. A variante da região Fc pode ser concebida, relativamente a uma molécula comparável, compreendendo a região Fc de tipo selvagem, de modo a ligar os receptores de Fc com uma afinidade maior ou menor.

Por exemplo, os anticorpos e fragmentos de ligação a IL-1β da presente invenção podem compreender uma região Fc modificada. Região Fc refere-se a polipéptidos de ocorrência natural ou sintéticos homólogos do dominio do terminal C de IgG que se produz após a digestão de IgG por papaina. A Fc de IgG tem um peso molecular de, aproximadamente, 50 kD. Nos anticorpos e fragmentos da presente invenção pode-se utilizar uma região Fc inteira ou apenas uma porção que aumenta o semi-periodo de vida. Além disso, são aceitáveis muitas 35 modificações na sequência de aminoácidos, porque a actividade natural não é necessária nem desejável em todos os casos. A região Fc, se desejado, pode ser mutada para inibir a sua capacidade para fixar o complemento e ligar-se ao receptor de Fc com uma elevada afinidade. Para a Fc de IgG de murino, a substituição dos resíduos Ala por Glu 318, Lis 320 e Lis 322 tornam a proteína incapaz de dirigir a CCDA (citotoxicidade celular dependente do anticorpo, em inglês ADCC) . A substituição de Glu por Leu 235 inibe a capacidade da proteína para se ligar ao receptor de Fc com uma elevada afinidade. São conhecidas várias mutações para a IgG humana (ver, por exemplo, Morrison et al., 1994, The Immunologist 2: 119 124 e Brekke et al., 1994, The Immunologist 2: 125).

Nalgumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos da presente invenção são providenciados com uma região Fc modificada em que a região Fc de ocorrência natural está modificada para aumentar o semi-período de vida do anticorpo ou do fragmento, num ambiente biológico, por exemplo, o semi-período de vida no soro ou o semi-período de vida medido num ensaio in vitro. Os processos para alterar a forma original de uma região Fc de uma IgG também estão descritos na patente norte-americana N°. 6.998.253.

Em certas modalidades, pode ser desejável modificar o anticorpo ou o fragmento de modo a aumentar o seu semi-período de vida no soro, por exemplo, adicionando moléculas, tais como PEG ou outros polímeros solúveis em água, incluindo polímeros de polissacáridos, aos fragmentos de anticorpos, para aumentar o semi-período de vida. Isto também pode ser conseguido, por exemplo, por incorporação de um epítopo de ligação ao receptor de recuperação no fragmento do anticorpo (por exemplo, por mutação da região apropriada no fragmento 36 do anticorpo ou por incorporação do epitopo num marcador de péptido que se funde depois com o fragmento do anticorpo quer numa extremidade ou no meio, por exemplo, por meio das sínteses de ADN ou de péptidos) (ver a publicação internacional N°. WO 96/32478) . 0 epitopo de ligação do receptor de recuperação refere-se a um epitopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3 ou IgG^) que é responsável pelo aumento do semi-período de vida no soro, in vivo, da molécula de IgG.

Um epitopo de ligação do receptor de recuperação pode incluir uma região em que qualquer um dos resíduos de aminoácidos de uma ou de duas espiras de um domínio de Fc são transferidos para uma posição análogo do fragmento do anticorpo. Ainda mais preferencialmente, são transferidos três ou mais resíduos de uma ou duas espiras do domínio de Fc. Ainda de forma mais preferível, retira-se o epitopo do domínio CP2 da região Fc (por exemplo, de uma IgG) e transfere-se para uma região CPI, CP3 ou VP ou para mais do que uma região do anticorpo. Alternativamente, o epitopo é retirado do domínio CP2 da região Fc e transferido para a região CL ou para a região VL ou ambas, do fragmento de anticorpo. Ver também os pedidos de patentes internacionais WO 97/34631 e WO 96/32478 que descrevem variantes de Fc e a sua interacção com o receptor de recuperação. A mutação dos resíduos dentro dos sítios dentro dos sítios de ligação do receptor de Fc pode resultar numa função efectora alterada, tal como em actividades de CCDA ou CDC alteradas ou o semi-período de vida alterado. As mutações potenciais incluem inserção, eliminação ou substituição de um ou mais resíduos incluindo a substituição com alanina, uma substituição conservadora, uma substituição não conservadora ou uma substituição com um resíduo de aminoácido 37 correspondente, na mesma posição, de uma subclasse diferente de IgG (por exemplo, substituindo um resíduo de IgGl por o correspondente resíduo de IgG2 nessa posição). Por exemplo, já foi referido que a mutação de serina na posição 241 dos aminoácidos, na IgG4, por prolina (encontrada nessa posição em IgGl e IgG2) levou à produção de um anticorpo homogéneo, assim como a uma extensão do semi-período de vida no soro e a uma melhoria da distribuição no tecido, comparada com a de IgG4 quimérica original. (Angal et al., Mol Immunol. 30: 105-8, 1993).

Preferencialmente, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo da presente invenção não reticula com nenhum alvo para além da IL-Ιβ. Por exemplo, os anticorpos e os fragmentos da presente invenção preferencialmente não se ligam a IL-Ια de forma detectável.

Anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação a IL-Ιβ

Os fragmentos de anticorpos são porções de um anticorpo de comprimento completo intacto, tal como uma ligação ao antigénio ou uma região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem Fab, Fab' , F(ab')2 e fragmentos Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples (por exemplo, scFv); fragmentos de anticorpos multiespecificos, tais como bi-específicos, tri-específicos e anticorpos multiespecificos (por exemplo, diacorpos, triacorpos, tetracorpos); minicorpos; anticorpos recombinantes de quelação; tricorpos ou bicorpos; intracorpos; nanocorpos; produtos imuno-farmacêuticos modulares pequenos (PFMP), proteínas de fusão da imunoglobulina do domínio de ligação; anticorpos de tipo camelo; anticorpos contendo VPP; e quaisquer outros polipéptidos formados a partir de fragmentos de anticorpos. 38 A presente invenção tem por objecto um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um seu fragmento de ligação a IL-Ιβ compreendendo uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 9, 10 ou 11 ou das SEQ ID N° . 9, 10 ou 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos e uma região de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 ou das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos.

A fig. 1 ilustra a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 2. Um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, que esteja descrito no contexto da presente invenção, compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 21 e, mais preferencialmente, compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 4, da SEQ ID N°. 5, da SEQ ID N°. 6, da SEQ ID N°. 7 ou da SEQ ID N°. 8. Os anticorpos que estão descritos no contexto da presente invenção, também podem compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 12 ou da SEQ ID N°. 13 e, mais preferencialmente, compreendem a SEQ ID N°. 14 ou a SEQ ID N°. 15. Um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que esteja descrito no contexto da presente invenção compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 2 (por exemplo, compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°s. 4-8, 12-15 ou 21) . A cadeia leve do anticorpo compreende, preferencialmente, consiste essencialmente ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1. Assim, por exemplo, a cadeia leve do anticorpo pode compreender, consistir essencialmente ou consistir na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 9, da SEQ ID N°. 10 ou da SEQ ID N°. 11. Um anticorpo ou um fragmento de anticorpo (por exemplo, uma 39 região variável de cadeia pesada de um anticorpo ou de um fragmento de anticorpo), que está descrito no contexto da presente invenção, compreende, consiste essencialmente ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 23 ou da SEQ ID N°. 24 (por exemplo, SEQ ID N°. 25 ou SEQ ID N°. 26). A presente invenção descreve um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um seu fragmento de ligação a IL-Ιβ compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID N°. 2, 23 ou 24, alternativamente uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID N°. 12, 13, 21, 23 ou 24 ou, alternativamente, uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID N°. 12, 13 ou 21 ou, alternativamente, uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID N°. 13 ou 21 ou, alternativamente uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID N°. 8, 14 ou 15 ou, alternativamente, uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID N°. 8 ou 15. Um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que está descrito no contexto da presente invenção compreende uma região variável de cadeia leve, preferencialmente compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 9, SEQ ID N°. 10 ou SEQ ID N°. 11. Como exemplo, um anticorpo preferido compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 8 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 11. A presente invenção também tem por objecto um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um seu fragmento de ligação a IL-Ιβ que compreende uma das sequências de aminoácidos da SEQ ID N°. 28. Preferencialmente, o anticorpo ou o fragmento ainda compreendem uma das sequências de aminoácidos da SEQ ID N°. 27. 40 A presente invenção também tem por objecto um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um seu fragmento de ligação a IL-Ιβ que compreende, consiste essencialmente ou consiste na SEQ ID N° . 29. Um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que esteja descrito no contexto da presente invenção compreende, consiste essencialmente ou consiste na sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 31-35 ou, alternativamente, na sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 31, 32 ou 33 ou, alternativamente, na sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 32 ou 33. Um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, que esteja descrito no contexto da presente invenção, ainda compreende a região variável de cadeia leve compreendendo uma sequências de aminoácidos da SEQ ID N°. 27. Um anticorpo preferido compreende uma das sequências de aminoácidos da SEQ ID N°. 9, da SEQ ID N°. 10 ou da SEQ ID N°. 11.

As figs. 2, 3 e 4 ilustram as regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos descritos no contexto da presente invenção cujas sequências correspondem aos anticorpos aqui referidos como ABI, AB2, AB3, AB4, AB5, AB5.1, AB5.2, AB5.3 e AB5.4. As sequências dos AB5.1, AB5.2, AB5.3 e AB5.4 contêm posições variáveis, designadas como XI e X2, na região RDC3 de cadeia pesada. Estas posições variáveis podem ser qualquer um dos aminoácidos indicados. Preferencialmente, XI e X2 representam, respectivamente, alanina e arginina, valina e arginina, fenilalanina e arginina, lisina e lisina ou asparagina e arginina. AB5.1 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 12 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 10. AB5.2 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13 e uma região variável de cadeia 41 leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 11. AB5.3 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 23 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 10. AB5.4 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 24 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 11. A presente invenção engloba os fragmentos do anticorpo de ligação a IL-Ιβ que compreende sequências de cadeia pesada ou leve das SEQ ID N°. 9, 10 ou 11 ou as SEQ ID N°. 9, 10 ou 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos, ou das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 ou das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos e que se ligam a IL-Ιβ. O termo fragmentos, tal como se utiliza aqui, refere-se a quaisquer 3 ou mais aminoácidos contíguos (por exemplo, 4 ou mais, 5 ou mais, 6 ou mais, 8 ou mais ou mesmo 10 ou mais aminoácidos contíguos) do anticorpo e engloba os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e F (v) ou as regiões variáveis individuais de cadeia leve ou pesada ou porções dessas regiões. Os fragmentos de ligação a IL-Ιβ incluem, por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2/ Fv e scFv. Estes fragmentos a que falta o fragmento Fc de um anticorpo intacto, desaparecem mais rapidamente da circulação e podem ter uma ligação ao tecido não-específica inferior à do anticorpo intacto. Ver Wahl et al. (1983), J. Nucl. Med., 24: 316-25. Estes fragmentos podem ser produzidos a partir de anticorpos intactos utilizando processos bem conhecidos, por exemplo, por clivagem proteolítica com enzimas, tais como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2). 42 A presente invenção engloba os anticorpos de ligação a IL-Ιβ e os seus fragmentos de ligação a IL-Ιβ que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 9, 10 ou 11 ou das SEQ ID N°. 9, 10 ou 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos ou das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 ou das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos, que se ligam selectivamente ao ligando de IL-Ιβ mas permitem ou praticamente permitem a ligação do ligando de IL-Ιβ ligado ao receptor de IL-1 de tipo I (IL-1RI) (ver, exemplo 14 e figs. 19 e 20) . Ao contrário de muitos anticorpos, incluindo vários anticorpos conhecidos de ligação a IL-Ιβ, os anticorpos designados por AB5 e AB7 ligam-se selectivamente ao ligando de IL-Ιβ, mas não bloqueiam ou praticamente não bloqueiam a ligação de IL-Ιβ a IL-1RI, como demonstrado no exemplo 14. Por exemplo, o anticorpo designado por AB7 liga-se a um epitopo de IL-Ιβ mas ainda permite a ligação de IL-Ιβ a IL-1RI. Assim, a presente invenção engloba anticorpos ou fragmentos de ligação a IL-Ιβ que se ligam a um epitopo de IL-Ιβ de tal maneira que o anticorpo ou o fragmento ligado permitem ou praticamente permitem que IL-Ιβ se ligue ao receptor I de IL-1 (IL-1RI) e o anticorpo ou o fragmento liga-se a IL-Ιβ humana com uma constante de dissociação inferior a 3 pM.

Existem descritos na técnica ensaios in vitro e à base de células para a determinação da ligação a IL-Ιβ ao receptor de IL-1 do tipo I, incluindo ensaios que determinam a presença de moléculas (tais como, anticorpos, antagonistas ou outros inibidores) que se ligam a IL-Ιβ ou a IL-1RI (ver, por exemplo, Evans et al., (1995), J. Biol. Chem. 270:11477-11483; Vigers et al., (2000), J. Biol. Chem. 275:36927-36933; Yanofsky et al., (1996), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:7381-7386; Fredericks et al., (2004), Protein Eng. Des. Sei. 43 17:95-106; Slack et al. , (1993), J. Biol. Chem. 268:2513- 2524; Smith et al., (2003), Immunity 18:87-96; Vigers et al., (1997), Nature 386:190-194; Ruggiero et al., (1997), J Immunol. 158:3881-3887; Guo et al., (1995) 1 , J. Biol. Chem 270:27562 -27568; Svenson et al., (1995), Eur. J. Immunol 25:2842-2850; Arend et al., (1994), J. Immunol. 153:4766-4774). O receptor recombinante de IL-1 do tipo I, incluindo o receptor humano de IL-1 do tipo I, para esses ensaios, está facilmente disponível numa grande variedade de fontes comerciais (ver, por exemplo, R&D Systems, SIGMA). O receptor de IL-1 do tipo I também pode ser expresso de partir de um vectora de expressão ou vector introduzido numa célula hospedeira apropriada utilizando padrões da biologia molecular e técnicas de transfecção conhecidas na técnica. O receptor de IL-1 do tipo I expresso pode então ser isolado e purificado para ser utilizado em ensaios de ligação ou, alternativamente, utilizado directamente numa forma associada a células.

Por exemplo, a ligação de IL-Ιβ ao receptor de IL-1 do tipo I pode ser determinada por imobilização de um anticorpo de ligação a IL-Ιβ, fazendo contactar IL-Ιβ com o anticorpo imobilizado e determinando se IL-Ιβ está ligada ao anticorpo e fazendo contactar uma forma solúvel de IL-1RI com o complexo de anticorpo ligado a IL-Ιβ e determinando se IL-1RI solúvel está ligado ao complexo. O protocolo pode também incluir o contacto de IL-1RI solúvel com o anticorpo imobilizado antes do contacto com IL-Ιβ, para confirmar que IL-1RI solúvel não se liga ao anticorpo imobilizado. Este protocolo pode ser realizado utilizando um dispositivo Biacore® para análise cinética das interacções de ligação. Esse protocolo pode também ser utilizado para determinar se um anticorpo ou outra molécula permite ou bloqueia a ligação de IL-Ιβ ao receptor de IL-1 do tipo I. 44

Para outros ensaios de ligação de IL-^/IL-lRI, pode-se determinar a permissão ou o bloqueio da ligação de IL-Ιβ ao receptor de IL-1 do tipo I comparando a ligação de IL-Ιβ a IL-1RI na presença ou na ausência de anticorpos de IL-Ιβ ou dos seus fragmentos de ligação a IL-Ιβ. 0 bloqueio é identificado na leitura do ensaio como uma redução designada da ligação de IL-Ιβ ao receptor de IL-1 do tipo I na presença de anticorpos anti-IL-Ιβ ou dos seus fragmentos de ligação a IL-Ιβ, quando comparados com uma amostra de controlo que contém o tampão ou o diluente correspondentes mas não um anticorpo de IL-Ιβ ou um seu fragmento de ligação a IL-Ιβ. A leitura do ensaio pode ser visionada qualitativamente conforme indique a presença ou a ausência de bloqueio ou pode ser vista quantitativamente se indicar a percentagem ou a redução da dobragem na ligação devidos à presença do anticorpo ou de fragmento.

Alternativamente ou adicionalmente, quando um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um fragmento de ligação a IL-Ιβ praticamente bloqueia a ligação de IL-Ιβ a IL-1RI, a ligação de IL-Ιβ a IL-1RI é reduzida pelo menos 10 vezes, alternativamente pelo menos 20 vezes, alternativamente pelo menos 50 vezes, alternativamente pelo menos 100 vezes, alternativamente pelo menos 1.000 vezes, alternativamente pelo menos 10.000 vezes ou mais, em comparação com a ligação, nas mesmas concentrações, de IL-Ιβ e IL-1RI, na ausência do anticorpo ou do fragmento. Como outro exemplo, quando um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um fragmento de ligação a IL- 1β praticamente permite a ligação de IL-Ιβ a IL-1RI, a ligação de IL-Ιβ a IL-1RI é pelo menos de cerca de 90 o o / alternativamente pelo menos de cerca de 95 o 0 r alternativamente pelo menos de cerca de 99 o o t alternativamente pelo menos de cerca de 99, 9 o 0 r alternativamente pelo menos de cerca de 99, 99 o O t 45 alternativamente pelo menos de cerca de 99,999 %, alternativamente pelo menos de cerca de 99,9999 %, alternativamente praticamente idêntica à ligação, nas mesmas concentrações, de IL-Ιβ e IL-1RI, na ausência do anticorpo ou do fragmento. A presente invenção também tem por objecto anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou fragmentos de ligação a IL-Ιβ que se ligam ao mesmo epitopo ou praticamente ao mesmo epítopo que um ou mais dos anticorpos exemplificados aqui descritos. Alternativamente ou adicionalmente, os anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ competem com a ligação de um anticorpo que tenha a região variável de cadeia leve da SEQ ID N°. 11 e a região variável de cadeia pesada da SEQ ID N°. 15. Alternativamente ou adicionalmente, a presente invenção engloba os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ que se ligam a um epitopo contido nas sequências de aminoácidos E S V D P KN Y P KKKME KR FVFNKIE (SEQ ID N°. 36), um epitopo a que se ligam os anticorpos designados por AB5 e AB7. Tal como se considera aqui, pode-se determinar facilmente se um anticorpo ou um fragmento de ligação a IL-Ιβ se ligam ao mesmo epitopo ou praticamente ao mesmo epitopo que um ou mais dos anticorpos exemplificados, tal como para o anticorpo exemplificado designado por AB7, utilizando qualquer um dos vários processos conhecidos na técnica.

Os residuos de aminoácidos-chave (epitopo) ligados por um anticorpo ou um fragmento de ligação a IL-Ιβ podem ser determinados utilizando um fragmento de péptido similar ao do processo descrito no exemplo 11. Uma matriz de péptido, tal como, por exemplo, uma matriz do péptido PepSpot™ (JPT Peptide Technologies, Berlim, Alemanha), com um rastreio de doze péptidos de aminoácidos, que se espalham por toda a sequência de aminoácidos de IL-Ιβ, cada péptido sobrepondo-se 46 em onze aminoácidos ao anterior, é sintetizado directamente numa membrana. A membrana que comporta os péptidos é então sondada com o anticorpo para qual se procura a informação de ligação ao epitopo, por exemplo, a uma concentração de 2 yg/mL, durante 2 h, à temperatura ambiente. A ligação do anticorpo aos péptidos ligados à membrana pode ser detectada utilizando um anticorpo secundário anti-humano (ou de murganho, quando apropriado) de cabra, conjugado com PRS (peroxidade de rábano silvestre, HRP em inglês), seguido de quimioluminescência aumentada (ECL). As manchas de péptidos que correspondem a residuos ou sequências de aminoácidos particulares da proteina madura de IL-Ιβ e que têm pontuação positiva para a ligação do anticorpo são indicativos da ligação do epitopo por meio de um anticorpo particular.

As experiencias de concorrência do anticorpo podem ser realizadas e esses ensaios são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, para determinar se um anticorpo ou um fragmento se ligam a um epitopo contido numa sequência de péptidos compreendendo os aminoácidos ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE, que correspondem aos resíduos 83-105 da proteína madura de IL-Ιβ, pode-se comparar um anticorpo de especificidade desconhecida com qualquer um dos exemplos de anticorpos (por exemplo, AB7) da presente invenção que se sabe que se ligam a um epitopo particular contido dentro desta sequência. Os ensaios de comparação da ligação podem ser realizados, por exemplo, utilizando um dispositivo Biacore® para a análise cinética das interacções de ligação ou por ELISA. Nesses ensaios, o anticorpo, de especificidade desconhecida para o epitopo, é avaliado quanto à sua capacidade para competir na ligação contra o anticorpo conhecido com que se compara (por exemplo, AB7) . A comparação da ligação para um epitopo particular é determinada por uma redução na ligação do epitopo de IL-Ιβ de pelo menos cerca de 50 % ou pelo menos cerca de 70 % ou pelo 47 menos cerca de 80 % ou pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % ou pelo menos cerca de 99 % ou cerca de 100 % para o anticorpo conhecido que está a ser comparado (por exemplo, AB7) e é indicativo da ligação a praticamente o mesmo epítopo.

Tendo em vista a identificação, nesta descrição, das regiões de ligação a IL-Ιβ nos exemplos de anticorpos e/ou nos epitopos reconhecidos pelos anticorpos descritos, considera-se que podem ser gerados mais anticorpos com caracteristicas de ligação similares e utilidade terapêutica ou de diagnóstico que é paralela à das modalidades da presente descrição.

Além disso, os anticorpos e os fragmentos de IL-Ιβ da presente invenção englobam qualquer uma das sequências de aminoácidos anteriores, de cadeias leves ou pesadas, com uma ou mais substituições conservadoras (por exemplo, as substituições conservadoras 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15) . À luz da presente descrição, pode-se determinar as posições, de uma sequência de aminoácidos, que são candidatas a substituições conservadoras e pode-se seleccionar aminoácidos sintéticos ou de ocorrência natural que efectuam substituições conservadoras para quaisquer aminoácidos particulares. As considerações para seleccionar as substituições conservadoras incluem o contexto no qual se faz qualquer substituição particular de aminoácidos, a hidrofobicidade ou a polaridade da cadeia lateral, a dimensão genérica da cadeia lateral e o valor de pK das cadeias laterais com carácter ácido ou básico, em condições fisiológicas. Por exemplo, a lisina, a arginina e a histidina são muitas vezes substituídas apropriadamente umas pelas outras. Como é sabido da técnica, isto verifica-se porque os três aminoácidos têm cadeias laterais básicas, enquanto o 48 valor de pK das cadeias laterais de lisina e de arginina estão muito mais próximos uns dos outros (cerca de 10 e 12) do que o da histidina (cerca de 6). Do mesmo modo, a glicina, a alanina, a valina, a leucina e a isoleucina são muitas vezes apropriadamente substituídas umas pelas outras com a condição de que a glicina muitas vezes não é apropriadamente substituída pelos outros elementos do grupo. Isto verifica-se porque cada um destes aminoácidos é relativamente hidrofóbico quando incorporado num polipéptido mas a falta de um carbono oí na glicina permite a rotação dos ângulos phi e psi (à volta do carbono a) por isso a maior liberdade conformacional dos resíduos de glicinilo pode provocar alterações na estrutura conformacional secundária o que não ocorre muitas vezes quando os outros aminoácidos são substituídos uns pelos outros. Outros grupos de aminoácidos que frequentemente são apropriados para serem substituídos uns pelos outros incluem, mas não se limitam ao grupo que consiste nos ácidos glutâmico e aspártico; o grupo consiste em fenilalanina, tirosina e triptofano; e o grupo consiste em serina, treonina e, eventualmente, tirosina.

Ao fazer modificações conservadoras à sequência de aminoácidos ou modificações correspondentes aos nucleótidos que os codificam, pode-se produzir anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou fragmentos de ligação a IL-Ιβ que tenham características funcionais e químicas semelhantes à dos exemplos de anticorpos e fragmentos aqui descritos. Pelo contrário, podem conseguir-se modificações substanciais nas características funcionais e/ou químicas dos anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou dos fragmentos de ligação a IL-Ιβ seleccionando substituições que diferem significativamente, no seu efeito, na manutenção de (a) a estrutura da matriz molecular na área de substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou em hélice, (b) a carga ou a 49 hidrofobicidade da molécula no sítio-alvo ou (c) o volume da cadeia lateral.

Os fragmentos de ligação ao antigénio de um anticorpo incluem fragmentos que retêm a capacidade de se ligarem especificamente a um antigénio, geralmente por retenção da porção de ligação ao antigénio do anticorpo. Está bem estabelecido que a função de ligação ao antigénio de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo. Exemplos dessas porções de ligação ao antigénio incluem (i) um fragmento Fab, que é um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VP, CL e CPI; (ii) um fragmento F(ab')2, que é um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfureto na região de charneira; (iii) um fragmento Fd, que representa os domínios VP e CPI; (iv) um fragmento Fv, que representa os domínios VL e VP de uma ramificação simples de um anticorpo (v) um fragmento de Acd (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que é um domínio VP; e (vi) uma região de determinação de complementaridade (RDC) isolada. Os anticorpos de cadeia simples estão também englobados dentro do termo de porção de um anticorpo de ligação ao antigénio. Os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ da presente invenção também englobam domínios monovalentes ou multivalentes ou monoméricos ou multiméricos (por exemplo, tetraméricos) de ligação derivados de RDC ou com ou sem uma matriz (por exemplo, uma matriz de proteína ou de hidrato de carbono).

Os anticorpos ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ da presente invenção podem fazer parte de moléculas de imuno-adesão maiores, formadas por uma associação covalente ou não covalente do anticorpo ou de uma porção do anticorpo com uma ou mais proteínas ou péptidos. Exemplos dessas moléculas de 50 imuno-adesão incluem a utilização da região nuclear de estreptavidina para produzir uma molécula tetramérica de scFv (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and

Hybridomas 6: 93-101) e a utilização de um resíduo de cisterna, um péptido marcador e um marcador de poli-histidina do terminal C, para produzir moléculas bivalentes e biotiniladas de scFv (Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Os anticorpos e os fragmentos que compreendem moléculas de imuno-adesão podem ser obtidos utilizando técnicas padrão de ADN recombinante, tal como descrito aqui. As porções preferidas de ligação ao antigénio são domínios completos ou pares de domínios completos.

Os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ da presente invenção também englobam fragmentos de anticorpo de domínio (Acd) (Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989) que consistem num domínio VP. Os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ da presente invenção também englobam diacorpos que são anticorpos bivalentes nos quais os domínios VP e VL estão expressos numa única cadeia polipeptídica, mas utilizando um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando assim os domínios a emparelharem-se com domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação do antigénio (ver, por exemplo, patente EP 404,097; WO 93/11161; Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448, 1993 e Poljak et al., Structure 2: 1121-1123, 1994) . Os diacorpos podem ser bi-específicos ou mono-específicos .

Os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ da presente invenção também englobam fragmentos de anticorpo de cadeia simples (scFv) que se ligam a IL-Ιβ. Um scFv compreende uma região variável de cadeia pesada (VP) do 51 anticorpo ligada operacionalmente a uma região variável de cadeia leve (VL) do anticorpo, em que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve, em conjunto ou individualmente, formam um sitio de ligação que se liga a IL-Ιβ. Um scFv pode compreender uma região VP na extremidade do terminal amino e uma região VL na extremidade do terminal carboxi. Alternativamente, scFv pode compreender uma região VL na extremidade do terminal amino e uma região VP numa extremidade do terminal carboxi. Além disso, embora os dois dominios do fragmento Fv, VL e VP, sejam codificados por genes separados, podem juntar-se, utilizando processos recombinantes, por meio de um ligante sintético que lhes permite tornarem-se numa cadeia única de proteína, em que as regiões VL e VP se emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidos como Fv de cadeia simples (scFv); ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883) .

Um scFv pode eventualmente compreender ainda um ligante de polipéptido entre a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve. Esses ligantes de polipéptido geralmente compreendem entre 1 e 50 aminoácidos, alternativamente entre 3 e 12 aminoácidos, alternativamente 2 aminoácidos. Um exemplo de um péptido ligante para a ligação das cadeias pesada e leve num scFv compreende a sequência de 5 aminoácidos Gli-Gli-Gli-Gli-Ser (SEQ ID N°. 37). Outros exemplos compreendem uma ou mais repetições, em tandem, dessa sequência (por exemplo, um polipéptido compreendendo duas a quatro repetições de Gli-Gli-Gli-Gli-Ser (SEQ ID N° . 37)) para criar ligantes.

Os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ da presente invenção também englobam anticorpos de cadeia pesada 52 (AcCP). As excepções das estruturas P2L2 de anticorpos convencionais ocorrem nalguns isotipos das imunoglobulinas encontradas em camelídeos (camelos, dromedários e lamas; Hamers-Casterman et al., 1993 Nature 363: 446; Nguyen et al., 1998 J. Mol. Biol. 275: 413), tubarões-tapete (Nuttall et al., Mol Immunol. 38:b313-26, 2001), tubarões-dormidores (Greenberg et al., Nature 374: 168-73, 1995; Roux et al., 1998 Proc. Nat. Acad. Sei. USA 95: 11804) e na ratazana-americana (Nguyen, et al., "Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation", 2002 Immunogenetics 54 (1): 39-47). Estes anticorpos aparentemente podem formar regiões de ligação ao antigénio utilizando apenas a região variável de cadeia pesada, pelo facto destes anticorpos funcionais serem dímeros apenas de cadeias pesadas (referidos como "anticorpos de cadeia pesada" ou "AcCP"). De acordo com isto, algumas modalidades dos presentes anticorpos e fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem ser anticorpos de cadeia pesada (AcCP) que se ligam especificamente a IL-Ιβ. Por exemplo, os anticorpos de cadeia pesada que são uma classe de IgG e não possuem cadeias leves são produzidos por animais do género Camelidae que incluem camelos, dromedários e lamas (Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993)). Os AcCP têm um peso molecular de cerca de 95 kDa em vez de um peso molecular de cerca de 160 kDa dos anticorpos convencionais IgG. Os seus domínios de ligação consistem apenas em domínios variáveis de cadeia pesada, muitas vezes referidos como VPP para os distinguir dos VP convencionais. Muyldermans et al., J. Mol. Recognit. 12: 131-140 (1999). O domínio variável dos anticorpos de cadeia pesada é algumas vezes referido como um nanocorpo (Cortez-Retamozo et al., Câncer Research 64: 2853-57, 2004). Pode-se gerar uma biblioteca de nanocorpos a partir de um dromedário imunizado tal como descrito em Conrath et al., (Antimicrob Agents 53

Chemother 45: 2807-12, 2001) ou utilizando processos recombinantes.

Dado que o primeiro dominio constante (CPi) está ausente (eliminado durante o tratamento de ARNm devido à perda de um sinal de consenso eliminado) , o dominio variável (VPP) é imediatamente seguido da região de charneira, os domínios CP2 e CP3 (Nguyen et al. , Mol. Immunol. 36: 515-524 (1999); Woolven et al., Immunogenetics 50: 98-101 (1999)). O VPP de camelídeo já foi referido como podendo recombinar-se com as regiões constantes de IgG2 e IgG3 que contêm a charneira, e os domínios CP2 e CP3 a que falta o domínio CPI (Hamers-Casterman et al., supra). Por exemplo, a IgGl de lama é um isotipo convencional de anticorpo (P2L2) em que VP se recombina com uma região constante que contém a charneira, os domínios CPI, CP2 e CP3, enquanto a IgG2 de lama e a IgG3 de lama são isotipos apenas com cadeias pesadas a que falta os domínios CPI e que não contêm cadeias leves.

Embora os AcCP não tenham cadeias leves, têm um reportório de ligação ao antigénio. O mecanismo genético de geração de AcCP está revisto em Nguyen et al. Adv. Immunol 79: 261-296 (2001) e Nguyen et al., Immunogenetics 54: 39-47 (2002). Os tubarões, incluindo os tubarões-dormidores, exibem domínios V monoméricos simples similares contendo o receptor do antigénio. Irving et al., J. Immunol. Methods 248: 31-45 (2001); Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95: 11804 (1998) .

As VPP compreendem pequenos fragmentos de ligação ao antigénio intactos (por exemplo, os fragmentos de cerca de 15 kDa, os resíduos 118-136). Verificou-se que os domínios VPP de camelídeos se ligam ao antigénio com uma elevada afinidade (Desmyter et al., J. Biol. Chem. 276: 26285-90, 2001), com 54 afinidades de VPP normalmente numa gama nanomolar e comparáveis com as dos fragmentos Fab e scFv. Os VPP são altamente solúveis e são mais estáveis do que os derivados dos fragmentos scFv e Fab correspondentes. Os fragmentos de VP têm sido relativamente dificeis de produzir sob a forma solúvel mas podem obter-se melhorias na solubilidade e na ligação específica quando os resíduos estruturais são alterados para serem mais semelhantes a VPP. (Ver, por exemplo, Reichman et al., J Immunol Methods 1999, 231: 25- 38) . As VPP comportam substituições de aminoácidos que os tornam mais hidrofílicos e previnem uma interacção prolongada com BiP (a proteína de ligação à cadeia pesada de imunoglobulina), que se liga normalmente à cadeia P no retículo endoplásmico (RE) durante a dobragem e a união, até ser deslocado pela cadeia L. Como aumenta a hidrofilicidade das VPP, melhora a secreção do RE.

As V pp funcionais podem ser obtidas por clivagem proteolítica de AcCP de um camelídeo imunizado, por clonagem directa dos genes de VPP de células B de um camelídeo imunizado resultante em VPP recombinantes de bibliotecas naturais ou sintéticas. Podem obter-se VPP com a especificidade do antigénio desejada através de uma metodologia de exibição de fagos. A utilização de VPP na visualização de fagos é mais simples e mais eficiente comparada com os Fab ou scFv, dado que apenas um domínio necessita de ser clonado e expresso para se obter um fragmento funcional de ligação ao antigénio. Muyldermans, Biotechnol. 74: 277-302 (2001); Ghahroudi et al., FEBS Lett. 414: 521-526 (1997); e van der Linden et al., J. Biotechnol. 80: 261-270 (2000). Os processos para gerar anticorpos, tendo cadeias pesadas de camelídeos, estão também descritos na publicação das patentes norte-americanas N°s. 20050136049 e 20050037421. 55

Os processos de exibição de ribossomas podem ser utilizados para identificar e isolar moléculas de scFv e/ou Vpp com a actividade e afinidade de ligação desejadas. Irving et al., J. Immunol. Methods 248: 31-45 (2001). A exibição de ribossomas e a sua selecção tem o potencial de gerar e exibir grandes bibliotecas (1014) .

Outras modalidades providenciam moléculas semelhantes a Vpp geradas através do processo de camelização, por meio da modificação de VP não pertencentes a Camelidae, tais como VPP humanas, para melhorar a sua solubilidade e prevenir ligações não especificas. Consegue-se isto substituindo os residuos no lado de VL das VP por residuos semelhantes a VPP, mimetizando assim os fragmentos de VPP mais solúveis. Os fragmentos de VP camelizados, particularmente os que se baseiam numa estrutura humana, devem exibir uma resposta imunitária muito reduzida quando administrados in vivo a um paciente e, de acordo com isto, espera-se que tenham vantagens significativas para aplicações terapêuticas. Davies et al., FEBS Lett. 339: 285-290 (1994); Davies et al., Protein Eng. 9: 531-537 (1996); Tanha et al., J. Biol. Chem. 276: 24774-24780 (2001); e Riechmann et al., Immunol. Methods 231: 25-38 (1999).

Existe disponível uma vasta gama de sistemas de expressão para a produção de fragmentos de IL-Ιβ incluindo fragmentos Fab, scFv e VPP. Por exemplo, podem utilizar-se sistemas de expressão com origem tanto procariótica como eucariótica para a produção em larga escala de fragmentos de anticorpos e proteínas de fusão de anticorpos. Particularmente vantajosos são os sistemas de expressão que permitem a secreção de grandes quantidades de fragmentos de anticorpos no meio de cultura. 56 A produção de Fab-scFv bi-específicos ("bicorpos") e Fab-(scFv)(2) tri-específicos ("tricorpos") estão descritos em Schoonjans et al. (J Immunol. 165: 7050-57, 2000) e Willems et al. (J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sei. 786: 161-76, 2003). Para os bicorpos ou tricorpos funde-se uma molécula de scFv com uma ou ambas as cadeias de VL-CL (L) e VP-CPi (Fd), por exemplo, para produzir um tricorpo fundem-se dois scFv com o terminal C de Fab enquanto num bicorpo se funde um scFv com o terminal C de Fab. Um "minicorpo" consiste num scFv fundido com CP3 por via de um ligante de péptido (sem charneira) ou por via de uma charneira de IgG tal como foi descrito em Olafsen, et al., Protein Eng Des Sei. 2004 Apr; 17 (4): 315-23.

Intracorpos são anticorpos de cadeia simples que exibem expressão intracelular e podem manipular a função da proteína intracelular (Biocca, et al., EMBO J. 9: 101-108, 1990; Colby et al., Proc Natl Acad Sei USA. 101: 17616-21, 2004). Os intracorpos que compreendem sequências de sinal de células que retêm a estrutura do anticorpo nas regiões intracelulares podem ser produzidos tal como descrito em Mhashilkar et al. (EMBO J 14: 1542-51, 1995) e Wheeler et al. (FASEB J. 17: 1733-5. 2003). Os transcorpos são anticorpos premeáveis às células em que os domínios de transdução de proteínas (DTP) estão fundidos com anticorpos de fragmentos variáveis de cadeia simples (scFv) Heng et al., (Med Hypotheses. 64: 1105-8, 2005).

Os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ da presente invenção também englobam anticorpos que são PFMP ou proteínas de fusão de imunoglobulinas do domínio de ligação, específicas para a proteína-alvo. Estas estruturas são polipéptidos de cadeia simples que compreendem domínios de ligação do antigénio fundidos com os domínios da 57 imunoglobulina necessários para realizar as funções efectoras do anticorpo. Ver, por exemplo, WO 03/041600, publicação da patente norte-americana 20030133939 e publicação da patente norte-americana 20030118592.

Os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ da presente invenção também englobam imuno-adesinas. Pode incorporar-se uma ou mais RDC numa molécula quer covalentemente ou de forma não covalente para torná-la numa imuno-adesina. As imuno-adesinas podem incorporar as RDC como parte de uma cadeia maior de polipéptido, podem ligar covalentemente as RDC a outra cadeia de polipéptido ou podem incorporar as RDC de forma não-covalente. As RDC aqui descritas permitem que as imuno-adesinas se liguem especificamente a IL-Ιβ.

Os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ da presente invenção também englobam estruturas que imitam os anticorpos e que compreendem uma ou mais porções de ligação a IL-Ιβ construidas sobre uma estrutura orgânica ou molecular (tal como uma estrutura de proteína ou de hidrato de carbono). As proteínas têm estruturas tridimensionais relativamente definidas, normalmente referidas como estruturas das proteínas e podem ser utilizadas como reagentes para a produção de estruturas que simulam anticorpos. Estas estruturas normalmente contêm uma ou mais regiões que estão disponíveis para variações de sequências específicas ou aleatórias e essa aleatorização das sequências é muitas vezes realizada para produzir bibliotecas de proteínas a partir das quais se podem seleccionar os produtos desejados. Por exemplo, uma estrutura que simula um anticorpo pode compreender um polipéptido de ligação a uma não imunoglobulina quimérica com um domínio semelhante a imunoglobulina contendo uma estrutura com duas ou mais 58 espiras expostas a um dissolvente contendo uma RDC diferente de um anticorpo parental inserido em cada uma das espiras e exibindo uma actividade de ligação selectiva em relação a uma ligação de um ligando, por parte do anticorpo parental. Estruturas de proteínas gue não são imunoglobulinas já foram propostas para a obtenção de proteinas com novas propriedades de ligação. (Tramontano et al., J. Mol. Recognit. 7: 9, 1994; McConnell and Hoess, J. Mol. Biol. 250: 460, 1995). Outras proteinas foram ensaiadas como estruturas e têm sido utilizadas para exibir resíduos aleatórios em superfícies alfa-helicoidais (Nord et al., Nat. Biotechnol. 15: 772, 1997; Nord et al., Protein Eng. 8: 601, 1995) e espiras entre as hélices alfa em feixes de hélices alfa (Ku e Schultz, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 6552, 1995) e as espiras restringidas por pontes de dissulfureto, tal como as dos inibidores pequenos de protease (Markland et al., Biochemistry 35: 8045, 1996; Markland et al., Biochemistry 35: 8058, 1996; Rottgen e Collins, Gene 164: 243, 1995; Wang et al., J. Biol. Chem. 270: 12250, 1995). Os processos para a utilização de estruturas para produzir novas estruturas que simulam anticorpos estão descritos na patente norte-americana 5.770.380 e nas publicações das patentes norte-americanas 2004/0171116, 2004/0266993 e 2005/0038229.

Assim, pode gerar-se uma variedade de anticorpos e fragmentos de ligação a IL-Ιβ, que compreendem uma, duas e/ou três RDC de uma região variável de cadeia pesada das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 ou das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos ou uma região variável de cadeia leve das SEQ ID N°. 9, 10 ou 11 ou das SEQ ID N°. 9, 10 ou 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos. 59

Os anticorpos ou os fragmentos que estão descritos neste contexto da presente invenção ligam-se a IL-Ιβ com (i) com uma CI5o de cerca de 0,5 nM ou menos (por exemplo, cerca de 0,4 ou menos, cerca de 0,3 ou menos ou mesmo cerca de 0,2 ou menos), conforme determinado pelo ensaio de imuno-absorção ligado a enzimas (ELISA), (ii) uma afinidade maior pelo menos cerca de 100 vezes (por exemplo, pelo menos cerca de 150 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes ou mesmo pelo menos cerca de 250 vezes) relativamente à sua ligação de IL-la (isto é, tem uma selectividade para IL-Ιβ superior a IL-la pelo menos cerca de 100 vezes (por exemplo, pelo menos cerca de 150 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes ou mesmo pelo menos cerca de 250 vezes)) e/ou (iii) uma constante de dissociação da ligação de equilíbrio (KD) para IL-Ιβ de cerca de 20 pM ou menos (por exemplo, cerca de 15 pM ou menos, cerca de 10 pM ou menos ou mesmo cerca de 5 pM ou menos) . Também são preferidos os anticorpos ou fragmentos da presente invenção que inibem a expressão de IL-6 no soro de um animal, induzida por IL-Ιβ, de pelo menos 50 % (por exemplo, pelo menos 60 %, pelo menos 70 % ou mesmo pelo menos 80 %) quando comparado com o nível de IL-6 no soro num animal estimulado por IL-Ιβ a que não tenha sido administrado um anticorpo ou um fragmento da presente invenção. De acordo com isto, a presente invenção, num dos seus aspectos, providencia um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um fragmento do anticorpo de ligação a IL-Ιβ que tem pelo menos uma das caracteristicas mencionadas antes.

Embora a presente invenção tenha sido aqui descrita em relação aos anticorpos de ligação a IL-Ιβ e aos seus fragmentos (por exemplo, compreendendo uma cadeia leve e pesada), a presente invenção também tem por objecto polipéptidos para além dos anticorpos de ligação a IL-Ιβ ou dos fragmentos dos anticorpos, tais como polipéptidos de 60 cadeia simples (incluindo polipéptidos de fusão, polipéptidos quiméricos, conjugados e similares). Assim, no contexto da presente invenção, descreve-se um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos de uma qualquer das SEQ ID N°. 8, 14, 15 25 ou 26 ou das SEQ ID N°. 8, 14, 15, 25 ou 26 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos ou das SEQ ID N°. 9, 10 ou 11 ou das SEQ ID N°. 9, 10 ou 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos ou um seu fragmento equivalente sob o ponto de vista funcional.

Os anticorpos e os fragmentos de anticorpos aqui descritos podem ser preparados por qualquer processo apropriado. Os processos apropriados para a preparação desses anticorpos e dos fragmentos dos anticorpos são conhecidos na técnica. Outros processos para a preparação de anticorpos e fragmentos de anticorpos são aqui descritos como parte da presente invenção. O anticorpo, o fragmento de anticorpo ou o polipéptido da presente invenção, tal como aqui descritos, podem ser isolados ou purificados em qualquer grau. Tal como se utiliza aqui, um composto isolado é um composto que tenha sido removido do seu ambiente natural. Um composto purificado é um composto a que se aumentou a pureza, de tal modo que o composto exista numa forma que é mais pura do que a que existe (i) no seu ambiente natural ou (ii) quando inicialmente sintetizado e/ou amplificado em condições laboratoriais, em que "pureza" é um termo relativo e não significa necessariamente "pureza absoluta".

Qualquer dos anticorpos e dos fragmentos de anticorpos anteriores ou dos polipéptidos anteriores da presente invenção podem ser humanizados ou humanos tratados por engenharia genética, tal como se descreve aqui. 61

Processos de preparação de anticorpos ou de fragmentos de anticorpos de IL-Ιβ

No contexto da presente invenção, descreve-se um processo de preparação de um polipéptido maduro de ligação a IL-Ιβ por afinidade, tal como um anticorpo ou um fragmento de anticorpo (incluindo uma região de anticorpo (por exemplo, uma região variável de cadeia leve ou pesada ou qualquer uma das suas partes, tal como uma RDC)), processo esse que compreende (a) providenciar um primeiro ácido nucleico que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipéptido de ligação a IL-Ιβ, que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID N°s. 1-26 e um segundo ácido nucleico que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que difere da primeira sequência de ácidos nucleicos por pelo menos um nucleótido, (b) realizar o arrastamento de ácidos nucleicos para providenciar dois ou mais ácidos nucleicos mutados e (c) seleccionar um ácido nucleico mutado que codifica um polipéptido que (i) se liga a IL-Ιβ com uma afinidade maior do que o polipéptido codificado pelo primeiro ácido nucleico, (ii) tem uma selectividade para IL-Ιβ superior à de IL-Ια que é maior do que a do polipéptido codificado pelo primeiro ácido nucleico, (iii) tem uma constante de dissociação da ligação em equilíbrio (KD) para IL-Ιβ que é inferior à do polipéptido codificado pelo primeiro ácido nucleico ou (iv) inibe a expressão de IL-6 no soro, induzida por IL-Ιβ, num animal, num grau maior que a do polipéptido codificado pelo primeiro ácido nucleico e (d) expressa o ácido nucleico mutado seleccionado para providenciar um polipéptido de IL-Ιβ maturado por afinidade. Preferencialmente, o polipéptido é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, tal como qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos aqui descritos como parte da presente invenção. 62 0 processo de preparação de um polipéptido de IL-Ιβ maturado por afinidade compreende ainda, eventualmente, a repetição das etapas (b) e (c) uma ou mais vezes, em que o arrastamento do ácido nucleico da etapa (b) é realizado utilizando (i) pelo menos um ácido nucleico mutado seleccionado da etapa (c) e (ii) pelo menos um ácido nucleico com uma sequência de ácidos nucleicos que difere do ácido nucleico mutado seleccionado por pelo menos um nucleótido. Preferencialmente, as etapas (b) e (c) são repetidas até se seleccionar um ácido nucleico optimizado. Selecciona-se um ácido nucleico optimizado quando já não é possível seleccionar um ácido nucleico que codifica um polipéptido que tenha características de ligação, em relação a IL-Ιβ (por exemplo, as características (i)-(iv) da etapa (c) ) que são superiores às de um polipéptido codificado por um ácido nucleico previamente seleccionado.

Desejavelmente, as etapas (b) e (c) repetem-se até se seleccionar um ácido nucleico que codifica um polipéptido tendo pelo menos uma das seguintes propriedades: (i) liga-se a IL-Ιβ com uma CI50 de cerca de 0,5 nM ou menos (por exemplo, cerca de 0,4 ou menos, cerca 0,3 ou menos ou mesmo cerca de 0,2 ou menos), conforme determinado pelo ensaio de imuno-absorção ligado a enzimas (ELISA), (ii) liga-se a IL-Ιβ com uma afinidade pelo menos cerca de 100 vezes maior (por exemplo, pelo menos cerca de 150 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes ou mesmo pelo menos cerca de 250 vezes) relativamente à sua ligação de IL-Ια (isto é, tem uma selectividade para IL-Ιβ superior a IL-Ια pelo menos cerca de 100 vezes (por exemplo, pelo menos cerca de 150 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes ou mesmo pelo menos cerca de 250 vezes)), (iii) liga-se a IL-Ιβ com uma conste de dissociação da ligação de equilíbrio (KD) , para IL-Ιβ, de cerca de 20 pM ou menos (por exemplo, cerca de 15 pM ou menos, cerca de 10 63 pM ou menos, 5 pM ou menos, 3 pM ou menos, 2 pM ou menos, 1 pM ou menos, 0,7 pM ou menos, 0,5 pM ou menos, 0,3 pM ou menos, 0,2 pM ou menos) ou (iv) inibem a expressão de IL-6 no soro de um animal, induzida por IL-Ιβ, de pelo menos 50 % (por exemplo, pelo menos 60 %, pelo menos, 70 % ou mesmo pelo menos 80 %) quando comparada com o nivel de IL-6 no soro de num animal, estimulado por IL-Ιβ, a que não tenha sido administrado um anticorpo ou um fragmento da presente invenção. A selecção de um ácido nucleico mutado que codifica um polipéptido que tenha as propriedades desejadas pode ser realizada por qualquer processo apropriado. Os processos para a expressão de polipéptidos codificados e as análises dos polipéptidos quanto à afinidade de ligação, selectividade de ligação, constante de equilíbrio da ligação e inibição da expressão de IL-6 induzida por IL-Ιβ estão aqui descritos (ver exemplos). Outros processos apropriados são conhecidos na técnica. Quando o polipéptido codificado pelo ácido nucleico mutado providenciado pela etapa (b) não é um anticorpo ou um fragmento inteiro de anticorpo (por exemplo, Fab) , pode ser necessário providenciar um anticorpo que compreenda o polipéptido de modo a determinar se o polipéptido cumpre os critérios de selecção. Assim, o processo de preparação de um polipéptido de IL-Ιβ maturado por afinidade pode ainda compreender uma etapa em que se providencia um anticorpo que compreende o polipéptido codificado pelo ácido nucleico mutado, em que a etapa de selecção do ácido nucleico mutado que codifica um polipéptido com as propriedades desejadas é realizada por análise do anticorpo. O arrastamento do ácido nucleico, tal como utilizado aqui, significa a fragmentação de duas ou mais sequências de 64 ácidos nucleicos para providenciar um conjunto de fragmentos de ácidos nucleicos aleatórios e a reunião dos fragmentos para criar dois ou mais ácidos nucleicos mutados. Sob este ponto de vista, um ácido nucleico mutado é meramente um ácido nucleico que tem uma sequência de ácidos nucleicos que tenha sido alterada. 0 arrastamento dos ácidos nucleicos pode ser realizado por qualquer processo apropriado. Conhecem-se nesta técnica muitos processos apropriados tal como os descritos nas patentes norte-americanas 6.489.145; 6.773.900; 6.764.835; 6.740.506; 6.713.282; 6.713.281; 6.713.279; 6.709.841; 6.696.275; 6.677.115; 6.673.552; 6.656.677; 6.605.449; 6.566.050; 6.562.594; 6.555.315; 6.537.776; 6.528.249; 6.479.258; 6.455.254; 6.440.668; 6.368.798; 6.361.974; 6.358.709; 6.352.842; 6.344.328; 6.335.179; 6.280.926; 6.238.884; 6.174.673; 6.171.820; 6.168.919; 6.057.103; 6.054.267; 6.030.779; 6.001.574; 5.965.408; 5.958.672; 5.939.250; 5.763.239; 6.395.547; 6.376.246; 6.372.497; 6.368.861; 6.365.408; 6.365.377; 6.358.740; 6.358.742; 6.355.484; 6.344.356; 6.337.186; 6.335.160; 6.323.030; 6.319.714; 6.319.713; 6.303.344; 6.297.053; 6.291.242; 6.287.861; 6.277.638; 6.180.406; 6.165.793; 6.132.970; 6.117.679; 5.834.252; 5.830.721; 5.811.238; 5.605.793. Ácidos Nucleicos

Os anticorpos, os fragmentos de anticorpos e os polipéptidos que estão descritos no contexto da presente invenção podem ser codificados por um único ácido nucleico (por exemplo, um único ácido nucleico que compreenda sequências de nucleótidos que codificam os polipéptidos de cadeia leve e pesada do anticorpo) ou por dois ou mais ácidos nucleicos separados, cada um dos quais codifica uma parte diferente do anticorpo ou do fragmento do anticorpo. Sob este 65 ponto de vista, a presente invenção providencia um ou mais ácidos nucleicos que codificam qualquer um dos anticorpos, fragmentos de anticorpos ou polipéptidos anteriores (por exemplo, qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve ou pesada anteriores) .

De acordo com um aspecto da presente invenção, a presente invenção providencia um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo ou de uma porção do anticorpo. Exemplos de sequências de ácidos nucleicos são dados nas SEQ ID N°s. 39 e 40, que codificam, respectivamente, a região variável de cadeia pesada da SEQ ID N°. 15 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID N°. 11. Sob este ponto de vista, a presente invenção descreve um ácido nucleico que codifica um polipéptido (por exemplo, uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 2, alternativamente a sequência da SEQ ID N°. 28 e, desejavelmente, codifica um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 21 (por exemplo, um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID N°s. 4-8). A presente invenção também tem por objecto sequências de ácidos nucleicos que codificam um polipéptido (por exemplo, uma região variável de cadeia pesada) que compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 12 ou SEQ ID N°. 13, por exemplo, um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos de uma qualquer das SEQ ID N°s. 14-15 ou que compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 23 ou SEQ ID N°. 24, por exemplo, das SEQ ID N° . 25 ou SEQ ID N°. 26.

Alternativamente ou adicionalmente, o ácido nucleico da presente invenção descreve uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma região variável de cadeia leve de um 66 anticorpo ou de uma porção do anticorpo. Sob este ponto de vista, a presente invenção tem por objecto um ácido nucleico que codifica um polipéptido (por exemplo, uma região variável de cadeia leve) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1. Por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos pode codificar um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 9. Mais preferencialmente, o ácido nucleico codifica um polipéptido (por exemplo, uma região variável de cadeia leve) que compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 10 ou 11.

Também estão englobados pela presente invenção os ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos anteriores, de cadeias leves ou pesadas, que compreendem uma ou mais substituições conservadoras (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições conservadoras), tal como se discutiu no que respeita ao anticorpo e ao fragmento de anticorpo da presente invenção, em que o anticorpo ou o fragmento que compreendem a substituição têm a mesma afinidade ou praticamente a mesma afinidade e especificidade de ligação ao epítopo que um ou mais dos anticorpos, fragmentos e sequências exemplificados e aqui descritos.

As sequências de ácidos nucleicos podem ser determinadas a partir das sequências de aminoácidos dos anticorpos, fragmentos de anticorpos e regiões variáveis de cadeia leve ou pesada aqui descritas, por meio de qualquer processo apropriado, tal como por conversão dessas sequências de aminoácidos nas correspondentes sequências de ácidos nucleicos, utilizando o código genético. Os ácidos nucleicos que codificam essas sequências de aminoácidos (tal como as sequências de aminoácidos aqui descritas) podem ser preparados (por exemplo, as sequências de ácidos nucleicos 67 isoladas ou sintetizadas) utilizando processos conhecidos nesta técnica, tal como os descritos, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, NY, 1994; e Herdewijn, ed., Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (Methods in Molecular Biology), Humana Press, Totowa, NJ, 2004. Os ácidos nucleicos aqui descritos podem ser isolados ou purificados em qualquer grau. Tal como se utiliza aqui, um composto isolado é um composto que tenha sido removido do seu ambiente natural. Um composto purificado é um composto a que se aumentou a pureza, de tal modo que o composto exista numa forma que é mais pura do que aquela em que existe (i) no seu ambiente natural ou (ii) quando inicialmente sintetizado e/ou amplificado, em condições laboratoriais, em que "pureza" é um termo relativo e não significa necessariamente "pureza absoluta".

Os ácidos nucleicos podem ser purificados utilizando qualquer uma das várias técnicas existentes incluindo, mas não se limitando a electroforese preparativa em gel ou focagem isoeléctrica, afinidade, imuno-afinidade ou cromatografia de permuta iónica, cromatografia de peneiro molecular, cromato-focagem ou cromatografia liquida de alta-pressão .

Vectores

Os ácidos nucleicos aqui descritos podem ser inseridos em vectores, por exemplo, vectores de expressão de ácidos nucleicos e/ou vectores-alvo. Esses vectores podem ser utilizados de várias formas, por exemplo, para a expressão de um anticorpo ou um fragmento de anticorpo de ligação a IL-Ιβ, 68 numa célula ou num animal transgénico. De acordo com isto, a presente invenção tem por objecto um vector que compreende qualquer um dos ácidos nucleicos da presente invenção. Um "vector" é qualquer molécula ou composição que tenha capacidade para comportar uma sequência de ácidos nucleicos numa célula hospedeira apropriada, onde pode ter lugar a sintese do polipéptido codificado. Normalmente e preferencialmente, um vector é um ácido nucleico que tenha sido tratado por engenharia genética utilizando técnicas de ADN recombinantes que são conhecidas nesta técnica, para incorporar uma sequência de ácidos nucleicos desejada (por exemplo, um ácido nucleico da presente invenção).

Desejavelmente, o vector é constituído por ADN. Exemplos de vectores de transferência de genes apropriados, à base de ADN, incluem plasmidos e vectores virais. Os vectores virais apropriados incluem, por exemplo, vectores à base de parvovirus (por exemplo, vectores à base de vírus adeno-associados (VAA)), vectores retrovirais, vectores à base do virus do herpes simples (VHS), vectores quiméricos adenovirais VAA, vectores à base do virus VIH e vectores à base de adenovírus. Qualquer um destes vectores pode ser preparado utilizando técnicas-padrão de ADN recombinante descritas em, por exemplo, Sambrook et al., supra, e Ausubel et al., supra. Contudo, os vectores que não são à base de ácidos nucleicos, tais como, lipossomas, também são conhecidos na técnica e podem ser utilizados em relação com a presente invenção. 0 vector da presente invenção pode basear-se num único tipo de ácido nucleico (por exemplo, um plasmido) ou numa molécula que não é um ácido nucleico (por exemplo, um lípido ou um polímero). Alternativamente, o vector pode ser uma combinação de um ácido nucleico e um ácido não nucleico (isto é, um vector "quimérico"). Por exemplo, um plasmido que comporta o ácido nucleico pode ser formulado com um lípido ou um polímero como um veículo de 69 administração. Esse vector é referido aqui como um "complexo de plasmido-lípido" e um complexo de "plasmido-polímero", respectivamente. 0 vector de transferência de genes da presente invenção pode ser integrado no genoma da célula hospedeira ou pode estar presente na célula hospedeira sob a forma de um epissoma.

Os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser inseridos em vectores de expressão de imunoglobulina, por exemplo, os vectores descritos em McLean et al., Mol. Immunol., 37: 837-45 (2000); Walls et al., Nucleic Acids Res., 21: 2921-9 (1993); e Norderhaug et al., J. Immunol. Meth., 204: 77-87 (1997).

Os vectores seleccionam-se normalmente para serem funcionais na célula hospedeira na qual o vector será utilizado (o vector é compatível com o mecanismo da célula hospedeira de tal modo que ocorra a amplificação do gene e/ou a expressão do gene). Uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo ou um fragmento de ligação a IL-Ιβ pode ser amplificada/expressa em células procarióticas de levedura, de insectos (sistemas de baculovírus) e/ou células hospedeiras eucarióticas. A selecção da célula hospedeira dependerá, em parte, de o anticorpo ou o fragmento de ligação a IL-Ιβ terem sido modificados pós-transicionalmente (por exemplo, glicosilados e/ou fosforilados). Se isso acontecer, as células preferidas são as células hospedeiras de levedura, insectos ou mamíferos. Outra informação acerca dos vectores de expressão pode ser encontrada em Meth. Enz. v. 185 (1990; Goeddel, ed.), Academic Press Inc., San Diego, Calif.

Os vectores de expressão normalmente contêm uma ou mais dos seguintes componentes: um promotor, uma ou mais sequências melhoradoras, uma origem de replicação, uma 70 sequência de terminação transcricional, uma sequência de intrão completa contendo um sitio de separação do dador e do receptor, uma sequência lider para a secreção, um sitio de ligação do ribossoma, uma sequência de poliadenilação, uma região poliligante para inserir o ácido nucleico que codifica o polipéptido a ser expresso e um elemento de um marcador seleccionável.

Os componentes do vector podem ser homólogos (das mesmas espécies e/ou estirpes que a célula hospedeira), heterólogos (de uma espécie diferente das espécies ou estirpes da célula hospedeira), híbridos (uma combinação de sequências diferentes de mais do que uma fonte), sequências sintéticas ou naturais que normalmente funcionam para regular a expressão da imunoglobulina. As fontes de componentes de vectores podem ser qualquer organismo procariótico ou eucariótico, qualquer organismo vertebrado ou invertebrado ou qualquer planta, desde que os componentes sejam funcionais e que possam ser activados pelo mecanismo da célula hospedeira.

Selecciona-se uma origem de replicação com base no tipo de célula hospedeira a ser utilizada para a expressão. A título de exemplo, a origem de replicação do plasmido pBR322 (produto N°. 303-3s, New England Biolabs, Beverly, Mass.) é útil para a maior parte das bactérias gram-negativas enquanto várias origens de SV40, polioma, adenovírus, vírus da estomatite vesicular (VEV) ou papilomavírus (tais como VPH ou VPB) são úteis para a clonagem de vectores em células de mamíferos. Geralmente, a origem da componente de replicação não é necessária para vectores de expressão de mamíferos (por exemplo, a origem de SV40 é muitas vezes utilizada porque contém o promotor precoce). 71

Uma sequência de terminação da transcrição está normalmente localizada em 3' da extremidade de um polipéptido que codifica regiões e serve para terminar a transcrição. As sequências de terminação da transcrição em células procarióticas muitas vezes compreendem um fragmento rico em G-C seguido de uma sequência de poli-T. as sequências de terminação da transcrição podem ser clonadas a partir de uma biblioteca, compradas comercialmente como parte de um vector ou sintetizadas utilizando processos para a sintese de ácidos nucleicos, tal como descritos antes.

Um elemento de um gene marcador seleccionável codifica uma proteina necessária para a sobrevivência e o crescimento de uma célula hospedeira que cresça num meio de cultura selectivo. Os genes marcadores de selecção tipicos codificam proteinas que (a) conferem resistência a antibióticos ou a outras toxinas, por exemplo, ampicilina, tetraciclina ou canamicina para as células hospedeiras procarióticas, (b) deficiências auxotróficas do complemento da célula; ou (c) fornece nutrientes críticos não disponíveis no meio do complexo. Os marcadores seleccionáveis preferidos são o gene de resistência à canamicina, o gene de resistência à ampicilina e o gene de resistência à tetraciclina. Um gene de resistência à neomicina pode também ser utilizado para selecção em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas.

Outros genes de selecção podem ser utilizados para amplificar o gene que será expresso. A amplificação é um processo em que os genes que têm maior procura para a produção de uma proteína crítica para o crescimento são reiterados em tandem dentro dos cromossomas das gerações sucessivas de células recombinantes. Exemplos de marcadores seleccionáveis para células de mamíferos incluem di-hidrofolato-reductase (DHFR) e timidina-cinase. Colocam-se os 72 transformantes de células de mamífero em pressão de selecção, transformantes esses que apenas são adaptados unicamente para sobreviverem em virtude do marcador presente no vector. A pressão de selecção é imposta pela cultura das células transformadas em condições em que a concentração do agente de selecção no meio é alterada sucessivamente, levando assim à amplificação tanto do gene de selecção como do ADN que codifica um anticorpo ou fragmento de IL-Ιβ. Como resultado, sintetizam-se quantidades crescentes de um anticorpo a partir do ADN amplificado.

Normalmente está presente um sítio de ligação do ribossoma para a iniciação da tradução do ARNm. Por exemplo, esse sitio é caracterizado por uma sequência Shine-Dalgarno (procariotos) ou uma sequência de Kozak (eucariotos) . 0 elemento está normalmente localizado em 3' em relação ao promotor e em 5' em relação à sequência de codificação do polipéptido a ser expresso. A sequência de Shine-Dalgarno é variável mas normalmente é uma polipurina (com um elevado teor de A-G). Já se identificaram muitas sequências de Shine-Dalgarno, cada uma das quais pode ser facilmente sintetizada utilizando processos estabelecidos antes e utilizada num vector procariótico.

Uma sequência líder ou de sinal pode ser utilizada para orientar a secreção de um polipéptido. Uma sequência de sinal pode estar posicionada dentro ou directamente na extremidade 5' de um polipéptido que codifica uma região. Muitas sequências de sinal já foram identificadas e podem ser seleccionadas com base na célula hospedeira utilizada para a expressão. Uma sequência de sinal pode ser homóloga (de ocorrência natural) ou heteróloga em relação a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína a expressar (tal como um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio) . 73

Uma sequência de sinal heteróloga seleccionada deve ser uma sequência que reconheça e transforme (clivada por uma peptidase de sinal), por meio da célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e não transformam uma sequência de sinal do anticorpo, a sequência de sinal é substituída por uma sequência de sinal procariótica seleccionada, por exemplo, do grupo de fosfatase alcalina, penicilinase ou líderes de enterotoxina II estável ao calor. Para a secreção da levedura, uma sequência de sinal do anticorpo original pode ser substituída pela invertase de levedura, factor alfa ou sequências líderes de fosfatase ácida. Na expressão de células de mamíferos, a sequência de sinal original é normalmente satisfatória, embora possam ser também apropriadas outras sequências de sinal de mamíferos.

Na maior dos casos, a secreção de um anticorpo ou de um fragmento de ligação do antigénio de uma célula hospedeira resultará na eliminação do péptido do sinal do anticorpo ou do fragmento. Assim, um anticorpo ou um fragmento maduro terão falta de qualquer sequência líder ou de sinal.

Na maior parte dos casos, a secreção de um anticorpo ou de um fragmento de ligação ao antigénio de uma célula hospedeira resultará na remoção do péptido de sinal do anticorpo ou do fragmento. Assim, o anticorpo ou o fragmento maduros terão falta de qualquer sequência líder ou de sinal.

Nalguns casos, tais como quando se deseja uma gi icosilação num sistema de expressão de células hospedeiras eucarióticas, pode-se manipular as várias pré-sequências para melhorar a glicosilação ou o rendimento de produção. Por exemplo, pode-se alterar o sítio de clivagem da peptidase de um péptido de sinal ou adicionar pró-sequências que também podem afectar a glicosilação. 0 anticorpo ou o fragmento 74 finais podem ter, na posição -1 (relativamente ao primeiro aminoácido da proteína madura) , um ou mais aminoácidos adicionais incidentes para a expressão, que podem não ter sido totalmente removidos. Por exemplo, o anticorpo ou o fragmento finais podem ter um ou dois aminoácidos encontrados no sítio de clivagem da peptidase, ligados ao terminal N. Alternativamente, o uso de alguns sítios de clivagem da enzima pode resultar numa forma ligeiramente truncada do anticorpo ou fragmento desejado, se a enzima cortar essa área dentro do anticorpo ou do fragmento maduros.

Os vectores de expressão conterão normalmente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está ligado operacionalmente a uma molécula de ácido nucleico, que codifica um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um fragmento de ligação ao antigénio. Pode-se utilizar quer um promotor natural ou heterólogo consoante a célula hospedeira utilizada para a expressão e o rendimento desejado.

Os promotores parem serem utilizados com hospedeiros procarióticos incluem os sistemas promotores de beta-lactamase e lactose; os sistemas de fosfatase alcalina e de um promotor de triptofano (trp); e promotores híbridos, tais como o promotor tac. Também são apropriados outros promotores bacterianos conhecidos. As suas sequências já foram publicadas e podem ser ligadas a sequências desejadas de ácidos nucleicos, utilizando ligante ou adaptadores, conforme desejado, para providenciar sítios de restrição.

Os promotores para serem utilizados com hospedeiros de leveduras são conhecidos na técnica. Os melhoradores das leveduras são utilizados, com vantagem, com promotores de leveduras. Os promotores apropriados para serem utilizados com células hospedeiras de mamíferos são bem conhecidos e 75 incluem os que se obtêm a partir de genomas de virus, tais como o virus de polioma, virus da variola aviária, adenovirus (tal como adenovirus 2) , virus do papiloma bovino, virus do sarcoma aviário, citomegalovirus, retrovirus, virus da hepatite B e, mais preferencialmente, o virus 40 de simio (SV40). Outros promotores de mamiferos apropriados incluem promotores heterólogos de mamiferos, por exemplo, promotores de choque térmico e promotores de actina.

Promotores adicionais que podem ser utilizados para a expressão de agentes de ligação selectivos da presente invenção incluem, mas não se limitam a: região promotora precoce do SV40 (Bernoist e Chambon, Nature, 290: 304-310, 1981); o promotor de CMV; o promotor contido na repetição do terminal longo de 3' do virus de sarcoma de Rous (Yamamoto et al. (1980), Cell 22: 787-97); o promotor de timidina-cinase do herpes (Wagner et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78: 1444-5); as sequências reguladoras do gene de metalotionina (Brinster et al, Nature, 296; 39-42, 1982); os vectores de expressão procarióticos, tais como o promotor de beta-lactamase (Villa-Kamaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 75; 3727-3731, 1978); ou o promotor de tac (DeBoer, et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 80: 21-5) . Também têm interesse as regiões de controlo transcricional de animais que se seguem, que exibem especificidade do tecido e têm sido utilizadas em animais transgénicos: a região de controlo do gene de elastase I que está activa nas células pancreáticas acinar (Swift et al. (1984), Cell 38: 639-46; Ornitz et al. (1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald (1987), Hepatology 7: 425-515); a região de controlo do gene da insulina que está activa nas células beta pancreáticas (Hanahan (1985), Nature 315: 115-22); a região de controlo do gene da imunoglobulina que está activa nas células linfóides 76 (Grosschedl et al. (1984), Cell 38; 647-58; Adames et al. (1985) , Nature 318; 533-8; Alexander et al. (1987), Mol.

Cell. Biol. 7: 1436-44); a região de controlo do vírus do tumor mamário de murganhos gue está activa nas células testiculares, da mama, linfóides e mastócitos (Leder et al. (1986) , Cell 45: 485-95), região de controlo do gene de albumina que está activa no fígado (Pinkert et al. (1987), Genes e Devei. 1: 268-76); a região de controlo do gene de alfa-fetoproteína que está activa no fígado (Krumlauf et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 5: 1639-48; Hammer et al. (1987),

Science, 235: 53-8); a região de controlo do gene alfa-1 anti-tripsina que está activa no fígado (Kelsey et al. (1987) , Genes and Devei. 1: 161-71); a região de controlo do gene de beta-globina que está activa nas células mielóides (Mogram et al., Nature, 315 338-340, 1985; Kollias et al. (1986), Cell 46: 89-94); a região de controlo do gene da proteína básica de mielina que está activa nas células oligodendrócitas no cérebro (Readhead et al. (1987) , Cell, 48: 703-12); a região de controlo do gene da cadeia leve 2 de miosina que está activa nos músculos do esqueleto (Sani (1985), Nature, 314: 283-6); e a região de controlo do gene da hormona que liberta gonadotrofina que está activa no hipotálamo (Mason et al. (1986), Science 234: 1372-8).

Pode-se inserir uma sequência melhoradora no vector para aumentar a transcrição em células hospedeiras eucarióticas. Conhecem-se várias sequências melhoradoras disponíveis em genes de mamíferos (por exemplo, globina, elastase, albumina, alfa-feto-proteína e insulina). Contudo, normalmente, será usado um melhorador de um vírus. O melhorador de SV40, o melhorador do promotor precoce de citomegalovírus, o melhorador de polioma e os melhoradores de adenovírus são exemplos de elementos de melhoria para a activação de promotores eucarióticos. 77

Embora um melhorador possa ser unido ao vector nas posições 5' ou 3' em relação à região de codificação do polipéptido, normalmente está localizado no sitio 5' do promotor.

Os vectores para a expressão de ácidos nucleicos incluem aqueles que são compatíveis com células hospedeiras bacterianas, de insectos e de mamíferos. Esses vectores incluem, inter alia, pCRII, pCR3 e pcADN3.1 (Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.), pET15 (Novagen, Madison, Wis.), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Paio Alto, Calif.), pETL (BlueBacII; Invitrogen), pDSR-alfa (publicação da patente N°. WO 90/14363) e pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, N.Y.).

Outros vectores possíveis incluem, mas não se limitam a cosmidos, plasmidos ou vírus modificados, mas o sistema de vectores deve ser compatível com a célula hospedeira seleccionada. Esses vectores incluem, mas não se limitam a plasmidos, tais como os derivados do plasmido Bluescript® (um fagemido à base de ColEl com um número elevado de cópias, Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla Calif.), plasmidos de clonagem por RCP concebidos para a clonagem de produtos de RCP amplificados por Taq (por exemplo, TOPO™. Um estojo TA Cloning®, os derivados do plasmidos PCR2.1, Invitrogen, Carlsbad, Calif.) e vectores de mamíferos, de leveduras ou de vírus, tais como o sistema de expressão do baculovírus (derivados do plasmidos pBacPAK, Clontech, Paio Alto, Calif.). As moléculas recombinantes podem ser introduzidas nas células hospedeiras por via de transformação, transfecção, infecção, electroporação ou outras técnicas conhecidas. 78 Células hospedeiras e as suas utilizações A presente invenção tem por objecto ainda uma célula (por exemplo, uma célula isolada ou purificada) compreendendo um ácido nucleico ou um vector da presente invenção. A célula pode ser qualquer tipo de células com excepção de uma célula de ovo humano fertilizado ou uma célula estaminal embrionária humana, sendo a célula capaz de ser transformada com o ácido nucleico ou o vector da presente invenção de modo a produzir um polipéptido codificado por ele. A célula é preferencialmente a célula de um mamifero, tal como de um ser humano e é, mais preferencialmente, uma célula de hibridoma, uma célula estaminal embrionária ou um ovo fertilizado.

Para expressar o anticorpo ou o fragmento de ligação a IL-Ιβ, inserem-se ADN que codificam cadeias leves e pesadas de comprimento parcial ou completo, obtidas como se descreveu antes, em vectores de expressão, de tal modo que os genes são ligados operacionalmente às sequências de controlo transcricionais e translacionais. Neste contexto, a expressão "ligada operacionalmente" é entendida como tendo um significado de que um gene de anticorpo é ligado a um vector de tal maneira que as sequências de controlo transcricional e translacional dentro do vector servem a função pretendida de regulação da transcrição e da tradução do gene do anticorpo. 0 vector de expressão e as sequências de controlo da expressão são escolhidos de modo a serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão utilizada. 0 gene da cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vectores separados ou, mais vulgarmente, inserem-se ambos os genes no mesmo vector de expressão. Os genes do anticorpo são inseridos num vector de expressão por processos-padrão (por exemplo, ligação dos sítios de restrição de complementaridade no fragmento e no 79 vector do gene do anticorpo ou ligação da extremidade cega se não estiverem presentes sitios de restrição). Antes da inserção das sequências de cadeia leve ou pesada, o vector de expressão pode já comportar as sequências da região constante do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem para converter as sequências seleccionadas de VP e VL nos genes do anticorpo de comprimento completo consiste em inseri-las nos vectores de expressão que já codificam as regiões constantes de cadeia pesada e as regiões contante de cadeia leve, respectivamente, de tal modo que o segmento VP está operacionalmente ligado ao segmento CP dentro do vector e o segmento VL está operacionalmente ligado ao segmento CL dentro do vector. Adicionalmente ou alternativamente, o vector de expressão recombinante pode codificar um péptido de sinal que facilita a secreção da cadeia do anticorpo a partir de uma célula hospedeira. 0 gene da cadeia do anticorpo pode ser clonado no vector de tal maneira que o péptido de sinal está ligado na matriz ao terminal amino do gene da cadeia de anticorpo. 0 péptido de sinal pode ser um péptido de sinal de imunoglobulina ou um péptido de sinal heterólogo (isto é, um péptido de sinal de uma proteína que não é imunoglobulina).

Para além dos genes da cadeia do anticorpo, os vectores de expressão recombinante da presente invenção podem comportar sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes da cadeia do anticorpo numa célula hospedeira. A expressão sequência reguladora é entendida como incluindo promotores, melhoradores e outros elementos de controlo da expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou a tradução dos genes da cadeia do anticorpo. Essas sequências reguladoras estão descritas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Deve entender-se que a concepção do vector de expressão, 80 incluindo a selecção das sequências reguladoras pode depender de factores, tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, assim como outras considerações. As sequências reguladoras preferidas para a expressão de células hospedeiras de mamíferos incluem elementos virais que provocam níveis elevados de expressão de proteína em células de mamíferos.

Para além dos genes da cadeia do anticorpo e das sequências reguladoras, os vectores de expressão recombinante da presente invenção podem comportar sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vector nas células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores seleccionáveis. 0 gene marcador seleccionável facilita e selecção das células hospedeiras em que o vector tenha de ser introduzido (ver, por exemplo, as patentes norte-americanas N°s. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas por Axel et al.). Por exemplo, normalmente o gene marcador seleccionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, numa célula hospedeira em que o vector tenha sido introduzido. Os genes marcadores seleccionáveis preferidos incluem o gene do di-hidrofolato-reductase (DHFR) (para ser utilizado em células hospedeiras de dhfr“ com selecção/amplificação de metotrexato) e o gene neo (para a selecção de G418).

Os processos de introdução de ácidos nucleicos e vectores em células isoladas e a cultura e selecção de células hospedeiras transformadas in vitro são conhecidos na técnica e incluem a utilização da transformação, transdução, conjugação mediada por cloreto de cálcio, associação triparental, DEAE, transfecção mediada por dextrano, infecção, fusão da membrana com lipossomas, bombardeamento de alta-velocidade com micro-projecteis revestidos com ADN, 81 micro-injecção directa em células simples e electroporação (ver, por exemplo, Sambrook et al., supra; Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 2a ed., McGraw-Hill Professional, 1995; e Neumann et al., EMBO J., 1: 841 (1982)). A célula que compreende o ácido nucleico ou o vector da presente invenção pode ser utilizada para produzir o anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou o seu fragmento ou uma porção dele (por exemplo, uma sequência de cadeia pesada ou uma sequência de cadeia leve codificada pelo ácido nucleico ou o vector). Após a introdução do ácido nucleico ou do vector da presente invenção na célula, faz-se a cultura da célula em condições apropriadas para a expressão da sequência codificada. 0 anticorpo, o fragmento de ligação do antigénio ou a porção do anticorpo podem ser isolados da célula.

Em certas modalidades, dois ou mais vectores que, em conjunto, codificam um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, podem ser introduzidos na célula. Por exemplo, um primeiro vector que codifica uma região variável de cadeia pesada ou uma sequência completa de cadeia pesada pode ser introduzido numa célula hospedeira e um segundo vector, que codifica uma região variável de cadeia leve ou uma sequência completa de cadeia leve, também pode ser introduzido na célula hospedeira. Faz-se então a cultura da célula em condições apropriadas para a expressão das duas sequências codificadas pelo primeiro e pelo segundo vectores e os polipéptidos codificados podem ser isolados da célula hospedeira. Se necessário, os polipéptidos isolados podem então ser combinados, em condições que promovem a sua associação e organização num anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou num seu fragmento de ligação ao antigénio. Alternativamente, o primeiro e o segundo vectores podem ser introduzidos em 82 células separadas e os produtos podem ser isolados das respectivas células e combinados para providenciar um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um seu fragmento de ligação ao antigénio. Os processos para a promoção da associação e a organização dos constituintes do anticorpo em polipéptidos de ligação ao antigénio já foram descritos na técnica. Do mesmo modo, os processos para isolar um anticorpo, um seu fragmento de ligação ao antigénio ou fragmentos de cadeia pesada e de cadeia leve, são conhecidos dos especialistas na matéria.

Podem utilizar-se células estaminais embrionárias ou ovos fertilizados (com excepção de células estaminais embrionárias humanas ou ovos fertilizados humanos) gue compreendem um ácido nucleico ou um vector da presente invenção, para gerar um animal transgénico não humano. Os processos para gerar animais transgénicos estão descritos em Hofker et al., Transgenic Mouse: Methods and Portocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press, Clifton, NJ, 2002. Os animais transgénicos não humanos que compreendem um ácido nucleico ou um vector aqui descrito podem ser utilizados para expressar o anticorpo codificado, um fragmento de ligação ao antigénio ou uma porção do anticorpo. O anticorpo, o fragmento de ligação ao antigénio ou uma porção podem então ser isolados do animal. As porções de um anticorpo podem em seguida ser reconstituídas (em combinação com outras partes do anticorpo) num anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou num fragmento do anticorpo da presente invenção.

As células hospedeiras podem ser células hospedeiras procarióticos (tais como E. coli) ou células hospedeiras eucarióticas (tais como células de leveduras, células de insectos ou células de vertebrados). A célula hospedeira, quando em cultura em condições apropriadas, expressa um anticorpo ou um fragmento de ligação a IL-Ιβ que podem em 83 seguida ser colhido do meio de cultura (se a célula hospedeira o segregar do meio) ou directamente da célula hospedeira que o produz (se não for segregado). A selecção de uma célula hospedeira apropriada irá depender de vários factores, tais como os niveis de expressão desejados, modificações do polipéptido que são desejáveis ou necessárias para a actividade, tais como glicosilação ou fosforilação e facilidade de dobragem numa molécula activa sob o ponto de vista biológico. Há um certo número de células hospedeiras apropriadas que são conhecidas na técnica e muitas estão disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Va. Exemplos delas incluem células de mamíferos, tais como células de ovário de hamster chinês (OHC) (ATCC N°. CCL61) células de DHFR ou de OHC (Urlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97, 4216-4220 (1980)), células 293 ou 293T de rim embriónico humano (HEK) (ATCC N°. CRL1573) , células 3T3 (ATCC N°. CCL92) ou células PER.C6. a selecção de células hospedeiras de mamífero apropriadas e os processos para a transformação, cultura, amplificação, rastreio e produção do produto e purificação são conhecidos na técnica. Outras de linhas de células de mamíferos apropriadas são as células COS-1 de macaco (ATCC N°. CRL1650) e linhas de células COS-7 (ATCC N° . CRL1651) e a linha de células CV-1 (ATCC N°. CCL70). Outros exemplos de células hospedeiras de mamíferos incluem linhas de células de primatas, linhas de células de aves e linhas de células de roedores incluindo linhas de células transformadas. Também são apropriadas células diploídes normais, estirpes de células derivadas de culturas in vitro de tecido primário, assim como explantes primários. As células candidatas podem ser deficientes sob o ponto de vista do genótipo no gene de selecção ou podem conter um gene de selecção que actua de forma dominante. Outras linhas de células apropriadas de mamíferos incluem, mas não se limitam a células N2A de neuroblastoma de murganhos, HeLa, células L- 84 929 de murganho, linhas 3T3 derivadas de ratos Swiss, Balb-c ou NIH, linhas de células de hamster BHK ou HaK, que estão disponíveis na American Type Culture Collection, Manassas, Va.. Cada uma destas linhas de células é conhecida dos especialistas na matéria e está disponível na técnica da expressão de proteínas.

Do mesmo modo, são úteis como células hospedeiras apropriadas para a presente invenção as células bacterianas. Por exemplo, as várias estirpes de E. coli (por exemplo, HB101, (ATCC N°. 33694) DH5a, DH10 e MC1061 (ATCC N°. 53338)) são bem conhecidas como células hospedeiras no domínio da biotecnologia. Também se podem utilizar neste processo várias estirpes de B. subtilis, Pseudomonas spp., outra Bacillus spp., Streptomyces spp. e similares.

Para a expressão das cadeias leve e pesada, os vectores de expressão que codificam as cadeias pesadas e leves são transfectados numa célula hospedeira por técnicas normalizadas. A transfecção engloba uma grande variedade de técnicas normalmente utilizadas para a introdução de ADN exógeno numa célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, electroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção de DEAE-dextrano e similares. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ, quer em células hospedeiras procarióticas, quer eucarióticas, a expressão dos anticorpos ou dos fragmentos em células eucarióticas e, mais preferencialmente, células hospedeiras de mamífero, é a expressão mais preferida porque essas células eucarióticas e, em particular, as células de mamífero, muito provavelmente, serão mais capazes de se juntar e segregar um anticorpo apropriadamente dobrado e activo sob o ponto de vista imunológico, do que as células procarióticas. As células 85 hospedeiras de mamíferos que expressam os anticorpos recombinantes da presente invenção incluem as de ovário de hamster chinês (células de OHC) (incluindo as células de dhfr-OHC, descritas em Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 42164220, utilizadas com um marcador seleccionável de DHFR, por exemplo, conforme descrito em R. J. Kaufman e P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Quando se introduzem vectores de expressão recombinante, que codificam qenes de anticorpos, em células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos pela cultura das células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferencialmente, a secreção do anticorpo num meio de cultura em que as células hospedeiras cresceram. Os anticorpos podem ser recuperados de um meio de cultura utilizando processos-padrão de purificação de proteínas.

Também estão disponíveis, como células hospedeiras, muitas estirpes de células de levedura conhecidas da técnica e que servem para a expressão dos anticorpos e fragmentos. As células de levedura preferidas incluem, por exemplo, Saccharomyces cerivisae. Adicionalmente, quando desejado, podem utilizar-se sistemas de células de insectos. Esses sistemas estão descritos, por exemplo, em Kitts et al. (Biotechniques, 14, 810-817 (1993)), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4, 564-572 (1993) e Lucklow et al. (J. Virol., 67, 4566-4579 (1993)). As células de insecto preferidas são as Sf-9 e Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.). A transformação ou a transfecção de uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo ou um fragmento de ligação a IL-Ιβ, numa célula hospedeira seleccionada, pode ser conseguida por processos bem conhecidos incluindo os 86 processos de cloreto de cálcio, os processos de electroporação, os processos de micro-injecção, os processos de lipofecção ou os processos de DEAE-dextrano. 0 processo seleccionado dependerá, em parte, do tipo de célula hospedeira a ser utilizada. Estes processos e outros processos apropriados são bem conhecidos e estão estabelecidos, por exemplo, em Sambrook et al. supra.

Também se podem utilizar animais transgénicos para expressar anticorpos e fragmentos glicosilados. Por exemplo, pode-se utilizar um animal transgénico que produza leite (por exemplo, uma vaca ou uma cabra) e obter agentes de ligação glicosilados no leite desse animal. Alternativamente, podem utilizar-se plantas para produzir agentes de ligação selectivos glicosilados.

As células hospedeiras que compreendem um vector de expressão que codifica um anticorpo ou um fragmento de ligação a IL — 1 (3 podem ser postas em culturas utilizando meios conhecidos na técnica. 0 meio deverá conter normalmente todos os nutrientes necessários para o crescimento e a sobrevivência das células. Exemplos de meios para a cultura de células de E. coli incluem caldo de lúria (CL) e/ou caldo terrífico (CT). Os meios apropriados para a cultura de células eucarióticas são RPMI 1640, MEM, DMEM, que podem ser complementados com soro e/ou factores de crescimento, conforme desejado, para a linha de células particular a ser posta em cultura. Um exemplo de um meio para culturas de insectos é o meio de Grace complementado com tolato de levedura, hidrolisado de lactalbumina e/ou soro fetal de bovino, conforme necessário.

Um antibiótico ou outro composto útil para o crescimento selectivo de células transfectadas ou transformadas pode ser 87 adicionado como um suplemento ao meio. 0 composto será escolhido com basse no elemento marcador seleccionável presente no plasmido com o qual a célula hospedeira vai ser transformada. Por exemplo, quando o elemento do marcador seleccionável é a resistência à canamicina, o composto que se adiciona ao meio de cultura deverá ser canamicina. Outros compostos para o crescimento selectivo incluem ampicilina, tetraciclina e neomicina. A quantidade de anticorpo ou fragmento de ligação a IL-1β produzida por uma célula hospedeira pode ser avaliada utilizando processos conhecidos na técnica. Esses processos incluem, sem limitação, a análise por "Western blot", electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, electroforese em gel não desnaturante, separação por CLAR, imunoprecipitação e/ou ensaios de actividade. A purificação de um anticorpo ou de um fragmento de anticorpo de ligação a IL-Ιβ que tenha sido segregado num meio celular pode ser realizada utilizando uma variedade de técnicas incluindo cromatografia de afinidade, de imuno-afinidade ou de permuta iónica, cromatografia de peneiro molecular, electroforese preparativa em gel ou focagem iso-eléctrica, cromatofocagem e cromatografia liquida de elevada pressão. Por exemplo, os anticorpos que contêm uma região Fc podem ser purificados por cromatografia de afinidade com proteína A, que se liga selectivamente à região Fc. As formas modificadas de um anticorpo ou de um fragmento de ligação a um antigénio podem ser preparadas com marcadores de afinidade, tais como hexa-histidina ou outras moléculas pequenas, tais como FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.) ou mic (Invitrogen), quer no seu terminal carboxilo, quer no terminal amino e purificadas por uma coluna de afinidade numa única etapa. Por exemplo, a poli-histidina liga-se com grande afinidade e especificidade a níquel, por isso pode-se utilizar uma coluna de afinidade de níquel (tais como as colunas de níquel da Qiagen®) para a purificação de agentes de ligação selectivos marcados com poli-histidina. (Ver por, exemplo, Ausubel et al, eds., Current Protocols in Molecular Biology, Secção 10.11.8, John Wiley & Sons, New York (1993)). Nalguns exemplos, pode-se utilizar mais do que uma etapa de purificação.

Os anticorpos ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ que são expressos em células hospedeiras procarióticas podem estar presentes sob uma forma solúvel quer no espaço periplásmico, quer no espaço citoplásmico ou sob uma forma insolúvel como parte de corpos de inclusão intracelulares. Os anticorpos ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem ser extraídos da célula hospedeira utilizando quaisquer técnicas apropriadas conhecidas neste domínio. Por exemplo, pode-se fazer a lise das células hospedeiras para libertar os conteúdos do periplasma/citoplasma por meio de uma prensa francesa, homogeneização e/ou tratamento com ultra-sons, seguidos de centrifugação.

As formas solúveis de um anticorpo ou de um fragmento de ligação a IL-Ιβ presentes quer no citoplasma ou libertadas do espaço periplásmico podem ainda ser purificadas utilizando processos conhecidos nesta técnica, por exemplo, os fragmentos Fab são libertados do espaço periplásmico bacteriano por técnicas de choque osmótico.

Se se formam corpos de inclusão que contêm um anticorpo ou um fragmento, eles podem muitas vezes ligar-se às membranas celulares mais internas e/ou mais externas e assim, irão ser encontrados principalmente no material granular após a centrifugação. O material granular pode então ser tratado a 89 pH extremo ou com um agente caotrópicos, tal como um detergente, guanidina, derivados de guanidina, ureia ou derivados de ureia, na presença de um agente redutor, tal como ditiotreitol, a um pH alcalino ou tris-carboxietil-fosfina, a um pH ácido, para libertar, fissurar e solubilizar os corpos de inclusão. 0 anticorpo ou o fragmento solúveis podem então ser analisados utilizando electroforese em gel, imunoprecipitação ou similares. Se se desejar isolar um anticorpo solubilizado ou um fragmento de ligação do anticorpo solubilizado, o isolamento pode ser feito utilizando processos-padrão, tais como os estabelecidos a seguir e em Marston et al. (Meth. Enz., 182: 264-275 (1990)).

Nalguns casos, um anticorpo ou um fragmento de ligação a IL-Ιβ podem não estar activos, sob o ponto de vista biológico, após o isolamento. Podem-se utilizar vários processos para a "redobragem" ou a conversão de um poli-péptido na sua estrutura terciária e gerar ligações de dissulfureto para restaurar a actividade biológica. Esses processos incluem a exposição do polipéptido solubilizado a um pH normalmente acima de 7 e na presença de uma concentração particular de um agente caotrópico. A selecção do agente caotrópico é muito semelhante às escolhas utilizadas para a solubilização de corpos de inclusão mas normalmente o agente caotrópico é utilizado a uma concentração mais baixa e não é necessariamente o mesmo agente caotrópico utilizado para a solubilização. Na maior parte dos casos, a solução de redobragem/oxidação irá também conter um agente redutor ou o agente redutor mais a sua forma oxidada, numa proporção especifica para gerar um potencial redox particular que permita a ocorrência do arrastamento do dissulfureto na formação das pontes de cisteina da proteína. Alguns dos pares redox normalmente utilizados incluem cisteína/cistamina, glutationa (GSH)/ditiobis GSH, cloreto 90 cúprico, ditiotreitol (DTT)/ditiano DTT e 2-mercaptoetanol (bME)/di-tio-b (ME). Em muitos casos, pode-se utilizar um co-dissolvente para aumentar a eficiência da redobragem e os reagentes normais utilizados com esta finalidade incluem glicerol, polietileno-glicol de vários pesos moleculares, arginina e similares.

Os anticorpos ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ da presente invenção podem também ser preparados por processos de síntese química (tais como, síntese de péptidos em fase sólida) utilizando técnicas conhecidas neste domínio, tais como as estabelecidas por Merrifield et al. (1963), J. Am.

Chem. Soc., 85: 2149, Houghten et al. (1985), Proc Natl Acad.

Sei. USA, 82: 5132 e Stewart and Young (1984), Solid Phase

Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, III. Esses anticorpos ou fragmentos podem ser sintetizados com ou sem uma metionina no terminal amino. Os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antigénio sintetizados quimicamente podem ser oxidados utilizando processos estabelecidos nestas referências para formar pontes de dissulfureto. Os anticorpos e os fragmentos assim preparados irão reter pelo menos uma actividade biológica associada com um anticorpo ou um fragmento de ligação a IL-Ιβ natural ou produzido de forma recombinante.

Composições farmacêuticas

Os anticorpos de ligação a IL-Ιβ, os fragmentos de anticorpos, os ácidos nucleicos ou os vectores da presente invenção podem ser formulados em composições, especialmente composições farmacêuticas. Essas composições compreendem uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico ou profiláctico, de um anticorpo de ligação a IL-Ιβ, um fragmento de anticorpo, um ácido nucleico ou um vector da 91 presente invenção, misturados com um veiculo apropriado, por exemplo, um agente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Normalmente, os anticorpos de ligação a IL-Ιβ, os fragmentos de anticorpo, os ácidos nucleicos ou os vectores da presente invenção estão suficientemente purificados para serem administrados a um animal antes da formulação numa composição farmacêutica.

Os agentes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico para serem utilizados nas composições farmacêuticas incluem veiculos, excipientes, diluentes, antioxidantes, conservantes, corantes, agentes aromatizantes e de diluição, agentes emulsionantes, agentes de suspensão, dissolventes, cargas, agentes para aumentar o volume, tampões, veiculos de libertação, agentes de tonicidade, co-dissolventes, agentes de molhagem, agentes complexantes, agentes para tamponar, antimicrobianos e tensioactivos.

As soluções salinas tamponadas neutras ou misturas de soluções salinas com albumina do soro são exemplos de veiculos apropriados. As composições farmacêuticas podem incluir antioxidantes, tais como ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular; proteinas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polimeros hidrofilicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; álcoois do açúcar, tais como, manitol ou sorbitol; contraiões que formam sais, tal como sódio; e/ou tensioactivos não iónicos, tais como Tween, pluronics ou polietileno-glicol (PEG). Também a titulo de exemplo, agentes apropriados para aumentar a tonicidade incluem halogenetos de metal alcalino (preferencialmente cloreto de sódio ou de 92 potássio), manitol, sorbitol e similares. Os conservantes apropriados incluem cloreto de benzalcónio, timerosal, álcool de fenetilo, metilparabeno, propilparabeno, clor-hexidina, ácido sórbico e similares. Também se pode utilizar peróxido de hidrogénio como conservante. Os co-dissolventes apropriados incluem glicerina, propileno-glicol e PEG. Os agentes complexantes apropriados incluem cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxi-propil-beta-ciclodextrina. Os tensioactivos apropriados ou os agentes de molhagem apropriados incluem ésteres de sorbitano, polisorbatos, tais como polisorbato 80, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal e similares. Os tampões podem ser tampões convencionais, tais como de acetato, borato, citrato, fosfato, bicarbonato ou Tris-HCl. O tampão de acetato pode ter um pH entre cerca de 4-5,5 e o tampão Tris pode ter um pH de cerca de 7-8,5. Outros agentes farmacêuticos adicionais estão indicados em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edição, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990. A composição pode estar na forma líquida ou numa forma liofilizada e pode incluir um ou mais lipoprotectores, excipientes, tensioactivos, aditivos estruturais de elevado peso molecular e/ou agentes para aumentar o volume (ver, por exemplo, as patentes norte-americanas 6.685.940, 6.566.329 e 6.372.716). Numa modalidade, incluiu-se um lipoprotector que é um açúcar não-redutor, tal como sacarose, lactose ou tre-halose. A quantidade de lipoprotector incluída geralmente é tal que, após reconstituição, a formulação resultante será isotónica, embora também possam ser apropriadas formulações hipertónicas ou ligeiramente hipotónicas. Além disso, a quantidade de lipoprotector deve ser suficiente para prevenir uma quantidade inaceitável de degradação e/ou agregação da proteína após a liofilização. Exemplos de concentrações de 93 lipoprotector para os açúcares (por exemplo, sacarose, lactose, tre-halose) na formulação pré-liofilizada são de cerca de 10 mM até cerca de 400 mM. Noutra modalidade, inclui-se um tensioactivo, tal como, por exemplo, tensioactivos não iónicos e tensioactivos iónicos, tais como polisorbatos (por exemplo, polisorbato 20, polisorbato 80) ; poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188); éteres de fenilo e poli (etileno-glicol) (por exemplo, Triton); sulfato de dodecilo e sódio (SDS); sulfato de laurilo e sódio; glicósido de octilo e sódio; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearilsulfobetaina; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- ou cetilbetaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- ou isostearamidopropil-betaína (por exemplo, lauroamidopropilo); miristamidopropil-, palmidopropil- ou isostearamidopropil-dimetilamina; taurato de metil-cocoil- e sódio ou taurato de metil-ofeil-dissódico; e as séries MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietil-glicol, polipropil-glicol e copolimeros de etileno e propileno-glicol (por exemplo, Pluronics, PF58, etc). Exemplos das quantidades de tensioactivo que podem estar presentes na formulação pré-liofilizada estão entre cerca de 0,001-0,5 %. Os aditivos estruturais de elevado peso molecular (por exemplo, cargas, ligantes) podem incluir, por exemplo, acácia, albumina, ácido alginico, fosfato de cálcio (dibásico), celulose, carboxi-metil-celulose, carboximetil-celulose sódica, hidroxietil-celulose, hidroxipropil-celulose, hidroxipropilmetil-celulose, celulose microcristalina, dextrano, dextrina, dextratos, sacarose, tilose, amido pré-gelatinizado, sulfato de cálcio, amilose, glicina, bentonite, maltose, sorbitol, etil-celulose, hidrogeno-fosfato dissódico, fosfato dissódico, pirossulfito dissódico, álcool de polivinilo, gelatina, glicose, goma de guar, glicose líquida, açúcar 94 compressível, silicato de magnésio e alumínio, maltodextrina, óxido de polietileno, polimetacrilatos, povidona, alginato de sódio, goma de tragacanto, celulose microcristalina, amido e zeína. Exemplos de concentrações de aditivos estruturais de elevado peso molecular estão entre 0,1 % e 10 % em peso. Noutras modalidades, pode-se incluir um agente para aumentar o volume (por exemplo, manitol, glicina).

As composições podem ser apropriadas para administração parentérica. Exemplos de composições que são apropriadas para injecção ou infusão num animal, por qualquer via disponível para um técnico desta área, tais como as vias intra-articular, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-peritonial, intracerebral (intraparenquimal), intracerebro-ventricular, intramuscular, intraocular, intra-arterial ou intralesional. Uma formulação parentérica normalmente será uma formulação esterilizada, isenta do pirogénio, uma solução aquosa isotónica, eventualmente contendo conservantes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Exemplos de dissolventes não aquosos são propileno-gi icol, polietileno-glicol, óleos vegetais, tais como azeite e ésteres orgânicos injectáveis, tais como oleato de etilo. Os veículos aquosos incluem água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo soluções salinas e meios tamponados. Os veículos parentéricos incluem soluções de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, cloreto de sódio e dextrose, solução de Ringer lactada ou óleos não voláteis. Os veículos intravenosos incluem fluidos e nutrientes de recarga, recargas de electrólitos, tais como as que se baseiam em dextrose de Ringer e similares. Podem estar presentes conservantes e outros aditivos, tais como, por exemplo, aditivos anti-microbianos, antioxidantes, agentes 95 quelantes, gases inertes e similares. Ver, de um modo geral, Remington's Pharmaceutical Science, 16a ed., Mack Eds., 1980.

As composições farmacêuticas aqui descritas podem ser formuladas para uma administração controlada ou sustentada de maneira que providenciem uma concentração local do produto (por exemplo, bolus, efeito de depósito) e/ou uma estabilidade aumentada ou um semi-periodo de vida aumentado num ambiente local particular. As composições podem incluir a formulação de anticorpos de ligação a IL-Ιβ, fragmentos de anticorpos, ácidos nucleicos ou vectores da presente invenção com preparações em partículas de compostos poliméricos, tais como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., assim como agentes, tais como matrizes biodegradáveis, microesferas injectáveis, partículas microcapsulares, microcápsulas, pérolas de partículas bioerodíveis, lipossomas e dispositivos de administração implantáveis que providenciam uma libertação controlada ou sustentada do agente activo que podem então ser libertados a partir de uma injecção de um depósito. As técnicas para formulação, tal como meios de libertação sustentada ou controlada são conhecidas e já foram desenvolvidos vários polímeros e utilizados para fármacos de libertação controlada. Esses polímeros são normalmente biodegradáveis e biocompatíveis. Podem ser desejáveis hidrogéis de polímeros incluindo os formados por complexação de polímeros enantioméricos ou segmentos de polipéptidos e hidrogéis, com propriedades sensíveis à temperatura ou ao pH, para providenciar o efeito de depósito do fármaco por causa das condições ligeiras e aquosas envolvidas na retenção de agentes de proteínas bioactivas (por exemplo, anticorpos). Ver, por exemplo, a descrição da libertação controlada de micropartículas poliméricas porosas para a administração de composições farmacêuticas na publicação do pedido de patente PCT WO 93/15722. 96

Os materiais apropriados para esta finalidade incluem poliláctidos (ver, por exemplo, a patente norte-americana 3.773.919), polimeros de poli-(a-ácidos hidroxicarboxilicos), tais como ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutirico (patente EP 133.988A), copolimeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), poli-(2-hidroxietilmetacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981), e Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), acetato de etileno e vinilo ou ácido poli-D (-)-3-hidroxibutirico. Outros polimeros biodegradáveis incluem poli(lactonas), poli(acetais), poli(orto-ésteres) e poli(orto-carbonatos). As composições de libertação sustentada também podem incluir lipossomas que podem ser preparados por qualquer um dos vários processos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82: 3688-92 (1985)). O próprio veiculo ou os produtos resultantes da sua degradação não devem ser tóxicos no tecido-alvo e também não devem agravar o estado clinico. Isto pode ser determinado por uma avaliação de rotina em modelos de animais com o distúrbio-alvo ou, se esses modelos estiverem indisponíveis, em animais normais. A microencapsulação de proteínas recombinantes para a libertação sustentada tem sido realizada com sucesso com a hormona de crescimento humano (rhGH), interferão- (rhIFN--), interleucina-2 e MN rgpl20. Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technologv. 8: 755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," em Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; patentes WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399 e a patente norte-americana N°. 5.654.010. As formulações de libertação 97 sustentada destas proteínas foram desenvolvidas utilizando polímero do ácido poli-láctico-coglicólico (PLGA) devido à sua biocompatibilidade e à vasta gama de propriedades biodegradáveis. Os produtos de degradação de PLGA, os ácidos láctico e glicólico, podem ser eliminados rapidamente dentro do corpo humano. Além disso, a degradibilidade deste polímero pode depender do seu peso molecular e da sua composição. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," em: M. Chasin e R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Mareei Dekker: New York, 1990), pp. 1-41. Outros exemplos de composições de libertação sustentada incluem, por exemplo, a patente europeia 58.481A, a patente norte-americana 3.887.699, a patente europeia 158.277A, a patente canadiana 1176565, U. Sidman et al., Biopolymers 22, 547 [1983], R. Langer et al., Chem. Tech. 12, 98 [1982], Sinha et al., J. Control. Release 90, 261 [2003], Zhu et al., Nat. Biotechnol. 18, 24 [2000] e Dai et al., Colloids Surf B Biointerfaces 41, 117 [2005].

Os polímeros bioadesivos estão também contemplados na utilização ou com composições da presente invenção. Os bioadesivos são materiais sintéticos e de ocorrência natural capazes de aderirem a substratos biológicos por períodos de tempo prolongados. Por exemplo, o Carbopol e o policarbofilo são ambos derivados de poli(ácido acrílico) sintético reticulado. Os sistemas de libertação dos bioadesivos baseiam-se em substâncias de ocorrência natural e incluem, por exemplo, ácido hialurónico, também conhecido como hialuronano. O ácido hialurónico é um mucopolissacárido de ocorrência natural que consiste em resíduos de ácido D-glucurónico e N-acetil-D-glicosamina. O ácido hialurónico encontra-se na matriz do tecido extracelular dos vertebrados, incluindo em tecidos conjuntivos, assim como no fluido 98 sinovial e no humor vítreo e aquoso dos olhos. Os derivados esterifiçados do ácido hialurónico têm sido utilizados para produzir microesferas para serem utilizadas na libertação pelo facto de serem biocompatíveis e biodegradáveis (ver, por exemplo, Cortivo et al., Biomaterials (1991) 12: 727-730; publicação da patente europeia N°. 517.565; publicação da patente internacional N°. WO 96/29998; Illum et al., J. Controlled Rei. (1994) 29:133-141). Exemplos de composições contendo ácido hialurónico da presente invenção compreendem polímeros de ésteres de ácido hialurónico numa quantidade de aproximadamente de 0,1 % a cerca de 40 % (p/p) de um anticorpo ou de um fragmento de ligação a IL-Ιβ, com polímero de ácido hialurónico.

Tanto as matrizes poliméricas biodegradáveis como as não biodegradáveis podem ser utilizadas para libertar composições da presente invenção e essas matrizes poliméricas podem conter polímeros naturais ou sintéticos. As matrizes biodegradáveis são as preferidas. O período de tempo ao longo do qual ocorre a libertação tem por base a selecção do polímero. Normalmente, liberta-se ao longo de um período que varia entre algumas horas e três a doze meses, no caso mais desejável. Exemplos de polímeros sintéticos que podem ser utilizados para formar o sistema de libertação biodegradável incluem: polímeros de ácido láctico e ácido glicólico, poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polialquileno-glicois, óxidos de polialquileno, tereftalatos de poli-alquileno, álcoois de polivinilo, éteres de polivinilo, ésteres de polivinilo, halogenetos de polivinilo, polivinil-pirrolidona, poliglicólidos, polisiloxanos, polianidridos, poliuretanos e os seus co-polímeros, poli(ácido butírico), poli(ácido valérico), alquil-celulose, hidroxialquil-celuloses, éteres de celulose, ésteres de celulose, nitro-celuloses, polímeros de ésteres acrílico e metacrílico, 99 metil-celulose, etil-celulose, hidroxipropil-celulose, hidroxipropil-metil-celulose, hidroxibutil-metil-celulose, acetato de celulose, propionato de celulose, butirato de acetato de celulose, ftalato de acetato de celulose, carboxiletil -celulose, triacetato de celulose, sal sódico de sulfato de celulose, poli(metacrilato de metilo), poli(meta-crilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli-(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo) , poli-(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo), poli-(acrilato de octadecilo), polietileno, polipropileno, poli-(etileno-glicol), poli(óxido de etileno), poli(tereftalato de etileno), poli(álcoois de vinilo), acetato de polivinilo, cloreto de polivinilo, polistireno e polivinilpirrolidona. Exemplos de polímeros naturais incluem alginato e outros polissacáridos incluindo dextrano e celulose, colagénio, os seus derivados químicos (substituições, adições de grupos químicos, por exemplo, alquilo, alquileno, hidroxilações, oxidações e outras modificações feitas por rotina podem ser feitas pelos especialistas na matéria), albumina e outras proteínas hidrofílicas, zeína e outras prolaminas e proteínas hidrofóbicas, co-polímeros e as suas misturas. Em geral, estes materiais degradam-se quer por hidrólise enzimática ou por exposição à água in vivo, por erosão superficial ou volumétrica. 0 polímero eventualmente está sob a forma de um hidrogel (ver, por exemplo, patentes internacionais WO 04/009664, WO 05/087201, Sawhney, et al., Macromolecules, 1993, 26, 581-587,) que pode absorver até 90 % do seu peso em água e ainda mais, eventualmente está reticulado com iões multivalentes ou outros polímeros.

Os sistemas de libertação também incluem sistemas não poliméricos que são lípidos incluindo esteróis, tais como 100 colesterol, ésteres de colesterol e ácidos gordos ou gorduras neutras, tais como mono-, di- e tri-glicéridos; sistemas de libertação de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas à base de péptidos; revestimentos de cera; comprimidos prensados utilizando ligantes convencionais e excipientes; implantes parcialmente fundidos; e similares. Exemplos específicos incluem, mas não se limitam a; (a) sistemas que sofrem erosão em que o produto está contido numa determinada forma dentro de uma matriz, tal como está descrito nas patentes norte-americanas N°s. 4.452.775, 4.675.189 e 5.736.152 e (b) sistemas de difusão em que um produto vai premiar, a uma taxa controlada, a partir de um polimero, tal como descrito nas patentes norte-americanas N°s. 3.854.480, 5.133.974 e 5.407.686. Os lipossomas contendo o produto podem ser preparados por processos conhecidos, tais como, por exemplo, (patente alemã 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: 4030-4034 (1980); patentes europeias 52.322; 36.676; 88.046; 143.949; 142.641; publicação da patente japonesa 83-118008; patentes norte-americanas N°s. 4.485.045 e 4.544.545; e patente europeia 102.324).

Alternativamente ou adicionalmente, as composições podem ser administradas localmente por via da implantação na área afectada de uma membrana, esponja ou outro material apropriado no qual um anticorpo de ligação a IL-Ιβ, um fragmento de anticorpo, um ácido nucleico ou um vector da presente invenção tenham sido absorvidos ou encapsulados. Quando se utiliza um dispositivo de implantação, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão apropriado e a libertação do anticorpo de ligação a IL-Ιβ, do fragmento de anticorpo, do ácido nucleico ou do vector da presente invenção podem ser feitas directamente através do dispositivo por via de bolus ou por via da administração 101 contínua ou por via de um cateter utilizando infusão contínua.

Uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo de ligação a IL-Ιβ, um fragmento de anticorpo, um ácido nucleico ou um vector da presente invenção podem ser formulados para inalação, tal como, por exemplo, sob a forma de um pó anidro. As soluções de inalação também podem ser formuladas num propelente liquefeito para libertação por meio de um aerossol. Ainda noutra formulação, as soluções podem ser nebulizadas. Outras composições farmacêuticas adicionais para administração pulmonar incluem as descritas, por exemplo, no pedido de publicação de patente PCT WO 94/20069, que descreve a administração pulmonar de proteínas modificadas quimicamente. Para a administração pulmonar a dimensão da partícula deve ser apropriada para libertação no pulmão distai. Por exemplo, a dimensão da partícula pode estar entre 1 pm e 5 pm; contudo, podem utilizar-se partículas maiores, por exemplo, se cada partícula for ligeiramente porosa.

Algumas formulações contendo anticorpos de ligação a IL-1β, fragmentos de anticorpos, ácidos nucleicos ou vectores da presente invenção podem ser administradas oralmente. As formulações administradas desta maneira podem ser formuladas com ou sem esses veículos habituais utilizados na composição de formas farmacêuticas sólidas, tais como comprimidos e cápsulas. Por exemplo, uma cápsula pode ser concebida para libertar a porção activa da formulação num determinado ponto do tracto gastrointestinal quando a biodisponibilidade é maximizada e a degradação pré-sistémica é minimizada. Podem-se incluir outros agentes para facilitar a absorção de um agente de ligação selectivo. Também se podem utilizar diluentes, aromatizantes, ceras de baixo ponto de fusão, 102 óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração dos comprimidos e ligantes.

Outra preparação pode envolver uma quantidade eficaz de um anticorpo de ligação a IL-Ιβ, um fragmento de anticorpo, um ácido nucleico ou um vector da presente invenção, numa mistura com excipientes não tóxicos que são apropriados para o fabrico de comprimidos. Dissolvendo os comprimidos em água esterilizada ou noutro veiculo apropriado, as soluções podem ser preparadas numa forma de dose unitária. Os excipientes apropriados incluem, mas não se limitam a diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação, tais como, amido, gelatina ou acácia; ou agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.

As formulações farmacêuticas apropriadas e/ou preferidas podem ser determinadas tendo em vista a presente descrição e o conhecimento geral sobre a tecnologia de formulação, consoante a via de administração pretendida, o formato de libertação e a dose desejada. Independentemente da maneira de administração, pode-se calcular uma dose eficaz de acordo com o peso corporal do doente, a área da superfície corporal ou a dimensão do órgão. Outros refinamentos dos cálculos para a determinação da dose apropriada para o tratamento envolvendo cada uma das formulações aqui descritas são feitos por rotina na técnica e estão dentro do âmbito das tarefas desempenhadas rotineiramente nesta técnica. As doses apropriadas podem ser acertadas através da utilização de dados apropriados de resposta à dose.

Outras formulações serão evidentes à luz da presente descrição, incluindo formulações que envolvem anticorpos de 103 ligação a IL-Ιβ, fragmentos de anticorpos, ácidos nucleicos ou vectores da presente invenção, em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos. Por exemplo, nalgumas formulações, formula-se o anticorpo de ligação a IL-Ιβ, o fragmento de anticorpo, o ácido nucleico ou o vector da presente invenção com um segundo inibidor de uma via de sinalização de IL-1. Exemplos representativos destes segundos inibidores incluem, mas não se limitam a anticorpos, fragmentos de anticorpos, péptidos, polipéptidos, compostos, ácidos nucleicos, vectores e composições farmacêuticas, tais como, por exemplo, os descritos nas patentes norte-americanas 6899878, 2003022869, 20060094663, 20050186615, 20030166069 e nas patentes internacionais WO/04022718, WO/05084696, WO/05019259. Por exemplo, uma composição pode conter um anticorpo de ligação a IL-Ιβ, um fragmento de anticorpo, um ácido nucleico ou um vector da presente invenção, em combinação com um anticorpo de ligação a IL-Ιβ, um fragmento ou um ácido nucleico ou um vector codificando esse anticorpo ou fragmento.

As composições farmacêuticas podem conter anticorpos ou fragmentos de ligação a IL-Ιβ em combinação com outros agentes activos. Essas combinações são as que são úteis para a finalidade pretendida. Os agentes activos mencionados a seguir são ilustrativos para determinados fins e não pretendem ser limitativos. As combinações, que fazem parte da presente invenção, podem ser com os anticorpos e fragmentos da presente invenção e pelo menos um agente adicional seleccionado nas listas que se seguem. A combinação pode também incluir mais do que um agente adicional, por exemplo, dois ou três agentes adicionais, se a combinação for tal que a composição formada possa exercer a função pretendida. 104

Agentes activos ou combinações com os anticorpos ou os fragmentos da presente invenção incluem fármacos anti-inflamatórios não-esteroidais (FAINE), tais como aspirina, ibuprofeno e outros derivados do ácido propiónico (alminoprofeno, benoxaprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, fenbufeno, fenoprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, indo-profeno, cetoprofeno, miroprofeno, naproxeno, oxaprozina, pirprofeno, pranoprofeno, suprofeno, ácido tiaprofénico e tioxaprofeno), derivados do ácido acético (indometacina, acemetacina, alclofenac, clidanac, diclofenac, fenclofenac, ácido fenclózico, fentiazac, fuirofenac, ibufenac, isoxepac, oxpinac, sulindac, tiopinac, tolmetina, zidometacina e zomepirac) , derivados do ácido fenâmico (ácido flufenâmico, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, ácido niflúmico e ácido tolfenâmico), derivados de ácido bifenilcarboxilico (diflunisal e flufenisal), oxicams (isoxicam, piroxicam, sudoxicam e tenoxican), salicilatos (ácido acetil-salicilico, sulfasalazina) e pirazolonas (apazona, bezpiperilona, feprazona, mofebutazona, oxifenbutazona, fenilbutazona). Outras combinações incluem inibidores de ciclo-oxigenase-2 (COX-2). Outros agentes activos para a combinação incluem esteróides, tais como prednisolona, prednisona, metil-prednisolona, betametasona, dexametasona ou hidrocortisona. Essas combinações podem ser especialmente vantajosas dado que se podem reduzir um ou mais efeitos secundários dos esteróides ou mesmo eliminá-los diminuindo a dose de esteróide necessária quando se tratam doentes em combinação com os anticorpos e fragmentos da presente invenção.

Exemplos adicionais de agentes activos para combinações com anticorpos ou fragmentos de ligação a IL-Ιβ para artrite reumatóide incluem fármacos anti-inflamatórios supressores de citocina (CSAID); anticorpos ou antagonistas de outras citocinas ou factores de crescimento humano, por exemplo, 105 FNT, LT, IL-Ιβ, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF ou PDGF. Os anticorpos e os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem combinar-se com anticorpos de moléculas da superfície celular, tais como CD2, CD3, CD4, CD8, CD2 5, CD2 8, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90 ou os seus ligandos incluindo CD 154 (gp39 ou CD40L).

As combinações preferidas de agentes activos podem interferir em diferentes pontos na cascata auto-imune e inflamatória subsequente; exemplos preferidos incluem antagonistas de FNT como anticorpos de FNT quiméricos, humanizados ou humanos, D2E7, cA2 (Remicade™) , CDP 571, fragmentos de anticorpos anti-FNT (por exemplo, CDP870) e receptores solúveis do FNT, p55 ou p75, os seus derivados, (p75TNFRIgG (Enbrel™) ou p55TNFRlgG (Lenercept), receptor de IL-13 solúvel (sIL-13) e também inibidores de enzimas que convertem FNTa (TACE) ; do mesmo modo os inibidores de IL-1 (por exemplo, inibidores de enzimas que convertem interleucina-1, tais como Vx740 ou IL-1RA, etc.) podem ser eficazes pela mesma razão. Outras combinações preferidas incluem interleucina-11, anti-P7s e ligandos da glicoproteina p-selectina (PSGL). Ainda outras combinações são com outros factores-chave da resposta auto-imune, que podem actuar de forma paralela, dependente ou em concertação com a função de IL-Ιβ.

Agentes activos para a doença de Crohn nos quais um anticorpo ou uma porção de ligação ao antigénio pode ser combinada incluem antagonistas de FNT, por exemplo, anticorpos anti-FNT, D2E7, cA2 (Remicade™) , CDP 571, fragmentos de anticorpos anti-FNT (por exemplo, CDP870), vectores de TNFR-Ig (p75TNFRIgG (Enbrel™) e p55TNFRIgG (Lenercept)), anti-P7s, ligandos de glicoproteina e p- 106 selectina (PSGL), receptor de IL-13 solúvel (sIL-13) e inibidores de PDE4. Os anticorpos ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem combinar-se com corticosteróides, por exemplo, budenósido e dexametasona. Os anticorpos ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem também ser combinados com agentes, tais como sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico e olsalazina e agentes que interferem com a síntese ou a acção de citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-1, por exemplo, inibidores de enzimas que convertem IL-1 (por exemplo, Vx740) e IL-lra. Os anticorpos ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem também ser utilizados com inibidores de sinalização das células T, por exemplo, os inibidores de tirosina-cinase, 6-mercaptopurinas. Os anticorpos ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem ser combinados com IL-11.

Outros exemplos de agentes activos para a esclerose múltipla com os quais os anticorpos ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem ser combinados incluem corticosteróides; prednisolona; metilprednisolona; aza-tioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4-amino-piridina; tizanidina; interferão^la (Avonex; Biogen); interferão^lb (Betaseron; Chiron/Berlex); copolímero 1 (Cop-1; copaxona; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); oxigénio hiperbárico; imunoglobulina intravenosa; clabribina; anticorpos ou antagonistas de outras citocinas humanas ou factores de crescimento, por exemplo, FNT, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF e PDGF. Os anticorpos ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem ser combinados com anticorpos das moléculas da superfície celular, tal como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 ou outros ligandos. Os anticorpos ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem ser combinados com agentes, tais como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato de mofetilo, leflunomida, 107 FAINE, por exemplo, ibuprofeno, corticosteróides, tais como prednisolona, inibidores de fosfodiesterase, agonistas de adensosina, agentes anti-trombóticos, inibidores do complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interferem com a sinalização por meio de citocinas pró-inflamatórias, tais como FNTa ou IL-1 (por exemplo, os inibidores de cinase IRAK, NIK, IKK, p38 ou MAP), inibidores de enzimas que convertem IL-Ιβ (por exemplo, Vx740), anti-P7s, ligando de glicoproteina de p-selectina (PSGL), inibidores de TACE, inibidores da sinalização de células T, tais como inibidores de cinase, inibidores de metaloproteinase, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inibidores de enzimas que convertem angiotensina, receptores de citocina solúveis e os seus derivados (por exemplo os receptores solúveis de FNT p55 ou p75, sIL-1 RI, sIL-1 RII, sIL-6R, receptor de IL-13 solúvel (sIL-13)) e citocinas anti-inflamatórias (por exemplo, IL-4, IL-10, IL-13 e TGF3).

Exemplos preferidos de agentes activos para esclerose múltipla em que os anticorpos ou os fragmentos de ligação a IL-Ιβ podem ser combinados incluem interferão-β, por exemplo, IF^la e IF^lb; copaxona, corticosteróides, inibidores de IL-1, inibidores de FNT e anticorpos do ligando CD40 e CD80.

As composições farmacêuticas podem incluir uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico ou uma quantidade eficaz sob o ponto de vista profiláctico dos anticorpos ou fragmentos de ligação a IL-Ιβ da presente invenção. Uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico refere-se a uma quantidade eficaz, nas doses e durante os periodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico do anticorpo ou de uma porção do anticorpo pode variar de acordo com factores, tais como o 108 estado de doença, a idade, o género e o peso do indivíduo e a capacidade do anticorpo ou da porção de anticorpo para provocar uma resposta necessária no indivíduo. Uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou da porção de anticorpo são desprezíveis face aos efeitos benéficos sob o ponto de vista terapêutico. Uma quantidade eficaz sob o ponto de vista profiláctico refere-se a uma quantidade eficaz, em doses e durante os períodos de tempo necessários para alcançar o resultado profiláctico desejado. Normalmente, dado que se utiliza uma dose profiláctica nos indivíduos antes ou num estado precoce da doença, a quantidade eficaz, sob o ponto de vista profiláctico, será inferior à quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico.

Os anticorpos de ligação a IL-Ιβ, os fragmentos do anticorpo, os ácidos nucleicos ou os vectores da presente invenção podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com outros agentes activos que podem estar na mesma composição farmacêutica ou numa composição farmacêutica diferente. Por exemplo, esses outros agentes activos podem compreender (i) antagonista de IL-1 (por exemplo, IL-lRa recombinante ou um agente retentor de IL) , (ii) um antagonista do receptor de interleucina-1, (iii) um receptor 1 de FNT solúvel, (iv) um receptor 2 de FNT solúvel (por exemplo, etanercept), (iv) inibidor de FNT (por exemplo, um anticorpo, tal como D2E7) e/ou (v) um agente terapêutico do cancro. Assim, por exemplo, pode-se incluir um ou mais destes componentes na composição da presente invenção com um anticorpo de ligação a IL-Ιβ, um fragmento de anticorpo, um ácido nucleico ou um vector da presente invenção. 109

Pode ser desejável, nalguns casos, utilizar uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de ligação a IL-Ιβ, um fragmento de anticorpo, um ácido nucleico ou um vector da presente invenção de uma forma ex vivo. Neste caso, as células, tecidos ou órgãos que tenham sido removidos de um doente são expostas a composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo de ligação a IL-Ιβ, um fragmento de anticorpo, um ácido nucleico ou um vector da presente invenção, depois do que as células, os tecidos e/ou órgãos são, em seguida, implantados novamente no doente.

Em certas situações, uma composição compreendendo um anticorpo de ligação a IL-Ιβ, um fragmento de anticorpo, um ácido nucleico ou um vector da presente invenção pode ser libertada por implantação nas células do doente que tenham sido transformadas por engenharia genética, tal como aqui descrito, para expressar e segregar os polipéptidos, agentes de ligação selectivos, fragmentos, variantes ou derivados. Essas células podem ser células de animais ou de seres humanos e podem derivar do tecido do próprio doente ou de outra fonte, quer humana, quer não humana. Eventualmente, as células podem ser células imortalizadas. Contudo, para diminuir a probabilidade de uma resposta imunológica, é preferivel que as células sejam encapsuladas para evitar infiltração nos tecidos circundantes. Os materiais de encapsulação são normalmente biocompativeis, materiais protectores ou membranas poliméricas semipermeáveis, que permitem a libertação dos produtos da proteína mas evitam a destruição das células pelo sistema imunitário do doente ou por outros factores prejudiciais, a partir dos tecidos circundantes.

Os processos utilizados para a encapsulação da membrana das células são conhecidos e a preparação de células 110 encapsuladas e a sua implantação em doentes já foi descrita, por exemplo, nas patentes norte-americanas 4.892.538, 5.011.472 e 5.106.627. Um sistema para a encapsulação de células vivas está descrito na publicação do pedido de patente PCT WO 91/10425. As técnicas para a formulação de uma variedade de outros meios de libertação sustentada ou controlada, tal como veículos lipossomáticos, partículas bio-erodíveis ou pérolas são também conhecidas do especialista na matéria e já foram descritas. As células, com ou sem encapsulação, podem ser implantadas em tecidos ou órgãos apropriados do corpo do doente.

Uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico ou profiláctico de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo de ligação a IL-Ιβ, um fragmento de anticorpo, um ácido nucleico ou um vector da presente invenção dependerá, por exemplo, dos objectivos terapêuticos, tais como a indicação para a qual a composição vai ser utilizada, a via de administração e o estado clínico do indivíduo. As composições farmacêuticas são administradas numa quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico ou profiláctico para tratar um estado clínico relacionado com IL-1. Uma "quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico ou profiláctico" de um anticorpo de ligação a IL-Ιβ, um fragmento de anticorpo, um ácido nucleico ou um vector da presente invenção é a quantidade que pode tratar ou prevenir um ou mais sintomas de uma doença relacionada com IL-1 num indivíduo.

De acordo com isto, pode ser desejável titular a dose do anticorpo de ligação a IL-Ιβ, do fragmento de anticorpo, do ácido nucleico ou do vector da presente invenção e modificar a via de administração conforme necessário para se obter o efeito terapêutico óptimo. Os intervalos de dosagem vão desde 111 cerca de 0,1 ng/kg até cerca de 100 mg/kg ou mais (em termos de quantidade de agente activo por unidade de peso do corpo do indivíduo a que se administrou o agente activo), consoante os factores mencionados antes. Noutras modalidades, os intervalos de dosagem variam desde cerca de 0,1 yg/kg até cerca de 100 mg/kg, desde cerca de 1 yg/kg até cerca 100 mg/kg, desde cerca de 5 yg/kg até cerca de 100 mg/kg, desde cerca de 0,5 mg/kg até cerca de 100 mg/kg ou desde cerca de 1 mg/kg até cerca de 100 mg/kg. Outras doses podem ser apropriadas. A composição pode ser administrada como uma dose única ou como duas ou mais doses (que podem ou não conter a mesma quantidade de um anticorpo de ligação a IL-Ιβ, um fragmento de anticorpo, um ácido nucleico ou um vector da presente invenção), ao longo do tempo ou como uma infusão contínua, por via, por exemplo, de um dispositivo de implantação ou de um cateter.

Processos de Utilização

Os anticorpos, os fragmentos de anticorpos, os ácidos nucleicos, os vectores, as células e as composições da presente invenção (colectivamente "os compostos e composições da presente invenção") podem ser utilizados para qualquer finalidade. Por exemplo, os compostos e as composições da presente invenção podem ser utilizados para pesquisar os mecanismos relacionados com IL-1, assim como as doenças e os estados clínicos associados com os mecanismos relacionados com IL-1. Contudo, os compostos e as composições da presente invenção são especialmente úteis para tratar um indivíduo (por exemplo, um mamífero ou um ser humano) que necessite de tratamento para um estado clínico relacionado com IL-1, por exemplo, uma doença ou um distúrbio auto-imune ou inflamatório. De acordo com isto, no contexto do processo da presente invenção, descreve-se o tratamento ou a prevenção de 112 uma doença num mamífero, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um ácido nucleico ou um vector da presente invenção a um mamífero que dele necessite, sendo assim a doença ou o distúrbio tratado ou prevenido num mamífero. A expressão "quantidade eficaz" refere-se à quantidade de anticorpo, de fragmento de anticorpo, de ácido nucleico ou de vector da presente invenção necessária para estabelecer um efeito profiláctico ou terapêutico. Tal como se utiliza aqui, o tratamento de uma doença ou de um estado clínico define-se como a redução ou a eliminação temporária ou permanente dos sintomas ou da progressão de uma doença ou de um estado clínico. Do mesmo modo, a prevenção de uma doença ou de um estado clínico significa a inibição temporária ou permanente, o retardamento ou a prevenção do início de uma doença ou de um estado clínico (ou dos sintomas de uma doença ou de um estado clinico). 0 processo descrito no contexto da presente invenção pode ser utilizado para tratar ou prevenir qualquer doença ou estado clinico relacionados com IL-1. Por exemplo, os anticorpos e os fragmentos da presente invenção são considerados para serem utilizados na profilaxia e no tratamento de doenças ou estados clínicos mediados por IL-1, por exemplo, estados clínicos inflamatórios, alergias e estados clínicos alérgicos, cancros, reacções de hiper-sensibilidade, doenças auto-imunes, infecções severas e rejeição de órgão ou tecidos transplantados. Os estados clínicos relacionados com IL-1 incluem artrite reumatóide (AR) , osteoartrite, doença de Crohn, colite ulcerosa (CU) , choque séptico, doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), asma, doença do hospedeiro versus enxerto, aterosclerose, leucemia das células T do adulto, mieloma múltiplo, esclerose múltipla, acidente vascular, doença de Alzheimer. Os 113 anticorpos e fragmentos da presente invenção também podem ser utilizados para tratar ou prevenir um distúrbio inflamatório multi-sistémico com inicio neonatal (NOMID/CINCA), artrite idiopática juvenil com inicio sistémico, doença de Stills, CAPS ou sindrome de Muckle-Wells.

Em geral, uma doença ou um estado clinico pode ser considerado uma doença ou um estado clinico relacionado com IL-Ιβ se estiver associado a niveis elevados de IL-Ιβ nos fluidos do corpo ou nos tecidos do corpo ou se as células ou tecidos retirados do corpo produzem elevados niveis de IL-Ιβ em cultura.

Por exemplo, os processos descritos no contexto da presente invenção podem ser utilizados para tratar ou prevenir o distúrbio inflamatório multi-sistémico com inicio neonatal (NOMID/CINCA), artrite idiopática juvenil com inicio sistémico, sindromes periódicas associadas a CIAS1 (CAPS), doença de Stills ou sindrome de Muckle-Wells.

Como outro exemplo, os processos da presente invenção podem ser utilizados para tratar ou prevenir artrite reumatóide, osteoartrite, doença de Crohn, colite ulcerosa, choque séptico, doença pulmonar obstrutiva crónica, asma, doença do hospedeiro versus enxerto, aterosclerose, leucemia das células T do adulto, mieloma múltiplo, esclerose múltipla, acidente vascular ou doença de Alzheimer.

Ainda como outro exemplo, os processos da presente invenção podem ser utilizados para tratar ou prevenir artrite idiopática juvenil com inicio sistémico, artrite reumatóide, osteoartrite, aterosclerose ou miastenia grave. 114

Outros exemplos de estados clínicos relacionados com IL-1β são pancreatite aguda; ALS; caquexia/anorexia, caquexia induzida pela SIDA; asma e outras doenças pulmonares; vasculite auto-imune; síndromes periódicas associadas a CIAS1 (CAPS); síndroma da fadiga crónica; doença associada ao Clostridium, incluindo diarreia associada a Clostridium; estados clínicos e indicações coronários incluindo insuficiência congestiva do coração, restenose coronária, enfarte do miocárdio, disfunção do miocárdio (por exemplo, relacionada com septicémia) e enxerto de "bypass" na artéria coronária; cancros, tais como mieloma múltiplo e mielogénico (por exemplo, AML e CML) e outras leucemias, assim como metástases de tumores; diabetes (por exemplo, diabetes dependente de insulina); endometriose; síndrome auto-inflamatória fria familiar (FCAS); febre mediterrânica familiar (FMF); febre; fibromialgia; glomerulonefrite; doença do hospedeiro versus enxerto/rejeição de transplante; choque hemorrágico; hiperalgesia; doença inflamatória do intestino; estados clínicos inflamatórios de uma articulação incluindo artrite psoriática (assim como osteoartrite e artrite reumatóide); doenças inflamatórias dos olhos, como as que podem estar associadas, por exemplo, com o transplante da córnea; isquémia, incluindo isquémia cerebral (por exemplo, lesão do cérebro em resultado de trauma, epilepsia, hemorragia ou acidente vascular, cada uma das quais leva a neurodegeneração) ; doença de Kawasaki; dificuldades de aprendizagem; doenças do pulmão (por exemplo, ARDS); miopatias (por exemplo, metabolismo da proteína do músculo, especialmente na septicémia); neurotoxicidade (por exemplo, a induzida por VIH); osteoporose; dor, incluindo a dor relacionada com o cancro; doença de Parkinson; doença periodontal; trabalho de parto pré-termo; psoríase; ferida de reperfusão; efeitos secundários da terapia de radiação; perturbações do sono; doença da articulação mandibular 115 temporal; síndrome de febre periódica associada ao receptor do factor de necrose do tumor (TRAPS); uveite; ou um estado clinico inflamatório resultante de uma estirpe, entorse, danos na cartilagem, traumas, cirurgia ortopédica, infecção ou outros processos de doença.

Os anticorpos e fragmentos da presente invenção também estão contemplados para serem utilizados no tratamento de doentes que vão receber transplantes de coração, pulmão, uma combinação de coração e pulmão, figado, rim, pâncreas ou transplantes da pele ou da córnea e incluindo rejeição de alo-enxertos, rejeição de xeno-enxertos ou para a prevenção da doença do hospedeiro versus o enxerto, tal como o que se segue ao transplante de medula óssea ou na aterosclerose associada ao transplante de órgãos.

Os anticorpos e os fragmentos da presente invenção estão contemplados na utilização no tratamento ou na prevenção de doenças auto-imunes ou estados clinicos inflamatórios, em particular, estados clinicos inflamatórios com uma etiologia que inclui um componente auto-imune, tal como artrite (por exemplo, artrite reumatóide, artrite crónica progressiva e doenças artríticas e reumáticas, incluindo estados clínicos inflamatórios e doenças reumáticas envolvendo perda óssea, dor inflamatória, hipersensibilidade (incluindo tanto a hipersensibilidade das vias aéreas como a hipersensibilidade dérmica) ou alergias. As doenças auto-imunes específicas para as quais os anticorpos e os fragmentos da presente invenção podem ser utilizados incluem distúrbios hematológicos auto-imunes (incluindo, por exemplo, anemia hemolítica, anemia aplásica, anemia pura dos glóbulos vermelhos e trombocitopénia idiopática), lúpus eritematoso sistémico, policondrite, esclerodoma, granulomatose de Wegener, hepatite activa crónica, miastenia grave, psoríase, síndrome de 116

Steven-Johnson, psilose idiopática, doença inflamatória auto-imune do intestino (incluindo, por exemplo, colite ulcerosa, doença de Crohn e sindrome do intestino irritável), doença de Graves endócrina, sarcoidose, esclerose múltipla, cirrose biliar primária, diabetes juvenil (diabetes mellitus do tipo I), uveite (anterior e posterior), ceratoconjuntivite sica e ceratoconjuntivite vernal, fibrose intersticial do pulmão, artrite psoriática ou glomerulonefrite (com e sem sindrome nefrótica, por exemplo, incluindo sindrome nefrótica idiopática ou nefropatia de alteração mínima).

Os anticorpos e fragmentos da presente invenção também estão contemplados para serem utilizados no tratamento, prevenção ou melhoria de asmas, bronquite, pneumoconiose, enfisema pulmonar e outras doenças obstrutivas ou inflamatórias das vias aéreas. Os anticorpos ou fragmentos para tratar reacções inflamatórias agudas e hiperagudas indesejáveis que são mediadas por IL-1 ou cuja produção envolve IL-1, especialmente a promoção da libertação de FNT por IL-1, por exemplo, infecções agudas, por exemplo, choque séptico (por exemplo, choque endotóxico e sindrome de insuficiência respiratória do adulto), meningite, pneumonia; e queimaduras graves; e para o tratamento de caquexia ou sindrome atrofiante associado com FNT a libertação mórbida de FNT, consequente a infecção, cancro ou disfunção de um órgão, especialmente caquexia relacionada com a SIDA, por exemplo, associada com ou na sequência de uma infecção por VIH.

Os anticorpos e fragmentos da presente invenção estão também contemplados para serem utilizados no tratamento de doenças do metabolismo ósseo, incluindo osteoartrite, osteoartrite e outras artrites inflamatórias e perda óssea em geral, incluindo a perda óssea relacionada com a idade e, em particular, a doença periodontal. 117

Os anticorpos e fragmentos da presente invenção estão também contemplados para serem utilizados no tratamento ou na prevenção de sindromes periódicos associados a CIAS1 (CAPS), incluindo cada um dos distúrbios inflamatórios multi-sistémicos de inicio neonatal (NOMID), sindrome de Muckle-Wells (MWS) e sindrome auto-inflamatória familiar do frio (FCAS) . As mutações no gene CIAS1 são hoje reconhecidas como sendo responsáveis por três sindromes genéticas raras: distúrbios inflamatórios multi-sistémicos de inicio neonatal (NOMID), sindrome de Muckle-Wells (MWS) e sindrome auto-inflamatório familiar do frio (FCAS) . (Hoffman et al. 2001 Naure 29: 301-305; Feldmann et al. 2002 Am J Hum Genet 71: 198-203; Aksentijevich et al. 2002 Arthritis Rheum 46: 3340-3348). Em agregado, estes estados clinicos são conhecidos como "CAPS". O CIAS1 codifica uma proteína designada por NALP3 que é uma componente da "inflamassoma", um complexo enzimático sub-celular que regula a actividade da caspase 1. A caspase 1 é enzima que cliva a pró-forma inactiva da citocina pró-inflamatória, IL-1, na sua forma activa sob o ponto de vista biológico (Agostini et al. 2004 supra). As mutações em CIAS1 levam a um aumento da produção de IL-1. O anticorpo ou o fragmento de anticorpo, o ácido nucleico ou o vector da presente invenção é normalmente administrado a um mamífero ou a um ser humano sob a forma de uma composição farmacêutica contendo o anticorpo ou o fragmento de anticorpo, o ácido nucleico ou o vector da presente invenção e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. As composições farmacêuticas apropriadas para serem utilizadas em conjunto com o processo de tratamento ou de prevenção de uma doença são as descritas aqui previamente. O anticorpo ou o fragmento de anticorpo, o ácido nucleico ou o vector da presente invenção podem ser 118 administrados a um mamífero como um agente activo único ou em conjunto com um ou mais de outros agentes que interrompem a sinalização do receptor de IL-1. Um agente que interrompe a sinalização do receptor de IL-1 pode ser qualquer composto ou composição que iniba uma interacçao entre IL-Ιβ e o receptor de IL-1. Por exemplo, os agentes que interrompem a sinalização do receptor de IL-1 incluem anticorpos que se ligam a IL-Ιβ ou ao receptor de IL-1, IL-lRa recombinante (por exemplo, da Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) e péptidos que "retêm" o receptor de IL-1 (por exemplo, da Regeneron Inc., Tarrytown, NY). Quando se utilizam dois ou mais agentes que interrompem a sinalização do receptor de IL-1, esses podem ser administrados em conjunto (por exemplo, numa única composição farmacêutica) ou podem cada um deles ser administrados separadamente (por exemplo, em composições farmacêuticas separadas). 0 anticorpo, fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vector da presente invenção podem ser administrados a um mamífero em combinação ou em conjugação com um ou mais de outros agentes activos para o tratamento ou a prevenção de estados clínicos ou de doenças mediados por IL-1, conforme estabelecido antes.

Utilizações para diagnóstico

Para além das utilizações terapêuticas, os anticorpos e fragmentos da presente invenção podem ser utilizados em processos de diagnóstico para detectar IL-Ιβ (por exemplo, numa amostra biológica, tal como soro ou plasma), utilizando um imuno-ensaio convencional, tal como ensaios imuno-absorventes ligados a enzimas (ELISA), um radio-imuno-ensaio (RIA) ou uma imuno-histoquímica dos tecidos. Um processo para detectar IL-Ιβ numa amostra biológica pode compreender as 119 etapas de contacto numa amostra biológica com um ou mais dos anticorpos ou fragmentos da presente invenção e a detecção quer do anticorpo ou do fragmento ligado a IL-Ιβ ou do anticorpo ou do fragmento não ligado para assim detectar IL-1β numa amostra biológica. 0 anticorpo ou o fragmento podem estar directamente ou indirectamente marcados com uma substância detectável para facilitar a detecção do anticorpo ligado ou não ligado. As substâncias detectáveis apropriadas incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioactivos. Exemplos de enzimas apropriadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, β-galactosidase ou acetilcolinosterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos apropriados incluem estreptavidina/ biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes apropriados incluem umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinil-amina-fluoresceina, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; e exemplos apropriados de materiais radioactivos incluem 125I, 131I, 35S ou 3H.

Em vez da marcação do anticorpo, a IL-Ιβ pode ser analisada em fluidos biológicos por meio de um imuno-ensaio comparativo utilizando padrões de IL-Ιβ marcados com uma substância detectável e um anticorpo anti-IL-Ιβ não marcado. Neste ensaio, a amostra biológica, os padrões de rIL-Ιβ marcados e o anticorpo anti-IL-Ιβ combinam-se e determina-se a quantidade-padrão de IL-Ιβ marcada com o anticorpo não marcado. A quantidade de IL-Ιβ na amostra biológica é inversamente proporcional à quantidade-padrão de IL-Ιβ marcada ligada ao anticorpo anti-IL-Ιβ. 120

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem ilustram melhor a presente invenção.

Nos exemplos que se seguem faz-se referência a vários anticorpos, incluindo os anticorpos designados por ABI, AB5 e AB7. Tal como mencionado antes, ABI compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 4 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 9. AB5 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 8 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 9. AB7 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 15 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 11.

Para as várias comparações, nos exemplos que se seguem, faz-se referência a um anticorpo designado por controlo de AB, um anticorpo disponível comercialmente com uma afinidade relativamente elevada para IL-Ιβ. 0 controlo de AB é um anticorpo de murino que se crê que tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência da SEQ ID N°. 40 e uma cadeia leve compreendendo a sequência da SEQ ID N°. 41. Estas sequências de murino estão indicadas na publicação do pedido de patente norte-americana N°. 2003/0026806, nas figuras 6A e 6B.

Em vários dos exemplos que se seguem, inesperadamente, AB5 e AB7 demonstraram ter uma afinidade maior para a IL-Ιβ humana do que o controlo AB. 121 EXEMPLO 1

Este exemplo ilustra as afinidades de ligação de alguns anticorpos conforme descrito no contexto da presente invenção em relação a IL-Ιβ.

Os anticorpos designados por ABI e AB5 foram analisados quanto às propriedades de ligação a IL-Ιβ utilizando um dispositivo KINEXA™ (da Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID) . A sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos ABI e AB5 estão indicadas nas fig. 2 e 3. Analisou-se, para comparação, um anticorpo disponível comercialmente com uma afinidade relativamente elevada para IL-Ιβ (aqui designado por controlo AB).

Os resultados do ensaio de ligação a IL-Ιβ estão resumidos no quadro 1. Os valores de KD representam as constantes de dissociação da ligação para os respectivos complexos de anticorpo-IL-Ιβ. Calculou-se KD como a relação entre a "taxa de saída" (taxa de dissociação para o complexo do anticorpo-IL-Ιβ) e a "taxa de entrada" (taxa de associação para o complexo do anticorpo-IL-Ιβ) . Uma taxa de KD mais baixa é indicativa de uma afinidade mais elevada do anticorpo.

Quadro 1: Resultados de Ligação a IL-Ιβ

Anticorpo KD (pM) Controlo AB 3,06 ABI 18, 63 AB5 (invenção) 0,261

Os resultados destas experiências mostram que ABI e AB5 se ligam a IL-Ιβ com elevada afinidade. As afinidades para 122 IL-Ιβ dos anticorpos da presente invenção são comparáveis ou melhores do que a afinidade da ligação do controlo AB em relação a IL-Ιβ. EXEMPLO 2

Este exemplo ilustra a inibição in vitro de IL-Ιβ utilizando anticorpos tal como foi descrito no contexto da presente invenção.

As potências inibidoras de IL-Ιβ por parte dos anticorpos ABI e AB5 (ver exemplo 1) foram avaliadas utilizando um bioensaio que mede a libertação de IL-6 de fibroblastos humanos, estimulada por IL-Ιβ. Tal como no exemplo 1, utilizou-se o controlo AB como uma amostra comparativa. Os detalhes do ensaio estão descritos em Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, cap. 6.2.1-6.2.7, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000. Em resumo, MRC5 humano, de fibroblastos humanos da American Type Culture Collection (ATCC) Manassas, VA (ATCC # CCL-171) cresceram até à confluência em placas de vários poços. As células foram tratadas com doses tituladas de anticorpo AB5. As células, em seguida, foram postas em contacto com (i) 100 pg/mL de IL-Ιβ ou (ii) 100 pg/mL de IL-Ιβ e o anticorpo ABI ou AB5 (do exemplo 1) . As células do controlo negativo não foram estimuladas por IL-Ιβ. As quantidades de IL-6 libertadas em cada grupo de células tratadas foram medidas utilizando um estojo de ELISA para IL-6 da BD Pharmingen (Franklin Lakes, NJ) de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados de ELISA estão descritos na fig. 5 e resumidos no quadro 2. A CI5o é a concentração de anticorpo necessária para inibir 50 % da IL-6 libertada por estimulação de IL-Ιβ. 123

Quadro 2: Resultados de ELISA

Anticorpo CI5o (nM) Controlo AB 0,017 ABI 0,15 AB5 (invenção) 0,014

Estes resultados demonstram que a potência in vitro dos anticorpos da presente invenção inibe IL-Ιβ. Além disso, a inibição da libertação de citocina estimulada por IL-Ιβ em MRC5 tem demostrado que está relacionada com a capacidade do agente para inibir a actividade, in vivo, mediada por IL-1. Assim, estes resultados indicam que os anticorpos da presente invenção terão uma eficácia inibidora de IL-Ιβ in vivo. EXEMPLO 3

Este exemplo ilustra a inibição in vivo de IL-Ιβ utilizando anticorpos tal como foi descrito no contexto da presente invenção.

Para confirmar a eficácia in vivo de AB5, ensaiou-se a sua capacidade para bloquear a actividade biológica de IL-Ιβ humana em ratos. Os detalhes do ensaio estão descritos em Economides et al., Nature Med., 9: 47-52 (2003). Em resumo, injectaram-se ratos macho C57/B16 (Jackson Laboratory Bar Harbor, Maine), intraperitonealmente, com doses tituladas de AB5 (exemplo 1) , controlo AB (exemplo 1) ou IgG de controlo (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) . Vinte e quatro horas após a injecção do anticorpo, injectaram-se os ratos, subcutaneamente, com IL-Ιβ humana recombinante (rhlL-1β) (da PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ) , a uma dose de 1 yg/kg. Duas horas após a injecção de rhIL-Ιβ (pico do tempo de resposta de IL-6), sacrificaram-se os ratos e colheu-se 124 sangue e tratou-se para o soro. Analisaram-se os níveis de IL-6 no soro por ELISA (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ) de acordo com o protocolo do fabricante. Calculou-se a inibição percentual a partir da proporção de IL-β detectada no soro do animal da experiência em relação a IL-6 detectada no controlo (multiplicada por 100).

Os resultados estão ilustrados na fig. 6. A capacidade para inibir a actividade de IL-Ιβ in vivo foi avaliada em função dos níveis de IL-6 no soro estimulados por IL-Ιβ. Tal como ilustrado na fig. 6, o anticorpo AB5 foi tão eficaz, senão mais eficaz, do que o controlo AB para a inibição da actividade de IL-Ιβ humana in vivo. 3 yg de AB5 foi tão eficaz como 10 yg de controlo AB neste ensaio.

Assim, os resultados indicam que os anticorpos ensaiados são úteis para a inibição da actividade de IL-Ιβ in vivo. Estes resultados mostram também que uma única injecção de AB5 pode bloquear a acção sistémica para a estimulação de IL-Ιβ ao longo de um período de tempo prolongado. EXEMPLO 4 O exemplo que se segue ilustra a preparação de um anticorpo, tal como descrito no contexto da presente invenção.

Gerou-se um certo número de sequências de anticorpos humanos tratados por engenharia genética utilizando a tecnologia HUMAN ENGINEERING™, tal como descrito em Studnicka et al., Protein Engineering, 7: 805-814 (1994) e nas patentes norte-americanas 5.766.886, 5.770.196, 5.821.123 e 5.869.619 e na publicação do pedido de patente WO 93/11794. As sequências de anticorpos humanos geradas por engenharia 125 genética incluíram AB5.1, AB5.2, AB5.3 e AB5.4. Tal como se mostra nas figs. 3 e 4, cada uma destas sequências compreende duas posições variáveis, na região RDC-3P, indicadas por Xi e X2. Assim, em certos exemplos de cada um destes anticorpos humanos tratados por engenharia genética, Xi e X2, da RDC3, correspondem a alanina e arginina, valina e arginina, fenilalanina e arginina, lisina e lisina ou asparagina e arginina, respectivamente. EXEMPLO 5

Os anticorpos designados por AB5 e AB7 (uma sequência de anticorpos humanos gerados por engenharia) foram analisados quanto às propriedades de ligação a IL-Ιβ utilizando um ensaio de exclusão cinética realizado num dispositivo KINEXA™ de uma forma semelhante à descrita no exemplo 1. Uma descrição adicional acerca dos dispositivos KINEXA™ e do modo operatório para a caracterização de anticorpos está disponível no fabricante e pode ser encontrada na literatura publicada, por exemplo, na patente norte-americana N°. 6.664.114 (Sapidyne, Inc.); e Darling et al., "Kinetic Exclusion Assay Technology: Characterization of Molecular Interactions." ASSAY and Drug Development Technologies, 2004, 2, 647-657. O dispositivo KINEXA™ realiza um ensaio de cinética de exclusão e fixa os dados para várias curvas teóricas e assim determina-se KD assim como outras propriedades, tais como os intervalos de confiança de 95 % para KD. O dispositivo KINEXA™ é geralmente mais sensível do que outros dispositivos (por exemplo, um dispositivo da BiaCore) para a análise das características de afinidade, tais como as constantes de dissociação e as taxas de dissociação. 126

As sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e leve de AB5 e AB7 estão ilustradas nas figs. 3 e 4A, respectivamente. Os resultados do ensaio de ligação a IL-Ιβ estão resumidos no quadro 3. Tal como no exemplo 1, calculou-se KD como a proporção entre a "taxa de dissociação" e "taxa de associação" e uma taxa de KD mais baixa é indicativa de uma maior afinidade do anticorpo.

Quadro 3

Anticorpo KD (pM) AB5 0,24 AB7 0,30

Os resultados destas experiências mostram que AB5 (consistente com os resultados observados no exemplo 1) e AB7 se ligam a IL-Ιβ com uma afinidade inesperadamente elevada, que é representada pelos valores inesperadamente baixos para as suas contantes de dissociação.

As figs. 7, 8 e 9 mostram as afinidades de ligação dos anticorpos designados por ABI, AB5 e AB7, respectivamente, conforme determinado para uma experiência representativa para cada uma das análises utilizando KINEXA. A fig. 7 reflecte os resultados ilustrados no quadro 1, enquanto as figs. 8 e 9 reflectem os resultados ilustrados no quadro 3.

Para além dos valores ilustrados no quadro 3, os resultados dos ensaios com KINEXA também indicam intervalos de confiança acima e abaixo de 95 % (KD baixa e KD elevada) . Para AB5, a KD baixa foi de 0,07 pM e a KD elevada foi de 0,72 pM. Para AB7, a KD baixa foi de 0,11 pM e a KD elevada foi de 0,74 pM. 127

Valores similares de KD baixa e Kd elevada foram encontrados no ensaio ilustrado no exemplo 1. Para o controlo AB, a KD baixa foi de 1,62 pM e a KD elevada foi de 5,23 pM. Para ABI, a KD baixa foi de 13,38 pM e a KD elevada foi de 24,84 pM. Para AB5, a KD baixa foi de 0,11 pM e a KD elevada foi de 0,56 pM.

Os resultados dos ensaios com KINEXA indicam que AB5 e AB7 têm uma constante de dissociação inesperadamente mais baixa do que o controlo AB. EXEMPLO 6

Este exemplo ilustra a inibição, in vitro, da libertação de IL-6 estimulada por IL-Ιβ. A CI5o para a inibição da libertação de IL-6, estimulada por IL-Ιβ, a partir de fibroblastos humanos, foi analisada para vários anticorpos da presente invenção, tal como se segue. A potência inibidora de AB5 e AB7 de IL-Ιβ foi avaliada de uma forma semelhante à descrita no exemplo 2, utilizando um bioensaio que mede a libertação de IL-6 de fibroblastos humanos estimulada por IL-Ιβ. As figs. 10-12 mostram as curvas de ligação para ensaios individuais em vários anticorpos. A fig. 10 mostra a inibição da libertação de IL-6, de fibroblastos humanos, pelos anticorpos designados por ABI, AB2 e AB3 e os resultados destes três ensaios individuais indicam que ABI tem uma CI50 de 0,029 nM (29 pM) , AB2 tem uma CI50 de 0,076 nM (76 pM) e AB3 tem uma CI50 de 0,214 nM (214 pM). A fig. 11 mostra a inibição da libertação de IL-6, de fibroblastos humanos, por meio dos anticorpos designados por ABI e AB7 num ensaio adicional. A fig. 12 mostra a inibição da libertação de IL-6, de fibroblastos humanos, pelos anticorpos AB5 e AB7, assim como pelo Kineret® 128 disponível comercialmente. Os resultados indicaram que AB5 e AB7 têm uma potência substancialmente maior no que respeita à inibição de IL-Ιβ do que Kineret®, com base nas determinações de CI5o nos ensaios. Kineret® é uma proteína feita pelo homem que é semelhante a uma proteína de ocorrência natural designada por antagonista do receptor de interleucina-1 (IL-lra) encontrada no corpo. As figs. 10-12 mostram os resultados dos ensaios individuais para a potência dos anticorpos ou Kineret®, em termos de percentagem de inibição de IL-6 sem o anticorpo e o quadro 4 mostra as CI5o calculadas para esses ensaios individuais. A CI5o é a concentração do anticorpo ou de Kineret® necessária para inibir 50 % de IL-6 libertada por estimulação de IL-Ιβ.

Quadro 4

Anticorpo CI50 (nM) AB5 0, 0049 (4, 9 pM) AB7 0, 0044 (4,4 pM) Kineret® 0,0454 (45,4 pM)

Para além dos resultados dos ensaios individuais relatados nos quadros 2 e 4 e ilustrados nas figuras 6, 10, 11 e 12, realizaram-se outros ensaios individuais para cada ABI, AB7 e para o controlo AB. Calculou-se uma média de CI50 a partir dos resultados dos ensaios individuais. A média de CI50 para ABI de 66,7 pM foi calculada, a partir dos resultados dos ensaios individuais, como sendo de 35 pM, 30 pM, 150 pM (estes valores também estão ilustrados no quadro 2) e 52 pM. A média de CI50 para AB7, de 5,6 pM, foi calculada a partir dos resultados dos ensaios individuais como sendo de 7,3 pM, 4,2 pM, 4,5 pM, 4,4 pM (estes valores também estão ilustrados no quadro 4), 6,0 pM, 5,0 pM e 7,8 pM. A média de CI50 para o controlo AB, de 8,9 pM, foi 129 calculada a partir dos resultados dos ensaios individuais como sendo de 5,0 pM, 17,0 pM (estes valores também estão ilustrados no quadro 2) e 4,9 pM.

Estes resultados demonstram a potência, in vitro, de ABI, AB5 e AB7 para inibir IL-β. Além disso, a inibição da libertação da citocina de fibroblastos humanos, estimulada por IL-Ιβ, tem demonstrado que está relacionada com a capacidade do agente de inibição para inibir a actividade mediada por IL-1 in vivo. Assim, estes resultados indicam que os anticorpos da presente invenção terão uma eficácia inibidora de IL-Ιβ in vivo. EXEMPLO 7

Este exemplo ilustra a inibição de IL-Ιβ, in vivo, utilizando anticorpos de ligação a IL-Ιβ. A eficácia de AB5, ABI e AB7, in vivo e a sua capacidade para bloquear a actividade biológica de IL-Ιβ humana foi ensaiada em murganhos de uma maneira semelhante à descrita no exemplo 3. Os resultados dos ensaios de AB5 e ABI estão ilustrados na fig. 13 e os resultados dos ensaios de AB5 e AB7 estão ilustrados na fig. 14. A capacidade para inibir a actividade de IL-Ιβ in vivo foi avaliada em função dos níveis de IL-6 no soro estimulados por IL-Ιβ. Tal como ilustrado pelas figs. 13 e 14, os anticorpos ABI, AB5 e AB7 foram eficazes na inibição da actividade, in vivo, de IL-Ιβ humana.

Estes resultam indicam que os anticorpos ensaiados são úteis para a inibição da actividade de IL-Ιβ in vivo. 130 EXEMPLO 8

Este exemplo ilustra que pelo menos alguns anticorpos de ligação a IL-Ιβ, de acordo com a presente invenção, reticulam com IL-Ιβ de alguns mamiferos, excepto seres humanos e não reticulam com IL-Ιβ de outros mamiferos não humanos. O anticorpo designado por AB7 (um anticorpo que se lida a IL-Ιβ humana com elevada afinidade) foi analisado quanto à ligação a IL-Ιβ de mamiferos não humanos, nomeadamente macaco rhesus, macaco cinomolgos, cães, porquinhos-da-índia e coelhos.

Obteve-se sangue completo fresco heparanizado de macaco rhesus, macaco cinomolgos, cães, porquinhos-da-índia e coelhos do Charles River Labs. Separou-se o sangue completo por centrifugação por gradiente de densidade de Ficoll e isolaram-se as células mononucleares de sangue periférico (CMSP) . Para cada espécie de CMSP, incubaram-se 2,5 x 105 células/mL em meio RPMI periférico com ou sem 50 ng/mL de lipopolissacárido (LPS) (E. Coli 055:B5) e colheram-se os sobrenadantes 24 horas apos a estimulação. Supõe-se que o LPS estimula a produção de IL-Ιβ pelas CMSP. Fez-se a incubação de 2 mL de cada sobrenadante, durante 3 horas, com 2 yg de AB7, seguido da adição de 50 yL de um aglomerado de pérolas de proteina A-sefarose para imunoprecipitar o complexo de AB7/IL-^. Imobilizou-se IL-Ιβ humana (Peprotech) em RPMI e realizou-se um ciclo de imunoprecipitação/controlos por "Western blot". Após a centrifugação e a lavagem das pérolas de proteina A - sefarose, carregaram-se todas as amostras num gel de SDS-PAGE e realizou-se um ciclo a 120V, durante 1 hora. No seguimento da transferência para uma membrana de Immobilon-P, a 22 V, durante a noite e do bloqueio com leite desnatado a 5 %, fez-se a incubação de AB7, a 2 yg/mL, com a membrana, durante 2 horas. Adicionou-se um anticorpo IgG anti-humano de cabra, secundário, conjugado com peroxidase de 131 rábano silvestre (PRS) no seguimento das etapas de lavagem e fez-se a detecção com uma etapa com uma solução de tetrametil-benzidina (TMB).

As figs. 15 e 16 mostram os resultados de "Western blot" obtidos a partir deste procedimento. Do lado esquerdo do resultado do ensaio ilustrado na fig. 15 (colunas 1-3) estão os controlos aos quais se adicionou quantidades variáveis (5 ng, 10 ng e 20 ng) de IL-Ιβ humano ao meio RPMI. Próximo do fundo da mancha, podem ver-se bandas em cada uma das colunas numa região correspondente a um peso molecular de aproximadamente de 17 kDa. Estas bandas são indicativas da ligação de AB7 a IL-Ιβ humana. A coluna do meio (coluna 4) é o meio RPMI. Do lado direito da mancha ilustrada na fig. 15 (colunas 5-8) ilustram-se os resultados para as amostras de macaco cinomolgos e macaco rhesus As colunas 5 e 6 são as amostras de macaco cinomolgos sem LPS e com 50 ng de LPS adicionados ao meio RPMI, respectivamente. As colunas 7 e 8 são as amostras de macaco rhesus sem LPS e com 50 ng de LPS adicionados ao meio de RPMI, respectivamente. Próximo do fundo da análise de "Western blot", podem ver-se as bandas nas colunas 6 e 8 (as amostras a que se tinha adicionado LPS) numa região correspondendo a um peso molecular de aproximadamente 17 kDa. Estas bandas nas colunas 6 e 8 são indicativas da reticulação de AB7 com IL-Ιβ de primata nomeadamente IL-Ιβ de macacos cinomolgos e de macaco rhesus. A fig. 16 mostra as análises de "Western blot" para os controlos e para a mostras de CMSP de cão, porquinhos-da-índia e coelhos. No lado esquerdo das manchas ilustradas na fig. 16 (colunas 1-4) estão os controlos aos quais se adicionou quantidades variáveis (5 ng, 10 ng, 50 ng e 200 ng) de IL-Ιβ humana ao meio RPMI. Próximo do fundo da mancha, podem ver-se bandas em cada uma das colunas, numa região 132 correspondente ao peso molecular de aproximadamente 17 kDa. Estas bandas são indicativas da ligação de AB7 a IL-Ιβ humana. A coluna 5 na fig. 15 é o meio RPMI. As colunas 6-8 são os resultados para as amostras das CMSP de cães, sem LPS, e com 50 ng de LPS e 200 ng de LPS, respectivamente. As colunas 9 e 10 são os resultados para as amostras das CMSP de porquinhos-da-índia, sem LPS e 50 ng de LPS, respectivamente. As colunas 11 e 12 são os resultados para as amostras das CMSP de coelho, sem LPS e com 50 ng de LPS, respectivamente. Próximo do fundo da análise de "Western blot", podem ver-se bandas, nas colunas 7, 8 e 12 (as amostras de cães e coelhos a que se adicionou LPS) numa região correspondendo a um peso molecular de aproximadamente 17 kDa. Estas bandas nas colunas 7, 8 e 12 são indicativas da reticulação de AB7 com IL-Ιβ de cães e IL-Ιβ de coelhos. A ausência de uma banda visivel na coluna 10 (CMSP de porquinho-da-índia a que se adicionou 50 ng de LPS) indica que AB7 não reticulou com IL-Ιβ de porquinhos-da-índia.

Estes resultados indicam que AB7 é reticulável com IL-Ιβ de vários mamíferos não-humanos, nomeadamente macacos rhesus, macacos cinomolgos, cães e coelhos, mas não é reticulável com IL-Ιβ de pelo menos um dos outros mamíferos não humanos, nomeadamente os porquinhos-da-índia. EXEMPLO 9

Este exemplo ilustra ainda que pelo menos alguns dos anticorpos de ligação a IL-Ιβ, de acordo com a presente invenção, são reticuláveis com IL-Ιβ de outros mamíferos não humanos. O anticorpo AB7 foi analisado quanto à ligação a IL-Ιβ de mamíferos não humanos, nomeadamente murganhos e ratos. 133

Carregou-se IL-Ιβ recombinante de seres humanos, murganhos e ratos (Peprotech) em condições redutoras e não redutoras, numa coluna de gel de SDS-PAGE e fez-se um ciclo a 120 V, durante 1 hora. No seguimento da transferência para uma membrana de Immobilon-P, a 22 V, durante a noite, bloqueando com leite desnatado a 5 %, fez-se a incubação de AB7, a 2 yg/mL, com uma membrana, durante 2 horas. Adicionou-se um anticorpo secundário de IgG de cabra anti-humano conjugada com PRS seguindo as etapas de lavagem e a detecção foi feita numa etapa com uma solução de TMB. A fig. 17 mostra a análise de "Western blot" obtida pelos processos anteriores. As colunas 1 e 2 são para IL-Ιβ humana não reduzida e reduzida, respectivamente. As colunas 3 e 4 são para IL-Ιβ de murganho reduzida e não reduzida, respectivamente. As colunas 5 e 6 são para IL-Ιβ de rato reduzida e não reduzida, respectivamente. No fundo da mancha, podem ver-se bandas em cada uma das colunas, numa região correspondente ao peso molecular de aproximadamente 17 kDa. Estas bandas são indicativas da presença de IL-Ιβ que, por sua vez, é indicativa da ligação de AB7 a IL-Ιβ humana, IL-Ιβ de murganho e IL-Ιβ de rato. Estes resultados indicam que AB7 é reticulável com IL-Ιβ de roedores. EXEMPLO 10

Este exemplo ilustra ainda que pelo menos alguns anticorpos de ligação a IL-Ιβ, de acordo com a presente invenção, são inibidores de IL-Ιβ de seres humanos e pelo menos alguns mamíferos não humanos. Fez-se o ensaio do anticorpo AB7 quanto à inibição da proliferação de células D10 estimuladas por IL-Ιβ humana, de macaco rhesus, de murganho e de rato. 134

As células D10.G4.1 (D10) são células T auxiliares de murino com especificidade para o antigénio de conalbumina da clara de ovo. Esta linha de células derivou de ratos AKR/J (haplotipo H-2k MHC) e requerem a activação de IL-1 e do receptor do antigénio para o crescimento, a proliferação e o crescimento. A linha de células D10 é altamente sensível a IL-1 e pode responder a IL-1 de várias espécies (incluindo seres humanos, macacos, murganhos e ratos) que permitem a análise do potencial de neutralização da reticulação de um anticorpo ou fragmento de ligação a IL-Ιβ, tal como AB7. A proliferação de D10 não é afectada pelos LPS ou por citocinas derivadas de macrófagos, tais como IL-6 e FNT-α. Como resultado, podem utilizar-se ensaios de D10 para avaliar a actividade específica de IL-1 de fontes endógenas (isto é, macrófagos activados por LPS).

As células D10 foram activadas com concanavalina A (Con A) e um nível contante de uma fonte recombinante ou natural de IL-1, na presença ou na ausência de várias concentrações de AB7. Colocaram-se as células em placas a 2 x 104/poço e estimularam-se com 2,5 pg/mL de Con A e diferentes concentrações de IL-Ιβ. Fez-se a cultura das células durante 72 horas e mediu-se a proliferação adicionando o corante de viabilidade redox Alamar azul, durante as últimas 8-14 horas da cultura e analisou-se a D.0.57o-6oo·

Para analisar a potência e a reticulação das espécies de AB7, realizou-se o bioensaio de D10 utilizando as concentrações que se seguem de IL-Ιβ recombinante ou natural: 10 pg/mL de IL-Ιβ humana recombinante; 10 pg/mL de IL-Ιβ recombinante de rhesus; 10 pg/mL de IL-Ιβ de murganho; e 100 pg/mL de IL-Ιβ de rato. Para o ensaio dlO utilizando IL-Ιβ humana endógena, utilizou-se uma diluição a 1:360 de sobrenadante a partir de CMSP humanas activadas por LPS. 135

Analisaram-se diferentes concentrações de AB7 com cada uma das IL-Ιβ. As medições de CI5o foram determinadas utilizando o Graphpad Prism. Calculou-se a média, o desvio-padrão (DP) o erro-padrão (SEM) para CI5o utilizando o Excel da Microsoft.

Os resultados do ensaio dlO estão resumidos no quadro 5, que inclui a média de CI5o e o SEM (com base em 4 experiências para IL-Ιβ humana recombinante e 3 experiências para IL-Ιβ de outras fontes). 0 AB7 foi altamente potente na neutralização de IL-Ιβ humana recombinante e produziu endogenamente (naturalmente) IL-Ιβ humana. 0 AB7 foi também altamente potente na neutralização de IL-Ιβ recombinante de macaco rhesus. 0 AB7 também neutralizou IL-Ιβ recombinante de murganho com uma potência mais baixa, tendo uma CI5o que foi 1.000 vezes mais elevada comparada com a humana. Ο AB7 não teve uma actividade significativa contra IL-Ιβ de rato neste ensaio.

Quadro 5: Resultados de ELISA CI5o (pM) SEM (pM) IL-Ιβ humana recombinante 2,4 + 0, 52 IL-Ιβ humana produzida endogenamente (natural) 2,6 + 0, 11 IL-Ιβ recombinante de macaco rhesus 2,7 + 0, 73 IL-Ιβ recombinante de murganho 2.618 + 60,9

Estes resultados indicam que AB7 é um anticorpo de neutralização altamente potente contra IL-Ιβ humana, com uma potência similar contra formas recombinantes e naturais da citocina. A actividade contra IL-Ιβ não humana do primata macaco rhesus foi semelhante à encontrada contra IL-Ιβ humana. Assim, pelo menos alguns anticorpos e fragmentos da presente invenção englobam anticorpos e fragmentos que têm praticamente a mesma potência contra IL-Ιβ humana e IL-Ιβ de primata e/ou têm praticamente a mesma potência contra IL-Ιβ 136 humana recombinante e IL-Ιβ endógena humana. Estes resultados também indicam que AB7 também neutraliza IL-Ιβ de murganho. EXEMPLO 11

Este exemplo ilustra o mapeamento do epítopo de IL-Ιβ ao qual se ligam pelo menos alguns anticorpos da presente invenção (por exemplo, o anticorpo designado por AB7).

Utilizou-se uma matriz de péptido PepSpot™ (JPT Peptide Technologies, Berlim, Alemanha) para identificar os resíduos de aminoácidos principais de IL-Ιβ (epítopo) envolvidos na ligação de AB7. Um rastreio de doze péptidos de aminoácidos que se distribuíam por toda a sequência de aminoácidos de IL-Ιβ, cada péptido sobrepondo-se por onze aminoácidos ao anterior, foram sintetizados directamente numa membrana. A membrana que comportava os péptidos foi sondada com AB7, a uma concentração de 2 pg/mL, durante 2 horas, à temperatura ambiente. A ligação de AB7 aos péptidos ligados à membrana foi detectada utilizando o anticorpo anti-humano secundário de cabra conjugado com PRS, seguido de uma quimio-luminescência melhorada (ECL). As manchas dos péptidos correspondiam aos resíduos de IL-Ιβ 83-105 pontuados como positivos para a ligação a AB7.

Este mapeamento indica que AB7 se liga a um epítopo dentro da sequência correspondente aos resíduos 83-105 da proteína de IL-Ιβ madura. A sequência compreende os aminoácidos ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE e AB7 é um exemplo dos anticorpos que se ligam a um epítopo dentro desta sequência. Espera-se que os anticorpos designados por AB6, AB8, AB9 e outros, tais como os anticorpos que têm a cadeia pesada da sequência da SEQ ID N°. 29 e a cadeia leve da SEQ ID N°. 27, também se ligam a um epítopo contido nesta sequência. 137 EXEMPLO 12

Este exemplo ilustra a inibição, in vitro, de IL-Ιβ utilizando um anticorpo da presente invenção, num ensaio de IL-8 à base de células.

Recolheu-se sangue periférico fresco, heparinizado de dadores saudáveis. Colocou-se em placa 180 yL de sangue completo numa placa de 96 poços e incubou-se, com várias concentrações do anticorpo AB7 e 100 pM de rhIL-Ιβ. Para as amostradas tratadas com Kineret® combinou-se Kineret® e rhlL-1β, a 1:1, antes de se misturar com o sangue. Incubaram-se as amostras durante 6 horas, a 37 °C, com CO2 a 5 %. Fez-se então a lise das células de sangue completo com 50 yL de Triton X-100 a 2,5 %. Analisou-se a concentração de interleucina-8 (IL-8) nos lisados purificados por meio de ELISA (estojo de ELISA para IL-8 e quanticina, R&D Systems) de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações de IL-8 nas amostras tratadas com AB7 e Kineret® foram comparadas com uma amostra de controlo tratada com controlo anti-KLH. Os resultados estão descritos na fig. 18 e resumidos no quadro 6. A CI50 é a concentração de anticorpo necessária para inibir 50 % da IL-8 libertada por estimulação de IL-Ιβ.

Quadro 6

CI50 (PM) AB7 1, 9 pM Kineret® 53,4 pM

Estes resultados demonstram a potência de AB7 in vitro conforme medida por inibição da libertação de IL-8 estimulada por IL-Ιβ. Estes resultados mostram uma potência maior 138 comparada com Kineret® que indicam que os anticorpos da presente invenção terão uma eficácia inibidora de IL-Ιβ in vi vo. EXEMPLO 13

Este exemplo ilustra que os anticorpos da presente invenção têm uma afinidade surpreendentemente elevada em comparação com um anticorpo que tem uma sequência semelhante.

Comprou-se AB5 com o controlo AB em termos da sequência e a afinidade de ligação. 0 AB5 compreende a região variável de cadeia pesada ilustrada na SEQ ID N°. 8 e a região variável de cadeia leve ilustrada na SEQ ID N°. 9. Crê-se que o controlo AB compreende a região variável de cadeia pesada ilustrada na SEQ ID N°. 38 e a região variável de cadeia leve ilustrada na SEQ ID N°. 39. Essas sequências, estão ilustradas na publicação do pedido de patente norte-americana N°. 2003/0026806, nas figuras 6A e 6B. Ο AB5 e o controlo AB têm as mesmas regiões de determinação de complementaridade nas suas regiões variáveis de cadeia pesada e leve. As suas cadeias pesadas diferem por três resíduos de aminoácidos na região estrutural 3, localizados nas posições 68, 74 e 86 das SEQ ID N°s. 8 e 38. As suas respectivas cadeias leves diferem de um residuo de aminoácido da região estrutural 3, localizado na posição 72 das SEQ ID N°s. 9 e 39. Apesar das semelhanças das sequências das suas regiões variáveis de cadeia pesada e leve, incluindo as mesmas RDC, AB5 e o controlo AB diferem significativamente e inesperadamente na sua afinidade de ligação. Tal como discutido nos exemplos 1 e 5 anteriores, verificou-se que AB5 tem uma constante de dissociação inferior a 0,3 pM (com uma KD baixa de 0,11 pM e uma KD elevada de 0,56 pM) e verificou-se que o controlo AB tinha uma constante de dissociação de 3 pM (com uma KD baixa 139 de 1,62 pM e uma KD elevada de 5,23 pM) . Dadas as semelhanças na sequência de aminoácidos, é surpreendente que AB5 tenha uma afinidade maior de uma ordem de grandeza.

Gerou-se AB7 utilizando a tecnologia HUMAN ENGINEERING™, conforme descrito no exemplo 4. As regiões variáveis de cadeia leve e pesada de AB7 incluem posições de risco baixo e moderado nas sequências de regiões variáveis de cadeia leve e pesada de AB5. AB7 compreende a região variável de cadeia pesada ilustrada na SEQ ID N°. 15 e a região variável de cadeia leve ilustrada na SEQ ID N°. 11.

Comparou-se AB7 com o controlo AB e AB5 em termos da sequência e da afinidade da ligação. AB7 e o controlo AB7 têm as mesmas regiões de determinação de complementaridade nas suas regiões variáveis de cadeia pesada e leve. As suas cadeias pesadas diferem em duas das três posições da região estrutural 3 (posições 74 e 86 nas SEQ ID N°s. 15 e 38) em que AB5 difere do controlo AB; contudo, na posição 68 na SEQ ID N°. 15, AB7 tem o mesmo aminoácido que o controlo AB. Na cadeia pesada de AB7, na posição 72 da SEQ ID N°. 11, difere tanto do controlo AB como de AB5. AB7 inclui várias outras diferenças nas regiões variáveis de cadeia leve e pesada quando comparado com o controlo AB e AB5 em virtude do processo HUMAN ENGINEERING™. Apesar da inclusão das alterações em posições de risco moderado e particularmente tendo em vista as alterações em AB7 comparadas com AB5 nas posições 68 na região variável de cadeia pesada e na posição 72 na região variável de cadeia leve, AB7 e AB5 têm constantes de dissociação semelhantes e AB7 difere significativamente e inesperadamente do controlo AB no que respeita à afinidade de ligação. Tal como discutido no exemplo 5 anterior, verificou-se que AB7 tem uma constante de dissociação de 0,3 pM (com uma KD baixa de 0,11 pM e uma KD 140 elevada de 0,74 pM) . Verificou-se que AB5 tem uma constante de dissociação de 0,24 pM (com uma KD baixa de 0,07 pM e uma KD elevada de 0,72 pM). Dadas as alterações feitas nas posições de risco moderado e as semelhanças globais na sequência de aminoácidos, particularmente nas RDC, é surpreendente que AB7 tenha uma afinidade semelhante a AB5 e uma afinidade maior do que o controlo AB, de uma ordem de grandeza. EXEMPLO 14

Este exemplo mostra que pelo menos um anticorpo da presente invenção se liga a um epitopo IL-Ιβ, de tal maneira que o anticorpo ligado não evita praticamente que IL-Ιβ ligado ao anticorpo se ligue ao receptor de IL-1 do tipo I. Este exemplo utiliza um instrumento de análise cinética Biacore® para examinar se a ligação de IL-Ιβ a um dos anticorpos da presente invenção (AB7) pode ainda ligar-se ao receptor de IL-1 do tipo I.

Para este exemplo, imobilizou-se AB7 na superfície de um chip sensor CM-5 num instrumento Biacore, tal como se segue. Utilizando como tampão da operação HBS-EP (Biacore®, Inc.), fixou-se a temperatura em 25 °C, fixou-se a velocidade do fluxo em 10 pL/min e o caminho do fluxo foi dirigido de tal maneira que fluísse apenas na célula 2. Misturou-se 135 pL de cada uma das soluções de NHS e ECD (Biacore®, Inc.) e injectou-se, imediatamente, no trajecto do fluxo, 70 pL da solução de NHS/ECD. Depois injectou-se 91 pL de uma solução

de AB7 (~20 pg/mL em tampão de acetato de sódio a 10 mM 141 (Biacore®, Inc.)), seguido de 70 pL de etanolamina 1 M (Biacore®, Inc.)· Imobilizou-se assim aproximadamente 5.650 UR de AB7. Para preparar uma superfície de referência, alterou-se o trajecto do fluxo para fluir apenas na célula 1. Misturou-se 135 pL de cada uma das soluções de NHS e ECD (Biacore®, Inc.) e injectou-se imediatamente 70 pL da solução de NHS/ECD no trajecto do fluxo, seguido de 70 pL de etanolamina 1 M (Biacore®, Inc.). O instrumento Biacore® estava então pronto para analisar se a ligação de IL-Ιβ a AB7 se manteria para o receptor de IL-1 do tipo I. Para esta análise, utilizou-se receptor de IL-1 do tipo I (IL-1 sRI) solúvel e analisou-se a ligação de IL-1 sRI a um complexo de AB7/IL-1P, tal como se segue. Diluiu-se, separadamente, IL-1 sRI (RnDSystems cat#269-lR-100/CF) e IL-Ιβ (Peprotech, cat#200-01B) para 10 ug/mL em HBS-EP. Fixou-se a velocidade o fluxo em 10 pL/min. Fixou-se o trajecto do fluxo para o instrumento Biacore® de modo a fluir pelas células 1 e 2 e utilizou-se a subtracção de referência da célula do fluxo 2 menos a célula do fluxo 1 para determinar uma resposta diferencial. A fig. 19 mostra a resposta diferencial medida a partir do instrumento Biacore® durante a análise. A fig. 20 ilustra as etapas utilizadas na análise, indicando as adições separadas à célula do fluxo de (A) IL-1 sRI, (B) IL-Ιβ e (C) IL-1 sRI, por esta ordem.

Aos 200 segundos, injectou-se 20 pL de sRI de IL-1 para verificar a ausência de ligação directamente ao AB7 imobilizado (injecção A nas figs. 19 e 20). Tal como se mostra na fig. 19, IL-1 sRI não aumentou as unidades de resposta, o que indica que sRI de IL-1 não se ligou directamente ao AB7 imobilizado. 142

Aos 600 segundos, ligou-se aproximadamente 1.000 UR de IL-Ιβ, por meio de AB7, formando um complexo de ΑΒ7/ΙΙι-1β na superfície do chip (injecção B nas figs. 19 e 20) . O aumento nas unidades de resposta indica que a ligação de IL-Ιβ ao AB7 imobilizado. Em seguida, injectou-se 20 yL de IL-1 sRI, a 1.200 segundos para analisar a ligação de IL-1 sRI ao complexo de AB7 e IL-Ιβ. Aproximadamente 1.500 UR de IL-1 sRI ligaram-se ao complexo de ΑΒ7/ΙΕ-1β (injecção C nas figs. 19 e 20). Este aumento nas unidades de resposta indica que IL-1 sRI se ligou ao complexo de ΙΕ-1β/ΑΒ7.

Este exemplo indica que sRI de IL-1 se liga a IL-Ιβ mas não se liga a AB7 e que AB7 se liga ao epítopo de IL-Ιβ de tal maneira que ο AB7 ligado praticamente não evita a ligação de IL-Ιβ a sRI de IL-1. A utilização dos termos "um" e "uma" e "o" e referências similares, no contexto da descrição da presente invenção (especialmente no contexto das reivindicações que se seguem), são utilizados para cobrir tanto o singular como o plural salvo indicação em contrário ou quando isso é claramente contradito pelo contexto. Os termos "compreendendo", "tendo", "incluindo" e "contendo" são dados como termos de finalidade aberta (isto é, significa "incluindo, mas não se limitando a") salvo indicação em contrário. Seja qual for o caso em que se utiliza o termo de finalidade aberta para descrever uma caracteristica ou um elemento da presente invenção, está especificamente contemplado que um termo de finalidade fechada pode ser utilizado em vez do termo de finalidade aberta sem sair do âmbito da presente invenção. A citação de intervalos de valor entende-se aqui meramente como servindo como um processo expedito para referir individualmente cada valor em separado, que cai dentro do intervalo, salvo indicação em contrário e que cada valor separado está 143 incorporado na especificação, tal como se fosse citado aqui individualmente. Todos os processos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem apropriada, salvo indicação em contrário, dada aqui ou quando isso é claramente contrariado pelo contexto. A utilização de qualquer um ou de todos os exemplos e da linquaqem dos exemplos (por exemplo, "tal como") dados aqui, entende-se meramente que servem para melhor ilustrar a presente invenção e não põem nenhum limite ao âmbito da presente invenção, salvo se for reivindicado de outra forma. Não se utiliza nenhuma linquaqem na especificação que indique qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da presente invenção.

As modalidades preferidas da presente invenção estão aqui descritas, incluindo a melhor prática conhecida dos requerentes para realizar a presente invenção. As variações das modalidades preferidas podem tornar-se evidentes para os que trabalham nesta técnica após a leitura da descrição anterior. Os requerentes esperam que técnicos na matéria utilizem essas variações como apropriadas e os requerentes pretendem que a invenção seja praticada mesmo de uma forma diferente da que foi aqui especificamente descrita. De acordo com isto, a presente invenção inclui todas as modificações e equivalentes da matéria de facto citada nas reivindicações em anexo, como é permitido pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos descritos antes, em todas as suas variações possíveis, está englobada pela presente invenção, salvo indicação aqui em contrário ou salvo o caso de ser claramente contradito pelo contexto.

Algumas modalidades da presente invenção dizem respeito a: 144 1. Um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um seu fragmento de ligação a IL-Ιβ, que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 28. 2. 0 anticorpo ou o fragmento de anticorpo de acordo com o item 1., em que o referido anticorpo ou o fragmento compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 2, SEQ ID N°. 23 ou SEQ ID N°. 24. 3. Um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um seu fragmento de ligação a IL-Ιβ, em que o referido anticorpo ou o fragmento se ligam a IL-Ιβ humana com uma constante de dissociação de cerca de 1 pM ou menos. 4. 0 anticorpo ou o fragmento de anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1.-3., em que o referido anticorpo ou o fragmento se liga a IL-Ιβ humana com uma constante de dissociação de cerca de 0,3 pM ou menos. 5. O anticorpo ou o fragmento de anticorpo de acordo com os itens 1.-3., em que o referido anticorpo ou o fragmento se liga a IL-Ιβ humana com uma constante de dissociação de cerca de 0,24 pM. 6. O anticorpo ou o fragmento de anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1.-3., em que o referido anticorpo ou o fragmento se liga a IL-Ιβ humana com uma constante de dissociação de cerca de 0,11 pM. 7. Um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um seu fragmento de ligação a IL-Ιβ, em que o anticorpo ou o fragmento se ligam a um epítopo de IL-Ιβ de tal modo que o anticorpo ou o fragmento ligados permitem praticamente a ligação IL-Ιβ ao receptor de IL-1 (IL-1RI) e o anticorpo ou 145 fragmento se ligam a IL-Ιβ humana com uma constante de dissociação inferior a 1 pM. 8. Um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um seu fragmento de ligação a IL-Ιβ, em que o anticorpo ou o fragmento se ligam a IL-Ιβ humana com uma constante de dissociação inferior a 1 pM e o anticorpo ou o fragmento se ligam praticamente ao mesmo epitopo que um anticorpo com a região variável de cadeia leve da SEQ ID N°. 11 e com a região variável de cadeia pesada da SEQ ID N°. 15 também se liga. 9. Um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um seu fragmento de ligação a IL-Ιβ, em que o anticorpo ou o fragmento se ligam a IL-Ιβ humana com uma constante de dissociação inferior a 1 pM e o anticorpo ou o fragmento concorrem com a ligação de um anticorpo tendo a região variável de cadeia leva da SEQ ID N°. 11 e a região variável de cadeia pesada da SEQ ID N°. 15. 10. O anticorpo ou fragmento de acordo com o item 8., em que o anticorpo ou o fragmento se ligam a um epitopo contido na sequência BSVDPKNYPKKKMBKRFVFNKIE (SEQ ID N°. 36) . 11. O anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens 1.-9., em que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo é humanizado ou humano tratado por engenharia genética. 12. O anticorpo ou o fragmento de anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1.-9., em que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo é humano. 146 13. 0 anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens 1.-12., em que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo é um anticorpo de neutralização. 14. 0 anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens 1.-13., em que o anticorpo ou os fragmentos de anticorpos compreendem uma cadeia leve lambda. 15. 0 anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens 1.-13., em que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo compreende uma região de IgG2. 16. 0 anticorpo ou o fragmento de anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1.-13., em que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo é um Fab, um F(ab')2, um Fv, uma fragmento de cadeia simples de anticorpo ou uma variante ou um derivado de qualquer um destes anticorpos ou fragmentos. 17. 0 anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens 1.-13., em que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo é um anticorpo multiespecifico, um diacorpo, um triacorpo, a tetracorpo, um minicorpo, um anticorpo linear, um anticorpo recombinante de quelação, um tricorpo, um bicorpo, um intracorpo, um nanocorpo, um produto imunofarmacêutico modular pequeno (SMIP), uma proteína de fusão do domínio da imunoglobulina ligada, um anticorpo camelizado, um anticorpo contendo VPP ou uma variante ou derivado de qualquer um destes anticorpos ou fragmentos. 18. 0 anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens 1.-17., em que o anticorpo ou o 147 fragmento compreende uma região variável de cadeia leve, que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 27. 19. 0 anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens 1.-17., em que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada, que compreende uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID N°s. 8, 14 e 15 e uma região variável de cadeia leve, que compreende uma das sequências de aminoácidos da SEQ ID N°s. 9, 10 e 11. 20. O anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens 1.-17., em que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo compreendem uma região variável de cadeia pesada, que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 8 e uma região variável de cadeia leve, que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 9. 21. O anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens 1.-17., em que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada, que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 15 e uma região variável de cadeia leve, que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 11. 22. O anticorpo ou o fragmento de anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1.-17., em que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada, que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 14 e uma região variável de cadeia leve, que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 10 . 148 23. 0 anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com o item 1. ou 2., em que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo têm uma constante de dissociação inferior a 3 pM. 24. 0 anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com o item 1. ou 2., em que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo têm uma constante de dissociação de cerca de 2 pM ou menos. 25. Um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um seu fragmento de ligação a IL-Ιβ, em que o anticorpo ou os fragmentos de anticorpos (i) têm uma CI5o de cerca de 0,5 nM ou menos para inibir a libertação de IL-6 de fibroblastos humanos, estimulada por IL-Ιβ, (ii) liga-se a IL-Ιβ com uma constante de dissociação de cerca de 1 pM ou menos e (iii) inibe a expressão de IL-6 no soro produzida por IL-Ιβ num animal de, pelo menos, 50 %, quando o anticorpo ou o fragmento de anticorpo é administrado ao animal numa quantidade eficaz quando comparada com o nivel de IL-6 no soro num animal estimulado por IL-Ιβ a que não tenha sido administrado um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. 26. Um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um seu fragmento de ligação a IL-Ιβ, em que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo se ligam a IL-Ιβ humana com uma constante de dissociação entre cerca de 6 pM e cerca de 50 pM e em que o anticorpo tem uma CI50 para a inibição da libertação de IL-6 de fibroblastos humanos, estimulada por IL-Ιβ, entre cerca de 5 pM e cerca de 200 pM. 27. O anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com o item 2 6., em que o anticorpo ou o fragmento de 149 anticorpo se liga a uma IL-Ιβ humana com uma constante de dissociação entre cerca de 13 pM e cerca de 25 pM. 28. 0 anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com os itens 26.-27., em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° . 4. 29. 0 anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com os itens 26.-28., em que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo compreendem uma região variável de cadeia leve, que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° . 9. 30. O anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens 1.-28., em que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo não se ligam a IL-Ια de forma detectável. 31. O anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens 1.-30., em que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo não reticulam com um alvo diferente de IL-Ιβ. 32. O anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens 1.-31., em que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo não se ligam a IL-Ιβ de roedor, IL-Ιβ de primata, IL-Ιβ de cão e IL-Ιβ de coelho. 33. O anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens 1.-31., em que o anticorpo ou o fragmento se liga a IL-Ιβ de murganho com uma afinidade mais elevada do que a de IL-Ιβ de rato. 150 34. 0 anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens 1.-33., em que o anticorpo ou o fragmento não se ligam a IL-Ιβ de porquinho-da-índia. 35. Um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um seu fragmento de ligação a IL-Ιβ, em que o anticorpo ou o fragmento compreende uma ou mais substituições, eliminações ou adições à sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 28 e o anticorpo ou o fragmento têm a mesma ou praticamente a mesma afinidade e especificidade do epitopo de ligação que a referida sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°. 28. 36. Um anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um seu fragmento de ligação a IL-Ιβ, em que o anticorpo ou o fragmento compreendem uma ou mais substituições, eliminações ou adições à sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 27 e o anticorpo ou o fragmento têm a mesma ou praticamente a mesma afinidade e especificidade do epitopo de ligação que a referida sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°. 27. 37. Um ácido nucleico que codifica o anticorpo ou o fragmento de anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1.-35. 38. 0 ácido nucleico de acordo com o item 37., em que o ácido nucleico compreende a sequência da SEQ ID N°. 38. 39. 0 ácido nucleico, de acordo com o item 37., em que o ácido nucleico compreende a sequência da SEQ ID N°. 39. 40. Um ácido nucleico que compõe uma sequência de ácidos nucleicos que codificam uma região variável de 151 cadeia pesada de um anticorpo, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 28. 41. A sequência de ácidos nucleicos, de acordo com o item 40., em que o ácido nucleico codifica uma região variável de cadeia pesada, que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 2, 23 ou 24. 42. Um ácido nucleico, que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma região variável de cadeia leve de um anticorpo, em que a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° . 27 . 43. Um vector, que compreende o ácido nucleico de acordo com qualquer um dos itens 37.- 41. 44. Uma célula, que compreende o ácido nucleico de acordo com qualquer um dos itens 37. .-41. ou o vector de acordo com o item 42. 45. A célula de acordo com o item 44., em que a célula é uma célula estaminal embrionária de um ovo fertilizado. 46. Um animal transgénico, que compreende a célula de acordo com o item 44. ou o item 45. 47. Um hibridoma que produz o anticorpo ou o fragmento de anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1.-34. 48. Uma composição, que compreende (a) o anticorpo ou o fragmento de anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1.-34., o ácido nucleico de acordo com qualquer um 152 dos itens 37.-41. ou o vector de acordo com o item 42. e (b) um seu veiculo. 49. A composição, de acordo com o item 48., em que o veiculo é um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. 50. A composição, de acordo com o item 49., em que a composição é uma forma apropriada para administração intra-articular, subcutânea, intravenosa, intra-peritonial, intracerebral (intraparenquimal), intra-cerebroventricular, intramuscular, intraocular, intra-arterial, intralesional, oral ou para administração por inalação. 51. A composição, de acordo com o item 49., em que a composição compreende um lioprotector, um tensioactivo, uma carga, um ligante e/ou um agente de aumento de volume. 52. A composição, de acordo com o item 4 9., em que a composição é uma composição farmacêutica de libertação controlada ou de libertação sustentada. 53. Um processo de tratamento ou de prevenção de uma doença ou de um estado clinico relacionado com IL-1, num mamífero, que compreende a administração de uma quantidade eficaz de (a) o anticorpo ou o fragmento de anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1.-34., (b) o ácido nucleico de acordo com qualquer um dos itens 37.-41., (c) o vector de 42. ou (d) a composição de acordo com 48.-54., a um mamífero que dela necessite, por meio da qual se trata uma doença ou se previne uma doença num mamífero. 153 54. 0 processo de acordo com 53., em que a doença ou o estado clínico relacionados com IL-1 é uma doença inflamatória, uma doença auto-imune ou um cancro. 55. 0 processo, de acordo com 53. ou 54., em que a doença ou o estado clínico relacionado com IL-1 se selecciona entre artrite reumatóide, osteoartrite, doença de Crohn, colite ulcerosa, choque séptico, doença pulmonar obstrutiva crónica, asma, doença do hospedeiro versus enxerto, aterosclerose, leucemia das células T do adulto, mieloma múltiplo, esclerose múltipla, acidente vascular ou doença de Alzheimer. 56. 0 processo, de acordo com qualquer um dos itens 53.-55., em que a doença ou o estado clínico relacionado com IL-1 é uma doença inflamatória multi-sistémica com origem neonatal (NOMID/CINCA), uma artrite idiopática juvenil de iniciação sistémica, síndromes periódicas associados a CIAS1 (CAPS), doença de Stills ou síndrome de Muckle-Wells. 57. 0 processo, de acordo com qualquer um dos itens 53.-56., em que a doença ou o estado clínico relacionads com IL-1 é a artrite idiopática juvenil de iniciação sistémica, artrite reumatóide, osteoartrite, aterosclerose ou miastenia grave. 58. 0 processo, de acordo com qualquer um dos itens 53.-56., em que o mamífero é um ser humano. 5 9. 0 processo, de acordo com qualquer um dos itens 54.-58., em que uma quantidade eficaz do anticorpo ou do fragmento de anticorpo é eficaz para inibir a expressão 154 de IL-6 no soro de um animal, induzida por IL-Ιβ, da ordem de pelo menos 50 %, quando comparado com o nivel de IL-6 no soro na ausência do anticorpo. 60. Um processo de preparação de um polipéptido de ligação a IL-Ιβ maturada por afinidade, que compreende: (a) providenciar um primeiro ácido nucleico que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipéptido de ligação a IL-Ιβ, que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 22 e um segundo ácido nucleico, que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que difere da primeira sequência de ácidos nucleicos por pelo menos um nucleótido, (b) realizar o arrastamento do ácido nucleico para providenciar dois ou mais ácidos nucleicos mutados, (c) seleccionar um ácido nucleico mutado que codifica um polipéptido que ou (i) se liga a IL-Ιβ com uma afinidade maior do que o polipéptido codificado pelo primeiro ácido nucleico, (ii) tem uma selectividade para IL-Ιβ superior a IL-Ια que é maior do que a do polipéptido codificado pelo primeiro ácido nucleico, (iii) tem uma constante de dissociação da ligação de equilíbrio para IL-Ιβ que é inferior à do polipéptido codificado pelo primeiro ácido nucleico ou (iv) inibe a expressão de IL-6 no soro de um animal induzida por IL-Ιβ num grau maior do que o polipéptido codificado pelo primeiro ácido nucleico e (d) expressa o ácido nucleico mutado seleccionado, por meio do qual se produz um polipéptido de IL-Ιβ maturado por afinidade. 155 de acordo com o item 60., que 61. O processo, compreende ainda providenciar um anticorpo que contém o polipéptido codificado pelos ácidos nucleicos mutados antes da selecção do ácido nucleico mutado, em que a selecção do ácido nucleico mutado é realizada por análise do anticorpo. 62. O processo, de acordo como item 60. ou 61., em que se repetem as etapas (b) e (c) , em que o arrastamento do ácido nucleico da etapa (b) é realizado utilizando (i) pelo menos um ácido nucleico mutado seleccionado na etapa (c) e (ii) pelo menos um ácido nucleico com uma sequência de ácidos nucleicos que difere da dos ácidos nucleicos mutados seleccionados por pelo menos um nucleótido. 63. O processo, de acordo com qualquer um dos itens 60.-62., em que se repetem as etapas (b) e (c) até se selecionar, de forma optimizada, um ácido nucleico. 64. O processo, de acordo com qualquer um dos itens 60.-63., em que o primeiro ácido nucleico codifica um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID N°s. 1-26. 65. O processo, de acordo com qualquer um dos itens 60.-64., em que o primeiro ácido nucleico codifica um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID N°s. 27-35 ou 42-57. 66. O processo, de acordo com qualquer um dos itens 60.-65., em que se repetem as etapas (b) e (c) até se seleccionar um ácido nucleico que codifica um polipéptido que (i) tem uma CI5o de cerca de 0,5 nM ou menos para a 156 inibição da libertação de IL-6 dos fibroblastos humanos estimulada por IL-Ιβ, (ii) se liga a IL-Ιβ com uma constante de dissociação para IL-Ιβ inferior a 3 pM, e (iii) inibe a expressão de IL-6 no soro de um animal, induzida por IL-Ιβ, de pelo menos 50 %, quando comparado com o nivel de IL-6 no soro de um animal, estimulada por IL-Ιβ, que não tenha sido administrado a um anticorpo ou a um fragmento.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> XOMA Technology Ltd.

<120> ANTICORPOS DE LIGAÇÃO A IL-Ιβ E OS SEUS FRAGMENTOS <130> 17646WO02 <160> 57 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 107

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sintético <22 0>

<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (7) . . (7) <223> "Xaa" representa Tre ou Ser 157 <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (15)..(15) <223> "Xaa" representa Leu ou Vai <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (22)..(22) <223> "Xaa" representa Tre ou Ser <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (41)..(41) <223> "Xaa" representa Asp ou Gli <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (42)..(42) <223> "Xaa" representa Gli ou Lis <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (43)..(43) <223> "Xaa" representa Tre ou Ala <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (72) . . (72) <223> "Xaa" representa Tre ou Ser <4 0 0> 1

Gli

Asp Ile Gin Met Tre Gin Xaa Tre Ser Ser Leu Ser Ala Ser Xaa 15 10 15 158

Asp Arg Vai Tre 20 Ile Xaa Cis Arg Leu Ser Trp 35 Tir Gin Gin Lis Pro 40 Tir Tir 50 Tre Ser Lis Leu His 55 Ser Ser 65 Gli Ser Gli Tre Asp 70 Tir Xaa Glu Asp Ile Ala Tre 85 Tir Fen Cis Tre Fen Gli Gli 100 Gli Tre Lis Leu

Ala 25 Ser Gin Asp Ile Ser 30 Asn Tir Xaa Xaa Xaa Vai Lis 45 Leu Leu Ile Gli Vai Pro Ser 60 Arg Fen Ser Gli Leu Tre Ile 75 Ser Asn Leu Glu Gin 80 Leu Gin 90 Gli Lis Met Leu Pro 95 Trp Glu 105 Ile Lis <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sintético <22 0> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS (3) . . (3) "Xaa" representa Tre ou Gin CARACTERÍSTICAS DIVERSAS (5) . . (5) "Xaa" representa Lis ou Gin CARACTERÍSTICAS DIVERSAS (11) · · dl) "Xaa" representa Ile ou Leu <221> <222> <223> <22 0> <221> <222> <223> <22 0> <221> <222> <223> <22 0>

<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (12)..(12) 159 <223> "Xaa" representa Leu ou Vai <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (67) . . (67) <223> "Xaa" representa Tre ou Ser <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (68) . . (68) <223> "Xaa" representa Gin ou Arg <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (77) . . (77) <223> "Xaa" representa Arg ou Lis <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (81) . . (81) <223> "Xaa" representa Fen ou Ser <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (88) .. (88) <223> "Xaa" representa Asp ou Tre <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (89) . . (89) <223> "Xaa" representa Tre ou Ala <22 0>

<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS 160 <222> (90)..(90) <223> "Xaa" representa Vai ou Ala <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (94) .. (94) <223> "Xaa" representa Tre ou Vai <220> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (100)..(100) <223> "Xaa" representa Ala, Vai, Fen, Lis ou Asn <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (101)..(101) <223> "Xaa" representa Arg ou Lis <400> 2

Gin Vai Xaa Leu Xaa Glu Ser Gli Pro Gli Xaa Xaa Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Xaa Xaa Leu Tre Ile Ser Lis Asp Tre Ser Xaa Asn Gin Vai 65 70 75 80 Xaa Leu Lis Ile Tre Ser Vai Xaa Xaa Xaa Asp Tre Ala Xaa Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Xaa Xaa Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120

<210> 3 <211> 10 <212> PRT 161 <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <22 0>

<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (1)..(1) <223> "Xaa" representa Ala, Vai, Fen, Lis ou Asn <22 0>

<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (2)..(2) <223> "Xaa" representa Arg ou Lis <400> 3

Xaa Xaa Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp 15 10 <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 4

Gin Vai Tre Leu Lis Glu Ser Gli Pro Gli Ile Leu Lis Pro Ser 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu

Gin

Ser

Glu 35 40 45 162

Trp Leu 50 Ala His Ile Trp Trp 55 Asp Leu 65 Lis Tre Gin Leu Tre 70 Ile Ser Fen Leu Lis Ile Tre 85 Ser Vai Asp Cis Ala Arg Ala 100 Arg Tir Asp Pro Gli Tre Leu 115 Vai Tre Vai Ser Ser 120

Gli Asp Glu Ser 60 Tir Asn Pro Ser Lis Asp Tre 75 Ser Arg Asn Gin Vai 80 Tre Vai 90 Asp Tre Ala Tre Tir 95 Fen Pro 105 Trp Fen Vai Asp Trp 110 Gli Gin <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 5

Gin Vai Tre Leu Lis Glu Ser Gli Pro Gli Ile Leu Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Tre Gin Leu Tre Ile Ser Lis Asp Tre Ser Arg Asn Gin Vai 65 70 75 80 Fen Leu Lis Ile Tre Ser Vai Asp Tre Vai Asp Tre Ala Tre Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Vai Arg Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 <210> 6 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial 163 <220> <223> Sintético <400> 6

Gin Vai Tre Leu Lis Glu Ser Gli Pro Gli Ile Leu Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Tre Gin Leu Tre Ile Ser Lis Asp Tre Ser Arg Asn Gin Vai 65 70 75 80 Fen Leu Lis Ile Tre Ser Vai Asp Tre Vai Asp Tre Ala Tre Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Fen Arg Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sintético <400> 7

Gin Vai Tre Leu Lis Glu Ser Gli Pro Gli Ile Leu Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Tre Gin Leu Tre Ile Ser Lis Asp Tre Ser Arg Asn Gin Vai 65 70 75 80 Fen Leu Lis Ile Tre Ser Vai Asp Tre Vai Asp Tre Ala Tre Tir Fen 164 85 90 95

Cis Ala Arg Lis 100 Lis Tir Asp Pro Pro 105 Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 110 Gli Tre Leu 115 Vai Tre Vai Ser Ser 120 <2 1 0> 8 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 8

Gin Vai Tre Leu Lis Glu Ser Gli Pro Gli Ile Leu Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Tre Gin Leu Tre Ile Ser Lis Asp Tre Ser Arg Asn Gin Vai 65 70 75 80 Fen Leu Lis Ile Tre Ser Vai Asp Tre Vai Asp Tre Ala Tre Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Asn Arg Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético 165 <4 Ο Ο> 9

Asp Ile Gin Met Tre Gin Tre Tre 1 5 Asp Arg Vai Tre Ile Ser Cis Arg 20 Leu Ser Trp Tir Gin Gin Lis Pro 35 40 Tir Tir Tre Ser Lis Leu His Ser 50 55 Ser Gli Ser Gli Tre Asp Tir Ser 65 70 Glu Asp Ile Ala Tre Tir Fen Cis 85 Tre Fen Gli Gli Gli Tre Lis Leu 100

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gli 10 15 Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tir 25 30 Asp Gli Tre Vai Lis Leu Leu Ile 45 Gli Vai Pro Ser Arg Fen Ser Gli 60 Leu Tre Ile Ser Asa Leu Glu Gin 75 80 Leu Gin Gli Lis Met Leu Pro Trp 90 95 Glu Ile Lis 105 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 10

Asp 1 Ile Gin Met Tre 5 Gin Ser Tre Asp Arg Vai Tre 20 Ile Tre Cis Arg Leu Ser Trp 35 Tir Gin Gin Lis Pro 40 Tir Tir 50 Tre Ser Lis Leu His 55 Ser Ser 65 Gli Ser Gli Tre Asp 70 Tir Tre Glu Asp Fen Ala Tre 85 Tir Fen Cis Tre Fen Gli Gin 100 Gli Tre Lis Leu

Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Leu 15 Gli Ala 25 Ser Gin Asp Ile Ser 30 Asn Tir Gli Lis Tre Vai Lis 45 Leu Leu Ile Gli Vai Pro Ser 60 Arg Fen Ser Gli Leu Tre Ile 75 Ser Ser Leu Gin Gin 80 Leu Gin 90 Gli Lis Met Leu Pro 95 Trp Glu 105 Ile Lis <210> 11 <211> 107 166

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 11

Asp Ile Gin Met Tre Gin Ser Tre Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gli 1 5 10 15 Asp Arg Vai Tre Ile Tre Cis Arg Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tir 20 25 30 Leu Ser Trp Tir Gin Gin Lis Pro Gli Lis Ala Vai Lis Leu Leu Ile 35 40 45 Tir Tir Tre Ser Lis Leu His Ser Gli Vai Pro Ser Arg Fen Ser Gli 50 55 60 Ser Gli Ser Gli Tre Asp Tir Tre Leu Tre Ile Ser Ser Leu Gin Gin 65 70 75 80 Glu Asp Fen Ala Tre Tir Fen Cis Leu Gin Gli Lis Met Leu Pro Trp 85 90 95 Tre Fen Gli Gin Gli Tre Lis Leu Glu Ile Lis 100 105 <210> 12 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <22 0>

<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (100)..(100) <223> "Xaa" representa Ala, Vai, Fen, Lis ou Asn <22 0>

<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (101)..(101) 167 <223> "Xaa" representa Arg ou Lis <4 0 0> 12

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro Gli Leu Leu Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Ser Gin Leu Tre Ile Ser Lis Asp Tre Ser Lis Asn Gin Vai 65 70 75 80 Ser Leu Lis Ile Tre Ser Vai Tre Ala Ala Asp Tre Ala Tre Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Xaa Xaa Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (100)..(100) <223> "Xaa" representa Ala, Vai, Fen, Lis ou Asn <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (101)..(101) <223> "Xaa" representa Arg ou Lis <4 0 0> 13 168

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro Gli Leu Vai Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Ser Arg Leu Tre Ile Ser Lis Asp Tre Ser Lis Asn Gin Vai 65 70 75 80 Ser Leu Lis Ile Tre Ser Vai Tre Ala Ala Asp Tre Ala Vai Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Xaa Xaa Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 14

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro Gli Leu Leu Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Ser Gin Leu Tre Ile Ser Lis Asp Tre Ser Lis Asn Gin Vai 65 70 75 80 Ser Leu Lis Ile Tre Ser Vai Tre Ala Ala Asp Tre Ala Tre Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Asn Arg Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 169 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 15

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli 1 5 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen 20 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg 35 40 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp 50 55 Leu Lis Ser Arg Leu Tre Ile Ser 65 70 Ser Leu Lis Ile Tre Ser Vai Tre 85 Cis Ala Arg Asn Arg Tir Asp Pro 100 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120

Pro Gli 10 Leu Vai Lis Pro Ser 15 Gin Ser 25 Gli Fen Ser Leu Ser 30 Tre Ser Gin Pro Ser Gli Lis 45 Gli Leu Glu Gli Asp Glu Ser 60 Tir Asn Pro Ser Lis Asp Tre 75 Ser Lis Asn Gin Vai 80 Ala Ala 90 Asp Tre Ala Vai Tir 95 Fen Pro 105 Trp Fen Vai Asp Trp 110 Gli Gin <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 16

Trp Fen Vai Asp 10

Ala Arg Tir Asp Pro Pro 1 5 170

<210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> Sintético <4 0 0> 17 Val Arg Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp 15 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 18 Fen Arg Tir Asp Pro Pro Trp Fen Val Asp 15 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <4 Ο 0> 19 171

Lis Lis Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp 15 10 <210> 20 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 20 Asn Arg Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp 15 10 <210> 21 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (100) . . (100) <223> "Xaa" representa Ala, Vai, Fen, Lis ou Asn <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (101) . . (101) <223> "Xaa" representa Arg ou Lis <4 0 0> 21 172

Gin Vai Tre Leu Lis Glu Ser Gli Pro Gli Ile Leu Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Tre Gin Leu Tre Ile Ser Lis Asp Tre Ser Arg Asn Gin Vai 65 70 75 80 Fen Leu Lis Ile Tre Ser Vai Asp Tre Vai Asp Tre Ala Tre Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Xaa Xaa Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 22

Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp 1 5 <210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <22 0>

<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (100)..(100) 173 <223> "Xaa" representa Ala, Vai, Fen, Lis ou Asn <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (101)..(101) <223> "Xaa" representa Arg ou Lis <400> 23

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro Gli Leu Leu Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Ser Gin Leu Tre Ile Ser Lis Asn Tre Ser Lis Asn Gin Vai 65 70 75 80 Ser Leu Lis Ile Tre Ser Vai Tre Ala Ala Asp Tre Ala Tre Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Xaa Xaa Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (100)..(100) <223> "Xaa" representa Ala, Vai, Fen, Lis ou Asn <22 0> 174

<221> CARACTERISTICAS DIVERSAS <222> (101)..(101)

Lis <223> "Xaa" representa Arg ou <400> 24

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli 1 5 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen 20 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg 35 40 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp 50 55 Leu Lis Ser Arg Leu Tre Ile Ser 65 70 Ser Leu Lis Ile Tre Ser Vai Tre 85 Cis Ala Arg Xaa Xaa Tir Asp Pro 100 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120

Pro Gli Leu Vai Lis Pro Ser Gin 10 15 Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 25 30 Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 45 Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 60 Lis Asn Tre Ser Lis Asn Gin Vai 75 80 Ala Ala Asp Tre Ala Vai Tir Fen 90 95 Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 105 110 <210> <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 25

Gin 1 Vai Gin Leu Gin 5 Glu Ser Gli Tre Leu Ser Leu 20 Tre Cis Ser Fen Gli Met Gli 35 Vai Gli Trp Ile Arg 40 Trp Leu 50 Ala His Ile Trp Trp 55 Asp

Pro Gli 10 Leu Leu Lis Pro Ser 15 Gin Ser 25 Gli Fen Ser Leu Ser 30 Tre Ser Gin Pro Ser Gli Lis 45 Gli Leu Glu Gli Asp Glu Ser 60 Tir Asn Pro Ser 175

Leu 65 Lis Ser Gin Leu Tre 70 Ile Ser Ser Leu Lis Ile Tre 85 Ser Vai Tre Cis Ala Arg Asn 100 Arg Tir Asp Pro Gli Tre Leu 115 Vai Tre Vai Ser Ser 120

Lis Asn Tre 75 Ser Lis Asn Gin Vai 80 Ala Ala 90 Asp Tre Ala Tre Tir 95 Fen Pro 105 Trp Fen Vai Asp Trp 110 Gli Gin <210> 26 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 26

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli 1 5 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen 20 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg 35 40 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp 50 55 Leu Lis Ser Arg Leu Tre Ile Ser 65 70 Ser Leu Lis Ile Tre Ser Vai Tre 85 Cis Ala Arg Asn Arg Tir Asp Pro 100 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial

Pro Gli Leu Vai Lis Pro Ser Gin 10 15 Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 25 30 Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 45 Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 60 Lis Asn Tre Ser Lis Asn Gin Vai 75 80 Ala Ala Asp Tre Ala Vai Tir Fen 90 95 Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 105 110 176 <22 0> <223> Sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (7) . . (7) <223> <22 0> "Xaa" representa Tre ou Ser <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (15) .. (15) <223> "Xaa" representa Leu ou Vai <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (22) . . (22) <223> "Xaa" representa Tre ou Ser <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (41)..(41) <223> "Xaa" representa Asp ou Gli <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (42) . . (42) <223> "Xaa" representa Gli ou Lis <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (43) . . (43) <223> <220> "Xaa" representa Tre ou Ala 177 <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (72)..(72) <223> "Xaa" representa Tre ou Ser <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (77)..(77) <223> "Xaa" representa Asn ou Ser <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (79) . . (79) <223> "Xaa" representa Glu ou Gin <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (83)..(83) <223> "Xaa" representa Ile ou Fen <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (100)..(100) <223> "Xaa" representa Gli ou Gin <400> 27

Asp Ile Gin Met Tre Gin Xaa Tre Ser Ser Leu Ser Ala Ser Xaa Gli 1 5 10 15 Asp Arg Vai Tre Ile Xaa Cis Arg Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tir 20 25 30 Leu Ser Trp Tir Gin Gin Lis Pro Xaa Xaa Xaa Vai Lis Leu Leu Ile 35 40 45 Tir Tir Tre Ser Lis Leu His Ser Gli Vai Pro Ser Arg Fen Ser Gli 50 55 60 Ser Gli Ser Gli Tre Asp Tir Xaa Leu Tre Ile Ser Xaa Leu Xaa Gin 65 70 75 80 Glu Asp Xaa Ala Tre Tir Fen Cis Leu Gin Gli Lis Met Leu Pro Trp 85 90 95 Tre Fen Gli Xaa Gli Tre Lis Leu Glu Ile Lis 100 105 178 <210> 28 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3) . . (3) <223> "Xaa" representa Tre ou Gin <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (5) . . (5) <223> "Xaa" representa Lis ou Gin <22 0>

<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (11)..(11) <223> "Xaa" representa Ile ou Leu <22 0>

<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (12)..(12) <223> "Xaa" representa Leu ou Vai <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (67) . . (67) <223> "Xaa" representa Tre ou Ser <220> 179

<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (68) . . (68) <223> "Xaa" representa Gin ou Arg <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (74) .. (74) <223> <22 0> "Xaa" representa Asp ou Asn <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (77) . . (77) <223> "Xaa" representa Arg ou Lis <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (81) . . (81) <223> "Xaa" representa Fen ou Ser <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (88) .. (88) <223> "Xaa" representa Asp ou Tre <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (89) . . (89) <223> "Xaa" representa Tre ou Ala <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (90) . . (90) <223> <22 0> "Xaa" representa Vai ou Ala 180 <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (94) .. (94) <223> "Xaa" representa Tre ou Vai <220> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (100)..(100) <223> "Xaa" representa Ala, Vai, Fen, Lis ou Asn <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (101)..(101) <223> "Xaa" representa Arg ou Lis <400> 28

Gin Vai Xaa Leu Xaa Glu Ser Gli Pro Gli Xaa Xaa Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Xaa Xaa Leu Tre Ile Ser Lis Xaa Tre Ser Xaa Asn Gin Vai 65 70 75 80 Xaa Leu Lis Ile Tre Ser Vai Xaa Xaa Xaa Asp Tre Ala Xaa Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Xaa Xaa Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 29 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético 181 <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3) . . (3) <223> "Xaa" representa Tre ou Gin <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (5) . . (5) <223> "Xaa" representa Lis ou Gin <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (11)..(11) <223> "Xaa" representa Ile ou Leu <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (12)..(12) <223> "Xaa" representa Leu ou Vai <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (67) . . (67) <223> "Xaa" representa Tre ou Ser <220>

<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (68) .. (68) <223> "Xaa" representa Gin ou Arg <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (74) . . (74) <223> "Xaa" representa Asp ou Asn 182 <22 0> <221> CARACTERISTICAS DIVERSAS <222> (77) . . (77) <223> "Xaa" representa Arg ou Lis <22 0> <221> CARACTERISTICAS DIVERSAS <222> (81) . . (81) <223> "Xaa" representa Fen ou Ser <22 0> <221> CARACTERISTICAS DIVERSAS <222> (88) .. (88) <223> "Xaa" representa Asp ou Tre <22 0> <221> CARACTERISTICAS DIVERSAS <222> (89) . . (89) <223> "Xaa" representa Tre ou Ala <22 0> <221> CARACTERISTICAS DIVERSAS <222> (90) . . (90) <223> "Xaa" representa Vai ou Ala <22 0> <221> CARACTERISTICAS DIVERSAS <222> (94) . . (94) <223> "Xaa" representa Tre ou Vai <22 0> <221> CARACTERISTICAS DIVERSAS <222> (100) . . (100) 183 <223> "Xaa" representa Ala, Vai, Fen, Lis ou Asn <220> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (101)..(101) <223> "Xaa" representa Arg ou Lis, mas não representa Lis se a posição (100) for Lis <400> 29

Gin Vai Xaa Leu Xaa Glu Ser Gli Pro Gli Xaa Xaa Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Xaa Xaa Leu Tre Ile Ser Lis Xaa Tre Ser Xaa Asn Gin Vai 65 70 75 80 Xaa Leu Lis Ile Tre Ser Vai Xaa Xaa Xaa Asp Tre Ala Xaa Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Xaa Xaa Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (1) . . (1) <223> "Xaa" representa Ala, Vai, Fen, Lis ou Asn 184 <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (2) . . (2) <223> "Xaa" representa Arg ou Lis, mas não representa Lis se a posição (1) for Lis <400> 30

Xaa Xaa Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp 15 10 <210> 31 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (100)..(100) <223> "Xaa" representa Ala, Vai, Fen, Lis ou Asn <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (101)..(101) <223> "Xaa" representa Arg ou Lis, mas não representa Lis se a posição (100) for Lis <400> 31

Gin 1 Vai Gin Leu Gin 5 Glu Ser Gli Pro Gli 10 Leu Leu Lis Pro Ser 15 Gin Tre Leu Ser Leu 20 Tre Cis Ser Fen Ser 25 Gli Fen Ser Leu Ser 30 Tre Ser 185

Gli Met Gli 35 Vai Gli Trp Ile Arg 40 Gin Pro Ser Gli Lis 45 Gli Leu Glu Trp Leu 50 Ala His Ile Trp Trp 55 Asp Gli Asp Glu Ser 60 Tir Asn Pro Ser Leu 65 Lis Ser Gin Leu Tre 70 Ile Ser Lis Asp Tre 75 Ser Lis Asn Gin Vai 80 Ser Leu Lis Ile Tre 85 Ser Vai Tre Ala Ala 90 Asp Tre Ala Tre Tir 95 Fen Cis Ala Arg Xaa 100 Xaa Tir Asp Pro Pro 105 Trp Fen Vai Asp Trp 110 Gli Gin Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 32 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sintético <220> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (100) .. (100) <223> "Xaa" representa Ala, Vai, Fen, Lis ou Asn <220> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (101)..(101) <223> "Xaa" representa Arg ou Lis, mas não representa Lis se a posição (100) for Lis <400> 32

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro Gli Leu Vai Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 186

Leu 65 Lis Ser Arg Leu Tre 70 Ile Ser Ser Leu Lis Ile Tre 85 Ser Vai Tre Cis Ala Arg Xaa 100 Xaa Tir Asp Pro Gli Tre Leu 115 Vai Tre Vai Ser Ser 120

Lis Asp Tre 75 Ser Lis Asn Gin Vai 80 Ala Ala 90 Asp Tre Ala Vai Tir 95 Fen Pro 105 Trp Fen Vai Asp Trp 110 Gli Gin <210> 33 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (100)..(100) <223> "Xaa" representa Ala, Vai, Fen, Lis ou Asn <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (101)..(101) <223> "Xaa" representa Arg ou Lis, mas não representa Lis se a posição (100) for Lis <400> 33

Gin 1 Vai Tre Leu Tre Leu Ser Leu 20 Gli Met Gli 35 Vai Trp Leu 50 Ala His Leu 65 Lis Tre Gin

Lis 5 Glu Ser Gli Tre Cis Ser Fen Gli Trp Ile Arg 40 Ile Trp Trp 55 Asp Leu Tre 70 Ile Ser

Pro Gli 10 Ile Leu Ser 25 Glu Fen Ser Gin Pro Ser Gli Gli Asp Glu Ser 60 Lis Asp Tre 75 Ser

Lis Pro Ser 15 Gin Leu Ser 30 Tre Ser Lis 45 Gli Leu Glu Tir Asn Pro Ser Arg Asn Gin Vai 80 187

Fen Leu Lis Ile Cis Ala Arg Xaa 100 Gli Tre Leu Vai 115

Tre 85 Ser Vai Asp Xaa Tir Asp Pro Tre Vai Ser Ser 120

Tre Vai 90 Asp Tre Pro 105 Trp Fen Vai

Ala Tre Tir 95 Fen Asp Trp 110 Gli Gin <210> 34 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (100)..(100) <223> "Xaa" representa Ala, Vai, Fen, Lis ou Asn <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (101)..(201) <223> "Xaa" representa Arg ou Lis, mas não representa Lis se a posição (100) for Lis <400> 34

Gin 1 Vai Tre Leu Gli Met Trp Leu 50 Leu 65 Lis Ser Leu Cis Ala

Gin Leu Ser Leu 20 Gli 35 Vai Ala His Ser Gin Lis Ile Arg Xaa 100

Gin 5 Glu Tre Cis Gli Trp Ile Trp Leu Tre 70 Tre 85 Ser Xaa Tir

Ser Gli Ser Fen Ile Arg 40 Trp 55 Asp Ile Ser Vai Tre Asp Pro

Pro Gli 10 Ser 25 Gli Gin Pro Gli Asp Lis Asn Ala Ala 90 Pro 105 Trp

Leu Leu Fen Ser Ser Gli Glu Ser 60 Tre Ser 75 Asp Tre Fen Vai

Lis Pro Leu Ser 30 Lis 45 Gli Tir Asn Lis Asn Ala Tre Asp Trp 110

Ser 15 Gin Tre Ser Leu Glu Pro Ser Gin Vai 80 Tir 95 Fen Gli Gin 188

Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <220> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (100)..(100)

Fen, Lis ou Asn <223> "Xaa" representa Ala, Vai, <22 0> <221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (101) . . (101) mas não representa Lis se <223> "Xaa" representa Arg ou Lis, a posição (100) for Lis <400> 35

Gli 10 Leu Vai Lis Pro Ser 15 Gin Gli Fen Ser Leu Ser 30 Tre Ser Pro Ser Gli Lis 45 Gli Leu Glu Asp Glu Ser 60 Tir Asn Pro Ser Asn Tre 75 Ser Lis Asn Gin Vai 80 Ala 90 Asp Tre Ala Vai Tir 95 Fen Trp Fen Vai Asp Trp 110 Gli Gin

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro 1 5 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser 20 25 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin 35 40 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli 50 55 Leu Lis Ser Arg Leu Tre Ile Ser Lis 65 70 Ser Leu Lis Ile Tre Ser Vai Tre Ala 85 Cis Ala Arg Xaa Xaa Tir Asp Pro Pro 100 205 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 189 <210> 36

<211> 23 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 36

Glu 1 Ser Vai Asp Pro 5 Lis Asn Tir Pro Lis 10 Lis Lis Met Glu Lis Arg 15 Fen Vai Fen Asn 20 Lis Ile Glu <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sequência do ligante <400> 37

Gli Gli Gli Gli Ser 1 5 <210> 38 <211> 360 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 38 caagtacaac ttcaagaaag cggtccaggc cttgttaaac cctcccaaac tctttctctt 60 acctgttctt tctctggatt ctctctctct acctctggca tgggcgtcgg ctggatacgt 190 120 caaccaagtg gaaaaggact cgaatggctt gcacatatat ggtgggatgg cgacgaatct 180 tataaccctt ctcttaaatc tcgacttaca atttctaaag acacttccaa aaaccaagtt 240 tccctcaaaa taacctccgt cactgctgca gatactgctg tctatttttg cgcacgaaac 300 agatatgatc ccccctggtt cgttgattgg ggccaaggaa cactcgtaac cgttagctca 360 <210> 39 <211> 321 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 39 gacatccaaa tgactcaatc cacttcctca ctctcagcct ctgtcggaga ccgtgtaact 60 atcacctgcc gtgcttccca agacatctct aattatctct cctggtatca acaaaaacct 120 ggtaaagctg ttaaacttct catttattat acttctaaac ttcactccgg tgtgccttct 180 cgtttctcag gatcaggctc aggaaccgac tatacactca ccatctcctc cctccaacaa 240 gaagacttcg ctacttactt ttgccttcaa ggaaaaatgc tcccctggac tttcggacaa 300 ggaacaaagc tcgaaattaa a 321 <210> 40 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sintético 191 <400> 40

Gin 1 Vai Tre Leu Lis 5 Glu Ser Gli Tre Leu Ser Leu 20 Tre Cis Ser Fen Gli Met Gli 35 Vai Gli Trp Ile Arg 40 Trp Leu 50 Ala His Ile Trp Trp 55 Asp Leu 65 Lis Tre Arg Leu Tre 70 Ile Ser Fen Leu Lis Ile Tre 85 Tre Vai Asp Cis Ala Arg Asn 100 Arg Tir Asp Pro Gli Tre Leu 115 Vai Tre Vai Ser Ser 120

Pro Gli 10 Ile Leu Lis Pro Ser 15 Gin Ser 25 Gli Fen Ser Leu Ser 30 Tre Ser Gin Pro Ser Gli Lis 45 Gli Leu Glu Gli Asp Glu Ser 60 Tir Asn Pro Ser Lis Asn Tre 75 Ser Arg Asn Gin Vai 80 Tre Vai 90 Asp Tre Ala Tre Tir 95 Fen Pro 105 Trp Fen Vai Asp Trp 110 Gli Gin <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 41

Asp Ile Gin Met Tre Gin Tre Tre 1 5 Asp Arg Vai Tre Ile Ser Cis Arg 20 Leu Ser Trp Tir Gin Gin Lis Pro 35 40 Tir Tir Tre Ser Lis Leu His Ser 50 55 Ser Gli Ser Gli Tre Asp Tir Fen 65 70 Glu Asp Ile Ala Tre Tir Fen Cis 85 Tre Fen Gli Gli Gli Tre Lis Leu ιοο

Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Leu 15 Gli Ala 25 Ser Gin Asp Ile Ser 30 Asn Tir Asp Gli Tre Vai Lis 45 Leu Leu Ile Gli Vai Pro Ser 60 Arg Fen Ser Gli Leu Tre Ile 75 Ser Asn Leu Glu Gin 80 Leu Gin 90 Gli Lis Met Leu Pro 95 Trp Glu 105 Ile Lis 192 <210> 42 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 42

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro Gli Leu Leu Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Ser Gin Leu Tre Ile Ser Lis Asp Tre Ser Lis Asn Gin Vai 65 70 75 80 Ser Leu Lis Ile Tre Ser Vai Tre Ala Ala Asp Tre Ala Tre Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Ala Arg Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 43 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 43

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro Gli Leu Leu Lis Pro Ser Gin 15 10 15 193

Tre Leu Ser Leu 20 Gli Met Gli 35 Vai Trp Leu 50 Ala His Leu 65 Lis Ser Gin Ser Leu Lis Ile Cis Ala Arg Vai 100 Gli Tre Leu 115 Vai

Tre Cis Ser Fen Gli Trp Ile Arg 40 Ile Trp Trp 55 Asp Leu Tre 70 Ile Ser Tre 85 Ser Vai Tre Arg Tir Asp Pro Tre Vai Ser Ser 120

Ser 25 Gli Fen Ser Gin Pro Ser Gli Gli Asp Glu Ser 60 Lis Asp Tre 75 Ser Ala Ala 90 Asp Tre Pro 105 Trp Fen Vai

Leu Ser 30 Tre Ser Lis 45 Gli Leu Glu Tir Asn Pro Ser Lis Asn Gin Vai 80 Ala Tre Tir 95 Fen Asp Trp 110 Gli Gin <210> 44 <211> 120 <212> PRT <213> Artificia <22 0> <223> Sintético <400> 44

Gin 1 Vai Gin Leu Tre Leu Ser Leu 20 Gli Met Gli 35 Vai Trp Leu 50 Ala His Leu 65 Lis Ser Gin Ser Leu Lis Ile Cis Ala Arg Fen 100 Gli Tre Leu 115 Vai

Gin 5 Glu Ser Gli Tre Cis Ser Fen Gli Trp Ile Arg 40 Ile Trp Trp 55 Asp Leu Tre 70 Ile Ser Tre 85 Ser Vai Tre Arg Tir Asp Pro Tre Vai Ser Ser 120

Pro Gli 10 Leu Leu Ser 25 Gli Fen Ser Gin Pro Ser Gli Gli Asp Glu Ser 60 Lis Asp Tre 75 Ser Ala Ala 90 Asp Tre Pro 105 Trp Fen Vai

Lis Pro Ser 15 Gin Leu Ser 30 Tre Ser Lis 45 Gli Leu Glu Tir Asn Pro Ser Lis Asn Gin Vai 80 Ala Tre Tir 95 Fen Asp Trp 110 Gli Gin

<210> 45 <211> 120 <212> PRT 194 <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 45

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro Gli Leu Leu Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Ser Gin Leu Tre Ile Ser Lis Asp Tre Ser Lis Asn Gin Vai 65 70 75 80 Ser Leu Lis Ile Tre Ser Vai Tre Ala Ala Asp Tre Ala Tre Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Lis Lis Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 46 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 4 6

Gin 1 Vai Gin Leu Gin 5 Glu Ser Gli Pro Gli 10 Leu Vai Lis Pro Ser 15 Gin Tre Leu Ser Leu 20 Tre Cis Ser Fen Ser 25 Gli Fen Ser Leu Ser 30 Tre Ser Gli Met Gli 35 Vai Gli Trp Ile Arg 40 Gin Pro Ser Gli Lis 45 Gli Leu Glu Trp Leu 50 Ala His Ile Trp Trp 55 Asp Gli Asp Glu Ser 60 Tir Asn Pro Ser 195

Leu 65 Lis Ser Arg Leu Tre 70 Ile Ser Lis Asp Tre 75 Ser Lis Asn Gin Vai 80 Ser Leu Lis Ile Tre 85 Ser Vai Tre Ala Ala 90 Asp Tre Ala Vai Tir 95 Fen Cis Ala Arg Ala 100 Arg Tir Asp Pro Pro 105 Trp Fen Vai Asp Trp 110 Gli Gin Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <2 1 0> 47 <2 11> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 47

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro Gli Leu Vai Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Ser Arg Leu Tre Ile Ser Lis Asp Tre Ser Lis Asn Gin Vai 65 70 75 80 Ser Leu Lis Ile Tre Ser Vai Tre Ala Ala Asp Tre Ala Vai Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Vai Arg Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 48 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sintético 196 <4Ο0> 48

Gin 1 Vai Gin Leu Gin 5 Tre Leu Ser Leu 20 Tre Gli Met Gli 35 Vai Gli Trp Leu 50 Ala His Ile Leu 65 Lis Ser Arg Leu Ser Leu Lis Ile Tre 85 Cis Ala Arg Fen 100 Arg Gli Tre Leu 215 Vai Tre

Glu Ser Gli Pro Gli 10 Cis Ser Fen Ser 25 Gli Trp Ile Arg 40 Gin Pro Trp Trp 55 Asp Gli Asp Tre 70 Ile Ser Lis Asp Ser Vai Tre Ala Ala 90 Tir Asp Pro Pro 105 Trp Vai Ser Ser 120

Leu Vai Lis Pro Ser 15 Gin Fen Ser Leu Ser 30 Tre Ser Ser Gli Lis 45 Gli Leu Glu Glu Ser 60 Tir Asn Pro Ser Tre 75 Ser Lis Asn Gin Vai 80 Asp Tre Ala Vai Tir 95 Fen Fen Vai Asp Trp 110 Gli Gin <210> 49 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 49

Gin 1 Vai Gin Leu Gin 5 Tre Leu Ser Leu 20 Tre Gli Met Gli 35 Vai Gli Trp Leu 50 Ala His Ile Leu 65 Lis Ser Arg Leu Ser Leu Lis Ile Tre 85 Cis Ala Arg Lis 100 Lis Gli Tre Leu Vai Tre

Glu Ser Gli Pro Gli 10 Cis Ser Fen Ser 25 Gli Trp Ile Arg 40 Gin Pro Trp Trp 55 Asp Gli Asp Tre 70 Ile Ser Lis Asp Ser Vai Tre Ala Ala 90 Tir Asp Pro Pro 105 Trp Vai Ser Ser

Leu Vai Lis Pro Ser 15 Gin Fen Ser Leu Ser 30 Tre Ser Ser Gli Lis 45 Gli Leu Glu Glu Ser 60 Tir Asn Pro Ser Tre 75 Ser Lis Asn Gin Vai 80 Asp Tre Ala Vai Tir 95 Fen Fen Vai Asp Trp 110 Gli Gin 197 115 120 <210> 50 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 50

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro Gli Leu Leu Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Ser Gin Leu Tre Ile Ser Lis Asn Tre Ser Lis Asn Gin Vai 65 70 75 80 Ser Leu Lis Ile Tre Ser Vai Tre Ala Ala Asp Tre Ala Tre Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Ala Arg Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 51 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 51

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro Gli Leu Leu Lis Pro Ser Gin 198 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Ser Gin Leu Tre Ile Ser Lis Asn Tre Ser Lis Asn Gin Vai 65 70 75 80 Ser Leu Lis Ile Tre Ser Vai Tre Ala Ala Asp Tre Ala Tre Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Vai Arg Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 52 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 52 Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro Gli Leu Leu Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Ser Gin Leu Tre Ile Ser Lis Asn Tre Ser Lis Asn Gin Vai 65 70 75 80 Ser Leu Lis Ile Tre Ser Vai Tre Ala Ala Asp Tre Ala Tre Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Fen Arg Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120

<210> 53 <211> 120 <212> PRT 199 <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 53

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro Gli Leu Leu Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Ser Gin Leu Tre Ile Ser Lis Asn Tre Ser Lis Asn Gin Vai 65 70 75 80 Ser Leu Lis Ile Tre Ser Vai Tre Ala Ala Asp Tre Ala Tre Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Lis Lis Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 54 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 54

Gin 1 Vai Gin Leu Gin 5 Glu Ser Gli Pro Gli 10 Leu Vai Lis Pro Ser 15 Gin Tre Leu Ser Leu 20 Tre Cis Ser Fen Ser 25 Gli Fen Ser Leu Ser 30 Tre Ser Gli Met Gli 35 Vai Gli Trp Ile Arg 40 Gin Pro Ser Gli Lis 45 Gli Leu Glu Trp Leu 50 Ala His Ile Trp Trp 55 Asp Gli Asp Glu Ser 60 Tir Asn Pro Ser 200

Leu 65 Lis Ser Arg Leu Tre 70 Ile Ser Lis Asn Tre 75 Ser Lis Asn Gin Vai 80 Ser Leu Lis Ile Tre 85 Ser Vai Tre Ala Ala 90 Asp Tre Ala Vai Tir 95 Fen Cis Ala Arg Ala 100 Arg Tir Asp Pro Pro 105 Trp Fen Vai Asp Trp 110 Gli Gin Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <2 1 0> 55 <2 11> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 55

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro Gli Leu Vai Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Ser Arg Leu Tre Ile Ser Lis Asn Tre Ser Lis Asn Gin Vai 65 70 75 80 Ser Leu Lis Ile Tre Ser Vai Tre Ala Ala Asp Tre Ala Vai Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Vai Arg Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 56 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético 201 <4Ο0> 56

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro Gli Leu Vai Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Ser Arg Leu Tre Ile Ser Lis Asn Tre Ser Lis Asn Gin Vai 65 70 75 80 Ser Leu Lis Ile Tre Ser Vai Tre Ala Ala Asp Tre Ala Vai Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Fen Arg Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 120 <210> 57 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 57

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro Gli Leu Vai Lis Pro Ser Gin 1 5 10 15 Tre Leu Ser Leu Tre Cis Ser Fen Ser Gli Fen Ser Leu Ser Tre Ser 20 25 30 Gli Met Gli Vai Gli Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gli Lis Gli Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gli Asp Glu Ser Tir Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lis Ser Arg Leu Tre Ile Ser Lis Asn Tre Ser Lis Asn Gin Vai 65 70 75 80 Ser Leu Lis Ile Tre Ser Vai Tre Ala Ala Asp Tre Ala Vai Tir Fen 85 90 95 Cis Ala Arg Lis Lis Tir Asp Pro Pro Trp Fen Vai Asp Trp Gli Gin 100 105 110 Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ser 202 115 120 115 120 Lisboa, 26 de Setembro de 2012. 203

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou um fragmento desse anticorpo de ligação a IL-Ιβ em que o referido anticorpo ou o referido fragmento se liga a uma IL-Ιβ humana com uma constante de dissociação inferior a 1 pM, caracterizado pelo facto de se seleccionar no grupo que consiste em: • uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 9 ou da SEQ ID N°. 9 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 8 ou da SEQ ID N°. 8 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos; • uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 10 ou da SEQ ID N°. 10 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 14 ou da SEQ ID N°. 14 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos; • uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 11 ou da SEQ ID N°. 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 15 ou da SEQ ID N°. 15 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos; 1 • uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 10 ou da SEQ ID N°. 10 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 25 ou da SEQ ID N°. 25 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos; • uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 11 ou da SEQ ID N°. 11 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 26 ou da SEQ ID N°. 26 com uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos.
2. Anticorpo ou um seu fragmento de ligação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o anticorpo ou o fragmento de anticorpo ser um Fab, um F(ab')2, um Fv, um fragmento de anticorpo de cadeia simples, um anticorpo multiespecifico, um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um minicorpo, um anticorpo linear, um anticorpo recombinante de quelação; um tricorpo, um bicorpo, um intracorpo, um nanocorpo, um produto imunofarmacêutico modular pequeno (PFMP), uma proteina de fusão da imunoglobulina do dominio de ligação; um anticorpo camelizado, ou um anticorpo contendo VHH.
3. Acido nucleico que codifica para o anticorpo ou o fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2 . 2
4. Ácido nucleico caracterizado pelo facto de compreender uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°s. 8, 12, 13, 14, 15, 23, 24, 25 ou 26.
5. Ácido nucleico caracterizado pelo facto de compreender uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para uma região variável de cadeia leve de um anticorpo, em que a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°s. 9, 10 ou 11.
6. Vector caracterizado pelo facto de compreender a sequência de ácidos nucleicos de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 a 5.
7. Célula caracterizada pelo facto de compreender um ácido nucleico de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 a 5 ou o vector de acordo com a reivindicação 6.
8. Composição caracterizada pelo facto de compreender (a) o anticorpo ou o fragmento de anticorpo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, o ácido nucleico de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 a 5 ou o vector de acordo com a reivindicação 6 e (b) um veiculo apropriado.
9. Composição farmacêutica para ser utilizada no tratamento ou na prevenção de uma doença ou de um estado clinico relacionado com IL-1 num mamifero, caracterizada pelo facto de compreender uma quantidade eficaz de (a) o anticorpo ou o fragmento de anticorpo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, (b) o ácido nucleico de acordo 3 com uma qualquer das reivindicações 3 a 5, (c) o vector de acordo com a reivindicação 6 ou (d) a composição de acordo com a reivindicação 7, em que a referida doença ou estado clínico, relacionados com IL-1, se selecciona no grupo que consiste em doenças inflamatórias, doenças auto-imunes e cancros. Lisboa, 26 de Setembro de 2012. 4