BRPI0612273B1

BRPI0612273B1 - anticorpo de ligação a il-1 beta ou fragmento de ligação a il-1 beta do mesmo, ácido nucleico, vetor, e, composição

Info

Publication number: BRPI0612273B1
Application number: BRPI0612273A
Authority: BR
Inventors: Linda Masat; Mary Haak-Frendscho; Gang Chen; Arnold Horwirtz; Marina Roell
Original assignee: Xoma; Llc
Priority date: 2005-06-21
Filing date: 2006-06-21
Publication date: 2019-02-05
Also published as: US7988968B2; WO2007002261A2; ZA200800555B; US20100061998A1; US7744866B2; KR20130076901A; US20090214545A1; US20100055110A1; EP2322552B1; CA2873914A1; US20120014967A1; SI2314623T1; WO2007002261A3; KR101502920B1; US20140004125A1; US20090060918A1; EP2314623B1; ES2335232T3; IL188094A0; HK1140781A1

Abstract

anticorpo de ligação a il-1 beta ou fragmento de ligação a il-1 beta do mesmo, ácido nucleico, vetor, célula, animal transgênico, hibridoma, composição, e, métodos de tratamento ou prevenção de uma doença ou doença relacionada a il-1 em um mamífero, e de preparação de um polipeptídeo de ligação a il-1 beta maturado por afimdade. um anticorpo de ligação a il- 1<225> ou fragmento de ligação a il- 1<225> do mesmo compreendendo a sequência de aminoácido de seq id no: 2 e ácidos nucleicos relacionados, vetores, células e composições, bem como método de uso dos mesmos para tratar ou prevenir uma doença e um método de preparo de um polipeptídeo de ligação a il- 1<225> maturado por afinidade. anticorpos de ligação a il- 1<225> ou fragmentos de ligação a il- 1<225>dos mesmos são proporcionados, os quais têm afinidade e potência desejáveis.

Description

“ANTICORPO DE LIGAÇÃO A IL-1 BETA OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A IL-1 BETA DO MESMO, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, E, COMPOSIÇÃO”

REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDO RELACIONADO

O presente pedido reivindica prioridade do pedido provisório US No. de Série 60/692.830 depositado em 21 de Junho de 2005, a divulgação do qual é incorporada aqui por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção se refere a anticorpos de ligação à IL-13 e incluindo fragmentos dos mesmos e ácidos nucleicos que codificam tais anticorpos, bem como a vetores, células e composições compreendendo os anticorpos ou ácidos nucleicos e usos dos mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A família de citocinas da interleucina-1 (IL-1) foi implicada em estados doentios, tais como artrite reumatóide (RA), osteoartrite, doença de Crohn, colite ulcerativa (UC), choque séptico, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), asma, doença enxerto versus hospedeiro, aterosclerose, leucemia de células T em adultos, mieloma múltiplo, esclerose múltipla, derrame e mal de Alzheimer. Membros da família IL-1 incluem IL-1a, IL-13 e IL-1Ra. Embora relacionadas à sua capacidade de se ligar a receptores de IL-1 (IL-1R1 e IL-1R2), cada uma dessas citocinas é expressa por um gene diferente e tem uma seqüência de aminoácido primária diferente. Além disso, as atividades fisiológicas dessas citocinas podem ser distinguidas.

Compostos que rompem a sinalização ao receptor de IL-1 foram investigados como agentes terapêuticos para tratar doenças mediadas

Petição 870180150663, de 12/11/2018, pág. 11/121

J.10 rr* pela IL-1. Esses compostos incluem IL-lRa recombinante (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) e o peptídeo trap do receptor de IL-1 (Regeneron Inc., Tarrytown, NY). Anticorpos monoclonais derivados de animal que se ligam à citocinas IL-1 também foram investigados. Contudo, seu valor clínico pode ser limitado em virtude de sua imunogenicidade. Por exemplo, sabe-se que seres humanos administrados com anticorpos monoclonais de camundongo produzem anticorpos anti-camundongo humanos (HAMA). Foi reportado que HAMA reduz a eficácia da terapia com anticorpo monoclonal e produz reações adversos, incluindo dano renal. Outros anticorpos de IL-1 β podem ser

M) limitados por sua afinidade de ligação e/ou sua potência. Conseqüentemente, compostos adicionais que rompem a sinalização ao receptor de IL-1 são necessários. A invenção proporciona tais compostos, bem como métodos para preparo e uso de tais compostos.

BREVE SUMÁRIO

A invenção proporciona um anticorpo de ligação à IL-Ιβ ou fragmento de ligação à IL-Ιβ do mesmo compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2. Também proporcionado aqui é um ácido nucleico que codifica o anticorpo ou fragmento de anticorpo, bem como um vetor compreendendo o ácido nucleico, uma célula compreendendo o ácido “20 nucleico ou vetor e uma composição compreendendo o anticorpo, ácido nucleico ou vetor.

A invenção ainda um método de tratamento ou prevenção de uma doença em um mamífero compreendendo administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor da invenção a um mamífero que precisa do mesmo, pelo que uma doença é tratada ou prevenida no mamífero.

A invenção proporciona um método de preparo de um polipeptídeo de ligação à IL-Ιβ maturado por afinidade compreendendo (a) fornecimento de um primeiro ácido nucleico compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de ligação à IL-Ιβ que compreende a seqüência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOs: 126 e um segundo ácido nucleico compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que difere da primeira seqüência de ácido nucleico por pelo menos 5 um nucleotídeo, (b) realização de embaralhamento de ácido nucleico para proporcionar dois ou mais ácidos nucléicos com mutação, (c) seleção de um ácido nucleico com mutação que codifica um polipeptídeo que (i) se liga à IL1 β com maior afinidade do que o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico, (ii) tem uma seletividade pela IL-ίβ com relação à IL-la que é maior do que aquela do polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico, (iii) tem uma constante de dissociação de ligação em equilíbrio (K_D) para IL• 1β que é menor do que aquela do polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico ou (iv) inibe a expressão IL-^-induzida de IL-6 no soro em um animal em um grau maior do que o polipeptídeo codificado pelo primeiro 15 ácido nucleico e (d) expressão do ácido nucleico com mutação selecionado, pelo que um polipeptídeo de ligação à IL-Ιβ maturado por afinidade é produzido.

A invenção proporciona novos anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ dos mesmos os quais se ligam à IL-Ιβ ”20 humana com uma constante de dissociação menor do que 3 pM, altemativamente cerca de 2 pM ou menos, de preferência cerca de 1 pM ou menos. Tais anticorpos de alta afinidade são considerados como sendo úteis para vários métodos de tratamento ou prevenção de doenças ou condições relacionadas à IL-1. Alternativa ou adicionalmente, os anticorpos de ligação à 25 IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ se ligam a um epítopo de IL-Ιβ, de modo que o anticorpo ou fragmento ligado não impede substancialmente a ILΙβ de se ligar ao receptor de IL-1 do tipo I. Alternativa ou adicionalmente, os anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ se ligam substancialmente ao mesmo epítopo que um ou mais dos anticorpos

exemplificativos descritos aqui, tal como o anticorpo designado AB7, o qual compreende uma região variável de cadeia pesada. Alternativa ou adicionalmente, os anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ competem com a ligação de um anticorpo tendo a região variável de 5 cadeia leve de SEQ ID NO: 11 e a região variável de cadeia pesada de SEQ

ID NO: 15. Alternativa ou adicionalmente, a presente invenção abrange anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ que se ligam a um epítopo contido na seqüência ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE (SEQ ID NO: 36). Anticorpos de ligação à IL-Ιβ exemplificativos incluem os TO anticorpos designados AB5 e AB7 aqui.

A invenção também proporciona anticorpos de ligação à IL-1 • ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ dos mesmos tendo uma constante de dissociação de menos de 3 pM, altemativamente cerca de 1 pM ou menos, altemativamente qualquer uma das outras constantes de dissociação 15 divulgadas aqui e compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma das seqüências de aminoácido de SEQ ID NOs: 12, 13, 21, 23 ou 24 ou, altemativamente, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NOs: 12, 13 ou 21 ou, altemativamente, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NOs: 13 ou 21 ou, altemativamente, a seqüência de aminoácido de SEQ

TO ID NOs: 8, 14 ou 15 ou, altemativamente, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NOs: 8 ou 15. O anticorpo de ligação à IL-Ιβ ou fragmento de ligação à IL-Ιβ também pode compreender a região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ou SEQIDNO: 11.

Como outra modalidade da presente invenção, novos anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ dos mesmos são proporcionados, os quais se ligam à IL-Ιβ com uma constante de dissociação entre cerca de 6 pM e cerca de 50 pM, altemativamente entre cerca de 13 pM e cerca de 25 pM, altemativamente cerca de 19 pM e, onde o anticorpo ou fragmento tem uma IC50 de menos de 0,5 nM (500 pM), altemativamente entre cerca de 5 pM e cerca de 200 pM, altemativamente entre cerca de 10 pM e cerca de 100 pM, altemativamente cerca de 30 pM, para inibição de liberação IL-lp-estimulada de IL-6 de fibroblastos humanos.

IC50 para inibição de liberação IL-lp-estimulada de IL-6 de fibroblastos humanos se refere à concentração requerida para inibir 50% da IL-6 liberada, através de estimulação por IL-Ιβ, dos fibroblastos humanos. Anticorpos exemplificativos incluem o anticorpo designado AB1 aqui.

A presente invenção também proporciona anticorpos de ^0 ligação à IL-1 ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ dos mesmos tendo uma constante de dissociação entre cerca de 6 e cerca de 50 pM e compreendendo * uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma das seqüências de aminoácido de SEQ ID NOs: 4, 5 ou 6, altemativamente uma das seqüências de aminoácido de SEQ ID NOs: 4 ou 5, altemativamente as seqüências de 15 aminoácido de SEQ ID NO: 4. Considera-se que, em algumas circunstâncias, um anticorpo de ligação à IL-Ιβ ou fragmento de ligação à IL-Ιβ tendo uma constante de dissociação relativamente maior pode ser desej ável, por exemplo, para alguns métodos de tratamento ou prevenção de doenças ou condições relacionadas à IL-1 onde um grau relativamente menor de afinidade “20 é desejável.

Anticorpos exemplificativos incluem os anticorpos designados AB1, AB2, AB3, AB4, AB5, AB6, AB7, AB8 e AB9. AB1 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a 25 seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 9. AB2 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 9. AB3 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 e

-y.o uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 9. AB4 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 9. AB 5 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido of- SEQ ID NO: 9. AB6 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10, AB7 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 11. AB8 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 25 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10, AB9 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 11.

A presente invenção abrange anticorpos de ligação à IL-1 β ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ tendo uma região variável de cadeia pesada que compreende qualquer uma das seqüências apresentadas em SEQ ID NO: 2, 48, 12-15, 21, 23-26, 28-35 ou 42-57, alternativamente qualquer uma das seqüências apresentadas em SEQ ID NO: 21, alternativamente qualquer uma das seqüências apresentadas em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, alternativamente qualquer uma das seqüências apresentadas em SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13, alternativamente qualquer uma das seqüências apresentadas em SEQ ID NO:

14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 26.

A invenção também abrange anticorpos de ligação à IL-1 β ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ tendo uma região variável de cadeia leve que compreende qualquer uma das seqüências apresentadas em SEQ ID NO: 1, 95 11 ou 27, altemativamente qualquer uma das seqüências apresentadas em

SEQ ID NO: 1, altemativamente qualquer uma das seqüências apresentadas em SEQ ID NO: 9, altemativamente qualquer uma das seqüências apresentadas em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11.

A presente invenção também abrange anticorpos de ligação à

IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ compreendendo uma das regiões variáveis de cadeia pesada das seqüências apresentadas em SEQ ID NO: 2, 4-

8, 12-15, 21, 23-26, 28-35 ou 42-57 e uma das regiões variáveis de cadeia leve das seqüências apresentadas em SEQ ID NO: 1,9-11 ou 27.

A presente invenção também abrange anticorpos de ligação à

IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ compreendendo porções que não se ligam à IL-Ιβ, mas antes, são responsáveis por outras funções, tal como meiavida em circulação, efeito citotóxico direto, rotulação detectável ou ativação de uma cascata de complemento endógena do recipiente ou citotoxicidade celular endógena. Anticorpos da invenção podem compreender toda ou uma “20 parte de uma região constante de um anticorpo. A região constante pode ser selecionada de qualquer isotipo, incluindo IgA (por exemplo, IgAl ou IgA2), IgD, IgE, IgG (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4) ou IgM. Por exemplo, o anticorpo pode compreender uma região de IgG2. Além de ou ao invés de compreender uma região constante, os anticorpos e fragmentos da 25 invenção podem incluir uma tag de epítopo, um epítopo do receptor de salvamento, uma porção de rotulação para fins diagnósticos ou de purificação ou uma porção citotóxica, tal como um radionuclídeo ou toxina.

A presente invenção também abrange composições farmacêuticas compreendendo qualquer um dos anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ e um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável adequado. De preferência, os anticorpos e compostos da invenção podem ser administrados em uma quantidade terapeuticamente eficaz, isto é, uma quantidade suficiente para aliviar um 5 sinal ou sintoma clínico de uma condição ou distúrbio associado à expressão da proteína alvo, a um indivíduo que precisa de tal tratamento. Em uma modalidade relacionada, a composição farmacêutica ainda compreende um segundo agente ativo. Em ainda outra modalidade relacionada, uma composição farmacêutica é proporcionada, em que o segundo agente ativo é *) um anticorpo a ou antagonista do fator de crescimento ou uma citocina. Em outra modalidade, o segundo agente ativo é outro anticorpo.

< Em outra modalidade da presente invenção, o uso dos anticorpos à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ é considerado na fabricação de um medicamento para prevenção ou redução de uma condição 15 ou distúrbio associado à IL-1. Em qualquer um dos usos, o medicamento pode ser coordenado com tratamento usando um segundo agente ativo. Em outra modalidade da invenção, o uso de uma combinação sinergística de um anticorpo da invenção para preparo de um medicamento para tratamento de um paciente exibindo sintomas de uma condição ou distúrbio relacionado à “20 IL-1 divulgado aqui, em que o medicamento é coordenado com tratamento usando um segundo agente ativo é considerado. Em uma modalidade relacionada, o segundo agente ativo é um anticorpo a ou antagonista de citocina ou um fator de crescimento. Modalidades de qualquer um dos usos antes mencionados são consideradas, em que a quantidade de anticorpo ou 25 fragmento de ligação à IL-Ιβ no medicamento é em uma dose eficaz para reduzir a dosagem do segundo agente ativo requerida para obter um efeito terapêutico.

Kits também são considerados pela presente invenção. Em uma modalidade, um kit compreende uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um composto ou composição da invenção (tal como um anticorpo, fragmento, ácido nucleico, vetor ou célula), embalada em um recipiente, tal como um frasco ou garrafa e ainda compreendendo uma bula presa a ou embalada com o recipiente, a bula descrevendo os conteúdos 5 do recipiente e proporcionando indicações e/ou instruções com relação ao uso dos conteúdos do recipiente para prevenir ou reduzir uma condição ou doença associada à expressão da proteína alvo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS VÁRIAS VISTAS DO(S) DESENHO(S)

A Fig. 1 é um conjunto de seqüências de aminoácido correspondendo às cadeias leve e cadeias pesadas da região variável de alguns dos anticorpos descritos aqui. As porções sublinhadas das seqüências de . aminoácido indicam regiões de determinação de complementaridade (CDRs).

A Fig. 2 é um conjunto de seqüências de aminoácido correspondendo às regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada de 15 anticorpos AB1, AB2, AB3 e AB4. As porções sublinhadas das seqüências de aminoácido indicam regiões de determinação de complementaridade (CDRs).

A Fig. 3 é um conjunto de seqüências de aminoácido correspondendo às regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpos AB5, AB5.1 e AB5.2. As porções sublinhadas das seqüências de “20 aminoácido indicam regiões de determinação de complementaridade (CDRs).

A Fig. 4 é um conjunto de seqüências de aminoácido correspondendo às regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpos AB5.3 e AB5.4. As porções sublinhadas das seqüências de aminoácido indicam regiões de determinação de complementaridade (CDRs).

A Fig. 4A é um conjunto de seqüências de aminoácido correspondendo às regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpos AB6 e AB7. As porções sublinhadas das seqüências de aminoácido indicam regiões de determinação de complementaridade (CDRs).

A Fig. 4B é um conjunto de seqüências de aminoácido γγ10 correspondendo às regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpos AB8 e AB9. As porções sublinhadas das seqüências de aminoácido indicam regiões de determinação de complementaridade (CDRs).

A Fig. 5 é um gráfico mostrando os resultados de um 5 experimento de estimulação de IL-Ιβ in vitro.

A Fig. 6 é um histograma mostrando os resultados de um experimento de estimulação de IL-Ιβ in vivo.

A Fig. 7 é um gráfico mostrando resultados do ensaio de exclusão cinética para o anticorpo designado AB1.

^0 A Fig. 8 é um gráfico mostrando resultados do ensaio de exclusão cinética para o anticorpo designado AB5.

A Fig. 9 é um gráfico mostrando resultados do ensaio de exclusão cinética para o anticorpo designado AB7.

A Fig. 10 é um gráfico mostrando os resultados de um experimento de estimulação de IL-Ιβ in vitro para os anticorpos designados AB1, AB2e AB3.

A Fig. 11 é um gráfico mostrando os resultados de um experimento de estimulação de IL-Ιβ in vitro para os anticorpos designados AB1 eAB7.

“20 A Fig. 12 é um gráfico mostrando os resultados de um experimento de estimulação de IL-Ιβ in vitro para os anticorpos designados AB5 e AB7, bem como para Kineret®.

A Fig. 13 é um histograma mostrando os resultados de um experimento de estimulação de IL-Ιβ in vitro para os anticorpos designados 25 AB5eABl.

A Fig. 14 é um histograma mostrando os resultados de um experimento de estimulação de IL-Ιβ in vitro para os anticorpos designados AB5 e AB7.

A Fig. 15 é uma Western blot mostrando os resultados de experimentos de reatividade-cruzada para o anticorpo designado AB7 com IL-Ιβ de macaco cynomolgus e macaco rhesus.

A Fig. 16 é uma Western blot mostrando os resultados de experimentos de reatividade-cruzada para o anticorpo designado AB7 com 5 IL-1 β de cão, porco-da-índia, porco e coelho.

A Fig. 17 é uma Western blot mostrando o resultado de experimentos de reatividade-cruzada para o anticorpo designado AB7 com IL-Ιβ humana recombinante, de camundongo e rato.

A Fig. 18 é um gráfico mostrando os resultados de um ||0 experimento in vitro para o anticorpo designado AB7 e para Kineret® envolvendo produção de IL-8 IL-1-induzida.

* A Fig. 19 é um gráfico mostrando os resultados de um ensaio para examinar se os presentes anticorpos impedem a IL-Ιβ de se ligar ao receptor de IL-1 do tipo I.

A Fig. 20 é uma ilustração de um ensaio para examinar se os presentes av s impedem a IL-Ιβ de se ligar ao receptor de IL-1 do tipo I.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A presente invenção abrange novos anticorpos e fragmentos à IL-Ιβ tendo afinidade e potência desejadas. Como um aspecto da presente “20 invenção, anticorpos de ligação à IL-Ιβ são proporcionados, os quais têm afinidade inesperadamente alta e baixas constantes de dissociação (por exemplo, menos do que 3 pM, altemativamente cerca de 1 pM ou menos) comparado com anticorpos de ligação à IL-Ιβ conhecidos. Anticorpos exemplificativos incluem os anticorpos designados AB5 e AB7 aqui. Como 25 outro aspecto da invenção, anticorpos de ligação à IL-Ιβ são proporcionados tendo uma constante de dissociação desejável (por exemplo, entre cerca de 6 pM e cerca de 50 pM) e IC₅o desejável (por exemplo, menos de 500 pM) para inibição de liberação IL-^-estimulada de IL-6 de fibroblastos humanos. Anticorpos exemplificativos incluem o anticorpo designado AB1 aqui.

A presente invenção também abrange anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ que se ligam seletivamente à IL-Ιβ pelo fato de que eles se ligam à IL-Ιβ com maior afinidade do que a outros fragmentos. Os anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL5 1β podem se ligar seletivamente à IL-Ιβ humana, mas também se ligam detectavelmente à IL-Ιβ não-humana. Alternativa ou adicionalmente, os anticorpos ou fragmentos podem se ligar à IL-Ιβ humana e à IL-Ιβ de pelo menos um outro mamífero (um primeiro mamífero) e não à IL-Ιβ de pelo menos um outro mamífero (um segundo mamífero). Por exemplo, os ^0 anticorpos ou fragmentos podem se ligar a uma ou mais de IL-Ιβ de roedor, IL-Ιβ de primata, IL-Ιβ de cão e IL-Ιβ de coelho e/ou não se ligar à IL-Ιβ de < porco-da-índia. Alternativa ou adicionalmente, os anticorpos ou fragmentos podem se ligar à IL-Ιβ de camundongo com maior afinidade do que à IL-Ιβ de rato. Alternativa ou adicionalmente, os anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou 15 fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ter a mesma ou substancialmente a mesma potência contra IL-Ιβ humana e IL-Ιβ de primata. Alternativa ou adicionalmente, os anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ter a mesma ou substancialmente a mesma potência contra ILΙβ humana recombinante e IL-Ιβ de primata. Alternativa ou adicionalmente, “20 os anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ter a mesma ou substancialmente a mesma potência contra IL-Ιβ humana recombinante e IL-Ιβ humana endógena. Alternativa ou adicionalmente, os anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem neutralizar a IL-Ιβ de camundongo.

Conforme usado aqui, um anticorpo ou fragmento que se liga especificamente a um antígeno alvo se refere a um anticorpo que se liga ao antígeno alvo com maior afinidade do que a antígenos similares. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento é específico para seu antígeno cognato quando as regiões variáveis do anticorpo ou fragmento reconhecem e se ligam ao antígeno cognato com uma preferência detectável (distinguindo o antígeno de outros polipeptídeos conhecidos da mesma família em virtude de diferenças mensuráveis na afinidade de ligação, a despeito de possível existência de identidade, homologia ou similaridade de seqüência localizada entre membros 5 de família). Deve ser compreendido que anticorpos e fragmentos específicos também podem interagir com outras proteínas (por exemplo, proteína A de S aureus ou outros anticorpos em técnicas de ELISA) através de interações com seqüências fora da região variável dos anticorpos e, em particular, na região constante do anticorpo ou fragmento. Ensaios de seleção para determinar a ή|0 especificidade de ligação de um anticorpo são bem conhecidos e rotineiramente praticados na técnica. Para uma discussão compreensiva de < tais ensaios veja Harlow e colaboradores (Eds), Antibodies A Laboratory Manual^ Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Capítulo 6.

Um aspecto da presente invenção abrange anticorpos de ligação à IL-Ιβ e fragmentos de ligação à IL-Ιβ dos mesmos tendo constantes de dissociação (K_D) inesperadamente baixas, por exemplo, menos de 3 pM, altemativamente 2 pM ou menos, altemativamente 1 pM ou menos, altemativamente 0,8 pM ou menos, altemativamente 0,74 pM ou menos, “20 altemativamente 0,72 pM ou menos, altemativamente 0,7 pM ou menos, altemativamente 0,6 pM ou menos, altemativamente 0,56 pM ou menos, altemativamente 0,5 pM ou menos, altemativamente 0,3 pM ou menos, altemativamente 0,26 pM ou menos, altemativamente 0,24 pM ou menos, altemativamente 0,2 pM ou menos. Assim, em algumas modalidades da presente invenção, anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ser descritos através de referência a um limite alto de uma faixa de constantes de dissociação. Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades da presente invenção, anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ser descritos através de referência a um limite baixo de uma faixa de constantes de dissociação tais como, por exemplo, um anticorpo ou fragmento tendo uma constante de dissociação de 0,07 pM ou maior, alternativamente 0,1 pM ou maior, alternativamente 0,11 pM ou maior, alternativamente 0,15 pM ou maior, alternativamente 0,2 pM ou maior, alternativamente 0,24 pM ou maior, 5 alternativamente 0,26 pM ou maior, alternativamente 0,3 pM ou maior, alternativamente 0,5 pM ou maior, alternativamente 0,7 pM ou maior. Qualquer constante de dissociação maior e constante de dissociação menor, conforme especificado acima, pode ser combinada para definir uma faixa de constantes de dissociação, contanto que o valor menor selecionado seja igual ^0 a ou menor do que o maior valor selecionado.

I

Outro aspecto da presente invenção proporciona novos . anticorpos de ligação à IL-1 β e fragmentos de ligação à IL-Ιβ dos mesmos os quais se ligam à IL-Ιβ com uma constante de dissociação maior do que 6 pM e menor do que ou igual a 50 pM, alternativamente entre cerca de 13 pM e 15 cerca de 25 pM e onde o anticorpo ou fragmento tem uma IC₅₀ para inibição de liberação IL-^-estimulada de IL-6 de fibroblastos humanos que é menor do que 0,5 nM (500 pM), alternativamente entre cerca de 5 pM e cerca de 200 pM, alternativamente entre cerca de 10 pM e cerca de 100 pM, alternativamente cerca de 30 pM. Considera-se que pode ser desejável io proporcionar um anticorpo ou fragmento de ligação à IL-Ιβ tendo a afinidade e potência de ligação precedentes para alguns métodos de tratamento ou prevenção de condições ou doenças mediadas pela IL-Ιβ. Anticorpos exemplificativos incluem o anticorpo designado AB1 aqui.

Os presentes anticorpos e fragmentos se ligam à IL-Ιβ com alta afinidade, conforme indicado pelas constantes de dissociação apresentadas aqui. Constantes de afinidade que caracterizam as afinidades de anticorpos a antígenos podem ser constantes de associação medidas pela cinética de formação de complexo de antígeno-anticorpo. Alternativamente, a afinidade de ligação pode ser caracterizada por uma constante de dissociação a qual é o inverso da constante de associação. O termo K_D, conforme usado aqui, se destina a se referir à constante de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno.

A presente invenção também abrange anticorpos de neutralização ou fragmentos de neutralização dos mesmos os quais se ligam à IL-Ιβ de modo a neutralizar a atividade biológica da IL-Ιβ. Neutralização de atividade biológica de IL-Ιβ pode ser avaliada através de ensaios para um ou mais indicadores de atividade biológica de IL-Ιβ, tal como liberação IL-Ιβestimulada de IL-6 de fíbroblastos humanos ou outras células, liberação IL|0 Ιβ-induzida de IL-8 de células sangüíneas ou proliferação IL-1-induzida de células T auxiliares. De preferência, os anticorpos e fragmentos de ligação à . IL-Ιβ da presente invenção neutralizam a atividade biológica de IL-Ιβ conectada à função de sinalização do receptor de IL-1 do tipo I (IL-1 RI) ligado pela IL-Ιβ.

Em geral, os anticorpos e fragmentos de neutralização da presente invenção podem neutralizar a atividade biológica de IL-Ιβ, a despeito de se a ligação de IL-Ιβ ao receptor de IL-1 do tipo I está bloqueada. Mais preferivelmente, os anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ neutralizam a atividade biológica de IL-Ιβ através de ligação “20 à IL-Ιβ, sem impedir substancialmente a ligação de IL-Ιβ ao receptor de IL-1 do tipo I. Uma vantagem potencial de tais anticorpos e fragmentos é que eles podem se ligar e neutralizar IL-Ιβ, ao mesmo tempo em que ainda permitem que a IL-Ιβ se ligue ao IL-1 RI. Isso pode resultar em uma redução eficaz na atividade biológica de IL-1 a, bem como atividade biológica de IL-Ιβ, uma 25 vez que há menos sítios sobre o IL-1 RI não ligados para que a IL-1 se ligue aos mesmos. Assim, anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ da presente invenção são úteis em métodos onde é desejável neutralizar a atividade biológica de IL-1 in vitro ou in vivo.

Os presentes anticorpos ou fragmentos podem ser anticorpos ou fragmentos de neutralização os quais se ligam especificamente a um epítopo de IL-Ιβ que afeta a atividade biológica de IL-Ιβ. Os presentes anticorpos ou fragmentos podem se ligar a um epítopo sensível à neutralização da IL-Ιβ. Quando um epítopo sensível à neutralização de IL-Ιβ 5 está ligado a um dos presentes anticorpos ou fragmentos, o resultado é uma perda de atividade biológica da IL-Ιβ contendo o epítopo.

Em algumas modalidades, os anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ter uma IC₅₀ para inibição de liberação IL-1 β-estimulada de IL-Ιβ de células sangüíneas que é menos do que 50 pM, 10 altemativamente cerca de 25 pM ou menos, altemativamente cerca de 10 pM |

ou menos, altemativamente cerca de 2 pM ou menos. IC₅₀ para inibição de . liberação IL-1 β-estimulada de IL-Ιβ de células sangüíneas se refere à concentração requerida para inibir 50% da IL-8 liberada através de estimulação de células sangüíneas pela IL-Ιβ. Anticorpos exemplificativos 15 incluem o anticorpo designado AB7 aqui.

A presente invenção também abrange um anticorpo de ligação à IL-Ιβ ou fragmento de ligação à IL-Ιβ do mesmo compreendendo uma seqüência de aminoácido alterada, em que o aminoácido alterado tem uma ou pelo menos uma substituição, adição ou deleção de uma seqüência de =Í0 aminoácido inicial selecionada de SEQ ID NOS: 27 ou 28 (ou qualquer uma das outras seqüências divulgadas aqui), onde o anticorpo ou fragmento alterado tem a mesma ou substancialmente a mesma afinidade e especificidade de ligação a epítopo que a seqüência de aminoácido inicial. Considera-se que uma ou mais substituições, deleções ou adições podem ser 25 feitas nos anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ proporcionados aqui, tais como anticorpos ou fragmentos compreendendo SEQ ID NO: 28 e/ou SEQ ID NO: 27, ao mesmo tempo em que mantém a mesma ou substancialmente a mesma afinidade e especificidade de ligação a epítopo do anticorpo ou fragmento inicial. Por exemplo, a presente invenção abrange um anticorpo de ligação à IL-1 β ou fragmento de ligação à IL-1 β do mesmo compreendendo uma seqüência de aminoácido alterada, em que o aminoácido alterado tem uma ou pelo menos uma substituição, adição ou deleção com relação a uma seqüência de aminoácido inicial compreendendo 5 SEQ ID NO: 8 (ou qualquer uma das outras seqüências divulgadas aqui que podem ser usadas como uma seqüência inicial), onde o anticorpo ou fragmento alterado tem a mesma ou substancialmente a mesma afinidade e especificidade de ligação a epítopo que a seqüência de aminoácido inicial compreendendo SEQ ID NO: 8 (ou a seqüência particular que está sendo |0 usada como a seqüência de aminoácido inicial). Pela frase substancialmente a mesma” afinidade, entenda-se que a afinidade ou constante de dissociação, conforme determinado através dos ensinamentos aqui, não é aumentada ou diminuída mais do que a variação inerente no ensaio para um anticorpo ou fragmento compreendendo SEQ ID NOs: 28 ou 27, tal como a variação 15 observada quando realizada três ou mais vezes independentes. Quando de comparação de um anticorpo ou fragmento compreendendo SEQ ID NOs: 28 ou 27, entenda-se que a comparação deverá ser feita entre a seqüência de aminoácido alterada e a seqüência de aminoácido inicial da qual a uma ou mais substituições, deleções ou adições foram feitas, tal como a seqüência άθ inicial sendo idêntica em todos os outros aminoácidos.

Anticorpos, Anticorpos Humanizados e Anticorpos Humanos Manipulados

Os anticorpos da presente invenção podem ser proporcionados como anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (mAbs), anticorpos 25 recombinantes, anticorpos quiméricos, anticorpos CDR-enxertados, anticorpos totalmente humanos, anticorpos com cadeia simples e/ou anticoipos biespecíficos, bem como fragmentos, incluindo variantes e derivados dos mesmos, proporcionados através de técnicas conhecidas incluindo, mas não limitado a, divagem enzimática, síntese de peptídeo ou técnicas recombinantes.

Anticorpos geralmente compreendem dois polipeptídeos de cadeia pesada e dois polipeptídeos de cadeia leve, embora anticorpos com um único domínio tendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve e anticorpos de 5 cadeia pesada desprovidos de cadeias leves também sejam considerados. Existem cinco tipos de cadeias pesadas, denominadas alfa, delta, epsilon, gama e mu, baseado na seqüência de aminoácido do domínio constante de cadeia pesada. Esses diferentes tipos de cadeia pesada dão origem a cinco classes de anticorpo, IgA (incluindo IgA! e IgA₂), IgD, IgE, IgG e IgM, ]0 respectivamente, incluindo quatro subclasses de IgG, a saber, IgGi, IgG₂, IgG₃ e IgG4. Existem também dois tipos de cadeias leves, denominadas kappa « (K) ou lambda (λ), baseado na seqüência de aminoácido dos domínios constantes. Um anticorpo de comprimento total inclui um domínio constante e um domínio variável. A região constante não precisa estar presente em um 15 fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo. Fragmentos de ligação a antígeno de um anticorpo divulgados aqui podem incluir os fragmentos de ligação de anticorpo Fab, Fab', F(ab')₂ e F(v). Conforme discutido em maiores detalhes abaixo, fragmentos de ligação à IL-ίβ abrangem fragmentos de anticorpo e polipeptídeos de ligação a antígeno que se ligam à IL-Ιβ.

~20 Cada uma das seqüências de cadeia pesada e de cadeia leve de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo inclui uma região variável com três regiões de determinação de complementaridade (CDRs), bem como regiões de estrutura de não-CDR (FRs). Os termos cadeia pesada e cadeia leve, conforme usado aqui, significam a região variável de cadeia 25 pesada e a região variável de cadeia leve, respectivamente, a menos que de outro modo mencionado. CDRs de cadeia pesada são referidas aqui como CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3. CDRs de cadeia leve são referidas aqui como CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3. Regiões variáveis e CDRs em uma seqüência de anticorpo podem ser identificadas (i) de acordo com regras gerais que foram desenvolvidas na técnica ou (ii) através de alinhamento das seqüências contra um banco de dados de regiões variáveis conhecidas. Métodos para identificação dessas regiões são descritos em Kontermann e Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001 e Dinarello e 5 colaboradores, Current Protocols in Immunology, John Wiley e Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000. Bancos de dados de seqüências de anticorpo são descritos em e podem ser acessados através do banco de dados The Kabatman em www.bioinf.org.ulc/abs (mantido por A.C. Martin no Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London, Londres, ^0 Inglaterra) e VBASE2 em www.vbase2.org, conforme descrito em Retter e colaboradores, Nucl. Acids Res., 33 (edição de banco de dados): D671-D674 « (2005). O web site do banco de dados Kabatman também inclui regras gerais de manuseio para identificação de CDRs. O termo CDR, conforme usado aqui, é conforme definido em Kabat e colaboradores, Sequences of 15 Immunological Interest, 5^a ed., US Department of Health and Human

Services, 1991, a menos que de outro modo indicado.

A presente invenção abrange anticorpos de ligação à IL-Ιβ que incluem duas cadeias pesadas de comprimento total e duas cadeias leves de comprimento total. Altemativamente, os anticorpos de ligação à IL-Ιβ podem io ser estruturas tais como anticorpos com uma única cadeia ou mini anticorpos que retêm a atividade de ligação à IL-1 β. Tais estruturas podem ser preparadas através de métodos conhecidos na técnica tais como, por exemplo, a clonagem e montagem PCR-mediada de anticorpos com uma única cadeia para expressão em E. coli (conforme descrito em Antibody Engineering, The 25 practical approach series, J. McCafferty. H. R. Hoogenboom e D. J. Chiswell editores, Oxford University Press, 1996). Nesse tipo de estrutura, as porções variáveis das cadeias pesada e leve de uma molécula de anticorpo são amplificadas por PCR a partir de cDNA. Os amplicons resultantes são, então, montados, por exemplo, em uma segunda etapa de PCR, através de um DNA ligante que codifica um ligante de proteína flexível composto dos aminoácidos Gly e Ser. Esse ligante permite que as porções de cadeia pesada e leve variáveis se dupliquem de uma forma que a bolsa de ligação do antígeno é regenerada e o antígeno é ligado com afinidades freqüentemente 5 comparáveis à molécula de imunoglobulina dimérica de comprimento total precursora.

Os anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ da presente invenção abrangem variantes dos anticorpos, fragmentos e seqüências exemplificativos divulgados aqui. Variantes incluem peptídeos e 10 polipeptídeos compreendendo uma ou mais substituições, deleções e/ou adições na seqüência de aminoácido que têm a mesma ou substancialmente a mesma afinidade e especificidade de ligação a epítopo que um ou mais dos anticorpos, fragmentos e seqüências exemplificativos divulgados aqui. Assim, variantes incluem peptídeos e polipeptídeos compreendendo uma ou mais 15 substituições, deleções e/ou adições na seqüência de aminoácido aos anticorpos, fragmentos e seqüências exemplificativos divulgados aqui onde tais substituições, deleções e/ou adições não causam alterações substanciais na afinidade e especificidade de ligação a epítopo. Por exemplo, uma variante de um anticorpo ou fragmento pode resultar de uma ou mais alterações em um tO anticorpo ou fragmento compreendendo uma ou mais das seqüências de aminoácido de SEQ ID NOS: 1-35 ou 42-57, onde o anticorpo ou fragmento alterado tem a mesma ou substancialmente a mesma afinidade e especificidade de ligação a epítopo que a seqüência inicial. Variantes podem ocorrer naturalmente, tais como variantes alélicas ou splice ou podem ser 25 artificialmente construídas. Variantes podem ser preparadas a partir das moléculas de ácido nucleico correspondentes que codificam as referidas variantes. Variantes dos presentes anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ter alterações nas seqüências de aminoácido de cadeia leve e/ou pesada que ocorrem naturalmente e são introduzidas através de manipulação in vitro de seqüências nativas usando técnicas de DNA recombinante. Variantes que ocorrem naturalmente incluem variantes somáticas as quais são geradas in vivo nas seqüências de nucleotídeo de linhagem germinativa correspondentes durante a geração de uma resposta de anticorpo a um 5 antígeno estranho.

Variantes de anticorpos de ligação à IL-Ιβ e fragmentos de ligação à IL-Ιβ também podem ser preparados através de técnicas de mutagênese. Por exemplo, alterações de aminoácido podem ser introduzidas aleatoriamente através de uma região de codificação de anticorpo e as |0 variantes resultantes podem ser selecionadas com relação à afinidade de ligação à IL-Ιβ ou outra propriedade. Altemativamente, alterações de . aminoácido podem ser introduzidas em regiões selecionadas de um anticorpo à IL-Ιβ, tal como nas CDRs de cadeia leve e/ou pesada e/ou nas regiões de estrutura e os anticorpos resultantes podem ser selecionados com relação à 15 ligação à IL-Ιβ ou alguma outra atividade. Alterações de aminoácido abrangem uma ou mais substituições de aminoácido em uma CDR, oscilando de uma diferença de um único aminoácido à introdução de múltiplas permutações de aminoácidos dentro de uma determinada CDR, tal como CDR3. Em outro método, a contribuição de cada resíduo dentro de uma CDR io para a ligação à IL-Ιβ pode ser avaliada através de substituição de pelo menos um resíduo dentro da CDR por alanina. Lewis e colaboradores (1995), Mol. Immunol. 32: 1065-72. Resíduos os quais não são ótimos para ligação à IL-Ιβ podem, então, ser alterados de forma a determinar uma seqüência mais ótima. Também abrangidas são variantes geradas através de inserção de aminoácidos 25 para aumentar o tamanho de uma CDR, tal como CDR3. Por exemplo, a maioria das seqüências de CDR3 de cadeia leve têm nove aminoácidos de comprimento. Seqüências de cadeia leve em um anticorpo as quais são mais curtas do que nove resíduos podem ser otimizadas com relação à ligação à ILΙβ através de inserção de aminoácidos apropriados para aumentar o comprimento da CDR.

Variantes também podem ser preparadas através de embaralhamento de cadeia de cadeias leves ou pesadas. Marks e colaboradores (1992), Biotechnology 10: 779-83. Uma única cadeia leve (ou 5 pesada) pode ser combinada com uma biblioteca tendo um repertório de cadeias pesadas (ou leves) e a população resultante é selecionada com relação a uma atividade desejada, tal como ligação à IL-Ιβ. Isso permite seleção de uma maior amostra de diferentes cadeias pesadas (ou leves) em combinação com uma única cadeia leve (ou pesada) que é possível com bibliotecas |0 compreendendo repertórios de cadeias pesadas e leves.

Os anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ da presente , invenção abrangem derivados dos anticorpos, fragmentos e seqüências exemplificativos divulgados aqui. Derivados incluem polipeptídeos ou peptídeos ou variantes, fragmentos ou derivados dos mesmos, os quais foram 15 quimicamente modificados. Exemplos incluem fixação covalente de um ou mais polímeros, tais como polímeros solúveis em água, carboidratos Nligados ou O-ligados, açúcares, fosfatos e/ou outras de tais moléculas. Os derivados são modificados de uma maneira que é diferente do peptídeo ou peptídeos iniciais ou que ocorrem naturalmente, quer quanto ao tipo ou Í0 localização das moléculas presas. Derivados ainda incluem deleção de um ou mais grupos químicos os quais estão naturalmente presentes sobre o peptídeo ou polipeptídeo.

Os anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ da presente invenção podem ser biespecíficos. Anticorpos ou fragmentos biespecíficos 25 podem ser de várias configurações. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem se assemelhar a anticorpos simples (ou fragmentos de anticorpo), mas têm dois sítios de ligação a antígeno diferentes (regiões variáveis). Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos através de técnicas químicas (Kranz e colaboradores (1981), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78: 5807), através de técnicas de polidoma (Pat. US No. 4.474.893) ou através de técnicas de DNA recombinante. Anticorpos biespecíficos da presente invenção podem ter especificidades de ligação por pelo menos dois epítopos diferentes, pelo menos um dos quais é um epítopo de IL-Ιβ. Os anticorpos e fragmentos de 5 ligação à IL-Ιβ também podem ser hetero-anticorpos. Hetero-anticorpos são dois ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação de anticorpo (Fab) ligados juntos, cada anticorpo ou fragmento tendo uma especificidade diferente.

Técnicas para criação de versões de DNA recombinante das regiões de ligação a antígeno das moléculas de anticorpo as quais ultrapassam |0 a geração de anticorpos monoclonais são consideradas para os presentes anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ. DNA é clonado em um sistema de expressão bacteriano. Um exemplo de tal técnica adequada para a prática da presente invenção usa um sistema de vetor lambda de bacteriófago tendo uma seqüência líder que faz com que a proteína de Fab expressa migre para o 15 espaço periplásmico (entre a membrana da célula bacteriana e a parede celular) ou seja secretada. Pode-se gerar e selecionar rapidamente grandes números de fragmentos Fab funcionais para aqueles os quais se ligam à IL-Ιβ. Tais agentes de ligação à IL-Ιβ (fragmentos Fab com especificidade por um polipeptídeo de IL-Ιβ) são especificamente abrangidos dentro dos anticorpos ÍO e fragmentos de ligação à IL-Ιβ da presente invenção.

Os presentes anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ser humanizados ou anticorpos humanos manipulados. Conforme usado aqui, um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é um polipeptídeo recombinante que compreende uma porção de um 25 sítio de ligação a antígeno de um anticorpo não-humano e uma porção da estrutura e/ou regiões constantes de um anticorpo humano. Um anticorpo ou fragmento de anticorpo humano manipulado é um anticorpo não-humano (por exemplo, camundongo) que foi manipulado através de modificação (por exemplo, deleção, inserção ou substituição) de aminoácidos em posições específicas de modo a reduzir ou eliminar qualquer imunogenicidade detectável do anticorpo modificado em um ser humano.

Anticorpos humanizados incluem anticorpos quiméricos e anticorpos CDR-enxertados. Anticorpos quiméricos são anticorpos que 5 incluem uma região variável de anticorpo não-humano ligada a uma região constante humana. Assim, em anticorpos quiméricos, a região variável é principalmente não-humana e a região constante é humana. Anticorpos quiméricos e métodos para fabricação dos mesmos são descritos em Morrison e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 6841-6855 (1984), 10 Boulianne e colaboradores, Nature, 312: 643-646 (1984) e Publicação de

I

Pedido PCT WO 86/01533. Embora eles possam ser menos imunogênicos do que um anticorpo monoclonal de camundongo, administrações de anticorpos quiméricos foram associadas à respostas imunes humanas (HAMA) à porção não-humana dos anticorpos. Anticorpos quiméricos também podem ser 15 produzidos através de splicing dos genes de uma molécula de anticorpo de camundongo de especificidade de ligação a antígeno apropriada junto com genes de uma molécula de anticorpo humano de atividade biológica apropriada, tal como a capacidade de ativar complemento humano e mediar a ADCC. Morrison e colaboradores (1984), Proc. Natl. Acad. Sei., 81: 6851; 4:0 Neuberger e colaboradores (1984), Nature, 312: 604. Um exemplo é a substituição de uma região Fc por aquela de um isotipo diferente.

Anticorpos CDR-enxertados são anticorpos que incluem as CDRs de um anticorpo doador” não-humano ligadas à região de estrutura de um anticorpo recipiente” humano. Em geral, anticorpos CDR-enxertados 25 incluem mais seqüências de anticorpo humano do que anticorpos quiméricos porque eles incluem ambas as seqüências de região constante e seqüências de região variável (estrutura) de anticorpos humanos. Assim, por exemplo, um anticorpo humanizado CDR-enxertado da invenção pode compreender uma cadeia pesada que compreende uma seqüência de aminoácido contínua (por exemplo, cerca de 5 ou mais, 10 ou mais ou mesmo 15 ou mais resíduos de aminoácido contínuos) da região de estrutura de um anticorpo humano (por exemplo, FR-1, FR-2 ou FR-3 de um anticorpo humano) ou, opcionalmente, a maioria ou toda a região de estrutura inteira de um anticorpo humano.

Anticorpos CDR-enxertados e métodos para fabricação dos mesmos são descritos em Jones e colaboradores, Nature, 321: 522-525 (1986), Riechmann e colaboradores, Nature, 332: 323-327 (1988) e Verhoeyen e colaboradores, Science, 239: 1534-1536 (1988)). Métodos que podem ser usados para produzir anticorpos humanizados também são descritos nas Patentes US Nos.

|0 4.816.567, 5.721.367, 5.837.243 e 6.180.377. Anticorpos CDR-enxertados ' são considerados menos prováveis do que anticorpos quiméricos de induzir a . uma reação imune contra porções de anticorpo não-humano. Contudo, foi reportado que seqüências de estrutura dos anticorpos doadores são requeridas para a afinidade de ligação e/ou especificidade do anticorpo doador, presumivelmente porque essas seqüências de estrutura afetam a duplicação da porção de ligação a antígeno do anticorpo doador. Portanto, quando doador, seqüências de CDR não-humanas são enxertadas sobre seqüências de estrutura humanas inalteradas, o anticorpo CDR-enxertado resultante pode exibir, em alguns casos, perda de avidez de ligação com relação ao anticorpo to doador não-humano original. Veja, por exemplo, Riechmann e colaboradores,

Nature, 332: 323-327 (1988) e Verhoeyen e colaboradores, Science, 239: 1534-1536(1988).

Anticorpos humanos manipulados incluem anticorpos embutidos” e anticorpos preparados usando a tecnologia HUMAN 25 ENGINEERING™ (XOMA (US) LLC, Berkeley, CA). A tecnologia HUMAN ENGINEERING™ está comercialmente disponível e envolve alteração de um anticorpo ou fragmento de anticorpo não-humano, tal como um anticorpo de camundongo ou quimérico ou fragmento de anticorpo, fazendo alterações específicas na seqüência de aminoácido do anticorpo de modo a produzir um anticorpo modificado com imunogenicidade reduzida em um ser humano que, todavia, retém as propriedades de ligação desejáveis dos anticorpos não-humanos originais. Em geral, a técnica envolve classificação de resíduos de aminoácido de um anticorpo não-humano (por exemplo, 5 camundongo) como resíduos de baixo risco, risco moderado e alto risco. A classificação é realizada usando um cálculo de risco/recompensa global que avalia os benefícios previstos de fazer uma substituição em particular (por exemplo, com relação à imunogenicidade em seres humanos) contra o risco de que a substituição afete a duplicação e/ou propriedades de 10 ligação a antígeno do anticorpo resultante. Assim, uma posição de baixo risco é uma para a qual uma substituição é prevista como sendo benéfica porque é previsto que ela reduza a imunogenicidade sem afetar signifícativamente as propriedades de ligação a antígeno. Uma posição de risco moderado é uma para a qual uma substituição é prevista como reduzindo a imunogenicidade, 15 mas é mais provável de afetar a duplicação de proteína e/ou ligação a antígeno. Posições de alto risco contêm resíduos mais prováveis de estarem envolvidos na duplicação ou ligação a antígeno apropriada. Em geral, posições de baixo risco em um anticorpo não-humano são substituídas por resíduos humanos, posições de alto risco raramente são substituídas e 4d0 substituições para humanização em posições de risco moderado são feitas algumas vezes, embora não indiscriminadamente. Posições com prolinas na seqüência da região variável de anticorpo não-humano são usualmente classificadas como posições de risco pelo menos moderado.

O resíduo de aminoácido humano a ser substituído em particular em uma determinada posição de baixo risco ou risco moderado de uma seqüência de anticorpo não-humano (por exemplo, camundongo) podem ser selecionadas através de alinhamento de uma seqüência de aminoácido das regiões variáveis de anticorpo não-humano com a região correspondente de uma seqüência de anticorpo humano de consenso ou específica. Os resíduos de aminoácido em posições de risco baixo ou moderado na seqüência nãohumana podem ser substituídos pelos resíduos correspondentes na seqüência de anticorpo humano de acordo com o alinhamento. Técnicas para fazer proteínas humanas manipuladas são descritas em maiores detalhes em 5 Studnicka e colaboradores, Protein Engineering, 7: 805-814 (1994), Patentes

US 5.766.886, 5.770.196, 5.821.123 e 5.869.619 e Publicação de Pedido PCT WO 93/11794.

Anticorpos embutidos” são anticorpos não-humanos ou humanizados (por exemplo, anticorpos quiméricos ou CDR-enxertados) que 10 foram manipulados para substituir determinados resíduos de aminoácido expostos a solvente de modo a reduzir adicionalmente sua imunogenicidade , ou intensificar sua função. Uma vez que presume-se que resíduos na superfície de um anticorpo quimérico são menos prováveis de afetar a duplicação apropriada do anticorpo e mais prováveis de estimular uma reação 15 imune, embutimento de um anticorpo quimérico pode incluir, por exemplo, identificação de resíduos expostos a solvente na região de estrutura de um anticorpo quimérico e substituição de pelo menos um deles pelos resíduos de superfície correspondentes de uma região de estrutura humana. Embutimento pode ser realizado através de qualquer técnica de manipulação adequada, +θ incluindo o uso da tecnologia HUMAN ENGINEERING™ acima descrita.

Em uma abordagem diferente, uma recuperação da avidez de ligação pode ser obtida através de desumanização de um anticorpo CDRenxertado. Desumanização pode incluir restauração de resíduos das regiões de estrutura do anticorpo doador ao anticorpo CDR-enxertado, desse modo, 25 restaurando a duplicação apropriada. Similar desumanização pode ser obtida através de (i) inclusão de porções da região de estrutura do doador no anticorpo recipiente ou (ii) enxerto de porções da região de estrutura do anticorpo doador no anticorpo recipiente (ao longo das CDRs enxertadas do doador).

Para uma discussão adicional de anticorpos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos manipulados e métodos para seu preparo veja Kontermann e Dubel, eds, Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001.

Anticorpos humanizados ou humanos manipulados exemplifícativos incluem anticorpos de IgG, IgM, IgE, IgA e IgD. Os presentes anticorpos podem ser de qualquer classe (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, etc.) ou isotipo e podem compreender uma cadeia leve kappa ou lambda. Por exemplo, um anticorpo humano pode compreender uma cadeia pesada de IgG ou fragmento definido, tal como pelo menos um dos isotipos IgGl, IgG2, ¹ IgG3 ou IgG4. Como um outro exemplo, os presentes anticorpos ou fragmentos podem compreender uma cadeia pesada de IgGl e uma cadeia leve de IgGl.

Os presentes anticorpos e fragmentos podem ser anticorpos humanos, tais como anticorpos os quais de ligam a polipeptídeos de IL-Ιβ e são codificados por seqüências de ácido nucleico as quais são variantes somáticas que ocorrem naturalmente da seqüência de ácido nucleico de imunoglobulina de linhagem germinativa humana e fragmentos, variantes sintéticas, derivados e fusões dos mesmos. Tais anticorpos podem ser L10 produzidos através de qualquer método conhecido na técnica, tal como através do uso de mamíferos transgênicos (tais como camundongos transgênicos) nos quais o repertório de imunoglobulina nativa tenha sido substituído por V-genes humanos no cromossoma do mamífero. Tais mamíferos parecem trazer recombinante VDJ e hipermutação somática dos 25 genes de anticorpo de linhagem germinativa humana de uma modo normal, assim, produzindo anticorpos de alta afinidade com seqüências completamente humanas.

Anticorpos humanos também podem ser gerados através da seleção in vitro de bibliotecas de anticorpo de phage display. Veja

Hoogenboom e colaboradores (1991), J. Mol. Biol. 227: 381; e Marks e colaboradores (1991), J. Mol. Biol. Ί22-. 581. Várias bibliotecas de phage display contendo anticorpo foram descritas e podem ser prontamente preparadas. Bibliotecas podem conter uma diversidade de seqüências de 5 anticorpo humano, tais como os fragmentos Fab, Fv e scFv humanos, que podem ser selecionadas contra um alvo apropriado. Bibliotecas de phage display podem compreender outros peptídeos ou proteínas que não anticorpos os quais podem ser selecionados para identificar agentes de ligação à IL-Ιβ seletivos.

Os anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ¹ compreender uma ou mais porções que não se ligam à IL-Ιβ, mas antes, são responsáveis por outras funções, tais como meia-vida em circulação, cascata de complemento endógeno do recipiente ou citotoxicidade celular endógena. Os anticorpos ou fragmentos podem compreender toda ou uma parte da região 15 constante e podem ser de qualquer isotipo, incluindo IgA (por exemplo, IgAl ou IgA2), IgD, IgE, IgG (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4) ou IgM. Além de ou ao invés de compreender uma região constante, compostos de ligação a antígeno da invenção podem incluir uma tag de epítopo, um epítopo de receptor de salvamento, uma porção de rotulação para fins diagnósticos ou 40 de purificação ou uma porção citotóxica, tal como um radionuclídeo ou toxina.

A região constante (quando presente) dos presentes anticorpos e fragmentos pode ser do tipo γΐ, γ2, γ3, γ4, μ, β2 ou δ, de preferência do tipo γ, mais preferivelmente do tipo γ, enquanto que a parte constante da cadeia 25 leve humana pode ser do tipo κ ou λ (a qual inclui os subtipos λΐ, λ2 e λ3), mas é, de preferência, do tipo κ.

Variantes também incluem anticorpos ou fragmentos compreendendo uma região Fc modificada, em que a região Fc modificada compreende pelo menos uma modificação de aminoácido com relação a uma região Fc do tipo silvestre. A região Fc variável pode ser projetada, com relação a uma molécula comparável compreendendo a região Fc do tipo silvestre, de modo a se ligar a receptores de Fc com uma afinidade maior ou menor.

Por exemplo, os presentes anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem compreender uma região Fc modificada. Região Fc se refere a polipeptídeos sintéticos ou que ocorrem naturalmente homólogos ao domínio C-terminal de IgG que são produzidos quando de digestão de IgG com papaína. Fc de IgG tem um peso molecular de aproximadamente 50 kD. Nos 10 presentes anticorpos e fragmentos, uma região Fc inteira pode ser usada ou ¹ apenas uma porção de intensificação de meia-vida. Além disso, muitas modificações na seqüência de aminoácido são aceitáveis, uma vez que atividade nativa não é, em todos os casos, necessária ou desejada.

A região Fc pode sofrer mutação, se desejado, para inibir sua capacidade de se fixar a complemento e se ligar ao receptor de Fc com alta afinidade. Para Fc de IgG de murino, substituição de resíduos de Ala por Glu 318, Lys 320 e Lys 322 toma a proteína incapaz de dirigir ADCC. Substituição de Glu por Leu 235 inibe a capacidade da proteína de se ligar ao receptor de Fc com alta afinidade. Várias mutações para IgG humana também ziO são conhecidas (veja, por exemplo, Morrison e colaboradores, 1994, The Immunologist 2: 119 124 e Brekke e colaboradores, 1994, The Immunologist 2: 125).

Em algumas modalidades, os presentes anticorpos ou fragmentos são proporcionados com uma região Fc modificada onde uma 25 região Fc que ocorre naturalmente é modificada para aumentar a meia-vida do anticorpo ou fragmento em um ambiente biológico, por exemplo, a meia-vida no soro ou uma meia-vida medida através de um ensaio in vitro. Métodos para alteração da forma original de uma região Fc de uma IgG também são descritos na Patente US No. 6.998.253.

Em determinadas modalidades, pode ser desejável modificar o anticorpo ou fragmento de forma a aumentar sua meia-vida no soro, por exemplo, adição de moléculas tal como PEG ou outros polímeros solúveis em água, incluindo polímeros de polissacarídeo, a fragmentos de anticorpo para 5 aumentar a meia-vida. Isso pode ser obtido também, por exemplo, através de incorporação de um epítopo de ligação a receptor de salvamento no fragmento de anticorpo (por exemplo, através de mutação da região apropriada no fragmento de anticorpo ou através de incorporação do epítopo em uma tag peptídica que é, então, fundido ao fragmento de anticorpo em uma 10 extremidade ou no meio, por exemplo, através de síntese de DNA ou * peptídeo) (veja Publicação Internacional No. WO96/32478). Epítopo de ligação a receptor de salvamento se refere a um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgGl, IgG₂, IgG₃ ou IgG₄) que é responsável por aumentar a meia-vida no soro in vivo da molécula de IgG.

Um epítopo de ligação a receptor de salvamento pode incluir uma região em que qualquer um ou mais resíduos de aminoácido de um ou dois laços de um domínio de Fc são transferidos para uma posição análoga do fragmento de anticorpo. Ainda mais preferivelmente, três ou mais resíduos de um ou dois laços do domínio de Fc são transferidos. Ainda mais _0 preferivelmente, o epítopo é tomado do domínio CH2 da região Fc (por exemplo, de uma IgG) e transferido para CHI, CH3 ou região VH ou mais de uma de tais regiões do anticorpo. Alternativamente, o epítopo é tomado do domínio CH2 da região Fc e transferido para a região Cl ou região V_L, ou ambas, do fragmento de anticorpo. Veja também pedidos internacionais WO 25 97/34631 e WO 96/32478 os quais descrevem variantes de Fc e sua interação com o receptor de salvamento.

Mutação de resíduos dentro dos sítios de ligação ao receptor de Fc pode resultar em função efetuadora alterada, tal como atividade de ADCC ou CDC alterada ou meia-vida alterada. Mutações potenciais incluem inserção, deleção ou substituição de um ou mais resíduos, incluindo substituição por alanina, uma substituição conservativa, uma substituição nãoconservativa ou substituição por um resíduo de aminoácido correspondente na mesma posição de uma subclasse de IgG diferente (por exemplo, substituição 5 de um resíduo de IgGl por um resíduo de IgG2 correspondente nessa posição). Por exemplo, foi reportado que mutação do aminoácido serina na posição 241 na IgG4 por prolina (encontrada nessa posição na IgGl e IgG2) leva à produção de um anticorpo homogêneo, bem como prolongamento da meia-vida no soro e aperfeiçoamento da distribuição tecidual comparado com 0 a IgG4 quimérica original (Angal e colaboradores, Mol Immunol, 30: 105- 8, 1993).

De preferência, o anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente invenção não reage cruzadamente com qualquer outro alvo que não IL-Ιβ. Por exemplo, os presentes anticorpos e fragmentos de preferência não 15 se ligam detectavelmente à IL-1 a.

Anticorpo ou Fragmento de Anticorpo de Ligação à IL-Ιβ

Fragmentos de anticorpo são porções de um anticorpo de comprimento total intacto, tal como uma região variável ou de ligação a antígeno do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem 0 fragmentos Fab, Fab', F(ab’)₂ e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo com uma única cadeia (por exemplo, scFv); fragmentos de anticorpo multi-específicos, tais como anticorpos biespecíficos, triespecíficos e multi-específicos (por exemplo, diacorpos, triacorpos, tetracorpos); minicorpos; anticorpos recombinantes de quelação; tricorpos ou bicorpos; 25 intracorpos; nanocorpos; produtos imunofarmacêuticos modulares pequenos (SMIP), proteínas de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação; anticorpos camelizados; anticorpos contendo Vhhí e quaisquer outros polipeptídeos formados a partir de fragmentos de anticorpo.

A invenção proporciona um anticorpo de ligação à IL-Ιβ ou fragmento de ligação à IL-Ιβ do mesmo compreendendo SEQ ID NO: 2. A

Fig. 1 ilustra a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2. De preferência, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID 5 NO: 8. Anticorpos da invenção também podem compreender a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13 e, de preferência, compreendem SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15. Tipicamente, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia pesada 0 compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 (por exemplo, compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NOS: 4-8, 12-15 ou 21). A cadeia leve do anticorpo compreende, de preferência consiste essencialmente de ou consiste de, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:

1. Assim, por exemplo, a cadeia leve do anticorpo pode compreender, 15 consistir essencialmente de ou consistir da seqüência de aminoácido de SEQ

ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11. Também preferido é um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo ou fragmento de anticorpo que compreende, consiste essencialmente de ou consiste da seqüência de aminoácido de SEQ -0 ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24 (por exemplo, SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID

NO: 26).

A invenção proporciona um anticorpo de ligação à IL-Ιβ ou fragmento de ligação à IL-Ιβ do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma das seqüências de aminoácido de SEQ 25 ID NO: 2, 23 ou 24, altemativamente uma das seqüências de aminoácido de

SEQ ID NO: 12, 13, 21, 23 ou 24 ou, altemativamente, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 12, 13 ou 21 ou, altemativamente, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 ou 21 ou, altemativamente, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8, 14 ou 15 ou, altemativamente, a seqüência de

-Ο aminoácido de SEQ ID NO: 8 ou 15. Tipicamente, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve, de preferência compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11. Como um exemplo, um anticorpo preferido compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 11.

A invenção também proporciona um anticorpo de ligação à ILΙβ ou fragmento de ligação à IL-Ιβ do mesmo compreendendo uma das seqüências de aminoácido de SEQ ID NO: 28. De preferência, o anticorpo ou fragmento ainda compreende uma das seqüências de aminoácido de SEQ ID NO: 27.

A invenção também proporciona um anticorpo de ligação à ILΙβ ou fragmento de ligação à IL-Ιβ do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente de ou consistindo de SEQ ID NO: 29. De preferência, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende, consiste essencialmente de ou consiste da seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 31-35 ou, altemativamente, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 31, 32 ou 33 ou, altemativamente, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 32 ou 33. De preferência, o anticorpo ou fragmento de anticorpo ainda compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma das seqüências de aminoácido de SEQ ID NO: 27, altemativamente uma das seqüências de aminoácido de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO; 11.

As Figs. 2, 3 e 4 apresentam as regiões variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpos exemplifícativos da invenção, seqüências as quais correspondem a anticorpos referidos aqui como AB1, AB2, AB3, AB4, AB5, AB5.1, AB5.2, AB5.3 e AB5.4. As seqüências do AB5.1, AB5.2, AB5.3 e AB5.4 contêm posições variáveis, designadas como XI e X2, na região CDR3 de cadeia pesada. Essas posições variáveis podem ser qualquer um dos aminoácidos indicados. De preferência, XI e X2 são, respectivamente, alanina, arginina, valina e arginina, fenilalanina e arginina, lisina e lisina ou asparagina e arginina.

Ο AB5.1 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10. Ο AB5.2 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ J0 ID NO: 11. Ο AB5.3 compreende uma região variável de cadeia pesada ί compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10. Ο AB5.4 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 24 e uma região 15 variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ IDNO: 11.

A presente invenção abrange fragmentos de anticorpo de ligação à IL-Ιβ compreendendo qualquer uma das seqüências de cadeia pesada ou leve precedentes e os quais se ligam à IL-Ιβ. O termo fragmentos, 0 conforme usado aqui, se refere a quaisquer 3 ou mais aminoácidos contínuos (por exemplo, 4 ou mais, 5 ou mais, 6 ou mais, 8 ou mais ou mesmo 10 ou mais aminoácidos contínuos) do anticorpo e abrange fragmentos Fab, Fab', F(ab’)₂ e F(v) ou as regiões variáveis de cadeia leve ou pesada individuais ou porções das mesmas. Fragmentos de ligação à IL-Ιβ incluem, por exemplo, 25 fragmentos Fab, Fab¹, F(ab’)₂, Fv e scFv. Esses fragmentos carecem do fragmento Fc de um anticorpo intacto, eliminar mais rapidamente da circulação e podem ter menos ligação a tecido não-específíco do que um anticorpo intacto. Veja Wahl e colaboradores (1983), J. Nucl. Med., 24: 31625. Esses fragmentos podem ser produzidos a partir de anticorpos usando

métodos bem conhecidos, por exemplo, através de divagem proteolítica com enzimas tais como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2).

A presente invenção compreende anticorpos de ligação à IL5 1β e fragmentos de ligação à IL-Ιβ dos mesmos que se ligam seletivamente ao ligante de IL-Ιβ, mas permitem ou permitem substancialmente a ligação do ligante de IL-Ιβ ligado ao receptor de IL-1 do tipo I (IL-1 RI) (veja Exemplo 14 e Figs. 19 e 20). Em contraste a muitos anticorpos, incluindo vários anticorpos de ligação à IL-Ιβ conhecidos, os anticorpos designados 0 AB5 e AB7 se ligam seletivamente ao ligante de IL-Ιβ, mas eles não bloqueiam ou bloqueiam substancialmente a ligação de IL-Ιβ ao IL-1 RI, conforme demonstrado no Exemplo 14. Por exemplo, o anticorpo designado AB7 se liga a um epítopo de IL-Ιβ, mas ainda permite que a IL-Ιβ ligada se ligue ao IL-1 RI. Assim, a presente invenção abrange anticorpos de ligação à 15 IL-Ιβ ou fragmentos que se ligam a um epítopo de IL-Ιβ, de modo que o anticorpo ou fragmento ligado permite ou permite substancialmente que a ILΙβ se ligue ao receptor I de IL-1 (IL-1 RI) e o anticorpo ou fragmento se liga à IL-Ιβ humana com uma constante de dissociação de menos de 3 pM.

Ensaios baseados em célula e in vitro são bem descritos na O técnica para uso na determinação da ligação de IL-Ιβ ao receptor de IL-1 do tipo I, incluindo ensaios que determinam a presença de moléculas (tais como anticorpos, antagonistas ou outros inibidores) que se ligam à IL-Ιβ ou IL-1 RI. (Veja, por exemplo, Evans e colaboradores, (1995), J. Biol. Chem. 270: 11477-11483; Vigers e colaboradores, (2000), J. Biol. Chem. 275: 3692725 36933; Yanofsky e colaboradores, (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:

7381-7386; Fredericks e colaboradores, (2004), Protein Eng. Des. Sei. 17: 95106; Slack e colaboradores, (1993), J. Biol. Chem. 268: 2513-2524; Smith e colaboradores, (2003), Immunity 18: 87-96; Vigers e colaboradores, (1997), Nature 386: 190-194; Ruggiero e colaboradores, (1997), J. Irnmunol. 158:

Η * 3881-3887; Guo e colaboradores, (1995), J. Biol. Chem. 270: 2562-27568;

v Svenson e colaboradores, (1995), Eur. J. Immunol. 25: 2842-2850; Arend e colaboradores, (1994), J. Immunol. 153: 4766-4774). O receptor de IL-1 do tipo I recombinante, incluindo receptor de IL-1 do tipo I humano, para tais ensaios está prontamente disponível de uma variedade de fontes comerciais (veja, por exemplo, R&D Systems, SIGMA). O receptor de IL-1 do tipo I também pode ser expresso a partir de uma estrutura ou vetor de expressão introduzido em uma célula hospedeira apropriada usando métodos padrões de biologia molecular e transfecção conhecidos na técnica. O receptor de IL-1 do 0 tipo I expresso pode, então, ser isolado e purificado para uso em ensaios de ligação ou, alternativamente, usado diretamente em uma forma célulaassociada.

►

Por exemplo, a ligação de IL-Ιβ ao receptor de IL-1 do tipo I pode ser determinada através de imobilização de um anticorpo de ligação à 15 IL-Ιβ, contato da IL-Ιβ com o anticorpo imobilizado e determinação se a ILΙβ se ligou ao anticorpo e contato de uma forma solúvel de IL-1 RI com o complexo de anticorpo/IL-Ιβ ligada e determinação se o IL-1 RI solúvel se ligou ao complexo. O protocolo também pode incluir contato do IL-1RI solúvel com o anticorpo imobilizado antes de contato com IL-Ιβ para confirmar se o IL-1 RI solúvel não se ligou ao anticorpo imobilizado. Esse protocolo pode ser realizado usando um instrumento Biacore® para análise cinética das interações de ligação. Tal protocolo também pode ser empregado para determinar se um anticorpo ou outra molécula permite ou bloqueia a ligação de IL-Ιβ ao receptor de IL-1 do tipo I.

Para outros ensaios de ligação de IL-^/IL-lRI, a permissão ou bloqueio de ligação de IL-Ιβ ao receptor de IL-1 do tipo I pode ser determinada comparando-se a ligação de IL-Ιβ ao IL-1 RI na presença ou ausência de anticorpos de IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ dos mesmos. Bloqueio é identificado na leitura do ensaio como uma redução designada de ligação de IL-Ιβ ao receptor de IL-1 do tipo I na presença de anticorpos anti-IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ dos mesmos, quando comparado com uma amostra de controle que contém o tampão ou diluente correspondente, mas não um anticorpo de IL-Ιβ ou fragmento de ligação à 5 IL-Ιβ do mesmo. A leitura do ensaio pode ser qualitativamente visualizada como indicando a presença ou ausência de bloqueio ou pode ser quantitativamente visualizada como indicando um percentual ou redução na ligação em virtude da presença do anticorpo ou fragmento.

Alternativa ou adicionalmente, quando um anticorpo de _ 0 ligação à IL-Ιβ ou fragmento de ligação à IL-Ιβ bloqueia substancialmente a ligação de IL-Ιβ ao IL-1 RI, a ligação de IL-Ιβ ao IL-1 RI é reduzida em pelo menos 10 vezes, altemativamente pelo menos cerca de 20 vezes, altemativamente pelo menos cerca de 50 vezes, altemativamente pelo menos cerca de 100 vezes, altemativamente pelo menos cerca de 1000 vezes, 15 altemativamente pelo menos cerca de 10000 vezes ou mais, comparado com a ligação das mesmas concentrações de IL-Ιβ e IL-1 RI na ausência do anticorpo ou fragmento. Como outro exemplo, quando um anticorpo de ligação à IL-1 β ou fragmento de ligação à IL-Ιβ permite substancialmente a ligação de IL-Ιβ ao IL-1 RI, a ligação de IL-Ιβ ao IL-1 RI é pelo menos cerca de 99%, altemativamente pelo menos cerca de 99,9%, altemativamente pelo menos cerca de 99,99%, altemativamente pelo menos cerca de 99,999%, altemativamente pelo menos cerca de 99,9999%, altemativamente substancialmente idêntica à ligação das mesmas concentrações de IL-Ιβ e IL1R1 na ausência do anticorpo ou fragmento.

A presente invenção abrange anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ que se ligam ao mesmo epítopo ou substancialmente ao mesmo epítopo que um ou mais dos anticorpos exemplificativos descritos aqui. Alternativa ou adicionalmente, os anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ competem com a ligação de um anticorpo tendo a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 11 e a * região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 15. Alternativa ou adicionalmente, a presente invenção abrange anticorpos de ligação e fragmentos de ligação à IL-Ιβ que se ligam a um epítopo contido na 5 seqüência de aminoácido ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE (SEQ ID NO:

36), um epítopo que os anticorpos designados AB5 e AB7 se ligam. Conforme considerado aqui, pode-se determinar prontamente se um anticorpo ou fragmento de ligação à IL-Ιβ se liga ao mesmo epítopo ou substancialmente ao mesmo epítopo que um ou mais dos anticorpos 4^o exemplifícativos tal como, por exemplo, o anticorpo designado AB7, usando qualquer um de vários métodos conhecidos na técnica.

Por exemplo, os resíduos de aminoácido chave (epítopo) ligados por um anticorpo ou fragmento de ligação à IL-Ιβ podem ser determinados usando um arranjo peptídico similar ao método descrito no 15 Exemplo 11. Um arranjo peptídico tal como, por exemplo, um arranjo peptídico PepSpot™ (JPT Peptide Technologies, Berlin, Alemanha), em que uma varredura de doze peptídeos de aminoácido, abrangendo a seqüência de aminoácido de IL-Ιβ inteira, cada peptídeo sobrepondo em 11 aminoácidos aquele anterior, é sintetizado diretamente sobre uma membrana. A membrana trazendo o peptídeo é, então, hibridizada com o anticorpo para o qual informação de ligação ao epítopo é procurada, por exemplo, em uma concentração de 2 pg/ml, durante 2 h em temperatura ambiente. Ligação do anticorpo aos peptídeos ligados à membrana pode ser detectada usando um anticorpo anti-humano (ou de camundongo, quando apropriado) de cabra 25 HRP-conjugado secundário, seguido por quimioluminescência intensificada (ECL). O(s) ponto(s) de peptídeo correspondendo a resíduos ou seqüências de aminoácido em particular da proteína de IL-Ιβ madura e o(s) qual(is) tem(têm) um escore positivo para ligação ao anticorpo, é (são) indicativo(s) do epítopo ligado pelo anticorpo em particular.

Alternativamente ou além disso, experimentos de competição > pelo anticorpo podem ser realizados e tais ensaios são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, para determinar se um anticorpo ou fragmento se liga a um epítopo contido em uma seqüência peptídica compreendendo os 5 aminoácidos ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE, os quais correspondem aos resíduos 83-105 da proteína de IL-Ιβ madura, um anticorpo de especificidade conhecida pode ser comparado com qualquer um dos anticorpos exemplificativos (por exemplo, AB7) da presente invenção que são conhecidos por se ligar a um epítopo contido dentro dessa seqüência. Ensaios _J0 de competição por ligação podem ser realizados, por exemplo, usando um instrumento Biacore® para análise cinética de interações de ligação ou através de ELISA. Em tal ensaio, o anticorpo de especificidade por epítopo desconhecida é avaliado com relação à sua capacidade de competir pela ligação contra o anticorpo comparativo conhecido (por exemplo, AB7).

Competição pela ligação a um epítopo em particular é determinada por uma redução na ligação ao epítopo de IL-Ιβ de pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% para o anticorpo comparativo conhecido (por exemplo, AB7) e é indicativo de ligação substancialmente ao mesmo epítopo.

Em vista da identificação, na presente divulgação, de regiões de ligação à IL-Ιβ em anticorpos exemplificativos e/ou epítopos reconhecidos pelos anticorpos divulgados, considera-se que anticorpos adicionais com características de ligação e utilidade terapêutica ou diagnostica similares 25 podem ser gerados que são equivalentes às modalidades da presente divulgação.

Além disso, os anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ da presente invenção abrangem qualquer uma das seqüências de aminoácido precedentes das cadeias leve ou pesada com uma ou mais substituições conservativas (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 > substituições conservativas). À luz da presente divulgação, pode-se determinar as posições de uma seqüência de aminoácido que são candidatos à substituições conservativas e pode-se selecionar aminoácidos sintéticos e que 5 ocorrem naturalmente que realizam substituições conservativas para quaisquer aminoácidos em particular. Consideração para seleção de substituições conservativas incluem o contexto no qual qualquer substituição de aminoácido em particular é feita, a hidrofobicidade ou polaridade da cadeia lateral, o tamanho geral da cadeia lateral e o valor de pK de cadeias laterais 10 com caráter ácido ou básico sob condições fisiológicas. Por exemplo, lisina, arginina e histidina são, muitas vezes, adequadamente substituídos uns pelos outros. Conforme é conhecido na técnica, isso é porque todos os três aminoácidos têm cadeias laterais básicas, enquanto que o valor de pK para cadeias laterais de lisina e arginina estão muito mais próximos um do outro 15 (cerca de 10 e 12) do que à histidina (cerca de 6). Similarmente, glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina são, muitas vezes, adequadamente substituídos uns pelos outros, contanto que a glicina seja, freqüentemente, não adequadamente substituída pelos outros membros no grupo. Isso é em virtude do fato de esses aminoácidos serem relativamente hidrofóbicos quando incorporados em um polipeptídeo, mas a glicina carece de um α-carbono que permite que os ângulos de rotação pi e psi (em tomo do α-carbono) formem a liberdade conformacional, de modo que os resíduos de glicinila podem disparar alterações na conformação ou estrutura secundária que freqüentemente não ocorrem quando os outros aminoácidos são substituídos 25 uns pelos outros. Outros grupos de aminoácidos freqüentemente substituídos adequadamente uns pelos outros incluem, mas não estão limitados a, o grupo consistindo de ácidos glutâmico e aspártico; o grupo consistindo de fenilalanina, tirosina e triptofano; e o grupo consistindo de serina, treonina e opcionalmente tirosina.

Fazendo modificações conservativas na seqüência de x aminoácido ou modificações correspondentes nos nucleotídeos de codificação, pode-se produzir anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ tendo características funcionais e químicas similares àquelas 5 dos anticorpos e fragmentos exemplificativos divulgados aqui. Em contraste, modificações substanciais nas características funcionais e/ou químicas de anticorpos de ligação à IL-Ιβ ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ser realizadas selecionando substituições que diferem signifícativamente quanto a seu efeito sobre a manutenção de (a) a estrutura da parte principal molecular j 0 na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo ou (c) o grosso da cadeia lateral.

Fragmentos de ligação a antígeno de um anticorpo incluem fragmentos que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno, 15 geralmente retendo a porção de ligação a antígeno do anticorpo. É bem estabelecido que a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de porções de ligação a antígeno incluem (i) um fragmento Fab, o qual é um fragmento monovalente consistindo dos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um ZZ) fragmento F(ab')₂, o qual é um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ligação em ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fc, o qual é os domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv, o qual é os domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward e colaboradores, (1989) Nature 341: 25 544-546), o qual é um domínio VH; e (vi) uma região de determinação de complementaridade (CDR) isolada. Anticorpos com cadeia simples são também abrangidos dentro do termo porção de ligação a antígeno de um anticorpo. Os anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ da presente invenção também abrangem domínios monovalentes ou multivalentes ou monoméricos ou multiméricos (por exemplo, tetraméricos), domínios de

- ligação CDR-derivados com ou sem uma armação (por exemplo, uma armação de proteína ou carboidrato).

Os presentes anticorpos ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ser parte de uma molécula de imunoadesão maior formada através de associação covalente ou não-covalente do anticorpo ou porção de anticorpo com uma ou mais proteínas ou peptídeos. Exemplos de tais moléculas de imunoadesão incluem o uso da região central de estreptavidina para fazer uma molécula de scFv tetramérica (Kipriyanov, S. M., e colaboradores (1995) ^0 Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101) e uso de um resíduo de cisteína, um peptídeo marcador e uma tag de polihistidina C-terminal para fazer moléculas de scFv biotiniladas e bivalentes (Kipriyanov, S. M., e colaboradores (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058). Anticorpos e fragmentos compreendendo moléculas de imunoadesão podem ser obtidos 15 usando técnicas de DNA recombinante padrões, conforme descrito aqui.

Porções de ligação a antígeno preferidas são domínios completos ou pares de domínios completos.

Os anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ da presente invenção também abrangem fragmentos de anticorpo de domínio (dAb) 0 (Ward e colaboradores, Nature 341: 544-546, 1989) os quais consistem de um domínio V_H. Os anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ da presente invenção também abrangem diacorpos, que são anticorpos bivalentes nos quais os domínios V_H e V_L são expressos sobre uma única cadeia polipeptídica, mas usando um ligante que é muito curto para permitir 25 emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, desse modo, forçando os domínios a se emparelharem com domínios complementares de outra cadeia e criando dois locais de ligação a antígeno (veja, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161; Holliger e colaboradores, Proc. Natl Acad. Sei. USA 90: 6444-6448, 1993 e Poljak e colaboradores, Structure 2: 1121-1123,

1994). Diacorpos podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

» Os anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ da presente invenção também abrangem fragmentos de anticorpo com cadeia simples (scFv) que se ligam à IL-Ιβ. Um scFv compreende uma região variável de cadeia pesada de anticorpo (Vh) operavelmente ligada a uma região variável de cadeia leve de anticorpo (V_L), em que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve, juntas ou individualmente, formam um sítio de ligação que se liga à IL-Ιβ. Um scFv pode compreender uma região V_H na extremidade amino-terminal e uma região V_L na extremidade carbóxi4° terminal. Altemativamente, o scFv pode compreender uma região V_L na extremidade amino-terminal e uma região V_H na extremidade carbóxiterminal. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, Vl e V_H, sejam codificados por genes distintos, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que os mesmos sejam 15 feitos como uma única cadeia de proteína na qual as regiões V_H e V_L se emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv com cadeia simples (scFv; veja, por exemplo, Bird e colaboradores (1988) Science 242: 423-426; e Huston e colaboradores (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883).

Um scFv pode, opcionalmente, ainda compreender um ligante polipeptídico entre a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve. Tais ligantes polipeptídicos geralmente compreender entre 1 e 50 aminoácidos, altemativamente entre 3 e 12 aminoácidos, altemativamente 2 aminoácidos. Um exemplo de um peptídeo ligante para ligação das cadeias 25 pesada e leve em um scFv compreende a temperatura de aminoácido Gly-GlyGly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 37). Outros exemplos compreendem uma ou mais repetições aleatórias dessa seqüência (por exemplo, um polipeptídeo compreendendo duas a quatro repetições de Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 37) para criar ligantes.

Os anticorpos de fragmentos de ligação à IL-Ιβ da presente invenção também abrangem anticorpos de cadeia pesada (HCAb). Exceções à estrutura H₂L₂ de anticorpos convencionais ocorrem em alguns isotipos das imunoglobulinas encontradas em camelídeos (camelos, dromedários e lhamas;

Hamers-Casterman e colaboradores, 1993 Nature 363: 446; Nguyen e colaboradores, 1998 J. Mol. Biol. 275: 413), tubarões baleia (Nuttall e colaboradores, Mol Immunol. 38: 313-26, 2001), tubarões tigre (Greenberg e colaboradores, Nature 374: 168-73, 1995; Roux e colaboradores, 1998 Proc. Nat. Acad. Sei. USA 95: 11804) e em quimera americana (Nguyen e y 0 colaboradores, Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation, 2002 Immunogenetics 54(1): 39-47). Esses anticorpos podem, aparentemente, formar regiões de ligação a antígeno usando apenas a região variável de cadeia pesada, pelo fato de que esses anticorpos funcionais são dímeros de cadeias pesadas apenas (referidos como anticorpos de cadeia 15 pesada ou HCAbs). Conseqüentemente, algumas modalidades dos presentes anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ser anticorpos de cadeia pesada (HCAb) que se ligam especificamente à IL-Ιβ. Por exemplo, anticorpos de cadeia pesada que são uma classe de IgG e desprovidos de cadeias leves são produzidos por animais do gênero Camelidade o qual inclui camelos, dromedários e lhamas (Hamers-Casterman e colaboradores, Nature 363: 446-448 (1993)). HCAbs têm um peso molecular de cerca de 95 kDa ao invés do peso molecular de 160 kDa de anticorpos de IgG convencionais. Seus domínios de ligação consistem apenas dos domínios variáveis de cadeia pesada, ffeqüentemente referidos como Vhh para distinguir os mesmos do Vh 25 convencional. Muyldermans e colaboradores, J. Mol. Recognit. 12: 131-140 (1999). O domínio variável dos domínios de cadeia pesada é, algumas vezes, referido como um nanocorpo (Cortez-Retamozo e colaboradores, Câncer Research 64: 2853- 57, 2004). Uma biblioteca de nanocorpo pode ser gerada a partir de um dromedário imunizado, conforme descrito em Conrath e colaboradores (Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-12, 2001) ou usando < métodos recombinantes.

Uma vez que o primeiro domínio constante (Chi) está ausente (unido durante processamento de mRNA em virtude da perda de um sinal de 5 consenso de união), o domínio variável (V_Hh) é imediatamente seguido pela região de dobradiça, os domínios C_H2 e C_H3 (Nguyen e colaboradores, Mol. Immunol. 36: 515-524 (1999); Woolven e colaboradores, Immunogenetics 50: 98-101 (1999)). V_Hh de camelídeo se recombina, segunda informações, com as regiões constantes de IgG2 e IgG3 que contêm a dobradiça, os domínios _|0 CH₂ e CH₃ e carecem de um domínio CH! (Hamers-Casterman e * colaboradores, supra). Por exemplo, IgGl de lhama é um isotipo de anticorpo convencional (H2L2) no qual VH se recombina com uma região constante que contém a dobradiça, domínios CH_b CH₂ e CH₃, enquanto que a IgG2 e IgG3 de lhama são isotipos de cadeia pesada apenas que carecem dos domínios CHi 15 e que não contêm cadeias leves.

Embora os HCAbs sejam desprovidos de cadeias leves, eles têm um repertório de ligação a antígeno. O mecanismo de geração genética de HCAbs é revisto em Nguyen e colaboradores, Adv. Immunol 79: 261-296 (2001) e Nguyen e colaboradores, Immunogenetics 54: 39-47 (2002). Tubarões, incluindo o tubarão tigre, mostram V-domínios monoméricos únicos contendo receptor de antígeno similar. Irving e colaboradores, J. Immunol. Methods 248: 31-45 (2001); Roux e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95: 11804 (1998).

Vrhs compreendem pequenos fragmentos de ligação a 25 antígeno (por exemplo, fragmentos que têm cerca de 15 kDa, 118-136 resíduos). Descobriu-se que domínios V_HH de camelídeo se ligam ao antígeno com alta afinidade (Desmyter e colaboradores, J Biol. Chem. 276: 26285-90, 2001), com afinidades do Vhh tipicamente na faixa nanomolar e comparáveis com aquelas de fragmentos Fab e scFv. V_HhS são altamente solúveis e mais estáveis do que os derivados correspondentes de fragmentos scFv e Fab.

< Fragmentos de V_H são relativamente difíceis de produzir na forma solúvel, mas aperfeiçoamentos na solubilidade e ligação específica podem ser obtidos quando resíduos de estrutura são alterados para serem mais semelhantes ao 5 Vhh· (Veja, por exemplo, Reichman e colaboradores, J Immunol Methods 1999, 231: 25-38.) Vhhs trazem substituições de aminoácido que tomam os mesmos mais hidrofílicos e impedem interação prolongada com BiP (proteína de ligação à cadeia pesada de imunoglobulina), a qual normalmente se liga à cadeia H no retículo endoplásmico (ER) durante duplicação e montagem, até que ela seja deslocada pela cadeia L. Em virtude do fato de os vhhs • aumentarem a hidrofilicidade, secreção do ER é aperfeiçoada.

Vhhs funcionais podem ser obtidos através de divagem proteolítica de HCAb de um camelídeo imunizado, através de clonagem direta de genes de Vhh de células B de um camelídeo imunizado, resultando em 15 Vhhs recombinantes ou de bibliotecas originais ou sintéticas. V_HhS com especificidade por antígeno desejada também podem ser obtidos através da metodologia de exibição de fago. Usar Vhhs em exibição de fago é muito mais simples e mais eficaz comparado com Fabs ou scFvs, uma vez que apenas um domínio precisa ser clonado e expresso para obter um fragmento de ligação a antígeno funcional. Muyldermans, Biotechnol. 74:277-302 (2001); Ghahroudi e colaboradores, FEBS Lett. 414: 521-526 (1997); e van der Linden e colaboradores, J Biotechnol. 80: 261-270 (2000). Métodos para geração de anticorpos tendo cadeias pesadas de camelídeo também são descritos nas Publicações de Patente US Nos. 20050136049 e 20050037421.

Métodos de visualização em ribossoma podem ser usados para identificar e isolar moléculas de scFv e/ou Vhh tendo a atividade e afinidade de ligação desejadas. Irving e colaboradores, J. Immunol. Methods 248: 31-45 (2001). Visualização em ribossoma e seleção tem o potencial de gerar e visualizar grandes bibliotecas (10¹⁴).

Outras modalidades proporcionam moléculas semelhantes ao

- Vhh geradas através do processo de camelização, através de modificação de V_Hs de não-Camelidae, tal como Vhhs humanos, para aperfeiçoar sua solubilidade e prevenir ligação não específica. Isso é obtido através de substituição de resíduos sobre o lado VlS de VhS por resíduos semelhantes ao Vhh, desse modo, imitando os fragmentos V_Hh mais solúveis. Espera-se que fragmentos Vh camelizados, particularmente aqueles baseados na estrutura humana, exibam uma resposta imune grandemente reduzida quando administrados in vivo a um paciente e, conseqüentemente, espera-se que 0 tenham vantagens significativas para aplicações terapêuticas. Davies e * colaboradores, FEBS Lett. 339: 285-290 (1994); Davies e colaboradores,

Protein Eng. 9: 531-537 (1996); Tanha e colaboradores, J. Biol. Chem. 216: 24774-24780 (2001); e Riechmann e colaboradores, Irnmunol. Methods 231: 25-38 (1999).

Uma ampla variedade de sistemas de expressão está disponível para a produção de fragmentos de IL-Ιβ, incluindo fragmentos Fab, scFv e Vhhs. Por exemplo, sistemas de expressão de origem procariota e eucariota podem ser usados para a produção em larga escala de fragmentos de anticorpo e proteínas de fusão de anticorpo. Particularmente vantajosos são sistemas de 0 expressão que permitem a secreção de grandes quantidades de fragmentos de anticorpo no meio de cultura.

Produção de Fab-scFv biespecíficos (bicorpo) e Fab(scFv)(2) triespecíficos (tricorpo) são descritos em Schoonjans e colaboradores (J Irnmunol 165: 7050-57, 2000) e Willems e colaboradores (J 25 Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786: 161-76, 2003). Para bicorpos ou tricorpos, uma molécula de scFv é fundida a uma ou ambas as cadeias VL-CL (L) e VH-CHi (Fd) por exemplo, para produzir um tricorpo, dois scFvs são fundidos ao término C do Fab enquanto que, em um bicorpo, um scFv é fundido ao C-term do Fab. Um minicorpo consistindo de scFv fundido ao CH3 via um ligante peptídico (sem dobradiça) ou via um a . dobradiça de IgG foi descrito em Olafsen e colaboradores, Protein Eng Des Sei. Abril de 2004; 17(4): 315-23.

Intracorpos são anticorpos com cadeia simples os quais demonstram expressão intracelular e podem manipular a função de proteína intracelular (Biocca e colaboradores, EMBO J. 9: 101-108, 1990; Colby e colaboradores, Proc Natl Acad Sei USA. 101: 17616-21, 2004). Intracorpos, os quais compreendem seqüências sinalizadoras celulares as quais retêm a estrutura de anticorpo em regiões intracelulares, podem ser produzidos |0 conforme descrito em Mhashilkar e colaboradores (EMBO J 14: 1542-51, * 1995) e Wheeler e colaboradores (FASEBJ. 17: 1733-2003). Transcoipos são anticorpos célula-permeáveis nos quais um domínio de transdução de proteína (PTD) é fundido a anticorpos com fragmento variável de cadeia simples (scFv), Heng e colaboradores (MedHypotheses. 64: 1105-8, 2005).

Os anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ da presente invenção também abrangem anticorpos que são SMIPs ou proteínas de fusão de imunoglobulina com domínio de ligação específico para a proteína alvo. Essas estruturas são polipeptídeos com cadeia simples compreendendo domínios de ligação a antígeno fundidos aos domínios de imunoglobulina =) necessários para realizar funções efetuadoras do anticorpo. Veja, por exemplo, W003/041600, Publicação de Patente US 20030133939 e Publicação de Patente US 20030118592.

Os anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ da presente invenção também abrangem imunoadesinas. Uma ou mais CDRs podem ser 25 incorporadas em uma molécula covalente ou não covalentemente para tomála uma imunoadesina. Uma imunoadesina pode incorporar a(s) CDR(s) como parte de uma cadeia polipeptídica maior, pode ligar covalentemente a(s) CDR(s) à outra cadeia polipeptídica ou pode incorporar a(s) CDR(s) não covalentemente. As CDRs divulgadas aqui permitem que a imunoadesina se ^k ligue especificamente à IL-1 β.

_w Os anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ da presente invenção também abrangem mímicos de anticorpo compreendendo uma ou mais porções de ligação à IL-Ιβ construídas de uma armação orgânica ou inorgânica (tal como uma armação de proteína ou carboidrato). Proteínas tendo estruturas tridimensionais relativamente definidas, comumente referidas como armações de proteína, podem ser usadas como reagentes para o design de mímicos de anticorpo. Essas armações contêm, tipicamente, uma ou mais regiões as quais são passíveis de variação de seqüência específica ou aleatória 10 e tal variação aleatória de seqüência é, freqüência, levada para produzir bibliotecas de proteínas dos quais produtos desejados podem ser selecionados. Por exemplo, um mímico de anticorpo pode compreender um polipeptídeo de ligação de não-imunoglobulina quimérico tendo um domínio semelhante à imunoglobulina contendo armação tendo dois ou mais laços expostos a solvente contendo uma CDR diferente de um anticorpo precursor inserida em cada um dos laços e exibindo atividade de ligação seletiva com relação a um ligante ligado pelo anticorpo precursor. Armações de proteína de nãoimunoglobulina foram propostas para obtenção de proteínas com novas propriedades de ligação. (Tramontano e colaboradores, J. Mol. Recognit. 7: 9, —0 1994; McConnell e Hoess, J. Mol. Biol. 250: 460, 1995). Outras proteínas foram testadas como estruturas e foram usadas para visualizar resíduos aleatórios sobre superfícies alfa helicoidais (Nord e colaboradores, Nat. Biotechnol. 15: 772, 1997; Nord e colaboradores, Protein Eng. 8: 601, 1995), laços entre alfa hélices em feixes de alfa hélice (Ku e Schultz, Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 92: 6552, 1995) e laços limitados por ligações em ponte de dissulfeto, tais como aqueles dos pequenos inibidores de protease (Markland e colaboradores, Biochemistry 35: 8045, 1996; Markland e colaboradores, Biochemistry 35: 8058, 1996; Rottgen e Collins, Gene 164: 243, 1995; Wang e colaboradores, J. Biol. Chem. 270: 12250, 1995). Métodos para empregar armações para mímicos de anticorpo são divulgados na Patente 5.770.380 e > Publicações de Patente US 2004/0171116, 2004/0266993 e 2005/0038229.

Assim, uma variedade de anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ compreendendo uma, duas e/ou três CDRs de uma região variável de 5 cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve de um anticorpo (de preferência uma ou mais das CDRs de SEQ ID NOS: 1-26) pode ser gerada.

Anticorpos ou fragmentos preferidos da presente invenção se ligam à IL-Ιβ com (i) uma IC₅₀ de cerca de 0,5 nM ou menos (por exemplo, cerca de 0,4 ou menos, cerca de 0,3 ou menos ou mesmo cerca de 0,2 ou ^0 menos), conforme determinado através de um ensaio imunoabsorvente * enzima-ligado (ELISA), (ii) pelo menos cerca de 100 vezes (por exemplo, _T pelo menos cerca de 150 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes ou mesmo pelo menos cerca de 250 vezes) maior afinidade com relação à sua ligação à IL-Ια (isto é, tem uma seletividade pela IL-Ιβ com relação à IL-Ια de pelo 15 menos cerca de 100 vezes (por exemplo, pelo menos cerca de 150 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes ou mesmo pelo menos cerca de 250 vezes) e/ou (iii) uma constante de dissociação de ligação em equilíbrio (K_D) para IL-1 β de cerca de 20 pM ou menos (por exemplo, cerca de 15 pM ou menos, cerca de 10 pM ou menos ou mesmo cerca de 5 pM ou menos). Também preferidos -0 são anticorpos ou fragmentos da invenção que podem se ligar à expressão ILΙβ-induzida de IL-6 no soro em um animal em pelo menos 50% (por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou mesmo pelo menos 80%) quando comparado ao nível de IL-6 no soro em um animal IL-^-estimulado ao qual não tenha sido administrado um anticorpo ou fragmento da invenção. 25 Conseqüentemente, a invenção proporciona, em um aspecto relacionado, um anticorpo de ligação à IL-Ιβ ou fragmento de anticorpo de ligação à IL-Ιβ que tem pelo menos uma das características antes mencionadas.

Embora a invenção tenha sido descrita aqui com relação a anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ dos mesmos (por exemplo,

compreendendo uma cadeia leve e pesada), a invenção também proporciona outros polipeptídeos que não anticorpos ou fragmentos de anticorpo de ligação à IL-Ιβ, tais como polipeptídeos de cadeia simples (incluindo polipeptídeos de fusão, polipeptídeos quiméricos, conjugados e semelhantes). 5 Assim, a invenção proporciona, a esse respeito, um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOS: 1-26 ou um fragmento ou variante funcionalmente equivalente das mesmas. A invenção também proporciona um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOS: 27-35 ou 0 42-57 ou um fragmento ou variante funcionalmente equivalente das mesmas.

Os anticorpos e fragmentos de anticorpo descritos aqui podem _w ser preparados através de qualquer método adequado. Métodos adequados para preparo de tais anticorpos e fragmentos de anticorpo são conhecidos na técnica. Outros métodos para preparo dos anticorpos e fragmentos de 15 anticorpo são conforme descrito aqui como parte da invenção. O anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo da invenção, conforme descrito aqui, pode ser isolado ou purificado em qualquer grau. Conforme usado aqui, um composto isolado é um composto que tenha sido removido de seu ambiente natural. Um composto purificado é um composto que tenha a pureza aumentada, de modo que o composto existe em uma forma que é mais pura do que ele existe (i) em seu ambiente natural ou (ii) quando inicialmente sintetizado e/ou amplificado sob condições em laboratório, em que pureza é um termo relativo e não significa necessariamente pureza absoluta.

Qualquer um dos anticorpos, fragmentos de anticorpo ou polipeptídeos precedentes da invenção pode ser humanizado ou humano manipulado, conforme descrito aqui.

Métodos de Preparo de Anticorpos ou Fragmentos de Ligação à IL-Ιβ

A invenção proporciona um método de preparo de um polipeptídeo de ligação à IL-Ιβ maturado por afinidade, tal como um anticorpo ou fragmento de anticorpo (incluindo uma região de anticorpo (por

- exemplo, uma região variável de cadeia pesada ou leve ou qualquer parte da mesma, tal como uma CDR)), método o qual compreende (a) fornecimento de um primeiro ácido nucleico compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de ligação à IL-Ιβ que compreende a seqüência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-26 e um segundo ácido nucleico compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que difere da primeira seqüência de ácido nucleico em pelo menos um nucleotídeo, (b) realização de embaralhamento de ácido nucleico para proporcionar dois ou -t° mais ácidos nucleicos com mutação e (c) seleção de um ácido nucleico com * mutação que codifica um polipeptídeo que (i) se liga à IL-Ιβ com uma maior f afinidade do que o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico, (ii) tem uma seletividade pela IL-Ιβ com relação à IL-Ια que é maior do que aquela do polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico, (iii) tem uma 15 constante de dissociação de ligação em equilíbrio (K_D) para IL-Ιβ que é menor do que aquela do polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico ou (iv) inibe a expressão IL-^-induzida de IL-6 no soro em um animal em um grau maior do que o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico e (d) expressão do ácido nucleico com mutação selecionado para proporcionar M) um polipeptídeo de IL-Ιβ maturado por afinidade. De preferência, o polipeptídeo é um anticorpo ou fragmento de anticorpo, tal como qualquer anticorpo ou fragmento de anticorpo descrito aqui como parte da invenção.

O método de preparo de um polipeptídeo de IL-Ιβ maturado por afinidade opcionalmente ainda compreende repetição das etapas (b) e (c) 25 uma ou mais vezes, em que o embaralhamento de ácido nucleico da etapa (b) é realizado usando (i) pelo menos um ácido nucleico com mutação selecionado da etapa (c) e (ii) pelo menos um ácido nucleico tendo uma seqüência de ácido nucleico que difere do ácido nucleico com mutação selecionado em pelo menos um nucleotídeo. De preferência, as etapas (b) e (c) são repetidas até que um ácido nucleico otimizado seja selecionado. Um « ácido nucleico otimizado é selecionado quando não é mais possível selecionar um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que tem características de ligação com relação à IL-Ιβ (por exemplo, características (i)-(iv) da etapa (c)) 5 que são superiores àquelas de um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico previamente selecionado.

Desejavelmente, as etapas (b) e (c) são repetidas até que seja selecionado um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos uma das seguintes propriedades: (i) se liga à IL-Ιβ com uma IC₅o de 0 cerca de 0,5 nM ou menos (por exemplo, cerca de 0,4 ou menos, cerca de 0,3 ou menos ou mesmo cerca de 0,2 ou menos), conforme determinado através de um ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA), (ii) se liga à IL-Ιβ com pelo menos cerca de 100 vezes (por exemplo, pelo menos cerca de 150 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes ou mesmo pelo menos cerca de 250 15 vezes) maior afinidade com relação à sua ligação à IL-Ια (isto é, tem uma seletividade pela IL-Ιβ com relação à IL-Ια de pelo menos cerca de 100 vezes (por exemplo, pelo menos cerca de 150 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes ou mesmo pelo menos cerca de 250 vezes)), (iii) se liga à IL-Ιβ com uma constante de dissociação de ligação em equilíbrio (K_D) pela IL-Ιβ de cerca de 20 pM ou menos (por exemplo, cerca de 15 pM ou menos, cerca de 10 pM ou menos, 5 pM ou menos, 3 pM ou menos, 2pM ou menos, 1 pM ou menos, 0,7 pM ou menos, 0,5 pM ou menos, 0,3 pM ou menos ou 0,2 pM ou menos) ou (iv) inibe a expressão IL-^-induzida de IL-6 no soro em um animal em pelo menos 50% (por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70% 25 ou mesmo pelo menos 80%) quando comparado com o nível de IL-6 no soro em um animal IL-^-estimulado ao qual não tenha sido administrado um anticorpo ou fragmento da invenção.

Seleção de um ácido nucleico com mutação que codifica um polipeptídeo tendo as propriedades desejadas pode ser realizada através de

qualquer método adequado. Procedimentos para expressão de polipeptídeos * codificados e ensaio dos polipeptídeos com relação à afinidade de ligação, seletividade de ligação, constantes de ligação em equilíbrio e inibição de expressão de IL-6 IL-ip-induzida são divulgados aqui (veja Exemplos).

Outros métodos adequados são conhecidos na técnica. Quando o polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico com mutação proporcionado pela etapa (b) não é um anticorpo ou fragmento de anticorpo inteiro (por exemplo, Fab), pode ser necessário proporcionar um anticorpo compreendendo o polipeptídeo de forma a determinar se o polipeptídeo reúne os critérios de seleção. Assim, o 10 método de preparo de um polipeptídeo de IL-Ιβ maturado por afinidade pode ainda compreender uma etapa de fornecimento de um anticorpo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico com mutação, em que a etapa de seleção de um ácido nucleico com mutação que codifica um polipeptídeo tendo as propriedades desejadas é realizada através de ensaio 15 do anticorpo.

Embaralhamento de ácido nucleico, conforme usado aqui, significa fragmentação de duas ou mais seqüências de ácido nucleico para proporcionar um reservatório de fragmentos de ácido nucleico aleatórios e remontagem dos fragmentos para criar dois ou mais ácidos nucleicos com ít) mutação. A esse respeito, um ácido nucleico com mutação é meramente um ácido nucleico que tem uma seqüência de ácido nucleico que foi alterada. Embaralhamento de ácido nucleico pode ser realizado através de qualquer método adequado. Muitos métodos adequados são conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos nas Patentes US 6.489.145; 6.773.900; 6.764.835;

6.740.506; 6.713.282; 6.713.281; 6.713.279; 6.709.841; 6.696.275;

6.677.115; 6.673.552; 6.656.677; 6.605.449; 6.566.050; 6,562.594:

6.555.315; 6.537.776; 6.528.249;6.479.25 8; 6.455.254; 6.440.668; 6.368.798;

6.361.974; 6.358.709; 6.352.842; 6.344.328; 6.335.179; 6.280.926;

6.238.884; 6.174.673; 6.171.820; 6.168.919; 6.057.103; 6.054.267; 6.030.779

6.001.574;	5.965.408;	5.958.672;	5.939.250;	5.763.239;	6.395.547;
6.376.246;	6.372.497;	6.368.861;	6.365.408;	6.365.377;	6.358.740;
6.358.742;	6.355.484;	6.344.356;	6.337.186;	6.335.160;	6.323.030;
6.319.714;	6.319.713;	6.303.344;	6.297.053;	6.291.242;	6.287.861;
6.277.638;	6.180.406;	6.165.793;	6.132.970;	6.117.679;	5.834.252;

5.830.721; 5.811.238; 5.605.793.

Ácidos Nucleicos

Os anticorpos, fragmentos de anticorpo e polipeptídeos da invenção podem ser codificados por um único ácido nucleico (por exemplo, |0 um único ácido nucleico compreendendo seqüências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos de cadeia leve e pesada do anticorpo) ou por dois ou mais ácidos nucleicos distintos, cada um dos quais codifica uma parte diferente do anticorpo ou fragmento de anticorpo. A esse respeito, a invenção proporciona um ou mais ácidos nucleicos que codificam qualquer um dos 15 anticorpos, fragmentos de anticorpo ou polipeptídeos precedentes (por exemplo, qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve ou pesada precedentes).

De acordo com um aspecto da invenção, a invenção proporciona um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia 0 pesada de um anticorpo ou uma porção da mesma. Seqüências de ácido nucleico exemplificativas são proporcionadas em SEQ ID NOS: 39 e 40 as quais codificam, respectivamente, a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 15 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 11. A esse respeito, a invenção proporciona um ácido nucleico que codifica um 25 polipeptídeo (por exemplo, uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo) compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, altemativamente a seqüência de SEQ ID NO: 28 e, desejavelmente, codifica um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 21 (por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácido

de qualquer uma de SEQ ID NOs: 4-8). Mais preferidos são seqüências de * ácido nucleico que codificam um polipeptídeo (por exemplo, uma região variável de cadeia pesada) compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13 (por exemplo, um polipeptídeo 5 compreendendo a seqüência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOs: 14-15) ou compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24 (por exemplo, SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 26).

Alternativamente ou além disso, o ácido nucleico da invenção pode compreender uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma região 0 variável de cadeia leve de um anticorpo ou uma porção da mesma. A esse respeito, a invenção proporciona um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo (por exemplo, uma região variável de cadeia leve) compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. Por exemplo, a seqüência de ácido nucleico pode codificar um polipeptídeo compreendendo a 15 seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 9. Mais preferivelmente, o ácido nucleico codifica um polipeptídeo (por exemplo, uma região variável de cadeia leve) que compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 ou 11.

Também abrangidos pela invenção são ácidos nucleicos que 40 codificam qualquer uma das seqüências de aminoácido precedentes das cadeias leve ou pesada que compreendem uma ou mais substituições conservativas (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições conservativas), conforme discutido com relação ao anticorpo e fragmento de anticorpo da invenção, onde o anticorpo ou fragmento 25 compreendendo a substituição tem a mesma ou substancialmente a mesma afinidade de especificidade de ligação a epítopo que um ou mais dos anticorpos, fragmentos e seqüências exemplificativos divulgados aqui.

As seqüências de ácido nucleico podem ser determinadas a partir das seqüências de aminoácido dos anticorpos, fragmentos de anticorpo e regiões variáveis de cadeia leve ou pesada descritos aqui através de qualquer * método adequado, tal como através de conversão de tais seqüências de aminoácido às seqüências de ácido nucleico correspondentes usando o código genético. Os ácidos nucleicos que codificam essas seqüências de aminoácido (tais como as seqüências de aminoácido descritas aqui) podem ser preparados (por exemplo, as seqüências de ácido nucleico isoladas ou sintetizadas) usando métodos conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos, por exemplo, em Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3^a edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001;

Ausubel e colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, NY, 1994; e Herdewijn, ed., Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (Methods in Molecular Biology), Humana Press, Totowa, NJ, 2004. Os ácidos nucleicos descritos aqui podem ser isolados ou purificados em qualquer grau.

Conforme usado aqui, um composto isolado é um composto que tenha sido removido de seu ambiente natural. Um composto purificado é um composto que tenha a pureza aumentada, de modo que o composto existe em uma forma que é mais pura do que ela existe (i) em seu ambiente natural ou (ii) quando inicialmente sintetizada e/ou amplificada sob condições de laboratório, em lO que pureza é um termo relativo e não significa necessariamente pureza absoluta.

Os ácidos nucleicos podem ser purificados usando qualquer uma de uma variedade de técnicas incluindo, mas não limitado a, eletroforese em gel preparativa ou focalização isoelétrica, cromatografia por afinidade, 25 imunoafinidade ou troca de íons, cromatografia em peneira molecular, cromatofocalização ou cromatografia de líquido em alta pressão.

Vetores

Os ácidos nucleicos descritos aqui podem ser inseridos em vetores, por exemplo, vetores de expressão de ácido nucleico e/ou vetores de

objetivação. Tais vetores podem ser usados de várias formas, por exemplo, < para a expressão de um anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação à ILΙβ em uma célula ou animal transgênico. Conseqüentemente, a invenção proporciona um vetor compreendendo qualquer um ou mais dos ácidos nucleicos da invenção. Um vetor é qualquer molécula ou composição que tem a capacidade de trazer uma seqüência de ácido nucleico em uma célula hospedeira adequada onde síntese do polipeptídeo codificado pode ocorrer. Tipicamente e de preferência, um vetor é um ácido nucleico que tenha sido manipulado, usando métodos de DNA recombinante, que são conhecidos na -I^o técnica, para incorporar uma seqüência de ácido nucleico desejada (por exemplo, um ácido nucleico da invenção), desejavelmente, o vetor é compreendido de DNA. Exemplos de vetores de transferência de gene baseados em DNA incluem plasmídeos e vetores virais. Vetores virais adequados incluem, por exemplo, vetores baseados em parvovírus (por exemplo, vetores baseados no vírus adeno-associado (AW)), vetores retrovirais, vetores baseados no vírus do herpes simplex (HSV), vetores quiméricos de AVV-adenovirais, vetores baseados no vírus do HIV e vetores baseados em adeno vírus. Qualquer um desses vetores pode ser preparado usando técnicas padrões de DNA recombinante descritas, por exemplo, em Sambrook e colaboradores, supra e Ausubel e colaboradores, supra. Contudo, vetores que não são baseados em ácidos nucleicos, tais como lipossomas, também são conhecidos na técnica e podem ser usados com relação à invenção. O vetor da invenção pode ser baseado em um único tipo de ácido nucleico (por exemplo, um plasmídeo) ou molécula de não-ácido nucleico 25 (por exemplo, um lipídio ou um polímero). Alternativamente, o vetor pode ser uma combinação de um ácido nucleico e um não-ácido nucleico (isto é, um vetor quimérico). Por exemplo, um plasmídeo abrigando o ácido nucleico pode ser formulado com um lipídio ou um polímero como um veículo de distribuição. Tal vetor é referido aqui como um complexo de plasmídeo lipídio e um complexo de plasmídeo-polímero, respectivamente. O vetor de transferência de gene da invenção pode ser integrado no genoma da célula hospedeira ou pode estar presente na célula hospedeira na forma de um epissoma.

Ácidos nucleicos da invenção podem ser inseridos em vetores de expressão de imunoglobulina, por exemplo, os vetores descritos em in McLean e colaboradores, Mol. Immunol., 37: 837-45 (2000); Walls e colaboradores, Nucleic Acids Res., 21: 2921-9 (1993); e Norderhaug e colaboradores, J. Immunol. Metk, 204: 77-87 (1997).

J0 Vetores são, tipicamente, selecionados para serem funcionais na célula hospedeira na qual o vetor será usado (o vetor é compatível com a maquinaria da célula hospedeira de modo que amplificação do gene e/ou expressão do gene possa ocorrer. Uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação à IL-Ιβ pode ser 15 amplificada/expressa em células hospedeiras procariotas, de levedo, de inseto (sistemas de baculovírus) e/ou eucariotas. Seleção da célula hospedeira dependerá, em parte, se o anticorpo ou fragmento de ligação à IL-Ιβ tem de ser pós-transitoriamente modificado (por exemplo, glicosilado e/ou fosforilado). Se assim, células hospedeiras de levedo, inseto ou mamífero são lO preferíveis. Informação adicional sobre vetores de expressão pode ser encontrada em Meth. Enz. v. 185 (1990; Goeddel, ed.), Academic Press Inc., San Diego, Calif.

Vetores de expressão contêm, tipicamente, um ou mais dos seguintes componentes: um promotor, uma ou mais seqüências 25 intensificadoras, uma origem de replicação, uma seqüência de término transcricional, uma seqüência de íntron completa contendo um sítio de união doador e aceitador, uma seqüência líder para secreção, um sítio de ligação ribossômica, uma seqüência de poliadenilação, uma região de poli-ligante para inserção do ácido nucleico que codifica o polipeptídeo a ser expresso e um elemento marcador selecionável.

Componentes do vetor podem ser homólogos (da mesma espécie e/ou cepa que a célula hospedeira), heterólogos (de uma outra espécie que não a espécie ou cepa da célula hospedeira), híbridos (uma combinação 5 de diferentes seqüências de mais de uma fonte), seqüências sintéticas ou nativas as quais normalmente funcionam para regular a expressão de imunoglobulina. Fontes de componentes de vetor podem ser qualquer organismo procariota ou eucariota, qualquer organismo vertebrado ou invertebrado ou qualquer planta, contanto que os componentes sejam 0 funcionais em e possam ser ativados pela maquinaria da célula hospedeira.

Uma origem de replicação é selecionada baseado no tipo de célula hospedeira que está sendo usada para expressão. À guisa de exemplo, a origem de replicação do plasmídeo pBR322 (Produto No. 303-3s, New England Biolabs, Beverly, Mass.) é útil para a maioria das bactérias Gram15 negativas, enquanto que várias origens do SV40, polioma, adenovírus, vírus de estomatite vesicular (VSV) ou papilomavírus (tal como HPV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células de mamífero. Geralmente, o componente origem de replicação não é necessário para vetores de expressão de mamífero (por exemplo, a origem SV40 é ffeqüentemente usada porque ela 40 contém o promotor precoce).

Uma seqüência de término de transcrição está, tipicamente, localizada 3’ da extremidade de regiões de codificação de um polipeptídeo e serve para terminar a transcrição. Seqüências de término de transcrição em células procaríotas freqüentemente compreendem um fragmento rico em G-C 25 seguido por uma seqüência poli T. Seqüências de término de transcrição podem ser clonadas a partir de uma biblioteca, adquiridas comercialmente como parte de um vetor ou sintetizadas usando métodos para síntese de ácido nucleico, tais como aqueles descritos acima.

Um gene marcador selecionável codifica uma proteína

necessária para a sobrevivência e crescimento de uma célula hospedeira crescida em um meio de cultura seletivo. Genes marcadores de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, tetraciclina ou canamicina para células 5 procariotas, (b) complementam deficiências auxotróficas da célula ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis nos meios complexos. Marcadores selecionáveis preferidos são o gene de resistência à canamicina, o gene de resistência à ampicilina e o gene de resistência à tetraciclina. Um gene de resistência à neomicina também pode ser usado para seleção em 0 células hospedeiras procariotas e eucariotas.

Outros genes de seleção podem ser usados para amplificar o gene o qual será expresso. Amplificação é um processo onde genes os quais estão em maior demanda para a produção de uma proteína crítica para o crescimento são reiterados aleatoriamente dentro dos cromossomas de 15 sucessivas gerações de células recombinantes. Exemplos de marcadores selecionáveis para células de mamífero incluem reductase de dihidrofolato (DHFR) e quinase de timidina. Os transformantes de célula de mamífero são colocados sob pressão de seleção à qual somente os transformantes são unicamente adaptados para sobreviver em virtude do marcador presente no lO vetor. Pressão de seleção é imposta através de cultura das células transformadas sob condições nas quais a concentração de agente de seleção no meio é sucessivamente alterada, desse modo, levando à amplificação do gene de seleção e ao DNA que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação à IL-Ιβ. Como um resultado, quantidades aumentadas de um anticorpo são 25 sintetizadas a partir do DNA amplificado.

Um sítio de ligação ribossômica está geralmente presente para início de tradução de mRNA. Por exemplo, tal sítio é caracterizado por uma seqüência de Shine-Dalgamo (procariotas) ou uma seqüência de Kozak (eucariotas). O elemento está, tipicamente, localizado 3’ ao promotor e 5' à seqüência de codificação do polipeptídeo a ser expresso. A seqüência de Shine-Dalgamo é variada mas é, tipicamente, uma polipurina (tendo um alto teor de A-G). Muitas seqüências de Shine-Dalgarno foram identificadas, cada uma das quais pode ser prontamente sintetizada usando métodos apresentados 5 acima e usados em um vetor procariota.

Uma seqüência líder ou sinalizadora pode ser usada para dirigir a secreção de um polipeptídeo. Uma seqüência sinalizadora pode estar posicionada dentro ou diretamente na extremidade 5' de uma região de codificação de polipeptídeo. Muitas seqüências sinalizadoras foram —10 identificadas e podem ser selecionadas baseado na célula hospedeira usada para expressão. Uma seqüência sinalizadora pode ser homóloga (ocorre naturalmente) ou heteróloga a uma seqüência de ácido nucleico que codifica a proteína a ser expressa (tal como anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno). Uma seqüência sinalizadora heteróloga selecionada será uma que é 15 reconhecida e processada (clivada por uma peptidase sinalizadora) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procariotas que não reconhecem e processam uma seqüência sinalizadora de anticorpo nativo, a seqüência sinalizadora é substituída por uma seqüência sinalizadora procariota selecionada, por exemplo, do grupo dos líderes de fosfatase alcalina, IO penicilinase ou enterotoxina II estável ao calor. Para secreção em levedo, uma seqüência sinalizadora de anticorpo nativo pode ser substituída pelos líderes de invertase de levedo, fator alfa ou fosfatase ácida. Em células de mamífero, expressão da seqüência sinalizadora nativa é geralmente satisfatória, embora outras seqüências sinalizadoras de mamífero possam ser adequadas.

Na maioria dos casos, secreção de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno a partir de uma célula hospedeira resultará na remoção do peptídeo sinalizador do anticorpo ou fragmento. Assim, o anticorpo maduro ou fragmento carecerá de qualquer seqüência líder ou sinalizadora.

Em alguns casos, tal como onde glicosilação é desejada em um sistema de expressão de célula hospedeira eucariota, pode-se manipular as várias pré-seqüências para melhorar a glicosilação ou rendimento. Por exemplo, pode-se alterar o sítio de divagem de peptidase de um peptídeo sinalizador ou adicionar pró-seqüências, as quais também podem afetar a 5 glicosilação. O anticorpo ou fragmento final pode ter, na posição 1 (com relação ao primeiro aminoácido da proteína madura) um ou mais aminoácidos adicionais incidentes à expressão, os quais podem não ter sido totalmente removidos. Por exemplo, o anticorpo ou fragmento final pode ter um ou dois aminoácidos encontrados no sítio de divagem de peptidase, presos ao N_|0 término. Altemativamente, o uso de alguns sítios de divagem enzimática pode resultar em uma forma ligeiramente truncada do anticorpo ou fragmento desejado, se a enzima corta em tal área dentro do anticorpo maduro ou fragmento.

Os vetores de expressão conterão, tipicamente, um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e operavelmente ligado a uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo de ligação à IL-Ιβ ou fragmento de ligação a antígeno. Um promotor nativo ou heterólogo pode ser usado, dependendo da célula hospedeira usada para expressão e do rendimento desejado.

«0 Promotores para uso com hospedeiros procariotas incluem os sistemas promotores de beta-lactamase e lactose; fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp); e promotores híbridos, tal como o promotor tac. Outros promotores bacterianos conhecidos também são adequados. Suas seqüências foram publicadas e eles podem ser ligados a 25 (uma) seqüência(s) de ácido nucleico desejada usando ligantes ou adaptadores, conforme desejado, para fornecer sítios de restrição.

Promotores para uso com hospedeiros de levedo também são conhecidos na técnica, Intensificadores de levedo são, vantajosamente, usados com promotores de levedo. Promotores adequados para uso com células hospedeiras de mamífero são bem conhecidos e incluem aqueles obtidos dos genomas de vírus tais como polioma vírus, fowlpox vírus, adenovírus (tal como Adenovírus 2), papiloma vírus bovino, vírus sarcoma de aves, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e, mais preferivelmente, 5 Vírus Simian 40 (SV40). Outros promotores de mamífero adequados incluem promotores de mamífero heterólogos, por exemplo, promotores de choque térmico e o promotor de actina.

Promotores adicionais os quais podem ser usados para expressão dos agentes de ligação seletivos da invenção incluem, mas não ^.0 estão limitados a: a região do promotor precoce de SV40 (Bemoist e Chambon, Nature, 290: 304-310, 1981); o promotor de CMV; o promotor contido na repetição terminal longa 3' do vírus de sarcoma de Rous (Yamamoto e colaboradores (1980), Cell 22\ 787-97); o promotor de quinase de timidina do herpes (Wagner e colaboradores (1981), Proc. Natl. Acad. Sei.

USA. 78: 1444-5); as seqüências regulatórias do gene de metalotionina (Brinster e colaboradores, Nature, 296: 39-42, 1982); vetores de expressão procariota, tal como promotor de beta-lactamase (Villa-Kamaroff e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 75: 3727-3731, 1978); ou o promotor tac (DeBoer e colaboradores (1983), Proc. Natl. Acad. Sei. USA., lO 80: 21-5). Também de interesse são as seguintes regiões de controle de transcrição animal, as quais exibem especificidade tecidual e têm sido utilizadas em animais transgênicos: a região de controle do gene de elastase I a qual é ativa em células acinares pancreáticas (Swift e colaboradores (1984), Cell 38: 639-46; Omitz e colaboradores (1986), Cold Spring Harbor Symp.

Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald (1987), Hepatology 7: 425-515); a região de controle do gene de insulina a qual é ativa em células beta pancreáticas (Hanahan (1985), Nature 315: 115-22); a região de controle do gene de imunoglobulina a qual é ativa em células linfóides (Grosschedl e colaboradores (1984), Cell 38: 647-58; Adames e colaboradores (1985), rr^

Nature 318: 533-8; Alexander e colaboradores (1987), Mol. Cell. Biol. 7: 1436-44); a região de controle do vírus de tumor mamário em camundongo a qual é ativa em mastócitos, células testiculares, de mama e linfóides (Leder e colaboradores (1986), Cell 45: 485-95), a região de controle do gene de albumina a qual é ativa no fígado (Pinkert e colaboradores (1987), Genes and Devei. 1: 268-76); a região de controle do gene de alfafetoproteína a qual é ativa no fígado (Krumlauf e colaboradores (1985), Mol. Cell. Biol. 5: 163948; Hammer e colaboradores (1987), Science, 235: 53-8); a região de controle do gene de alfa 1-antitripsina a qual é ativa no fígado (Kelsey e colaboradores ^0 (1987), Genes and Devei. 1: 161-71); a região de controle do gene de betaglobina a qual é ativa em células mielóides (Mogram e colaboradores, Nature, 315: 338-340, 1985; Kollias e colaboradores (1986), Cell 46: 89-94); a região de controle do gene de proteína básica de mielina a qual é ativa em células de oligodendrócito no cérebro (Readhead e colaboradores (1987), Cell 48: 70315 12); a região de controle do gene da cadeia leve-2 de miosina a qual é ativa em músculo esquelético (Sani (1985), Nature, 314: 283-6); e a região de controle do gene do hormônio de liberação gonadotrófico a qual é ativa no hipotálamo (Mason e colaboradores (1986), Science 234: 1372-8).

Uma seqüência intensificadora pode ser inserida no vetor para

U0 aumentar a transcrição em células hospedeiras eucariotas. Várias seqüências intensifícadoras disponíveis de genes de mamífero são conhecidas (por exemplo, globina, elastase, albumina, alfa-feto-proteína e insulina). Tipicamente, contudo, um intensificador de um vírus será usado. O intensificador de SV40, o intensificador do promotor precoce de 25 citomegalovírus, o intensificador de polioma e os intensificadores de adenovírus são elementos de intensificação exemplificativos para a ativação de promotores eucariotas.

Embora um intensificador possa ser unido ao vetor em posição 5' ou 3' à região de codificação de polipeptídeo, ele está, tipicamente, or localizado em um local 5' do promotor.

Vetores para expressão de ácidos nucleicos incluem aqueles os quais são compatíveis com células hospedeiras bacterianas, de inseto e mamífero. Tais vetores incluem, inter alia, pCRII, pCR3 e pcDNA3.1 5 (Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.), pET15 (Novagen, Madison, Wis.), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Paio Alto, Calif.), pETL (BlueBacII; Invitrogen), pDSR-alfa (Publicação PCT No. WO90/14363) e pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, N.Y.).

UO Possíveis vetores adicionais incluem, mas não estão limitados a, cosmídeos, plasmídeos ou vírus modificados, mas o sistema de vetor deve ser compatível com a célula hospedeira selecionada. Tais vetores incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos tais como derivados do plasmídeo Bluescript® (um fagemídeo baseado em ColEl de alto número de cópia,

Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla Calif.), plasmídeos de clonagem por PCR projetados para clonagem de produtos de PCR Taq-amplificados (por exemplo, TOPO™. TA Cloning® Kit, derivados de plasmídeo PCR2.1, Invitrogen, Carlsbad, Calif.) e vetores de mamífero, levedo ou vírus, tal como um sistema de expressão de baculovírus (derivados de plasmídeo pBacPAK, Clontech, Paio Alto, Calif.). As moléculas recombinantes podem ser introduzidas em células hospedeiras via transformação, transfecção, infecção, eletroporação ou outras técnicas conhecidas.

Células Hospedeiras e Usos das Mesmas

A invenção ainda proporciona uma célula (por exemplo, uma célula isolada ou purificada) compreendendo um ácido nucleico ou vetor da invenção. A célula pode ser qualquer tipo de célula capaz de ser transformado com o ácido nucleico ou vetor da invenção de modo a produzir um polipeptídeo codificado pelo mesmo. A célula é, de preferência, a célula de um mamífero, tal como um ser humano e, mais preferivelmente, é uma célula de hibridoma, uma célula tronco embriônica ou um ovo fertilizado.

Para expressar o anticorpo ou fragmento de ligação à IL-Ιβ, DNAs que codificam cadeias leve e pesada parciais ou de comprimento total, obtidos conforme descrito acima, são inseridos em vetores de expressão de 5 modo que os genes são operativamente ligados à seqüências de controle transcrição e tradução. Nesse contexto, o termo operativamente ligado se destina a significar que um gene de anticorpo está ligado em um vetor de modo que seqüências de controle de transcrição e tradução dentro do vetor servem à sua função pretendida de regulação da transcrição e tradução do 4^o gene de anticorpo. O vetor de expressão e seqüências de controle de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene de cadeia leve do anticorpo e o gene de cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em um vetor distinto ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os 15 genes do anticorpo são inseridos no vetor de expressão através de métodos padrões (por exemplo, ligação dos sítios de restrição complementares sobre o fragmento do gene de anticorpo ou vetor ou ligação à extremidade cega se nenhum sítio de restrição está presente). Antes de inserção das seqüências de cadeia leve ou pesada, o vetor de expressão já pode trazer seqüências de M) região constante do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem para converter as seqüências VH e VL selecionadas em genes de anticorpo de comprimento total é inserir as mesmas em vetores de expressão que já codificam regiões constante de cadeia pesada e constante de cadeia leve, respectivamente, de modo que o segmento VH esteja operativamente ligado ao(s) segmento(s) CH 25 dentro do vetor e o segmento VL esteja operativamente ligado ao segmento CL dentro do vetor. Adicional ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo sinalizador que facilita a secreção da cadeia de anticorpo a partir de uma célula hospedeira. O gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor de modo que o peptídeo sinalizador esteja ligado em-rede ao amino término do gene da cadeia de anticorpo. O peptídeo sinalizador pode ser um peptídeo sinalizador de imunoglobulina ou um peptídeo sinalizador heterólogo (isto é, um peptídeo sinalizador de uma proteína de não-imunoglobulina).

Além dos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinante da invenção podem trazer seqüências regulatórias que controlam a expressão dos genes da cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. O termo seqüência regulatória se destina a incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, _|0 sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes de cadeia de anticorpo. Tais seqüências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Será apreciado que o design do vetor de expressão, incluindo a seleção de seqüências regulatórias, pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, bem como outras considerações. Seqüências regulatórias preferidas para expressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que direcionam a altos níveis de expressão de proteína em células de mamífero.

Além dos genes de cadeia de anticorpo e seqüências regulatórias, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem trazer seqüências adicionais, tais como seqüências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de 25 células hospedeiras nas quais o vetor tenha sido introduzido (veja, por exemplo, Pats. US Nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas por Axel e colaboradores). Por exemplo, tipicamente, o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, sobre uma célula hospedeira na qual o vetor tenha sido introduzido. Genes marcadores selecionáveis incluem o gene de reductase de dihidrofolato (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação por metotrexato) e o gene neo (para seleção por G418).

Métodos de introdução de ácidos nucleicos e vetores em células isoladas e a cultura e seleção de células hospedeiras transformadas in vitro são conhecidos na técnica a incluem o uso de transformação mediada por cloreto de cálcio, transdução, conjugação, combinação triparental, DEAE, transfecção mediada por dextrana, infecção, fusão de membrana com lipossomas, bombardeamento em alta velocidade com microprojéteis —10 revestidos de DNA, micro injeção direta em células simples e eletroporação (veja, por exemplo, Sambrook e colaboradores, supra; Davis e colaboradores, Basic Methods in Molecular Biology, 2^a ed., McGraw-Hill Professional, 1995; e Neumann e colaboradores, EMBO J, 1: 841 (1982)).

A célula compreendendo o ácido nucleico ou vetor da invenção pode ser usada para produzir o anticorpo de ligação à IL-Ιβ, fragmento do mesmo ou uma parte do mesmo (por exemplo, uma seqüência de cadeia pesada ou uma seqüência de cadeia leve codificada pelo ácido nucleico ou vetor). Após introdução do ácido nucleico ou vetor da invenção na célula, a célula é cultivada sob condições adequadas para expressão da _0 seqüência codificada. O anticorpo, fragmento de ligação a antígeno ou parte do anticorpo, então, pode ser isolada da célula.

Em determinadas modalidades, dois ou mais vetores que juntos codificam um anticorpo de ligação à IL-Ιβ ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, podem ser introduzidos na célula. Por exemplo, um 25 primeiro vetor que codifica uma região variável de cadeia pesada ou uma seqüência de cadeia pesada completa pode ser introduzido em uma célula hospedeira e um segundo vetor que codifica uma região variável de cadeia leve ou seqüência de cadeia leve completa também é introduzido na célula hospedeira. A célula é, então, cultivada sob condições adequadas para expressão das duas seqüências codificadas pelos primeiro e segundo vetores e os polipeptídeos codificados podem ser isolados da célula hospedeira. Se necessário, os polipeptídeos isolados, então, podem ser combinados sob condições que promovem sua associação e organização em um anticorpo de ligação à IL-Ιβ ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Altemativamente, os primeiro e segundo vetores podem ser introduzidos em células separadas e os produtos podem ser isolados das respectivas células e combinados para proporcionar um anticorpo de ligação à IL-Ιβ ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Métodos para promoção da associação e organização de constituintes do anticorpo em polipeptídeos de ligação a antígeno foram descritos na técnica. Similarmente, métodos para isolamento de um anticorpo, fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou fragmentos de cadeia pesada e cadeia leve são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Células tronco embriônicas ou ovos fertilizados que compreendem um ácido nucleico ou vetor da invenção podem ser usados para gerar um animal não-humano transgênico. Métodos para fabricação de animais transgênicos são descritos em Hofker e colaboradores, Transgenic Mouse: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press, Clifton, NJ, 2002. Animais não-humanos transgênicos que compreendem um ácido nucleico ou vetor divulgado aqui podem ser usados para expressar o anticorpo codificado, fragmento de ligação a antígeno ou parte do anticorpo. O anticorpo, fragmento de ligação a antígeno ou parte do mesmo pode, então, ser isolada do animal. Partes de um anticorpo podem ser subseqüentemente reconstituídas (em combinação com partes adicionais de anticorpo) em um anticorpo de ligação à IL-Ιβ ou fragmento de anticorpo da invenção.

As células hospedeiras podem ser células hospedeiras procariotas (tal como E. coli) ou células hospedeiras eucariotas (tais como ι

uma célula de levedo, uma célula de inseto ou uma célula de vertebrado). A . célula hospedeira, quando cultivada sob condições apropriadas, expressa um anticorpo ou fragmento de ligação à IL-Ιβ o qual pode ser subseqüentemente coletado da célula hospedeira que o produz (se ele não é secretado). Seleção de uma célula hospedeira apropriada dependerá de vários fatores, tais como níveis de expressão desejados, modificações de polipeptídeo que são desejáveis ou necessárias para atividade, tal como glicosilação ou fosforilação, e facilidade de duplicação em uma molécula biologicamente ativa. Uma série de células hospedeiras adequadas são conhecidas na técnica e _|0 muitas estão disponíveis da American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Va. Exemplos incluem células de mamífero, tais como células de ovário de hâmster Chinês CHO) (ATCC No. CCL61), células CHO DHFR (Urlaub e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei USA 97, 4216-4220 (1980)), células de rim embriônico humano (HEK) 293 ou 293T (ATCC No.

CRL1573), células 3T3 (ATCC No. CCL92) ou células PER.C6. A seleção de células hospedeiras de mamífero adequadas e métodos para transformação, cultura, amplificação, seleção e produção e purificação de produto são conhecidos na técnica. Outras linhagens de célula de mamífero adequadas são as linhagens de células COS-1 (ATCC No. CRL1650) e COS-7 (ATCC No.

M) CRL1651) de macaco e a linhagem de célula CV-1 (ATCC No. CCL70). Outras células hospedeiras de mamífero exemplificativas incluem linhagens de célula de primata, linhagens de células de ave e linhagens de célula de roedor, incluindo linhagens de célula transformadas. Células diplóides normais, gêneros de células derivadas de cultura in vitro de tecido primário, 25 bem como explantes primários, também são adequados. Células candidatas podem ser genotipicamente deficientes no gene de seleção ou podem conter um gene de seleção dominantemente ativo. Outras linhagens de célula de mamífero adequadas incluem, mas não estão limitadas a, células N2A de neuroblastoma de camundongo, HeLa, células L-929 de camundongo, linhagens 3Τ3 derivadas de camundongos Swiss, Balb-c ou NIH, linhagens de células de hâmster BHK ou HaK, as quais estão disponíveis da American Type Culture Collection, Manassas, Va. Cada uma dessas linhagens de célula é conhecida e está disponível para aqueles habilitados na técnica de expressão 5 de proteína.

Similarmente, úteis como células hospedeiras adequadas para a presente invenção são células bacterianas. Por exemplo, as várias cepas de E. coli (por exemplo, HB101 (ATCC No. 33694) DH5a, DH10 e MC1061 (ATCC No. 53338)) são bem conhecidas como células hospedeiras no campo _10 de biotecnologia. Várias cepas de B. subtilis, Pseudomonas spp., outros Bacillus spp., Streptomyces spp. e semelhantes também podem ser empregadas nesse método.

Para expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(es) de expressão que codifica as cadeias pesada e leve é(são) transfectado(s) em uma 15 célula hospedeira através de técnicas padrões. Transfecção abrange uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariota ou eucariota, por exemplo, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção com DEAEdextrana e semelhantes. Embora seja teoricamente possível expressar os _0 anticorpos ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ em células hospedeiras procariotas ou eucariotas, expressão dos anticorpos ou fragmentos em células eucariotas e, mais preferivelmente, células hospedeiras de mamífero, é mais preferido porque é mais provável que tais células eucariotas e, em particular, células de mamífero, se estruturem e secretem um anticorpo 25 imunologicamente ativo e apropriadamente duplicado do que células procariotas. Células hospedeiras de mamífero para expressão dos anticorpos recombinantes da invenção incluem células de ovário de hâmster chinês (CHO) (incluindo células CHO dhfr^- descritas por Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA ΊΊ: 42164220, usadas com um marcador DHFR74 selecionável, por exemplo, conforme descrito em R. J. Kaufman e P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601- 621), células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Quando vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os 5 anticorpos são produzidos através de cultura das células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são crescidas. Anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura usando métodos padrões de purificação de _[0 proteína.

Muitas cepas de células de levedo conhecidas na técnica também estão disponíveis como células hospedeiras para expressão dos anticorpos e fragmentos. Células de levedo preferidas incluem, por exemplo, Saccharomyces cerivisae. Adicionalmente, onde desejado, sistemas de célula 15 de inseto podem ser utilizados. Tais sistemas são descritos, por exemplo, em Kitts e colaboradores (Biotechniques, 14, 810- 817 (1993)), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4, 564-572 (1993) e Lucldow e colaboradores (J. Virol., 6Ί, 4566-4579 (1993)). Células de inseto preferidas são Sf-9 e Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.).

βθ Transformação ou transfecção de uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação à IL-Ιβ em uma célula hospedeira selecionada pode ser realizada através de métodos bem conhecidos, incluindo métodos com cloreto de cálcio, métodos de eletroporação, métodos de microinjeção, métodos de lipofecção ou os 25 métodos com DEAE-dextrana. O método selecionado dependerá, em parte, do tipo de célula hospedeira a ser usada. Esses métodos e outros métodos adequados são bem conhecidos e são apresentados, por exemplo, em Sambrook e colaboradores, supra.

Animais transgênicos também podem ser usados para expressar anticorpos e fragmentos glicosilados. Por exemplo, pode-se usar um * animal transgênico que produz leite (uma vaca ou cabra, por exemplo) e obter agentes de ligação glicosilados no leite do animal. Altemativamente, pode-se usar plantas para produzir agentes de ligação seletivos glicosilados.

Células hospedeiras compreendendo um vetor de expressão que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação à IL-Ιβ podem ser cultivadas usando meios conhecidos na técnica. Os meios usualmente conterão todos os nutrientes necessários para o crescimento e sobrevivência das células. Exemplos de meios para cultura de células de E. coli incluem _J0 Caldo de Luria (LB) e/ou Caldo Terrific (TB). Meios adequados para cultura de células eucariotas são RPMI 1640, MEM, DMEM, os quais podem ser suplementados com soro e/ou fatores de crescimento conforme desejado para a linhagem de célula que está sendo cultivada em particular. Um meio exemplificativo para cultura de células é meio de Grace suplementado com 15 yeastolato, hidrolisato de lactalbumina e/ou soro fetal de cabra, conforme necessário.

Um antibiótico ou outro composto útil para crescimento seletivo de células transfectadas ou transformadas pode ser adicionado como um suplemento ao meio. O composto será escolhido baseado no elemento MO marcador selecionável presente sobre o plasmídeo com o qual a célula hospedeira foi transformada. Por exemplo, onde o elemento marcador selecionável é resistência à canamicina, o composto adicionado ao meio de cultura será canamicina. Outros compostos para crescimento seletivo incluem ampicilina, tetraciclina e neomicina.

A quantidade de anticorpo ou fragmento de ligação à IL-Ιβ produzido por uma célula hospedeira pode ser avaliada usando métodos conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, sem limitação, análise de Western blot, SDS-poliacrilamida, eletroforese em gel, eletroforese em gel de não-desnaturação, separação por HPLC, imunoprecipitação e/ou ensaios de atividade.

. Purificação de um anticorpo ou fragmento de ligação à IL-Ιβ o qual foi secretado no meio de célula pode ser realizada usando uma variedade de técnicas, incluindo cromatografia por afinidade, imunoafinidade ou troca de íons, cromatografia em peneira molecular, eletroforese em gel preparativa ou focalização isoelétrica, cromatofocalização e cromatografia de líquido de alta pressão. Por exemplo, anticorpos compreendendo uma região Fc podem ser purificado através de cromatografia por afinidade com Proteína A, a qual se liga seletivamente à região Fc. Formas modificadas de um anticorpo ou ^0 fragmento de ligação a antígeno podem ser preparadas com tags de afinidade, tais como hexahistidina ou outro pequeno peptídeo, tal como FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.) ou myc (Invitrogen) em seu carbóxi ou amino término e purificadas através de uma coluna de afinidade em uma etapa. Por exemplo, polihistidina se liga com maior afinidade e especificidade ao níquel, assim, uma coluna de afinidade de níquel (tal como as colunas de níquel Qiagen.®) pode ser usada para purificação de agentes de ligação seletivos rotulados com polihistidina. (Veja, por exemplo, Ausubel e colaboradores, eds., Current Protocols in Molecular Biology, Seção 10.11.8, John Wiley & Sons, New York (1993)). Em alguns casos, mais de uma etapa de purificação pode ser empregada.

Anticorpos ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ os quais são expressos em células hospedeiras procariotas podem estar presentes em uma forma solúvel no espaço periplásmico ou no citoplasma ou em uma forma insolúvel como parte de corpos de inclusão intracelulares. Anticorpos ou 25 fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ser extraídos da célula hospedeira usando qualquer método apropriado conhecido na técnica. Por exemplo, as células hospedeiras podem ser submetidas à lise para liberar os conteúdos no periplasma/citoplasma através de uma prensa de French, homogeneização e/ou ultra-som, seguido por centrifugação.

Μ6

Formas solúveis de um anticorpo ou fragmento de ligação à IL-Ιβ presentes no citoplasma ou liberadas do espaço periplásmico podem ser ainda purificadas usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, fragmentos Fab são liberados do espaço periplásmico bacteriano através de 5 técnicas de choque osmótico.

Se corpos de inclusão compreendendo um anticorpo ou fragmento se formaram, eles podem freqüentemente se ligar às membranas celulares internas e/ou externas e, assim, serão encontrados primariamente no material em pelota após centrifugação. O material em pelota pode, então, ser _L0 tratado em extremos de pH ou com um agente caotrópico, tal como um detergente, guanidina, derivados de guanidina, uréia ou derivados de uréia na presença de um agente de redução, tal como ditiotreitol, em pH alcalino ou tris carbóxietil fosfina em pH ácido para liberar, quebrar e solubilizar os corpos de inclusão. O anticorpo ou fragmento solúvel pode, então, ser 15 analisado usando eletroforese em gel, imunoprecipitação ou semelhante. Se é desejado isolar um anticorpo ou agente de ligação a antígeno solubilizado, isolamento pode ser realizado usando métodos padrões, tais como aqueles apresentados abaixo e em Marston e colaboradores (Meth. Enz., 182: 264- 275 (1990)).

-HO Em alguns casos, um anticorpo ou fragmento de ligação à IL1 β pode não ser biologicamente ativo quando de isolamento. Vários métodos para reduplicação ou conversão de um polipeptídeo à sua estrutura terciária e geração de ligações de dissulfeto podem ser usados para restaurar a atividade biológica. Tais métodos incluem exposição do polipeptídeo 25 solubilizado a um pH usualmente acima de 7 e na presença de uma concentração particular de um caotropo. A seleção do caotropo é muito similar às escolhas usadas para solubilidade de corpos de inclusão, mas usualmente o caotropo é usado em uma menor concentração e não é necessariamente o mesmo que os caotropos usados para a solubilidade. Na

- maioria dos casos, a solução de reduplicação/oxidação também conterá um agente de redução ou o agente de redução mais sua forma oxidada em uma proporção específica para gerar um potencial redox particular para permitir que embaralhamento de dissulfeto ocorra na formação da(s) ligação(ões) em 5 ponte de cisteína da proteína. Alguns dos pares redox comumente usados incluem cisteína/cistamina, glutationa (GSH)/ditiobis GSH, cloreto cúprico, ditiotreitol(DTT)/ditiano DTT e 2-mercaptoetanol (bME)/di-tio-b(ME). Em muitos casos, o co-solvente pode ser usado para aumentar a eficácia da reduplicação e reagentes comuns usados para essa finalidade incluem glicerol, 10 polietileno glicol de vários pesos moleculares, arginina e semelhantes.

Anticorpos ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ da presente invenção também podem ser preparados através de métodos de síntese química (tal como síntese de peptídeo em fase sólida) usando métodos conhecidos na técnica, tais como aqueles apresentados por Merrifield e 15 colaboradores (1963), J. Am. Chem. Soc, 85: 2149, Houghten e colaboradores (1985), Proc Natl Acad. Sci. USA, 82: 5132 e Stewart e Young (1984), Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, 111. Tais anticorpos ou fragmentos podem ser sintetizados com e sem uma metionina sobre o amino termino. Anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno quimicamente “0 sintetizados podem ser oxidados usando métodos apresentados nessas referências para formas ligações em ponte de dissulfeto. Anticorpos e fragmentos assim preparados reterão pelo menos uma atividade biológica associada a um anticorpo ou fragmento de ligação à IL-Ιβ nativo ou recombinantemente produzido.

Composições Farmacêuticas

Anticorpos de ligação à IL-Ιβ, fragmentos de anticorpo, ácidos nucleicos ou vetores da invenção podem ser formulados em composições, especialmente composições farmacêuticas. Tais composições compreendem uma quantidade terapêutica ou profílaticamente eficaz de um ' anticorpo de ligação à IL-Ιβ, fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor da invenção em mistura com um veículo adequado, por exemplo, um agente farmaceuticamente aceitável. Tipicamente, anticorpos de ligação à IL-Ιβ, fragmentos de anticorpo, ácidos nucléicos ou vetores da invenção são 5 suficientemente purificados para administração a um animal antes de formulação em uma composição farmacêutica.

Agentes farmaceuticamente aceitáveis para uso nas presentes composições farmacêuticas incluem veículos, excipientes, diluentes, antioxidantes, conservantes, agentes de coloração, flavorização e diluição, _^0 agentes de emulsificação, agentes de suspensão, solventes, enchedores, agentes de composição de volume, tampões, veículos de distribuição, agentes i de tonicidade, co-solventes, agentes de umedecimento, agentes de formação ¹ de complexo, agentes de tamponamento, antimicrobianos e tensoativos.

Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina do soro são veículos apropriados exemplificativos. As composições farmacêuticas podem incluir antioxidantes, tal como ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular; proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, 0 asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes de quelação, tal como EDTA; álcoois de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contra-íons de formação de sal, tal como sódio; e/ou tensoativos não-iônicos, tais como Tween, pluronics ou polietileno glicol (PEG). Também, à guisa de exemplo, 25 agentes de intensificação de tonicidade adequados incluem haletos de metal alcalino (de preferência cloreto de sódio ou potássio), manitol, sorbitol e semelhantes. Conservantes adequados incluem cloreto de benzalcônio, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico e semelhantes. Peróxido de hidrogênio também pode ser usado como ' conservante. Co-solventes adequados incluem glicerina, propileno glicol e PEG. Agentes de formação de complexo adequados incluem cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidróxi-propil-beta-ciclodextrina. Tensoativos ou agentes de umedecimento adequados incluem sorbitan ésteres, 5 polisorbatos, tal como polisorbato 80, trometamina, lecitína, colesterol, tiloxapal e semelhantes. Os tampões podem ser tampões convencionais, tais como acetato, borato, citrato, fosfato, bicarbonato ou Tris-HCl. Tampão de acetato pode estar em tomo de um pH de 4-5,5 e tampão de Tris pode estar em tomo de um pH de 7-8,5. Agentes farmacêuticos adicionais são 0 apresentados em Remington 's Pharmaceutical Sciences, 18^a Edição, A. R.

Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990.

A composição pode estar em uma forma líquida ou em uma * forma liofilizada ou congelada a seco e pode incluir um ou mais lioprotetores, excipientes, tensoativos, aditivos estruturais de alto peso molecular e/ou 15 agentes de composição de volume (veja, por exemplo, Patentes US 6.685.940, 6.566.329 e 6.372.716). Em uma modalidade, um lioprotetor é incluído, o qual é um açúcar de não-redução, tal como sacarose, lactose ou trealose. A quantidade de lioprotetor geralmente incluída é tal que, quando de reconstituição, a formulação resultante será isotônica, embora formulações “0 hipertônicas ou ligeiramente hipotônicas também possam ser adequadas.

Além disso, a quantidade de lioprotetor deverá ser suficiente para impedir uma quantidade inaceitável de degradação e/ou agregação da proteína quando de liofilização. concentrações de lioprotetor exemplificativas para açúcares (por exemplo, sacarose, lactose, trealose) na formulação pré-liofilizada são de 25 cerca de 10 mM a cerca de 400 mM. Em outra modalidades, um tensoativo é incluído tal como, por exemplo, tensoativos não-iônicos e tensoativos iônicos, tais como polisorbatos (por exemplo, polisorbato 20, polisorbato 80); poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188); (poli)etileno glicol fenil éteres (por exemplo, Triton); dodecil sulfato de sódio (SDS); lauril sulfato de sódio;

*' octil glicosídeo de sódio; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sulfobetaína;

_# lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- ou cetilbetaína; lauramidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- ou isoestearamidopropil-betaína (por exemplo, lauramidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil- ou estearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil- de sódio ou metil-oleil-taurato dissódico; e a série MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, NJ.), polietil glicol, polipropil glicol e copolímeros de etileno e propileno glicol (por exemplo Pluronics, PF68, etc). Quantidades exemplificativas de JO tensoativo que podem estar presentes na formulação pré-liofílizada são de cerca de 0,001-0,5%. Aditivos estruturais de elevado peso molecular (por exemplo, enchedores, aglutinantes) podem incluir, por exemplo, acácia, albumina, ácido algínico, fosfato de cálcio (dibásico), celulose, carbóximetilcelulose, carbóximetilcelulose de sódio, hidróxietilcelulose, 15 hidróxipropilcelulose, hidróxipropilmetilcelulose, celulose microcristalina, dextrana, dextrina, dextratos, sacarose, tilose, amido pré-gelatinizado, sulfato de cálcio, amilose, glicina, bentonita, maltose, sorbitol, etilcelulose, hidrogen fosfato dissódico, fosfato dissódico, piro-sulfíto dissódico, álcool polivinílico, gelatina, glicose, goma guar, glicose líquida, açúcar compressível, silicato de 0 magnésio alumínio, maltodextrina, óxido de polietileno, polimetacrilatos, povidona, alginato de sódio, tragacanta, celulose microcristalina, amido e zeína. Concentrações exemplificativas de aditivos estruturais de elevado peso molecular são de 0,1% a 10% em peso. Em outras modalidades, um agente que confere volume (por exemplo, manitol, glicina) pode ser incluído.

Composições podem ser adequadas para administração parenteral. Composições exemplificativas são adequadas para injeção ou infusão em um animal através de qualquer via disponível para aqueles habilitados, tais como as vias intra-articular, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal),

' intracérebroventricular, intramuscular, intra-ocular, intra-arterial ou intralesional. Uma formulação parenteral será, tipicamente, uma solução aquosa isotônica estéril, isenta de pirogênio, opcionalmente contendo conservantes farmaceuticamente aceitáveis.

Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais, tal como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. Veículos aquosos incluem água, soluções aquosas/alcoólicas, emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e meios tamponados. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, .jO dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactada ou óleos fixos.

Veículos intravenosos incluem repositores de fluido e nutriente, repositores de eletrólito, tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer e semelhantes. Conservantes e outros aditivos também podem estar presentes tais como, por exemplo, anti-microbianos, antioxidantes, agentes de quelação, gases inertes e 15 semelhantes. Veja, de modo geral, Remington's Pharmaceutical Science, 16^oa

Ed., Mack Eds., 1980, a qual é incorporada aqui por referência.

Composições farmacêuticas descritas aqui podem ser formuladas para distribuição controlada ou sustentada de uma maneira que proporciona uma concentração local do produto (por exemplo, bolo, efeito de 0 depósito) e/ou estabilidade ou meia-vida aumentada em um ambiente local em particular. As composições podem incluir a formulação de anticorpos de ligação à IL-Ιβ, fragmentos de anticorpo, ácidos nucleicos ou vetores da invenção com preparados em partícula de compostos poliméricos, tais como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., bem como agentes tais como uma 25 matriz biodegradável, microesferas injetáveis, partículas microcapsulares, microcápsulas, glóbulos de partículas passíveis de bioerosão, lipossomas e dispositivos de distribuição implantáveis que proporcionam a liberação controlada ou sustentada do agente ativo o qual, então, pode ser distribuído como uma injeção de depósito. Técnicas para formulação de tais meios de ' distribuição com liberação sustentada ou controlada são conhecidas e uma variedade de polímeros foram desenvolvidos e usados para a liberação e distribuição controlada de fármacos. Tais polímeros são, tipicamente, biodegradáveis e biocompatíveis. Hidrogéis poliméricos, incluindo aqueles 5 formados através de formação de complexo de polímero enantiomérico ou segmentos polipeptídicos e hidrogéis com propriedades sensíveis à temperatura ou pH, podem ser desejáveis para proporcionar um efeito de depósito de fármaco em virtude das condições aquosas e suaves envolvidas em contenção de agentes de proteína bioativos (por exemplo, anticorpos).

4^o Veja, por exemplo, a descrição de micropartículas poliméricas porosas com liberação controlada para a distribuição de composições farmacêuticas na Publicação de Pedido PCT WO 93/15722.

Materiais adequados para essa finalidade incluem polilactídeos (veja, por exemplo, Patente US 3.773.919), polímeros de ácidos (poli)-cc15 hidróxicarboxílico, tal como ácido poli-D-(-)-3-hidróxibutírico (EP 133,988A), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman e colaboradores, Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), (poli)-2hidróxietil-metacrilato (Langer e colaboradores, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) e Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), acetato de etileno 0 vinila ou ácido poli-D(-)-3-hidróxibutírico. Outros polímeros biodegradáveis incluem (poli)lactonas, (poli)acetais, (poli)ortoésteres e (poli)ortocarbonatos. Composições com liberação sustentada também podem incluir lipossomas, os quais podem ser preparados através de vários métodos conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Eppstein e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82: 25 3688-92 (1985)). O veículo em si ou seus produtos da degradação deverão ser não tóxicos no tecido alvo e não deverão agravar adicionalmente a condição. Isso pode ser determinado através de seleção de rotina em modelos com animais do distúrbio alvo ou, se tais modelos estão indisponíveis, em animais normais.

Microencapsulação de proteínas recombinantes para liberação sustentada foi realizada com sucesso com hormônio do crescimento humano (rhGH), interferon-(rhIFN-), interleucina-2 e MNrgpl20, Johnson e colaboradores, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:

1221-1223 (1993); Hora e colaboradores, Bio/Technology. 8: 755-758 (1990);

Cleland, Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems em Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell e Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), páginas 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399;

^0 e Pat. US No. 5.654.010. As formulações com liberação sustentada dessas proteínas foram desenvolvidas usando polímero de poli-lactídeo-co-ácido glicólico (PLGA) em virtude de sua biocompatibilidade e ampla faixa de propriedades biodegradáveis. Os produtos da degradação de PLGA, ácidos láctico e glicólico podem ser liberados rapidamente dentro do corpo humano.

Além disso, a degradabilidade desse polímero pode ser dependente de seu peso molecular e composição. Lewis, Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer em: M. Chasin e R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcei Dekker: New York, 1990), páginas 1-41. Exemplos adicionais de composições com 0 liberação sustentada incluem, por exemplo, EP 58.481 A, Pat. US No.

3.887.699, EP 158.277A, Patente Canadense No. 1176565, U. Sidman e colaboradores, Biopolymers 22, 547 [1983], R. Langer e colaboradores, Chem. Tech. 12, 98 [1982], Sinha e colaboradores, J. Control. Release 90, 261 [2003], Zhu e colaboradores, Nat. Biotechnol. 18, 24 [2000] e Dai e 25 colaboradores., Colloids Surf B Biointerfaces 41,117 [2005].

Polímeros bioadesivos também são considerados para uso em ou com composições da presente invenção. Bioadesivos são materiais sintéticos e que ocorrem naturalmente capazes de aderir a substratos biológicos durante períodos de tempo prolongados. Por exemplo, Carbopol e • policarbófilo são derivados reticulados sintéticos de ácido (poli)acrílico. Sistemas de distribuição bioadesivos baseados em substâncias que ocorrem naturalmente incluem, por exemplo, ácido hialurônico, também conhecido como hialuronana. Ácido hialurônico é um mucopolissacarídeo que ocorre 5 naturalmente consistindo de resíduos D-glucurônicos e de N-acetil-Dglicosamina. Ácido hialurônico é encontrado na matriz tecidual extracelular de vertebrados, incluindo em tecidos conectivos, bem como em fluido sinovial e no vítreo e humor aquoso dos olhos. Derivados esterifícados de ácido hialurônico têm sido usados para produzir microesferas para uso em 10 distribuição que são biocompatíveis e biodegradáveis (veja, por exemplo, Cortivo e colaboradores, Biomaterials (1991) 12: 727-730; Publicação Européia No. 517.565; Publicação Internacional No. WO 96/29998; Ilium e colaboradores, J. Controlled Rei. (1994) 29: 133-141). Composições exemplificativas contendo ácido hialurônico da presente invenção 15 compreendem um polímero de éster de ácido hialurônico em uma quantidade de aproximadamente 0,1% a cerca de 40% (peso/peso) de um anticorpo ou fragmento de ligação à IL-Ιβ para o polímero de ácido hialurônico.

Matrizes poliméricas biodegradáveis e não-biodegradáveis podem ser usadas para distribuir composições da presente invenção e tais “0 matrizes poliméricas podem compreender polímeros naturais ou sintéticos. Matrizes biodegradáveis são preferidas. O período de tempo durante o qual liberação ocorre é baseado em seleção do polímero. Tipicamente, liberação durante um período oscilando de entre umas poucas horas e três a doze meses é mais desejável. Polímeros sintéticos exemplificativos os quais podem ser 25 usados para formar o sistema de distribuição biodegradável incluem: polímeros de ácido láctico e ácido glicólico, poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polialquileno glicóis, óxidos de polialquileno, tereftalatos de polialquileno, álcoois polivinílicos, polivinil éteres, polivinil ésteres, haletos de polivinila, polivinilpirrolidona, poliglicolídeos, poli-siloxanos, * polianidridos, poliuretanos e copolímeros dos mesmos, ácido (poli)butírico, ácido (poli)valérico, alquil celulose, hidróxialquil celuloses, éteres de celulose, ésteres de celulose, nitro celuloses, polímeros de ésteres acrílicos e metacrílicos, metil celulose, etil celulose, hidróxipropil celulose, hidróxi5 propil metil celulose, hidróxibutil metil celulose, acetato de celulose, propionato de celulose, butirato de acetato de celulose, ftalato de acetato de celulose, carbóxietil celulose, triacetato de celulose, sal de sódio de sulfato de celulose, (poli)metil metacrilato, (poli)etil metacrilato, (poli)butil metacrilato, (poli)isobutil metacrilato, (poli)hexil metacrilato, (poli)isodecil metacrilato, ^0 . (poli)lauril metacrilato, (poli)fenil metacrilato, (poli)metil acrilato, (poli)isopropil acrilato, (poli)isobutil acrilato, (poli)octadecil acrilato, polietileno, polipropileno (poli)etileno glicol, óxido de polietileno, tereftalato de polietileno, álcoois (poli)vinílicos, acetato de polivinila, cloreto de polivinila, poliestireno e polivinilpirrolidona. Polímeros naturais 15 exemplificativos incluem alginato e outros polissacarídeos, incluindo dextrana e celulose, colágeno, derivados químicos dos mesmos (substituições, adições de grupos químicos, por exemplo, alquila, alquileno, hidroxilações, oxidações e outras modificações rotineiramente feitas por aqueles habilitados na técnica), albumina e outras proteínas hidrofílicas, zeína e outras prolaminas e _0 proteínas hidrofóbicas, copolímeros e misturas dos mesmos. Em geral, esses materiais degradam através de hidrólise enzimática ou exposição à água in vivo, através de erosão da superfície ou em geral. O polímero está opcionalmente na forma de um hidrogel (veja, por exemplo, WO 04/009664, WO 05/087201, Sawhney e colaboradores, Macromolecules, 1993, 26, 58125 587) que pode absorver até cerca de 90% de seu peso em água e ainda, opcionalmente, é reticulado com íons multivalentes ou outros polímeros.

Sistemas de distribuição também incluem não polímeros que são lipídios, incluindo esteróis, tais como colesterol, ésteres de colesterol e ácidos graxos ou gorduras neutras, tais como mono-, di- e tri-glicerídeos;

sistemas de liberação de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas baseados em * peptídeo; revestimentos de cera; tabletes comprimidos usando aglutinantes e excipientes convencionais; implantes parcialmente fundidos; e semelhantes. Exemplos específicos incluem, mas não estão limitados a: (a) sistemas 5 passíveis de erosão nos quais o produto está contido em uma forma dentro de uma matriz, tal como aqueles descritos nas Pats. US Nos. 4.452.775, 4.675.189 e 5.736.152 e (b) sistemas difusionais nos quais um produto permeia em uma taxa controlada de um polímero, tal como descrito nas Pats. US Nos. 3.854.480, 5.133.974 e 5.407.686. Lipossomas contendo o produto -J0 podem ser preparados através de métodos conhecidos na técnica tais como, por exemplo, DE 3.218.121; Epstein e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: 4030-4034 (1980); EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; Pedido de Patente Japonesa 83-118008; Pats. US Nos. 4.485.045 15 e 4.544.545; eEP 102.324.

Alternativa ou adicionalmente, as composições podem ser administradas localmente via implante na área afetada de uma membrana, esponja ou outro material apropriado sobre o qual um anticorpo de ligação à IL-Ιβ, fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor da invenção tenha —0 sido absorvido ou encapsulado. Onde um dispositivo de implante é usado, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado e distribuição de um anticorpo de ligação à IL-Ιβ, fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor da invenção pode ser diretamente através do dispositivo via bolo ou via administração contínua ou via um cateter usando 25 infusão contínua.

Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de ligação à IL-Ιβ, fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor d antígeno pode ser formulada para inalação tal como, por exemplo, como um pó seco. Soluções para inalação também podem ser formuladas em um

’ propelente liquefeito para distribuição por aerossol. Em ainda outra _K formulação, soluções podem ser nebulizadas. Composição farmacêutica adicional para administração pulmonar incluem aquelas descritas, por exemplo, na Publicação de Pedido PCT WO 94/20069, a qual divulga 5 distribuição pulmonar de proteínas quimicamente modificadas. Para distribuição pulmonar, o tamanho de partícula deverá ser adequado para distribuição distai aos pulmões. Por exemplo, o tamanho de partícula pode ser de 1 pm a 5 pm; contudo, partículas maiores podem ser usadas, por exemplo, se cada partícula é razoavelmente porosa.

Determinadas formulações contendo anticorpos de ligação à

IL-Ιβ, fragmentos de anticorpo, ácidos nucléicos ou vetores da invenção podem ser administrados oralmente. Formulações administradas desse modo * podem ser formuladas com ou sem aqueles veículos comumente usados na composição de formas de dosagem sólidas, tais como tabletes e cápsulas. Por 15 exemplo, uma cápsula pode ser projetada para liberar a porção ativa da formulação no ponto no trato gastrintestinal quando biodisponibilidade é maximizada e degradação pré-sistêmica é minimizada. Agentes adicionais podem ser incluídos para facilitar a absorção de um agente de ligação seletivo. Diluentes, flavorizantes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos =0 vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de tablete e aglutinantes também podem ser empregados.

Outro preparado pode envolver uma quantidade eficaz de um anticorpo de ligação à IL-Ιβ, fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor da invenção em uma mistura com excipientes não tóxicos os quais são adequados para a fabricação de tabletes. Através de dissolução de tabletes em água estéril ou outro veículo apropriado, soluções podem ser preparadas na forma de dose unitária. Excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato ou . bicarbonato de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação, tais ’ como amido, gelatina ou acácia; ou agentes de lubrificação, tais como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.

Formulações farmacêuticas adequadas e/ou preferidas podem ser determinadas em vista da presente divulgação e conhecimento geral de 5 tecnologia de formulação, dependendo da via de administração pretendida, formato de distribuição e dosagem desejada. A despeito da maneira de administração, uma dose eficaz pode ser calculada de acordo com o peso corporal do paciente, área de superfície corporal ou tamanho de órgão. Refino adicional dos cálculos para determinação da dosagem apropriada para _|0 tratamento envolvendo cada uma das formulações descritas aqui é feito rotineiramente na técnica e está dentro do âmbito de tarefas rotineiramente realizadas na técnica. Dosagens apropriadas podem ser determinadas através de uso de dados de dose-resposta apropriados.

Formulações adicionais serão evidentes à luz da presente divulgação, incluindo formulações envolvendo anticorpos de ligação à IL-Ιβ, fragmentos de anticorpo, ácidos nucleicos ou vetores da invenção em combinação com um ou mais de outros agentes terapêuticos. Por exemplo, em algumas formulações, um anticorpo de ligação à IL-Ιβ, fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor da invenção é formulado com um segundo _0 inibidor de uma via de sinalização de IL-1. Segundos inibidores representativos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos, fragmentos de anticorpo, peptídeos, polipeptídeos, compostos, ácidos nucleicos, vetores e composições farmacêuticas tais como, por exemplo, aquelas descritas na US 6899878, US 2003022869, US 20060094663, US 20050186615, US 25 20030166069, WO/04022718, WO/05084696, WO/05019259. Por exemplo, uma composição pode compreender um anticorpo de ligação à IL-Ιβ, fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor da invenção em combinação com um anticorpo de ligação à IL-Ιβ, fragmento ou um ácido nucleico ou vetor que codifica tal anticorpo ou fragmento.

As composições farmacêuticas podem compreender anticorpos ' ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ em combinação com outros agentes ativos. Tais combinações são aquelas úteis para sua finalidade pretendida. Os agentes ativos apresentados abaixo são ilustrativos para finalidades e não se destinam 5 a ser limitativos. As combinações as quais são parte da presente invenção podem ser os presentes anticorpos e fragmentos e pelo menos um agente adicional selecionado das listas abaixo. A combinação pode também incluir mais de um agente adicional, por exemplo, dois ou três agentes adicionais se a combinação é tal que a composição formada pode desempenhar sua função ^0 pretendida.

Agentes ativos ou combinações com os presentes anticorpos ou fragmentos incluem um fármaco anti-inflamatório não-esteroidal (NSAID), tal como aspirina, ibuprofen e outros derivados de ácido propiônico (alminoprofen, benoxaprofen, ácido buclóxico, carprofen, fenbufen, 15 fenoprofen, fluprofen, flurbiprofen, indoprofen, cetoprofen, miroprofen, naproxen, oxaprozina, pirprofen, pranoprofen, suprofen, ácido tiaprofênico e tioxaprofen), derivados de ácido acético (indometacina, acemetacina, alclofenac, clidanac, diclofenac, fenclofenac, ácido fenclózico, fentiazac, fuirofenac, ibufenac, isoxepac, oxpinac, sulindac, tiopinac, tolmetina, lO zidometacina e zomepirac), derivados de ácido fenâmico (ácido flufenâmico, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, ácido niflúmico e ácido tolfenâmico), derivados de ácido bifenilcarboxílico (diflunisal e flufenisal), oxicames (isoxicame, piroxicame, sudoxicame e tenoxicame), salicilatos (ácido acetil salicílico, sulfasalazina) e as pirazolonas (apazona, bezpiperylon, 25 feprazona, mofebutazona, oxifenbutazona, fenilbutazona). Outras combinações incluem inibidores de ciclooxigenase-2 (COX-2). Outros agentes ativos para combinação incluem esteróides, tais como prednisolona, prednisona, metilprednisolona, betametasona, dexametasona ou hidrocortisona. Tal combinação pode ser especialmente vantajosa, uma vez

- que um ou mais efeitos colaterais do esteróide podem ser reduzidos ou mesmo eliminados através de redução da dose de esteróide requerida quando de tratamento de pacientes em combinação com os presentes anticorpos e fragmentos.

Exemplos adicionais de agentes ativos para combinações com anticorpos ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ para artrite reumatóide incluem fármaco(s) anti-inflamatório(s) supressores de citocina (CSAIDs); anticorpos a ou antagonistas de outras citocinas ou fatores de crescimento humanos, por exemplo, TNF, LT, IL-Ιβ, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF ou PDGF. Os anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ser combinados com anticoipos à moléculas da superfície celular, tais como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90 ou seus ligantes, incluindo CD 154 (gp39 ou CD40L).

Combinações preferidas de agentes ativos podem interferir em diferentes pontos na cascata autoimune e inflamatória subseqüente; exemplos preferidos incluem antagonistas de TNF, tais como anticorpos ao TNF quiméricos, humanizados ou humanos; D2E7, cA2 (Remicade™), CDP 571, fragmentos de anticorpo anti-TNF (por exemplo, CDP870) e receptores solúveis de TNF p55 ou p75, derivados dos mesmos, (p75TNFRIgG (Enbrel™) ou p55TNFRlgG (Lenercept), receptor solúvel de IL-13 (sIL-13) e também inibidores da enzima de conversão de TNFa (TACE); similarmente, inibidores de IL-1 (por exemplo, inibidores da enzima de conversão de Interleucina-1, tais como Vx740 ou IL-IRA, etc.) podem ser eficazes pela mesma razão. Outras combinações preferidas incluem Interleucina 11, antiP7s e glicoproteína de p-selectina (PSGL). Ainda outra combinação são outros fatores chave da resposta autoimune os quais podem atuar em paralelo a, dependente de ou em conjunto com a função de IL-1 β.

Agentes ativos para doença de Crohn nos quais um anticorpo ou uma porção de ligação a antígeno podem ser combinados incluem * antagonistas de TNF, por exemplo, anticorpos anti-TNF, D2E7, cA2 (Remicade™), CDP 571, fragmentos de anticorpo anti-TNF (por exemplo, CDP870), estruturas de TNFR-Ig (p75TNFRIgG (Enbrel™) e p55TNFRIgG 5 (Lenercept)), anti-P7s, ligante de glicoproteína de p-selectina (PSGL), receptor de IL-13 solúvel (sIL-13) e inibidores de PDE4. Os anticorpos e fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ser combinados com corticosteróides, por exemplo, budenosida e dexametasona. Os anticorpos ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ também podem ser combinados com agentes tais como sulfa_|0 salazina, ácido 5- amino-salicílico e olsalazina e agentes os quais interferem com a síntese ou ação de citocinas pró-inflamatórias, tal como IL-1, por exemplo, inibidores da enzima de conversão de IL-1 (por exemplo, Vx740) e IL-lra. Os anticorpos ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ também podem ser usados com inibidores de sinalização de células T, por exemplo, inibidores da 15 quinase de tirosina, 6-mercaptopurinas. Os anticorpos ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ser combinados com IL-11.

Outros exemplos de agentes ativos para esclerose múltipla com os quais os anticorpos ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ser combinados incluem corticosteróides; prednisolona; metilprednisolona; LO azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4- aminopiridina; tizanidina; interferon^la (Avonex; Biogen); interferon-pib (Betaseron; Chiron/Berlex); Copolímero 1 (Cop-1; Copaxone; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); oxigênio hiperbárico; imunoglobulina intravenosa; clabribina; anticorpos a ou antagonistas de outras citocinas ou fatores de 25 crescimento humanos, por exemplo, TNF, LT, IL-I, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF e PDGF. Os anticorpos ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ser combinados com anticorpos à moléculas na superfície celular, tais como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 ou seus ligantes. Os

	anticorpos ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ser combinados com
	agentes, tais como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetila, leflunomida, NSAIDs, por exemplo, ibuprofen, corticosteróides, tais como prednisolona, inibidores de fosfodiesterase,
5	agonistas de adensosina, agentes anti-trombóticos, inibidores de complemento, agentes adrenérgicos, agentes os quais interferem com a sinalização através de citocinas pró-inflamatórias, tal como TNFa; ou IL-1 (por exemplo, inibidores de quinase IRAK, NIK, IKK, p38 ou MAP), inibidores da enzima de conversão de IL-Ιβ (por exemplo, Vx740), anti-P7s,
4°	ligante de glicoproteína de p-selectina (PSGL), inibidores de TACE, inibidores de sinalização de células T, tais como inibidores de quinase, inibidores de metaloproteinase, sulfa-salazina, azatioprina, 6-
*	mercaptopurinas, inibidores da enzima de conversão de angiotensina, receptores solúveis de citocina e derivados dos mesmos (por exemplo,
15	receptores solúveis de TNF p55 ou p75, sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R, receptor solúvel de IL-13 (sIL-13)) e citocinas anti-inflamatórias (por exemplo, IL-4, IL-10, IL-13 eTGFp). Exemplos preferidos de agentes ativos para esclerose múltipla nos quais os anticorpos ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ podem ser
0	combinados incluem interferon-β, por exemplo, IFNpla e ΙΡΝβΙό; Copaxona, corticosteróides, inibidores de IL-1, inibidores de TNF e anticorpos ao ligante CD40 e CD80. As composições farmacêuticas podem incluir uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade profilaticamente eficaz dos
25	presentes anticorpos ou fragmentos de ligação à IL-Ιβ. Uma quantidade terapeuticamente eficaz se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários, para obter o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou porção de anticorpo pode variar de acordo com fatores tais como o estado doentio,

• idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade do anticorpo ou porção de ⁹ anticorpo de estimular uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudicais do anticorpo ou porção de anticorpo são superados pelos efeitos 5 terapeuticamente benéficos. Uma quantidade profilaticamente eficaz se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários, para obter o resultado profilático desejado. Tipicamente, uma vez que uma dose profilática é usada em indivíduos antes de ou em um estágio precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor do que a 0 quantidade terapeuticamente eficaz.

Anticorpos de ligação à IL-Ιβ, fragmentos de anticorpo, ácidos nucleicos ou vetores da invenção podem ser empregados sozinhos ou em combinação com outros agentes ativos, os quais podem estar na mesma composição farmacêutica ou em uma composição farmacêutica diferente. Por 15 exemplo, esses outros agentes ativos podem compreender (i) antagonista de

IL-1 (por exemplo, IL- IRa ou uma IL-trap recombinante), (ii) um antagonista do receptor de interleucina-1, (iii) um receptor-1 de TNF solúvel, (iv) um receptor-2 de TNF solúvel (por exemplo, etanercept), (iv) inibidor de TNF (por exemplo, um anticorpo, tal como D2E7) e/ou (v) um agente para èO terapia de câncer. Assim, por exemplo, um ou mais desses componentes podem ser incluídos na composição da invenção com um anticorpo de ligação à IL-Ιβ, fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor da invenção.

Pode ser desejável, em alguns casos, usar uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de ligação à IL-Ιβ, fragmento de 25 anticorpo, ácido nucleico ou vetor da invenção de uma maneira ex vivo. Nesse caso, células, tecidos ou órgãos que foram removidos de um paciente são expostos à composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo de ligação à IL-Ιβ, fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor da invenção, após o que as células, tecidos e/ou órgãos são subseqüentemente implantados novamente no paciente.

Em determinadas situações, uma composição compreendendo um anticorpo de ligação à IL-Ιβ, fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor pode ser distribuição através de implante em células de paciente que 5 foram geneticamente manipuladas, conforme descrito aqui, para expressar e secretar os polipeptídeos, agentes de ligação seletivos, fragmentos, variantes ou derivados. Tais células podem ser células de animal ou humanas e podem ser derivadas de tecido do próprio paciente ou de outra fonte, quer humana ou não-humana. Opcionalmente, as células podem ser células imortalizadas. _|0 Contudo, de forma a diminuir a chance de uma resposta imunológica, é preferido que as cápsulas sejam encapsuladas para evitar infiltração de tecidos *

circundantes. Os materiais de encapsulação são, tipicamente, biocompatíveis, envoltórios poliméricos semi-permeáveis ou membranas que permitem a liberação do(s) produto(s) de proteína, mas previnem a destruição das células 15 pelo sistema imune do paciente ou através de outros fatores prejudiciais de tecidos circundantes.

Métodos usados para encapsulação em membrana de células são conhecidos e o preparo das células encapsuladas e seu implante em pacientes foi descrito, por exemplo, nas Patentes US 4.892.538, 5.011.472 e *) 5.106 .627. Um sistema para encapsulação de células vivas é descrito na

Publicação de Pedido PCT WO 91/10425. Técnicas para formulação de uma variedade de outros meios, tais como veículos lipossômicos, partículas ou glóbulos passíveis de bio-erosão, também são conhecidos por aqueles habilitados na técnica e são descritos. As células, com ou sem encapsulação, 25 podem ser implantadas em tecidos ou órgãos do corpo adequados do paciente.

Uma quantidade terapêutica ou profílaticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de ligação à IL-Ιβ, fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor da invenção dependerá, por exemplo, dos objetivos terapêuticos, tais como a indicação para a qual a

composição está sendo usada, a via de administração e a condição do indivíduo, composições farmacêuticas são administradas em uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz para tratar uma condição relacionada à IL-1. Uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um 5 anticorpo de ligação à IL-Ιβ, fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor da invenção é aquela quantidade a qual pode tratar ou prevenir um ou mais sintomas de uma doença relacionada à IL-1 em um indivíduo.

Conseqüentemente, pode ser desejável titular a dosagem do anticorpo de ligação à IL-Ιβ, fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor _p da invenção e modificar a via de administração, conforme requerido, para obter o efeito terapêutico ótimo. Faixas de dosagem incluem de cerca de 0,1 ng/kg até cerca de 100 mg/kg ou mais (em termos de quantidade de agente ativo por unidade de peso corporal do indivíduo administrado o agente ativo), dependendo dos fatores mencionados acima. Em outras modalidades, as 15 faixas de dosagem de cerca de 0,1 pg/kg a cerca de 100 mg/kg, de cerca de 1 pg/kg a cerca de 100 mg/kg, de cerca de 5 pg/kg a cerca de 100 mg/kg, de cerca de 0,5 mg/kg até cerca de 100 mg/kg ou de cerca de 1 mg/kg até cerca de 100 mg/kg. Outras dosagens podem ser apropriadas. A composição pode ser administrada como uma única dose ou como duas ou mais doses (as quais podem ou não conter a mesma quantidade de um anticorpo de ligação à IL1 β, fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor da invenção) ao longo do tempo ou como uma infusão contínua via, por exemplo, dispositivo de implante ou cateter.

Métodos de Uso

Os anticorpos, fragmentos de anticorpo, ácidos nucleicos, vetores, células e composições da invenção (coletivamente os compostos e composições da invenção) podem ser usados para qualquer finalidade. Por exemplo, os compostos e composições da invenção podem ser usados para pesquisar mecanismos relacionados à IL-1, bem como as doenças e condições

associadas a mecanismos relacionados à IL-1. Contudo, os compostos e composições da invenção são especialmente úteis para tratar um indivíduo (por exemplo, um mamífero ou um ser humano) que precisa de tratamento para uma condição relacionada à IL-1, por exemplo, uma doença ou distúrbio 5 autoimune ou inflamatório. Conseqüentemente, a invenção proporciona um método de tratamento ou prevenção de uma doença em um mamífero compreendendo administração de uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor da invenção a um mamífero que precisa do mesmo, pelo que a doença é tratada ou prevenida no mamífero. ^10 O termo quantidade eficaz” se refere à quantidade do anticorpo ou fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor da invenção necessária para estabelecer um efeito profilático ou terapêutico. Conforme usado aqui, tratamento de uma doença ou condição é definido como redução ou eliminação temporária ou permanente dos sintomas ou progressão de uma doença ou condição.

Similarmente, prevenção de uma doença ou condição significativa inibição, diminuição ou prevenção temporária ou permanentemente do início de uma doença ou condição (ou dos sintomas de uma doença ou condição).

O método da invenção pode ser usado para tratar ou prevenir qualquer doença ou condição relacionada à IL-1. Por exemplo, os presentes M) anticorpos e fragmentos são considerados para uso na profilaxia e tratamento de doenças ou condições médicas mediadas pela IL-1, por exemplo, condições inflamatórias, alergias e condições alérgicas, cânceres, reações de hiper-sensibilidade, doenças autoimunes, infecções graves e rej eição a transplante de órgão ou tecido. Condições relacionadas à IL-1 incluem artrite 25 reumatóide (RA), osteoartrite, doença de Crohn, colite ulcerativa (UC), choque séptico, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), asma, doença enxerto versus hospedeiro, aterosclerose, leucemia de células T em adultos, mieloma múltiplo, esclerose múltipla, derrame, mal de Alzheimer. Os presentes anticorpos e fragmentos também podem ser usados para tratar ou

prevenir Distúrbio Inflamatório de Multi-sistemas com Início Neonatal (NOMID/CINCA), artrite idiopática juvenil de início sistêmico, doença de Stills, CAPS ou síndrome de Muckle-Wells.

Em geral, uma doença ou condição pode ser considerada uma doença ou condição relacionada à IL-Ιβ se ela está associada a níveis elevados de IL-Ιβ em fluidos ou tecido corporal ou se as células ou tecidos tomados do corpo produzem níveis elevados de IL-Ιβ em cultura.

Por exemplo, os presentes métodos podem ser usados para tratar ou prevenir Distúrbio Inflamatório de Multi-sistemas com Início _|.O Neonatal (NOMID/CINCA), artrite idiopática juvenil de início sistêmico, Síndromes Periódicas Associadas a CIAS1 (CAPS), doença de Stills ou síndrome de Muckle-Wells.

Como outro exemplo, os presentes métodos podem ser usados para tratar ou prevenir artrite reumatóide, osteoartrite, doença de Crohn, colite 15 ulcerativa, choque séptico, doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, doença enxerto versus hospedeiro, aterosclerose, leucemia de células T em adultos, mieloma múltiplo, esclerose múltipla, derrame ou mal de Alzheimer.

Como ainda outro exemplo, os presentes métodos podem ser usados para tratar ou prevenir artrite idiopática juvenil de início sistêmico, O artrite reumatóide, osteoartrite, aterosclerose ou miastenia gravis.

Outros exemplos de condições relacionadas à IL-Ιβ são pancreatite aguda; ALS; caquexia/anorexia, incluindo caquexia AIDSrelacionada; asma e outras doenças pulmonares; vasculite autoimune; Síndromes Periódicas Associadas a CIAS1 (CAPS); síndrome de fadiga 25 crônica; enfermidades associadas a Clostridium, incluindo diarréia associada a Clostridium; condições e indicações coronarianas, incluindo insuficiência cardíaca congestiva, restenose coronariana, enfarte do miocárdio, disfunção do miocárdio (por exemplo, relacionada à sepsia) e enxerto por bypass da artéria coronária; cânceres, tais como mieloma múltiplo e leucemias mielogêneas (por exemplo, AML e CML) e outras, bem como metástases tumorígenas; diabetes (por exemplo, diabetes por insulina); endometriose; Síndrome Autoinflamatória de Gripe Familial (FCAS); febre do mediterrâneo familial (FMF); febre; fibromialgia; glomerulonefrite; doença enxerto versus 5 hospedeiro/rejeição a transplante; choque hemorrágico; hiperalgesia; doença inflamatória do intestino; condições inflamatórias de uma articulação, incluindo artrite psoriática (bem como osteoartrite e artrite reumatóide); doença inflamatória dos olhos, conforme possa estar associada, por exemplo, a transplante de córnea; isquemia, incluindo isquemia cerebral (por exemplo, 10 lesão cerebral como um resultado de trauma, epilepsia, hemorragia ou derrame, cada um dos quais pode levar à neurodegeneração); doença de Kawasaki; deficiência de aprendizado; doenças pulmonares (por exemplo, ARDS); miopatias (por exemplo, metabolismo de proteína muscular, especialmente em sepsia); neurotoxicidade (por exemplo, conforme induzido 15 pelo HIV); osteoporose; dor, incluindo dor relacionada ao câncer; mal de Parkinson; doença periodontal; trabalho pré-parto; psoríase; lesão por reperfusão; efeitos colaterais de terapia por radiação; perturbação do sono; doença da articulação temporo-mandibular; síndrome de febre periódica associada ao receptor de fator de necrose de tumor (TRAPS); uveíte; ou uma condição inflamatória resultante de deslocamentos, torções, dano na cartilagem, trauma, cirurgia ortopédica, infecção ou outros processos doentios.

Os presentes anticorpos e fragmentos são também considerados para uso no tratamento de recipientes de transplantes de 25 coração, pulmão, coração-pulmão combinados, fígado, rim, pâncreas, pele ou córnea, incluindo rejeição a aloenxerto ou rejeição a xenoenxerto ou para a prevenção de doença enxerto-versus-hospedeiro, tal como após transplante de medula óssea ou transplante de órgão associado à arteriosclerose.

Os presentes anticorpos e fragmentos são considerados para

100 uso no tratamento ou prevenção de doença autoimune ou condições inflamatórias, em particular condições inflamatórias com uma etiologia incluindo um componente autoimune, tal como artrite (por exemplo, artrite reumatóide, artrite crônica progressiva e artrite e doenças reumáticas, 5 incluindo condições inflamatórias e doenças reumáticas envolvendo perda óssea, dor inflamatória, hiper-sensibilidade (incluindo hiper-sensibilidade das vias aéreas e hiper-sensibilidade dérmica) ou alergias. Doenças auto-imunes específicas para as quais os presentes anticorpos e fragmentos podem ser empregados incluem distúrbios hematológicos autoimunes (incluindo, por =^0 exemplo, anemia hemolítica, anemia aplástica, anemia pura de células vermelhas e trombocitopenia idiopática), lupus eritematoso sistêmico, policondrite, esclerodoma, granulomatose de Wegener, hepatite ativa crônica, miastenia gravis, psoríase, síndrome de Steven-Johnson, psilose idiopática, doença inflamatória do intestino autoimune (incluindo, por exemplo, colite 15 ulcerativa, doença de Crohn e Síndrome do Intestino Irritável), doença endócrina de Graves, sarcoidose, esclerose múltipla, cirrose biliar primária, diabetes juvenil (diabetes mellitus do tipo I), uveíte (anterior e posterior), queratoconjuntivite sicca e queratoconjuntivite vemal, fibrose pulmonar intersticial, artrite psoriática ou glomerulonefrite (com e sem síndrome 4o nefrótica, por exemplo, incluindo síndrome nefrótica idiopática ou nefropatia com alteração mínima).

Os presentes anticorpos e fragmentos também são considerados para uso no tratamento, prevenção ou alívio de asma, bronquite, pneumoconiose, enfisema pulmonar e outras doenças obstrutivas ou 25 inflamatórias das vias aéreas. Os anticorpos ou fragmentos para tratamento de reações inflamatórias agudas e hiperagudas indesejáveis as quais são mediadas por IL-1 ou envolvem a produção, especialmente, ou a promoção de liberação de TNF pela IL-1, por exemplo, infecções agudas, por exemplo, choque séptico (por exemplo, choque endotóxico e síndrome de dificuldade

101 respiratória em adultos), meningite, pneumonia; e queimaduras graves; e para o tratamento de caquexia ou síndrome debilitante associada à liberação mórbida de TNF, conseqüente à infecção, câncer ou disfunção de órgão, especialmente caquexia AIDS-relacionada, por exemplo, associada a ou 5 conseqüente à infecção pelo HIV.

Os presentes anticorpos e fragmentos também são considerados para uso no tratamento de doenças do metabolismo ósseo, incluindo osteoartrite, osteoporose e outras artrites inflamatórias e perda óssea em geral, incluindo perda óssea idade-relacionada e, em particular, doença 10 periodontal.

Os presentes anticorpos e fragmentos também são considerados para uso no tratamento ou prevenção de Síndromes Periódicas Associadas a CIAS 1 (CAPS), incluindo cada um de Distúrbio Inflamatório de Multi-sistema com Início Neonatal (NOMID), Síndrome de Muckle-Wells 15 (MWS) e Síndrome Autoinflamatória de Gripe Familial (FCAS). Mutações no gene CIAS1 são agora reconhecidas como sendo responsáveis por três síndromes genéticas raras: Distúrbio Inflamatório de Multi-sistema com Início Neonatal (NOMID), Síndrome de Muckle-Wells (MWS) e Síndrome Autoinflamatória de Gripe Familial (FCAS). (Hoffinan e colaboradores. 2001 —0 Naure 29: 301-305; Feldmann e colaboradores. 2002 Am J Hum Genet 71:

198-203; Aksentijevich e colaboradores. 2002 Arthritis Rheum 46: 33403348). Em conjunto, essas condições são conhecidas como CAPS. CIAS1 codifica uma proteína denominada NALP3 que é um componente do inflamassoma, um complexo de enzima subcelular que regula a atividade da 25 caspase 1. A caspase 1 é a enzima que cliva a pró-forma inativa da citocina pró-inflamatória, IL-1, em sua forma biologicamente ativa (Agostini e colaboradores. 2004, supra). Mutações no CIAS1 levam à reprodução aumentada de IL-1.

O anticorpo ou fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou

102 vetor da invenção é, tipicamente, administrado ao mamífero ou ser humano como uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Composições farmacêuticas adequadas para uso 5 em conjunto com o método de tratamento ou prevenção de uma doença são conforme previamente descrito aqui.

O anticorpo ou fragmento de anticorpo, ácido nucleico ou vetor da invenção pode ser administrado ao mamífero como o único agente ativo ou em conjunto com um ou mais de outros agentes que rompem a 10 sinalização ao receptor de IL-1. Um agente que rompe a sinalização ao receptor de IL-1 pode ser qualquer composto ou composição que inibe uma interação entre a IL-Ιβ e o receptor de IL-1. Por exemplo, agentes que rompem a sinalização ao receptor de IL-1 incluem anticorpos que se ligam à IL-Ιβ ou ao receptor de IL-1, IL-lRa recombinante (por exemplo, da Amgen 15 Inc., Thousand Oaks, CA) e peptídeos trap do receptor de IL-1 (por exemplo, da Regeneron Inc., Tarrytown, NY). Quando dois ou mais agentes que rompem a sinalização ao receptor de IL-1 são usados, eles podem ser administrados juntos (por exemplo, em uma única composição farmacêutica) ou eles podem, cada um, ser administrados separadamente (por exemplo, em =l0 composições farmacêuticas distintas).

O anticorpo, fragmento, ácido nucleico ou vetor da invenção pode ser administrado a um mamífero em combinação ou em conjunto com um ou mais de outros agentes ativos para tratamento ou prevenção de condições ou doenças mediadas pela IL-1 são apresentadas acima.

Usos Diagnósticos

Além de usos terapêuticos, os presentes anticorpos e fragmentos podem ser usados em métodos diagnósticos para detectar IL-Ιβ (por exemplo, em uma amostra biológica, tal como soro ou plasma) usando um imunoensaio convencional, tal como ensaios imunoabsorventes enzima103 ligados (ELISA), um radioimunoensaio (RIA) ou imunohistoquímica tecidual. Um método para detecção de IL-Ιβ em uma amostra biológica pode compreender as etapas de contato de uma amostra biológica com um ou mais dos presentes anticorpos ou fragmentos e detecção do anticorpo ou fragmento 5 ligado à IL-Ιβ ou anticorpo ou fragmento não ligado para, desse modo, detectar IL-1 β na amostra biológica. O anticorpo ou fragmento pode ser direta ou indiretamente rotulado com uma substância detectável para facilitar a detecção do anticorpo ligado ou não ligado. Substâncias detectáveis adequadas incluem várias enzimas, grupos prótéticos, materiais fluorescentes, —10 materiais luminescentes e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de armorácia, fosfatase alcalina, βgalactosidase ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupo protético adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, 15 fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; e exemplos de material radioativo adequado incluem ¹²⁵1, ¹³¹1, ³⁵S ou ³H.

Ao invés de rotulação do anticorpo, IL-Ιβ pode ser ensaiada lO em fluidos biológicos através de um imunoensaio de competição utilizando padrões de IL-Ιβ rotulados com uma substância detectável e um anticorpo anti-IL-Ιβ não rotulado. Nesse ensaio, a amostra biológica, os padrões de ILΙβ rotulados e o anticorpo anti-IL-Ιβ são combinados e a quantidade de padrão de IL-Ιβ rotulado ligado ao anticorpo não rotulado é determinada. A 25 quantidade de IL-Ιβ na amostra biológica é inversamente proporcional à quantidade de padrão de IL-Ιβ rotulado ligado ao anticorpo anti-IL-Ιβ.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir ilustram adicionalmente a invenção mas, naturalmente não deverão ser construídos como limitando de qualquer

104 maneira seu escopo.

Nos Exemplos a seguir, referência é feita a vários anticorpos da presente invenção, incluindo os anticorpos designados AB1, AB5 e AB7. Conforme mencionado acima, AB1 compreende uma região variável de 5 cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 9. AB5 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de J0 aminoácido de SEQ ID NO: 9. AB7 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 *

e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 11.

Para várias comparações nos Exemplos a seguir, referência é feita a um anticorpo designado AB-controle, um anticorpo comercialmente disponível com afinidade relativamente alta pela IL-Ιβ. AB-controle é um anticorpo de murino o qual acredita-se que tenha uma cadeia pesada compreendendo a seqüência de SEQ ID NO: 40 e uma cadeia leve compreendendo a seqüência de SEQ ID NO: 41. Essas seqüências de murino 4o são apresentadas na Publicação de Pedido de Patente US No. 2003/0026806, nas Figuras 6A e 6B.

Em vários dos Exemplos que seguem, é mostrado que AB5 e AB7 têm afinidade inesperadamente maior pela IL-Ιβ humana do que o ABcontrole.

EXEMPLO 1

Esse exemplo ilustra as afinidades de ligação de determinados anticorpos da invenção à IL-Ιβ.

Anticorpos designados AB1 e AB5 foram avaliados com relação às propriedades de ligação à IL-Ιβ usando um dispositivo KINEXA™

3Ϊ3

105 (da Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID). As seqüências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos AB1 e AB5 são proporcionadas nas Figs. 2 e 3. Um anticorpo comercialmente disponível com afinidade relativamente alta pela IL-Ιβ (aqui AB-controle) foi avaliado para comparação.

Resultados do ensaio de ligação à IL-Ιβ são resumidos na Tabela 1. Valores de Kd representam as constantes de dissociação para os respectivos complexos de anticorpo-IL-Ιβ. A K_D foi calculada como a proporção da taxa off' (taxa de dissociação para o complexo de anticorpoIL-Ιβ) para a taxa on (taxa de associação para o complexo de anticorpo-ILΙβ). Uma menor taxa de K_D é indicativa de maior afinidade do anticorpo.

Tabela 1: Resultados de ligação à IL-Ιβ

Anticorpo	K_D (pM)
AB-controle	3,06
AB1 (invenção)	18,63
AB5 (invenção)	0,261

EXEMPLO 2

Esse exemplo ilustra a inibição in vitro de IL-Ιβ usando anticorpos da invenção.

As potências inibitórias de IL-Ιβ dos anticorpos AB1 e AB5 (veja Exemplo 1) foram avaliados usando um bioensaio que mede a liberação IL-1 β-estimulada de IL-6 de fibroblastos humanos. Conforme no Exemplo 1, AB-controle foi usado como uma amostra comparativa. Detalhes do ensaio são descritos em Dinarello e colaboradores, Current Protocols in Immunology, Capítulos 6.2.1-6.2.7, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000. Resumidamente, fibroblastos humanos MRC5 da American Type Culture Collection (ATCC) Manassas, VA (ATCC #CCL-171) foram crescidos até a confluência em lâminas com multi-cavidades. As células foram tratadas com doses tituladas de anticorpo AB5. As células foram subseqüentemente contatadas com (i) 100 pg/ml de IL-Ιβ ou (ii) 100 pg/ml de

IL-Ιβ e anticorpo AB1 ou AB5 (do Exemplo 1). Células de controle negativo

106 não foram estimuladas com IL-Ιβ. As quantidades de IL-6 liberada em cada grupo de células tratadas foram medidas usando um kit ELISA para IL-6 da BD Pharmingen (Franklin Lakes, NJ) de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados do ELISA são representados na Fig. 5 e resumidos na Tabela 2. A IC₅₀ é a concentração de anticorpo requerida para inibir 50% da IL-6 liberada através de estimulação pela IL-Ιβ.

Tabela 2: Resultados do ELISA

Anticorpo	IC₅₀ (nM)
AB-controle	0,017
AB1 (invenção)	0,15
AB5 (invenção)	0,014

EXEMPLO 3

Esse exemplo ilustra a inibição in vivo de IL-Ιβ usando anticorpos da invenção.

Para confirmar a eficácia in vivo do AB5, sua capacidade de bloquear a atividade biológica de IL-Ιβ foi testada em camundongos. Detalhes do ensaio são descritos em Economides e colaboradores, Nature Med., 9: 47-52 (2003). Resumidamente, camundongos machos C57/B16 (Jackson Laboratory Bar Harbor, Maine) foram injetados intraperitonealmente com doses tituladas de AB5 (Exemplo 1), AB-controle (Exemplo 1) ou IgG de controle (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Vinte e quatro horas após injeção de anticorpo, os camundongos foram injetados subcutaneamente com IL-Ιβ humana recombinante (rhIL-Ιβ) (da PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ) em uma dose de 1 pg/kg. Duas horas pós-injeção de rhIL-Ιβ (tempo para resposta de pico de IL-6), os camundongos foram sacrificados e o sangue foi coletado e processado para soro. Os níveis de IL-6 no soro foram avaliados através de ELISA (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ) de acordo com o protocolo do fabricante. A inibição percentual foi calculada a partir da proporção de IL-6 detectada no soro de um animal experimental para a IL-6 detectada no controle (multiplicada por 100).

Os resultados são apresentados na Fig. 6. A capacidade de

107 inibir a atividade in vivo de IL-Ιβ é avaliada como uma função dos níveis de IL-6 estimulados pela IL-Ιβ no soro. Conforme ilustrado pela Fig. 6, o anticorpo AB5 era tão eficaz, se não mais, do que o AB-controle para inibição da atividade in vivo de IL-Ιβ humana. 3 μg de AB5 eram tão eficazes quanto 5 10 pg de AB-controle nesse ensaio.

Assim, os resultados indicam que os anticorpos testados são úteis para a inibição de atividade de IL-Ιβ in vivo. Esses resultados também mostram que uma única injeção de AB5 pode bloquear a ação sistêmica à estimulação de IL-Ιβ durante um período de tempo prolongado.

_J0 EXEMPLO 4

O exemplo a seguir ilustra o preparo de um anticorpo de acordo com a invenção.

Uma série de seqüências de anticorpo humano manipulado foram geradas usando a tecnologia HUMAN ENGINEERING™, conforme 15 descrito em Studnicka e colaboradores, Protein Engineering, 7: 805-814 (1994) e nas Patentes US 5.766.886, 5.770.196, 5.821.123 e 5.869.619 e Publicação de Pedido PCT WO 93/11794. Seqüências de anticorpo humano manipuladas geradas incluem AB5.1, AB5.2, AB5.3 e AB5.4. Conforme mostrado nas Figs. 3 e 4, cada uma dessas seqüências compreende duas 0 posições variáveis na região CDR-3H indicada por Xi e X2. Assim, em determinados exemplos de cada um desses anticorpos humanos manipulados, Xi e X₂ da CDR3 correspondem à alanina e arginina, valina e arginina, fenilalanina e arginina, lisina e lisina ou asparagina e arginina, respectivamente.

EXEMPLO 5

Anticorpos designados AB5 e AB7 (uma seqüência de anticorpo humano manipulado) foram avaliados com relação às propriedades de ligação à IL-Ιβ usando um ensaio de exclusão cinética realizado sobre um dispositivo KINEXA™ de uma maneira semelhante àquela descrita no

108

Exemplo 1. Descrição adicional sobre dispositivos KINEXA™ e operação para caracterização de anticorpo está disponível do fabricante e pode ser encontrada na literatura publicada, por exemplo, Patente US No. 6.664.114 (Sapidyne, Inc.); e Darling e colaboradores, Kinetic Exclusion Assay 5 Technology: Characterization of Molecular Interactions. ASSAY and Drug

Development Technologies, 2004, 2, 647-657. O dispositivo KINEXA™ realiza um ensaio de exclusão cinética e adapta os dados à várias curvas teóricas e, assim, determina a K_D, bem como outras propriedades, tal como intervalos de confiança de 95% para K_D. O dispositivo KINEXA™ é _10 geralmente mais sensível do que outros dispositivos (por exemplo, um dispositivo BiaCore) para análise de características de afinidade, tais como constantes de dissociação e taxas off.

As seqüências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada e leve do AB5 e AB7 são proporcionadas nas Figs. 3 e 4A, 15 respectivamente. Os resultados do ensaio de ligação à IL-Ιβ são resumidos na

Tabela 3. Conforme no Exemplo 1, a Kd foi calculada como a proporção da taxa off’ para a taxa on e uma menor taxa de K_D é indicativa de maior afinidade do anticorpo.

Tabela 3

Anticorpo	IC_So(nM)
AB5	0,24
AB7	0,30

Os resultados desses experimentos mostram que ο AB5 (consistente com os resultados observados no Exemplo 1) e AB7 se ligam à IL-Ιβ com afinidade inesperadamente alta, a qual é representada pelos valores inesperadamente baixos para suas constantes de dissociação.

As Figs. 7, 8 e 9 mostram as afinidades de ligação de anticorpos designados AB1, AB5 e AB7, respectivamente, conforme determinado a partir de um experimento representativo para cada um usando análise no KINEXA. A Fig. 7 reflete os resultados apresentados na Tabela 1,

109 enquanto que as Figs. 8 e 9 refletem os resultados apresentados na Tabela 3.

Além dos valores apresentados na Tabela 3, os resultados do ensaio KINEXA também indicam intervalos de confiança de 95% altos e baixos (K_D-baixa e K_D-alta). Para ο AB5, a K_D-baixa era de 0,07 pM e a K_D5 alta era de 0,72 pM. Para ο AB7, a K_D-baixa era de 0,11 pM e a K_D-alta era de 0,74 pM.

Valores similares de K_D-baixa e K_D-alta foram encontrados no ensaio apresentado no Exemplo 1. Para o AB-controle, a K_D-baixa era de 1,62 pM e a K_D-alta era de 5,23 pM. Para ο AB1, a K_D-baixa era de 13,38 pM e a _l0 K_D-alta era de 24,84 pM. Para ο AB5, a K_D-baixa era de 0,11 pM e a K_D-alta era de 0,56 pM.

Os resultados do ensaio KINEXA indicam que ο AB5 e AB7 tinham uma constante de dissociação inesperadamente menor do que o ABcontrole.

EXEMPLO 6

Esse exemplo ilustra a inibição in vitro de liberação de IL-6 estimulada por IL-Ιβ. A IC₅o para inibição de liberação de IL-6 estimulada pela IL-Ιβ de fibroblastos humanos foi avaliada para vários anticorpos da presente invenção como segue.

Η) A potência inibitória de IL-Ιβ do AB5 e AB7 foi avaliada de uma maneira semelhante àquela descrita no Exemplo 2, usando um bioensaio que mede a liberação de IL-6 estimulada pela IL-Ιβ de fibroblastos humanos. As Figs. 10-12 mostram as curvas de ligação para ensaios individuais sobre vários anticorpos. A Fig. 10 mostra a inibição de liberação de IL-6 de 25 fibroblastos humanos pelos anticorpos designados AB1, AB2 e AB3 e os resultados desses três ensaios individuais indicaram que ο AB1 tinha uma IC₅₀ de 0,029 nM (29 pM), ο AB2 tinha uma IC₅₀ de 0,076 nM (76 pM) e o AB3 tinha uma IC₅₀ de 0,214 nM (214 pM). A Fig. 11 mostra a inibição da liberação de IL-6 de fibroblastos humanos por anticorpos designados AB1 e

110

AB7 em um ensaio adicional. A Fig. 12 mostra a inibição de liberação de IL-6 de fíbroblastos humanos pelos anticorpos AB5 e AB7, bem como o Kineret® comercialmente disponível. Os resultados indicam que ο AB5 e AB7 tinham potência substancialmente melhor com relação à inibição de IL-Ιβ do que o 5 Kineret, baseado em determinações de IC₅₀ nos ensaios. O Kineret® é uma proteína feita pelo homem que é similar a uma proteína que ocorre naturalmente denominada antagonista do receptor de interleucina-1 (IL-Ira) encontrada no corpo. As Figs 10-12 mostram resultados de ensaios individuais com relação à potência dos anticorpos ou Kineret® em termos de 0 inibição percentual de IL-6 sem anticorpo e a Tabela 4 mostra a IC50 calculada a partir desses ensaios individuais. A IC₅₀ é a concentração de anticorpo ou Kineret® requerida para inibir 50% da IL-6 liberada através de estimulação pela IL-Ιβ.

Tabela 4

Anticorpo	IC50 (nM)
AB5	0,0049 (4,9 pM)
AB7	0,0044 (4,4 pM)
Kineret	0,0454 (45,4 pM)

Além dos resultados do ensaio individual reportados das

Tabelas 2 e 4 e mostrados nas Figuras 6, 10, 11 e 12, outros ensaios individuais foram conduzidos para cada um dos AB1, AB7 e AB-controle. Uma IC50 média pode ser calculada a partir dos resultados de ensaio individuais. Uma IC50 média para ο AB1 de 66,7 pM foi calculada a partir dos 20 resultados do ensaio individual de 35 pM, 30 pM, 150 pM (esse valor também é mostrado na Tabela 2) e 52 pM. Uma IC₅o média para ο AB7 de 5,6 pM foi calculada a partir dos resultados do ensaio individual de 7,3 pM, 4,2 pM, 4,5 pM, 4,4 pM (esse valor também é mostrado na Tabela 4), 6,0 pM, 5,0 pM e 7,8 pM. Uma IC50 média para o AB-controle de 8,9 pM foi calculada a partir 25 dos resultados do ensaio individual de 5,0 pM, 17,0 pM (esse valor também é mostrado na Tabela 2) e 4,9 pM.

Esses resultados demonstram a potência in vitro do AB1, AB5

111 N-V e ΑΒ7 de inibir a IL-Ιβ. Além disso, foi mostrado que a inibição da liberação de citocina estimulada pela IL-Ιβ em fibroblastos humanos se correlaciona com a capacidade do agente de inibição de inibir a atividade IL-1-mediada in vivo. Assim, esses resultados indicam que os anticorpos da invenção terão eficácia inibitória de IL-1 β in vivo.

EXEMPLO 7

Esse exemplo ilustra a inibição in vivo de IL-Ιβ usando anticorpos de ligação à IL-Ιβ

A eficácia in vivo do AB5, AB1 e AB7 e sua capacidade de JO bloquear a atividade biológica de IL-Ιβ humana foram testadas em camundongos de uma maneira semelhante àquela descrita no Exemplo 3. Os b

resultados de testagem do AB5 e AB1 são apresentados na Fig. 13 e os resultados de testagem do AB5 e AB7 são apresentados na Fig. ,14. A capacidade de inibir a atividade de IL-Ιβ in vivo foi avaliada como uma função dos níveis de IL-6 estimulados pela IL-Ιβ no soro. Conforme ilustrado pelas Figs. 13 e 14, os anticorpos AB1, AB5 e AB7 eram eficazes para inibição da atividade in vivo de IL-1 β humana.

Esses resultados indicam que os anticorpos testados são úteis para a inibição de atividade de IL-Ιβ in vivo.

EXEMPLO 8

Esse Exemplo ilustra que pelo menos alguns anticorpos de ligação à IL-Ιβ de acordo com a presente invenção são cruzadamente reativos com a IL-Ιβ de alguns outros mamíferos que não seres humanos e não reagem cruzadamente com a IL-Ιβ de outros mamíferos não-humanos. O anticorpo designado AB7 (um anticorpo que se liga à IL-Ιβ humana com alta afinidade) foi avaliado com relação à ligação à IL-Ιβ de mamíferos nãohumanos, isto é, macaco rhesus, macaco cynomolgus, cão, porco-da-índia e coelho.

Sangue íntegro heparinizado fresco de macaco rhesus, macaco

112 cynomolgus, cão, porco-da-índia e coelho foi obtido do Charles River Labs. O sangue íntegro foi separado através de centrifugação em gradiente de Ficoll e células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas. Para as PBMCs de cada espécie, 2,5 x 10⁵ células/ml foram incubadas em meio RPMI 5 periférico com e sem 50 ng/ml de Lipopolissacarídeo LPS (E. coli 055:B5) e sobrenadantes foram coletados a 24 horas pós-estimulação. LPS se destina a estimular a produção de IL-Ιβ pelas PBMCs. 2 ml de cada sobrenadante foram incubados durante 3 horas com 2 pg de AB7, seguido pela adição de 50 pl de pasta de glóbulo de proteína A-Sepharose para imunoprecipitar o _l0 complexo de AB7/IL-lp. IL-Ιβ humana (Peprotech) foi colocada em RPMI e operada como controles para imunoprecipitação/Western blot. Após centrifugação e lavagem dos glóbulos de proteína A-Sepharose, todas as amostras foram carregadas sobre um gel de SDS-PAGE e operadas a 120V durante 1 hora. Após transferência para membrana Immobilon-P a 22V 15 durante a noite e bloqueio com leite desnatado a 5%, AB7 foi incubado a 2 pg/ml com a membrana durante 2 horas. Um anticorpo de IgG anti-humano secundário conjugado à peroxidase de armorácia (HRP) foi adicionado após as etapas de lavagem e detecção foi com solução de tetrametil benzidina (TMB) em uma etapa.

IO As Figs. 15 e 16 mostram as Western blots obtidas a partir desse procedimento. Do lado esquerdo da blot mostrada na Fig. 15 (fileiras 1-

3) estão os controles nos quais quantidades variadas (5 ng, 10 ng e 20 ng) de IL-Ιβ humana foram adicionadas ao meio RPMI. Próximo do fundo da blot, bandas podem ser observadas em cada uma das fileiras em uma região correspondendo a um peso molecular de aproximadamente 17 kDa. Essas bandas são indicativas da ligação de AB7 à IL-Ιβ humana. A fileira do meio (fileira 4) é o meio RPMI. Sobre o lado direito da blot mostrada na Fig. 15 (fileiras 5-8), os resultados para as amostras de macaco cynomolgus e macaco rhesus são mostrados. As fileiras 5 e 6 são as amostras de macaco

113 cynomolgus sem LPS e com 50 ng de LPS adicionados ao meio RPMI, respectivamente. As fileiras 7 e 8 são as amostras de macaco rhesus sem LPS e com 50 ng de LPS adicionados ao meio RPMI, respectivamente. Próximo do fundo da Western blot, bandas podem ser observadas nas Fileiras 6 e 8 (as 5 amostras às quais LPS foi adicionado) em uma região correspondendo a um peso molecular de aproximadamente 17 kDa. Essas bandas nas Fileiras 6 e 8 são indicativas de reatividade cruzada do AB7 com IL-Ιβ de primata, isto é, IL-Ιβ de macaco cynomolgus e macaco rhesus.

A Fig. 16 mostra Western blots para controles e amostras de -J0 PBMCs de cão, porco-da-índia e coelhos. Sobre o lado esquerdo das blots mostradas na Fig. 16 (fileiras 1-4) estão os controles nos quais quantidades variadas (5 ng, 10 ng, 50 ng e 200 ng) de IL-Ιβ humana foram adicionadas ao meio RPMI. Próximo do fundo da blot, bandas podem ser observadas em cada uma das fileiras em uma região correspondendo a um peso molecular de 15 aproximadamente 17 kDa. Essas bandas são indicativas da ligação de AB7 à IL-Ιβ humana. A fileira 5 na Fig. 15 é o meio RPMI. As fileiras 6-8 são os resultados para as amostras de PBMCs de cão, sem nenhum LPS, 50 ng de LPS e 200 ng de LPS, respectivamente. As fileiras 9 e 10 são os resultados para as amostras de PBMCs de porco-da-índia, sem nenhum LPS e 50 ng de 0 LPS, respectivamente. As fileiras 11 e 12 são os resultados para as amostras de PBMCs de coelho, sem nenhum LPS e 50 ng, respectivamente. Próximo do fundo da Western blot, bandas podem ser observadas nas Fileiras 7, 8 e 12 (as amostras de cão e coelho às quais LPS foi adicionado) em uma região correspondendo a um peso molecular de aproximadamente 17 kDa. Essas 25 bandas nas Fileiras 7, 8 e 12 são indicativas de reatividade cruzada do AB7 com IL-Ιβ de cão e IL-Ιβ de coelho. A ausência de uma visível na Fileira 10 (PBMC de porco-da-índia com 50 ng de LPS adicionados) indica que ο AB7 não reage cruzadamente com IL-Ιβ de porco-da-índia.

Esses resultados indicam que ο AB7 reage cruzadamente com

114 a IL-Ιβ de vários mamíferos não-humanos, isto é, macaco rhesus, macaco cynomolgus, cão e coelho, mas não reage cruzadamente com IL-Ιβ de pelo menos um outro mamífero não-humano, isto é, porco-da-índia.

EXEMPLO 9

Esse Exemplo ainda ilustra que pelo menos alguns anticorpos de ligação à IL-Ιβ de acordo com a presente invenção reagem cruzadamente com a IL-Ιβ de outros mamíferos não-humanos. O anticorpo AB7 foi avaliado com relação à ligação à IL-Ιβ de mamíferos não-humanos, isto é, camundongo e rato.

IL-1 β recombinante humana, de camundongo e rato (Peprotech) foram carregadas em condição e redução e não redução sobre um gel de SDS-PAGE e operadas a 120V durante 1 hora. Após transferência para uma membrana Immobilon-P a 22V durante a noite e bloqueio com leite desnatado a 5%, AB7 foi incubado a 2 pg/ml com a membrana durante 2 horas. Um anticorpo de IgG anti-humano de cabra HRP-conjugado secundário foi adicionado após as etapas de lavagem e detecção foi com solução de TMB em uma etapa.

A Fig. 17 mostra a Western blot obtida através dos procedimentos precedentes. As Fileiras 1 e 2 são para IL-Ιβ humana não=0 reduzida e reduzida, respectivamente. As fileiras 3 e 4 são para IL-Ιβ de camundongo não-reduzida e reduzida, respectivamente. As fileiras 5 e 6 são para IL-Ιβ de rato não-reduzida e reduzida, respectivamente. Na parte inferior da blot, bandas podem ser observadas em cada uma das fileiras em uma região correspondendo a um peso molecular de aproximadamente 17 kDa.

Essas bandas são indicativas da presença, de IL-Ιβ a qual, por sua vez, é indicativa da ligação do AB7 à IL-Ιβ humana, IL-Ιβ de camundongo e IL-Ιβ de rato. Esses resultados indicam que ο AB7 reage cruzadamente com a IL-Ιβ de roedor.

EXEMPLO 10

115

Esse Exemplo ainda ilustra que pelo menos alguns anticorpos de ligação à IL-Ιβ de acordo com a presente invenção são inibidores de IL-Ιβ de seres humanos e pelo menos alguns mamíferos não-humanos. O anticorpo AB7 foi avaliado com relação à inibição da proliferação de células D10 5 estimulada por IL-Ιβ humana, de macaco rhesus, de camundongo e de rato.

Células Dl0.G4.1 (D 10) são células T auxiliares com especificidade pelo antígeno conalbumina de clara de ovo. Esse linhagem de célula foi derivado do camundongo AKR/J (haplotipo H-2^k MHC) e requer ativação do receptor de IL-1 e antígeno para crescimento, proliferação e _L0 sobrevivência. A linhagem de células D10 é altamente sensível à IL-1 e pode responder à IL-1 de várias espécies (incluindo ser humano, macaca, ♦

camundongo e rato) o que permite a testagem do potencial de neutralização de reação cruzada de um anticorpo ou fragmento de ligação à IL-Ιβ, tal como AB7. A proliferação de D10 não é afetada pelo LPS ou por citocinas 15 macrófago-derivadas, tais como IL-6 e TNE-a. Como um resultado, ensaios com D10 podem ser usados para avaliar a atividade de IL-1 específica de fontes endógenas (isto é, macrófagos LPS-ativados).

Células D10 foram ativadas com Concanavalina A (Con A) e um nível constante de fonte recombinante ou nativa de IL-1 na presença ou _0 ausência de várias concentrações de AB7. As células foram colocadas em lâminas a 2 x 10⁴/cavidade e estimuladas com 2,5 pg/ml de Con A e diferentes concentrações de IL-Ιβ. As células foram cultivadas durante 72 horas e a proliferação foi medida através da adição de corante de viabilidade redox Alamar Blue durante as últimas 8-14 horas de cultura e avaliação da 25 O.D.570-600·

Para testar a potência e reatividade cruzada com relação às espécies do AB7, o bioensaio com D10 foi realizado usando as seguintes concentrações de IL-Ιβ recombinante ou nativa: 10 pg/ml de IL-Ιβ humana recombinante; 10 pg/ml de IL-Ιβ recombinante de rhesus; 10 pg/ml de IL-Ιβ

116 de camundongo; e 100 pg/ml de IL-Ιβ de rato. Para o ensaio com D10 empregando IL-Ιβ humana endógena, uma diluição a 1:360 de sobrenadante de PBMCs humanas LPS-ativadas foi usada. Diferentes concentrações de AB7 foram testadas com cada IL-Ιβ. Medições da IC₅₀ foram determinadas usando Graphpad Prism. A média, desvio padrão (SD) e erro padrão (SEM) para IC₅₀ foram calculados usando Microsoft Excel.

Os resultados do ensaio D10 são resumidos na Tabela 5, a qual inclui a IC50 média e a SEM (baseado em 4 experimentos para IL-Ιβ humana recombinante e 3 experimentos para a IL-Ιβ de outras fontes). AB7 era altamente potente na neutralização de IL-Ιβ humana recombinante e IL-Ιβ humana endogenamente produzida (nativa). AB7 também era altamente potente na IL-Ιβ recombinante de macaco rhesus. AB7 também neutralizou a IL-1 β recombinante de camundongo com menor potência, tendo uma IC₅₀ que era 1000 vezes maior comparado com a humana. AB7 não teve atividade significativa contra IL-1 β de rato nesse ensaio.

Tabela 5: Resultados do ELISA

	IC₅o(pM)	SEM (pM)
IL-Ιβ humanarecombinante	2,4	±0,52
IL-Ιβ humana endogenamente produzida (nativa)	2,6	±0,11
IL-Ιβ recombinante de macaco rhesus	2,7	±0,73
IL-1 β recombinante de camundongo	2618	±60,9

Esses resultados indicam que ο AB7 é um anticorpo de neutralização altamente potente contra IL-Ιβ humana, com potência similar contra as formas recombinantes e nativas da citocina.

A atividade contra a IL-Ιβ de macaco rhesus não-primata era similar àquela contra IL-Ιβ humana. Assim, pelo menos alguns anticorpos e fragmentos da presente invenção abrangem anticorpos e fragmentos tendo substancialmente a mesma potência contra IL-Ιβ humana e IL-Ιβ de primata e/ou tendo substancialmente a mesma potência contra IL-Ιβ humana recombinante e IL-Ιβ humana endógena. Esses resultados também indicam que ο AB7 também neutraliza a IL-Ιβ de camundongo.

117

EXEMPLO 11

Esse Exemplo ilustra o mapeamento do epítopo de ao qual pelo menos alguns anticorpos da presente invenção (por exemplo, o anticorpo designado AB7) se liga.

Um arranjo de peptídeo PepSpot™ (JPT Peptide Technologies,

Berlin, Alemanha) foi usado para identificar os resíduos de aminoácido chaves da IL-Ιβ (epítopo) envolvidos na ligação do AB7. Uma exploração de doze peptídeos de aminoácido, abrangendo a seqüência de aminoácido inteira da IL-Ιβ, cada peptídeo sobrepondo em 11 aminoácidos aquele anterior, foi 10 sintetizada diretamente sobre uma membrana. A membrana trazendo os peptídeos foi hibridizada com AB7 em uma concentração de 2 μg/ml durante 2 horas em temperatura ambiente. Ligação do AB7 aos peptídeos ligados à membrana foi detectada usando um anticorpo anti-humano HRP-conjugado secundário, seguido por quimioluminescência intensificada (ECL). Os pontos 15 de peptídeo correspondendo aos resíduos 83-105 da IL-Ιβ foram classificados positivos com relação à ligação ao AB7.

Esse mapeamento indica que ο AB7 se liga a um epítopo dentro da seqüência correspondendo aos resíduos 83-105 da proteína de IL-Ιβ madura. A seqüência compreende os aminoácidos _0 ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE e ο AB7 é um exemplo de anticorpos que se ligam a um epítopo dentro dessa seqüência. Espera-se que os anticorpos AB6, AB8, AB9 e outros, tais anticorpos tendo a cadeia de seqüência de SEQ ID NO: 29 e a cadeia leve de SEQ ID NO: 27, também se ligam a um epítopo contido nessa seqüência.

EXEMPLO 12

Esse exemplo ilustra a inibição in vitro de IL-Ιβ usando um anticorpo da invenção em um ensaio de IL-8 baseado em célula.

Sangue periférico heparinizado fresco foi coletado de doadores saudáveis. 180 μΐ de sangue íntegro foram colocados em uma lâmina com 96

cavidades e incubados com várias concentrações do anticorpo AB7 e 100 pM de rhIL-Ιβ. Para amostras tratadas com Kineret®, Kineret® e rblL-Ιβ foram combinados a 1:1 antes de mistura com sangue. As amostras foram incubadas durante 6 horas a 37°C com 5% de CO2. Células de sangue íntegro foram, então, submetidas à lise com 50 μΐ de Triton X-100 a 2,5%. A concentração de interleucina-8 (IL-8) em lisatos clarificados foi avaliada através de ELISA (kit ELISA para IL-8 humana Quantikine, R&D Systems) de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações de IL-8 em amostras tratadas com AB7 e Kineret® foram comparadas com uma amostra de controle tratada com controle anti-KLH. Os resultados são representados na Fig. 18 e resumidos na Tabela 6. A IC50 é a concentração de anticorpo requerida para inibir 50% da IL-8 liberada através de estimulação pela IL-Ιβ.

Tabela 6

	IC₅₀ (pM)
AB7	1,9 pM
Kineret®	53,4 pM

Esses resultados demonstram a potência in vitro do AB7, conforme medido através da inibição de liberação de IL-8 estimulada pela ILΙβ. Esses resultados mostrando maior potência comparado com o Kineret® indicam que os anticorpos da invenção terão eficácia inibitória de IL-Ιβ in vivo.

EXEMPLO 13

Esse exemplo ilustra que os anticorpos da invenção têm afinidade surpreendentemente alta em comparação com um anticorpo tendo uma seqüência similar.

AB5 foi comparado ao AB-controle em termos de seqüência e afinidade de ligação. Ο AB5 compreende a região variável de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO: 8 e a região variável de cadeia leve apresentada em SEQ ID NO: 9. Acredita-se que o AB-controle compreenda a região variável de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO: 38 e a região variável

119

J. Ί í	de cadeia leve apresentada em SEQ ID NO: 39. Aquelas seqüências apresentadas na Publicação de Pedido de Patente US No. 2003/0026806, nas Figuras 6A e 6B. AB5 e AB-controle têm as mesmas regiões de determinação de complementaridade em suas regiões variáveis de cadeia pesada e leve.
5	Suas cadeias pesadas diferem pelos resíduos de aminoácido na região 3 da estrutura, localizada nas posições 68, 74 e 86 em SEQ ID NOS: 8 e 38. Suas respectivas cadeias leves diferem em um resíduo de aminoácido na região 3 da estrutura, localizada na posição 72 em SEQ ID NOS: 9 e 39. A despeito das similaridades nas seqüências de suas regiões variáveis de cadeia pesada e
-4° *	leve, incluindo as mesmas CDRs, AB5 e AB-controle diferem significativa e inesperadamente quanto à sua afinidade de ligação. Conforme discutido nos Exemplos 1 e 5 acima, descobriu-se que ο AB5 tem uma constante de dissociação de menos de 0,3 pM (com uma K_D-baixa de 0,11 pM e uma K_Dalta de 0,56 pM) e o descobriu-se que o AB-controle tem uma constante de
15	dissociação de 3 pM (com uma K_D-baixa de 1,62 pM e uma K_D-alta de 5,23 pM). Dadas as similaridades na seqüência de aminoácido, é surpreendente que ο AB5 tenha maior afinidade em uma ordem de magnitude. Ο AB7 foi gerado usando a tecnologia HUMAN ENGINEERING™, conforme descrito no Exemplo 4. As regiões variáveis de
4o	cadeia leve e pesada do AB7 incluem posições de risco baixo e moderado nas seqüências das regiões variáveis de cadeia leve e pesada do AB5. Ο AB7 compreende a região variável de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO: 15 e a região variável de cadeia leve apresentada em SEQ ID NO: 11. Ο AB7 foi comparado ao AB-controle e AB5 em termos de
25	seqüência e afinidade de ligação. Ο AB7 e AB-controle têm as mesmas regiões de determinação de complementaridade em suas regiões variáveis de cadeia pesada e leve. Suas cadeias pesadas diferem em duas das três posições na região 3 da estrutura (posições 74 e 86 em SEQ ID NOS: 15 e 38) onde o AB5 diferia do AB-controle; contudo, na posição 68 em SEQ ID NO: 15, o

120 * ΑΒ7 tem o mesmo aminoácido que o AB-controle. Na cadeia leve do AB7, a posição 72 em SEQ ID NO: 11 difere do AB-controle e AB5. Ο AB7 inclui várias outras diferenças nas regiões variáveis de cadeia leve e pesada quando comparado com o AB-controle e AB5 em virtude do processo HUMAN

ENGINEERING™. A despeito da inclusão de alterações em posições de risco moderado e particularmente em vista das alterações no AB7 comparado com ο AB5 na posição 68 na região variável de cadeia pesada e na posição 72 na região variável de cadeia leve, ο AB7 e AB5 têm constantes de dissociação similares e ο AB7 difere significativa e inesperadamente do AB-controle com 10 relação à afinidade de ligação. Conforme discutido no Exemplo 5 acima, descobriu-se que ο AB7 tem uma constante de dissociação de 0,3 pM (com uma K_D-baixa de 0,11 pM e uma Ko-alta de 0,74 pM). Descobriu-se que o AB5 tem uma constante de dissociação de 0,24 pM (com uma K_D-baixa de 0,07 pM e uma K_D-alta de 0,72 pM). Dadas as alterações em posições de risco 15 moderadas e as similaridades globais na seqüência de aminoácido, particularmente nas CDRs, é surpreendente que ο AB7 tenha afinidade similar ao AB5 e maior afinidade do que o AB-controle em uma ordem de magnitude.

EXEMPLO 14

Esse exemplos mostra que pelo menos um anticorpo da presente invenção se liga a um epítopo de IL-Ιβ, de modo que o anticorpo ligado não impede substancialmente a IL-Ιβ ligada ao anticorpo de se ligar ao receptor de IL-1 do tipo I. Esse Exemplo emprega um instrumento de análise cinética Biacore® para examinar se a IL-Ιβ ligada a um dos presentes 25 anticorpos (AB7) pode ainda se ligar ao receptor de IL-1 do tipo I.

Para esse Exemplo, ο AB7 foi imobilizado sobre a superfície de uma lasca sensora CM-5 em um instrumento Biacore como segue. Usando HBS-EP (Biacore®, Inc.) como tampão de operação, a temperatura foi ajustada para 25°C, a taxa de fluxo foi ajustada em 10 pL/min e o trajeto de

121 _k fluxo foi dirigido para a célula de fluxo 2 apenas. 135 pL de cada de soluções de NHS e ECD (Biacore®, Inc.) foram misturados e 70 pL da solução de NHS/ECD foram imediatamente injetados no trajeto de fluxo. Então, 91 pL de uma solução de AB7 (~20 pg/mL em tampão de acetato a 10 mM 5 (Biacore®, Inc.)) foi injetada, seguido por 70 pL de Etanolamina a 1M (Biacore®, Inc.). Aproximadamente 5650 RU de AB7 foram, assim, imobilizados. Para preparar uma superfície de referência, o trajeto de fluxo foi alterado para a célula de fluxo 1 apenas. 135 pL de cada de soluções de NHS e ECD (Biacore®, Inc.) foram misturados e 70 pL da solução de NHS/ECD foram imediatamente injetados no trajeto de fluxo, seguido por 70 pL de Etanolamina a 1M (Biacore®, Inc.).

*

O instrumento Biacore® estava, então, pronto para a análise se a IL-Ιβ ligada ao AB7 ainda se ligava ao receptor de IL-1 do tipo I. Para essa análise, receptor de IL-1 do tipo I solúvel (sRI IL-1) foi usado e a ligação de 15 sRI IL-1 a um complexo de ΑΒ7/ΙΕ-1β foi testada como segue. sRI IL-1 (RnDSystems cat#269-lR-100/CF) e IL-Ιβ (Peprotech, cat#200-01B) foram separadamente diluídos para 10 ug/mL em HBS-EP. A taxa de fluxo foi ajustada para 10 pL/min. O trajeto de fluxo para o instrumento Biacore® foi ajustado para as células 1 e 2 e a subtração de referência da célula de fluxo 2 =0 da célula de fluxo 1 foi usada para determinar um diferencial de resposta. A Fig. 19 mostra o diferencial de resposta medido do instrumento Biacore durante curso da análise. A Fig. 20 proporciona uma ilustração das etapas usadas na análise, indicando as adições distintas à célula de fluxo de (A) sRI IL-1, (B) IL-Ιβ e (C) sRI IL-1, nessa ordem.

A 200 segundos, 20 pL de sRI IL-1 foram injetados para verificar a ausência de ligação diretamente ao AB7 imobilizado (injeção A nas Figs. 19 e 20). Conforme mostrado na Fig. 19, sRI IL-1 não aumenta as unidades de resposta, o que indica que o sRI IL-1 não se liga diretamente ao AB7 imobilizado.

122 v A 600 segundos, aproximadamente 1000 RU de IL-IL-Ιβ foram ligados pelo AB7, formando um complexo de ΑΒ7/ΙΣ-1β sobre a superfície da lasca (injeção B nas Figs. 19 e 20). O aumento nas unidades de resposta indica que a IL-Ιβ se ligou ao AB7 imobilizado. 20 pL de sRI IL-1 foram, em seguida, injetados a 1200 segundos para testar a ligação de sRI IL1 ao complexo de AB7 e IL-Ιβ. Aproximadamente 1500 RU de sRI IL-1 se ligaram ao complexo de AB7/IL-lp (injeção C nas Figs. 19 e 20). Esse aumento nas unidades de resposta indica que o sRI IL-1 se ligou ao complexo de Χ-1β/ΑΒ7.

J.0 Esse Exemplo indica que o sRI IL-Ιβ se liga à IL-Ιβ, mas não se liga ao AB7 e que ο AB7 se liga a um epítopo de IL-Ιβ, de modo que o AB7 ligado não impede substancialmente a IL-Ιβ de se ligar ao sRI IL-1.

Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patente e patentes, mencionados aqui são aqui incorporados por referência, até 15 o mesmo ponto como se cada referência fosse individual e especificamente indicada como sendo incorporada por referência e foram apresentadas em sua totalidade aqui.

O uso dos termos um e uma e o, a e referentes similares no contexto de descrição da invenção (especialmente no contexto Í0 das reivindicações a seguir) deve ser construído para abranger o singular e o plural, a menos que indicado de outro modo aqui ou claramente contradito pelo contexto. Os termos compreendendo, tendo, incluindo e contendo devem ser construídos como termos abertos (isto é, significando incluindo, mas não limitado a), a menos que de outro modo observado.

Sempre que um termo aberto é usado para descrever uma característica ou elemento da invenção, é especialmente considerado que um termo fechado pode ser usado em lugar do termo aberto sem se desviar do espírito e escopo da invenção. Menção de faixas de valores aqui se destina meramente a servir como um método abreviado para se referir individualmente a cada valor

123 separado que cai dentro da faixa, a menos que de outro modo indicado aqui e cada valor separado é incorporado na especificação como se fosse individualmente mencionado aqui. Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que de outro modo 5 indicado aqui ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer e todos os exemplos ou linguagem exemplificativa (por exemplo, tal como) proporcionada aqui se destina meramente a esclarecer melhor a invenção e não impõe uma limitação sobre o escopo da invenção, a menos que de outro modo reivindicado. Nenhuma linguagem na especificação deverá _IO ser construída como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

Modalidades preferidas da presente invenção são descritas aqui, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores para realização da invenção. Variações dessas modalidades preferidas se tomarão evidentes para 15 aqueles habilitados na técnica quando de leitura da descrição precedente. Os inventores esperam que aqueles habilitados possam empregar tais variações conforme apropriado e os inventores pretendem que a invenção seja praticada de outro modo que não conforme especificamente descrito aqui. Conseqüentemente, a presente invenção inclui todas as modificações e —0 equivalentes do assunto em questão mencionado nas reivindicações em anexo, conforme permitido pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas as possíveis variações dos mesmos, é abrangida pela invenção, a menos que de outro modo indicado aqui ou de outro modo claramente contradito pelo contexto.

Claims

1. Anticorpo de ligação a IL-Ιβ ou fragmento de ligação a ILΙβ do mesmo, caracterizado pelo fato de o anticorpo ou fragmento se ligar à IL-1 β humana com uma constante de dissociação de menos de 1 pM e o anticorpo ou fragmento se ligar substancialmente ao mesmo epítopo que um anticorpo tendo a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 11 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 15.

2. Anticorpo ou fragmento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o anticorpo ou fragmento se ligar a um epítopo contido na seqüência ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE (SEQ ID NO: 36).

3. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de o anticorpo ou fragmento de anticorpo ser um anticorpo de neutralização.

4. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de o anticorpo ou fragmento de anticorpo ser um Fab, F(ab')2, um Fv, um fragmento de anticorpo com cadeia simples, um anticorpo multi-específico, um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um minicorpo, um anticorpo linear, um anticorpo recombinante de quelação, um tricorpo, um bicorpo, um intracorpo, um nanocorpo, um produto imunofarmacêutico modular pequeno (SMIP), uma proteína de fusão de imunoglobulina com domínio de ligação, um anticorpo camelizado, um anticorpo contendo VHH ou uma variante ou derivado de qualquer um desses anticorpos ou fragmentos.

5. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de o anticorpo ou fragmento compreender uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 9, 10 ou 11.

6. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com

Petição 870180150663, de 12/11/2018, pág. 12/121

2/2 qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 8, 12, 13, 14, 15, 23, 24, 25 ou 26.

7. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de codificar o anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender o ácido nucleico como definido na reivindicação 7.

9. Composição, caracterizada pelo fato de compreender (a) o anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o ácido nucleico como definido na reivindicação 7 ou o vetor como definido na reivindicação 8 e (b) um veículo adequado.

10. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de a composição ser para uso no tratamento ou na prevenção de uma doença ou condição relacionada a IL-1 em um mamífero.