CN1714153A

CN1714153A - 重组蛋白质变异体

Info

Publication number: CN1714153A
Application number: CNA2003801039329A
Authority: CN
Inventors: J·霍尔姆; J·N·拉森
Original assignee: ALK Abello AS
Current assignee: ALK Abello AS
Priority date: 2002-11-01
Filing date: 2003-10-31
Publication date: 2005-12-28
Also published as: PL375218A1; US20040171116A1; EP2270164A3; US7384635B2; US20090054625A1; AU2003275941A1; WO2004039834A3; WO2004039834A2; EP2270164A2; CA2503886A1; JP2006520184A

Abstract

本发明涉及的是可以用作免疫治疗成分的新型重组蛋白质变异体。本发明还涉及编码所述蛋白质变异体的DNA序列以及包含所述蛋白质变异体的组合物。

Description

重组蛋白质变异体

发明领域

本发明涉及的是免疫疗法，特别涉及的是应用新型重组蛋白的过敏疫苗接种策略。

本发明还涉及一种包含新型重组蛋白变异体混合物的组合物。

发明背景

过敏是适应西方生活方式的国家中存在的一种主要健康问题。而且，在这些国家中过敏性疾病的流行正在增加。尽管一般认为过敏并不是危及生命的疾病，但是哮喘每年导致大量的死亡。在西方，十几岁的青少年中过敏的流行率高达非同寻常的30％，这导致生活质量的显著下降、工作时间的显著减少以及钱财的大量损失，这些已经有足够的理由使得过敏被列为西方世界的一种主要健康问题。

过敏是一种复杂的疾病。有许多因素影响这一致敏化事件。在这些因素中有个体的易感性，它由现在还不能充分搞清楚的一些基因之间的相互作用决定。另外一个重要因素是过敏原的暴露超过了特定阈值。有几个环境因素在这一致敏化过程中可能是重要的，包括污染、儿童时期的感染、寄生虫感染、肠道微生物等等。一旦一个个体被致敏化，且过敏免疫应答被建立，则仅仅很少量的过敏原就会被有效地转化为过敏症状。

过敏性疾病的天然进程通常伴随着两个水平上的病情加剧。首先是症状和疾病严重性的发展以及疾病的发展，例如从花粉热到哮喘。第二是经常出现刺激性过敏原的扩散，导致过敏性多反应性。慢性发炎一般使得粘膜抵御机制出现减弱，导致非特异的刺激以及最终粘膜组织的破坏。婴儿可能主要对食物过敏，例如牛奶，导致湿疹或者胃肠道不适，但是通常他们的这些症状会自然消失。这些婴儿在他们生命后期中有出现吸入过敏的风险。

最重要的过敏原来源是我们呼吸的空气中最为广布的具有特定大小的颗粒。这些过敏原来源非常普遍，包括草的花粉、屋室尘螨的粪便颗粒、这二者是大约50％过敏的原因。具有全球重要性的还有动物的毛屑，例如猫和狗的毛屑、其他花粉例如艾属的花粉，以及微型真菌例如交链孢属真菌。在不同区域过敏原有其他占据优势的花粉，例如在北欧和中欧的白桦花粉、美国东部和中部的豚草以及日本的雪松花粉。昆虫例如蜜蜂和黄蜂的毒液以及食物分别构成2％的过敏发病的原因。

所有IgE介导的免疫反应针对的都是蛋白质。近年来现代分子生物学和结构生物学技术的应用大大促进了对于过敏原分子的研究。这些研究不能证明所有的过敏原存在共同的结构基元或者生物学功能。必须预见的是任何蛋白质都是潜在的过敏原，而大多数过敏原，即主要的过敏原是悬浮于空气中的粒子上面数量最多的蛋白质，粒子的大小有助于过敏原向免疫系统的呈递。

过敏，即I型超敏，是由对外源的非病原物质产生的不适当免疫反应所造成的。过敏的重要临床表现包括哮喘、花粉热、湿疹以及胃肠道不适。过敏反应十分迅速，在接触侵入的过敏原20分钟后达到高峰，8-24小时之后通常有一个晚期反应。而且，就一个特定个体对一种特定过敏原致敏化而言，过敏反应是特异的，而个体对于其他已知导致过敏疾病的物质不一定表现出过敏反应。过敏表型的突出特征是靶器官的粘膜出现明显的炎症，在循环中以及在肥大细胞和嗜碱性细胞表面出现IgE类型的过敏原特异的抗体。

当免疫原特异的IgE抗体与肥大细胞和嗜碱性细胞表面上高度亲和性的IgE特异受体相结合时，外源免疫原与IgE抗体发生反应即引发过敏攻击。肥大细胞和嗜碱性细胞含有预先形成的递质，即组胺、类胰蛋白酶以及其他物质，在两个或更多结合受体的IgE抗体交联时它们被释放。IgE抗体通过同时结合一个过敏原分子而被交联。因此断定只有一个抗体结合表位的外源物质不会引发过敏反应。在肥大细胞表面结合受体的IgE的交联导致信号分子的释放，这些信号分子的作用是吸引嗜曙红细胞、过敏原特异的T细胞以及其他类型的细胞到达过敏应答的位置。这些细胞与过敏原、IgE以及效应器细胞相互作用导致在接触过敏原之后12-24小时症状突现重新开始。

过敏疾病的处理包括诊断和治疗，包括预防性治疗。过敏的诊断涉及过敏原特异的IgE的证明以及过敏原来源的确定。很多情况下仔细考察既往病史对于过敏的诊断和刺激性过敏原的来源物质可能就足够了。但是常见的情况是由客观的测量来支持对过敏的诊断，例如皮肤穿刺测验、血液试验或者激发试验。血液试验的原则是使用一系列的过敏原来源证明特异IgE的存在。有三种主要类型的治疗性选择方案。第一种是避免接触过敏原或者减少接触。尽管避免接触过敏原是显而易见的，例如对于食物过敏原，但是这可能是困难或者昂贵的，如对于屋室尘螨过敏原；或者是不可能的，如对于花粉过敏原。第二种并且是最广泛使用的治疗选择方案是对症开药。对症的药物是安全和有效的，但是它们并不能改变疾病的天然原因，也不能控制疾病的扩散。第三种治疗选择方案是特异性过敏疫苗接种，即特异性的免疫治疗方法，其在大多数情况中减少或者缓解由于特定过敏原引起的过敏性症状。

特异性过敏疫苗接种是过敏性疾病的非正式治疗。它干扰了基本的免疫学机制，使得患者的免疫状况得到持续的改善。因此，特异性过敏疫苗接种的保护性作用延续到治疗阶段以外，这与对症开药治疗形成对比。一些接受接种的患者被治愈，此外多数患者的疾病严重程度得到减轻，或者至少病情停止加重。因此，特异性过敏疫苗接种具有保护作用，降低花粉热发展为哮喘的风险以及降低出现新过敏性的风险。

尽管特异性过敏疫苗接种具有优点，但是其并未被广泛使用，主要有两个原因。一个原因是传统疫苗接种程序不方便，该程序要求几个月中反复进行接种。另一个最重要的原因是过敏性副反应的风险。普通的针对感染性因子的疫苗接种使用一次或者几次高剂量免疫接种就可以有效进行了。而这种策略不能用于过敏疫苗接种，因为接种时已经出现病理性免疫应答。

因此采用长时间内多次免疫进行特异性过敏疫苗接种。接种过程分为两个阶段，剂量增加阶段和维持阶段。在剂量增加阶段使用增加的剂量，通常是16周，从很小的剂量开始。达到推荐的维持剂量时，在维持阶段使用此维持剂量，通常是每六周进行注射。由于有发生过敏性副反应的风险，每次注射之后患者必须接受20-60分钟的医疗看护，过敏性副反应通常可能是危及生命的。此外，诊所必须配备应对紧急情况下治疗的设施。毫无疑问排除疫苗中过敏性副反应的风险有助于更为一般的使用，可能甚至使得在家中进行自我疫苗接种成为可能。

成功过敏性疫苗接种背后的免疫学机制还没有详细理解。特异的免疫应答，例如针对某种病原产生抗体，被认为是一种适应性的免疫应答。这种应答可以与先天免疫应答区别开来，先天免疫应答是针对病原物的非特异反应。

过敏疫苗一定要解决适应性免疫应答的问题，这种免疫应答包括具有抗原特异性的细胞和分子，例如T细胞和产生抗体的B细胞。如果没有具有相应特异性的T细胞的帮助，B细胞不能成熟为产生抗体的细胞。参与激发过敏性免疫应答的T细胞主要是Th2类型的。Th1和Th2细胞之间新平衡的建立被认为是有益的并且对于特异性过敏疫苗接种的免疫学机制是重要的。这种平衡的建立是由于Th2细胞的减少，还是由于Th2细胞向Th1细胞的转变，或者是由于Th1细胞的上调，还存在争议。

近来提出调控性T细胞对于过敏疫苗接种的机制是重要的。根据该模式调控性T细胞，即Th3或者Th1细胞对具有相应抗原特异性的Th1和Th2细胞进行下调控。尽管有这些不明确性，但是一般认为活性的疫苗必须具有激发过敏原特异的T细胞(优选是Th1细胞)的能力。

关于在特异性过敏疫苗接种期间的过敏原特异抗体，有一个重要的观察结果是尽管有临床的改善，但是看起来IgE没有相应的改变。过敏原特异的IgE在治疗的早期可能有暂时的升高。但是在治疗中回到治疗前的水平，接下来可能显示逐渐的下降。而临床的改善在整个治疗过程中稳步增加。

另一个重要的观察结果是在治疗早期过敏原特异的IgG的大量增加。过敏原特异的IgG通常增加到浓度达到IgE浓度的数百或者上千倍。据认为过敏原特异的IgG对于特异过敏疫苗接种的免疫学机制是很重要的，这是由于过敏原特异的IgG可以干扰或者“阻滞”IgE与过敏原之间的相互作用。根据这个模型，有可能IgG在其能够有效地与IgE竞争结合过敏原之前，需要通过重复免疫接种，经历亲和成熟和/或浓度增加的过程，这解释了在治疗中观察到的临床改善的稳步增加。

人类免疫系统有两种不同的特异性分子识别方式：通过T细胞表面的T细胞受体，以及通过抗体——抗体可能结合在产生它们的B细胞的表面，或者自由存在于溶液中，或者与免疫系统中多种不同的细胞表面的特异受体结合。通过T细胞受体的识别要求抗原被内化和消化，抗原的一个片段被抗原呈递细胞呈递到与主要组织相容性复合体(MHC)复合的细胞表面。整个的复合体被体细胞受体识别。

抗原呈递细胞可以是专门的抗原呈递细胞，即巨噬细胞、树突状细胞或者B细胞。巨噬细胞和树突状细胞通过吞噬作用摄取抗原；而B细胞通过表面结合的抗体捕获抗原，接下来进行内化和呈递。T细胞表位是一个有15-20个氨基酸的多肽片段。

B细胞表位，即抗体结合表位，与线性的T细胞表位不同。尽管使用弗氏完全佐剂免疫实验动物产生的抗体可以与线性的多肽片段即序列的表位结合，这种抗体在对于过敏原的天然应答中很少产生。抗体与正确折叠的抗原分子表面的一个部分结合。

因此设想天然存在的过敏原的IgE表位由许多暴露于表面的氨基酸组成，这些氨基酸位于受到过敏原骨架和整体三维结构支撑的有限的表面区域内。这种“表位氨基酸”几乎总是以单个氨基酸或者几个氨基酸组成的簇(这些氨基酸分布于过敏原的大部分一级序列之中)的形式出现，在分子折叠之后被“一起带到”表面上。抗体结合的表位通常可以达到800-900²，但是抗体的结合“掩盖”了更大的区域。这意味着抗体与表位结合之后，高达2000²的区域不能再被其他抗体分子结合。

抗体和抗原之间相互作用的亲和性不仅仅取决于相互吸引的静电引力，即范德华相互作用、氢键以及离子桥，而且取决于将水分子几乎完全排除在交界面外所得到的熵。这样，两个分子表面轮廓的相吻合可以说是确定相互作用结合强度的一个重要参数。因此得出的结论是抗原(或者过敏原)的变性，即去折叠通常破坏了抗体结合表位，这样在生理浓度范围内抗体的结合不再可行。因此还得出的结论是如果一个表位中的氨基酸被另外一个氨基酸替代，将会导致相互作用亲和性的降低。抗体结合亲和性的降低程度取决于特异的被取代的氨基酸以及相应的抗体。例如有报导显示在一个抗原中的一个单氨基酸替代可影响抗原抗体相互作用的1000倍。

尝试使用化学修饰改善用于特异性过敏疫苗接种的疫苗已经进行了30年，这包括了各种方法，这些方法的共同目标是提高安全性而同时又不损害效力；或者换言之，降低IgE的结合同时不损害免疫原性。

最初的方法包括使过敏原完全变性。但是人体试验不能显示效力，这可能是由于没有有效地产生保护性免疫应答。为了解释T细胞在过敏性免疫应答中的作用，在人体试验中测试了中等大小的合成多肽(长度为50-60个氨基酸)。尽管在非常高的剂量时多肽表现出一些作用，但是由于出现了无规律的副反应，试验被终止。从这些试验看到，在疫苗中没有抗体结合表位存在时效力似乎受到损害。

其他的早期尝试包括对过敏原提取物进行化学修饰，化学修饰包括乙酰化(表位掩盖)、与大型多聚物(聚乙二醇)偶联或者使用甲醛或戊二醛使过敏原聚合成为所谓的“类过敏原”。前面两种方法从未进入到人体试验，而“类过敏原”现在有常规的临床使用，但是并未获得提高的安全性。原因很可能是化学交联随机破坏了一些表位，这使得必须使用更高的剂量以获得最佳的效力，因此增加了过敏性副反应的水平，与使用常规过敏疫苗观察到的副反应水平大致相当。

使用遗传工程改善过敏疫苗的方法包括多种不同的破坏过敏原疫苗分子三维结构的策略。其中有替代参与二硫桥形成的半胱氨酸。另一个策略是通过定点突变将一些天然存在的氨基酸替代物装配成一个分子。这些策略的共同性质是破坏疫苗的三级结构，或者至少不认为保持三维结构是重要的。

另外一个通常使用的方法是制备正确折叠的天然存在的过敏原的重组突变体变异体。通常选择的突变以降低突变蛋白对于IgE的亲和性。

WO 99/47608公开了向天然存在的过敏原中已经被确定的关键位置引入人造氨基酸替代物，同时保持了过敏原的α-碳骨架三级结构。

WO 02/40676公开了将至少4个一级的人造氨基酸替代物引入到已经确定的关键位置中，同时保持了过敏原的α-碳骨架三级结构，其中每一个一级突变与其他一级突变之间的间隔至少为15，且其中至少一个面积为800²的环形表面区域不包含突变。

J.Biomol.Struc.Dynamics(2000)，vol.17 pp.821-828(Liang etal.)公开了通过将一个蛋白的功能性部分移植到另一个适当的支架蛋白上，从而将一个蛋白的功能转移给另一个蛋白。做为一个试验系统，将芽孢杆菌RNA酶的抑制因子Barstar蛋白的结合表位移植到一个更小些的分子上。

Protein Science(1994)，vol.3，p.2351-2357(Jin & Wells)公开了使用抗原-抗体复合体研究蛋白质之间的相互作用。研究了人生长激素hGH与单克隆抗体(MAb3)的结合。将5个hGH的与Mab3结合所必须的氨基酸移植到一个没有结合作用的hGH同源物——人类胎盘泌乳素(hPL，其序列与hGH有86％相同)上。还引入了两个框架突变。移植的hPL突变体与Mab3和hGH都有结合。将表位移植到另外一个与hGH有23％同源性的支架蛋白上的尝试没有成功。

J.Immunol(2001)，vol.166，p.6057-6065(King et al.)公开了杂合体的昆虫毒液过敏原。杂合体是将外来过敏原的一小部分，Ves v 5，插入到同源的宿主蛋白Pol a 5中而获得。Ves v 5和Pol a 5的序列一致性达到59％，并且抗原交叉反应程度低。将大约7个氨基酸到大约50个氨基酸的一个部分插入到过敏原中形成杂合体。杂合体用于对蛋白质的含B细胞表位的蛋白区域定位作图，并且可以用作人类的免疫治疗药剂。但是这种制备过敏原杂合体的方法不适宜在过敏疫苗接种策略中应用，原因如下。首先，将来源于昆虫过敏原的多肽片段插入到一个昆虫支架蛋白中，在许多情况下会导致分子的三维结构变得不稳定。不稳定的分子不适于在疫苗接种中使用。第二，由于表位几乎从来不是由过敏原的单个线性多肽片段组成，该途径不适于将三维表位从过敏原“移植”到支架蛋白上。

发明目的

本发明的目的是提供天然过敏原的新型蛋白质变异体，所述的蛋白质变异体具有用于过敏免疫接种的性质。因此，本发明的目的是制备支架蛋白的变异体，用作疫苗成分，这些变异体在整体蛋白质折叠模式和表面局部轮廓方面与天然过敏原相似，同时与过敏原相比其表面轮廓结合IgE的能力低或者下降。目的是制备与所讨论的天然过敏原相似的支架蛋白的表面轮廓，以刺激能产生保护性IgG抗体的免疫应答，这些IgG抗体能够阻碍IgE与天然过敏原的结合因此缓解或者治愈过敏症状。

以前在例如过敏疫苗方面获得具有改良表现的蛋白质变异体的方法主要集中在对天然存在的过敏原进行修饰以降低与IgE结合的亲和性。这种方法的一个主要缺陷是由于向过敏原中引入了大量的突变，使分子的三维结构变得不稳定的风险大大增加，而不稳定的分子对用作治疗性疫苗候选者方面当然没有吸引力了。

本发明的主导思想是选择与天然过敏原具有序列同源性的天然存在的“支架蛋白”。支架蛋白的折叠模式与天然过敏原的折叠模式相似，同时表现出明显降低的抗体交叉反应性。这样就保证了“起始原材料”是具有正确三维折叠模式、与天然过敏原的特异性IgE抗体没有结合或者几乎没有结合的稳定分子。向支架蛋白中引入突变，使得与过敏原结构同源的、已经存在的抗体结合表面轮廓或表位被引入、修饰或者去除，这样会产生稳定的蛋白质变异体，它们能够产生保护性的免疫应答，而引发副反应的风险降低，原因是突变的支架蛋白变异体与天然过敏原相比表现出更低的抗体反应性。

本发明认识到有可能通过将支架蛋白表面区域上对应于表位部分的氨基酸用过敏原一级氨基酸序列中处于相应位置的氨基酸替代，而在支架蛋白上部分或者全部地模拟过敏原的一个表位，这是本发明的基础。特别地，本发明基于认识到即使大多数表位是不连续的，然而完全通过或者部分通过对位于一级氨基酸序列中不同位置的表位中的关键表面氨基酸进行选择性和特异性突变来制备这样的表位还是很有可能的。此外，发现这种突变的支架蛋白变异体可以代替天然过敏原用于治疗和诊断的目的，还发现这种突变的支架蛋白与抗体结合的性质被改变且因此在用作一种过敏疫苗成分使用时具有降低引起过敏反应的风险的优势，这些也都是本发明的基础。

可以通过使用不同蛋白质变异体的混合物更为有效地产生保护性免疫应答，这样将免疫系统接触几种不同的表位区域，优选不在同一个分子上呈递一个以上的表位。

本发明的一方面包含向一个面积可达5000²的确定和连贯的表面区域中引入一级突变以建立一个模拟天然过敏原上表位的表面区域。将要被突变的表面区域限制在5000²的目的是每次只允许一个抗体分子的结合，这样避免在疫苗接种方案中触发效应细胞的风险。优选地，支架蛋白与过敏原特异的IgE抗体没有或者几乎没有可测量的结合，并且因此产生的突变过敏原变异体优选地只具有与一个抗体分子结合的能力。

本发明的另一个目的包括为了建立模拟过敏原表位的一些表面区域而引入突变。并且为了降低其他表面区域与过敏原特异的IgE抗体交叉反应的亲和性可以引入突变。这样在理论上一些抗体分子能够结合所讨论的突变的蛋白变异体，但是与这些抗体同天然过敏原的结合比较，同变异体结合的亲和性大大降低了。IgE相互作用亲和性降低到的水平应该限制或者去除引发效应细胞脱粒的风险，同时保持了诱导保护性抗体形成的能力，所述抗体与所讨论的过敏原发生反应。

附图描述

图1：通过定点突变获得的突变。点线代表DNA序列。线上的括号内的数字代表有义寡核苷酸引物：(1)，(3)，(5)，(7)，(9)，(11)。线下的括号内的数字代表无义寡核苷酸引物：(2)，(4)，(6)，(8)，(10)，(12)。符号X(位置(pos))Y代表不同位置的突变。(1)代表包括蛋白质N末端的有义寡核苷酸引物。(12)代表包括蛋白质C末端的无义寡核苷酸引物。

图2：圆二色性(CD)谱学：rMal d 1(2620)(■)、rBet v 1.2801(●)、突变的rMal d 1(2762)(◇)以及突变的rMal d 1(2781)(△)的CD光谱。

图3A和3B：rBet v 1.2801(·)，rMal d 1(2620)[■]或者具有三个二级突变的突变的rMal d 1(2760)

对生物素化的rBet v 1.2801与合并的白桦过敏患者血清中的IgE结合的抑制。A＝血清库0202/148。B＝血清库11-97。

图4：rMal d 1(2620)的热变性。显示了15℃到90℃得到的CD光谱。天然折叠(15℃)的rMal d 1(2620)在214-216nm和192-194nm分别有负的和正的振幅。与天然折叠的过敏原相比，rMal d 1(2620)蛋白质制备物在204nm处有负振幅，但是在214-216nm处以及192-194nm处的负正数值明显减小。90℃热变性的蛋白质制备物冷却后在15℃再次做一个CD光谱，谱线与天然折叠的蛋白质制备物的谱线重合。此外，在70℃时记录的rMal d1(2620)谱线与15℃时记录的相比只有微小的改变。

图5A、B和C：rMal d 1(2620)(A，B)和rMal d 1(2760)(C)的三维结构模型。图示了分子表面。灰色的表面区域显示了Mal d 1(2620)上Betv 1.2801特异的氨基酸残基。A和C＝前视。B＝后视。一个大的白桦苹果抗体交叉反应表面区域在图A中被黑线框出。图C中用黑色显示了rMal d 1(2760)的三个二级突变N28T，K32Q，E45S。其中的两个二级突变N28T，K32Q影响了大的白桦苹果抗体交叉反应表面区域的局部特征以及氨基酸的电荷分布。

图6A、B、和C：rMal d 1(2620)(A)，rMal d 1(2781)(B)和rBet V1.2801(C)的三维结构模型。图示了分子表面(前视)。灰色的表面区域显示Bet v 1.2801特异的氨基酸残基。白色表面区域显示了Mal d 1(2620)特异的氨基酸残基。图B中在rMal d 1(2781)中引入的六个一级突变用黑色表示。图C中用黑色显示了Bet v 1.2801中相同的氨基酸残基。比较图A、B和C显示rMal d 1(2781)中的六个一级突变将Bet v 1的特异表面结构引入rMal d 1的一个表面区域上。

图7A、B、和C：rMal d 1(2620)(A)，rMal d 1(2762)(B)和rBetv 1.2801(C)的三维结构模型。图示了分子表面(后视)。灰色的表面区域显示了Bet v 1.2801特异的氨基酸残基。白色表面区域显示了Mal d 1(262O)特异的氨基酸残基。图B中在rMal d 1(2762)中引入的八个一级突变用黑色表示。图C中用黑色显示了Bet v 1.2801中相同的氨基酸残基。比较图A、B和C显示rMal d 1(2762)中的八个一级突变将Bet v 1的特异表面结构引入rMal d 1的一个表面区域上。

图8A和B：A．由rBet v 1.2801(·)，rMal d 1(2620)(■)或者分别具有八个和六个一级突变的突变rMal d 1(2762)[◇]或(2781)[△]对生物素化的rBet v 1.2801与合并的白桦过敏患者血清中的IgE结合的抑制。

B.与rBet v 1.2802相比，rMal d 1和突变的rMal d 1的组胺释放。rBetv 1.2801(·)，rMal d 1(2620)(■)或者分别具有八个和六个一级突变的突变rMal d 1(2762)[◇]或(2781)[△]。

图9：图示了IgE抑制实验(右)和组胺释放实验(左)的结果，使用了来自5个患者的血清。右侧：rMal d 1(2620)(■)和突变rMal d 1 2760 分别对人血清IgE与rBet v 1.2801(·)结合的抑制。左侧：与rBet v 1.2801相比，rMal d 1和突变rMal d 1的组胺释放。

图10A和B：支架蛋白以及由引入一级和二级突变而衍生自支架蛋白的支架蛋白变异体的示意图。

图11A、B、和C：对三个独立患者MCDS12(A)，GUA(B)以及AHB21(C)rMAL d 1过敏原的T细胞增殖性应答。

图12：图11(A，B，C)中三个患者的T细胞刺激指数。

图13：Bet v 1特异的T细胞系的T细胞增殖性应答。

图14：对PBL培养中的Mal d 1过敏原的细胞因子应答。

图15：对Bet v 1特异的T细胞系中Mal d 1的细胞因子应答。

图16：Bet v 1特异表面区域I的移植。Dau c 1和Bet v 1的氨基酸比对。序列上方的位置编号是指Dau c 1(T14325)。序列下方的位置编号是指Bet v 1(z80104)。黑色背景显示了多肽序列中具有相同氨基酸残基的位置。灰色背景显示了多肽序列中具有同源氨基酸残基的位置。实施例1A中被靶向引入二级突变的氨基酸位置用黑色背景中的三条杠表示，而引入一级突变的氨基酸位置用黑色箭头表示。

图17：Bet v 1特异表面区域II的移植。Dau c 1和Bet v 1的氨基酸比对。序列上方的位置编号是指Dau c 1(T14325)。序列下方的位置编号是指Bet v 1(z80104)。黑色背景显示了多肽序列中具有相同氨基酸残基的位置。灰色背景显示了多肽序列中具有同源氨基酸残基的位置。实施例1B中被靶向引入二级突变的氨基酸位置用黑色背景中的三条杠表示，引入一级氨基酸突变的位置用黑色箭头表示。

图18：Lep d 2和Der p 2的氨基酸比对。序列上方的位置编号是指Lepd 2(S66499)。序列下方的位置编号是指Der p 2(P49278)。黑色背景显示了多肽序列中具有相同氨基酸残基的位置。灰色背景显示了多肽序列中具有同源氨基酸残基的位置。实施例2A中被靶向引入一级突变的氨基酸位置用黑色背景中的白色箭头表示。实施例2B中被靶向引入一级突变的氨基酸位置用白色背景中的黑色箭头表示。在实施例2A或者2B中建议引入二级氨基酸突变的位置用黑色背景中的三条杠表示。

图19：对Lep d 2上以下氨基酸残基位置的视图：K6，S22，R30，K76，K81，V114，它们在实施例2A中被选择作为引入二级突变的可能靶向位置。ABCD显示了在http：//www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html中使用pdb进入1ktj作为模板对Lep d 2(登录编号S66499)的分子表面进行模型化。A＝正视，B＝转角度1(绕水平轴从平面外翻90°后的正面视图)，C＝转角度2(绕水平轴从平面外翻180°后的正面视图)，D＝转角度3(绕水平轴从平面外翻270°后的正面视图)。灰色显示了在相对应的位置与Der p 2特异的氨基酸残基相同或者同源的氨基酸残基上的α-碳骨架原子或者侧链原子。白色显示了Lep d 2(登录编号S66499)特异的氨基酸残基。黑色显示了Lep d 2上的一些氨基酸残基，它们在实施例2A中被选择作为引入二级突变的可能靶向。

图20：对Lep d 2上以下氨基酸残基位置的视图：D17，S19，Q32，K33，T35，N88，T92，A95，它们在实施例2A中被选择作为引入一级突变的可能靶向位置。ABCD显示了在http：//www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html中使用pdb 1ktj作为模板对Lep d 2(登录编号S66499)的分子表面进行模型化。A＝正视，B＝转角度1(绕水平轴从平面外翻90°后的正面视图)，C＝转角度2(绕水平轴从平面外翻180°后的正面视图)，D＝转角度3(绕水平轴从平面外翻270°后的正面视图)。灰色显示了在Der p 2(pdb进入号1ktj)上面相应位置与Der p 2特异的氨基酸残基相同或者同源的氨基酸残基上的α-碳骨架原子或者侧链原子。白色显示了Lep d 2(登录编号S66499)特异的氨基酸残基。黑色显示了Lep d 2上的一些氨基酸残基，它们在实施例2A中被选择作为引入一级突变的可能靶向。

图21：Mal d 1(2620)和Bet v 1.2801的氨基酸比对。序列上方的位置编号是指Mal d 1(登录编号AJ488060)。序列下方的位置编号是指Bet v 1(登录编号z80104)。黑色背景显示了多肽序列中具有相同氨基酸残基的位置。灰色背景显示了多肽序列中具有同源氨基酸残基的位置。实施例3中被靶向引入二级突变的氨基酸位置用黑色背景中的三条杠表示，而引入一级突变的氨基酸位置用黑色箭头表示。

图22：Gly d 2和Der p 2的氨基酸比对。序列上方的位置编号是指Glyd 2(AJ272216)。序列下方的位置编号是指Der p 2(P49278)。黑色背景显示了多肽序列中具有相同氨基酸残基的位置。灰色背景显示了多肽序列中具有同源氨基酸残基的位置。实施例4中被靶向引入二级突变的氨基酸位置用黑色背景中的三条杠表示，而引入一级突变的氨基酸位置用黑色箭头表示。

图23：对Gly d 2上一些氨基酸残基位置的视图，它们在实施例4中被选择作为引入二级突变的可能靶向位置。ABCD显示了在http：//www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html中使用pdb进入号1ktj作为模板对Gly d 2(登录编号AJ272216)的分子表面进行模型化。A＝正视，B＝转角度1(绕水平轴从平面外翻90°后的正面视图)，C＝转角度2(绕水平轴从平面外翻180°后的正面视图)，D＝转角度3(绕水平轴从平面外翻270°后的正面视图)。灰色显示了在Der p 2(pdb进入号1ktj)上面相应位置与Der p 2特异的氨基酸残基相同或者同源的氨基酸残基上的α-碳骨架原子或者侧链原子。白色显示了Gly d 2(登录编号AJ272216)特异的氨基酸残基。黑色显示了Gly d 2上的一些氨基酸残基，它们在实施例4中被选择作为引入二级突变的可能靶向。

图24：对Gly d 2上一些氨基酸残基位置的视图，它们在实施例4中被选择作为引入一级突变的可能靶向位置。ABCD显示了在http：//www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html中使用pdb进入号1ktj作为模板对Gly d 2(登录编号AJ272216)的分子表面进行模型化。A＝正视，B＝转角度1(绕水平轴从平面外翻90°后的正面视图)，C＝转角度2(绕水平轴从平面外翻180°后的正面视图)，D＝转角度3(绕水平轴从平面外翻270°后的正面视图)。灰色显示了在Der p 2(pdb进入号1ktj)上面相应位置与Der p 2特异的氨基酸残基相同或者同源的氨基酸残基上的α-碳骨架原子或者侧链原子。白色显示了Gly d 2(登录编号AJ272216)特异的氨基酸残基。黑色显示了Gly d 2上的一些氨基酸残基，它们在实施例4中被选择作为引入一级突变的可能靶向。

图25：通过将CD光谱反卷积得到的Mal d 1(2620)，Mal d 1(2762)，Mal d 1(2781)和Bet v 1.2801的二级结构成分的组成。Mal d 1(2762)，Mal d 1(2781)和Bet v 1.2801反卷积的结果是在对参考蛋白Mal d 1(2620)确定的接受范围以内(±15％)，所以可以认为这四个蛋白在二级结构上具有结构相似性。

图26：Biacore实验。单克隆抗体BV16与rBet v 1.2801、未突变的Mald 1(2620)以及突变的rMal d 1(2781)结合。没有观察到与未突变的Mal d1(2620)有结合。BV16与rBet v 1.2801以及突变的rMal d 1(2781)都有结合。

发明概述

本发明涉及的是一种重组蛋白变异体，其具有诱导针对天然过敏原的保护性免疫应答的能力，其中的蛋白质变异体

●是支架蛋白的变异体，所述的支架蛋白具有与天然过敏原结构相似的三维结构折叠模式，

●与支架蛋白相比，所述的重组蛋白变异体包含两个或者更多一级突变，突变之间至少间隔一个未突变的氨基酸残基，每个一级突变向支架蛋白中引入至少一个与天然过敏原中相应氨基酸残基相同或者同源的氨基酸残基，且

●与支架蛋白相比，所述的重组蛋白变异体与对天然过敏原特异的IgE抗体的亲和性和/或结合能力有所提高。

本发明还涉及一或者多种蛋白质变异体在制备用于治疗过敏个体的药物组合物中的用途。

本发明还涉及编码根据本发明的蛋白质变异体的DNA序列以及包含这些DNA序列的载体和宿主细胞，以及制备重组蛋白的方法。

本发明还涉及诊断试验。

发明详述

本发明的主导思想是利用具有相似三维折叠模式但是与天然过敏原没有或者几乎没有抗体交叉反应性的“支架蛋白”作为基础，制备新型的过敏原突变体。

该支架蛋白可以用于产生新型重组蛋白质变异体，这些变异体的表面区域与过敏原特异抗体具有或者没有抗体交叉反应性。使用支架蛋白作为基础产生过敏原疫苗候选者有几个重要的优势。通常需要对过敏原进行大量的突变以降低其与过敏原特异的IgE的反应性，从而降低疫苗接种过程中引发副反应的风险。而且，由于大量的突变有使蛋白质不稳定的趋势，这些突变的过敏原经常不适宜作为疫苗的候选者。因此本发明的主导思想是一般需要相对少量的突变，以在适当的支架蛋白表面部分地或者全部建立过敏原特异的IgE识别轮廓。这样的分子具有诱导新型保护性免疫应答的潜力，新型的免疫应答能够与IgE竞争结合暴露的过敏原，从而使诱发IgE介导的过敏性应答的风险降低。

本发明的一个方面是制备具有一个过敏原同源表面区域的突变蛋白质变异体。据此优选的支架蛋白是与天然过敏原的特异IgE抗体没有或者几乎没有结合的支架蛋白，将它作为起始点会使对于引入二级突变的需要达到最小化。与过敏原特异抗体有一些结合的支架蛋白也可能是适宜的。将一个或者多个二级突变引入这样一个支架蛋白中可以限制或者去除潜在的交叉反应性。支架蛋白以及支架蛋白变异体与天然存在的过敏原的特异性抗体的结合能力可以通过放射性过敏原吸附试验(RAST)抑制来检测，使用一组对于特定过敏原有过敏的患者的血清(Nolte et al(1987)Allergy，42：366-373)。没有抗体结合意味着抗体亲合性降低了1000倍，更为优选降低了10000倍，最为优选100000倍或者更多。

支架蛋白和某过敏原之间结构相似性的比较包括对三维结构和/或氨基酸序列的评价。优选地，通过比较支架蛋白和过敏原的三维结构来评价折叠模式相似性。如果没有已知的支架蛋白和/或天然存在过敏原的三维结构，与过敏原有10％以上序列同一性的蛋白，优选20％以上序列同一性的蛋白一般可以预期与过敏原有类似的折叠模式，并因此可以作为支架蛋白。但是已经知道甚至低于10％氨基酸同一性的蛋白(例如进入AAH05642和pdb登录号1jss所示例的)也与相比较的过敏原(例如在这里是Betv1)具有相同的折叠模式。

还可以根据某过敏原的已知结构对支架蛋白的三维结构进行模拟，或者根据支架蛋白的三维结构对过敏原的结构进行模拟。更为优选的是支架蛋白分子和所讨论的过敏原之间的序列一致性应该低于67％，更为优选在20％-60％之间，更为优选在20％-60％之间，还要更为优选在30％-50％之间。

支架蛋白分子表面上的许多氨基酸与所讨论的过敏原表面上的氨基酸是相同的，且它们的位置是在同源结构中的相应位置上。这可以通过比较三维结构模型或者预期的三维结构而看到。

选择一个表面区域进行“表位移植”，优选表面区域包含尽量多的在支架蛋白和过敏原上处于相同位置的氨基酸残基。这样用于部分或者完全建立在支架蛋白表面上模拟过敏原的表面区域所需要的人工突变的数目会达到最小化。优选地，制备的表面区域包含的面积在1000到3600²之间，不超过5000²。据估计大约2000²的面积在只结合互补决定簇区域之后被掩盖。而且由于整个抗体的存在会导致立体障碍。因此其他抗体分子不能接触到的面积达5000²。

在支架蛋白的所选区域内，对支架蛋白和所讨论的过敏原之间不同的表面氨基酸进行突变，使得所选区域内大多数的--或者优选全部的--表面暴露氨基酸残基与所讨论的过敏原的表面暴露氨基酸同源或者相同。

另一方面可以对表面区域进行修饰，降低其与过敏原表面的相同性或者同源性，以避免与过敏原特异性的抗体的这些表面发生交叉反应。在这种表面区域中，与过敏原中相同位置上的氨基酸残基相同或者同源的氨基酸残基被不同的或者同源性降低的氨基酸残基替代。

可以检查产生的突变支架蛋白(即重组蛋白质变异体)整体折叠模式以及“被移植的”表位区域的构象，对其三维结构进行验证。确定蛋白质二级机构和三级结构的方法包括X射线晶体学、NMR谱以及圆二色性谱。产生的突变分子的稳定性可以采用一系列不同的尿素浓度、pH、离子强度、温度或者其他参数，通过圆二色性光谱学进行评价。

在一个疫苗接种方案中，蛋白变异体或者优选的无重叠过敏原特异表面区域的蛋白变异体的混合物，预期是安全的，这是由于两种对于某过敏原特异的IgE抗体优选地不能同时结合，并因此不会引发过敏反应。而且预期这些变异体或者变异体混合物对于在由过敏原特异的表面区域所涵盖的表面区域内刺激产生保护性IgG抗体应答是有效的，其中IgG对该天然过敏原具有反应性。

根据本发明的另一个方面，制备了突变的蛋白质变异体，其具有几个移植区域，分布在部分的或者整个分子中。可以对支架蛋白进行突变以降低或增加抗体结合亲合性或者二者兼有，这样在支架蛋白的其他部分完全地或部分地去除了的表位区域，和/或建立了表位区域。原则是使整个表面上获得总体低的结合过敏原特异性IgE抗体的亲合相互作用。

支架蛋白表面上的许多氨基酸残基与所讨论的过敏原表面上的氨基酸残基相同。这可以通过比较过敏原和支架蛋白的三维结构而看出。

选择用来降低IgE亲合性的支架蛋白表面区域是连续的表面区域，包含过敏原和支架蛋白之间相同或者同源的氨基酸残基。然后使这样的氨基酸残基突变为与所讨论的过敏原中的氨基酸残基相关或者无关的氨基酸残基。

在蛋白质异体的被选择用来提高过敏原特异的抗体交叉反应性的蛋白质变异体表面区域中，选择在支架蛋白分子和过敏原之间不同的氨基酸残基。然后将这些氨基酸残基突变为与所讨论的过敏原同源的，或者更为优选的是相同的，氨基酸残基。

重组蛋白变异体的表面包含与所讨论的过敏原相同的以及不同的氨基酸区域。当用图表示重组蛋白变异体表面时，可以看到表面包含至少一个基本上是环形的区域，该区域与天然存在的过敏原的相应区域是同源的或者相同的。这个区域的面积约有300-900²，更为优选500-800²，最为优选500-600²。

因此优选地，支架蛋白与天然存在的过敏原特异抗体不具有任何免疫原性反应性。但是也可以使用与天然存在的过敏原特异抗体有反应性的支架蛋白，在这种情况下优选对一个或者多个表位进行修饰以去除或者降低这些表位的抗体结合亲合性。

换言之，本发明的主要方面涉及重组蛋白变异体，其具有诱导针对天然存在的过敏原的保护性免疫应答的能力，其中的蛋白质变异体

●是支架蛋白的变异体，所述的支架蛋白具有与天然存在的过敏原结构相似的三维结构折叠模式，

●与支架蛋白相比，所述的支架蛋白变异体包含两个或者更多一级突变，突变之间至少间隔一个未突变的氨基酸残基，每个一级突变向支架蛋白中引入至少一个与天然存在的过敏原中相应氨基酸残基相同或者同源的氨基酸残基，以及

●与支架蛋白相比，所述的支架蛋白变异体对天然存在的过敏原的特异性IgE抗体的亲和性和/或结合能力有所提高。

根据本发明的一级突变可以包含替代、删除和/或添加。根据本发明，进行2-50个、优选2-40个、更为优选3-25个、更为优选4-15个且最为优选5-12个一级突变。本发明中非常重要的一个方面是至少要进行两个一级突变，以保证所建立的能够结合过敏原特异性抗体的三维表位区域被移植到支架蛋白分子上。

本发明还包含向支架蛋白引入氨基酸残基(这些氨基酸残基在天然存在的过敏原的相应位置处不存在)的一个或者多个二级突变的蛋白质变异体。引入二级突变的目的可以是例如稳定蛋白变异体的三维折叠模式或者降低过敏原特异的IgE交叉反应性。

根据本发明，进行0-20个、优选1-10个或最优选2-5个二级突变。

一般来说，根据本发明的二级突变可以将一个或者多个氨基酸残基突变为在支架蛋白或者天然存在的过敏原中的特定位置上不存在的氨基酸残基。优选地，二级突变是替代天然存在的过敏原中不存在、但是与支架蛋白的氨基酸同源的氨基酸残基，目的是使蛋白质变异体不稳定化的风险降到最低。

根据本发明的一级或者二级突变可以包含通过定点突变(插入、删除或者替代)、DNA重排、和/或基因文库的方法进行的突变。

根据本发明的一级或者二级突变可以由许多连续突变的氨基酸组成。根据本发明，在一级或者二级突变中对1-15个、优选为1-10个、最优选为1-5个连续的氨基酸进行突变。在许多情况下，暴露于表面的属于一个表位区域的氨基酸在过敏原一级结构中作为单个氨基酸“点”而存在。在这些情况下通常对这样的氨基酸进行点突变即有效。但是在其他情况下有必要突变几个连续的氨基酸以增加或者降低抗体结合亲合性。

本发明的一个方面包含制备重组蛋白变异体的一种方法，这些蛋白变异体具有诱导针对天然存在的过敏原的保护性免疫应答的能力，该方法包含以下步骤：

●选择一个支架蛋白，所述的支架蛋白具有与天然存在的过敏原的三维折叠模式结构上相似的三维折叠模式，

●向支架蛋白中引入两个或者更多一级突变，突变之间间隔至少一个未突变的氨基酸残基，每个一级突变向支架蛋白中引入至少一个与天然存在的过敏原中相应位置上的氨基酸相同或者同源的氨基酸残基，以及

●这样就制备了一个蛋白质变异体，与支架蛋白相比较，它对天然存在的过敏原的特异性IgE抗体的亲合性和/或结合能力有所提高。

通过上述方法可以获得的产物也包含在本发明的范畴中。

在一项实施方案中，根据本发明的蛋白质变异体与支架蛋白相比较，对天然存在的过敏原的特异抗体的结合能力提高。所述的结合能力与天然过敏原的抗体结合能力相比，优选地提高10％，更优选地提高50％且高达100％。而且与天然存在的过敏原相比，所述的蛋白质变异体诱导组胺释放的能力优选地有所下降。与天然存在的过敏原的相应能力相比，蛋白变异体使组胺释放的能力优选下降两倍，更优选10倍，还更优选100倍，还更优选1000倍且最优选10000倍或者降低更高。

通过确保蛋白质变异体诱导组胺释放的能力，即变异体与IgE受体交联的能力大大降低，这样蛋白质变异体作过敏疫苗的活性组分就成为了天然过敏原的更为安全的替代物，这是由于导致组胺释放的能力主要与急性类型的过敏应答和过敏疫苗接种中的副反应有关，并且是这些副反应产生的原因。

根据第二个实施方案，根据本发明的蛋白质变异体具有的三维折叠方式或者α-碳骨架三级结构与支架蛋白的十分相似，这在实施例4中有测量和描述。一个组成表位的表面轮廓由多肽的α-碳骨架的折叠模式所支撑。

根据一项优选的实施方案，根据本发明的蛋白质变异体因此优选地来源于的氨基酸一致性在20％-60％之间，优选地在30％-50％之间的支架蛋白。

根据第三个实施方案，根据本发明的蛋白质变异体的所有一级突变都位于面积为600-900²的表面区域中，这样就保证一级突变组成了能够被过敏原特异抗体的互补决定簇识别的表位区域。而且根据本发明的蛋白质变异体优选地包含暴露在表面的氨基酸的一级突变。暴露在表面的氨基酸的溶剂可接触性在20％以上，优选在30％以上，更为优选在40％以上，最为优选在50％以上。

根据本发明的第四个实施方案，天然存在的过敏原是一种吸入过敏原，优选地是来自分类的壳斗目，木樨目或者松杉目，最为优选的是Bet v 1(数据库登录编号：Z80104)。一个优选的Bet v 1折叠蛋白是Mal d 1。

在其他优选的实施方案中，主要白桦花粉过敏原Bet v1的支架蛋白有，例如Aln g 1(赤杨)的同种型由登录编号S50892示例；Car b 1(角树)的同种型，由登录编号Q96382，Q96381，CAA47367，Q96377，Q96378，Q96379，Q96503，Q96501，CAA47366，Q96380示例；Fag s 1(山毛榉)的同种型，由登录编号AJ130889示例；Cas s 1[Castanea sativa甜栗]的同种型，由登录编号AJ417550示例；Mal d 1(苹果)的同种型，由登录编号AJ488060，Q43550，Q43551，Q43552，Q43549，AAK13027，AAK13028，Q40280，AAD13683，Q9SYV2，Q9SYV3，Q9SYV4，Q9SYV6，Q9SYV9，Q9SYW3，Q9SYV5，AAK13029，Q9SYV7，Q9SYV8，JC4276，S51119示例；Pru av 1(樱桃)的同种型，由登录编号022521024248，050001以及gi13787043示例；Pyr c 1(梨)的同种型，由登录编号AF057030示例；Api g 1(芹菜)的同种型，由登录编号p49372，p92918示例；Dau c 1(胡萝卜)的同种型，由登录编号004298，t14322，t14325示例；羽扁豆的同种型，由登录编号p52779(pdb进入号1IFV_A)示例；其他Patogenesis相关蛋白的同种型，例如由登录编号CAA10719，S20517，P93333，AB17_PEA，AB18_PEA，T14817所示例的以及其他含有相同二级结构元件排列的蛋白，例如进入AAH05642(pdb进入号1jss)表示的蛋白。

在一个实施方案中，Mal d 1(2620)(数据库登录编号：AJ488060)是Betv 1支架蛋白，蛋白质变异体包含选自以下组中的至少两个一级突变：(E12V，E12I，E12M，E12L)，P16A，(H40S，H40T)，143N，L44I，D47N，G65K，K70R，(E76H，E76R，E76K，Q76H)，S107T，G108P，+109D，S110G，E129A，K152L，(P154S，P154T)，P155S；且可选进行一或者更多二级突变，二级突变选自以下组：N28X，优选是N28T，K32X，优选是K32Q，E45S，E96X，+159X。在上述以及在以下的实施例中，第一个字母和数字对应某特定氨基酸位置中原来的氨基酸符号。后面的字母是可以用来替代原来氨基酸的氨基酸。括号的含义是在一个给定的位置进行突变时有几种不同的选择。可以选择其中的一种。

在一个特别的实施方案中，Mal d 1蛋白变异体(rMal d 1(2760))包含了SEQ ID NO.1限定的序列：

GVYTYENEYTSEIPPPRLFKAFVLDADTLIPQIAPQAIKHAEILSGDGGPGTIKKITFGEGSQYGYVKHKIDSVDEANYSYAYTLIEGDALTDTIEKVSYETKLVASGSGSIIKSISHYHTKGDVEIMEEHVKAGKEKAHGLFKLIESYLKDHPDAYN，

所述的变异体包含下面的二级突变：N28T，K32Q，E45S。rMal d 1(2760)变异体是根据本发明的支架蛋白的一个实例，该支架蛋白包含了许多二级突变，它们一起降低了支架蛋白与Bet v 1特异性IgE抗体的反应性，这在实施例中有详细的阐释。

在另一个特别的实施方案中，Mal d 1蛋白变异体的一个蛋白变异体(rMal d 1(2781))包含了SEQ ID NO.2限定的序列：

GVYTYENEYTSEIPPPRLFKAFVLDADNLIPKIAPQAIKHAENIEGNGGPGTIKKITFGEGSQYKYVKHRIDSVDHANYSYAYTLIEGDALTDTIEKVSYETKLVASGSGSIIKSISHYHTKGDVEIMEEHVKAGKEKAHGLFKLIESYLKDHPDAYN，

所述的变异体包含下面的一级突变：I43N，L44I，D47N，G65K，K70R，Q76H。rMal d 1(2781)变异体是根据本发明的蛋白变异体的一个实例，与“天然的”Mal d 1 2620相比，该蛋白变异体与Bet v 1特异性IgE抗体的反应性降低。这在实施例中有详细的阐释。

在另一个特别的实施方案中，Mal d 1蛋白变异体的一个蛋白变异体(rMal d 1(2762))包含了SEQ ID NO.3限定的序列：

GVYTYENEYTSVIPPARLFKAFVLDADNLIPKIAPQAIKHAEILEGDGGPGTIKKITFGEGSQYGYVKHKIDSVDEANYSYAYTLIEGDALTDTIEKVSYETKLVATPDGGSIIKSISHYHTKGDVEIMEEHVKAGKEKAHGLFKLIESYLLDHSDAYN，

所述的变异体包含下面的突变：E12V，P16A，K152L，P155S，S107T，G108P，+109D，S110G。“+”在此的意思是在所示位置插入一个氨基酸。rMal d 1(2762)变异体是根据本发明的蛋白变异体的一个实例，与“天然的”Mal d 1 2620相比，该蛋白变异体与Bet v 1特异性IgE抗体的反应性提高。这在实施例中有详细的阐释。

在一个表明Mal d 1的蛋白质变异体可能包含一级和二级突变的实施方案中，这样的蛋白质变异体包含至少两个选自以下组的一级突变：(E12V，E12I，E12M，E12L)，(H40S，H40T)，(E76H，E76R，E76K)，E129A，(P154S，P154T)；且可选进行一个或者更多选自以下组的二级突变：E8X，N28X，K32X，E96X，+159X。

根据第五个实施方案，本发明的蛋白质变异体是其中Dau c 1(数据库登录编号T14325)是Bet v 1的支架蛋白的蛋白质变异体。根据该实施方案，Dau c 1的蛋白质变异体包含至少两个选自以下组的一级突变：(S12V，S12L，S12I，S12M)，S14P，E16A，P105A，A107P，(A148S，A148T)，(I151L，I151V，I151M)，(N153H，N153K，N153R)，(+154S，+154T)，(+155D，+155E)，+156A，(+157Y，+157F)，(+158N，+158Q)，(K39S，K39T)，(K44E，K44D)，(V52I，V52M，V52L)，(I54K，I54R，I54H)，(T64K，T64R，T64H)，(T65Y，T65F，T65W)，(T67K，T67R，T67H)，D86E，L91G，(G92D，G92E)；且可选进行一个或者更多选自以下组的二级突变：K32X，E42X，E59X，R69X，E95X，K122X，E8X，T10X，D25X，K32X，D46X，E59X，E95X，D108X，K122X。

在一个特别的实施方案中，Dau c 1蛋白质变异体包含至少两个选自以下组的一级突变：(S12V，S12L，S12I，S12M)，S14P，E16A，P105A，A107P，(A148S，A148T)，(I151L，I151V，I151M)，(N153H，N153K，N153R)，(+154S，+154T)，(+155D，+155E)，+156A，(+157Y，+157F)，(+158N，+158Q)；且可选进行一个或者更多选自以下组的二级突变：K32X，E42X，E59X，R69X，E95X，K122X。该实施方案显示了在支架蛋白的表面建立单一表位区域，而其他区域被突变以降低抗体亲合性。

在另一个特别的实施方案中，Dau c 1蛋白质变异体包含至少两个选自以下组的一级突变：(K39S，K39T)，(K44E，K44D)，(V52I，V52M，V52L)，(I54K，I54R，I54H)，(T64K，T64R，T64H)，(T65Y，T65F，T65W)，(T67K，T67R，T67H)，D86E，L91G，(G92D，G92E)；且可选进行一个或者更多选自以下组的二级突变：E8X，T10X，D25X，K32X，D46X，E59X，E95X，D108X，K122X。该实施方案是另一个实例，显示了在支架蛋白的表面建立单一表位区域，而降低分子其他部分的抗体亲合性。

在本发明的第六个实施方案中，天然存在的过敏原来自分类学中的禾本目，菊目或者荨麻目。主要的草花粉过敏原Phl p 1的支架蛋白的实例有Zea m 1的同种型，由登录编号Q07154所示例；Gly m 1的同种型，由登录编号U03860示例；Ory s 1的同种型，由登录编号U31771示例；β棒曲霉素的同种型，由登录编号U95968，AC001229，U95967，s53082，U30477，U85246，Y07782，U30479，U30481，U30480，U30478，U30476，U30460，U30382，U64890，U64891，U64892，U64893，U82123，D26459，D88415示例；第二组和第三组草花粉过敏原的同种型，由登录编号P14947，X73363，A48595，P43214，P14948，U25343，Z50867示例。Phl p 5是另外一个草花粉过敏原的实例。猫尾草(Phleumpratense)第五组过敏原的实例，Phl p 5支架蛋白包括：P93466，081342，Q9SBE0，081343，081344，2023228A，S38584。黑麦草(Lolium perenne)第五组过敏原的实例，Lol p 5支架蛋白包括CAB64344，Q9XF24，a38582。草地早熟禾(Poa pratensis)第五组过敏原的实例，Poa p 5支架蛋白包括：Q9FPR0，B39098。绒毛草(Holcus lanatus)第五组过敏原的同种型，Hol l 5，由023971，023972，Q9FPQ9示例。喜湿虉草(Phalaris aquatica)第五组过敏原的同种型，Pha a 5，由MP51_PHAAQ示例。鸭茅(Dactylis glomerata)第五组过敏原的同种型，Dac g 5，由Q93XE0，Q93XD9示例。大麦(Hordeumvulgare)第五组过敏原的同种型，Hor v 5(还被称为Hor v 9)，由004828示例。猫尾草(Phleum pratense)第六组过敏原的同种型，Phl p 6由065868，CAA76557示例。

在本发明的第七个实施方案中，天然存在的过敏原是尘螨过敏原，优选地来自尘螨属(Dermatophagoides)，且优选是Der p 2(数据库登录编号P49278)。优选的Der p 2支架蛋白是Eur m 1(数据库登录编号P25780)、Glyd 2(数据库登录编号AJ272216)，和Lep d 2(数据库登录编号S66499)。

Lep d 2蛋白质变异体的一个具体实施方案是包含至少两个选自以下组的一级突变的蛋白质变异体：D17L，D17I，D17V，D17M，S19P，Q32K，Q32R，Q32H，K33P，T35Q，T35N，N88K，N88R，N88H，T92N，T92Q，A95K，A95R，A95H；且可选进行选自以下组的一个或者更多二级突变：K6X，S22X，R30X，K76S，K81X，V114X。这是Lep d 2蛋白质变异体的实例，该蛋白的表面建立了单一的表位区域，可以选择在表面的其他部分下调Der p 2的抗体交叉反应性。

Lep d 2蛋白质变异体的另一个具体实施方案是在单一表位区域内包含至少两个选自以下组的一级突变的蛋白质变异体：D45N，D45Q，N47K，N47R，N47H，K48T，K48S，T50K，T50R，T50H，K52E，K52D，L54K，L54R，L54H，E107K，E107R，E107M，H112D，H112E，T119I，T119L，T119V，T199M；且可选进行选自以下组的一个或者更多二级突变：K6X，S22X，K29X，R30X，K76X，K81X。

Gly d 2蛋白质变异体的一个具体实施方案是包含至少两个选自以下组的一级突变的蛋白质变异体：K2Q，K2N，K4D，K4E，K10N，K10Q，T14K，T14R，S22H，S22R，S22K，K39V，K39L，K39I，K39M，D45N，D45Q，T60L，T60V，T60I，T60M，Q6三维，Q63E，K80V，K80L，K80I，K80M，T91S，H112D，H112E，R122I，R122V，R122L，R122M；且可选进行选自以下组的一个或者更多二级突变：K6X，优选是K6R或K6H，R30X，优选是R30K或者R30H，F74X，优选是F74Y或者F74W，K81X，优选是K81R或者K81H，K88X，优选是K88R或者K88H，T90X，以及V114X，优选是V114L，V114I或者V114M。该实例是与Der p 2相比较，具有提高的IgE反应性的蛋白质变异体，并且可选择进行二级突变将氨基酸替代为同源氨基酸，以避免蛋白质突变体出现不稳定。

其他Der p 2支架蛋白的具体实施方案是第二组尘螨腐酪食螨(Tyrophagus putrescentiae)过敏原Tyr p 2的同种型，由数据库登录编号002380示例；储藏室尘螨害嗜鳞(Lepidoglyphus destructor)第二组过敏原Led d 2(在某些出版物中被错误地称为Led d 1)的同种型，由登录编号P80384，S48727，2118249B示例；Gly d 2的同种型，由登录编号CAB76459，Q9U5P7示例；同源蛋白组的同种型，由登录编号097763，P79345，Q9VQ62，Q9Z0J0，AAF99719，Q28895示例。

在另一个优选的实施方案中，主要屋室尘螨过敏原Der p 1的支架蛋白是Der f 1(登录编号P16311)。

在本发明的第八个实施方案中，天然存在的过敏原是来自蟑螂(德国小蜚蠊(Blatella germanica)(过敏原：Bla g 1 or B1a g 2))、美洲大蠊(Periplenata Americana)(过敏原：Per a 1)或者蠓(Chironimus Spp.-过敏原：Chi t 1)的昆虫过敏原。

在本特异发明的第九个实施方案中，天然存在的过敏原是动物过敏原，优选的是哺乳动物过敏原，优选地来自猫、狗、大鼠、小鼠或者马，优选地是来自猫的Fel d 1过敏原。

在本发明的第十个实施方案中，天然存在的过敏原是毒液过敏原，优选地来自分类学中的膜翅目中的胡蜂科、蜜蜂科、或者蚁科。优选的毒液过敏原是Ves v 5。可能的Ves v 5支架蛋白包括P35783，P35760，P35785，P35784，P35787，P35736，P35786，P10737，Q05108，P35781，P35782，P81657，P81656，P35780，P35759，Q05109，P35779，P35778。此外其他低同源性蛋白实例有P54108，019010，P16562，Q16937，P48060，Q60477，P35795，P35795，Q09566，P47033，Q40374，P12020，Q41359，P47032，Q91055，Q034401，P08299，P11670，P36110，P16563，P54107，Q08697，Q04108，P79845，P07053，P09042，P35794，P04284，Q03402，P33154，P35792，Q05968，P35793，Q00008，Q41495，P16547，P13390，022456，Q15335，Q62871，088487，Q13409，P54131，Q9LRZ5，P18859，004067。

在本发明的第十一个实施方案中，天然存在的过敏原是来自花生、大豆、牛奶、鸡蛋清或者蛋黄、虾或者鳕鱼的食物过敏原。

在本发明的第十二个实施方案中，支架蛋白与植物、草、食物或者螨虫的过敏原同源。根据该实施方案的蛋白质变异体包含至少一个一级突变。与天然存在的过敏原的去卷积CD谱相比，蛋白质变异体的去卷积CD光谱的偏离还小于30％，优选地小于20％，且更为优选地小于10％。优选地，支架蛋白与天然存在的过敏原之间的序列同一性在30％-50％之间；优选地，支架蛋白与天然存在的过敏原的α-碳骨架三级结构相似，相似程度是它们的CD谱之间的偏离小于30％，优选小于20％，且更优选小于10％(实施例4)。

在本发明的第十三个实施方案中，天然存在的过敏原是一个真菌蛋白。

优选地，本发明的蛋白质变异体包含至少一个T细胞表位，它能够刺激产生对天然存在的过敏原特异的T细胞克隆或者T细胞系。

因此，蛋白质变异体在Th2T细胞应答之上优选地诱导新的过敏原特异的Th0/1T细胞免疫应答，或者支架蛋白变异体诱导T细胞无反应性或者诱导T细胞的应答从Th2-类型变为Th1-类型。

本发明还涉及根据本发明的蛋白质变异体作为药物的用途，以及用于治疗或者预防过敏的药物的生产制备的用途。优选地，药物组合物包含两种或者多种根据本发明的重组蛋白质变异体，其中每个变异体具有至少一个一级突变在其他变异体的至少一个中不存在。这样，可以使得变异体中存在模拟天然过敏原表位的不同表位区域，同时确保在例如肥大细胞表面出现IgE交叉结合的风险达到最小。根据本发明的组合物优选地包含2-12个，优选地包含3-10个，更为优选包含4-8个，最为优选包含5-7个不同的蛋白质变异体。这种组合物可以用于制备预防和/或治疗过敏的药物。

根据本发明的药物组合物优选地包含一种生理上或者药物上可以接受的载体和/或赋形剂和/或佐剂。“载体”或者赋形剂包括通常与药物一起使用的任何载体或者赋形剂，例如油、淀粉、蔗糖和乳糖。根据本发明的组合物可以为适合口服的形式，包括胶囊、药丸、药片和糖浆。或者根据本发明的组合物可以为肠道外制剂的形式，例如适于静脉内、皮下等给药。

“佐剂”是指在与抗原共同注射时促进或者延长抗体合成的一种物质。佐剂的实例包括弗氏完全/不完全佐剂以及氢氧化铝胶体。根据本发明的药物组合物优选地是疫苗形式，针对天然存在的过敏原在过敏患者中引起的过敏反应。

包含在本发明范畴内的还有通过在其体内产生免疫应答对个体进行疫苗接种或者治疗的方法，包括向受试者给服根据本发明的重组蛋白质变异体或者药物组合物。

包含在本发明范畴内的还有将根据本发明的重组蛋白质变异体或者组合物与药物上可以接受的物质和/或赋形剂和/或佐剂混合来制备药物组合物的方法。

本发明的另一个方面包括制备重组蛋白质变异体的方法，其中的重组蛋白质变异体由DNA序列产生，该DNA序列来自编码支架蛋白和天然存在过敏原的DNA序列的DNA重排(分子育种)。

最后，本发明涉及编码重组蛋白质变异体的DNA序列。同样，本发明包含含有根据本发明的DNA序列并能够产生重组蛋白质变异体的表达载体和宿主细胞。而且，重组蛋白质变异体的制备方法也包括在本发明中，其包括培养这种带有载体的宿主细胞。使用重组蛋白质变异体评价对受试者进行治疗的相关性、安全性和结果的诊断实验也包括在本发明中，其中受试者的含有IgE的样品与所述的蛋白质变异体或者所述的组合物相混合，评价所述样本中的IgE与所述蛋白质变异体的反应性水平。

定义

支架蛋白：支架蛋白是一种天然存在的蛋白，它经常与被选作过敏原疫苗接种的过敏原有很高程度的氨基酸序列同源性。此外，支架蛋白的三维折叠模式与天然存在的过敏原的三维折叠模式相似。很难确切地给出必须达到何种标准才能说两个蛋白有相似的折叠模式。但是本领域内的技术人员知晓氨基酸同源性在10％以上的蛋白质或者蛋白质结构域，其以相似的方式折叠、具有相似含量的α-螺旋、随机卷曲和β-折叠片的可能性非常高。这可以通过例如圆二色性来测定，其中两个蛋白CD谱之间的偏离应该小于30％，优选小于20％，还要更为优选小于10％。

优选地，支架蛋白与过敏原特异的IgE之间没有或者几乎没有可测量的反应性，因此能在支架蛋白上建立过敏原特异的表面区域，即表位结构。这样，只有一个过敏原特异表位的突变支架蛋白不能与一个以上的IgE分子结合，因此就不能导致如肥大细胞表面附着的IgE分子发生交叉结合。与过敏原表位类似的蛋白质变异体表面区域在这里被称为例如“表位区域”、“模拟一个表位”等等。

“过敏原特异的抗体”，例如Bet v 1特异的抗体是指与天然存在的过敏原发生反应的抗体。这种抗体还可以与其他结构相关的蛋白，包括突变体变异体，发生反应。

支架蛋白和过敏原之间的序列同源程度在0到95％之间，优选在5-90％之间，更为优选在10-67％之间，还要更为优选在20-60％之间，最为优选在30-50％之间。在鉴别两个蛋白是同种型或同源蛋白时经常选择67％为最低程度的序列一致性(King et al，(1995)J.Allergy Clin.Immunol.96：5-14)。优选地，支架蛋白不是天然存在过敏原的同种型或者同源物，这样就保证支架蛋白与过敏原之间只有较低程度的抗体交叉反应性。

与支架蛋白相比，蛋白质变异体对天然存在的过敏原的特异抗体的结合能力提高：可以认为此陈述与完整蛋白变异体以及单个表位都有关。

与天然存在过敏原的特异IgE抗体完全没有结合的支架蛋白：选择用于突变的支架蛋白可能完全不同某过敏原的特异抗体发生结合，或者优选地一些来自对该过敏原过敏的普通患者的IgE抗体可能有交叉反应性。与抗体没有结合的意思是平均抗体亲合性降低1000倍，更为优选的是10000倍，最为优选的是100000倍或者更高。对于多克隆抗体，亲合性一般是平均亲合性。对于单克隆抗体亲合性也被称为抗体亲抗原性。

一级突变(表位的产生、稳定骨架等等)：一级突变的引入可以是替代、删除或者添加。优选地，一级突变是使用与天然过敏原中相应位置上的氨基酸同源或者相同的残基代替至少一个支架氨基酸残基。蛋白质变异体优选包含2-50个、更为优选2-40个、更为优选3-25个、更为优选4-15个、最为优选5-12个一级突变。而且，蛋白质变异体可能包含一个或者更多由许多连续的突变氨基酸组成的突变序列片断。优选地，突变的序列片段由2-15个、更为优选3-12个、最为优选5-10个氨基酸组成。

在本发明的一个优选的实施方案中，所有的蛋白质变异体的一级突变位于面积大约900 ² 的表面区域中。在本发明的该优选实施方案中蛋白质变异体只有一个表位与天然存在的过敏原的特异IgE抗体有反应性。认为这种蛋白质变异体的优势是它不会产生不利的免疫应答，例如过敏反应，这是由于这种应答需要引发IgE交联，即这种应答需要过敏原有至少两个不重叠的表位。

优选地，要被突变的主要氨基酸残基是暴露于表面的氨基酸。要被突变的氨基酸残基的溶剂可接触性优选大于20％，优选地大于30％，更为优选地大于40％，最为优选地大于50％。

除了突变暴露于表面的氨基酸，即组成表位的氨基酸之外，蛋白质骨架的氨基酸，即位于蛋白质三级结构内部的氨基酸也可以被突变。这种突变可能改变分子的折叠，并由此改变蛋白质表面上表位的结合性质。突变的目的之一可能是稳定骨架的折叠，从而稳定蛋白质的三级结构。一个实例可以是二硫桥的引入。

在本发明的一个实施方案中，通过定点突变进行一个或者更多突变。定点突变可以根据在例如“分子克隆”[Sambrook & Rusell(2001)，冷泉港实验室出版社]中的详细描述进行。

DNA重排：是一个包含许多重组方法的术语，通过这些重组方法，许多具有显著同源性的序列或者序列片段被例如消化和超声波等打断。通过重新连接和接下来的PCR(聚合酶链式反应)，大量的新变异体随机产生。DNA重排可以通过更有控制的方式进行，通过例如向反应中加入序列明确的引物等。

基因文库方法：基因文库方法包括构建、表达和筛选任意形式的DNA文库，这些DNA文库编码蛋白质的突变变异体。编码蛋白的DNA序列可以半随机或者随机进行突变。描述半随机文库的非限制性实例可以是一个文库，其中突变的基因变异体中发生突变的只是编码暴露于表面的氨基酸残基的DNA密码子。另一个实例是对于突变结果的任何限制，即突变是否只允许替代某些氨基酸残基例如同源氨基酸残基、小的或者带电荷的/没有电荷的氨基酸残基。在一个实施例中，通过使用简并寡核苷酸引物和PCR技术引入多样性。在另一个实施例中，突变多样性是通过使用可引起高频突变的宿主生物体而引入的。通过半随机文库的方法引入一个或者更多突变。

二级突变(表位的减弱或者去除)：二级氨基酸突变是向支架蛋白氨基酸残基中引入的突变，这些突变在天然存在的过敏原的对应位置处不存在。

二级氨基酸突变可以是替代、删除或者添加。蛋白质变异体优选地含有0-50个，更为选1-40个、更为优选2-25个、更为优选3-15个、最为优选4-12个二级突变。而且，蛋白质变异体可能包含一个或者更多二级突变，每一个二级突变由许多连续的突变氨基酸组成。突变的序列片段优选地由2-15个、更为优选3-12个、最为优选5-10个氨基酸组成。

以上提到的二级突变的目的是对支架蛋白的表位进行修饰以去除或者降低其抗体结合作用，从而降低IgE交联以及引发过敏反应的风险。

表位移植：表位移植的含义是在支架蛋白表面确立过敏原特异的抗体结合性质。由于该“移植的”支架蛋白变异体能够使保护性免疫应答产生，所以它是一个有吸引力的抗过敏疫苗候选者。

保护性免疫应答：使保护性免疫应答产生的意思是改变免疫系统对于天然存在的过敏原的反应，以避免出现与过敏有关的不利反应。保护性免疫应答被认为主要由大量IgG抗体的产生而介导，推测这些IgG抗体可能阻碍过敏原和IgE抗体之间的相互作用。保护性免疫应答很可能还包括对T细胞的刺激。

表面结构/轮廓：虽然一个蛋白的三维折叠由α-碳骨架的三级折叠决定，但是有关蛋白质局部形状和电荷分布的分子表面结构/轮廓的特性部分地决定于表面存在的氨基酸链的特性和组成，所以分子表面结构显示出一定程度的溶剂可接触性。因此在蛋白表面引入一级和/或二级突变会改变蛋白质表面结构/轮廓的特性。

本发明的组合物：根据本发明的组合物或者药物组合物可以包含至少一种支架蛋白变异体以及任何其他药物的或者非药物的试剂、赋形剂、佐剂、载体、媒介物或者药物传输系统。

蛋白质变异体：与天然存在的蛋白质的氨基酸序列存在一个或者更多氨基酸差异的蛋白质。优选地，根据本发明的蛋白质变异体是支架蛋白的重组蛋白变异体，所述的蛋白变异体能够与对一种过敏原过敏的患者的血清发生反应，该过敏原与天然存在的过敏原的氨基酸序列具有高度同源性。但是，与天然存在的过敏原相比，蛋白质变异体的IgE反应性更低。

氨基酸一致性水平：在这里，氨基酸一致性水平定义为两个一级蛋白质序列中相对应位置上相同氨基酸残基的百分比。

氨基酸同源性水平：在这里，氨基酸同源性水平定义为两个一级蛋白质序列中相对应位置上的氨基酸残基相同或者同源的百分比。

过敏原：根据本发明的过敏原是任何已经报导的在与个体反复接触时引发过敏——即IgE介导的反应——的天然存在的蛋白质。天然存在的过敏原的实例包括吸入过敏原(树或者草的花粉过敏原、螨虫过敏原、昆虫过敏原(吸入剂和毒液过敏原)、来自狗、猫、马等动物的毛发和皮屑过敏原)以及食物过敏原。

免疫应答的调节：在使用部分模拟过敏原结构的重组蛋白变异体进行疫苗接种后，会出现以下几个水平的“免疫应答”：(a)蛋白质变异体可能与预先形成的IgE结合--这些IgE或者已经与例如肥大细胞结合或者存在于循环中--而不导致在肥大细胞表面上的IgE交叉结合；(b)可能形成新型IgG抗体，或者已有的IgG抗体“成熟化”以增加表位亲和性；以及(c)新的或者已有的T细胞可能被激活。因此在本发明的背景下，免疫应答的调节被解释为重组蛋白变异体诱导保护性IgG应答的能力，优选地，该重组蛋白还刺激T细胞同时降低在例如肥大细胞表面上IgE交叉结合的风险。接触过敏原之后不良反应的主要原因是肥大细胞表面上的IgE交叉结合。

一个过敏原变异体是否能够促使产生“与天然存在的过敏原促使产生的免疫应答相当的免疫应答”，这可以用几种方法量度。不止限于本发明，一种优选的量度方法是在至少一次免疫检测中，对支架蛋白变异体结合过敏实验对象血清IgE的能力或者抑制来自过敏实验对象的血清IgE与天然存在过敏原结合的能力进行统计显著性(p＜0.05)检验。另一种优选的方式是在免疫检测中测量用支架蛋白变异体免疫接种的动物的血清样本中抗体与过敏原特异的IgE竞争结合的能力。

抗体-抗原相互作用亲和性：抗体-抗原相互作用的特异性和亲和性是一枚硬币的两面。这是因为结合强度，即亲和性，不仅仅由吸引力(焓的作用)即离子相互作用、氢键、范德华相互作用决定，而且由复合体中将水分子从两个分子的界面处几乎完全排开(熵的作用)决定。用通常的话讲，意思是分子表面局部轮廓的完全适合是至关重要的。

适合度的降低，例如由于突变的结果，几乎总会导致相互作用亲和性的下降。复合体仍然会形成，但是是在更高的浓度下，而且从动力学角度看，平衡会发生移动，于是在任何给定的时刻会有更高比例的抗原和抗体分子自由存在于溶液中，而相反较低比例的分子会相互结合形成复合体。

因此，无论亲和性如何，提高相互作用反应物--即抗原或者抗体--中任意一个的浓度会使复合体的浓度增加。用通常的话讲，只要浓度足够高，任何抗原会和任何的抗体结合。这反过来意味着对于反应物需要有浓度的限制，以确保在与生理浓度相近的浓度下发生反应，即特异的相互作用。

因此K_d是相互作用亲和性的直接量度。但是实际来讲，由于通常使用多克隆抗体，所以K_d是一个不易测量的量。

在抗体浓度恒定的情况下，作log[抗原]对[抗原抗体]的函数图，得到S形曲线。在最大结合的一半时的抗原浓度是一个实际中有用的测量值--但是是K_d和B_max的组合。在给定抗体浓度时抗原抗体复合体饱和时的浓度是一个常数，B_max。B_max在理论上更容易理解，因为它是最大的结合，但是实际中可能很难获得足够高的抗原浓度。B_max是结合能力。这样，可以比较在给定抗体浓度时结合能力的相对量度。

一个突变使抗原表面的一部分明显改变，则抗原对于未突变抗原特异的多克隆抗体的结合能力降低。突变抗原和一个多克隆抗体之间相互作用的平均亲和性可能也会降低。但是如果多克隆抗体的特异性没有随机散布在整个表面(已知一些患者的IgE会出现这种情况)，或者是一个单克隆抗体，即如果被抗体识别的表位在突变影响的区域以外，则结合能力以及平均亲和性可能不会因为突变受到影响。如果使用大规模免疫实验动物产生的多克隆抗体或者是患者血清的混合物，则这种情况出现的可能性会降低。

根据本发明，可以在某些表面区域引入突变。以降低这些区域的平均亲和性，对于其他表面区域也是如此，不同之处在于，其目的是在所讨论的过敏原特异的抗体的整个表面获得均衡的低亲和性相互作用。这些支架蛋白变异体具有与所讨论的过敏原相似的抗体结合能力，但是平均亲和性显著下降。在一个体外试验系统中，可以使用由肥大细胞或者嗜碱细胞表面上结合的IgE的交联释放组胺的能力来评价支架蛋白变异体的这些联合性质。释放组胺的能力一定程度上反映了平均亲和性，一定程度上反应了相关的临床反应。而且，这种支架蛋白变异体刺激IgG抗体的产生，其极可能与天然的过敏原以低亲和力相互作用。由于与IgE相比IgG抗体含量要多得多，即使低亲和性的IgG相互作用也被认为能有利地干扰天然过敏原和低浓度IgE之间高亲和性相互作用。

对IgE反应性，例如结合能力和结合亲和性的评价

评价支架蛋白变异体的IgE反应性，可以有许多种实验方法，例如，K_d，即抗体抗原相互作用的平均亲和性，以及B_max，即结合能力，可以在固相免疫抑制试验或者直接的结合试验中进行实验测量。

在固相免疫抑制试验中，可以将抗体与固相偶联。还可以使用偶联在固相上的抗原进行这些实验。然后使用待测抗原--即突变的支架蛋白--的系列稀释，对纯化和标记好的过敏原的结合进行抑制，并且与使用未突变的分子进行的相似实验进行比较。用抑制百分比对抑制剂浓度的对数作图，图线符合S形曲线。如果一个突变的抗原其K_d有变化，但是B_max相同，这会使得到的曲线沿X轴平移。高亲和力会使曲线左移，反之亦然。B_max的改变会影响曲线的最大值以及S形曲线中线性部分的斜率。在所有突变抗原与非突变分子进行比较的情况下，曲线的线性部分可以用统计学检测其线性，并且可以检测曲线的线形部分是否平行，或者从完整曲线拟合——即四参数对数曲线拟合——得到的参数之间的比较可以用于统计分析。如果曲线是平行的并且是相互平移的，这就显示了抗体抗原相互作用的不同亲合性。如果斜率不同，这就显示了表位的组成，即结合能力有所改变，或者结合能力和亲和性二者都有所改变。

暴露于表面的氨基酸：是指位于三维结构表面的氨基酸残基，其排列方式使得当过敏原在溶液中时，该氨基酸残基至少一个原子的至少一部分可以被周围的溶剂接触。优选地，三维结构中氨基酸残基的溶剂(水)可接触性至少是20％，适宜的是至少30％，更为适宜是至少40％，且最为优选是至少50％。

溶剂可接触性：定义为可以被半径与溶剂(水)分子(半径为1.4)相当的球体接触的分子面积。短语“暴露于表面的”、“表面氨基酸”以及“暴露于溶剂的”可以交换使用。

同源氨基酸残基：同源氨基酸残基的特点是共同具有大致相同的化学性质。分类氨基酸的一个实例是将丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸有时还有甘氨酸和脯氨酸描述为“脂肪氨基酸”。其他的“组”包括羟基残基(丝氨酸和苏氨酸)、酸性残基(天冬氨酸和谷氨酸)、酰胺残基(天冬酰胺和谷胺酰胺)、碱性残基(赖氨酸和精氨酸)以及芳香残基(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)。当然其他将氨基酸划分为具有相似化学性质的组的分类也是可以的，例如将氨基酸分为疏水和亲水残基。

使用以下非限制的实施例进一步阐述本发明。

实施例

实施例1

与Bet v 1同源的支架蛋白的修饰

定点突变

所有的Mal d 1突变体都是如下产生的。首先(I)将每一个单突变(或者是几个突变，如果它们在DNA序列上紧密靠近)引入编码Mal d 1(2620)(登录编号AJ488060)的DNA序列中，使用包含每一个突变的有义和反义突变特异的寡聚核苷酸引物以及包含上游或者下游邻近突变或者Mal d 1 N末端/C末端的有义和反义的寡聚核苷酸引物，分别如图1(I)所示。第二，来自(I)中PCR反应的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和PCR凝胶纯化，混和作为再次(II)PCR反应的模板，并使用包含Mal d 1 N末端和C末端的寡聚核苷酸引物，如图1(II)所示。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和PCR凝胶纯化，然后用乙醇沉淀，限制性酶切(Sac/EcoRI或者SacI/XbaI)，定向连入用相同酶切割的pMAL-c中。

核苷酸测序

在添加0.1g/l氨苄青霉素的LB培养基中过夜生长至饱和的10ml细菌培养物，用tip 20柱(QIAGEN)纯化其质粒DNA，使用Perkin Elmer公司的直接反应染料终止循环测序试剂盒和荧光测序仪AB PRISM 377进行测序，按照厂商的建议进行测序反应。

蛋白质的表达和纯化

重组的Mal d 1(2620)和突变体在具有氨基末端大肠杆菌融合伙伴麦芽糖结合蛋白(MBP)的操纵子中，在大肠杆菌DH5α细胞中过量表达。向6个含有1升添加100mg/L氨苄青霉素的LB培养基的5升摇瓶中接入10ml转化大肠杆菌的过夜培养物，在37℃振荡培养至600nm光吸收至0.75，加入5ml100mM IPTG诱导，3小时后离心收获。6升培养物的菌体重悬于2×150ml的裂解缓冲液(30mM NaCl，10mM EDTA，1mM苯甲脒，10mg/ml SBTI(一种蛋白酶抑制剂)，10mM Na2HPO4·12H2O/NaH2PO4·H2O缓冲液pH7.0，0.02％NaN3)，加入3mM PMSF，在冰上用超声波裂解10分钟。超声后加入1.5ml1mg/mlDNA酶、5mM MgCl2和40ml 4M NaCl，室温孵育30分钟去除DNA。细胞裂解物在4℃12000rpm离心30分钟。上清(300ml)混和在一起，使用0.45微米的滤器过滤，加入稀释缓冲液(0.5M NaCl，2mM EDTA，1mM苯甲脒(benzaminide)，10μg/ml SBTI，10mM Na2HPO4·12H2O/NaH2PO4·H2O缓冲液pH7.0，0.02％NaN3)1200ml。重组的融合蛋白经淀粉酶亲和层析分离，使用装有Unicore 4.0软件的Akta explorer system(Pharmacia Biotech，瑞典)的200毫升的淀粉酶层析柱。洗脱的融合蛋白用装有30KDa截断分子量滤膜的amicon压力离心管浓缩至30ml，用2×5L 20mM TRIS-HCl pH8.0透析过夜。

用1％的1mg/ml因子Xa在切割缓冲液(20mM TRIS-HCl pH8.0，100mMNaCl，2mM CaCl2，0.02％-1.00％SDS)对所有MBP-Mal d 1融合蛋白在20℃切割20小时，缓慢搅拌，融合蛋白的浓度是OD280＝4-6。由加入5mM苯甲脒和10mM的EDTA终止因子Xa的切割。蛋白质溶液用装有10KDa截断分子量滤膜的Amicon压力离心管浓缩至20ml，加入到一个50ml的上样环中，进行FPLC，使用Pharmacia Sephadex G-75层析柱，进行10个循环，根据厂商的建议使用kta explorer system。汇和含有Mal d 1的蛋白级分，加入NaCl到200mM，加入DTT到5mM，(45微米)过滤，之后进行第二轮的淀粉酶亲和层析。汇和含有纯化的Mal d 1的蛋白级分，用2×5L of TRIS-HCl缓冲液pH7.5透析，然后用装有3或10KDa截断分子量滤膜的amicon压力离心管浓缩至蛋白浓度大于1mg/ml，储存于4℃或者-80℃。纯化具有正确氨基末端的Mal d 1突变体，至电泳纯，产率是每升培养物2-5毫克。所有纯化的Mal d 1制备物在银染的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后呈现单一条带，表观分子量为17.5KDa。

圆二色性谱

使用OLIS DSM 10 CD分光光度计(On Line Instrument Systems，Bogart，Geo，USA)获得圆二色性谱，分光光度计配备有圆柱形(31-Q-1/CD)或者方形(21-Q-1/CD)的0.1cm光程的石英比色杯(Starna，Essex，UK)。在260nm至184nm记录谱线，每隔一秒收集数据，每条谱线上有38个数据点。使用JulaboModel F30-C水浴/循环温度控制部件(Julabo Labortechnik，Seelbach，Germany)保持比色杯温度的恒定。获得光谱时其蛋白浓度为0.1mg/ml，缓冲液为0.01M磷酸钠，pH7.2。每条谱线代表经过缓冲液吸收校正，并且将曲线标准化为260nm时的Δε＝0后四次的测量结果的算术平均值。记录下的mDeg使用下面的公式转化为Δε：

Δε＝mDeg/(32980·c·l)Abs_单位/(M·cm)，

其中mDeg是圆二色性信号，c是通过氨基酸分析得到的以mol/L表示的浓度，l是以厘米表示的光程。

IgE结合实验

单个患者的血清或者来自几个白桦花粉过敏患者血清的等体积混合物，用于进行特异血清IgE抑制试验。rBet v 1.2801(数据库登录编号Z80104)，根据与rMal d 1相同的方法进行表达和纯化，以1∶5(Bet v 1：生物素)的摩尔比与生物素偶联。在ADVIA Centaur System(Bayer，Denmark)上进行抑制试验，如下：血清样品(25μl)与包被了单克隆小鼠抗人IgE抗体(ALK-Abelló，Denmark)的顺磁小珠(固相)一起孵育，漂洗，重悬，与系列稀释的生物素化的Bet v 1和抑制剂(非生物素化的Bet v 1，rMal d 1(2620)或者突变的rMal d 1过敏原)的混合物一起孵育。与吖啶酯标记的链亲和素共同孵育之后，通过测量相对光单位(RLU)，来估计与固相上的血清IgE相结合的生物素化Bet v 1的量。抑制的程度用使用缓冲液得到的RLU与使用突变体作为抑制剂得到的RLU之间的比值计算。

组胺释放实验(rMal d 1(2762)和(2781))

将100微升PIPES缓冲液pH7.4或者100μl过敏原稀释物(PIPES缓冲液pH7.4)1ng，3ng，10ng，30ng，100ng，1000ng的rBet v 1.2801，rMal d 1(2620)或突变的rMal d 1(2762)或rMal d 1(2781)加入到96孔板中，作三个平行。将96孔板预热至37℃，分别向含有不同稀释度的过敏原或者含有PIPES缓冲液的孔中加入100微升预热至37℃的用PIPES缓冲液pH7.4稀释5倍的血。然后在37℃孵育96孔板30分钟，在装有96孔板转头的离心机内800g离心10分钟。每孔内的上清转移到新的微量滴定板中，加盖，用密封带密封，然后于0℃孵育。

每个样品中的组胺释放使用基于ELISA的酶免疫检测试剂盒ref.2015(Immunotech，France)，根据厂商的建议进行测量。100μl样品或者标准溶液用25μl的酰化缓冲液和25μl的酰化试剂进行酰化，使其在后面的实验中与抗组胺抗体结合。然后50μl酰化的组胺样物、标准品或者阴性对照加入到抗组胺抗体包被的孔中，同时加入200μl碱性磷酸酶偶联的组胺，在5℃下振荡孵育2小时。用稀释的洗涤液润洗平板3次，然后加入200μl对硝基苯基磷酸钠(pNPP)底物溶液，室温下振荡孵育30分钟，然后加入50μl终止溶液终止。组胺样品和组胺标准物(1nM，3nM，10nM，30nM，100nM，1000nM)抑制碱性磷酸酶偶联的组胺与抗组胺抗体包被的小孔结合的能力通过405nm的相对吸收进行测量。

结果

多肽骨架吸收远紫外区域的260nm以下的紫外线并且在这里具有光活性，吸收的大小取决于骨架的构象。测量在左和右圆偏振光圆二色性谱中吸收的差异，能够检测出蛋白质二级结构，例如的α螺旋、β折叠片或者随机卷曲的改变。此外，测量蛋白质变性过程中的圆二色性谱提供了蛋白质稳定性的信息。为了评价长期储存或者改变缓冲液的蛋白质稳定性，对所有的蛋白质制备物，在进行生物检测之前进行圆二色性谱测量。对rMal d 1(2620)进行热变性。未变性的rMal d 1(2620)和rMal d 1突变体(2781和2762)，都具有与天然折叠的rBet v 1.2801形状相似的CD谱(参见图2)。这表明rMal d 1分子与rBet v 1.2801包含相同的二级结构元件。

来自苹果的Mal d 1同种型与Bet v 1有50-60％的氨基酸同一性，与Betv 1特异的IgE只有有限的反应性。这在图3A和3B中予以说明，显示来自两个不同血清混合物的、对白桦花粉过敏的患者血清IgE与生物素化rBet v1.2801的结合，受到rMal d 1(2620)[■]的抑制。抑制曲线显示血清混合物A不能与rMal d 1(2620)结合，而rMal d 1(2620)与血清混合物B中rBetv 1特异的IgE抗体的结合小于20％。作为天然存在的同种型，rMal d 1(2620)是一个稳定的蛋白质。这在图4中予以说明，这里热变性实验显示rMal d 1(2620)在温度升至70℃时保持了其大部分的二级结构。而且，热变性实验显示该蛋白能够完全地重新折叠。

因此Mal d 1的同种型，例如rMal d 1(2620)被认为是适宜的Bet v 1支架蛋白的候选者。

尽管有一些氨基酸变异，一个大的表面区域(参见图5A和5B)与Bet v1 IgE具有高度的结构相似性。在该区域的交叉反应性在很大程度上是一些白桦花粉过敏患者中由苹果引发的口腔过敏症候群(OAS)的原因。为了降低支架蛋白rMal d 1(2620)引发白桦花粉过敏患者组胺释放的能力，向白桦和苹果蛋白共同的rMal d 1(2620)表面区域中引入三个二级突变N28T，K32Q，E45S(参见图5C)。该突变体被命名为rMal d 1(2760)。rMal d 1(2620)上面其他的表面区域具有非常高密度的未在Bet v 1中发现的Mal d 1特异残基，因此在这些区域预计不会出现交叉反应性。为了提高这种表面结构与Bet v 1特异的抗体结合的能力，向支架蛋白上的Mal d 1特异表面区域中引入特异的氨基酸残基。两个包含这种一级突变的rMal d 1突变体实例是rMal d 1(2781)(SEQ ID NO 2)(参见图6A，B和C)以及rMal d 1(2762)(SEQ IDNO 3)(参见图7A，B和C)。

一级突变

在rMal d 1(2762)和rMal d 1(2781)中分别引入8个和6个一级突变，与rMal d 1(2620)相比，显著提高了突变体结合白桦花粉过敏原患者血清IgE的能力。这在图8A中予以示出，这里rMal d 1(2762)和rMal d 1(2781)抑制血清IgE与生物素化的rBet v 1.2801结合的能力从0分别增加到62％和39％，抑制剂的浓度为每次检测3000ng。然而与rBet v 1.2801相比，突变体达到62％和39％的IgE抑制分别需要升高500倍和1000倍的抗原浓度，这显示rMal d 1突变体结合IgE的亲和性比rBet v 1.2801低得多。

进一步用人嗜碱性细胞组胺释放试验检测了突变的rMal d 1分子。在测定的抗原浓度范围中非突变的rMal d 1(2620)没有出现组胺释放。rBet v1.2801和突变的rMal d 1都引发了组胺的释放。与rBet v 1.2801相比，突变的rMal d 1(2781)和(2762)的组胺释放曲线分别向高抗原浓度移动了2倍和20倍，如图8B所示。

二级突变

在图9(右侧)中，支架蛋白rMal d 1(2620)和突变的rMal d 1(2760)抑制个体患者中人血清IgE与rBet v 1.2801的结合，抑制率达到0到30％。与rBet v 1.2801相比，在一些但不是所有白桦花粉过敏患者的嗜碱性细胞中rMal d 1(2620)确实显示了引发组胺释放能力的显著下降，如图9(左侧)所示。在支架蛋白rMal d 1(2760)上的Bet v 1特异表面结构中引入三个二级突变Asn28Thr，Lys32Gln和Glu45Ser，进一步降低了在两个白桦花粉过敏患者的嗜碱性细胞中(o，p)引发组胺释放的能力，如图9所示(左侧)。与rBetv 1.2801相比，在这里3个二级突变的引入，在测定的抗原浓度范围中去除了患者(o)的组胺释放，且在患者(p)中引发组胺释放所需的rMal d 1(2760)浓度升高了100倍。

一级和二级突变

图10A和B示意说明了一个支架蛋白和通过引入一级和二级突变得到的该支架蛋白的变异体。rMal d 1(2620)被用来作为一个实例。图示了蛋白的正面和背面。支架(Mal d 1)特异的表面结构用白色表示。Bet v 1和Mal d 1共同的表面结构用灰色表示。二级突变用黑色表示。前上侧视图显示了与Betv 1特异的人血清IgE高度亲和结合的支架蛋白上面的两个大的表面区域。前下侧视图显示了在支架蛋白中引入降低IgE结合亲和性的4个二级突变。后上侧视图显示几乎没有共同表面结构的支架蛋白上的表面区域。后下侧视图显示了引入一级突变提高共同表面结构密度的结果，这里可以用来指导形成与天然Bet v 1异构过敏原交叉反应的阻滞抗体。图10B。前上侧和前下侧视图：图示了由引入3个二级突变后所致的推定的Bet v 1特异IgE抗体的适合度降低。后上侧视图图示了阻滞抗体(IgG)的产生，其与Bet v 1的交叉反应性增加。

对重组野生型和突变Mad d 1过敏原的T细胞应答

过敏原中氨基酸序列的改变可以潜在地引起T细胞表位的去除和/或添加。这种情况下，与针对野生型过敏原的应答相比，改变的过敏原可能引起降低的T细胞应答，并且/或者它们会活化识别新表位的T细胞。理论上讲，维持Bet v 1的低致敏性Mal d 1突变体的T细胞刺激特性是很重要的，目的是修饰已经存在的过敏原特异的T细胞群并且维持阻抑性非IgE抗体的产生。因此检测了rMal d 1过敏原的T细胞活化特性。

对两种细胞类型进行了分析，二者均来自白桦过敏的个体：

1)新鲜分离的包含多克隆T细胞的血细胞(PBL)。这些T细胞具有对Betv 1特异的表位和Mal d 1特异的表位以及由序列改变产生的新表位产生应答的能力。血细胞在过敏原存在的情况下培养7天，然后进行分析。检测了3个个体供体的PBL。

2)通过使用nBet v 1反复刺激产生的过敏原特异的细胞系。这些细胞可以在培养中维持，并且可以在长时间内检测。T细胞与过敏原一起培养3天。加入自体PBL细胞，作为抗原呈递细胞(APC)。这些T细胞主要针对原有的Bet v 1特异的表位发生应答，并且在过敏患者中已有的Bet v 1特异的T细胞群中显示T-细胞活化的水平。检测了四个Bet v 1特异的T细胞系。

通过两种试验分析了针对于rMal d 1过敏原的T细胞应答：

1)刺激T细胞增殖，测量18小时的培养过程中放射性标记的胸腺嘧啶向DNA中的整合。

2)刺激细胞因子的产生，通过测量6种不同Th1/Th2细胞因子的CBA法，一种基于FACS的试验检测细胞上清中的细胞因子。

图11显示来自3个供体的PBL刺激试验的结果，总结于图12中。在这些实验中，野生型Mal d 1过敏原(2620)以及三突变Mal d 1突变体(2760)不诱导任何T细胞活化。一个患者中的突变体2762，以及全部三个PBL检测中的2781突变体，都诱导T细胞增殖，这与rBet v 1(2801)诱导的T细胞活化相当，表明T细胞表位可能已经通过向这些分子中引入的氨基酸替代被重新恢复。另一种情况是可能已经引入了新的表位，导致相似的T细胞活化。正如预期，所有的T细胞系都对nBet v 1产生应答。

图13显示了四个检测的Bet v 1特异的T细胞系中的一个T细胞系的T细胞增殖性应答。该T细胞系显示了明显的与野生型Mal d 1分子(2620)的交叉反应性，但是不识别突变体2760，这提示该分子中引入的突变破坏了由该T细胞系识别的一个Bet v 1/Mal d 1交叉反应的T细胞表位。与此相反，突变体2762和2781都诱导增殖。

在PBL培养中的细胞因子产生(图14)以及在交叉反应性的T细胞系中产生细胞因子(图15)确证了在增殖试验中的T细胞激活。在比较对Bet v1.2801和Mal d 1过敏原的应答时，没有观察到细胞因子产生总体特征的显著改变，提示Bet v 1和Mal d 1之间的差异或者通过突变引入的改变没有导致增强的或者选择性的Th1激活。没有观察到抑制性细胞因子IL-10的诱导。

结论是，与野生型Mal d 1过敏原(2620)相比，Mal d1突变体2762且特别是2781似乎对Bet v 1特异的T细胞系中和在新鲜分离的过敏患者的血细胞培养都诱导增强的T细胞激活。

实施例2

Bet v 1同源支架蛋白的修饰(表面区域I)

本实施例是基于Dau c 1(登录编号T14325)的修饰。以下提到的氨基酸残基位置编号是指T14325的，如图16所示。本实施例是基于引入一个或者更多以下的二级突变：K32X，E42X，E59X，R69X，E95X，K122X，其中X可以是任何类型的氨基酸残基，但是优选为Bet v 1的已知同种型中相对应位置处不存在的氨基酸残基。本实施例还包括引入一个或者更多以下的一级突变，其中残基被替代为与Bet v 1的任何已知同种型中相对应的氨基酸残基同源的，或者更优选一致的氨基酸残基。同源氨基酸残基有：E＝D，V＝L＝I＝M，S＝T，Y＝F＝W，K＝R＝H，N＝Q，，其中＝表示两个或者更多氨基酸残基是同源的。以下是建议的突变：S12V或S12L或S12I或S12M，S14P，E16A，P105A，A107P，A148S或A148T，I151L或I151V或I151M，N153H或N153K或N153R，以及使用一个或者更多以下氨基酸残基延长氨基酸序列：+154S或+154T，+155D或+155E，+156A，+157Y或157F，+158N或+158Q。图16显示了具有突变氨基酸残基的蛋白质序列。

Bet v 1同源支架蛋白的修饰(表面区域II)

本实施例是基于Dau c 1(登录编号T14325)的修饰。以下提到的氨基酸残基位置编号是指T14325的，如图17所示。本实施例是基于引入一个或者更多以下的二级突变：E8X，T10X，D25X，K32X，D46X，E59X，E95X，D108X，K122X，其中X可以是任何类型的氨基酸残基，但是优选为Bet v 1的已知同种型中相对应位置处不存在的氨基酸残基。本实施例还包括引入一个或者更多以下的一级突变，其中残基被替代为与Bet v 1的任何已知同种型中相对应的氨基酸残基同源的，或者更优选一致的氨基酸残基。同源氨基酸残基有：E＝D，V＝L＝I＝M，S＝T，Y＝F＝W，K＝R＝H，N＝Q，，其中＝表示两个或者更多氨基酸残基是同源的。以下是建议的突变：K39S或K39T，K44E或K44D，V52I或V52M或V52L，I54K或I54R或I54H，T64K或T64R或T64H，T65Y或T65F或T65W，T67K或T67R或T67H，D86E，L91G，G92D或G92E。图17示意了具有突变氨基酸残基的蛋白质序列。

Der p 2同源支架蛋白的修饰(表面区域I)

本实施例是基于Lep d 2(登录编号S66499)的修饰。以下提到的氨基酸残基位置编号是指S66499的，如图18所示。本实施例是基于引入一个或者更多以下的二级突变：K6X，S22X，R30X，K76X，K81X，V114X，其中X可以是任何类型的氨基酸残基，但是优选为nDer p 2或者nDer f 2或者Eur m2的已知同种型中相对应位置处不存在的氨基酸残基。本实施例还包括引入一个或者更多以下的一级突变，其中残基被替代为与nDer p 2或者nDer f 2或者nEur m 2的任何已知同种型中相对应的氨基酸残基同源的，或者更优选一致的氨基酸残基。同源氨基酸残基有：E＝D，V＝L＝I＝M，S＝T，Y＝F＝W，K＝R＝H，N＝Q，，其中＝表示两个或者更多氨基酸残基是同源的。以下是建议的突变：D17L或D17I或D17V或D17M，S19P，Q32K或Q32R或Q32H，K33P，T35Q或T35N，N88K或N88R或N88H，T92N或T92Q，A95K或A95R或A95H。图18显示了具有突变氨基酸残基的蛋白质序列。突变体的3-D模型示于图19A，B，C和D以及图20A，B，C和D。

Der p 2同源支架蛋白的修饰(表面区域II)

本实施例是基于Lep d 2(登录编号S66499)的修饰。以下提到的氨基酸残基位置编号是指S66499的。本实施例是基于引入一个或者更多以下的二级突变：K6X，S22X，H29X，R30X，K76X，K81X，其中X可以是任何类型的氨基酸残基，但是优选为nDer p 2或者nDer f 2或者Eur m 2的已知同种型中相对应位置处不存在的氨基酸残基。本实施例还包括引入一个或者更多以下的一级突变，其中残基被替代为与nDer p 2或者nDer f 2或者nEur m 2的任何已知同种型中相对应的氨基酸残基同源的，或者更优选一致的氨基酸残基。同源氨基酸残基有：E＝D，V＝L＝I＝M，S＝T，Y＝F＝W，K＝R＝H，N＝Q，，其中＝表示两个或者更多氨基酸残基是同源的。以下是建议的突变：D45N或D45Q，N47K或N47R或N47H，K48T或K48S，T50K或T50R或T50H，K52E或K52D，L54K或L54R或L54H，E107K，E107R或E107H，H112D或H112E，T119I或T119L或T119V或T119M。图18显示了具有突变氨基酸残基的蛋白质序列(前面已经显示)。

实施例3

Bet v 1同源支架蛋白的修饰

本实施例是基于Mal d 1(2620)(登录编号AJ4488060)的修饰。以下提到的氨基酸残基位置编号是指AJ4488060的，如图21所示。本实施例是基于引入一个或者更多以下的二级突变：E8X，N28X，K32X，E96X以及氨基酸插入+X159(X可以是任何氨基酸残基)。在本发明的一个优选实施方案中，一个或者更多被引入的氨基酸残基(X)可以是对于每一个对应的位置与Bet v 1特异的残基同源的残基。同源氨基酸残基有：E＝D，V＝L＝I＝M，S＝T，Y＝F＝W，K＝R＝H，N＝Q，其中＝表示两个或者更多氨基酸残基是同源的。以下是建议的突变：E8D，N28Q，K32R或者K32H，E96D。本实施例还包括引入一个或者更多以下的一级突变，其中引入的突变是与Bet v 1的任何已知同种型中相对应的氨基酸残基同源的，或者是一致的氨基酸残基。以下是建议的突变：E12V或E12I或E12M或E12L，H40S或H40T，E76H或E76R或E76K，E129A，P154S或P154T。图21显示了具有突变氨基酸残基的蛋白质序列。

Der p 2同源支架蛋白的修饰

本实施例是基于Gly d 2(登录编号AJ272216)的修饰。以下提到的氨基酸残基位置编号是指AJ272216的，如图22所示。本实施例是基于引入一个或者更多以下的二级突变：K6X，R30X，F74X，K81X，K88X，T90X，V114X(X可以是任何氨基酸残基)。

在本发明的一个优选实施方案中，一个或者更多被引入的氨基酸残基(X)可以是对于每一个对应的位置与Der p 2或者Der f 2或者Eur m 2特异的残基同源的残基。同源氨基酸残基有：E＝D，V＝L＝I＝M，S＝T，Y＝F＝W，K＝R＝H，N＝Q，其中＝表示两个或者更多氨基酸残基是同源的。以下是建议的突变：K6R或K6H，R30K或R30H，F74Y或F74W，K81R或K81H，K88R或K88H，T91S，V114L或V114I或V114M。本实施例还包括引入一个或者更多以下的一级突变，其中引入的突变是与Der p 2或者Der f 2或者Eur m 2的任何已知同种型中相对应的氨基酸残基同源的，或者是一致的氨基酸残基。

实施例4

通过CD谱或者一种试验方法对均一折叠的蛋白质的均质制备物中的二级结构元件进行比较，以确定两种蛋白的三维结构是否具有显著的同源性：

可以让本领域内的专家进行不同或者同源蛋白质的CD谱线的视觉比较。如果谱线看起来能够合理地叠加，则可以认为被比较的蛋白质很可能属于同一结构类型并且去卷积可以确证这种分类。

通过CDNN程序对在260nm到至少184nm记录的CD谱进行去卷积：

www.bioinformatik.biochemtech.uni-halle.de/cdnn

去卷积如下进行：

将CD数据(作为由逗号限定的文本文档(nm；mDeg))输入到软件中，提供适当的参数(分子量，浓度(mg/ml)，氨基酸的数目)，使用训练基础谱套(training base spectra set of)33对谱线进行去卷积。

将蛋白质的浓度调整到一个数值，使这时的所有二级结构元件总和为100％±1％(185-260nm)。

二级结构元件转化为3个数值：螺旋、″折叠片″＝反平行+平行，以及转角+卷曲＝β-转角+随机卷曲。如果蛋白质的去卷积组(螺旋、β-折叠片、转角+卷曲)在参考蛋白所确定的去卷积组值的正负20％以内，则认为这些蛋白与参考蛋白结构上相似。

根据图25，Mal d 1(2762)，Mal d 1(2781)以及Bet v 1.2801的去卷积组结果落在了对参考蛋白Mal d 1(2620)确定的的接受范围内(±15％)，且因此可以认为这些蛋白结构上(二级结构)相似。

实施例5

Bet v 1和突变Mal d 1的抗体反应性：

通过表面等离子体共振(sPR)，对针对nBet v 1的单克隆小鼠IgG抗体(BV16)分别与两个过敏原rBet v 1.2801和修饰的rMal d 1(2781)之间相互作用的的动力学参数进行测定。

根据实施例1中的描述制备重组蛋白。根据制造商的建议(Biacore 2000Instrument Handbook，January 2001；Getting started Biacore 3000，October，1998)设定Biacore实验。简言之，将单克隆抗体BV16(ALK，Hrsholm，丹麦)(1到10μg/ml于HBS-EP biacore缓冲液)注射进入Biacore感受器芯片CM5的四个流动管道中300秒，流速为30μl/min(负荷相)，接下来流150秒的(30μl/min)HBS-EP缓冲液(平衡相)。将抗原，即rBet v 1.2801，rMal d 1(2620)或者突变的rMal d 1(2781)注射进入管道内180秒(结合相)，接下来且HBS-EP缓冲液流(30μl/min)直至1000秒(解离相)，再用10mM甘氨酸溶液pH1.8脉冲30秒，以流速30μl/min对流动管道进行再生。用于估计k1(M-1·s-1)，k-1(s-1)和Kd(M)数值的数据获自5个不同抗原浓度下(1到150μg/mL)进行的实验。

Biacore实验的结果图示于图26。动力学参数示于表1。

表1

复合体	k₁±S.E.M^-1s^-1	k_-1±S.E.s^-1	～K_d±S.E.M
复合体	k₁±S.E.M^-1s^-1	k_-1±S.E.s^-1	～K_d±S.E.M	BV16rBet v 1.2801	(1.0±0.1)*10⁵	(2.5±1.4)*10^-5	＝(2.4±1.4)*10^-10
BV16rMal d 1(2781)	(1.2±0.1)*10⁵	(3.2±0.3)*10^-5	＝(2.7±0.4)*10^-10	BV16rBet v 1.2801	(1.0±0.1)*10⁵	(2.5±1.4)*10^-5	＝(2.4±1.4)*10^-10

表1：单克隆抗体BV16分别与两个过敏原rBet v 1.2801和修饰的rMald 1(2781)之间相互作用的的动力学参数。动力学参数根据不同抗原浓度、时间长度直至1000秒的几次测量结果进行计算。

得到的两个抗体/抗原复合体的K_d数值大致相同。这强烈显示这些蛋白具有非常相似的α-碳骨架折叠模式。而且，被BV16抗体识别的表位包括的氨基酸残基位于rBet v 1.2801(pdb进入号1bv1)晶体学结构中反平行β-折叠片的几条链中。结论是，不仅已经将基本上完整和有功能的表位从rBet v 1移植到rMal d 1上。而且几乎相同的K_d数值提示完整结构的BV16表位已经被引入到Mal d 1的表面上。

序列表

<110> A/S

<120>重组蛋白质变异体

<130>P200101752 DK

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>158

<212>PRT

<213>苹果(Malus domestica)

<400>1

Gly Val Tyr Thr Tyr Glu Asn Glu Tyr Thr Ser Glu Ile Pro Pro Pro

1 5 10 15

Arg Leu Phe Lys Ala Phe Val Leu Asp Ala Asp Thr Leu Ile Pro Gln

20 25 30

Ile Ala Pro Gln Ala Ile Lys His Ala Glu Ile Leu Ser Gly Asp Gly

35 40 45

Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Thr Phe Gly Glu Gly Ser Gln Tyr

50 55 60

Gly Tyr Val Lys His Lys Ile Asp Ser Val Asp Glu Ala Asn Tyr Ser

65 70 75 80

Tyr Ala Tyr Thr Leu Ile Glu Gly Asp Ala Leu Thr Asp Thr Ile Glu

85 90 95

Lys Val Ser Tyr Glu Thr Lys Leu Val Ala Ser Gly Ser Gly Ser Ile

100 105 110

Ile Lys Ser Ile Ser His Tyr His Thr Lys Gly Asp Val Glu Ile Met

115 120 125

Glu Glu His Val Lys Ala Gly Lys Glu Lys Ala His Gly Leu Phe Lys

130 135 140

Leu Ile Glu Ser Tyr Leu Lys Asp His Pro Asp Ala Tyr Asn

145 150 155

<210>2

<211>158

<212>PRT

<213>苹果

<400>2

Gly Val Tyr Thr Tyr Glu Asn Glu Tyr Thr Ser Glu Ile Pro Pro Pro

1 5 10 15

Arg Leu Phe Lys Ala Phe Val Leu Asp Ala Asp Asn Leu Ile Pro Lys

20 25 30

Ile Ala Pro Gln Ala Ile Lys His Ala Glu Asn Ile Glu Gly Asn Gly

35 40 45

Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Thr Phe Gly Glu Gly Ser Gln Tyr

50 55 60

Lys Tyr Val Lys His Arg Ile Asp Ser Val Asp His Ala Asn Tyr Ser

65 70 75 80

Tyr Ala Tyr Thr Leu Ile Glu Gly Asp Ala Leu Thr Asp Thr Ile Glu

85 90 95

Lys Val Ser Tyr Glu Thr Lys Leu Val Ala Ser Gly Ser Gly Ser Ile

100 105 110

Ile Lys Ser Ile Ser His Tyr His Thr Lys Gly Asp Val Glu Ile Met

115 120 125

Glu Glu His Val Lys Ala Gly Lys Glu Lys Ala His Gly Leu Phe Lys

130 135 140

Leu Ile Glu Ser Tyr Leu Lys Asp His Pro Asp Ala Tyr Asn

145 150 155

<210>3

<211>159

<212>PRT

<213>苹果

<400>3

Gly Val Tyr Thr Tyr Glu Asn Glu Tyr Thr Ser Val Ile Pro Pro Ala

1 5 10 15

Arg Leu Phe Lys Ala Phe Val Leu Asp Ala Asp Asn Leu Ile Pro Lys

20 25 30

Ile Ala Pro Gln Ala Ile Lys His Ala Glu Ile Leu Glu Gly Asp Gly

35 40 45

Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Thr Phe Gly Glu Gly Ser Gln Tyr

50 55 60

Gly Tyr Val Lys His Lys Ile Asp Ser Val Asp Glu Ala Asn Tyr Ser

65 70 75 80

Tyr Ala Tyr Thr Leu Ile Glu Gly Asp Ala Leu Thr Asp Thr Ile Glu

85 90 95

Lys Val Ser Tyr Glu Thr Lys Leu Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly Ser

100 105 110

Ile Ile Lys Ser Ile Ser His Tyr His Thr Lys Gly Asp Val Glu Ile

115 120 125

Met Glu Glu His Val Lys Ala Gly Lys Glu Lys Ala His Gly Leu Phe

130 135 140

Lys Leu Ile Glu Ser Tyr Leu Leu Asp His Ser Asp Ala Tyr Asn

145 150 155

Claims

1.重组蛋白质变异体，其具有诱导针对天然存在的过敏原的保护性免疫应答的能力，其中的蛋白质变异体

●是支架蛋白的变异体，所述的支架蛋白具有与天然存在的过敏原结构相似的三维折叠模式；

●与支架蛋白相比，所述的重组蛋白变异体包含两个或者更多一级突变，所述突变之间至少间隔一个未突变的氨基酸残基，每个一级突变向支架蛋白中引入至少一个与天然存在的过敏原中对应位置上的氨基酸残基相同或者同源的氨基酸残基；

●与支架蛋白相比，所述的重组蛋白变异体对天然存在的过敏原的特异性IgE抗体的亲和性和/或结合能力有所提高。

2.根据权利要求1的蛋白质变异体，其中的蛋白质变异体与天然存在的过敏原相比具有降低的诱导组胺释放的能力。

3.根据权利要求2的蛋白质变异体，其中诱导组胺释放的能力降低2-10000倍。

4.根据上述权利要求中任何一项的蛋白质变异体，该变异体还包含一或者多个向支架蛋白中引入氨基酸残基的二级突变，这些氨基酸残基在天然存在的过敏原中相对的位置处不存在。

5.根据上述权利要求中任何一项的蛋白质变异体，该变异体包含2-50个、优选2-40个、更为优选3-25个、更为优选4-15个且最为优选5-12个一级突变。

6.根据上述权利要求中任何一项的蛋白质变异体，其中的支架蛋白与天然存在的过敏原的氨基酸一致性在20-60％之间，优选地在30-50％之间。

7.根据上述权利要求中任何一项的蛋白质变异体，其中该蛋白质变异体与天然存在的过敏原相比，对天然存在的过敏原的特异抗体的结合能力有所降低。

8.根据权利要求1-7的蛋白质变异体，其中所述的结合能力比天然过敏原的抗体结合能力提高至少10％，优选至少50％，且高达100％。

9.根据上述权利要求中任何一项的蛋白质变异体，其中至少一个一级突变是替代。

10.根据上述权利要求中任何一项的蛋白质变异体，其中引入的至少一个一级突变是删除和/或添加。

11.根据上述权利要求中任何一项的蛋白质变异体，其中该蛋白质变异体的去卷积CD谱与天然存在的过敏原的去卷积CD谱线相比，偏离小于30％，优选小于20％，且更为优选小于10％。

12.根据上述权利要求中任何一项的蛋白质变异体，其中所有的一级突变都位于面积约为600-900²的表面区域以内。

13.根据上述权利要求中任何一项的蛋白质变异体，其中的一级突变包括对暴露于表面的氨基酸的突变。

14.根据权利要求13的蛋白质变异体，其中将要被突变的一级氨基酸残基溶剂可接触性大于20％，优选地大于30％，更为优选地大于40％，且最为优选地大于50％。

15.根据上述权利要求中任何一项的蛋白质变异体，其中通过定点突变进行一或多个突变。

16.根据上述权利要求中任何一项的蛋白质变异体，其中通过DNA重排进行一或多个突变。

17.根据上述权利要求中任何一项的蛋白质变异体，它由基因文库的方法获得。

18.制备重组蛋白变异体的一种方法，这些蛋白变异体具有诱导针对天然存在的过敏原的保护性免疫应答的能力，该方法包含以下步骤：

●向支架蛋白中引入两或者更多个一级突变，突变之间由至少一个未突变的氨基酸残基间隔，每个一级突变向支架蛋白中引入至少一个与天然存在的过敏原中相应氨基酸相同或者同源的氨基酸残基，以及

●该蛋白变异体，与支架蛋白相比较，对天然存在的过敏原的特异性IgE抗体的亲合性和/或结合能力有所提高。

19.可以通过权利要求18的方法获得的产物。

20.根据上述权利要求中任何一项的蛋白质变异体，其中天然存在的过敏原是吸入过敏原。

21.根据权利要求20的蛋白质变异体，其中天然存在的过敏原是花粉过敏原。

22.根据权利要求21的蛋白质变异体，其中天然存在的过敏原是来自分类中壳斗目，木樨目或者松杉目的花粉过敏原。

23.根据权利要求22的蛋白质变异体，其中天然存在的过敏原是Bet v1。

24.根据权利要求23的蛋白质变异体，其中支架蛋白是Mal d1。

25.根据权利要求24的蛋白质变异体，其中至少两个一级突变选自由下面突变组成的组：(E12V，E12I，E12M，E12L)，P16A，(H40S，H40T)，I43N，L44I，D47N，G65K，K70R，(E76H，E76R，E76K，Q76H)，S107T，G108P，+109D，S110G，E129A，K152L，(P154S，P154T)，P155S，并且可选进行一或多个二级突变，其选自由下面的突变组成的组：N28X，优选是N28T，K32X，优选是K32Q， E45S， E96X，+159X。

26.根据权利要求24的蛋白质变异体(rMal d1(2781)，它包含SEQ IDNO.2中确定的序列，所述的变异体包含下面的一级突变：I43N，L44I，D47N，G65K，K70R，Q76H。

27.根据权利要求24的蛋白质变异体(rMal d1(2762))，它包含SEQ IDNO.3中确定的序列，所述的变异体包含下面的突变：E12V，P16A，K152L，P155S，S107T，G108P，+109D，S110G。

28.根据权利要求24的蛋白质变异体，它包含至少两个一级突变，其选自由下面突变组成的组：(E12V，E12I，E12M，E12L)，(H40S，H40T)，(E76H，E76R，E76K)，E129A，(P154S，P154T)，并且可选进行一或多个二级突变，其选自由下面的突变组成的组：E8X，N28X，K32X，E96X，+159X。

29.根据权利要求23的蛋白质变异体，其中Bet v1的支架蛋白是Dau c1。

30.根据权利要求29的蛋白质变异体，其中至少两个一级突变选自由下面突变组成的组：(S12V，S12L，S12I，S12M)，S14P，E16A，P105A，A107P，(A148S，A148T)，(I151L，I151V，I151M)，(N153H，N153K，N153R)，(+154S，+154T)，(+155D，+155E)，+156A，(+157Y，+157F)，(+158N，+158Q)，(K39S，K39T)，(K44E， K44D)，(V52I，V52M，V52L)，(I54K，I54R，I54H)，(T64K，T64R，T64H)，(T65Y，T65F，T65W)，(T67K，T67R，T67H)，D86E，L91G，(G92D，G92E)，并且可选进行一或多个二级突变，其选自由下面的突变组成的组：K32X，E42X，E59X，R69X，E95X，K122X，E8X，T10X，D25X，K32X，D46X，E59X，E95X， D108X， K122X。

31.根据权利要求29的蛋白质变异体，它包含至少两个选自由下面突变组成的组的一级突变：(S12V，S12L，S12I，S12M)，S14P，E16A，P105A，A107P，(A148S，A148T)，(I151L，I151V，I151M)，(N153H，N153K，N153R)，(+154S，+154T)，(+155D，+155E)，+156A，(+157Y，+157F)，(+158N，+158Q)，并且可选进行一或多个二级突变，其选自由下面的突变组成的组：K32X，E42X，E59X，R69X，E95X，K122X。

32.根据权利要求29的蛋白质变异体，它包含至少两个选自由下面突变组成的组的一级突变：(K39S，K39T)，(K44E，K44D)，(V52I，V52M，V52L)，(I54K，I54R， I54H)，(T64K，T64R，T64H)，(T65Y，T65F，T65W)，(T67K，T67R，T67H)，D86E，L91G，(G92D，G92E)，并且可选进行一或多个二级突变，其选自由下面的突变组成的组：E8X，T10X，D25X，K32X，D46X，E59X，E95X，D108X， K122X。

33.根据权利要求20的蛋白质变异体，其中天然存在的过敏原来自分类学中的禾本目。

34.根据权利要求20的蛋白质变异体，其中天然存在的过敏原来自分类学中的菊目或荨麻目。

35.根据权利要求20的蛋白质变异体，其中天然存在的过敏原是屋室尘螨过敏原。

36.根据权利要求35的蛋白质变异体，其中天然存在的过敏原是来自尘螨属(Dermatophagoides)的螨虫过敏原。

37.根据权利要求36的蛋白质变异体，其中天然存在的过敏原是Der p2。

38.根据权利要求37的蛋白质变异体，其中的支架蛋白是Eur m1。

39.根据权利要求37的蛋白质变异体，其中的支架蛋白是Lep d2。

40.根据权利要求39的蛋白质变异体，它包含至少两个选自由下面突变组成的组的一级突变：D17L，D17I，D17V，D17M，S19P，Q32K，Q32R，Q32H，K33P，T35Q，T35N，N88K，N88R，N88H，T92N，T92Q，A95K，A95R，A95H，并且可选进行一或多个二级突变，其选自由下面的突变组成的组：K6X，S22X，R30X，K76S，K81X，V114X。

41.根据权利要求39的蛋白质变异体，它包含至少两个选自由下面突变组成的组的一级突变：D45N，D45Q，N47K，N47R，N47H，K48T，K48S，T50K，T50R，T50H，K52E，K52D，L54K，L54R，L54H，E107K，E107R，E107M，H112D，H112E，T119I，T119L，T119V，T199M，并且可选进行一或多个二级突变，其选自由下面的突变组成的组：K6X，S22X，K29X，R30X，K76X，K81X。

42.根据权利要求37的蛋白质变异体，其中的支架蛋白是Gly d2。

43.根据权利要求42的蛋白质变异体，它包含至少两个选自由下面突变组成的组的一级突变：K2Q，K2N，K4D，K4E，K10N，K10Q，T14K，T14R，S22H，S22R，S22K，K39V，K39L，K39I，K39M，D45N，D45Q，T60L，T60V，T60I，T60M，Q63D，Q63E，K80V，K80L，K80I，K80M，T91S，H112D，H112E，R122I，R122V，R122L，R122M，并且可选进行一或多个二级突变，其选自由下面的突变组成的组：K6X，优选为K6R或者K6H，R30X，优选为R30K或R30H，F74X，优选为F74Y或F74W，K81X，优选为K81R或K81H，K88X，优选为K88R或K88H，T90X，以及V114X，优选为V114L，V114I或V114M。

44.根据权利要求20的蛋白质变异体，其中天然存在的过敏原是蟑螂过敏原。

45.根据权利要求19的蛋白质变异体，其中天然存在的过敏原是动物过敏原，优选地是哺乳动物过敏原。

46.根据权利要求45的蛋白质变异体，其中天然存在的过敏原是来自猫、狗或者马的过敏原。

47.根据权利要求1-19中任何一项的蛋白质变异体，其中天然存在的过敏原是毒液过敏原。

48.根据权利要求47的蛋白质变异体，其中天然存在的过敏原来自分类学中的膜翅目。

49.根据权利要求48的蛋白质变异体，其中天然存在的过敏原来自胡蜂科、蜜蜂科和蚁科的分类目。

50.根据权利要求49的蛋白质变异体，其中天然存在的过敏原是Ves v5。

51.根据权利要求1-19中任何一项的蛋白质变异体，其中天然存在的过敏原是食物过敏原。

52.一种重组蛋白质变异体，它能够调节针对天然存在的过敏原的免疫应答，其中

●天然存在的过敏原选自由植物、草、食物以及螨虫过敏原组成的组，

●蛋白质变异体是支架蛋白的变异体，所述的支架蛋白具有与天然存在过敏原的三维折叠模式相类似的折叠模式，与支架蛋白相比该蛋白质变异体包含至少一个一级突变，它向支架蛋白中引入至少一个氨基酸残基，该残基与天然存在的过敏原中相应位置的至少一个氨基酸残基相同或者同源，以及

●与支架蛋白相比，该蛋白质变异体对天然存在蛋白质的特异性IgE抗体的亲和性和/或结合能力提高。

53.一种重组蛋白质变异体，它能够调节针对天然存在的过敏原的免疫应答，其中

●蛋白质变异体是支架蛋白的变异体，所述的支架蛋白具有与天然存在过敏原的三维折叠模式相类似的折叠模式，

●支架蛋白与天然存在的过敏原之间的序列一致性水平在30-50％之间，

●与支架蛋白相比，该蛋白质变异体包含至少一个一级突变，它向支架蛋白中引入至少一个氨基酸残基，该残基与天然存在的过敏原中相应位置的至少一个氨基酸残基相同或者同源，以及

●与支架蛋白相比，该蛋白质变异体对天然存在的蛋白质的特异性IgE抗体的亲和性和/或结合能力提高。

54.一种重组蛋白质变异体，它能够调节针对天然存在的过敏原的免疫应答，其中

●该蛋白质变异体的去卷积CD谱与天然存在的过敏原的去卷积CD谱相比，偏离小于30％，优选小于20％，更为优选小于10％。

●与支架蛋白相比，该蛋白质变异体包含至少一个一级突变，它向支架蛋白中引入至少一个氨基酸残基，该残基与天然存在的过敏原中相位置的至少一个氨基酸残基相同或者同源，以及

55.根据权利要求1-54中任何一项的蛋白质变异体，用作药物。

56.根据权利要求1-54中任何一项的重组蛋白质变异体在制备治疗或者预防过敏的药物中的用途。

57.组合物，其包含两或者更多种根据权利要求1-54中任何一项的重组蛋白质变异体，其中每种变异体限定为具有至少一个一级突变，该一级突变在其他变异体的至少一个中是不存在的。

58.根据权利要求57的组合物，该组合物包含2-12个、优选为3-10个、更优选为4-8个、最为优选为5-7个不同的根据权利要求1-21的蛋白质变异体。

59.根据权利要求57或者58的组合物，用作药物。

60.根据权利要求57-59的组合物在制备预防和/或治疗过敏的药物中的用途。

61.药物组合物，其特征在于它包含根据权利要求1-54中任何一项的重组蛋白质变异体或者根据权利要求57或者58的组合物。

62.根据权利要求57或者58的药物组合物，其还包含药物上可以接受的载体和/或赋形剂和/或佐剂。

63.根据权利要求57或者58的药物组合物，其中药物组合物的形式是疫苗，疫苗针对的是由天然存在的过敏原在过敏患者体内引起的过敏反应。

64.一种在受试者体内产生免疫应答的方法，它包含向受试者施用根据权利要求1-54中任何一项的重组蛋白质变异体，或者根据权利要求57或者58的组合物，或者根据权利要求61到63任一项的药物组合物。

65.疫苗接种或者治疗受试者的方法，它包含向受试者施用根据权利要求1-54中任何一项的重组蛋白质变异体，或者根据权利要求57或58的组合物，或者根据权利要求61到63任一项的药物组合物。

66.制备根据权利要求57或者58的药物组合物的方法，它包括将根据权利要求1-54中任何一项的重组蛋白质变异体，或者根据权利要求57或者58的组合物与药物上可以接受的物质和/或赋形剂和/或佐剂相混和。

67.通过根据权利要求66的方法可以获得的药物组合物。

68.治疗、预防或者减轻受试者过敏反应的方法，它包括向受试者施用根据权利要求1-54中任何一项的重组蛋白质变异体，或者根据权利要求57或者58的组合物，或者根据权利要求61到63任一项的药物组合物。

69.用于制备根据权利要求1-54中任何一项的重组蛋白质变异体的方法，其中所述重组蛋白质变异体由编码支架蛋白和天然存在的过敏原的DNA通过DNA重排(分子育种)之后获得的DNA序列产生。

70.DNA序列，它编码根据权利要求1-54中任何一项的重组蛋白质变异体。

71.根据权利要求70的DNA序列，其中该衍生物由对编码支架蛋白的DNA进行定点诱变获得。

72.根据权利要求70-71任一项的DNA序列，其中的序列是选自SEQ IDNO.2和3的序列的衍生物。

73.表达载体，它包含根据权利要求70-72任一项的DNA。

74.宿主细胞，它包含根据权利要求73的表达载体。

75.制备重组突变蛋白质变异体的方法，它包含下面的步骤：培养根据权利要求74的宿主T细胞。

76.根据权利要求1-54中任何一项的重组蛋白质变异体，它包含至少一个T细胞表位，该表位能够刺激对天然存在的过敏原特异的T细胞克隆或者T细胞系。

77.诊断试验，其使用根据权利要求1-54中任何一项的重组蛋白质变异体或者根据权利要求57或者58的组合物评价对受试者治疗的相关性、安全性或者结果，其中受试者的含有IgE的样品与所述的蛋白质变异体或者所述的组合物混和，并对所述样品中的IgE与所述蛋白质变异体之间的反应性水平进行评价。