CN103874509A - 来自苹果的主要变应原Mal d 1的低变应原性变体 - Google Patents
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Abstract
公开了苹果主要变应原Mal d 1的低变应原性变体，及其在治疗变应性疾病中的用途。
Description
本发明涉及Mal d1蛋白质的低变应原性序列变体、编码其的核酸分子、包含其的药物组合物以及它们在由苹果（Malus domestica）物种导致的变应性疾病的免疫疗法中的用途。
背景技术
变态反应由免疫系统功能异常导致，所述免疫系统通过产生IgE-类抗体与主要包含在花粉、螨、上皮和食品中的无害蛋白质反应。
最近的评估表明工业化国家中超过25％的人口患有该疾病，如果疾病持续不愈，则可以导致症状恶化（例如出现哮喘）或对其他变应原致敏，由此造成更难以选择最适当的治疗。
在世界范围内，约三分之一的变应性对象是对树木花粉过敏。在温带地区，属于山毛榉目(Fagales)的树（桦树、桤木、榛树、橡树和角树）的花粉是变应性哮喘和鼻炎的主要原因之一。对桦树花粉变应的患者约95%产生抗Bet v1的IgE抗体，60%的这类患者仅与Bet v1（以登录号X15877保存在GenBank的cDNA）反应，这是桦树花粉的主要变应原（1）。
在食用某些食物（苹果、胡萝卜、榛子和芹菜）后，对桦树花粉变应的个体高百分比（50%-93%）出现变应反应。桦树花粉变应患者中的这类超敏性被描述为“花粉-食物综合征（PFS）”，其特征是对水果、坚果和蔬菜的变应性。症状范围从上消化道粘膜的反应（口服变态反应综合征）和胃肠道的反应至荨麻疹和哮喘，在某些情况下可以导致过敏性休克。对水果的负面反应最常见于苹果中。在由桦树花粉导致的花粉热的情况下，该综合征主要是由Bet v1最初诱导的交叉反应性IgE抗体介导（2）。
这类患者的治疗主要基于避免从膳食中摄入食物变应原。对于治疗对花粉、动物和螨的变态反应，已经证实了脱敏特异性免疫疗法（SIT）是有效的病原治疗形式，与药理治疗不同，前者积极地影响着作为这类疾病的 基础的一些免疫学参数。SIT涉及施用增加剂量的获自导致疾病的物质的标准提取物（疫苗）（3）。以这种方式，在患者中逐步诱导出对该物质的一类“免疫耐受”，同时伴随着变态反应症状的降低（如果不是消失的话）。但是，考虑到引起严重副作用（包括过敏性休克）的高风险，特定的免疫疗法通常不用于治疗食物变态反应。
虽然Bet v1和同源食物蛋白质之间的交叉反应性是PFS诱导的反应的潜在原因，但已发现，使用桦树花粉的SIT不导致食物变态反应症状的任何改善。
在胡萝卜变态反应中已经观察到了该无效作用，胡萝卜变态反应主要是由Bet v1的同源物——变应原Dau c1导致的，其中初发敏化作用是对桦树变应原发生的，而在食用胡萝卜后，后续的敏化作用则是针对不与Bet v1交叉反应的Dau c1的新表位的（4）。
在治疗苹果变态反应中，使用桦树花粉提取物的SIT产生了有争议的，有时是有利的结果，可能是由于Bet v1和Mal d1之间更高的序列同一性导致的（氨基酸序列为60%，与Dau c1仅为40%）。
在1998年的一项研究中，用基于桦树花粉提取物的SIT治疗的对桦树和苹果过敏的患者中的84%的患者中，经过第一年的治疗后，出现食用苹果后的OAS（口服变态反应综合征）症状的显著降低（50%-95%）或完全消失（5）。在2004年公开的一项更新的研究中，使用桦树花粉提取物的SIT仅在3个月的治疗后，就导致了对Bet v1和Mal d1的SPT反应性的显著降低。由Bet v1强烈诱导的IgG4抗体表现出与Mal d1的交叉反应性，因此支持这样的假设，即，抗桦树花粉变态反应的SIT也可以降低对含有Bet v1同源性变应原的食物变态反应（6）。同年公开的另一项研究（2004）显示，在对桦树和苹果过敏的患者中，基于桦树花粉提取物的SIT显著改善了由花粉导致的变应性症状，但不降低苹果变态反应的严重程度（7）。
因此，基于现有知识，不能确定的认为使用桦树花粉变应原的免疫疗法为对含有Bet v1同源物的食物的变态反应的情形提供显著好处，所述情形因此应该作为独立的疾病进行治疗。
针对Bet v1的PFS交叉反应性最常涉及的变应原之一是Mal d1，这是属于蔷薇科（Rosaceae）的水果——苹果——的主要变应原。Mal d1与Bet v1共享约60%的氨基酸序列（同一性），交叉反应性实验证实了存在共同的IgE和T表位（8,9）。
Mal d1（登录号Q9SYW3或AJ417551）是159个氨基酸的蛋白质，分子量为17.7kDa（10）。该变应原属于“发病机制相关蛋白”的PR-10家族，即，由植物响应环境胁迫或病理性胁迫时产生的遍在蛋白质，其功能被认为与类固醇运输相关。Mal d1位于苹果的果皮和果肉中。测量多种苹果变种的蛋白质提取物中的Mal d1含量证实该变应原在不同变种中以相当不同的浓度存在；在生长于不同地区的同一变种中也发现了Mal d1含量的变化。此外，即使是在具有低Mal d1含量的变种中，也观察到变应原浓度在果实的成熟和储藏过程中显著增加。
Mal d1由具有至少18个成员的基因家族所表示，其特征是基因中存在或缺少内含子。一些成员在不同的苹果变种中是高度保守的（Mal d1.01、Mal d1.02），而其他成员则存在更大的变化（Mal d1.04、Mal d1.05、Mal d1.06A、B、C）（11）。当在花粉-食物综合征的患者中进行SPT分析时，观察到了在由Mal d1.04和Mal d1.06A基因编码的蛋白质变体之间的关联性，以及苹果变种的更大的变应原性。该类研究的结果可应用于鉴别和培育具有较低变应原性的苹果变种，用作食物或常规免疫疗法的原材料。
出现用于特定免疫疗法的低变应原性食物变应原可代表避免食物变应原的良好替代方案，以及允许治疗疾病，所述疾病涉及对患者健康的高风险，对生活质量具有显著的负面影响，并可以导致不适的营养失衡。
近年来，大量的注意力集中在研发更安全、更有效的疫苗，包括在对IgE结合重要的氨基酸水平诱变重组蛋白质，即，在不导致副作用的条件下有利的影响疾病天然进程的低变应原性变体（12）。
文献中可获得关于Mal d1或属于蔷薇科的其他果实的同源蛋白质的低变应原性变体的一些研究。
基于Bet v1和Mal d1之间的交叉反应性，通过定点诱变同种型Mal d 1.0108上的5个氨基酸残基（T10P；I30V、T57N、T112C和I113V），生产主要的苹果变应原——Mal d1——的突变体，所述突变体是通过与Bet v1变应原的低变应原性突变体类似选定的（9）。由SPT和DBPCFC（双盲安慰剂-对照的食物刺激）分析证实，取代所述氨基酸降低了Mal d1的90%的变应原活性。与Bet v1的类似物突变体和相应的野生型分子平行的测试了具有5个氨基酸取代的相同突变体（13）。虽然在免疫印迹测试中，对桦树和苹果过敏的患者的血清表现出对Bet v1更大的IgE反应性，但也观察到与两种测试的突变体的结合降低。在ELISA测定中，在大部分测试血清（10/14）中，相比野生型变应原，观察到突变体Mal d1的IgE结合降低30%至88%。然而，诱变选定的5个氨基酸似乎对Mal d1的主要表位没有IgE反应性的偏见，因为在一些分析血清中没有观察到特定IgE结合的改变（3/14）。
在Pru av1——与Mal d1同源的主要樱桃变应原中，证实了丝氨酸112的点状取代对IgE识别分子是关键性的。在同源物Bet v1中的脯氨酸中的相同氨基酸诱变证实了丝氨酸112在保留交叉反应性IgE的表位结构中的重要性。将Pru av1的P环序列中的Glu45取代为色氨酸证实了该区域是与Bet v1交叉反应的IgE表位（14）。通过诱变第28位（Asn28Lys）、第108位（Pro108Ala）或两个位置上的氨基酸，获得了3个其他的Pru av1变体。在单突变体（Asn28Lys）和双突变体（Asn28Lys、Pro108Ala）中观察到了对桦树和樱桃过敏的患者血清中IgE结合降低多达80%，而在Pro108位的单突变体仅获得12%的降低，提示Pru av1中的氨基酸Asn28参与IgE表位。该天冬酰胺暴露在溶剂中，并且是假设为同源蛋白质Bet v1的主要抗原位点的区域之一的一部分（15）。
通过NMR分析和X射线衍射研究Bet v1的三维结构，导致鉴别出可能涉及IgE结合的具有大于
的面积的三个区域（16）。这3个区域暴露在同源变应原的由高保守氨基酸组成的表面上，所述变应原是在属于山毛榉目的物种中表达的，并被认为是对Bet v1与植物花粉的同源蛋白质之间的交叉反应性负责的潜在IgE表位。定点诱变这些区域中的氨基酸验证了它们参与IgE结合。Bet v1中的突变例如修饰出多达5个分布在分子表面上的不 同区域（包括上述3个区域），且导致变应原性降低（17），所述突变表征出2个多重突变体（T28、Q32、S45、G108）和（V5、S42、S45、K78、V103、I123、E134、H156、N160）。构成3个Gajhede假设的IgE表位的氨基酸序列在与Bet v1同源的食物变应原中也是保守的。为了降低与Bet v1的表面相似性，位于一个上述区域中的Mal d1的保守性氨基酸Thr28、Gln32和Ser45被Bet v1中相应位置上存在的氨基酸取代。相比wt对应物，这些残基的取代不改变突变体Mal d1抑制IgE-Bet v1结合的能力，同时在5个测试例的唯一一例中，消除了相同桦树变态反应患者的血液中的嗜碱性粒细胞中的组织胺释放（24）。
为了鉴别参与花粉-食物综合征的临床症状的IgE表位，通过向Bet v1序列移植4个Mal d1的短肽片段，生成嵌合蛋白质（18）。移植区域包括之前验证过对患者与两种变应原（Bet v1和Mal d1）的IgE结合关键性的氨基酸残基：T10、F30、S57、S112、I113和D125。使用来自两组患者的血清，测试嵌合蛋白质的IgE反应性，两组患者具有桦树变态反应，在摄入苹果后无PFS或表现出PFS症状。两组的IgE识别嵌合分子，但相比具有苹果变态反应的患者，无PFS的组的结合显著更低，提示Bet v1上移植的序列参与Bet v1/Mal d1IgE交叉反应性。
特征是PFS的桦树花粉变态反应代表了用于鉴别交叉反应性IgE表位的优秀的研究模型，所述模型允许生产具有降低的IgE结合能力的重组变应原。
长期以来，在特定的脱敏免疫疗法中使用改造的多聚体分子的可能性都被认为是有吸引力的，所述多聚体分子由来自相同生物或不同生物的不同变应原组成。该方法允许在单个分子中装配多个变应原，其优点是生产含有精确摩尔比的变应原的单一制品。在单个杂合分子中关联Bet v1和Mald1应该展示两种分子的T表位库，可诱导针对两种变应原的强IgG保护性应答（17）。诱导特异性针对敏化变应原的IgG抗体是与由SIT导致的益处的相关因素之一。这类（保护性）抗体可以抑制与抗原的IgE结合，改变分子的三维构象。
已进行一些研究探讨使用变应原Bet v1的三聚体衍生物的SIT对桦树花粉变态反应的临床效果（19）。治疗诱导强的IgG1和IgG4特异性变应原抗体应答，和降低鼻与皮肤的反应性，但没有产生临床症状的显著改善。
在用胡萝卜变应原Dau c1的二聚体wt或第112位的突变体形式治疗的小鼠实验中，也观察到了显著的IgG抗体应答，所述Dau c1与Bet v1变应原同源（20）。两种二聚体变体都被证实比相应单体形式的混合物抗原性更高。此外，针对Dau c1生产的所有鼠血清（单体、二聚体、wt和突变体形式）都含有与人IgE识别的表位交叉反应的特异性抗体，提示结构上改变的抗原（如二聚体）能够诱导产生对构象表位特异性的抗体。
使用低变应原性杂交变体（如Bet v1-Mal d1）可消除由对食物变应原的严重副反应导致的难题，当进行使用桦树花粉提取物的SIT时，改善了不仅对Bet v1的致耐原性应答，而且也改善了对苹果的主要变应原的致耐原性应答。
发明内容
现已发现通过取代特定的氨基酸残基来修饰序列，可以降低Mal d1变应原对IgE的结合。
根据其第一方面，本发明提供从苹果的主要变应原Mal d1（wt序列SEQ ID NO:1）或其与SEQ ID NO:1具有至少95%，优选至少97%序列同一性的同种型，获得的Mal d1序列变体，所述变体的特征在于：
a)与野生型Mal d1SEQ ID NO:1相比，对IgE的反应性降低；
b)当与SEQ ID NO:1比对时，氨基酸序列在SEQ ID NO:1的第25位和第78位的Asp和/或Asn残基中，或在Mal d1的所述同种型的相应位置中存在至少一个，优选两个取代。
Mal d1的同种型与SEQ ID NO:1具有至少95%序列同一性，包括以登录号Mal d1.0201（Uniprot Q40280）和Mal d1.0204（Uniprot Q9SYV4）保藏的天然序列。
变应原Mal d1的优选变体是这样的变体，所述变体的残基Asp25被中 性、极性或碱性的氨基酸取代，所述氨基酸优选选自Ala、Thr、Gly、Pro、Leu、Ile、Ser、Phe、Lys和Arg，更优选Ala、Thr、Ser、Gly、Lys和Arg，而残基Asn78被中性、酸性或碱性的氨基酸取代，所述氨基酸优选选自Ala、Gly、Pro、Leu、Ile、Phe、Lys、Arg、Asp和Glu，更优选Ala、Gly、Lys、Arg、Asp和Glu。
在优选的实施方案中，具有2个取代的本发明的变体具有SEQ ID NO:2中确定的序列。
本发明的变应原Mal d1的取代变体对垂枝桦花粉和苹果过敏的患者血清表现出比野生型分子降低至少10%的IgE反应性，优选至少50%，更优选至少80%。
在来自变应性个体的血清库中通过ELISA测定分析变体SEQ ID NO:2的IgE反应性（图1）。相对于wt变应原Mal d1(SEQ ID NO:1)，当用来自对桦树花粉和苹果过敏的患者的血清库孵育时，所述变体表现出IgE反应性降低89%（至1μng/ml）（SEQ ID NO:2）。在相同条件下，Mal d1变应原的变体的另一个例子（具有取代Asn78Ala）（SEQ ID NO:11）表现出IgE结合降低70.9%（图1）。
这些结果由ELISA抑制实验证实，该实验可以评测来自不同蛋白质的同源表位的反应性。发现利用0.3125μg/ml抑制剂，wt Mal d1蛋白质（SEQ ID NO:1）与来自血清库的IgE的结合被抑制93.3%（当血清用相同蛋白质预处理时），而当用变体SEQ ID NO:2预温育时，则被抑制25.4%（图2）。在相同条件下，在Asn78具有单取代的变体抑制SEQ ID NO:1-IgE结合19.7%（图2，SEQ ID NO:11）。
这些结果明确提示取代SEQ ID NO:1的第25位和/或第78位的氨基酸干扰IgE对Mal d1变应原的识别。
还观察到以浓度0.625μg/ml使用的变应原wt Mal d1SEQ ID NO:1和低变应原性变体SEQ ID NO:2以不同程度的效果抑制wt Bet v1与桦树-和苹果阳性血清库中的IgE结合。当用相同蛋白质wt Bet v1预处理血清时，抑制的量高达94%，当用蛋白质SEQ ID NO:1预温育时，抑制的量是46%，当 用蛋白质SEQ ID NO:2预温育时，抑制的量是4.2%，并且当用单取代变体SEQ ID NO:11预处理血清时，抑制的量是32.1%（图3）。
用于免疫Balb/c小鼠的wt Mal d1变应原SEQ ID NO:1和低变应原性变体SEQ ID NO:2诱导特异性IgG应答（图4）。特别是，针对SEQ ID NO:2生产的抗体也识别wt对应物SEQ ID NO:1（图5），表明修饰第25和78位的残基不导致分子IgG表位的重大改变。此外，用变体SEQ ID NO:2免疫接种诱导比用wt对应物SEQ ID NO:1所获得的免疫应答更高和更快的免疫应答。相反，用不相关抗原免疫的动物血清中存在的抗体不能识别wt Mal d1和SEQ ID NO:2。
从第五周开始，可检测到用SEQ ID NO:2免疫小鼠诱导的抗体与苹果提取物的反应性，峰值在第七周，此时用SEQ ID NO:1免疫产生的抗体仅观察到非常弱的识别，尽管在7周时，对wt Mal d1的抗体滴度与用SEQ ID NO:2免疫小鼠获得的抗体滴度是相当的（图6）。
对于诱导能够在变应原和IgE结合中竞争的保护性抗体，观察到针对SEQ ID NO:2产生的IgG抗体比wt蛋白质（SEQ ID NO:1）更有效的（p<0.001）抑制Mal d1（SEQ ID NO:1）与对桦树和苹果过敏的患者的IgE的结合（图7）。ELISA抑制实验已证实，来自用SEQ ID NO:2免疫的小鼠的IgG抑制7位患者血清的IgE反应性平均为66%（数值范围从49.6至82.2%），针对SEQ ID NO:1产生的IgG抑制平均为32.3%（11.5-53%）。作为对照使用的未免疫接种的动物的血清对特异性IgE-Mal d1结合不产生任何抑制作用。
本发明的另一方面涉及与Mal d1片段相应的免疫活性肽，所述免疫活性肽包含至少一种上述取代。所述肽优选含有15-35个、更优选15-20个氨基酸残基。本文使用的表达方式“免疫活性的”意指肽必须能够刺激不依赖IgE的免疫应答。
本发明的另一方面涉及含有本文所述的苹果主要变应原的序列变体和垂枝桦花粉的Bet v1主要变应原的低变应原性变体的杂交蛋白质，两者可能由接头分隔开。
在本发明的杂交蛋白质中，所述Mal d1和Bet v1的低变应原性变体被按头-尾方向放置在氨基末端或羧基末端均可；换言之，当杂交蛋白质的氨基末端与Bet v1或Mal d1的氨基末端一致时，杂交蛋白质的羧基末端则分别与蛋白质Mal d1或Bet v1的羧基末端一致。根据优选的实施方案，杂交蛋白质的氨基末端被Bet v1占据，而羧基末端则被Mal d1占据（图8）。
分隔Bet v1和Mal d1的突变序列的接头优选由8个氨基酸的链组成，更优选由2个氨基酸的链组成，甚至更优选由二肽EF（Glu-Phe）组成。
在本发明的优选的实施方案中，杂交蛋白质含有描述在国际专利申请WO2007/073907和欧洲专利申请EP2172215中的Bet v1的低变应原性变体，两篇专利申请是由相同申请人提交的，并通过引用全文整合到本文中。特别是，包含在本发明的杂交蛋白质中的Bet v1的低变应原性变体是从序列SEQ ID NO:5的蛋白质或其同种型通过用选自Ala、Thr、Gly、Pro、Leu、Ile、Phe和Ser的中性或极性氨基酸取代了第54、115和/或123位（SEQ ID NO:5的情况下）或所述同种型的相应位置的Lys残基获得的，所述同种型与所述序列SEQ ID NO:5至少94%，优选至少97%相同。在优选的实施方案中，所述Bet v1的低变应原性变体是SEQ ID NO:6。本文所述的Bet v1的低变应原性变体描述在上述两个专利申请中。
与SEQ ID NO:5具有超过94%序列同一性的Bet v1的同种型包括以登录号Bet v1-a（Uniprot P15494）、Bet v1-j（Uniprot P43184）和Bet v1-f（Uniprot P43179）保藏的天然分子。
序列SEQ ID NO:4的这样的杂交蛋白质是特别优选的，其中Bet v1的低变应原性变体（SEQ ID NO:6）通过二肽EF接头，按头-尾方向（Bet v1→Mal d1）结合Mal d1的低变应原性变体（SEQ ID NO:2）。
与wt杂交体相比，本发明的杂交变体表现出IgE结合降低至少10%，优选50%，并且更优选70%。
在对桦树花粉和苹果过敏的个体的血清库中，通过ELISA测定分析变体SEQ ID NO:4的IgE反应性（图9）。当与血清孵育时，与wt杂交体（SEQ ID NO:3）相比，所述变体表现出IgE反应性平均降低55.1%。
这些结果是由ELISA抑制实验证实的。观察到在等浓度（1.25μg/ml）的抑制剂条件下，当血清用单wt变应原的混合物预处理时，吸附在孔上的变应原wt Bet v1（SEQ ID NO:5）与包含在7位患者血清中的特异性IgE之间的结合平均被抑制79.9%，当血清用2种诱变组分的混合物预温育时，平均抑制53.3%，而当血清用SEQ ID NO:3预处理时，平均抑制为63.3%，并且当血清用SEQ ID NO:4预温育时，平均抑制32.1%（表2和图10A）。突变的杂交体SEQ ID NO:4在Bet v1-IgE结合中竞争的能力比SEQ ID NO:3和两种诱变变应原（mut Bet v1-SEQ ID NO:6和mut Mal d1-SEQ ID NO:2）的混合物显著减小(p<0.05)。
在等量抑制剂的条件下（1.25μg/ml），当血清用单wt变应原的混合物预处理时，吸附在孔上的wt Mal d1变应原（SEQ ID NO:1）与包含在7位患者血清中的特异性IgE之间的结合平均被抑制82.8%，当血清用2种诱变组分的混合物预温育时，平均抑制51.6%，而当血清用SEQ ID NO:3预处理时，平均抑制为74.6%，并且当血清用SEQ ID NO:4预温育时，平均抑制63.6%（表3和图10B）。针对Mal d1获得的结果与针对Bet v1测量的结果相当，SEQ ID NO:4是例外，它被证实更与Mal d1反应。
还观察到用于免疫接种Balb/c小鼠的低变应原性变体SEQ ID NO:4诱导产生能够识别存在于垂枝桦提取物中的Bet v1变应原的特异性IgG（图11）。杂交分子SEQ ID NO:4诱导的特异性IgG应答与用桦树提取物、SEQ ID NO:3或各wt或诱变变应原的混合物在小鼠中诱导的应答相似。相反，在用不相关抗原免疫接种的动物的血清中存在的抗体不能识别SEQ ID NO:3和4，以及wt和突变变应原的混合物。
低变应原性杂交变体SEQ ID NO:4也能够诱导对苹果果肉提取物组分的特异性IgG应答（图12）。在初次免疫接种后5周，用SEQ ID NO:4免疫接种诱导的IgG应答比用等摩尔量的两种单诱变变体的混合物（mut混合）免疫接种获得的应答大30倍，比wt杂交变应原SEQ ID NO:3的应答大3.2倍。从第5周起，用桦树提取物免疫接种诱导产生能够识别包含在苹果提取物中的Mal d1的IgG。
此外，当其是杂交低变应原性分子SEQ ID NO:4的一部分时，低变应原性变体SEQ ID NO:2的免疫原性增加。在用杂交变体SEQ ID NO:4免疫接种的小鼠中，特异性针对wt Mal d1（SEQ ID NO:1）和突变体Mal d1（SEQ ID NO:2）的IgG抗体的诱导作用比用单变应原SEQ ID NO:2免疫接种的小鼠高得多且早得多。在治疗的第四周中，已经观察到SEQ ID NO:4诱导作用的实质性增加，而用蛋白质SEQ ID NO:2免疫接种的动物花费了至少七周时间来获得相同的应答（图13-A，B）。
关于诱导能够抑制变应原和IgE之间结合的保护性抗体，已观察到针对SEQ ID NO:4生产的IgG抗体比用两种单突变变体的混合物（mut混合）诱导的抗体更有效的（p<0.05）抑制Bet v1（SEQ ID NO:5）与对桦树和苹果过敏的患者的IgE的结合（图14）。ELISA抑制实验已证实了在用SEQ ID NO:4免疫接种的小鼠中生产的IgG抑制7名患者的血清的IgE反应性，平均抑制87.7%（数值范围从77.4至94.7%），而针对两种诱变的变体的混合物（mut混合）产生的抗体则平均抑制82%（63.5-92.3%）；针对wt蛋白质的混合物（wt混合）产生的IgG抗体平均抑制结合54.7%（32.4-68.6%），而用wt杂交SEQ ID NO:3免疫接种获得的抗体则平均抑制82.2%（51.9-93.5%）。
用SEQ ID NO:4免疫接种的小鼠中诱导的IgG抗体还抑制在Mal d1（SEQ ID NO:1）和对桦树和苹果过敏的患者的血清中的IgE之间的结合，平均抑制47.5%，如果它们是用wt蛋白质的混合物、突变变体的混合物或免疫原SEQ ID NO:3免疫接种的，则分别平均抑制9.9%、53.5%和59.4%（图15）。
用作对照的未免疫接种的动物的血清不导致对特异性IgE与Bet v1和Mal d1的结合的任何抑制作用。
使用本领域技术人员已知的技术，通过诱变Mal d1（SEQ ID NO:7）、Bet v1（SEQ ID NO:8）、其同种型或天然变体的cDNA序列，或wt杂交物的cDNA序列（SEQ ID NO:9），可容易地制备本发明的取代变体（21）。
编码SEQ ID NO:2和4所示的（单体）双取代变体或杂交变体的cDNA序列分别报告于SEQ ID NO:10和19中。
因此，本发明的其他方面涉及编码本文所述的变应原Mal d1变体的核酸分子、编码来自其的肽的核酸分子或编码杂交蛋白质Mal d1-Bet v1的核酸分子，和包含所述分子与用于在真核或原核细胞中表达控制的元件的表达载体，所述元件如转录启动子或增强子、信号序列、或其他转录调控序列。载体可以是质粒、病毒、噬菌体或遗传工程中通常使用的任何其他载体。
本发明还包括用本发明载体转化或转染的原核或真核宿主细胞。原核细胞例如大肠杆菌（Escherichia coli）或枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis），或真核细胞例如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）通常用作克隆和cDNA表达的载体。
本发明的低变应原性变体还可作为融合蛋白制备。
由于它们降低的IgE反应性，本发明的Mal d1变体可方便地用于制备药物组合物(例如片剂)，所述药物组合物用于对苹果和/或垂枝桦花粉的过敏的个体的免疫疗法。
因此本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含有效量的Mal d1的低变应原性变体，任选和其他垂枝桦的变应原，和可药用载体、赋形剂或佐剂组合。在优选实施方案中，所述药物组合物以适当的疫苗形式用于变应性疾病的预防性或治疗性治疗，所述疾病如支气管哮喘和鼻炎、结膜炎和口服变态反应综合征。舌下、皮下和透皮的施用形式是最优选的。
接种的原理和方法是本领域技术人员已知的，描述在例如（22）中。
下列实施例进一步阐明本发明。
实施例
除非另行指出，下列实施例中所用方法描述于Sambrook,Fritsch ET Maniatis“Molecular cloning:A laboratory manual”第二版，第1-2-3卷，CSH Lab出版，1989。
实施例1–编码Mal d1变应原的cDNA的位点特异性诱变
编码Mal d1变应原的cDNA(SEQ ID NO:7，5’前是编码6个组氨酸的序列)的位点特异性诱变通过原核载体(pBluescript,GenBank登录号X52327)中的cDNA克隆，然后是PCR扩增进行。PCR反应中用作引物的寡核苷酸(表1)具有合适的碱基取代。对于每个诱变，使用结合到DNA链相应区域的互补寡核苷酸(21)。扩增后，限制酶DpnI催化的酶促消化选择性降解未改变的原模板。然后用诱变的分子转化大肠杆菌细胞。根据Sanger（法）对获自单细菌菌落的克隆进行测序，以确定cDNA中正确的碱基修饰以及不存在非特定的突变。
在PCR扩增后，在原核载体（pBluescript，GenBank登录号X52327）中通过cDNA克隆进行Mal d1变应原（SEQ ID NO:7，5’前端为编码六组氨酸的序列）编码cDNA的位点特异性诱变。在PCR反应中用作引物的寡核苷酸（表1）具有恰当的碱基取代。对于每种诱变，使用与DNA链的相应区域结合的互补寡核苷酸（21）。在扩增后，通过限制性酶Dpn I催化的酶促消化选择性降解不变的原始模板。然后，用诱变分子转化大肠杆菌细胞。根据Sanger测序从单细菌集落获得克隆，确定正确的碱基修饰和cDNA中缺少的非特定的突变。
表1.位点特异性诱变中用作引物的寡核苷酸序列。突变的碱基为黑体字符。
| 寡核苷酸 | 序列 |
| Mald1D25 | Gcc ttt gtc ctt gct gct gac aac ctc（SEQ ID NO:12) |
| Mald1N78 | Gtt gac gag gca gcc tac tca tac gcc（SEQ ID NO:13) |
实施例2–构建编码野生型Bet v1-Mal d1杂交分子的质粒（wtHybrid）
通过融合编码单变应原的cDNA，获得含有野生型Bet v1-Mal d1杂交物的遗传信息的杂交分子。
对Bet v1使用Bet v1DIM FW（ggt gtt ttc aat tac gaa act g-SEQ ID NO:14）和Bet v1DIM Eco RV（Gc gaa ttc gtt gta ggc atc ggag-SEQ ID NO:15）寡核苷酸引物，对Mal d1使用Mal d1DIM Eco FW（cgc gaa ttc ggt gtc tac aca ttt gag aac g-SEQ ID NO:16）和Mal d1DIM Bam RV（Gcg gga tcc tta gtt gta tgc gtc ggg gtg-SEQ ID NO:17）寡核苷酸引物，通过PCR分别获得编码成熟Bet v1和Mal d1蛋白质的cDNA。使用Bet v1SEQ ID NO:8和Mal d1SEQ ID NO:7克隆作为模板。
通过用Bet v1DIM Kpn FW（gcg ggt acc cat atg cat cac cat cac cat cac ggt gtt ttc aat tac gaa act g-SEQ ID NO:18）替换Bet v1DIM FW引物，重新扩增从Bet v1获得的扩增产物，从而在Bet v1序列的上游插入编码六组氨酸的序列。在Bet v1扩增产物的5’插入Kpn I位点和Nde I位点（含有ATG），在其3’插入Eco R I位点替换终止密码子。在Mal d1的5’插入Eco R I位点替换ATG，在其3’的终止密码子之后插入Bam H I位点。纯化扩增产物，用Kpn I和Eco R I限制性酶（Bet v1）或Eco R I和Bam H I（Mal d1）（限制性位点是引物中下划线的）消化，之后插入到pEt3c载体（Stratagene,La Jolla,CA）的Kpn I/Bam H I位点中，获得能够表达位于六组氨酸序列之前的Bet v1-Mal d1融合蛋白的构建体。导入Eco R I限制性位点是克隆片段必需的，这允许在两个蛋白质的连接处插入2个氨基酸（谷氨酸和苯丙氨酸）而不改变阅读框（图8）。
通过Sanger方法，测序从单个细菌菌落获得的克隆，验证碱基改变是正确的，以及在cDNA中没有非特定的突变。
实施例3–构建编码突变体Bet v1-Mal d1杂交分子的质粒（MutHybrid）
按照实施例2中描述的用于野生型杂交变体的方法，获得编码突变体Bet v1-Mal d1杂交物的杂交分子。
用于PCR反应中的寡核苷酸对是相同的，而用作模板的cDNA编码两种低变应原性变体，其序列在本文中如SEQ ID NO:20（对于Bet v1突变体）和SEQ ID NO:10（Mal d1突变体）所示。
通过Sanger方法，测序从单个细菌菌落获得的克隆，验证碱基改变是正确的，以及在cDNA中没有非特定的突变。
实施例4–生产Mal d1和Bet v1蛋白质、相应的突变体、wtHybrid和MutHybrid
根据标准方案（23），将前面是六组氨酸的编码序列的野生型Bet v1（SEQ ID NO:8）和Mal d1（SEQ ID NO:7）cDNA、诱变的cDNA（SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:10）、和改造的wt和Mut杂交cDNA（SEQ ID NO:9e19）克隆到表达载体中，并在大肠杆菌细胞中表达。离心收集细胞，重悬于100mM NaH2PO4缓冲液，pH8中并超声裂解。离心分离重组蛋白。将含有不溶蛋白质聚集体的沉淀重悬于变性缓冲液尿素6M、NaH2PO4100mM、Tris10mM pH8中，并在20℃下搅拌60分钟。将溶解的重组蛋白从不溶性残渣中离心分离，并通过使用这样的琼脂糖柱的亲和层析从上清液中纯化，所述琼脂糖柱结合了与变应原融合的六组氨酸部分相互作用的氨三乙酸螯合型镍离子。在(NH4)HCO35mM溶液中4℃透析18小时来重折叠纯化的蛋白质。
实施例5–变应性受试者血清的表征
血清收集自具有对垂枝桦花粉有季节性变态反应临床史，并具有对Bet v1和Mal d1变应原特异的RAST3+反应性的个体，然后以单独或混合的形式使用这些血清。使用来自非变应性患者的血清库作为阴性对照。
实施例6-Mal d1变体对血清库中IgE的反应性的ELISA分析
通过在4℃下温育16小时，将wt变应原（SEQ ID NO:1）和诱变的变体（SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:11）的在50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（pH9.6）中连续三倍稀释的等分试样吸附到ELISA分析用聚苯乙烯（polystirene）板的孔上。用洗涤溶液（60mM含有0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH6.5）洗涤孔，并用稀释溶液（150mM磷酸盐缓冲液中 含25%山羊血清、1mM EDTA、0.05%Tween20、0.01%邻乙汞硫基苯酸钠（Thiomersal），pH7.4）封闭。向每个样品中加入60μl来自RAST3+或非变应性对象的人血清库的稀释缓冲液中的等分试样，在25℃温育2小时。洗涤三次后，加入缀合过氧化物酶的抗人-IgE血清（稀释缓冲液中1:4000），再在25℃温育1.5小时。洗涤三次后，加入100μl TMB试剂（BioFX Laboratories,Owings Mills,MD），并在25℃温育15分钟，进行比色反应。加入100μl1N HCl终止反应，并使用酶标仪（microplate reader spectrophotometer）在450nm处读数。通过三次独立实验验证结果。应用有一些修饰的相同操作规程，测试改造的wt和Mut杂交物的IgE反应性。
在50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（pH9.6）中，按1:2的比例制备连续稀释的杂交变应原（SEQ ID NO:3和4），起始浓度为150nM，并吸附到聚苯乙烯（polystirene）板的孔上。在稀释溶液中1:2.5稀释对Bet v1和Mal d1阳性或来自作为阴性对照的非变应性对象的血清库，加入每个孔（70μl），并在25℃温育3小时。
实施例7-ELISA抑制测定-Mal d1的单体变体抑制Mal d1与血清中的IgE结合
通过在4℃下预温育16小时，将在50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（pH9.6）中的等量（0.1μg）野生型Mal d1吸附到用于ELISA分析的聚苯乙烯板的孔上。然后用洗涤溶液（60mM含有0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH6.5）洗涤孔，并用稀释溶液（150mM磷酸盐缓冲液中含15%山羊血清、1mM EDTA、0.05%Tween20，pH7.4）封闭游离的位点。在25℃下，用4倍连续稀释的wt或诱变的变应原（起始浓度为5μg/ml）预温育1:3稀释的Bet v1和Mal d1阳性的混合人血清等分试样（100μl）2小时。然后将混合物加入到每个孔中，并在4℃温育16小时。在用0.06M磷酸，pH6.5，0.05％Tween-20缓冲液洗涤三次后，加入在稀释缓冲液中1:4000稀释的缀合了过氧化物酶的抗人IgE血清，并在25℃温育1.5小时。洗涤三次后，通过加入100μl TMB试剂（BioFX Laboratories,Owings Mills, MD）获得比色反应显色，在25℃温育15分钟。通过加入100μl1N HCl终止反应，用分光光度仪在450nm处读数来评价反应。使用下列公式计算抑制百分数：100x[(A-B)/A]，其中A是无抑制剂时450nm处的吸光度，而B是存在抑制剂时的吸光度。数据是3次独立实验所代表的。
实施例8-ELISA抑制测定-Mal d1的单体变体抑制Bet v1与血清中的IgE结合
通过在4℃下预温育16小时，将在50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（pH9.6）中的等量（0.1μg）野生型Bet v1吸附到用于ELISA分析的聚苯乙烯板的孔上。然后用洗涤溶液（60mM含有0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH6.5）洗涤孔，并用稀释溶液（150mM磷酸盐缓冲液中含15%山羊血清、1mM EDTA、0.05%Tween20，pH7.4）封闭游离的位点。在25℃下，用连续4倍稀释的wt Bet v1、wt Mal D1或诱变的变体（起始浓度为10μg/ml）预温育1:3稀释的Bet v1和Mal d1阳性的混合人血清等分试样（100μl）2小时。然后将混合物加入到每个孔中，并在4℃温育16小时。在用0.06M磷酸，pH6.5，0.05％Tween-20缓冲液洗涤三次后，加入在稀释缓冲液中1:4000稀释的缀合了过氧化物酶的抗人IgE血清，并在25℃温育1.5小时。洗涤三次后，通过加入100μl TMB试剂（BioFX Laboratories,Owings Mills,MD）获得比色反应显色，在25℃温育15分钟。通过加入100μl1N HCl终止反应，用分光光度仪在450nm处读数来评价反应。使用下列公式计算抑制百分数：100x[(A-B)/A]，其中A是无抑制剂时450nm处的吸光度，而B是存在抑制剂时的吸光度。数值是通过3次独立实验所确定的。
实施例9-ELISA抑制测定-SEQID NO:3和SEQ ID NO:4抑制Betv1或Mal d1与血清中的IgE结合
通过在4℃下预温育16小时，将在50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（pH9.6）中的等量（0.1μg）野生型Bet v1或Mal d1吸附到用于ELISA 分析的聚苯乙烯板的孔上。然后用洗涤溶液（60mM含有0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH6.5）洗涤孔，并用稀释溶液（150mM磷酸盐缓冲液中含15%山羊血清、1mM EDTA、0.05%Tween20，pH7.4）封闭游离的位点。在25℃下，用等量（1.25μg/ml）的野生型变应原、诱变或改造的变体（杂交物）预温育1:3稀释的Bet v1和Mal d1阳性的混合人血清库的等分试样（70μl）2小时。然后将混合物加入到每个孔中，并在4℃温育16小时。在用0.06M磷酸，pH6.5，0.05％Tween-20缓冲液洗涤三次后，加入在稀释缓冲液中1:4000稀释的缀合了过氧化物酶的抗人IgE血清，并在25℃温育1.5小时。洗涤三次后，通过加入100μl TMB试剂（BioFX Laboratories,Owings Mills,MD）获得比色反应显色，在25℃温育15分钟。通过加入100μl1N HCl终止反应，用分光光度仪在450nm处读数来评价反应。使用下列公式计算抑制百分数：100x[(A-B)/A]，其中A是无抑制剂时450nm处的吸光度，而B是存在抑制剂时的吸光度。
表2.杂交野生型-和诱变的-分子抑制Bet v1-IgE结合
表3.杂交野生型-和诱变的-分子抑制Mad d1-IgE结合
实施例10–免疫接种Balb/c小鼠
将由5只Balb/c系雌性动物（Charles River）组成的10组小鼠用150pmol的wt、诱变的或改造的（杂交）变应原或与200μl盐水中的2mgAl(OH3)混合的10μg垂枝桦或苹果的提取物皮下免疫。另外两次加强免疫在21和42天时实施。作为对照，5只小鼠接受用不相关抗原的相同治疗（数据未显示）。在首次免疫后的第2、4、5和7周，从小鼠颈静脉收集血液，用ELISA检查抗体与每种免疫原的应答。在用SEQ ID NO:2和4免疫的小鼠中，还分析了识别野生型蛋白质或垂枝桦花粉和苹果提取物的能力。基于免疫原性类型和首次免疫接种后花费的时间，混合小鼠的血清。
实施例11-ELISA测定来分析免疫小鼠中的特异性IgG应答
通过在4℃下温育16小时，将在50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（pH9.6）中的等量的垂枝桦花粉和苹果的提取物（20μg/ml）或wt Bet v1或Mal d1或SEQ ID NO:2（2μg/ml）吸附到用于ELISA测定的聚苯乙烯板的孔上。然后用洗涤溶液（60mM含有0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH6.5）洗涤孔，并用稀释溶液（150mM磷酸盐缓冲液中含15%山羊血 清、1mM EDTA、0.05%Tween20，pH7.4）封闭游离的位点。向每个孔加入在稀释缓冲液中1:1000稀释的每只小鼠血清或混合血清的相等等分试样（100μl），并在25℃温育2小时。洗涤三次后，加入在稀释缓冲液中1:2000稀释的缀合了过氧化物酶的抗全小鼠IgG血清，并在25℃温育1.5小时。洗涤三次后，通过加入100μl TMB试剂（BioFX Laboratories,Owings Mills,MD）获得比色反应显色，在25℃温育20分钟。加入100μl1N HCl终止反应，用分光光度仪在450nm处读数。数据显示了分析每组的5只小鼠的血清获得的平均反应性。
实施例12–ELISA抑制测定。抗SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的IgG抑制在野生型Bet v1或Mal d1与Bet v1和Mal d1阳性的变应性患者血清中的IgE之间的结合
通过在4℃下预温育16小时，将在50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（pH9.6）中的等量Bet v1（0.1μg）或Mal d1（0.2μg）吸附到用于ELISA测定的聚苯乙烯板的孔上。然后用洗涤溶液（60mM含有0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH6.5）洗涤孔，并用稀释溶液（150mM磷酸盐缓冲液中含15%山羊血清、1mM EDTA、0.05%Tween20，pH7.4）封闭游离的位点。在4℃下温育首次免疫接种7周后收集的小鼠血清1:10稀释库的等分试样（100μl）16小时。在用0.06M的磷酸缓冲液（pH6.5）、0.05％Tween-20洗涤三次后，在25℃加入7种对Bet v1和Mal d1阳性的1:3稀释的人血清3小时。在用0.06M的磷酸缓冲液（pH6.5）、0.05％Tween-20洗涤三次后，加入在稀释缓冲液中1:4000稀释的缀合了过氧化物酶的抗人IgE血清，并在25℃温育1.5小时。洗涤三次后，通过加入100μl TMB试剂（BioFX Laboratories,Owings Mills,MD）获得比色反应显色，在25℃温育20分钟。加入100μl1N HCl终止反应，用分光光度仪在450nm处读数。使用下列公式计算抑制百分数：100x[(A-B)/A]，其中A是无抑制性人血清时450nm处的吸光度，而B是存在抑制性人血清时的吸光度。
实施例13–统计学分析
在附图中，结果表示为平均值加相应的标准差。
统计学分析使用Excel软件的UNISTAT5.5Light。通过成对T检验分析数据。
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Claims (20)
1.苹果（Malus domestic）主要变应原Mal d1wt（SEQ ID NO:1）或其与SEQ ID NO:1至少95%，优选至少97%相同的同种型的序列变体，所述变体的特征是：
a)其表现出比所述Mal d1变应原（SEQ ID NO:1）降低的IgE反应性；
b)其具有这样的氨基酸序列，当与SEQ ID NO:1比对时，所述氨基酸序列在与SEQ ID NO:1的第25位和第78位对应的Asp和/或Asn残基上存在至少一个，优选两个取代。
2.权利要求1的序列变体，其中相比Mal d1变应原SEQ ID NO:1，来自对苹果和/或垂枝桦（Betula verrucosa）花粉过敏的患者的血清的IgE反应性降低至少10%。
3.权利要求1-2的序列变体，其中所述Asp和Asn残基都被取代。
4.权利要求1-3的序列变体，其中：
-Asp25残基被中性、极性或碱性的氨基酸取代，所述氨基酸优选选自Ala、Thr、Gly、Pro、Leu、Ile、Ser、Phe、Lys和Arg，更优选Ala、Thr、Ser、Gly、Lys和Arg；
-Asn78残基被中性、酸性或碱性的氨基酸取代，所述氨基酸优选选自Ala、Gly、Pro、Leu、Ile、Phe、Lys、Arg、Asp和Glu，更优选Ala、Gly、Lys、Arg、Asp和Glu。
5.权利要求1-4的序列变体，由SEQ ID NO:2组成。
6.含有权利要求1-5定义的苹果主要变应原的序列变体和垂枝桦花粉的主要变应原Bet v1的低变应原性变体的杂交蛋白质，任选由接头分隔开。
7.权利要求6的杂交蛋白质，其中所述Bet v1低变应原性变体是通过取代SEQ ID NO:5的第54、115和/或123位或其同种型的相应位置上的一个或多个Lys残基从蛋白质SEQ ID NO:5或其同种型获得的，所述同种型与SEQ IDNO:5具有至少94%，优选至少97%序列同一性。
8.权利要求7的杂交蛋白质，其中所述Lys残基被选自Ala、Thr、Gly、Pro、Leu、Ile、Phe和Ser的中性或极性氨基酸取代。
9.权利要求6-8的杂交蛋白质，其中所述Bet v1低变应原性变体由SEQ IDNO:6组成。
10.权利要求6-9的杂交蛋白质，其中所述Mal d1和Bet v1低变应原性变体以头-尾的方向位于氨基末端或羧基末端。
11.权利要求10的杂交蛋白质，其中Bet v1和Mal d1分别位于氨基末端和羧基末端。
12.权利要求6-11的杂交蛋白质，其中所述接头由含有1-8个氨基酸的氨基酸序列，优选EF二肽，组成。
13.权利要求12的杂交蛋白质，由SEQ ID NO:4组成。
14.编码权利要求1-5的Mal d1低变应原性变体，或编码权利要求6-13的杂交蛋白质的核酸分子。
15.权利要求14的核酸分子，其序列选自SEQ ID NO:10和19。
16.含有权利要求14-15的核酸分子的表达载体。
17.药物组合物，其包含有效量的权利要求1-5的Mal d1的低变应原性变体或权利要求6-13的杂交蛋白质，和可药用载体、赋形剂或佐剂。
18.权利要求17的组合物，其处于适合舌下、皮下或透皮施用的形式。
19.权利要求1-5的Mal d1低变应原性变体，或权利要求6-13的杂交蛋白质，或权利要求17-18的药物组合物，用于对苹果和/或垂枝桦花粉过敏的对象的免疫疗法。
20.权利要求19的用于对苹果和/或垂枝桦花粉过敏的对象的免疫疗法的低变应原性变体或杂交蛋白质或药物组合物，其中所述对象患支气管哮喘、鼻炎、结膜炎或口服变态反应综合征。
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