ITMI20111489A1 - Varianti ipoallergeniche dell'allergene maggiore mal d 1 di malus domestica - Google Patents

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

“VARIANTI IPOALLERGENICHE DELL’ALLERGENE MAGGIORE MAL D 1 DI MALUS DOMESTICAâ€

La presente invenzione riguarda varianti di sequenza della proteina Mal d 1 ipoallergeniche, molecole di acido nucleico che le codificano, composizioni farmaceutiche contenenti le stesse e il loro uso nell’immunoterapia di malattie allergiche causate dalla specie Malus domestica.

SFONDO DELL’INVENZIONE

Le allergie sono determinate da una anomalia del sistema immunitario che reagisce producendo anticorpi della classe IgE verso proteine, di per sé del tutto innocue, contenute principalmente in pollini, acari, epiteli ed alimenti.

Stime recenti indicano che più del 25% della popolazione nei paesi industrializzati à ̈ affetta da questa patologia che, persistendo nel tempo, può determinare un peggioramento dei sintomi (p. es. comparsa di asma) ed una sensibilizzazione ad altri allergeni, complicando così la scelta della terapia più idonea (1).

Nel mondo circa un terzo di tutti i pazienti allergici soffre di allergia al polline degli alberi. Nelle zone con clima temperato, il polline di alberi appartenenti all’ordine Fagales (betulla, ontano, nocciolo, quercia, carpino) rappresenta una delle più importanti cause di rinite e asma allergica. Circa il 95% dei pazienti allergici al polline di betulla produce anticorpi IgE contro Bet v 1 e il 60% di questi pazienti reagisce esclusivamente contro Bet v 1 (cDNA depositato in GenBank acc. n. X15877), l’allergene maggiore del polline di betulla (2,3).

Una percentuale elevata degli individui allergici al polline di betulla (50%-93%) sviluppa reazioni allergiche dopo l’ingestione di alcuni alimenti (mele, carote, nocciole, sedano) (4). Questo tipo di ipersensibilità in pazienti con allergia ai pollini, caratterizzata dalla comparsa di allergia a frutta, frutta secca, verdure, à ̈ descritta come “pollen-food syndrome†(PFS). I sintomi spaziano dalle reazioni della mucosa del primo tratto digestivo (sindrome allergica orale) e gastro-enterica a orticaria, asma, e possono provocare in alcuni casi shock anafilattico. Le reazioni avverse alla frutta si verificano più frequentemente nei confronti della mela. Nel caso della pollinosi causata da polline di betulla, questa sindrome à ̈ mediata principalmente da anticorpi IgE cross-reattivi indotti originariamente da Bet v 1 (5).

Il trattamento di questi pazienti à ̈ basato principalmente sull’esclusione dalla dieta dell’alimento responsabile dell’allergia. Per il trattamento dell’allergia a pollini, animali, acari, l’immunoterapia specifica iposensibilizzante (ITS), a differenza della terapia farmacologica, si à ̈ dimostrata una forma di trattamento eziologico efficace, in grado di modificare positivamente alcuni parametri immunologici che sono alla base della malattia. L’ITS consiste nella somministrazione a dosi crescenti di estratti standardizzati (vaccini), ottenuti a partire dalla stessa sostanza causa della malattia (6). In questo modo si induce progressivamente nel paziente una sorta di “tolleranza immunologica†nei confronti di tale sostanza che si accompagna ad una riduzione se non scomparsa dei sintomi allergici. Al contrario, l’immunoterapia specifica non à ̈ comunemente usata per il trattamento delle allergie alimentari a causa del rischio elevato di indurre effetti collaterali gravi, incluso lo shock anafilattico (7,8).

Nonostante che la cross-reattività tra Bet v 1 e le proteine omologhe degli alimenti sia alla base delle reazioni da PFS, à ̈ stato riscontrato che l’ITS con polline di betulla non induce miglioramento dei sintomi provocati dall’allergia associata agli alimenti (9,10,13).

Questa inefficacia à ̈ stata osservata nel caso dell’allergia alla carota, causata principalmente dall’allergene Dau c 1, omologo di Bet v 1, in cui si verifica una sensibilizzazione primaria nei confronti dell’allergene della betulla e una sensibilizzazione successiva, in seguito al consumo di carota, verso nuovi epitopi di Dau c 1 non cross-reattivi con Bet v 1 (10).

Nella cura dell’allergia alla mela, l’ITS con estratto di polline di betulla ha dato luogo a risultati controversi, in alcuni casi positivi, probabilmente riconducibili alla maggiore identità di sequenza esistente tra Bet v 1 e Mal d 1 (60% della sequenza aminoacidica contro il 40% di Dau c 1).

In uno studio del 1998, nell’84% dei pazienti allergici a betulla e mela, trattati con ITS a base di estratto di polline di betulla, si osservava una diminuzione significativa (50-95%) o totale dei sintomi da OAS (sindrome orale allergica) dopo ingestione di mela già dopo il primo anno di trattamento (11). In un lavoro più recente, pubblicato nel 2004, l’ITS con estratto di polline di betulla determinava una diminuzione significativa della reattività in SPT per Bet v 1 e Mal d 1, già dopo tre mesi dal trattamento. Gli anticorpi IgG4 fortemente indotti contro Bet v 1 mostravano cross-reattività con Mal d 1, supportando perciò l’ipotesi che l’ITS verso l’allergia al polline di betulla potesse diminuire anche l’allergia ai cibi contenenti allergeni omologhi a Bet v 1 (12). Un altro studio pubblicato nello stesso anno (2004) mostrava, in pazienti con allergia alla betulla e alla mela, che l’ITS a base di estratto di polline di betulla apportava benefici significativi alla sintomatologia allergica provocata dal polline ma non diminuiva la gravità dell’allergia alla mela (13).

In base alle conoscenze attuali non si può perciò affermare con certezza che l’immunoterapia con gli allergeni del polline di betulla sia in grado di apportare benefici significativi all’allergia agli alimenti contenenti omologhi di Bet v 1 la quale va perciò trattata come una patologia separata.

Uno degli allergeni più frequentemente implicati nella cross-reattività da PFS con Bet v 1 à ̈ Mal d 1, l’allergene maggiore della mela, frutto appartenente alla famiglia delle Rosaceae. Mal d 1 condivide con Bet v 1 circa il 60% della sequenza aminoacidica (identità) ed esperimenti di cross-reattività hanno dimostrato la presenza di epitopi IgE e T comuni (14-16).

Mal d 1 (Acc. N° Q9SYW3 o nt. AJ417551) à ̈ una proteina di 159 aminoacidi con un peso molecolare di 17.7 kDa. (17). Questo allergene appartiene alla famiglia delle PR-10, “pathogenesis-related proteins†, proteine ubiquitarie prodotte dalle piante in risposta a condizioni di stress ambientale o patologico, la cui funzione si à ̈ ipotizzato essere relativa al trasporto di steroidi (18,19). Mal d 1 si localizza nella mela a livello sia della buccia che della polpa (20). Il dosaggio di Mal d 1 negli estratti proteici di numerose varietà di mela ha dimostrato che questo allergene à ̈ presente in concentrazioni considerevolmente differenti nelle diverse varietà (21); un’alta variabilità nel contenuto di Mal d 1 à ̈ stata riscontrata anche a livello della stessa varietà coltivata in luoghi diversi. Inoltre, anche nelle varietà a basso contenuto di Mal d 1, si à ̈ osservato che la concentrazione dell’allergene aumenta significativamente durante la maturazione e lo stoccaggio dei frutti (22).

Mal d 1 à ̈ rappresentato da una famiglia genica a cui appartengono almeno diciotto membri caratterizzati dalla presenza o meno di introni nel gene. Alcuni membri sono altamente conservati nelle differenti varietà di mela (Mal d 1.01, Mal d 1.02), altri presentano un livello di variabilità maggiore (Mal d 1.04, Mal d 1.05, Mal d 1.06 A, B, C) (23). Effettuando analisi di SPT su pazienti con “pollen-food syndrome†, à ̈ stata osservata un’associazione tra le varianti proteiche codificate dai geni Mal d 1.04, Mal d 1.06A e la maggiore allergenicità delle varietà di mela. I risultati di studi di questo tipo potrebbero avere applicazioni nell’identificazione e nella coltivazione di varietà di mela caratterizzate da minore allergenicità da utilizzare nell’alimentazione o come materia prima per l’immunoterapia tradizionale.

Lo sviluppo di allergeni alimentari ipoallergenici da impiegare nell’immunoterapia specifica potrebbe rappresentare una valida alternativa alla sospensione degli alimenti dalla dieta e consentire la cura di una patologia che, oltre a indurre rischi elevati per la salute dei pazienti, ha un impatto sociale considerevole e può portare a squilibri nutrizionali invalidanti.

Negli ultimi anni, molta attenzione si à ̈ concentrata sullo sviluppo di vaccini più efficaci e con un maggior grado di sicurezza, costituiti da proteine ricombinanti mutagenizzate a livello di aminoacidi importanti per il riconoscimento IgE, cioà ̈ varianti ipoallergeniche in grado di incidere positivamente sul decorso naturale della malattia senza causare effetti secondari indesiderati (24).

In letteratura sono disponibili alcuni studi su varianti ipoallergeniche di Mal d 1 o di proteine omologhe prodotte in altri frutti appartenenti alla famiglia delle Rosaceae.

Sulla base della cross-reattività tra Bet v 1 e Mal d 1 à ̈ stato prodotto un mutante dell’allergene maggiore della mela Mal d 1 mediante mutagenesi sito-diretta di cinque residui aminoacidici sull’isoforma Mal d 1.0108: T10P; I30V, T57N, T112C, I113V, scelti per analogia con un mutante ipoallergenico dell’allergene Bet v 1 (16). La sostituzione di questi aminoacidi ha determinato la diminuzione del 90% dell’attività allergenica di Mal d1, come dimostrato in analisi di SPT e DBPCFC (double-blind placebo-controlled food challenge). Lo stesso mutante con cinque sostituzioni aminoacidiche à ̈ stato sottoposto a test in parallelo con il mutante analogo di Bet v 1 e con le rispettive forme wild-type (25). I sieri di pazienti allergici a betulla e mela, pur mostrando in immunoblotting una reattività IgE maggiore nei confronti di Bet v 1, hanno mostrato una diminuzione di legame nei confronti di entrambi i mutanti testati. In ELISA nella maggioranza dei sieri testati (10/14) à ̈ stata osservata una diminuzione dal 30 all’88% del legame IgE nei confronti del mutante Mal d 1 rispetto all’allergene wild-type. La mutagenesi dei cinque aminoacidi selezionati sembrerebbe però non compromettere la reattività IgE degli epitopi principali di Mal d 1 visto che con alcuni sieri analizzati (3/14) non si à ̈ osservata una variazione del legame con le IgE specifiche.

In Pru av 1, l’allergene maggiore della ciliegia omologo a Mal d 1, la sostituzione puntiforme della serina 112 si à ̈ rivelata critica per il riconoscimento della molecola da parte delle IgE. Lo stesso aminoacido mutagenizzato in prolina nell’omologo Bet v 1 ha confermato l’importanza della serina 112 nel preservare la struttura dell’epitopo IgE cross-reattivo (26). La sostituzione di Glu45 in triptofano all’interno della sequenza P-loop di Pru av 1 ha dimostrato che questa regione à ̈ un epitopo IgE cross-reattivo con Bet v 1 (27). Altre tre varianti di Pru av 1 sono state ottenute mutagenizzando l’amminoacido in posizione 28 (Asn28Lys), 108 (Pro108Ala) o in entrambe le posizioni. Una riduzione fino all’80% del legame tra allergene e IgE di pazienti allergici a betulla e ciliegia à ̈ stato osservato per il mutante singolo (Asn28Lys) e doppio (Asn28Lys, Pro108Ala) mentre si à ̈ ottenuta una diminuzione di appena il 12% per il mutante singolo su Pro108, suggerendo che l’aminoacido Asn28 in Pru av 1 à ̈ coinvolto in un epitopo IgE. Questa asparagina à ̈ esposta al solvente e fa parte di una delle aree proposte come siti antigenici principali nella proteina omologa Bet v 1 (28).

Lo studio della struttura tridimensionale di Bet v 1 mediante analisi di NMR e diffrazione ai raggi X ha permesso infatti di identificare tre aree con una superficie superiore a 600 Ã… che potrebbero essere coinvolte nel legame IgE (29). Queste tre zone esposte in superficie sono costituite da aminoacidi altamente conservati negli allergeni omologhi espressi nelle specie appartenenti alle Fagales e sono state proposte come potenziali epitopi IgE responsabili della cross-reattività tra Bet v 1 e le proteine omologhe dei pollini delle piante (30). La mutagenesi sito-diretta a livello di aminoacidi compresi in queste aree ha confermato il loro coinvolgimento nel legame della molecola con le IgE. Le mutazioni di Bet v 1 che caratterizzano i due mutanti multipli (T28, Q32, S45, G108) e (V5, S42, S45, K78, V103, I123, E134, H156, N160), per esempio, modificano fino a cinque differenti aree distribuite sulla superficie della molecola, comprese le tre zone sopra descritte, e ne determinano una diminuzione dell’allergenicità (31). Le sequenze aminoacidiche che compongono i tre epitopi IgE proposti da Gajhede sono conservate anche negli allergeni alimentari omologhi a Bet v 1 (32). Al fine di diminuire la similarità di superficie tra Bet v 1 e Mal d 1, gli aminoacidi conservati Thr 28, Gln 32, Ser 45 di Mal d 1, localizzati in una delle aree sopra descritte, sono stati sostituiti con aminoacidi non presenti in Bet v 1 nelle medesime posizioni. La sostituzione di questi residui non ha determinato alcuna variazione significativa nella capacità di Mal d 1 mutato di inibire il legame IgE-Bet v 1 rispetto alla corrispondente molecola wt, mentre à ̈ stata osservata l’abolizione del rilascio di istamina nel sangue degli stessi pazienti allergici alla betulla in un solo caso su cinque testati (43).

Per meglio individuare gli epitopi IgE coinvolti nelle manifestazioni cliniche da pollen-food syndrome, à ̈ stata generata una proteina chimerica inserendo nella sequenza di Bet v 1 cinque corte sequenze peptidiche di Mal d 1 (33). Le sequenze scelte comprendevano i residui aminoacidici precedentemente dimostratisi cruciali per il legame delle IgE a entrambi gli allergeni Bet v 1 e Mal d 1: T10, F30, S57, S112, I113, D125. La reattività IgE della proteina chimerica à ̈ stata testata su due gruppi di pazienti con allergia alla betulla associata o meno a reattività clinica nei confronti della mela. La molecola chimerica veniva riconosciuta dalle IgE di entrambi i gruppi ma il legame era significativamente più basso nel gruppo senza PFS rispetto al gruppo con allergia alla mela, suggerendo che le sequenze inserite su Bet v 1 erano coinvolte nella cross-reattività IgE Bet v 1/Mal d 1.

L’allergia al polline di betulla caratterizzata da PFS rappresenta un ottimo modello di studio per identificare gli epitopi IgE cross-reattivi e consentire la produzione di allergeni ricombinanti con ridotta capacità di legame alle IgE.

È da tempo ritenuta interessante la possibilità di utilizzare molecole multimeriche ingegnerizzate costituite da differenti allergeni dello stesso organismo o di organismi diversi per la terapia iposensibilizzante specifica. Questo approccio consente di assemblare più allergeni in un’unica molecola con il vantaggio di produrre un'unica preparazione contenente gli allergeni in un preciso rapporto molare. L’associazione di Bet v 1 e Mal d 1 in una singola molecola ibrida rappresenterebbe il repertorio degli epitopi T di entrambe le molecole e potrebbe indurre una forte risposta IgG protettiva (31,34,35) nei confronti di entrambi gli allergeni. L’induzione di anticorpi IgG specifici per l’allergene sensibilizzante à ̈ infatti uno degli elementi che si correla al beneficio indotto dalla ITS. Questi anticorpi (protettivi) possono inibire il legame delle IgE all’antigene, influenzandone la conformazione tridimensionale.

Alcuni studi sono stati effettuati per testare gli effetti clinici sull’allergia al polline di betulla dell’ITS con derivati trimerici dell’allergene Bet v 1 (36). Il trattamento induceva una marcata risposta anticorpale specifica di tipo IgG1 e IgG4, una minore reattività ai test di provocazione nasale e cutanea ma non portava a un miglioramento significativo dei sintomi clinici.

Una risposta anticorpale IgG elevata à ̈ stata altresì osservata in esperimenti su topi trattati con la forma dimerica wt o mutagenizzata in posizione 112 dell’allergene Dau c 1 della carota, omologo di Bet v 1 (37). Entrambi i dimeri sono risultati più immunogenici rispetto alla miscela delle rispettive forme monomeriche. Inoltre, tutti i sieri murini prodotti contro Dau c 1 (in forma monomerica, dimerica, wt e mutante) contenevano anticorpi specifici per gli epitopi riconosciuti dalle IgE umane, indicando che antigeni strutturalmente alterati come i dimeri sono in grado di indurre la produzione di anticorpi specifici per epitopi conformazionali.

L’utilizzo di una variante ipoallergenica della proteina ibrida Bet v 1-Mal d 1 potrebbe consentire di superare le difficoltà causate dalla pericolosità degli allergeni alimentari e di ottenere una risposta mirata non solo verso Bet v 1, come avverrebbe utilizzando l’ITS a base di estratto di betulla, ma anche verso l’allergene maggiore della mela.

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

Si à ̈ ora trovato che à ̈ possibile ridurre il legame alle IgE da parte dell’allergene Mal d 1 modificandone la sequenza attraverso la sostituzione di specifici residui amminoacidici.

Secondo un primo aspetto, l’invenzione si riferisce a una variante di sequenza di Mal d 1 ottenuta a partire dall’allergene maggiore di Malus domestica Mal d 1 (sequenza wt SEQ ID NO:1) o di una sua isoforma avente, rispetto a SEQ ID NO:1, un’identità di sequenza di almeno il 95%, preferibilmente almeno il 97%, detta variante essendo caratterizzata da (per le sequenze indicate con “SEQ ID NO:†si fa riferimento all’allegata Lista delle Sequenze):

a) una ridotta reattività alle IgE rispetto a detto allergene Mal d 1 SEQ ID NO:1;

b) una sequenza aminoacidica che, allineata a SEQ ID NO:1, presenta almeno una, preferibilmente due sostituzioni a livello dei residui Asp e/o Asn nelle posizioni 25 e 78 di SEQ ID NO:1 o nelle corrispondenti posizioni di dette isoforme di Mal d 1.

Tra le isoforme di Mal d 1 con identità di sequenza di almeno il 95% rispetto a SEQ ID NO:1 sono comprese le molecole naturali depositate ai numeri di accesso Mal d 1.0201 (Uniprot Q40280) e Mal d 1.0204 (Uniprot Q9SYV4).

Sono preferite le varianti dell’allergene Mal d 1 in cui il residuo Asp 25 à ̈ sostituito con un amminoacido neutro, polare o basico, che à ̈ preferibilmente scelto tra Ala, Thr, Gly, Pro, Leu, Ile, Ser, Phe, Lys, Arg, più preferibilmente tra Ala, Thr, Ser, Gly, Lys, Arg, mentre il residuo Asn 78 à ̈ sostituito con un aminoacido neutro, acido o basico, che à ̈ preferibilmente scelto tra Ala, Gly, Pro, Leu, Ile, Phe, Lys, Arg, Asp, Glu, più preferibilmente tra Ala, Gly, Lys, Arg, Asp, Glu.

In una realizzazione preferita, la variante secondo l’invenzione recante 2 sostituzioni ha la sequenza identificata in SEQ ID NO: 2.

La variante di sostituzione dell’allergene Mal d 1 secondo la presente invenzione à ̈ in grado di ridurre la reattività verso le IgE, rispetto alla molecola wild-type, di almeno il 10%, preferibilmente di almeno il 50%, più preferibilmente di almeno l’80%, nel siero di pazienti allergici al polline di Betula verrucosa e alla mela.

La reattività della variante SEQ ID NO: 2 verso le IgE à ̈ stata analizzata in un pool di sieri di soggetti allergici mediante saggio ELISA (Fig. 1).

Incubata con un pool di sieri di pazienti allergici al polline di betulla e alla mela, tale variante presentava una riduzione della reattività alle IgE (a 1 µg/ml), rispetto all’allergene Mal d 1 (SEQ ID NO: 1), pari all’89% (SEQ ID NO: 2). Altro esempio di variante dell’allergene Mal d 1 con una sostituzione, Asn 78 in Ala (SEQ ID NO:11), mostrava nelle stesse condizioni una riduzione del legame IgE, rispettivamente del 70,9%, (Fig. 1).

Questi risultati sono stati confermati mediante esperimenti di ELISA-inibizione, che permettono di valutare la reattività di epitopi omologhi in proteine diverse. Si à ̈ visto che con 0,3125 µg/ml di inibitore, il legame tra la proteina Mal d 1 wt (SEQ ID NO: 1) e le IgE del pool di sieri à ̈ inibito del 93,3% quando il siero à ̈ pretrattato con la stessa proteina, del 25,4% quando à ̈ preincubato con la variante SEQ ID NO: 2 (Fig. 2). Nelle stesse condizioni, la variante a singola sostituzione in Asn78 inibisce il legame SEQ ID NO: 1-IgE del 19,7% (Fig. 2, SEQ ID NO: 11).

Questi risultati indicano chiaramente che la sostituzione degli aminoacidi in posizione 25 e/o 78 di SEQ ID NO: 1 interferisce nel riconoscimento dell’allergene Mal d 1 da parte delle IgE.

Inoltre si à ̈ visto che l’allergene Mal d 1 wt SEQ ID NO: 1 e la variante ipoallergenica SEQ ID NO: 2, utilizzati alla concentrazione di 0,625 µg/ml, sono in grado di inibire con differente efficacia il legame a Bet v 1 wt da parte delle IgE di un pool di sieri positivi a betulla e mela. L’inibizione à ̈ del 94%, quando il siero à ̈ pretrattato con la stessa proteina Bet v 1 wt, del 46% quando à ̈ preincubato con la proteina SEQ ID NO: 1, del 4,2% con SEQ ID NO: 2; del 32,1% quando il siero à ̈ pretrattato con la variante a singola sostituzione SEQ ID NO: 11 (Fig. 3).

La proteina Mal d 1 wt SEQ ID NO: 1 e la variante ipoallergenica SEQ ID NO: 2, utilizzate per immunizzare topi Balb/c, sono in grado di indurre una risposta IgG specifica (Fig. 4). In particolare, gli anticorpi prodotti contro SEQ ID NO: 2 sono in grado anche di riconoscere la controparte wt SEQ ID NO: 1 (Fig. 5), dimostrando che la modifica dei residui in posizione 25 e 78 non determina un’alterazione significativa degli epitopi IgG della molecola. Inoltre, l’immunizzazione con la variante SEQ ID NO: 2 induce una risposta immunitaria più elevata e celere rispetto a quella ottenuta con la controparte wt SEQ ID NO: 1. Per contro, gli anticorpi presenti nel siero degli animali immunizzati con un antigene non correlato non sono in grado di riconoscere Mald 1 wt e SEQ ID NO: 2.

La reattività verso l’estratto di mela degli anticorpi prodotti immunizzando i topi con SEQ ID NO: 2 à ̈ rilevabile a partire dalla quinta settimana e raggiunge il massimo alla settima settimana, momento in cui si osserva un riconoscimento molto blando da parte degli anticorpi prodotti immunizzando con SEQ ID NO: 1, nonostante il titolo anticorpale verso Mal d 1 wt a sette settimane sia paragonabile a quello ottenuto in topi immunizzati con SEQ ID NO: 2 (Fig. 6).

Riguardo l’induzione di anticorpi protettivi in grado di competere con il legame tra allergene e IgE, si à ̈ osservato che gli anticorpi IgG prodotti contro SEQ ID NO: 2 sono in grado di inibire il legame delle IgE di pazienti allergici a betulla e mela a Mal d 1 (SEQ ID NO: 1) più efficacemente rispetto alla proteina wt (SEQ ID NO: 1) (p<0.001) (Fig.7). Esperimenti di ELISA inibizione hanno mostrato che le IgG prodotte nei topi immunizzati con SEQ ID NO: 2 inibiscono la reattività IgE di sette sieri di pazienti mediamente del 66% (con valori dal 49,6 all’82,2%) mentre quelli prodotti contro SEQ ID NO: 1 del 32,3% (11,5-53%). Il siero degli animali non immunizzati, utilizzato come controllo, non dà origine ad alcuna inibizione del legame specifico IgE-Mal d 1.

In un ulteriore aspetto, la presente invenzione si riferisce a un peptide immunologicamente attivo corrispondente a un frammento della sequenza Mal d 1 contenente almeno una delle sostituzioni sopra descritte. Preferibilmente tale peptide contiene da 15 a 35, più preferibilmente da 15 a 20 residui amminoacidici. Come qui usata, l’espressione “immunologicamente attivo†significa che il peptide deve essere in grado di stimolare una risposta immunitaria non IgE-mediata.

Un altro aspetto dell’invenzione si riferisce a una proteina ibrida contenente una variante di sequenza dell’allergene maggiore di Malus domestica come qui descritta e una variante ipoallergenica dell’allergene maggiore Bet v 1 di polline di Betula verrucosa, eventualmente separate da un linker.

Nella proteina ibrida secondo l’invenzione, dette varianti ipoallergeniche di Mal d 1 e di Bet v 1 sono indifferentemente collocate all’ammino- o al carbossi-terminale con orientamento testa-coda, intendendo con ciò che quando l’ammino terminale della proteina ibrida coincide con l’ammino terminale di Bet v 1 o di Mal d 1, il carbossi terminale della proteina ibrida coincide con il carbossi terminale della proteina Mal d 1 o Bet v 1, rispettivamente. Secondo una realizzazione preferita, l’ammino-terminale della proteina ibrida à ̈ occupato da Bet v 1 e il carbossi-terminale da Mal d 1 (Fig. 8).

Il linker che separa le sequenze mutate di Bet v 1 e Mal d 1 à ̈ preferibilmente costituito da una catena di 8 amminoacidi, più preferibilmente da una catena di due amminoacidi, ancora più preferibilmente dal dipeptide EF.

In una realizzazione preferita dell’invenzione, la proteina ibrida contiene la variante ipoallergenica di Bet v 1 descritta nella domanda internazionale WO2007/073907 e nella domanda europea EP2172215, a nome dello stesso richiedente e qui interamente incorporate per riferimento. In particolare, la variante ipoallergenica di Bet v 1 contenuta nella proteina ibrida secondo l’invenzione à ̈ ottenuta a partire da una proteina di sequenza SEQ ID NO:5 o una sua isoforma identica per almeno il 94%, preferibilmente almeno il 97% a detta sequenza SEQ ID N:5, attraverso la sostituzione dei residui Lys in posizione 54, 115 e/o 123 (riferiti a SEQ ID N:5), o nelle corrispondenti posizioni di detta isoforma, con amminoacidi neutri o polari scelti tra Ala, Thr, Gly, Pro, Leu, Ile, Phe e Ser. In una realizzazione preferita, tale variante ipoallergenica di Bet v 1 à ̈ rappresentata da SEQ ID NO:6. Le varianti ipoallergeniche di Bet v 1 qui riferite sono descritte nelle due domande di brevetto citate sopra.

Tra le isoforme di Bet v 1 con identità di sequenza maggiore del 94% rispetto a SEQ ID NO:5 sono incluse le molecole naturali depositate ai numeri di accesso Bet v 1-a (Uniprot P15494), Bet v 1-j (Uniprot P43184), Bet v 1-f (Uniprot P43179).

È maggiormente preferita la proteina ibrida di sequenza SEQ ID NO:4, in cui la variante ipoallergenica di Bet v 1 (SEQ ID NO:6) à ̈ legata alla variante ipoallergenica di Mal d 1 (SEQ ID NO:2) con orientamento testa-coda (Bet v 1 → Mal d 1) mediante il linker dipeptidico EF.

La variante ibrida secondo la presente invenzione esprime una capacità IgE-binding ridotta di almeno il 10%, preferibilmente il 50%, più preferibilmente il 70%, rispetto all’ibrido wt.

La reattività della variante SEQ ID NO: 4 verso le IgE à ̈ stata analizzata in un pool di sieri di soggetti allergici al polline di betulla e alla mela mediante saggio ELISA (Fig. 9). Incubata con i sieri, tale variante presentava una riduzione media di reattività alle IgE rispetto all’ibrido wt (SEQ ID NO: 3) pari al 55,1%.

Questi risultati sono stati confermati mediante esperimenti di ELISA-inibizione. Si à ̈ visto che a uguali concentrazioni (1,25 µg/ml) di inibitore, il legame tra l’allergene Bet v 1 wt (SEQ ID NO: 5) adsorbito ai pozzetti e le IgE specifiche contenute nei sieri di 7 pazienti à ̈ inibito mediamente del 79,9% quando il siero à ̈ pretrattato con la miscela degli allergeni singoli wt, del 53,3% quando preincubato con la miscela delle due componenti mutagenizzate, del 63,3% quando à ̈ pretrattato con SEQ ID NO: 3, mentre à ̈ inibito del 32,1% quando il siero à ̈ preincubato con SEQ ID NO: 4 (Tab. 2 e Fig. 10A). La capacità dell’ibrido mutante SEQ ID NO: 4 di competere nel legame Bet v 1-IgE diminuisce in modo significativo (p<0.05) sia rispetto a SEQ ID NO: 3 sia rispetto alla miscela dei due allergeni mutagenizzati (Bet v 1 mut - SEQ ID NO:6 e Mal d 1 mut - SEQ ID NO:2).

Alla stessa quantità (1,25 µg/ml) di inibitore, il legame tra l’allergene Mal d 1 wt (SEQ ID NO:1) adsorbito ai pozzetti e le IgE specifiche contenute nei sieri dei 7 pazienti à ̈ inibito mediamente dell’82,8% quando il siero à ̈ pretrattato con la miscela degli allergeni singoli wt, del 51,6% quando preincubato con la miscela delle due componenti mutagenizzate, del 74,6% quando à ̈ pretrattato con SEQ ID NO: 3, mentre à ̈ inibito del 63,6% quando il siero à ̈ preincubato con SEQ ID NO: 4 (Tab. 3 e Fig. 10B). I risultati ottenuti nei confronti di Mal d 1 sono comparabili a quelli misurati verso Bet v 1, ad eccezione di SEQ ID NO:4 che risulta più reattiva nei confronti di Mal d 1.

Inoltre si à ̈ visto che la variante ipoallergenica SEQ ID NO:4, utilizzata per immunizzare topi Balb/c, induce la produzione di IgG specifiche in grado di riconoscere l’allergene Bet v 1 presente nell’estratto di Betula verrucosa (Fig. 11). La molecola ibrida SEQ ID NO:4 induce una risposta IgG specifica sovrapponibile a quella indotta nei topi dall’estratto di betulla, da SEQ ID NO: 3 o dalla miscela dei rispettivi allergeni wt o mutagenizzati. Per contro, gli anticorpi presenti nel siero degli animali immunizzati con un antigene non correlato non sono in grado di riconoscere SEQ ID NO: 3 e 4 e le miscele degli allergeni wt e mutanti.

La variante ipoallergenica ibrida SEQ ID NO: 4 à ̈ in grado di indurre una risposta IgG specifica anche verso componenti dell’estratto di polpa di Malus domestica (Fig. 12). A cinque settimane dalla prima immunizzazione, la risposta IgG indotta immunizzando con SEQ ID NO: 4 à ̈ superiore 30 volte a quella ottenuta immunizzando con quantità equimolari della miscela delle due singole varianti mutagenizzate (mix mut) e 3.2 volte rispetto all’allergene ibrido wt SEQ ID NO: 3. L’immunizzazione con estratto di betulla induce la produzione di IgG in grado di riconoscere il Mal d 1 contenuto nell’estratto di mela a partire dalla quinta settimana.

Inoltre, l’immunogenicità della variante ipoallergenica SEQ ID NO: 2 aumenta quando essa à ̈ parte della molecola ibrida ipoallergenica SEQ ID NO: 4. L’induzione di anticorpi IgG specifici per Mal d 1 wt (SEQ ID NO: 1) e mutato (SEQ ID NO: 2) à ̈ infatti molto più elevata e precoce in topi immunizzati con la variante ibrida SEQ ID NO: 4 che in topi immunizzati con l’allergene singolo SEQ ID NO:2. Un aumento sostanziale dell’induzione con SEQ ID NO: 4 si osserva infatti già alla quarta settimana di trattamento, mentre sono necessarie almeno sette settimane per ottenere la stessa risposta immunizzando gli animali con la proteina SEQ ID NO: 2 (Fig. 13-A,B).

Riguardo l’induzione di anticorpi protettivi in grado di bloccare il legame tra allergene e IgE, si à ̈ osservato che gli anticorpi IgG prodotti contro SEQ ID NO: 4 sono in grado di inibire il legame delle IgE di pazienti allergici a betulla e mela a Bet v 1 (SEQ ID NO: 5) più efficacemente rispetto a quelli indotti dalla miscela delle due varianti singole mutate (mix mut) (p<0.05) (Fig.14). Esperimenti di ELISA inibizione hanno mostrato che le IgG prodotte nei topi immunizzati con SEQ ID NO: 4 inibiscono la reattività IgE di sette sieri di pazienti mediamente dell’87,7% (con valori dal 77,4 al 94,7%) mentre quelli prodotti contro la miscela delle due varianti mutagenizzate (mix mut) dell’82% (63,5-92,3%); gli anticorpi IgG prodotti contro la miscela delle proteine wt (mix wt) inibiscono il legame mediamente del 54,7% (32,4-68,6%), mentre quelli ottenuti immunizzando con l’ibrido wt SEQ ID NO: 3 dell’82,2% (51,9-93,5%).

Gli anticorpi IgG indotti nei topi immunizzati con SEQ ID NO: 4 sono inoltre in grado di inibire il legame tra Mal d 1 (SEQ ID NO: 1) e le IgE di sieri di pazienti allergici a betulla e mela mediamente del 47,5%, se immunizzati con la miscela delle proteine wt del 9,9%, con la miscela delle varianti mutate del 53,5%, con l’immunogeno SEQ ID NO: 3 del 59,4% (Fig.15).

Il siero degli animali non immunizzati, utilizzato come controllo, non causa alcuna inibizione del legame specifico delle IgE con Bet v 1 e Mal d 1.

Le varianti di sostituzione secondo l’invenzione possono essere facilmente preparate per mutagenesi della sequenza del cDNA di Mal d 1 (SEQ ID NO: 7), Bet v 1 (SEQ ID NO: 8), di loro isoforme o varianti naturali, o della sequenza del cDNA dell’ibrido wt (SEQ ID NO: 9) con tecniche note all’esperto del settore (38).

In SEQ ID NO: 10 e 19 sono riportate le sequenze dei cDNA codificanti per la variante (monomerica) a doppia sostituzione o la variante ibrida identificate rispettivamente da SEQ ID NO: 2 e 4.

Ulteriori aspetti dell’invenzione riguardano quindi una molecola di acido nucleico che codifica per una variante dell’allergene Mal d 1 qui descritta, per un peptide da essa derivato o per la proteina ibrida Mal d 1-Bet v 1, e un vettore di espressione contenente tale molecola insieme a elementi per il controllo dell’espressione in cellule eucariote o procariote, quali promotori o intensificatori (“enhancers†) della trascrizione, sequenze segnale o altre sequenze per la regolazione della trascrizione. Il vettore può essere un plasmide, virus, fago o qualsiasi altro vettore comunemente utilizzato nell’ingegneria genetica.

L’invenzione comprende inoltre una cellula ospite procariota o eucariota trasformata o trasfettata con il vettore dell’invenzione. Generalmente per il clonaggio del vettore e l’espressione del cDNA si utilizzano cellule procariote quali Escherichia coli e Bacillus subtilis, o eucariote quali Saccharomyces cerevisiae.

Inoltre, le varianti ipoallergeniche secondo l’invenzione possono essere prodotte come proteine di fusione.

Data la ridotta reattività alle IgE, le varianti di Mal d 1 secondo la presente invenzione potranno essere convenientemente utilizzate per la preparazione di composizioni farmaceutiche (per es. compresse) da impiegare nell’immunoterapia di soggetti allergici alla mela e/o al polline di Betula verrucosa.

Un ulteriore aspetto dell’invenzione riguarda pertanto una composizione farmaceutica comprendente una quantità efficace di variante ipoallergenica di Mal d 1, eventualmente in combinazione con altri allergeni di Betula verrucosa, insieme a veicoli, eccipienti o adiuvanti farmaceuticamente accettabili. In una realizzazione preferita, tale composizione farmaceutica à ̈ in forma di vaccino idoneo per il trattamento preventivo o terapeutico di malattie allergiche, quali asma bronchiale e rinite allergiche, congiuntivite allergica, sindrome allergica orale. Maggiormente preferite sono le forme di somministrazione sublinguale, sottocutanea e transdermica.

I principi e i metodi per la vaccinazione sono noti all’esperto del settore e sono descritti, per esempio, in (39) e (40).

Gli esempi che seguono illustrano l’invenzione in maggior dettaglio. ESEMPI

I metodi utilizzati nei seguenti esempi, se non altrimenti specificato, sono quelli descritti da Sambrook, Fritsch ET Maniatis “Molecular cloning. A laboratory manual†II ed. vol. 1-2-3 CSH Lab Press 1989.

ESEMPIO 1 - Mutagenesi sito-specifica del cDNA codificante per l’allergene Mal d 1

La mutagenesi sito-specifica del cDNA codificante per l’allergene Mal d 1 wt (SEQ ID NO:7 preceduto al 5’ da una sequenza codificante sei istidine) à ̈ condotta per amplificazione con PCR (Polymerase Chain Reaction) dello stesso cDNA clonato in un vettore procariota (pBluescript, GenBank acc. n. X52327). Gli oligonucleotidi (Tab. 1) impiegati come primer per l’innesco della reazione della PCR presentano le opportune sostituzioni di basi. Per ogni mutagenesi à ̈ utilizzato un oligonucleotide complementare, che si lega a una regione corrispondente del filamento della molecola di DNA (38). Dopo amplificazione, il templato originale non modificato à ̈ selettivamente degradato con digestione enzimatica catalizzata dall’enzima di restrizione Dpn I. Cellule di Escherichia coli sono quindi trasformate con le molecole mutagenizzate. I cloni ottenuti da singole colonie batteriche sono sequenziati con il metodo di Sanger per verificare la corretta modificazione delle basi e l’assenza di mutazioni aspecifiche del cDNA.

Tab. 1. Sequenze degli oligonucleotidi utilizzati come primer nelle reazioni di mutagenesi sito-specifica.

In grassetto sono evidenziate le basi che generano la mutazione.

Nome oligonucleotide Sequenza oligonucleotide

Mald1D25 Gcc ttt gtc ctt gct gct gac aac ctc (SEQ ID NO:12) Mald1N78 Gtt gac gag gca gcc tac tca tac gcc (SEQ ID NO:13)

ESEMPIO 2 - Costruzione del plasmide codificante la molecola ibrida wild-type Bet v 1-Mal d 1 (wtHybrid)

La molecola ibrida contenente le informazioni genetiche per l’ibrido wild-type Bet v 1-Mal d 1 à ̈ stata ottenuta mediante fusione dei cDNA codificanti per i singoli allergeni.

I cDNA contenenti l’informazione genetica per le proteine mature Bet v 1 e Mal d 1 sono stati ottenuti separatamente mediante PCR utilizzando le coppie di oligonucleotidi Bet v 1 DIM FW (ggt gtt ttc aat tac gaa act g - SEQ ID NO:14) e Bet v 1 DIM Eco RV (Gc gaa ttc gtt gta ggc atc gga g- SEQ ID NO:15) per Bet v 1 e Mal d 1 DIM Eco FW (cgc gaa ttc ggt gtc tac aca ttt gag aac g - SEQ ID NO:16) e Mal d 1 DIM Bam RV (Gcg gga tcc tta gtt gta tgc gtc ggg gtg - SEQ ID NO:17) per Mal d 1 e come stampo i cDNA Bet v 1 SEQ ID NO: 8 e Mal d 1 SEQ ID NO: 7. L’amplificato ottenuto per Bet v 1 à ̈ stato riamplificato sostituendo il primer Bet v 1 DIM FW con Bet v 1 DIM Kpn FW (gcg ggt acc cat atg cat cac cat cac cat cac ggt gtt ttc aat tac gaa act g - SEQ ID NO:18) in modo da inserire la sequenza codificante per sei istidine a monte della sequenza di Bet v 1. Nell’amplificato di Bet v 1 sono stati inseriti al 5’ i siti Kpn I e Nde I (contenente l’ATG) e al 3’ un sito Eco R I al posto del codone di stop, mentre al 5’ di Mal d 1 à ̈ stato inserito un sito Eco R I al posto dell’ATG e al 3’ un sito Bam H I dopo il codone di stop. Gli amplificati sono stati purificati e digeriti con gli specifici enzimi di restrizione (siti di restrizione sottolineati nei primers). Bet v 1 à ̈ stato digerito con Kpn I e Eco R I e inserito nel vettore procariota pBluescript (GenBank acc. n. X52327); il costrutto così ottenuto à ̈ stato digerito con Eco R I e Bam H I e ligato con l’amplificato Mal d 1 purificato e digerito con gli stessi enzimi di restrizione. Le due sequenze nucleotidiche contigue sono state excise da pBluescript con gli enzimi Nde I e Bam H I e inserite nei siti Nde I/Bam H I del vettore pEt 3c (Stratagene, La Jolla, CA), a costituire un costrutto in grado di esprimere una proteina di fusione Bet v 1-Mal d 1, preceduta da una sequenza di sei istidine. L’introduzione del sito di restrizione Eco R I necessario per il clonaggio dei frammenti ha portato all’inserimento di due aminoacidi (acido glutammico e fenilalanina) nel punto di giunzione delle due proteine, senza compromissione della fase di lettura (Fig. 8).

I cloni ottenuti da singole colonie batteriche sono stati sequenziati con il metodo di Sanger per verificare la corretta modificazione delle basi e l’assenza di mutazioni aspecifiche del cDNA.

ESEMPIO 3 - Costruzione del plasmide codificante la molecola ibrida mutante Bet v 1-Mal d 1 (MutHybrid)

La molecola ibrida codificante per l’ibrido mutante Bet v 1-Mal d 1 à ̈ stata ottenuta seguendo il metodo descritto in ESEMPIO 2 per la variante ibrida wild-type.

Le coppie di oligonucleotidi usate nella reazione di PCR sono identiche, mentre i cDNA utilizzati come stampo hanno le sequenze riportate in SEQ ID NO:20, per la variante mutagenizzata di Bet v 1, e SEQ ID NO:10, per la variante mutagenizzata di Mal d 1.

I cloni ottenuti da singole colonie batteriche sono stati sequenziati con il metodo di Sanger per verificare la corretta modificazione delle basi e l’assenza di mutazioni aspecifiche del cDNA.

ESEMPIO 4 - Produzione della proteina Mal d 1 e delle sue varianti

I cDNA wild-type di Bet v 1 (SEQ ID NO:8) e Mal d 1 (SEQ ID NO:7), quelli mutagenizzati (SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO:10) e quelli ingegnerizzati wt e Mut Hybrid (SEQ ID NO: 9 e 19), preceduti dalla sequenza codificante per sei istidine, dopo clonaggio in un vettore di espressione, sono espressi in cellule di Escherichia coli secondo protocolli standard (41,42). Le cellule sono raccolte per centrifugazione, risospese in NaH2PO4100 mM, pH 8 e lisate mediante sonicazione. Le proteine ricombinanti sono isolate dopo centrifugazione. Il pellet contenente le proteine sotto forma di aggregati insolubili à ̈ risospeso in tampone denaturante urea 8 M, NaH2PO4100 mM, Tris 10 mM pH 8, e sottoposto ad agitazione per 60 min a 20°C. Le proteine ricombinanti solubilizzate, separate dai detriti insolubili mediante centrifugazione, sono purificate mediante cromatografia di affinità in condizioni denaturanti utilizzando colonne di agarosio a cui à ̈ legato acido nitrilotriacetico chelante ioni nichel Ni-NTA (Qiagen, Milan, Italy) che interagiscono con la porzione di sei istidine fusa all’allergene. Mal d 1 e le varianti mutagenizzate sono rinaturate mediante dialisi in (NH4)HCO35 mM, a 4°C per 18 ore.

ESEMPIO 5 - Caratteristiche dei sieri provenienti da soggetti allergici

I sieri, raccolti da soggetti con una storia clinica di allergia stagionale verso il polline di Betula verrucosa ed una reattività 3+ specifica per gli allergeni Bet v 1 e Mal d 1, sono stati utilizzati singolarmente o riuniti in un pool ed utilizzati in tale forma. Come controllo negativo à ̈ stato utilizzato un pool di sieri provenienti da soggetti non allergici.

ESEMPIO 6 - Analisi con saggio ELISA della reattività delle varianti di Mal d 1 verso le IgE di un pool di sieri

Diluizioni in base 3, a partire da 0,1 µg, di allergene wt (SEQ ID NO: 1) e delle sue varianti mutagenizzate (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11), in tampone carbonato/bicarbonato 50 mM pH 9.6, sono adsorbite sui pozzetti di piastre di polistirene per saggi ELISA mediante incubazione a 4°C per 16 ore. I pozzetti sono quindi lavati con soluzione di lavaggio (tampone fosfato 60 mM pH 6,5 contenente Tween-20 allo 0,05%) e i siti liberi sono saturati con soluzione diluente (15% siero di capra, EDTA 1 mM, Tween 20 0,05%, in tampone fosfato 150 mM pH 7,4). Uguali aliquote (60 µl) di un pool di sieri umani positivi verso Bet v 1 e Mal d 1 o di sieri di soggetti non allergici sono aggiunte a ciascun campione e fatte incubare a 25°C per 2 ore. Dopo tre lavaggi à ̈ aggiunto il siero anti-IgE umane coniugato a perossidasi diluito 1:4000 in tampone diluente, che à ̈ incubato a 25°C per 1,5 ore. Dopo tre lavaggi, lo sviluppo della reazione colorimetrica si ottiene aggiungendo 100 µl di reagente TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e incubando 15 minuti a 25°C. La reazione à ̈ bloccata con l’aggiunta di 100 µl di HCl 1 N e valutata con lettura a 450 nm allo spettrofotometro. I dati sono stati confermati da tre esperimenti indipendenti.

La stessa procedura à ̈ stata applicata apportando le seguenti due modifiche per valutare la reattività IgE degli allergeni ingegnerizzati (ibridi) wt e mutante. Gli allergeni ibridi SEQ ID NO:3 e 4 sono adsorbiti sui pozzetti di piastre di polistirene partendo da 150 nM e applicando poi una diluizione in base 2 in tampone carbonato/bicarbonato 50 mM pH 9.6. Il pool di sieri umani (70 µl), positivi verso Bet v 1 e Mal d 1 o di sieri di soggetti non allergici à ̈ aggiunto a ciascun campione alla diluizione 1:2.5 in tampone diluente e fatto incubare a 25°C per 3 ore.

ESEMPIO 7 - Analisi con saggio ELISA inibizione. Capacità delle varianti (monomeriche) di Mal d 1 di inibire il legame tra Mal d 1 e IgE contenute in un pool di sieri

Uguali quantità (0,1 µg) di allergene Mal d 1 wt, in tampone carbonato/bicarbonato 50 mM pH 9.6, sono adsorbite sui pozzetti di piastre di polistirene per saggi ELISA mediante incubazione a 4°C per 16 ore. I pozzetti sono quindi lavati con soluzione di lavaggio (tampone fosfato 60 mM pH 6,5 contenente Tween-20 allo 0,05%) e i siti liberi sono saturati con soluzione diluente (15% siero di capra, EDTA 1 mM, Tween 20 0,05%, in tampone fosfato 150 mM pH 7,4). Aliquote (100 µl) di una diluizione 1:3 di un pool di sieri umani positivi a Bet v 1 e Mal d 1 sono preincubate con diluizioni seriali di allergene wt e delle sue varianti mutagenizzate (a partire da 5 µg/ml, diluizioni seriali in base 4) a 25°C per 2 ore. Le miscele sono quindi aggiunte a ogni pozzetto e incubate a 25°C per 2 ore. Dopo tre lavaggi con tampone fosfato 0.06 M pH 6.5, Tween-20 0,05%, à ̈ aggiunto il siero anti-IgE umane coniugato a perossidasi diluito 1:4000 in tampone diluente, che à ̈ incubato a 25°C per 1,5 ore. Dopo tre lavaggi, lo sviluppo della reazione colorimetrica si ottiene aggiungendo 100 µl di reagente TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e incubando 15 minuti a 25°C. La reazione à ̈ bloccata con l’aggiunta di 100 µl di HCl 1 N e valutata con lettura a 450 nm allo spettrofotometro.

La percentuale di inibizione à ̈ calcolata usando la seguente formula: 100x [(A-B)/A], dove A à ̈ l’assorbanza a 450 nm in assenza dell’inibitore e B l’assorbanza in presenza di inibitore. I dati sono stati confermati da tre esperimenti indipendenti.

ESEMPIO 8 - Analisi con saggio ELISA inibizione. Capacità di Mal d 1 e delle sue varianti (monomeriche) di inibire il legame tra Bet v 1 e IgE contenute in un pool di sieri

Uguali quantità (0,1 µg) di allergene Bet v 1, in tampone carbonato/bicarbonato 50 mM pH 9.6, sono adsorbite sui pozzetti di piastre di polistirene per saggi ELISA mediante incubazione a 4°C per 16 ore. I pozzetti sono quindi lavati con soluzione di lavaggio (tampone fosfato 60 mM pH 6,5 contenente Tween-20 allo 0,05%) e i siti liberi sono saturati con soluzione diluente (15% siero di capra, EDTA 1 mM, Tween 20 0,05%, in tampone fosfato 150 mM pH 7,4). Aliquote (100 µl) di una diluizione 1:3 di un pool di sieri umani con reattività 3+ verso Bet v 1 e Mal d 1 sono preincubate con diluizioni seriali di Bet v 1 wt, Mal d 1 wt e delle sue varianti mutagenizzate (a partire da 10 µg/ml, diluizioni seriali in base 4) a 25°C per 2 ore. Le miscele sono quindi aggiunte a ogni pozzetto e incubate a 25°C per 2 ore. Dopo tre lavaggi con tampone fosfato 0.06 M pH 6.5, Tween-20 0,05%, à ̈ aggiunto il siero anti-IgE umane coniugato a perossidasi diluito 1:4000 in tampone diluente, che à ̈ incubato a 25°C per 1,5 ore. Dopo tre lavaggi, lo sviluppo della reazione colorimetrica si ottiene aggiungendo 100 µl di reagente TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e incubando 15 minuti a 25°C. La reazione à ̈ bloccata con l’aggiunta di 100 µl di HCl 1 N e valutata con lettura a 450 nm allo spettrofotometro.

La percentuale di inibizione à ̈ calcolata usando la seguente formula: 100x [(A-B)/A], dove A à ̈ l’assorbanza a 450 nm in assenza dell’inibitore e B l’assorbanza in presenza di inibitore.

ESEMPIO 9 - Analisi con saggio ELISA inibizione. Capacità della proteina ibrida wt (SEQ ID NO: 3) e della sua variante mutagenizzata (SEQ ID NO. 4) di inibire il legame tra Bet v 1 o Mal d 1 e le IgE contenute nei sieri

Uguali quantità (0,1 µg) di allergene Bet v 1 o Mal d 1, in tampone carbonato/bicarbonato 50 mM pH 9.6, sono adsorbite sui pozzetti di piastre di polistirene per saggi ELISA mediante incubazione a 4°C per 16 ore. I pozzetti sono quindi lavati con soluzione di lavaggio (tampone fosfato 60 mM pH 6,5 contenente Tween-20 allo 0,05%) e i siti liberi sono saturati con soluzione diluente (15% siero di capra, EDTA 1 mM, Tween 20 0,05%, in tampone fosfato 150 mM pH 7,4). Aliquote (70 µl) di una diluizione 1:3 di sieri umani RAST 3+ verso Bet v 1 e Mal d 1 sono preincubate con uguali quantità (1,25 µg/ml) di allergene wt, mutagenizzato o ingegnerizzato (ibrido) a 25°C per 2 ore. Le miscele sono quindi aggiunte a ogni pozzetto e incubate a 4°C per 16 ore. Dopo tre lavaggi con tampone fosfato 0.06 M pH 6.5, Tween-20 0,05%, à ̈ aggiunto il siero anti-IgE umane coniugato a perossidasi diluito 1:4000 in tampone diluente, che à ̈ incubato a 25°C per 1,5 ore. Dopo tre lavaggi, lo sviluppo della reazione colorimetrica si ottiene aggiungendo 100 µl di reagente TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e incubando 20 minuti a 25°C. La reazione à ̈ bloccata con l’aggiunta di 100 µl di HCl 1 N e valutata con lettura a 450 nm allo spettrofotometro. La percentuale di inibizione à ̈ calcolata usando la seguente formula: 100x [(A-B)/A], dove A à ̈ l’assorbanza a 450 nm in assenza dell’inibitore e B l’assorbanza in presenza di inibitore.

Tab. 2. Capacità inibitoria delle molecole ibride wild-type e

mutagenizzata del legame Bet v 1 - IgE

siero wt Mix Mut Mix SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 1 97.1 88.4 93.6 90.2

2 96.6 72.8 85.1 36.4

3 90.9 52.3 76.2 35.9

4 81.2 56.5 61.7 35.9

5 91.6 41.0 50.8 7.8

6 65.2 41.8 56.6 0

7 36.8 20.6 15.9 18.2

%inibizione

media 79.9 53.3 63.3 32.1

deviazione

standard 22.02 22.2 25.77 29.53

Tab. 3. Capacità inibitoria delle molecole ibride wild-type e

mutagenizzata del legame Mal d 1 - IgE

siero wt Mix Mut Mix SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 1 95.5 76.7 92.0 91.0

2 93.9 42.4 84.5 41.9

3 80.5 49.0 75.1 66.3

4 77.3 46.0 71.3 64.3

5 88.3 27.6 68.0 50.8

6 73.7 53.9 70.5 70.8

7 70.3 65.6 60.6 60.4

%inibizione

media 82.8 51.6 74.6 63.6

deviazione

standard 9.9 16.0 10.6 15.6

ESEMPIO 10 - Protocollo di immunizzazione dei topi Balb/c

Dieci gruppi di topi costituiti ciascuno da cinque esemplari femmina di ceppo Balb/c (Charles River) sono immunizzati, per via sottocutanea, con 150 pmol di allergene wt, mutagenizzato o ingegnerizzato (ibrido) o 10 µg di estratto di Betula verrucosa o Malus domestica miscelati a 2 mg di Al(OH3) in 200 µl di soluzione fisiologica. Altri due richiami sono effettuati ad intervalli di tre settimane. Come controllo, cinque topi ricevono il medesimo trattamento con un antigene non correlato. Due, quattro, cinque e sette settimane dopo la prima immunizzazione viene effettuato un prelievo di sangue dalla vena giugulare dei topi per controllare la risposta anticorpale nei confronti del rispettivo immunogeno mediante ELISA. Per i gruppi di topi immunizzati con SEQ ID NO: 2 e 4 à ̈ analizzata anche la capacità di riconoscere la proteina wild-type e gli estratti di mela e betulla. I sieri dei topi sono testati singolarmente o sono riuniti in base al tipo di immunogeno e al tempo trascorso dalla prima immunizzazione e usati in forma di pool.

ESEMPIO 11 - Analisi con saggio ELISA della risposta IgG specifica in topi immunizzati

Uguali quantità di estratto di betulla o di mela (20 µg/ml) o di Bet v 1 e Mal d 1 wt o di variante SEQ ID NO: 2 (2 µg/ml), in tampone carbonato/bicarbonato 50 mM pH 9.6, sono adsorbite sui pozzetti di piastre di polistirene per saggi ELISA mediante incubazione a 4°C per 16 ore. I pozzetti sono quindi lavati con soluzione di lavaggio (tampone fosfato 60 mM pH 6,5 contenente Tween-20 allo 0,05%) e i siti liberi sono saturati con soluzione diluente (15% siero di capra, EDTA 1 mM, Tween 20 0,05%, in tampone fosfato 150 mM pH 7,4). Uguali aliquote (100 µl) di diluizioni 1:1000 in tampone diluente del siero di ciascun topo o del pool di sieri sono aggiunte a ogni pozzetto e fatte incubare a 25°C per 2 ore. Dopo tre lavaggi à ̈ aggiunto il siero anti-IgG murine coniugato a perossidasi diluito 1:2000 in tampone diluente, che à ̈ incubato a 25°C per 1,5 ore. Dopo tre lavaggi, lo sviluppo della reazione colorimetrica si ottiene aggiungendo 100 µl di reagente TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e incubando 15 minuti a 25°C. La reazione à ̈ bloccata con l’aggiunta di 100 µl di HCl 1 N e valutata con lettura a 450 nm allo spettrofotometro.

È mostrata la reattività media ottenuta analizzando il siero di cinque topi per ciascun gruppo sperimentale.

ESEMPIO 12 - Analisi con saggio ELISA inibizione. Capacità degli anticorpi IgG prodotti contro la variante mutagenizzata Mal d 1 (SEQ ID NO: 2) e la proteina ibrida Bet v 1 – Mal d 1 (SEQ ID NO: 4) di inibire il legame tra Bet v 1 wt o Mal d 1 wt e le IgE contenute nei sieri di pazienti allergici alla betulla e alla mela

Uguali quantità di allergene Bet v 1 (0,1 µg) o Mal d 1 (0,2 µg), in tampone carbonato/bicarbonato 50 mM pH 9.6, sono adsorbite sui pozzetti di piastre di polistirene per saggi ELISA mediante incubazione a 4°C per 16 ore. I pozzetti sono quindi lavati con soluzione di lavaggio (tampone fosfato 60 mM pH 6,5 contenente Tween-20 allo 0,05%) e i siti liberi sono saturati con soluzione diluente (15% siero di capra, EDTA 1 mM, Tween 20 0,05%, in tampone fosfato 150 mM pH 7,4). Aliquote (100 µl) di pool, diluite 1:10, di sieri di topo prelevati a sette settimane dalla prima immunizzazione sono incubate nei pozzetti a 4°C per 16 ore. Dopo tre lavaggi con tampone fosfato 0.06 M pH 6.5, Tween-20 0,05%, sono aggiunti sette sieri umani positivi verso Bet v 1 e Mal d 1, diluiti 1:3, a 25°C per 3 ore. Dopo tre lavaggi con tampone fosfato 0.06 M pH 6.5, Tween-20 0,05%, à ̈ aggiunto il siero anti-IgE umane coniugato a perossidasi diluito 1:4000 in tampone diluente, che à ̈ incubato a 25°C per 1,5 ore. Dopo tre lavaggi, lo sviluppo della reazione colorimetrica si ottiene aggiungendo 100 µl di reagente TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e incubando 20 minuti a 25°C. La reazione à ̈ bloccata con l’aggiunta di 100 µl di HCl 1 N e valutata con lettura a 450 nm allo spettrofotometro. La percentuale di inibizione à ̈ calcolata usando la seguente formula: 100x [(A-B)/A], dove A à ̈ l’assorbanza a 450 nm ottenuta preincubando l’allergene con il siero di topi non immunizzati e B l’assorbanza ottenuta inibendo i sieri umani con i sieri di topo immunizzato.

ESEMPIO 13 - Analisi statistica

Nelle figure i risultati sono espressi come valori medi con la rispettiva deviazione standard.

Per le analisi statistiche à ̈ stato utilizzato il software UNISTAT 5.5 Light for Excel. I dati sono stati analizzati utilizzando il t-Test per dati appaiati.

BIBLIOGRAFIA

1) Vrtala S, (2008) “From allergen genes to new forms of allergy diagnosis and treatment†. Allergy; 63(3):299-309.

2) Breiteneder H., Pettenburger K., Bito A et al. (1989). “The gene coding for the major birch pollen allergen Bet v 1 is highly homologous to a pea disease resistance response gene†. EMBO J, 8: 1935-1938.

3) Batard T., Didierlaurent A., Chabre H., et al., (2005). “Characterization of wild-type recombinant Bet v 1a as a candidate vaccine against birch pollen allergy†. Int Arch Allergy Immunol. 136: 239-249.

4) Vieths S., Scheurer S., Ballmer-Weber B. (2002). “Current understanding of cross-reactivity of food allergen and pollen†. Ann N Y Acad Sci, 964:47-68.

5) Valenta R, Kraft D. (1996). “ Type 1 allergic reactions to plant-derived food, a consequence of primary sensitization to pollen allergens†. J Allergy Clin Immunol 97: 893-895.

6) Malling H. J., (1998) “Immunotherapy as an effective tool in allergy treatment†. Allergy, 53: 461

7) Oppenheimer JJ, Nelson HS, Boch SA, Christensen F, Leung DY. “Treatment of peanut allergy with rush immunotherapy†. (1992), J Allergy Clin Immunol 90:256-62.

8) Nelson HS, Lahr J, Rule R, Bock A, Leung D. “Treatment of anaphylactic sensitivity to peanuts by immunotherapy with injections of aqueous peanut extract†. (1997). J Allergy Clin Immunol 99:744-51.

9) Bucher X, Pichler WJ, Dahinden CA, Helbling A. (2004). “Effect of tree pollen specific, subcutaneous immunotherapy on the oral allergy syndrome to apple and hazelnut†. Allergy 59(12):1269-71.

10) Ballmer-Weber BK, Wuthrich B, Wangorsch A, Fotisch K, Altmann F, Vieths S. (2001) “Carrot allergy: double-blinded, placebo-controlled food challenge and identification of allergens†. J Allergy Clin Immunol 108:301-307.

11) Asero R. (1998). “Effects of birch pollen-specific immunotherapy on apple allergy in birch pollen-hypersensitive patients†. Clin Exp Allergy.; 28(11):1368-73.

12) Bolhaar ST, Tiemessen MM, Zuidmeer L, van Leeuwen A, Hoffmann-Sommergruber K, Bruijnzeel-Koomen CA, Taams LS, Knol EF, van Hoffen E, van Ree R, Knulst AC. (2004). “Efficacy of birch-pollen immunotherapy on cross-reactive food allergy confirmed by skin tests and double-blind food challenges†. Clin Exp Allergy. 34(5):761-9.

13) Hansen KS, Khinchi MS, Skov PS, Bindslev-Jensen C, Poulsen LK, Malling HJ (2004) "Food allergy to apple and specific immunotherapy with birch pollen†. Mol Nutr Food Res. 48(6):441-8.

14) Klinglmayr E, Hauser M., Zimmermann F, Dissertori O., Lackner P, Wopfner N., Ferreira FS., Wallner M. (2009). “Identification of B-cell epitopes of Bet v 1 involved in cross-reactivity with food allergens†. Allergy; 64:647-651.

15) Ebner C, Hirschwehr R, Bauer L, Breiteneder H, Valenta R, Ebner H. (1995). “Identification of allergens in fruits and vegetables: IgE cross-reactivities with the important birch pollen allergens Bet v 1 and Bet v 2 (birch profilin)†. J Allergy Clin Immunol 95:962-969.

16) Bolhaar STHP, Zuidmeer L, Ma Y, Ferreira F, Bruijnzeel-Koomen CAFM, Hoffmann-Sommergruber K, van Ree R, Knulst AC. (2005). “A mutant of the major apple allergen, Mal d 1, demonstrating hypo-allergenicity in the target organ by double-blind placebo-controlled food challenge“. Clin Exp Allergy 35:1638-1644.

17) Vanek-Krebitz M., Hoffmann-Sommergruber K., Laimer da Camara Machado M., Susani M., Ebner C., Kraft D., Scheiner O., Breiteneder H. (1995). “Cloning and sequencing of Mal d 1, the major allergen from apple (Malus domestica), and its immunological relationship to Bet v 1, the major birch pollen allergen†. BBRC 214 (2):538-551.

18) Swoboda I., Scheiner O., Heberle-Bors E., Vicente O., (1992). “cDNA cloning and characterisation of three genes in the Bet v 1 gene family that encode pathogenesis-related proteins†. Plant Cell Environ. 18: 865-874.

19) Markovic-Housley Z., Degano M., Lamba D., von Roepenack-Lahaye E., Clemens S., Susani M., Ferreira F., Scheiner O., Breiteneder H. (2003). “Crystal structure of a hypoallergenic isoform of the major birch pollen allergen Bet v 1 and its likely biological function as a plant steroid carrier†. J Mol Biol, 325: 123-133.

20) Marzban G, Puehringer H, Dey R, Brynda S, Ma Y, Martinelli A, Zaccarini M, van der Weg E, Housley Z, Kolarich D, Altmann F, Laimer M. (2005). “Localisation and distribution of the major allergens in apple fruits†. Plant Science 169:387-394.

21) Vieths S, Jankiewicz B, Aulepp H. (1994). “Apple allergy: the IgE-binding potency of apple strains is related to the occurrence of the 18-kDa allergen.†. Allergy 49:262-271.

22) Vieths S, Schoning B, Jankiewicz B,. (1993). “Occurrence of IgE binding allergens during ripening of apple fruits†. Food and agricul Immunol 5:93-105.

23) Gao Z, va de Weg EW, Matos CI, Arens P, Bolhaar ST, Knulst AC, Li Y, Hoffmann-Sommergruber K, Gilissen LJ. “Assessment of allelic diversity in intron-containing Mal d 1 genes and their association to apple allergenicity†. (2008). Plant Biol. 8:116.

24) Cromwell O, Hafner D, Nandy A. (2011). “Recombinant allergens for specific immunotherapy†J Allergy Clin Immunol. 127(4):865-872

25) Ma Y, Gadermayer G, Bohle B, Bolhaar S, Knulst A, Markovic-Housley Z, Breiteneder H, Briza P, Hoffmann-Sommergruber K, Ferreira F. (2006). “Mutational analysis of amino acid positions crucial for IgE-binding epitope of the major apple (Malus domestica) allergen, Mal d 1†. Int Arch Allergy Immunol 139:53-62.

26) Scheurer S, Son DY, Boehm M, Karamloo F, Franke S,. Hoffmann A, Haustein D and Vieths S. (1999) “Cross-reactivity and epitope analysis of Pru av 1, the major cherry allergen†. Mol Immunol 36:155-167.

27) Neudecker P, Lehmann K, Nerkamp J, Haase T, Wangorsch A, Fotish K, Hoffmann S, Rosch P, Vieths S, Scheurer S. (2003) “Mutational epitope analysis of Pru av 1 and Api g 1, the major allergens of cherry (Prunus avium) and celery (Apium graveolens): correlating IgE reactivity with three-dimensional structure†. Biochem J. 376:97-107.

28) Wiche R, Gubesh M, konig H, Fotisch K, Hoffmann A, Wangorsch A, Scheurer S, Vieths.S. (2005) “Molecular basis of pollen-related food allergy: identification of a second cross-reactive IgE epitope on Prua v 1, the major (Prunus avium) allergen†. Biochem J. 385:319-327.

29) Gajhede M, Osmark P, Poulsen FM, Ipsen H, Larsen JN, Joost van Neerven RJ, Schou C, Lowenstein H, and Spangfort MD. (1996). “X-ray and NMR structure of Bet v 1, the origin of birch pollen allergy†. Nat Struct. Biol.

3:1040-1045.

30) Spangfort M, Gaijhede M, Osmark P, Poulsen F, Ipsen H, Larsen J, Joost va Neerven RJ, Schou C, Lowenstein H. (1997). “Three-dimensional structure and epitopes of Bet v 1†. Int Arch Allergy Immunol 113:243-245.

31) Holm J, Gajhede M, Ferreras M, Henriksen A, Ipsen H, Larsen JN, Lund L, Jacobi H, Millner A, Wurtzen PA, Spangfort MD. (2004). “Allergy vaccine engineering: epitope modulation of recombinant Bet v 1 reduces IgE binding but retains protein folding pattern for induction of protective blocking-antibody responses†. The journal of Immunology. 173:5258-5267.

32) Neudecker P, Schweimer K, Nerkamp J, Scheurer S, Vieths S, Sticht H, Rosch P. (2001) “Allergic cross-reactivity made visible: solution structure of the major cherry allergen Prua v 1†. J. Biol Chem 276:22756-22763.

33) Klingmayr E, Hauser M, Zimmermann F, Dissertori O, Lackner P, Wopfner N, Ferreira F, Wallner M. (2009). “Identification of B-cell epitope of Bet v 1 involved in cross-reactivity with food allergens†Allergy; 64:647-651 34) Vrtala S, Ball T, Spitzauer s, Pandjaitan B, Suphioglu C, Knox B, Sperr WR, Valent P, Kraft D, Valenta R. (1998). “Immunization with purified natural and recombinant allergens induces mouse IgG1 antibodies that recognize similar epitopes as human IgE and inhibit the human IgE-allergen interaction and allergen-induced basophil degranulation†. J Immunol 160: 6137.

35) Visco V, Dolecek C, Denépoux S, Le Mao J, Guret C, Rousset F, Guinnepain MT, Kraft D, Valenta R, Weyer A, Banchereau J, Lebecque S. (1996). “Human IgG monoclonal antibodies that modulate the binding of specific IgE to birch pollen Bet v 1†. J. Immunol. 157: 956-962.

36) Purohit A, Niederberger V, Kronqvist M, Horak F, Grönneberg R, Suck R, Weber B, Fiebig H, van Hage M, Pauli G, Valenta R, Cromwell O. (2008). “Clinical effects of immunotherapy with genetically modified recombinant birch pollen Bet v 1 derivatives†. Clin Exp Allergy. 38(9):1514-25.

37) Reese G, Ballmer-Weber B, Wangorsch A, Randow S, Vieths S. (2007) “Allergenicity and antigenicity of wild-type and mutant, monomeric, and dimeric carrot major allergen Dau c 1: destruction of conformation, not oligomerization, is the roadmap to save allergen vaccines†. J allergy Clin Immunology 119:944-951.

38) Wang W., Malcolm BA. (2002). “Two-stage polymerase chain reaction protocol allowing introduction of multiple mutations, deletions, and insertions, using QuikChange site-directed mutagenesis†. Methods Mol Biol.;182: 37-43.

39) Paul, (1989), “Fundamental Immunology†, Raven press, New York. 40) Cryz, S. J. (1991), “Immunotherapy and Vaccines†, VCH Verlagsgesellschaft.

41) Younghee Kim. (2004). “Cloning and Expression of a Lipase Gene from Rice (Oryza sativa cv. Dongjin)†. Mol. Cells, 18 (1): 40-45.

42) Asturias JA, Ibarrola I, Eseverri JL, Arilla MC, Gonzales-Rioja R, Martinez A. (2004). “PCR-based cloning and immunological characterization of Parietaria judaica pollen profilin†. J Investig Allergol Clin Immunol, 14: 43-48. Holm J, Ferreras M, Ipsen H, Wurtzen PA, Gajhede M, Larsen JN, Lund L, Spangfort MD. (2011). “Epitope grafting, re-creating a conformational Bet v 1 antibody epitope on the surface of the homologous apple allergen Mal d 1†. J Biol Chem. 286:17569-78.

Claims (20)

1. RIVENDICAZIONI 1. Variante di sequenza dell’allergene maggiore di Malus domestica Mal d 1 wt (SEQ ID NO:1) o di una sua isoforma identica a SEQ ID NO:1 per almeno il 95%, preferibilmente almeno il 97%, detta variante essendo caratterizzata da: a) una ridotta reattività alle IgE rispetto a detto allergene Mal d 1 SEQ ID NO:1; b) una sequenza aminoacidica che, allineata a SEQ ID NO:1, presenta almeno una, preferibilmente due sostituzioni a livello dei residui Asp e/o Asn corrispondenti alle posizioni 25 e 78 di SEQ ID NO:1.
2. 2. Variante di sequenza secondo la rivendicazione 1, in cui la reattività alle IgE di sieri di pazienti allergici a Malus domestica e/o al polline di Betula verrucosa à ̈ ridotta di almeno il 10% rispetto all’allergene Mal d 1 SEQ ID NO:1.
3. 3. Variante di sequenza secondo le rivendicazioni 1-2, in cui detti due residui Asp e Asn sono sostituiti.
4. 4. Variante di sequenza secondo le rivendicazioni 1-3, in cui: - il residuo Asp 25 à ̈ sostituito con un amminoacido neutro, polare o basico, preferibilmente scelto tra Ala, Thr, Gly, Pro, Leu, Ile, Ser, Phe, Lys, Arg, più preferibilmente tra Ala, Thr, Ser, Gly, Lys, Arg; - il residuo Asn 78 à ̈ sostituito con un aminoacido neutro, acido o basico, preferibilmente scelto tra Ala, Gly, Pro, Leu, Ile, Phe, Lys, Arg, Asp, Glu, più preferibilmente tra Ala, Gly, Lys, Arg, Asp, Glu.
5. 5. Variante di sequenza secondo le rivendicazioni 1-4, avente la sequenza SEQ ID NO:2.
6. 6. Proteina ibrida contenente una variante di sequenza dell’allergene maggiore di Malus domestica come definita nelle rivendicazioni 1-5 e una variante ipoallergenica dell’allergene maggiore Bet v 1 di polline di Betula verrucosa, eventualmente separate da un linker.
7. 7. Proteina ibrida secondo la rivendicazione 6, in cui detta variante ipoallergenica di Bet v 1 à ̈ ottenuta a partire dalla proteina di sequenza SEQ ID NO:5 o da una sua isoforma identica a SEQ ID NO:5 per almeno il 94%, preferibilmente almeno il 97%, attraverso la sostituzione di uno o più residui Lys in posizione 54, 115 e/o 123 di SEQ ID N:5, o nelle corrispondenti posizioni di detta isoforma.
8. 8. Proteina ibrida secondo la rivendicazione 7, in cui detti residui Lys sono sostituiti con amminoacidi neutri o polari scelti tra Ala, Thr, Gly, Pro, Leu, Ile, Phe e Ser.
9. 9. Proteina ibrida secondo le rivendicazioni 6-8, in cui detta variante ipoallergenica di Bet v 1 ha la sequenza SEQ ID NO:6.
10. 10. Proteina ibrida secondo le rivendicazioni 6-9, in cui dette varianti ipoallergeniche di Mal d 1 e di Bet v 1 sono collocate o all’ammino o al carbossi terminale con orientamento testa-coda.
11. 11. Proteina ibrida secondo la rivendicazione 10, in cui l’ammino-terminale à ̈ occupato da Bet v 1 e il carbossi-terminale da Mal d 1.
12. 12. Proteina ibrida secondo le rivendicazioni 6-11, in cui detto linker à ̈ costituito da una catena amminoacidica contenente da 1 a 8 amminoacidi, preferibilmente dal dipeptide EF.
13. 13. Proteina ibrida secondo la rivendicazione 12, di sequenza SEQ ID NO:4.
14. 14. Molecola di acido nucleico codificante per una variante ipoallergenica di Mal d 1 secondo le rivendicazioni 1-5 o per una proteina ibrida secondo le rivendicazioni 6-13.
15. 15. Molecola di acido nucleico secondo la rivendicazione 14, avente una sequenza scelta dal gruppo comprendente SEQ ID NO:10 e 19.
16. 16. Vettore di espressione contenente la molecola di acido nucleico secondo le rivendicazioni 14-15.
17. 17. Composizione farmaceutica comprendente una quantità efficace di una variante ipoallergenica di Mal d 1 secondo le rivendicazioni 1-5 o di una proteina ibrida secondo le rivendicazioni 6-13 insieme a veicoli, eccipienti o adiuvanti farmaceuticamente accettabili.
18. 18. Composizione secondo la rivendicazione 17, in forma idonea alla somministrazione sublinguale, sottocutanea e transdermica.
19. 19. Variante ipoallergenica di Mal d 1 secondo le rivendicazioni 1-5 o proteina ibrida secondo le rivendicazioni 6-13 o composizione farmaceutica secondo le rivendicazioni 17-18, per uso nell’immunoterapia di soggetti allergici a Malus domestica e/o al polline di Betula verrucosa.
20. 20. Variante ipoallergenica, proteina ibrida o composizione farmaceutica per uso nell’immunoterapia di soggetti allergici a Malus domestica e/o al polline di Betula verrucosa secondo la rivendicazione 19, dove detti soggetti sono affetti da asma bronchiale, rinite allergica, congiuntivite allergica e sindrome allergica orale.