CN1484699A - 新型变态反应原突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有多重突变及减小的IgE结合亲和力的新型重组变态反应原。该变态反应原是天然变态反应原的非天然存在的突变体。总的α－碳主链的三级结构基本保守。本文也公开了制备这种重组变态反应原的方法及其用途。
Description
发明领域
本发明涉及天然变态反应原的突变体，新型重组变态反应原。本发明也涉及包含该新型重组变态反应原突变体的混合物的组合物。更进一步，本发明涉及制备这种重组变态反应原突变体的方法以及包含该重组变态反应原突变体的药物组合物，包括疫苗。在进一步的实施方案中，本发明涉及在被试者中产生免疫反应的方法、涉及对被试者接种疫苗或治疗以及制备本发明的组合物的方法。
发明背景
遗传诱发的个体对源于各种环境来源的抗原以及对该个体所暴露的变态反应原变得过敏(变态反应)。当先前过敏的个体再次遭受同样或同源的变态反应原时发生变态反应。响应于如蜜蜂或大黄蜂刺痛或昆虫叮咬，变态反应的范围为从枯草热、rhinoconductivitis、鼻炎和气喘到全身过敏反应及死亡。该反应是立即发生的，且可由各种特异反应性的变态反应原导致，如源于草、树、野草、昆虫、食物、药品、化学品和香料等。
然而，当个体初次遭受变态反应原时不发生该反应。初始的适应性反应耗费时间且一般不导致任何症状。但当已经生产了能够与变态反应原反应的抗体和T细胞时，任何随后的暴露都可引起症状。因而，变态反应证明免疫反应本身能够导致显著的病理学状态，其可威胁生命。
涉及在特异反应性变态反应中的抗体主要属于IgE类的免疫球蛋白。IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的特异性受体结合。在特异性变态反应原与结合肥大细胞的IgE形成复合物之后，在细胞表面交联的受体导致通过受体的信号传导和目的细胞的生理学反应。脱粒导致释放缺席的组胺、肝素、嗜曙红白细胞的一种趋化因子、白三烯C4、D4和E4，它们导致了支气管平滑肌细胞收缩延长。所导致的作用可能为全身性或局部性。
抗体介导的过敏性反应可分为4类，即类型I、类型II、类型III和类型IV。类型I变态反应是在抗原暴露之后数秒或数分钟之内发生的典型的即时过敏反应。这些症状由变态反应原特异的IgE所介导。
通常观察到的变态反应是作为对蛋白质变态反应原的反应，这些蛋白质变态反应原存在于如花粉、房屋尘螨、动物毛发和头皮屑、毒液和食物产品中。
为了减少或消除变态反应，通常使用谨慎控制并重复给药的变态反应疫苗。变态反应疫苗接种传统上是以渐增的剂量在一个相当长的时期内通过肠胃外、鼻内或舌下给药方式进行，且导致患者脱敏。精确的免疫学机制尚未知道，但认为在变态反应原特异的T细胞表型中诱导的差异特别重要。
变态反应疫苗接种
疫苗接种的概念基于免疫系统的两个基本特征，即特异性和记忆。疫苗接种将使受者的免疫系统预先准备好，且在重复暴露在相似的蛋白质中时该免疫系统将能够对如微生物感染产生更加剧烈的反应。疫苗是疫苗接种中用于在受者中产生这种保护性免疫反应的蛋白质的混合物。该保护将仅包含存在于疫苗和同源抗原中的成分。
与其他类型的疫苗接种相比较，变态反应疫苗接种由于在变态反应患者中存在正在进行的免疫反应而是复杂。该免疫反应特征在于当暴露于变态反应原时存在介导变态反应症状释放的变态反应原特异的IgE。因而，利用来自于天然来源的变态反应原的变态反应疫苗接种具有固有的副作用的危险，其最大的结果甚至威胁患者生命。
避免这个问题的方法可分为三类。实际上经常组合使用超过一类的方法。第一类方法包括在延长的时间内给药几种小剂量以达到相当的累积剂量。第二类方法包括通过将变态反应原掺入到凝胶物质如氢氧化铝中而对变态反应原进行物理修饰。氢氧化铝制备物具有减小活性变态反应原成分的组织浓度的缓慢变态反应原释放的佐剂作用及贮存作用。第三类方法包括目的在于减少变态反应性即IgE结合的变态反应原的化学修饰。
成功的变态反应疫苗接种的详细机制仍有争议。然而，一致认为T细胞在免疫反应的全面调节中发挥了关键的作用。根据目前的一致意见，T细胞表型的两个极端即Th1和Th2决定了个体的变态反应状态。当用变态反应原刺激时，Th1细胞分泌以干扰素-γ为主的导致保护性免疫的白细胞介素，则个体是健康的。另一方面，Th2细胞主要分泌导致IgE合成和嗜曙红性的白细胞介素4和5，则个体发生变态反应。体外研究显示通过用衍生自含有相关的T细胞抗原决定部位的肽的变态反应原免疫激发可能改变变态反应原特异的T细胞的反应。因此目前对新变态反应疫苗的研究主要是基于影响T细胞，其目的在于使T细胞沉默(诱导无反应性)或将Th2表型的反应转变为Th1表型的。
结合抗体的抗原决定部位(B-细胞抗原决定部位)
对Fab-抗原复合物的X-射线晶体学分析已经增加了对抗体-结合的抗原决定部位的理解。根据该类分析抗体-结合的抗原决定部位可定义为包含来自15～25个氨基酸残基的原子的抗原表面部分，它们处在与能直接相互作用的抗体原子的一定距离之内。抗原-抗体相互作用的亲和力不能单从由范德瓦耳斯相互作用、氢键或离子键贡献的焓来预测。与水分子几乎完全从界面排除相关的熵代表了大小相似的能量贡献。这意味着相互作用分子外形之间的正确配合是抗原-抗体高亲和力相互作用的主要因素。
在WO 97/30150(参考文献1)中，要求保护一组蛋白质分子，该蛋白质分子与亲代蛋白质相比在氨基酸序列中具有特异性突变的分布。从说明书中可知，看来该发明涉及生产与亲代蛋白质相比被修饰的类似物，但它们以与亲代蛋白质(天然存在的变态反应原)相似的方式被吸收、消化及呈递给T细胞。因此，获得了修饰的T细胞反应。修饰的蛋白质文库用称为PM(简约原则诱变)的技术来制备。
在WO 92/02621(参考文献2)中，描述了重组DNA分子，该分子包含编码具有至少一个Fagalrs目树木变态反应原的抗原决定部位多肽的DNA，该变态反应原选自Aln g 1、Cor a 1和Bet v 1。在此处描述的重组分子都具有与天然发生的变态反应原的序列相应的氨基酸序列或部分氨基酸序列。
WO 90/11293(参考文献3)在理论上涉及分离的豚草(ragweed)花粉的变态反应肽和修饰的豚草花粉肽。在此处公开的肽具有与天然存在的变态反应原或其天然存在的同种型相应的氨基酸序列。
变态反应原的化学修饰
已经采取了几种对变态反应原化学修饰的方法。七十年代早期的方法包括将变态反应原与聚合物化学偶联和用甲醛等化学交联变态反应原，从而形成所谓的“类变态反应原(allergoid)”。这些方法背后的基本原理是通过附加化学配体而造成的IgE结合的抗原决定部位的随机破坏，因而在通过增加的复合物分子量维持免疫原性同时减少了IgE-结合。“类变态反应原”生产的固有缺点与在控制化学交联方法中的困难及在对结果所得的高分子量复合物的分析和标准化中的困难有关。“类变态反应原”目前做临床应用，且由于IgE结合的抗原决定部位的随机破坏，与常规疫苗相比可以应用高剂量，但其安全和效力参数并没有比常规疫苗的应用有改进。
对变态反应原的化学修饰的更新方法目标在于对变态反应原三级结构的整体破坏从而消除IgE的结合，这里假定基本的治疗目标是变态反应原特异的T细胞。这样的疫苗包含由变态反应原序列，其衍生自代表最小的T细胞抗原决定部位的合成肽、代表连接的T细胞抗原决定部位的较长的肽、较长的变态反应原序列，其衍生自代表免疫决定T细胞抗原表位区域的合成肽或被重组技术切割成两个半分子的变态反应原分子。另一个基于该基本原理的方法建议使用“低IgE结合”重组同种型。最近几年中已经明确天然的变态反应原是异质性的，其含有氨基酸约达25％被替换的异变态反应原(isoallergen)和变体。已发现一些重组异变态反应原可能由于不可逆的变性及因此导致的三级结构的整体破坏而具有较低的IgE结合效力。
体外诱变和变态反应疫苗接种
已经用几种变态反应原进行了通过体外定点突变来减少变态反应性的尝试，包括Der f 2(Takai等人，参考文献4)，Der p 2(Smith等人，参考文献5)，一个39 kDa的粉尘螨(Dermatophagoides farinae)变态反应原(Aki等人，参考文献6)，蜜蜂毒液磷脂酶A2(Frster等人，参考文献7)，Ara h 1(Burks等人，参考文献8)，Ara h 2(Stanley等人，参考文献9)，Bet v 1(Ferreira等人，参考文献10和11)，桦木抑制蛋白(Wiedemann等人，参考文献12)和Ory s 1(Alvarez等人，参考文献13)。
这些方法背后的基本原理再次针对变态反应原特异的T细胞而同时减少IgE介导的副作用危险，这是通过破坏重组变态反应原突变体的三级结构减少或消除IgE结合。这些方法背后的基本原理不包括主要IgE结合抗原决定部位的概念且不包括起始也涉及B-细胞和抗体产生的新的保护性免疫反应的概念。
Ferreira等人(参考文献11)的文章描述了目的在于减少IgE结合的定点突变的应用。尽管在文中提到了Bet v 1的三维结构，但作者未用该结构对暴露在溶剂中的氨基酸残基做突变预测，其中一半的残基具有低程度的溶剂暴露。相反，他们应用了一种发展来用于在与对此处描述的基于确定保守表面区域的结构概念不同的蛋白质功能残基的预测方法。尽管作者确实讨论了α-碳主链的三级结构的保守性，但是该概念不是治疗策略的部分，而仅仅是包含在体外IgE结合的估计中。另外，出示的证据不足，因为CD-谱的归一化阻碍估计样品的部分变性，这是一个普遍的问题。所述治疗策略目标在于对变态反应原特异性T细胞诱导耐受性且没有提到起始新免疫反应。
Wiedemann等人(参考文献12)的文章描述了定点突变的应用和用于单克隆抗体抗原决定部位表征的肽合成。作者拥有抗原三级结构的知识，而且他们用这些知识选择了一个表面暴露的氨基酸进行突变。可以说所用的算法是与本发明者所描述的算法相反的，因其选择了与同源序列有差异的氨基酸。该研究证明表面暴露的氨基酸的替换具有修饰单克隆抗体的结合特征的能力，考虑到一般的知识这并不令人惊讶。所述实验不是设计来估计对多克隆抗体如变态反应患者的血清IgE结合的调制。包含的一个实验的确应用了IgE，且尽管该实验不适于数量评估，但IgE的结合看来没有受发生的突变的影响。
Smith等人(参考文献5)的文章描述了用于单克隆抗体抗原决定部位的作图和减少IgE结合的定点突变的应用。作者没有三级结构的知识，且他没有尝试估价α-碳主链的三级结构的保守性。所用的算法不能确保选择用来进行突变的氨基酸是事实上暴露于分子表面。只有一个所述突变体导致IgE结合真正减少。该突变体在对所有检验的抗体的结合中都有缺陷，这显示其三级结构被破坏。作者没有定义治疗策略，且没有提到起始新免疫反应。
Colombo等人(参考文献14)的文章描述了通过应用定点突变和肽合成对IgE结合抗原决定部位的研究。作者应用基于同源蛋白质的晶体结构的三维电脑模型结构来阐明存在于分子表面的抗原决定部位。抗原决定部位在显示一级结构同源的不同变态反应原上进一步的存在是用代表抗原决定部位的合成肽来陈述的。治疗策略是基于应用该代表单价IgE结合抗原决定部位的合成肽进行治疗。没有提到同源变态反应原之间保守的表面区域以及起始一种新的保护性免疫反应的治疗概念。
Spangfort等人(参考文献15)的文章描述了主要桦木变态反应原三维结构和保守表面暴露的区块。文章没有提到主要IgE结合抗原决定部位，也没有提到定点突变，也没有陈述治疗应用。
上述的研究中没有一个关于由替换表面暴露的氨基酸同时保持α-碳主链的三级结构而减少IgE结合。上述方法背后的基本原理没包括主要IgE结合抗原决定部位的概念，且它不包括起始一种新保护性免疫反应的治疗概念。
WO 99/47680公开了在维持变态反应原的α-碳主链三级结构同时，向确定的关键性位置引入人工氨基酸替换。具体地，WO99/47680公开了一种重组变态反应原，它是衍生自天然存在的变态反应原的非天然存在的突变体，其中至少一种表面暴露的B细胞抗原决定部位的保守氨基酸残基是由另一种残基替换的，在该天然存在的变态反应原所源自的分类目中该残基不存在于任何已知同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置上，该变态反应原突变体具有基本与该天然存在的变态反应原相同的α-碳主链三级结构，且对突变的变态反应原的特异的IgE结合与对该天然存在的变态反应原的结合相比是减少的。
在WO 99/47680中公开的重组变态反应原通过以下途径可得到：a)在天然存在的变态反应原中确定氨基酸残基，该变态反应原是保守的，其在该天然存在的变态反应原所源自的分类目中的所有已知的同源蛋白质中以超过70％的一致性保守，b)确定至少一片区域的保守氨基酸残基，它们在变态反应原分子的三维表面上至少4002的面积上互相连接，该小片区域由具有至少20％的溶剂可接近性所定义，其中至少一个区域包含至少一个B细胞抗原决定部位，和c)在至少一个区域用另一个氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基，该新残基在该特别位置不保守，但基本保持了该变态反应原分子的α-碳主链三级结构。
附图简述
图1表示用于Bet v 1突变体1号的突变体特异性寡核苷酸引物。突变的核苷酸以下划线表示。
图2表示两个合成并用于所有突变体的一般可适用的引物(以“全有义的”和“全无义的”标明)。
图3表示天然存在的变态反应原Bet v 1和许多Bet v 1突变体的DNA和氨基酸序列。
图4表示通过非生物素化的Bet v 1和Bet v 1 Glu45Ser突变体抑制生物素化的重组Bet v 1与来自变态反应患者群体的血清IgE结合。
图5表示通过非生物素化的Bet v 1和Bet v 1突变体Asn28Thr+Lys32Gln抑制生物素化的重组Bet v 1与来自变态反应患者群体的血清IgE结合。
图6表示通过非生物素化的Bet v 1和Bet v 1 Pr0108Gly突变体抑制生物素化的重组Bet v 1与来自变态反应患者群体的血清IgE结合。
图7表示通过非生物素化的Bet v 1和Bet v 1突变体Glu60Ser抑制生物素化的重组Bet v 1与来自变态反应患者群体的血清IgE结合。
图8表示重组和三重区块突变体的CD谱，以接近相等的浓度记录。
图9表示通过非生物素化的Bet v 1和Bet v 1三重区块突变体抑制生物素化的重组Bet v 1与来自变态反应患者群体的血清IgE结合。
图10表示单独比对的抗原5残基和黄胡蜂属(Vespula)抗原5序列(左面部分)的溶剂可接近性。在图10的右图版显示了在黄胡蜂抗原5：s中具有保守区域的抗原5的分子表面。
图11表示相应于由有义链衍生的Ves v 5氨基端的引物序列。下游引物的序列从无义链衍生。
图12表示两个合成并用于所有突变体的一般可适用的引物(以“全有义的”和“全无义的”表示)。
图13表示天然存在的变态反应原Ves v 5以及2个Ves v 5突变体的DNA和氨基酸序列。
图14表示通过非生物素化的Ves v 5和Ves v 5突变体Lys72Ala抑制生物素化的重组Ves v 5与来自变态反应患者群体的血清IgE结合。
图15表示变态反应原和肥大细胞之间通过IgE交联的反应的理论模型。
图16表示天然存在的变态反应原Der p 2的DNA和氨基酸序列。
图17示意性地表示用于产生突变的引物。(I)表示有义和反义引物。(II)表示在显示的位置含有突变的最终重组蛋白质。
图18表示对构建Bet v 1突变体的说明和所用引物的列表。该突变体含有5到9个氨基酸。
图19表示在Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)表面引入的点突变。在突变体Bet v 1(2628)中，在Bet v 1的一半中引入了5个初级突变而另一半没有改变。在突变体Bet v 1(2637)中，在另一半中引入了5个初级突变和3个二级突变，而第一半没有改变。
图20表示以几乎相等的浓度记录的重组Bet v 1.2801(野生型)和Bet v 1(2637)突变体的圆二色(CD)谱。
图21表示通过非生物素化的Bet v 1.2801和通过Bet v 1(2628)、Bet v 1(2637)及Bet v 1(2628)与Bet v 1(2637)的1∶1混合物抑制生物素化的重组Bet v 1.2801(野生型)与来自变态反应患者群体的血清IgE结合。
图22表示人Bet v 1.2801(野生型)、Bet v 1(2628)和Bet v1(2637)嗜碱性粒细胞中的组胺释放。
图23表示人Bet v 1.2801(野生型)、Bet v 1(2628)和Bet v1(2637)嗜碱性粒细胞中的组胺释放。
图24表示Bet v 1(2744)表面的点突变。
图25表示Bet v 1(2753)表面的点突变。
图26表示Bet v 1(2744)和Bet v 1(2753)表面的点突变。
图27表示以几乎相等的浓度记录的Bet v 1.2801(野生型)和Bet v 1(2744)的圆二色(CD)谱。
图28表示人Bet v 1.2801(野生型)和突变体Bet v 1(2744)嗜碱性粒细胞中的组胺释放。
图29表示人Bet v 1.2801(野生型)和突变体Bet v 1(2744)嗜碱性粒细胞中的组胺释放。
图30表示Bet v 1(2733)表面的点突变。
图31表示用于对Der p 2进行定点突变的引物。
图32表示Der p 2与其他类群2屋尘螨变态反应原的序列比对。
图33从4个不同角度表示Der p 2的表面外形。
图34从4个不同角度表示Der p 2突变体的表面外形。
图35A和B表示Der p 1与其他类群1屋尘螨变态反应原的序列比对。
图36从4个不同角度表示Der p 1的表面外形。
图37从4个不同角度表示Der p 1突变体的表面外形。
图38A-D表示Phl p 5与其他类群5草变态反应原的序列比对。
图39A和B分别从4个不同角度表示Phl p 5模型A和模型B的表面外形。
图40A和B分别从4个不同角度表示Phl p 5突变体模型A和B的表面外形。
图41表示表达为各种Bet v 1制备物的刺激指数(StimulationIndex，SI)的外周血淋巴细胞的增殖。
图42-44表示用各种Bet v制备物刺激的T细胞的细胞因子的概况。图42表示具有Th0状况的患者，图43表示Th1状况，图44表示Th2状况。
发明目的
本发明背后的基本原理
本发明基于独特的基本原理。根据此基本原理，成功的变态反应原免疫接种机制不是改造进行中的Th2-类型免疫反应，而是平行地起始一种新的涉及B-细胞识别三级抗原决定部位和抗体形成的免疫反应。现已相信该新的免疫反应部分属于Th1-类型免疫反应。该模型由于观察到特异IgE水平不受成功的免疫接种治疗的影响而得到支持，且成功的治疗经常是伴随变态反应原特异的IgG4的真正增加。另外，在变态反应原攻击前后的鼻活组织检查中没有显示具Th2-样表型的T细胞的减少，而是观察到Th1-样T细胞的增加。当将疫苗(或药物组合物)通过除呼吸道之外的其他途径给药时，假定该新的免疫反应在与正在进行的Th2反应物理相分隔的位置上发展，因而使得两个反应得以平行存在。
免疫系统的另一个重要方面是所谓的主要IgE结合抗原决定部位存在的确定。有人提出这些主要IgE结合抗原决定部位是由三级结构依赖的连续表面区域构成，该区域大小足够大容纳抗体结合，且在异变态反应原、变体和/或来自相关物种的同源变态反应原中保守。能够在同源变态反应原上结合相似抗原决定部位的交叉反应性IgE的存在得到了临床观察的支持，即变态反应患者经常对几种密切相关的物种反应，如桤木、桦木和榛子，多种草本物种，或嗜皮螨属(Dermatophagoides)的几个物种。此外，它得到了实验室实验的支持，该实验证明了来自相关物种的同源变态反应原之间的IgE交叉反应性及一种变态反应原抑制IgE结合同源变态反应原的能力(Ipsen等人，1992，参考文献16)。众所周知，暴露和免疫反应以剂量依赖的方式相关。结合这些观察，可假定保守的表面区域暴露于免疫系统的剂量比不保守的表面区域更高，导致具有更高亲和力的IgE抗体的产生，因此有了术语“主要IgE结合抗原决定部位”。
根据这个基本原理，必要的是变态反应原具有与天然变态反应原基本上相同的α-碳主链三级结构，因而确保围绕保守区块的区域表面拓扑学的保守性，这些区域代表了旨在减少IgE结合的诱变目标。通过实现这些标准，变态反应原有潜力以相对较高的剂量施用以改善其效力，即产生一种保护性的免疫反应而不损害安全性。
此外，本发明基于如下发现，即变态反应症状由IgE通过高亲和力的受体FceR I在效应细胞即肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的2个特异的结合所导致的变态反应交联引起。为了说明，我们参考图15，它描述了具有IgE结合抗原决定部位的变态反应原的理论模型。诱导中介体从肥大细胞释放及因此产生的变态反应症状由变态反应原所介导的结合于肥大细胞表面的IgE所致，参考图15A。在图15B所示的情况下，两个抗原决定部位已经发生突变以减少它们的IgE结合亲和力，并因此防止了变态反应原介导的交联。在这种联系中应该注意到变态反应原通常包含超过3个的B细胞抗原决定部位。然而，从图15中描述的理论状况下可假定发生的以消除或减少其IgE结合能力的抗原决定部位的突变越多，那么变态反应原介导的交联和结果所得的变态反应症状的危险就越低。
然而，为了使突变的变态反应原能够引起新的免疫反应，包括IgG反应，变态反应原必须包含至少一个未变的抗原决定部位。优选，未变的抗原决定部位是主要的抗原决定部位，因为这样的突变变态反应原用于疫苗接种时将提供改善的保护。
总之，本发明的发明思想基于如下认识，即具有在多重B细胞抗原决定部位中减少IgE结合的突变的变态反应原突变体和至少一种未变的抗原决定部位将一方面减少变态反应原介导的交联，另一方面允许引起具有与IgE竞争的结合能力的IgG反应。因而，该变态反应原突变体组成了一种非常有利的变态反应原，这里过敏性的反应的危险将大大减少。
本发明也基于如下认识，即包含不同这样的变态反应原突变体的混合物的疫苗，其中许多或全部抗原决定部位都理想地表现为未变化，在其诱导对变态反应症状的保护的能力上具有与天然存在的变态反应原相同的效力，其中从天然的变态反应原衍生了该变态反应原突变体。
发明概述
本发明涉及向一些确定的关键位点，即IgE结合的抗原决定部位引入人工的氨基酸替换，目的在于减少每个突变的抗原决定部位的特异的IgE结合能力。
本发明提供了重组变态反应原，其特征在于它是天然存在的变态反应原的突变体，其中变态反应原突变体具有至少4个初级突变，与该天然存在的变态反应原的IgE结合能力相比，这每一个突变都减少了变态反应原突变体的特异的IgE结合能力；其中每一个初级突变都用其他的残基替换一个表面暴露的氨基酸残基，在该天然存在的变态反应原所源自的分类学物种中该新残基不发生于任何已知同源蛋白质氨基酸序列的相同位置上；其中每一个初级突变都与任一其他初级突变间隔至少15；且其中初级突变以这种方式分布，以使得至少一个具有8002面积的圆形表面区域不包含有突变。
如果不受理论的限制，相信B细胞抗原决定部位可分布在变态反应原的几乎整个表面。此外，有实验证据表明至少一些抗原决定部位组成了包含大量交迭抗原决定部位的抗原决定部位簇的一部分。因此，本发明的理论基础即为任何表面暴露的氨基酸都构成突变的潜在位点，其可导致降低特异地结合IgE的能力。
因此，初级突变是由它们相互的定位而确定，即它们相互隔开，以确保它们是分离的抗原决定部位簇中的突变。
本发明也提供包含两或多种根据权利要求1的重组变态反应原突变体的组合物，其中每一个变体都是通过具有至少一个主要突变而定义，该突变在至少一个其他的变体中不存在；其中对于每一个变体而言在每一个不存在的初级突变的15的半径之内不存在二级突变。该组合物优选包含2～12个，更优选3～10个，更优选4～8个且最优选5～7个变体。
本发明也提供制备根据权利要求1的重组变态反应原的方法，其特征在于
a)在天然存在的变态反应原中确定一些氨基酸残基，它们具有至少20％的溶剂可接近性；
b)以这样的方式选择至少4个确定的氨基酸残基以使得每个所选氨基酸与其他所选氨基酸相互间隔至少15，且所选氨基酸是以这种方式放置，使得至少一个具有8002面积的圆形表面区域不包含选择的氨基酸；和
c)对每个所选氨基酸进行初级突变，使得与天然存在的变态反应原的结合能力相比变态反应原突变体的特异性IgE结合能力减少了，其中每个初级突变都是用其他的氨基酸替换所选氨基酸残基，前者在该天然存在的变态反应原所源自的分类学物种中不发生于任何已知同源蛋白质氨基酸序列的相同位置上。
在另一个方面，本发明涉及制备根据本发明的重组变态反应原的方法，其特征在于该变态反应原是从由编码相应的天然存在的变态反应原的DNA进行的DNA改组(DNA shuffling)(分子培育(Molecular breeding))获得的DNA序列生产。
此外，本发明涉及根据权利要求1以用作药物的重组变态反应原。
本发明也涉及根据权利要求1的重组变态反应原在制备预防和/或治疗变态反应的药物中的用途。
此外，本发明涉及根据权利要求37的用作药物的组合物。
本发明也涉及根据权利要求37的组合物以制备药物来预防和/或治疗变态反应的用途。
更进一步地，本发明涉及药物组合物，其特征在于它包含根据权利要求1的重组变态反应原或根据权利要求37的组合物，可选地与药物学上可接受的载体和/或赋形剂，以及可选佐剂结合。根据本发明的药物组合物可为对抗变态反应的疫苗的形式，该变态反应是由天然存在的变态反应原在遭受变态反应的患者中引起。
本发明也涉及在被试者中产生免疫反应的方法，包含向被试者施用根据权利要求1的重组变态反应原、根据权利要求37的组合物或根据权利要求41-42或46的药物组合物。
更进一步地，本发明涉及对被试者进行疫苗接种或治疗，包含向被试者施用根据权利要求1的重组变态反应原、根据权利要求37的组合物或根据权利要求41-42或46的药物组合物。
本发明也涉及制备根据权利要求41或42的药物组合物的方法，包含将根据权利要求1的重组变态反应原或根据权利要求37的组合物与药物学上可接受的物质和/或赋形剂混合。
更进一步地，本发明涉及由根据权利要求45的方法可获得的药物组合物。
本发明也涉及在被试者中治疗、预防或减轻变态反应的方法，包含向被试者施用根据权利要求1的重组变态反应原、根据权利要求37的组合物或根据权利要求41-42或46的药物组合物。
更进一步地，本发明涉及编码根据本发明的变态反应原的DNA序列、其衍生物、其部分序列、其简并的序列或在严紧条件下与其杂交的序列，其中该衍生物、部分序列、简并序列或杂交序列编码具有至少一个B细胞抗原决定部位的肽。
本发明也涉及包含根据本发明的DNA的表达载体。
此外，本发明也涉及含有根据本发明的表达载体的宿主细胞。
此外，本发明涉及生产重组变态反应原突变体的方法，该方法包含培养根据本发明的宿主细胞的步骤。
最后，本发明涉及根据本发明或由根据本发明的DNA序列编码的重组变态反应原，其包含至少一种T细胞抗原决定部位能够刺激特异于天然存在的变态反应原的T细胞克隆或T细胞系。
根据本发明的突变体应该优选地能够以由T细胞刺激指数测量的相似方式/程度来刺激变态反应原特异的T细胞系。
发明详述
在本发明的一个优选实施方案中，初级突变间隔20，优选地为25，且最优选地为30。
相信变态反应原包含许多特异的IgE的潜在结合区，其中每个区域约具有8002的面积，每个表面区域包含大量的交迭抗原决定部位。因而，变态反应原含有许多由8002划分的表面区域的潜在的初级突变。
优选地，根据本发明的重组变态反应原包含5～20个，优选6～15个，更优选7～12个，且最优选8～10个初级突变。
在本发明的一个优选实施方案中，不含有突变的表面区域具有7002的面积，优选6002，更优选5002且最优选4002。
在本发明的一个优选实施方案中，重组变态反应原包含许多二级突变，与该天然存在的变态反应原的结合能力相比，它们每一个突变都减少了变态反应原突变体的特异的IgE结合能力；其中每一个二级突变都是用其他的残基替换一个表面暴露的氨基酸残基，前者在该天然存在的变态反应原所源自的分类学物种中不发生于任何已知同源蛋白质氨基酸序列的相同位置上；其中的二级突变是处于圆形表面区域之外。
二级突变可位于靠近初级突变的位置，即二级突变也可是相同抗原决定部位的额外突变，该抗原决定部位已有了初级突变。
在本发明的一个优选实施方案中，在天然存在的变态反应原中至少一个要进行替换的表面暴露的氨基酸具有超过20％的溶剂可接近性，优选超过30％，更优选超过40％且最优选超过50％。
在本发明的另一个优选实施方案中，至少一个要在天然存在的变态反应原中进行替换的表面暴露的氨基酸在该天然存在的变态反应原所源自的分类目中的所有已知的同源蛋白质中具有超过70％，优选80％的且最优选90％的一致性。
优选地，根据本发明的重组变态反应原基本上具有与该天然存在的变态反应原相同的α-碳主链三级结构。
当比较突变体和天然存在的变态反应原分子的α-碳主链三级结构时，对原子坐标的平均根均方偏差优选地低于2。
在本发明的重组变态反应原的一个优选实施方案中，每一个要结合入变态反应原突变体的氨基酸残基在该天然存在的变态反应原所源自的分类学属，优选亚科，更优选科，更优选总科，更优选军团(legion)，更优选亚目且最优选目中都不发生于任何已知同源蛋白质氨基酸序列的相同位置上。
在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的重组变态反应原突变体是非天然存在的变态反应原。
在使用来自来源特异的IgE反应性变态反应患者或其群体的血清进行的免疫测定中与天然存在的异变态反应原或相似的重组蛋白质相比，对突变的变态反应原的特异的IgE结合减少了至少5％，优选至少10％。
估计减少的IgE结合和减少的介导突变体交联能力的另一个途径是突变体起始组胺释放(HR)的能力。组胺的释放可在几个组胺释放测定中被测量。突变体减少的组胺释放来源于对结合到细胞表面的特异的IgE的亲和力的减小及其减少的促进交联的能力。与天然存在的变态反应原相比，本发明的突变体HR优选减少5～100％，更优选25～100％，更优选50～100％且最优选75～100％。
典型地，不含有突变且具有8002面积的圆形表面区域包含15～25个氨基酸残基的原子。
根据本发明的一个优选的重组变态反应原特征在于将表面暴露的氨基酸残基关于溶剂可接近性分级，且将处于较高的溶剂可接近性的氨基酸中的一个或多个替换。
根据本发明一个进一步优选的重组变态反应原特征在于将表面暴露的氨基酸残基关于其在该天然存在的变态反应原所源自的分类学种中的所有已知同源蛋白质中的保守程度而分级，且将处于较高保守程度的氨基酸中的一个或多个替换。
优选地，根据本发明的重组变态反应原对于每个初级突变包含1～4个二级突变。
本发明的一个优选实施方案特征在于一个或多个替换由定点突变实现。
本发明的另一个优选实施方案特征在于一个或多个替换由随机诱变实现。
本发明进一步的一个优选实施方案特征在于一个或多个替换由DNA改组实现。
根据本发明的重组变态反应原可适当地为吸入的变态反应原的突变体，它理论上来源于树、草、草本植物、真菌、屋尘螨、蟑螂和动物毛发和皮屑。来自树、草和草本植物的重要花粉变态反应原是源自分类目Fagales、Oleales和Pinales的这些，理论上包括桦木(桦木属(Betula))、桤木(桤木属(Alnus))、榛树(榛属(Corvlus))、角树(鹅耳枥属(Carpinus))和橄榄树(齐墩果属(Olea))，Poales目理论上包括黑麦草属(Lolium)、猫尾草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)和黑麦属(Secale)等属的草，Asterales和Urticales目理论上包括豚草属(Ambrosia)和蒿属(Artemisia)的草本植物。来自真菌的重要吸入型变态反应原理论上为源自链格孢属(Alternaria)和芽枝霉属(Cladosporium)的这些。其他重要吸入型变态反应原来自嗜皮螨属的屋尘螨、来自蟑螂和来自哺乳动物如猫、狗和马。更进一步地，根据本发明的重组变态反应原可为毒液变态反应原的突变体，包括来自刺人的或咬人的昆虫，例如来自膜翅目，包括蜜蜂(蜜蜂总科(Apidae))，黄蜂(胡蜂总科(Vespidae))和蚂蚁(蚁Formicoidae总科)。
特异的变态反应原成分包括如Fagalrs目的Bet v 1(白桦(B.verrucosa)，桦木)、Aln g 1(胶桤木(Alnus glutinosa)，桤木)、Cor a 1(Corylus avelana，榛子)和Car b 1(桦叶鹅耳枥(Carpinus betulus)，角树)。其他的为Cry j 1(Pinales)、Amb a1和2、Art v 1(Asterales)、Par j 1(Urticales)、Ole e 1(Oleales)、Ave e 1、Cyn d 1、Dac g 1、Fes p 1、Hol l 1、Lol p 1
和5、Pas n 1、Phl p 1和5、Poa p 1、2和5、Sec c 1和5、及Sorh 1(各种草的花粉)、Alt a 1和Cla h 1(真菌)、Der f 1和2、Derp 1和2(屋尘螨，分别为粉尘螨(D.farinae)和屋尘螨(D.pteronyssinus))、Lep d 1和2(Lepidoglyphus destructor；贮藏螨(storage mite))、Bla g 1和2、Per a 1(蟑螂，分别为德国小蠊(Blatella germanica)和美洲大蠊(Periplaneta americana)、Fel d1(猫)、Can f 1(狗)、Equ c 1、2和3(马)、Apis m 1和2(蜜蜂)、Ves v 1、2和5、Pol a 1、2和5(全为黄蜂)和Sol i 1、2、3和4(火蚁(fire ant))。
在一个实施方案中重组变态反应原是Bet v 1的一个突变体。潜在适合用于替换的氨基酸包含氨基酸V2、D72、E87、K-129、E-60、N-47、K-65、P-108、N-159、D-93、K-123、K-32、D-125、R-145、D-109、E-127、Q-36、E-131、L-152、E-6、E-96、D-156、P-63、H-76、E-8、K-134、E-45、T-10、V-12、K-20、S-155、H-126、P-50、N-78、K-119、V-2、L-24、E-42、N-4、A-153、I-44、E-138、G-61、A-130、R-70、N-28、P-35、S-149、K-103、Y-150、H-154、N-43、A-106、K-115、P-14、Y-5、K-137、E-141、E-87和E-73。一或多种一次和二次替换可选自V2F、V2L、V2I、V2M、Y5V、T10P、T10A、K20N、D25E、N28T、K32Q、Q36A、Q36K、E42S、E45S、N47S、K55N、K65N、D72H、D72Q、D72N、T77A、N78K、E87G、E96L、K97S、K103V、P108G、D109N、K123I、D125Y、K129N、K134E、R145E、S149R、S149T、D156H和+160N，其中+表示插入了一个额外的氨基酸。
根据本发明Bet v 1突变体的实施例如下(当用到时，括弧表示一次和二级突变)：
突变体A：
(Asn28Thr，Lys32Gln)、(Asn78Lys，Lys103Val)、Arg145Glu、(Asp156His，+160Asn)。
突变体B：
Tyr5Val、Glu42Ser、Glu45Ser、Asn78Lys、Lys103Val、Lys123Ile、Lys134Glu、Asp156His。
突变体2595(实施例2)：
N28T、K32Q、E45S、P108G
突变体2628(实施例4)：
Tyr5Val、Glu45Ser、Lys65Asn、Lys97Ser、Lys134Glu。
突变体2637(实施例4)：
Ala16Pro、(Asn28Thr，Lys32Gln)、Lys103Thr、Pro108Gly、(Leu152Lys，Ala153Gly，Ser155Pro)。
突变体2724：
N28T、K32Q、N78K、K103V、P108G、R145E、D156H、+160N。
突变体2733(实施例4)：
(Tyr5Val，Lys134Glu)、(Asn28Thr，Lys32Gln)、Glu45Ser、Lys65Asn、(Asn78Lys，Lys103Val)、Lys97Ser、Pro108Gly、Arg145Glu、(Asp156His，+160Asn)。
突变体2744：(Tyr5Val，Lys134Glu)、(Glu42Ser、Glu45Ser)、(Asn78Lys，Lys103Val)、Lys123Ile、(Asp156His，+160Asn)。
突变体2753(实施例4)：
(Asn28Thr，Lys32GIn)、Lys65Asn、(Glu96Leu，Lys97Ser)、(Pro108Gly，Asp109Asn)、(Asp125Tyr，Glu127Ser)、Arg145Glu。
突变体2744+2595：
Y5V、N28T、K32Q、E42S、E45S、N78K、K103V、P108G、K123I、K134E、D156H、+160N。
突变体2744+2628：
Y5V、E42S、E45S、K65N、N78K、K97S、K103V、K123I、K134E、D156H、+160N。
突变体2744+2595+2628：
Y5V、N28T、K32Q、E42S、E45S、K65N、N78K、K97S、K103V、P108G、K123I、K134E、D156H、+160N。
此外，所有上述突变体包含一种或多种下面的替换：V2F、V2L、V2I、V2M、T10A、K20N、Q36A或Q36K、D72H、D72Q、D72N、E87G、K129N和S149R或S149T。
在另一个实施方案中，重组变态反应原衍生自来自分类学目胡蜂科(Vespidae)、蜜蜂科(Apidae)和蚁(Formicoidae)总科的毒液变态反应原。
在进一步的实施方案中，重组变态反应原衍生自Ves v 5。潜在适合用于替换的氨基酸包含氨基酸K-16、K-185、K-11、K-44、K-210、R-63、K-13、F-6、K-149、K-128、E-184、K-112、F-157、E-3、K-29、N-203、N-34、K-78、K-151、L-15、L-158、Y-102、W-186、K-134、D-87、K-52、T-67、T-125、K-150、Y-40、Q-48、L-65、K-81、Q-101、Q-208、K-144、N-8、N-70、H-104、Q-45、K-137、K-159、E-205、N-82、A-111、D-131、K-24、V-36、N-7、M-138、T-209、V-84、K-172、V-19、D-56、P-73、G-33、T-106、N-170、L-28、T-43、Q-114、C-10、K-60、N-31、K-47、E-5、D-145、V-38、A-127、D-156、E-204、P-71、G-26、Y-129、D-141、F-201、R-68、N-200、D-49、S-153、K-35、S-39、Y-25、V-37、G-18、W-85和I-182。一或多种一次和二次替换可选自K29A、T67A、K78A、V84S、Y102A、K112S、K144A、K202M和N203G。
在进一步的实施方案中，重组变态反应原衍生自Der p 2。潜在适合用于替换的氨基酸包含氨基酸R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109和R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109、K-15。一或多种一次和二次替换可选自K6A、N10S、K15E、S24N、H30N、K48A、E62S、H74N、K77N、K82N、K100N和R128Q。
根据本发明Bet v 1突变体的实施例如下：
突变体A：
K6A、K15E、H30N、E62S。
突变体B：
K6A、K15E、H30N、E62S、H74N、K82N。
突变体C：
K6A、N10S、K15E、S24N、H30N、K48A、E62S、H74N、K77N、K82N、K100N和R128Q
疫苗
疫苗的制备为本领域众所周知。疫苗一般以可注射的液体溶液或悬浮液的形式制备。这样的疫苗也可以乳化或调配以使其能够经鼻及经口给药，包括口腔和舌下给药。正被讨论的免疫原性成分(如在此处所限定的重组变态反应原)可适当地与药物学上可接受，且进一步与活性成分相容的赋形剂混合。适当的赋形剂的实例为水、盐、右旋糖、甘油、乙醇等以及它们的组合。疫苗另外可含有其他的物质，如润湿剂、乳化剂、缓冲剂或增强疫苗效力的佐剂。
疫苗最通常通过皮下或肌内注射以肠胃外方式给药。适合于通过其他途径给药的制剂包括口服制剂和栓剂。经口给药的疫苗可适当地用通常用于这种制剂的赋形剂来调配，如药物等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠(sodium saccharine)、纤维素、碳酸镁等。组合物可被制备成溶液、悬浮掖、乳剂、片剂、药丸、胶囊、缓释制备物、气溶胶、粉末或颗粒。
疫苗的给药途径应与剂量配方相容，并且其量在药物学上有效且具免疫原性。在疫苗中包含的活性成分的量依赖于治疗对象、理论上被试者响应于治疗的免疫系统对治疗的应答能力、给药途径及被试者的年龄和体重。适当的剂量范围在0.0001μg～1000μg。
如上所述，通过向制备物中添加佐剂可获得增加的作用。这样的佐剂的实例为氢氧化铝和磷酸缓冲盐溶液中0.05％～0.1％的磷酸(明矾)或磷酸钙溶液、用作0.25％溶液的糖或聚交酯乙交酯(polylactid glycolid)(PLG)的合成多聚体。也可采用与细菌细胞如小棒杆菌(C.parvum)、革兰氏阴性细菌的内毒素或脂多糖成分的混合物、在生理学可接受的油载体如二缩甘露醇monoaleate(Aracel A)中的乳剂或在用作阻断替换的20％全氟烃(perfluorocarbon)(如Fluosol-DA)溶液中的乳剂。也可用到油乳剂如MF-59。也可以用到其他的佐剂如弗氏完全和不完全佐剂以及皂苷，如QuilA、Qs-21和ISCOM和RIBI。
最经常地，疫苗的多重给药对确保其作用是必需的。疫苗经常以初次给药后伴随后续接种或其他给药的方式来给药。疫苗接种的数量一般为1～50次，通常不超过35次疫苗接种。疫苗接种通常双周到双月地进行3个月到5年的时间。预期这将达到预防或治疗效果的期望水平。
重组变态反应原可被用作药物制备物，在症状出现所在年的期间适合于提供某些对抗变态反应的保护(预防)。通常，必须每年重复治疗以维持保护作用。调配为鼻、口和舌下应用的制备物特别适合于这个目的。
制备根据本发明的重组变态反应原的方法
如上所述，本发明也涉及制备本发明的重组变态反应原突变体的方法，参考权利要求48。
依照本发明适合于替换的表面暴露的氨基酸可以其溶剂(水)可接近性的信息为基础进行确定，该信息表达了其表面暴露的程度。本发明方法的一个优选实施方案特征在于以溶剂可接近性对其中确定的氨基酸残基进行分级，且在具有较大溶剂可接近性的氨基酸中替换一个或多个。
有助于确定依照本发明的适合用作替换的表面暴露的氨基酸的第二个参数是氨基酸在该天然存在的变态反应原所源自的物种中所有已知同源蛋白质中的保守程度。或者，将其在该天然存在的变态反应原所源自的分类学属、亚科、科、总科、军团(legion)、亚目或目中所有已知的同源蛋白质中的保守程度用作这样的第二个参数。
因此，本发明方法的一个优选实施方案特征在于选择确定的氨基酸残基，其在该天然存在的变态反应原所源自的物种中所有已知同源蛋白质中具有超过70％，优选超过80％的且最优选超过90％的一致性。
此外，本发明方法的特别优选的一个实施方案特征在于关于以在该天然存在的变态反应原所源自的物种中所有已知同源蛋白质中的保守程度来对其中确定的氨基酸残基进行分级，且在具有较大保守性的氨基酸中替换一个或多个。
本发明方法更进一步优选的实施方案包含选择确定的氨基酸以形成变态反应原突变体，它具有与天然存在的变态反应原基本上相同的α-碳主链三级结构。
本发明方法的另一个优选实施方案特征在于对氨基酸残基的替换通过定点突变来实现。
本发明方法的另一个优选实施方案特征在于对氨基酸残基的替换通过DNA改组来实现。
替换标准
对于三级结构已经确定的分子(例如通过X-射线晶体学或NMR电子显微镜方法)，带有替换的氨基酸的突变体应该优选地符合如下标准：
1.分子的总α-碳主链三级结构优选保守。保守定义为比较结构时原子坐标中平均根均方偏差低于2。这由于两个原因而重要：a)可预期天然的变态反应原的整个表面组成了潜在抗体结合抗原决定部位的一个交迭连续统一体。分子表面的大部分不受替换影响，并因而维持了其抗体结合诱导的性质，这对于产生针对也存在于天然变态反应原上的抗原决定部位的新保护性抗体特异性重要。b)考虑保存限期和注射入体液中时的稳定性。
2.要替换的氨基酸优选位于表面，因而可供抗体结合所接近。位于三维结构的表面的氨基酸通常具有至少20％的溶剂(水)可接近性，适当地为20～80％，更适当地为30～80％。溶剂可接近性定义为对具有与溶剂(水，r＝1.4)分子相当半径的球体可接近的分子的面积。
3.每个替换的氨基酸优选位于具有超过4002面积的保守区块中。保守的区块定义为表面暴露的保守氨基酸残基和主链的连续相结合的区域。保守的氨基酸残基由处于相同分类学属、亚科、科、总科、军团(legion)、亚目或目中的同源蛋白质的所有已知氨基酸序列的序列比对来界定。在超过70％的序列中具有相同氨基酸残基的氨基酸位置被认为保守。预期保守的区块含有大多数患者的IgE所针对的抗原决定部位。
α-碳主链三级结构的保守是由在诱变前后用X-射线晶体学或NMR获得相同的结构而最好地确定的。没有描述突变体结构数据时，如果与由对结构上确定的分子分析所获得的数据相比，不能区别的CD-谱或免疫化学数据如抗体反应性则能推知大概α-碳主链三级结构的保守性。
4.在保守的区块中，用于诱变的氨基酸应该优选选自优选位于接近保守区块中心的具有最大溶剂(水)可接近性的那些。
5.优先地，极性氨基酸残基由另一个极性残基替换，而非极性氨基酸残基由另一个非极性残基替换。
为了基本维持变态反应原的三维结构，要结合进来的氨基酸可基于同该变态反应原的结构类似物的蛋白质的比较来选择，例如一个与该变态反应原属于相同分类学目且与该变态反应原不具有任何交叉反应性的蛋白质。
根据本发明的DNA
在一个优选实施方案中，本发明的DNA序列是编码天然存在的变态反应原的DNA序列的衍生物。
优选，该DNA衍生物通过对编码天然存在的变态反应原的DNA进行定点突变或随机诱变而获得。
在第一个特别优选的实施方案中，DNA序列是如图3所示的序列的一个衍生物，其中的DNA序列进行了突变以编码具有至少4个突变的变态反应原，这些突变选自K-129、E-60、N-47、K-65、P-108、N-159、D-93、K-123、K-32、D-125、R-145、D-109、E-127、Q-36、E-131、L-152、E-6、E-96、D-156、P-63、H-76、E-8、K-134、E-45、T-10、V-12、K-20、S-155、H-126、P-50、N-78、K-119、V-2、L-24、E-42、N-4、A-153、I-44、E-138、G-61、A-130、R-70、N-28、P-35、S-149、K-103、Y-150、H-154、N-43、A-106、K-115、P-14、Y-5、K-137、E-141、E-87、E-73。
在第二个特别优选的实施方案中，DNA序列是如图13所示的序列的一个衍生物，其中的DNA序列进行了突变以编码具有至少4个突变的变态反应原，这些突变选自K-16、K-185、K-11、K-44、K-210、R-63、K-13、F-6、K-149、K-128、E-184、K-112、F-157、E-3、K-29、N-203、N-34、K-78、K-151、L-15、L-158、Y-102、W-186、K-134、D-87、K-52、T-67、T-125、K-150、Y-40、Q-48、L-65、K-81、Q-101、Q-208、K-144、N-8、N-70、H-104、Q-45、K-137、K-159、E-205、N-82、A-111、D-131、K-24、V-36、N-7、M-138、T-209、V-84、K-172、V-19、D-56、P-73、G-33、T-106、N-170、L-28、T-43、Q-114、C-20、K-60、N-31、K-47、E-5、D-145、V-38、A-127、D-156、E-204、P-71、G-26、Y-129、D-141、F-201、R-68、N-200、D-49、S-153、K-35、S-39、Y-25、V-37、G-18、W-85和I-182。
在第三个特别优选的实施方案中，DNA序列是如图16所示的序列的一个衍生物，其中的DNA序列进行了突变以编码具有至少4个突变的变态反应原，这些突变选自R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109和R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109、K-15。
DNA改组(shuffling)
根据本发明的重组变态反应原突变体可以用从相关天然DNA的DNA改组(分子培育)获得的DNA来生产。DNA改组可根据在Punnonen等人(参考文献25)的文章所公开的程序以及其中提到的文章中公开的程序来实施，这些程序在此处引用作为参考。
诊断测定
此外，根据本发明的重组变态反应原突变体具有诊断可能性和优点。当前领域中的变态反应疫苗基于天然存在的变态反应原来源的提取物，因而代表了多种同种型。变态反应个体最初针对一种或多种存在的同种型过敏并产生IgE。由于同源性及随后与使个体发生变态反应的同种型的交叉反应性，一些同种型关于变态反应个体的变态反应是相关的，然而其他同种型由于不具有任何变态反应个体对其具有特异性IgE的IgE结合抗原决定部位而不相关。由于IgE群体特征性的异质性，一些同种型因而可安全地给药，即它们不导致经由IgE的变态反应，然而其他的同种型可能有害地导致不良的副作用。
因而，打算治疗性给药的本发明的突变体和本发明的组合物也可被用作体内或体外诊断测定以监控使用这种突变体或组合物进行治疗的适当性、安全性或结果。应用的诊断样品包括人体样品，如血清。
因而，本发明也涉及用根据本发明的重组变态反应原突变体或根据本发明的组合物来估计对被试者的治疗的适当性、安全性或结果的诊断测定，其中将被试者的含IgE的样品与该突变体或该组合物混合并估计该样品中或该突变体中IgE之间的反应性的水平。对该样品中或该突变体中IgE之间的反应性的水平的估计可用任何已知的免疫测定来实施。
定义
在本发明中，表达“与该天然存在的变态反应原的IgE结合能力相比减少特异性IgE结合能力”指在至少一个免疫测定中，该减少是以统计学显著的方式(p＜0.05)可测量的，其中的免疫测定应用来自对天然存在的变态反应原发生变态反应的被试者的血清。优选，IgE结合能力减少了至少5％，更优选至少10％。
表达“表面暴露的氨基酸”指氨基酸残基这样位于三维结构的表面：当变态反应原在溶液中时，氨基酸残基的至少一个原子的至少一部分可接触周围溶剂。优选，在三维结构中的氨基酸残基具有至少20％的溶剂(水)可接近性，适当地为至少30％，更适当地为至少40％且最优选地为至少50％。
表达“溶剂可接近性”定义为对具有与溶剂分子相当半径的球体(水，r＝1.4)是可接近的分子面积。
表达“表面暴露的”和“溶剂暴露的”可互换使用。
表达“天然存在的变态反应原所源自的分类学物种”指分类学系统中的物种。
此外，表达“该变态反应原突变体具有与该天然存在的变态反应原基本相同的α-碳主链三级结构”指当比较结构时，对原子坐标的平均根均方偏差低于2。
在本发明中，表达“替换”指与天然存在的变态反应原的氨基酸序列相比的氨基酸缺失、替换或加成。
本发明通过下面非限制性的实施例进一步地进行阐明。
实施例
实施例1
实施例1描述了具有1个或3个初级突变的重组变态反应原突变体的制备。根据本发明的重组变态反应原突变体，即包含至少4个初级突变的变态反应原可用相同的程序来制备。
Fagales花粉变态反应原中共同抗原决定部位的确定
主要桦木花粉变态反应原Bet v 1显示与来自分类学相关的树木花粉的主要变态反应原有约90％的氨基酸序列一致性，即Fagales(例如榛子和角树)和桦木花粉变态反应患者常显示对这些Bet v 1同源蛋白质变态反应交叉反应性的临床症状。
Bet v 1也显示与在某些水果(例如苹果和樱桃)和蔬菜(例如芹菜和胡萝卜)中存在的变态反应蛋白质有约50～60％的序列一致性，且有临床证据显示Bet v 1和这些食物相关的蛋白质之间的变态反应交叉反应性。
另外，Bet v 1与一组称为病原体相关的蛋白质(PR-10)的植物蛋白质享有显著的序列一致性(20～40％)，然而对这些PR-10蛋白质的变态反应交叉反应性没有报道。
分子模型暗示因与Bet v 1结构近乎相同，Fagales和食物变态反应原和PR-10蛋白质的结构相近。
变态反应性Bet v 1的交叉反应性的结构基础报道于(Gajhede等人1996，参考文献17)，其中可以确定Bet v 1分子表面的3个区块同已知的主要树木花粉变态反应原相同。因而，识别Bet v 1上这些区块的任何IgE将能够交叉反应并结合到其他Fagales主要花粉变态反应原上，从而引起变态反应症状。对这3个共同区块的确定是在将主要树木花粉变态反应原所有已知的氨基酸序列比对结合对报道于参考文献17中的α-碳主链三级结构所揭示的Bet v 1分子表面的分析之后进行。另外，基于结合有抗体后被覆盖的面积这些区块界定为具有确定的最小尺寸(＞4002)。
用于定点突变的氨基酸残基的选择
用于定点突变的氨基酸残基选自存在于Bet v 1特异区域和共同区块的残基，因为对这些残基的修饰预期可影响其与来自大多数表现临床树木花粉变态反应交叉反应性的患者的血清IgE的结合。
各个区块中每个氨基酸残基溶剂暴露的相对方向和百分比基于其原子坐标来计算。由于可能导致破坏结构或缺乏抗体相互作用，而不认为具有低程度的溶剂暴露(＜20％)的残基与诱变相关。剩下的残基根据其溶剂暴露的程度分级。
序列比对
与所考察序列(Bet v 1 No.2801，WHO IUIS变态反应原命名小组委员会)同源的序列是通过BLAST检索(Altschul等人，参考文献18)在GenBank和EMBL序列数据库中得来。将BLAST报告的概率小于0.1的所有序列进行考察，且构建含有不重复同源序列列表的列表。这些序列通过CLUSTAL W(Higgins等人，参考文献19)进行比对，且一致性百分比考虑了全部列表或单独分类学相关的物种对序列中的每个位置进行计算。总计有122个序列与Bet v 1 No.2801同源，其中的57个序列源自分类学相关的物种。
编码Bet v 1的基因的克隆
通过酚抽提和LiCl沉淀从白桦(Betula verrucosa)花粉(Allergon，瑞典)制备RNA。Oligo(dT)-纤维素亲和层析是在Eppendorph管中以分批方式进行，且双链的cDNA是用商品试剂盒(Amersham)合成。通过PCR扩增编码Bet v 1的DNA并克隆。简单扼要地，PCR以cDNA作为模板进行，其引物设计为分别在相应于Bet v 1的氨基端和3’-非翻译区的位置与cDNA的序列相配对。将引物在5’-端延长以包含限制酶切位点(NcoI和HindIII)以定向克隆入pKK233-2。
亚克隆入pMAL-c
将编码Bet v 1的基因随后亚克隆入麦芽糖结合蛋白质融合载体pMAL-c(New England Biolabs)。将该基因通过PCR扩增并在malE的框内亚克隆以生成麦芽糖结合蛋白质(MBP)-Bet v 1蛋白质融合操纵子，其中MBP和Bet v 1由因子Xa蛋白酶切割位点分隔，该位点被定位于当切割后可恢复原来的Bet v 1氨基端序列的位置，如在参考文献15中所描述。简单扼要地，PCR以插入了Bet v 1的pKK233-3作为模板，且其引物分别相应于蛋白质的氨基-和羧基端。将接近启动子的引物在5’-端延长以包含在框内编码因子Xa蛋白酶切割位点的4个密码子。将两个引物都在5’-端延长以包含限制酶切位点(Kpn I)以进行克隆。将编码Bet v 1的基因用20个循环的PCR进行亚克隆以减少PCR假象的频率。
体外诱变
体外诱变以插入了Bet v 1的重组pMAL-c作为模板经过PCR进行。每个突变体Bet v 1基因都是用4个引物由3次PCR来生成的。
合成2个包含每个突变的突变特异性寡核苷酸引物，每个DNA链对应1个，参见图1和2。用突变的核苷酸作为起始位点，两个引物都在5’-端延长7个核苷酸，而在3’-端延长15个核苷酸。延长的核苷酸在序列上与实际区域的Bet v 1基因相同。
此外合成了2个通用引物(图2标为“全有义”和“全无义”)并用于所有突变体。这些引物长为15个核苷酸且在序列上与pMAL-c载体中Bet v 1的上游和下游约1千碱基对(kb)处区域的序列相应。上游引物的序列衍生自有义链而下游引物的序列衍生自无义链，参见图2。
基本根据标准程序进行2个独立的PCR反应(Saiki等人1988，参考文献20)，只进行20次循环变温以减少PCR假象的频率。每个PCR反应都使用插入了Bet v 1的pMAL-c作模板且一个突变特异的引物和一个通用引物形成有意义的组合。
在三重区块突变体中引入4个氨基酸替换(Asn28Thr，Lys32Gln，Glu45Ser，Pro108Gly)如上所述按一步一步的方法进行。首先，用插入了Bet v 1 No.2801、Bet v 1(Glu45Ser)、Bet v 1(Glu45Ser，Pro108Gly)的pMAL-c作为模板来分别引入Glu45Ser突变，然后是Pro108Gly突变，最后是Asn28Thr，Lys32Gln突变。
用琼脂糖凝胶电泳和电洗脱及随后的乙醇沉淀纯化PCR产物。第三次PCR反应使用来自前两次PCR反应产物的组合作为模板和两个通常可适用的引物来进行。再次使用标准PCR的20次循环。将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳和电洗脱及随后的乙醇沉淀进行纯化，用限制性内切酶(BsiW I/EcoR I)进行切割，并定向地连接入用相同的酶限制酶切的插入了Bet v 1的pMAL-c中。
图3表示所有9个Bet v 1突变的概述，其如下：
Thr10Pro、Asp25Gly、Asn28Thr+Lys32Gln、Glu45Ser、Asn47Ser、Lys55Asn、Glu60Ser(非区块的)、Thr77Ala和Pro108Gly。也制备具有4个突变的额外的突变体(Asn28Thr、Lys32Gln、Glu45Ser、Pro108Gly)。在这些突变中，选择5个以进行进一步的检验：Asn28Thr+Lys32Gln、Glu45Ser、Glu60Ser、Pro108Gly和三重区块突变体Asn28Thr、Lys32Gln、Glu45Ser、Pro108Gly。
核苷酸测序
对Bet v 1编码基因核苷酸序列的确定分别在亚克隆前后及随后的体外诱变中进行。
按照供应商的建议，将来自10ml在补充了0.1g/l氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜至饱和的细菌培养物的质粒DNA用Qiagen-tip20柱进行纯化并用测序酶(Sequenase)2.0型DNA测序试剂盒(USB)进行测序。
重组Bet v 1和突变体的表达和纯化
如在参考文献15中所述，将重组Bet v 1(Bet v 1 No.2801和突变体)在大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α中过量表达，融合到麦芽糖结合蛋白质上并纯化。简要地，使重组大肠杆菌细胞在37℃生长到436nm光密度为1.0，随之Bet v 1融合蛋白质的表达由添加IPTG来诱导。在诱导后3小时通过离心来收集细胞，并重悬于裂解缓冲液中并用超声断裂。在超声处理和额外的离心之后，通过直链淀粉亲和层析分离重组的融合蛋白质并随后通过与因子Xa温育来切割(参考文献15)。在F Xa切割后，将重组Bet v 1用凝胶过滤来分离，且如果发现必要的话，进行另一轮的直链淀粉亲和层析以除去痕量的麦芽糖结合蛋白质。
将纯化的重组Bet v 1超滤浓缩为约5mg/ml并贮存于4℃。纯化的重组Bet v 1制备物的终产量为每升大肠杆菌细胞培养物2～5mg。
纯化的重组Bet v 1制备物经银染SDS-聚丙烯酰胺电泳后显示单一的表现分子量为17.5kDa的条带。N-末端的测序显示预期的序列为衍生自cDNA核苷酸序列，且定量的氨基酸分析显示预期的氨基酸组合物。
我们在前面显示(参考文献15)重组Bet v 1 No.2801与天然存在的Bet v 1在免疫化学上不能区别。
用兔多克隆抗体的免疫电泳
以重组Bet v 1蛋白质的形式生产了7个突变体Bet v 1并如上所述进行了纯化，然后检验它们对多克隆兔抗体的反应性，该抗体由对抗从桦木花粉中分离的Bet v 1而产生。当在天然条件下经免疫电泳(火箭线(rocket-line)免疫电泳)进行分析时，兔抗体能够沉淀所有的突变体，显示这些突变体具有保守的α-碳主链三级结构。
为了分析对人多克隆IgE反应的作用，选择了突变体Glu45Ser、Pro108Gly、Asn28Thr+Lys32Gln和Glu60Ser进行进一步的分析。
Bet v 1 Glu45Ser突变体
位置45的谷氨酸显示了高度的溶剂暴露(40％)，并定位于Fagales变态反应原所共有的分子表面区块(区块I)。在一些Bet v1同源的PR-10蛋白质中发现丝氨酸残基占具位置45，这表示谷氨酸可被丝氨酸替换而不使α-碳主链三级结构发生变形。另外，由于没有已知的Fagales变态反应原序列在位置45具有丝氨酸，谷氨酸被丝氨酸替换则产生了一个非天然存在的Bet v 1分子。
用重组的Glu45Ser Bet v 1突变体进行T细胞增殖测定
该分析以如Spangfort等人1996a描述方法进行。发现重组Betv 1 Glu45Ser突变体能够诱导来自3种不同的桦木花粉变态反应患者中的T细胞系的增殖，其刺激指数与重组体的和天然存在的情况相似。
重组的Glu45Ser Bet v 1的结晶和结构确定
重组G1u45Ser Bet v 1的晶体于25℃由蒸气扩散来生长，基本如在(Spangfort等人1996b，参考文献21)中所述。将浓度为5mg/ml的Glu45Ser Bet v 1与相同体积的2.0M的硫酸铵、0.1M的柠檬酸钠、1％(v/v)的二氧六环，pH6.0的溶液混合，并对100x体积的2.0M的硫酸铵、0.1M的柠檬酸钠、1％(v/v)的二氧六环，pH6.0的溶液进行平衡。平衡24小时之后，通过采用在参考文献21中所描述的加晶种技术来诱导晶体生长，这里用重组的野生型Bet v 1作为晶种来源。
2个月后，收获晶体并用如参考文献21所述从Rigaku旋转阳极生成的X-射线进行分析，且该结构用分子置换(molecularreplacement)来解决。
Bet v 1 Glu45Ser突变体的结构
突变的结构作用通过生长三维Bet v 1 Glu45Ser蛋白质晶体而陈述，当用旋转阳极生成的X-射线进行分析时该晶体衍射为3.0的分辨率。位置45上谷氨酸到丝氨酸的替换通过Bet v 1 Glu45Ser的结构电子密度图象证实，该图象也显示总的α-碳主链三级结构保守。
Bet v 1 Glu45Ser突变体的IgE结合性质
在液相IgE抑制测定中比较Bet v 1 Glu45Ser突变体与重组Betv 1的IgE结合性质，该测定使用衍生自桦木变态反应患者的血清IgE库。
重组Bet v 1 no.2801以摩尔比为1∶5进行生物素化(Bet v 1 no.2801：生物素)。抑制测定进行如下：将血清样品(25μl)与固相抗IgE温育，洗涤，重悬并进一步在生物素化的Bet v 1 no.2801(3.4nM)和给定的突变体(0～28.6nM)的混合物中温育。结合到固相的生物素化的Bet v 1 no.2801的量通过在用丫啶酯(acridiniumester)标记的链酶抗生物素温育后测量RLU来估计。抑制的程度计算为用缓冲液和突变体作为抑制备物所获得的RLU的比率。
图4表示由非生物素化的Bet v 1和Bet v 1 Glu45Ser突变体抑制生物素化的重组Bet v 1对来自变态反应患者库的血清IgE的结合。
对存在于血清库中的血清IgE的结合达到50％的抑制所必需的各种重组蛋白质的量有明显的差别。重组Bet v 1在约6.5ng即达到了50％的抑制，而相应的Bet v 1 Glu45Ser突变体的浓度为约12ng。这显示在Bet v 1 Glu45Ser突变体中引入的点突变以约2的系数降低了特异性血清IgE的亲和力。由Bet v 1 Glu45Ser突变体达到的最高抑制水平与重组Bet v 1相比明显较低。这可能显示在Glu45Ser替换之后，一些存在于血清库中的特异性IgE不能识别Bet v 1Glu45Ser突变体。
Bet v 1突变体Asn28Thr+Lys32Gln
位置28和32的天冬氨酸和赖氨酸分别显示了高度的溶剂暴露(分别为35％和50％)，并位于Fagales变态反应原所共同的分子表面区块(区块II)。在结构中，天冬氨酸28和赖氨酸32相互靠近地位于分子表面，且极可能通过氢键相互作用。在一些与Bet v 1同源的PR-10蛋白质中发现苏氨酸和谷氨酸残基分别占具位置28和32，这表明天冬氨酸和赖氨酸可分别被苏氨酸和谷氨酸替换而不使α-碳主链三级结构发生变形。另外，由于没有已知的天然发生的异变态反应原序列在位置28和32分别具有苏氨酸和谷氨酸，则这些替换产生了一个非天然存在的Bet v 1分子。
Bet v 1突变体Asn28Thr+Lys32Gln的IgE结合性质
在液相IgE抑制测定中比较突变体Asn28Thr+Lys32Gln与重组Bet v 1的IgE结合性质，该测定使用上述衍生自桦木变态反应患者的血清IgE库。
图5表示由非生物素化的Bet v 1和由Bet v 1突变体Asn28Thr+Lys32Gln抑制生物素化的重组Bet v 1与来自变态反应患者库的血清IgE的结合。
对存在于血清库中的血清IgE的结合达到50％的抑制所必需的各种重组蛋白质的量有明显的差别。重组Bet v 1在约6.5ng即达到了50％的抑制，而相应的Bet v 1突变体Asn28Thr+Lys32Gln的浓度为约12ng。这显示在Bet v 1突变体Asn28Thr+Lys32Gln中引入的点突变以约2倍的系数降低其特异性血清IgE的亲和力。
由Bet v 1突变体Asn28Thr+Lys32Gln达到的最高抑制水平与重组Bet v 1相比明显较低。这可能显示在Asn28Thr+Lys32Gln替换之后，一些存在于血清库中的特异性IgE不能识别Bet v 1突变体Asn28Thr+Lys32Gln。
Bet v 1突变体Pro108Gly
位置108的脯氨酸显示了高度的溶剂暴露(60％)，并位于Fagales变态反应原所共同的分子表面区块(区块III)。在一些与Betv 1同源的PR-10蛋白质中发现甘氨酸残基占具位置108，这表明脯氨酸可被甘氨酸替换而不使α-碳主链三级结构发生变形。另外，由于没有已知的异变态反应原序列在位置108具有甘氨酸，脯氨酸被甘氨酸的替换则产生一个非天然存在的Bet v 1分子。
Bet v 1 Pro108Gly突变体的IgE结合性质
在液相IgE抑制测定中比较Bet v 1 Pro108Gly突变体与重组Betv 1的IgE结合性质，该测定使用上述衍生自桦木变态反应患者的血清IgE库。
图6表示由非生物素化的Bet v 1和由Bet v 1 Pro108Gly突变体抑制生物素化的重组Bet v 1与来自变态反应患者库的血清IgE的结合。
对存在于血清库中的血清IgE的结合达到50％的抑制所必需的各个重组蛋白质的量有明显的差别。重组Bet v 1在约6.5ng即达到了50％的抑制，而相应的Bet v 1 Pro108Gly突变体的浓度为约15ng。这显示在Bet v 1 Pro108Gly突变体中引入的点突变以约2倍的系数降低了特异性血清IgE的亲和力。
由Bet v 1 Pro108Gly突变体达到的最高抑制水平与重组Bet v 1相比明显较低。这可能显示在Pro108Gly替换之后，一些存在于血清库中的特异性IgE不能识别Bet v 1 Pro108Gly突变体。
Bet v 1突变体Glu60Ser(非区块突变体)
位置60的谷氨酸显示了高度的溶剂暴露(60％)，然而它不位于Fagales变态反应原所共同的分子表面区块内。在一些与Bet v 1同源的PR-10蛋白质中发现丝氨酸残基占具位置60，这表明谷氨酸可被丝氨酸替换而不使α-碳主链三级结构发生变形。另外，由于没有已知的异变态反应原序列在位置60具有丝氨酸，谷氨酸被丝氨酸的替换则产生一个非天然存在的Bet v 1分子。
Bet v 1 Glu60Ser突变体的IgE结合性质
在液相IgE抑制测定中比较Bet v 1 Glu60Ser突变体与重组Betv 1的IgE结合性质，该测定使用上述衍生自桦木变态反应患者的血清IgE库。
图7表示由非生物素化的Bet v 1和由Bet v 1 Glu60Ser突变体抑制生物素化的重组Bet v 1与来自变态反应患者库的血清IgE的结合。与Glu45Ser、Pro108Gly和Asn28Thr+Lys32Gln突变体相反，谷氨酸60到丝氨酸的替换不显示对IgE结合性质有任何显著的作用。这显示在定义的Fagales共同区块之外的替换对特异性血清IgE的结合仅具有少量作用，这支持了保守的变态反应原分子表面包含主要IgE结合抗原决定部位的概念。
Bet v 1三重区块突变体
在三重区块突变体中，将如上所述在3个不同的共同Fagales区块引入的点突变(Glu45Ser、Asn28Thr+Lys32Gln和Pro108Gly)同时引入以造成具有4个氨基酸替换的人工突变体。
Bet v 1三重区块突变体的结构分析
纯化的Bet v 1三重区块突变体的结构完整性用圆二色(CD)谱学分析。图8显示以近乎相同的浓度记录的重组的和三重区块突变体的CD谱。来自2个重组蛋白质的CD谱中峰幅和位置的交迭显示2种制备物含有等量的二级结构，这强有力地暗示α-碳主链三级结构没有受到引入的氨基酸替换的影响。
Bet v 1三重区块突变体的IgE结合性质
在液相IgE抑制测定中比较Bet v 1三重区块突变体与重组Bet v1的IgE结合性质，该测定使用上述衍生自桦木变态反应患者的血清IgE库。
图9表示由非生物素化的Bet v 1和由Bet v 1三重区块突变体抑制生物素化的重组Bet v 1与来自变态反应患者库的血清IgE的结合。与上述的单独的突变体相反，三重区块突变体抑制曲线相对于重组体不再平行。这显示在三重区块突变体中引入的替换与重组体相比改变了IgE结合性质和抗原决定部位的外形。平行性的缺乏使得很难定量三重区块突变体对特异性血清IgE亲和力的降低。
重组Bet v 1在约6ng即达到了50％的抑制，而相应的Bet v 1三重区块突变体的浓度为约30ng，即亲和力以系数5倍降低。然而，为了达到80％的抑制，相应的值分别为20ng和400ng，即以系数20降低。
用重组Bet v 1三重区块突变体进行T细胞增殖测定
该分析以如参考文献15中所述方法实施。发现重组Bet v 1三重区块突变体能够诱导来自3个不同的桦木花粉变态反应患者中的T细胞系的增殖，其刺激指数与重组体的和天然存在的情况相似。这暗示三重区块突变体可以起始抗体生产所必需的细胞免疫反应。
实施例2
实施例2描述了具有1个初级突变的重组变态反应原突变体的制备。根据本发明的重组变态反应原突变体，即包含至少4个初级突变的变态反应原可用相同的程序来制备。
Vespula Vulgaris毒液主要变态反应原抗原5中共同抗原决定部
位的确定
抗原5是3个黄蜂毒液蛋白质之一，它们是已知的人变态反应原。黄蜂包括大黄蜂类、小黄蜂和黄蜂。另外2个已知的黄蜂毒液变态反应原是磷脂酶A1和透明质酸酶。来自Vespula Vulgaris(Ves v5)的抗原5已在酵母体系中被克隆及表达为重组蛋白质(Monsalve等人1999，参考文献22)。最近已经以1.8的分辨率确定重组Vesv 5的三维晶体结构(准备中)。该结构的主要特征由4个β-链和4个α-螺旋排列在3个堆积层形成“α-β-α三明治”组成。在来自不同黄胡蜂属(Vespula)物种的抗原5同源变态反应原之间的序列一致性为约90％，这暗示存在保守的分子表面区域和B细胞抗原决定部位。
如前文对3个花粉变态反应原的描述，共同区块的存在和确定在对黄胡蜂属抗原5变态反应原所有已知的氨基酸序列进行比对结合对由Ves v 5的三维结构揭示的抗原5的分子表面分析之后进行。图10显示单独比对的抗原5残基的溶剂可接近性及黄胡蜂属抗原5序列的比对(左图版)。在图10的右图版显示了黄胡蜂属抗原5的分子表面，其中有色区域表示保守区。
用于定点突变的氨基酸戎基的选择
用于定点突变的氨基酸残基选自存在于黄胡蜂属共同区块的残基，这是因为对这些残基的修饰预期可影响血清IgE的结合，这些血清IgE来自大多数表现临床黄胡蜂属变态反应交叉反应性的患者。
各个区块中每个氨基酸残基溶剂暴露的相对方向和百分比基于其原子坐标来计算。由于可能的结构破坏或缺乏抗体相互作用，而不认为具有低程度溶剂暴露的残基适用于诱变。剩下的残基根据它们溶剂暴露的程度来分级。
编码Ves v 5的基因的克隆
总RNA以如在(Fang等人1988，参考文献23)中所描述的方法从Vespula Vulgaris黄蜂的毒液酸腺中分离。
第一链cDNA的合成、PCR扩增和Ves v 5基因的克隆以如(Lu等人1993，参考文献24)中所述方法进行。
亚克隆入pPICZαA
将编码Ves v 5的基因随后亚克隆入pPICZαA载体中(Invitrogen)以得到Ves v 5在毕赤巴斯德酵母(pichia pastoris)中的分泌表达。将该基因通过PCR扩增并以同啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-因子分泌信号的编码序列框相匹配地亚克隆。在该构建体中，α-因子在蛋白质分泌期间将由毕赤巴斯德酵母Kex2蛋白酶体系在体内。
简单扼要地，PCR以Ves v 5作为模板的，其引物分别相应于蛋白质的氨基-和羧基端。将引物在5’-端延长以分别包含用于克隆的限制酶切位点EcoR I和Xba I。编码Kex2切割位点的核苷酸在这个构建体中位于蛋白质氨基端上游18个核苷酸处，导致Ves v 5在氨基末端具有6个额外的氨基酸Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Phe的表达。
将pPICZαA-Ves v 5插入到毕赤巴斯德酵母中
插入了Ves v 5基因的pPICZαA载体经过Sac I限制酶切而线性化并插入到毕赤巴斯德酵母基因组的AOX1座位。插入是依照Invitrogen的建议通过在毕赤巴斯德酵母KM71细胞中同源重组而进行。
体外诱变
体外诱变以插入了Ves v 5的重组pPICZαA作为模板经过PCR进行。每个突变体Ves v 5基因都使用4个引物由3次PCR来生成。
合成2个包含每种突变的突变特异性寡核苷酸引物，每个DNA链对应1个，参见图11和12。用突变的核苷酸作为起始位点，两个引物都在5’-端延长了6-7个核苷酸，而在3’-端延长了12-13个核苷酸。延长的核苷酸在序列上与实际区域的Ves v 5基因相同。
此外合成了2个通用的引物(图12标为“全有义”和“全无义”)并用于所有突变体。为了确保具有原氨基末端的Ves v 5突变体的表达，相应于蛋白质氨基末端的一个引物在5’-端延长了一个Xho I位点。当Ves v 5突变体基因插入到pPICZαA载体中时，在Ves v 5的氨基末端上游直接就再生了Kex2蛋白酶的切割位点。第二个引物在序列上相应于pPICZαA载体中位于Ves v 5基因下游约300bp的区域。相应于Ves v 5的氨基末端的引物序列衍生自有义链而下游引物的序列衍生自无义链，参见图11。
基本根据标准程序进行了2个独立的PCR反应(Saiki等人1988)，只是进行20次循环变温以减少PCR假象的频率。每个PCR反应都使用插入了Ves v 5的ppICZαA作为模板且一个突变特异性的引物和一个通用的引物形成有意义的组合。
将PCR产物用“Concert，Rapid PCR Purification System”(Life Technologies)进行纯化。第三次PCR反应使用来自前两次PCR产物的组合作为模板和两个通常可适用的引物来进行。再次使用标准PCR的20次循环。将PCR产物用“Concert，Rapid PCRPurification System”(Life Technologies)进行纯化，用限制性内切酶(XhoI/XbaI)进行切割，并定向地连接入用相同的酶限制酶切的pPICZαA载体中。图13表示所有Ves v 5突变的概况。
将nPICZαA-Ves v 5突变体插入到毕赤巴斯德酵母中
插入了Ves v 5突变体基因的pPICZαA载体经过Sac I限制酶切而线性化并插入到毕赤巴斯德酵母基因组的AOX1座位。插入依照Invitrogen的建议通过在毕赤巴斯德酵母KM71细胞中同源重组而进行。
核苷酸测序
Ves v 5编码基因核苷酸序列的确定分别在亚克隆前后及随后的体外诱变中进行。
按照供应商的建议，将来自10ml在补充了0.1g/l氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜至饱和的细菌培养物的质粒DNA用Qiagen-tip20柱进行纯化并用测序酶(Sequenase)2.0型DNA测序试剂盒(USB)进行测序。
重组Ves v 5的表达和纯化
毕赤巴斯德酵母菌株KM71的重组酵母细胞在30℃于定轨摇床，225rpm，在500ml的瓶中生长直到A600nm为4-6，瓶中含有100ml包含酵母氮碱、生物素、甘油和组氨酸的pH6.0的磷酸缓冲液。细胞经离心收集，并重悬于10mL的相似的用甲醇替换了甘油的缓冲培养基中。于30℃继续温育7天，每天添加0.05ml甲醇。
细胞经离心收获，且收集的培养物流体通过超滤来浓缩。在对50mM的醋酸铵缓冲液，pH4.6透析之后，将样品应用于在相同缓冲液中平衡的FPLC(Pharmacia)SE-53阳离子交换柱。该柱用0-1.0M的NaCl，50mM醋酸铵线性梯度进行洗脱。收集在约0.4M的NaCl洗脱出的重组Ves v 5峰并对0.02N的乙酸进行透析。在浓缩到约为10mg/ml之后，将纯化的Ves v 5保存于4℃。
重组Ves v 5的结晶
Ves v 5的晶体于25℃用蒸气扩散技术来生长。为了结晶，将5μl 5mg/ml的Ves v 5与5μl含18％的PEG 6000、0.1M的柠檬酸钠，pH6.0的溶液混合，并对1ml含18％的PEG 6000、0.1M的柠檬酸钠，pH6.0的溶液进行平衡。
X-射线衍射数据于100K从天然Ves v 5晶体及插入重原子衍生物之后收集，并用于解析Ves v 5的三维结构，参见图10(原稿在准备中)。
用兔多克隆抗体的免疫电泳
以重组Ves v 5蛋白质的形式生产2个Ves v 5突变体并检验了它们对多克隆兔抗体的反应性，该抗体是对抗重组Ves v 5而产生的。当在天然条件下经火箭免疫电泳进行分析时，兔抗体能够沉淀重组Ves v 5以及两种突变体，显示这些突变体具有保守的α-碳主链三级结构。
特异性血清IgE的抑制
在液相IgE抑制测定中比较Ves v 5突变体与重组Ves v 5的IgE结合性质，该测定使用衍生自黄蜂毒液变态反应患者的血清IgE库。
抑制测定如上文所述用生物素化的重组Ves v 5代替Bet v 1进行。
Ves v 5 Lys72Ala突变体
位置72的赖氨酸显示高度的溶剂暴露(70％)，并位于黄胡蜂属抗原5所共同的分子表面区块。溶剂暴露的相对方向和高程度的溶剂暴露说明赖氨酸72可被丙氨酸残基替换而不使α-碳主链三级结构发生变形。另外，由于没有已知的异变态反应原序列在位置72具有丙氨酸，赖氨酸被丙氨酸的替换则产生了一个非天然存在的Ves v 5分子。
Ves v 5 Lys72Ala突变体的IgE结合性质
在液相IgE抑制测定中比较Ves v 5 Lys72Ala突变体与重组Vesv 5的IgE结合性质，该测定使用上述衍生自桦木变态反应患者的血清IgE库。
图14表示由非生物素化的Ves v 5和Ves v 5 Lys72Ala突变体抑制生物素化的重组Ves v 5与来自变态反应患者库的血清IgE的结合。
对存在于血清库中的血清IgE的结合达到50％的抑制所必需的各个重组蛋白质的量有明显的差别。重组Ves v 5在约6ng即达到了50％的抑制，而相应的Ves v 5 Lys72Ala突变体的浓度为40ng。这显示在Ves v 5 Lys72Ala突变体中引入的点突变以约6倍的系数降低了特异性血清IgE的亲和力。由Ves v 5 Lys72Ala突变体达到的最高抑制水平与重组Ves v 5相比明显较低。这可能显示在Lys72Ala替换之后，一些存在于血清库中的特异的IgE不能识别Ves v 5 Lys72Ala突变体。
Ves v 5 Tyr96Ala突变体
位置96的酪氨酸显示了高度的溶剂暴露(65％)，并位于黄胡蜂属抗原5所共同的分子表面区块。溶剂暴露的相对方向和高的溶剂暴露程度表明酪氨酸96可被丙氨酸残基替换而不使α-碳主链三级结构发生变形。另外，由于没有已知的异变态反应原序列在位置96具有丙氨酸，酪氨酸被丙氨酸的替换则产生了一个非天然存在的Ves v5分子。
Ves v 5 Tyr96Ala突变体的IgE结合性质
在液相IgE抑制测定中比较Ves v 5 Tyr96Ala突变体与重组Vesv 5的IgE结合性质，该测定使用上述衍生自桦木变态反应患者的血清IgE库。
图14表示由非生物素化的Ves v 5和由Ves v 5 Tyr96Ala突变体抑制生物素化的重组Ves v 5与来自变态反应患者库的血清IgE的结合。
对存在于血清库中的血清IgE的结合达到50％的抑制所必需的各个重组蛋白质的量中有明显的差别。重组Ves v 5在约6ng即达到了50％的抑制，而相应的Ves v 5 Tyr96Ala突变体的浓度为40ng。
这显示在Ves v 5 Tyr96Ala突变体中引入的点突变以约6倍的系数降低了特异性血清IgE的亲和力。
由Ves v 5 Tyr96Ala突变体达到的最高抑制水平与重组Ves v 5相比明显较低。这可能显示在Tyr96Ala替换之后，一些存在于血清库中的特异性IgE不能识别Ves v 5 Tyr96Ala突变体。
实施例3
对用于替换的氨基酸的确定和选择
用溶剂可接近性和保守程度参数来确定和选择适合于对变态反应原Bet v 1、Der p 2和Ves v 5进行替换的表面暴露的氨基酸。
溶剂可接近性
溶剂可接近性用软件InsightII版本97.0(MSI)和1.4的探测半径来计算。
通过使用软件PASS(推定的球体活性位点)以探针充满而从分析中排除内部腔。随后手动去除表面的探针。
保守性
Bet v 1：
3-D结构基于访问号Z80104(1bv1.pdb)。
包括在保守残基分析中的38个其他的Bet v 1序列包含访问号：
P15494＝X15877＝Z80106、Z80101、AJ002107、Z72429、AJ002108、Z80105、Z80100、Z80103、AJ001555、Z80102、AJ002110、Z72436、P43183＝X77271、Z72430、AJ002106、P43178＝X77267、P43179＝X77268、P43177＝X77266、Z72438、P43180＝X77269、AJ001551、P43185＝X77273、AJ001557、Z72434、AJ001556、Z72433＝P43186、AJ001554、X81972、Z72431、P45431＝X77200、P43184＝X77272、P43176＝X77265、S47250、S47251、Z72435、Z72439、Z72437、S47249。
Der p 2：
3-D结构基于访问号P49278(1a9v.pdb)的。
包括在保守残基分析中的6个其他的Der p 2序列包含下列替换：
ALK-G：V40L、T47S、M111L、D114N。
ALK-101：M76V。
ALK-102：V40L、T47S。
ALK-104：T47S、M111I、D114N。
ALK-113：T47S。
ALK-120：V40L、T47S、D114N。
Ves v 5：
3-D结构基于访问号Q05110(pdb坐标尚未发表)。
在保守残基分析中的另一个Ves v 5序列含有一个氨基酸替换：M202K。
结果
Bet v 1
高溶剂暴露的59个氨基酸：
K-129、E-60、N-47、K-65、P-108、N-159、D-93、K-123、K-32、D-125、R-145、D-109、T-77、E-127、Q-36、E-131、L-152、E-6、E-96、D-156、P-63、H-76、E-8、K-134、E-45、T-10、V-12、K-20、L-62、S-155、H-126、P-50、N-78、K-119、V-2、L-24、E-42、N-4、A-153、I-44、E-138、G-61、A-130、R-70、N-28、P-35、S-149、K-103、Y-150、H-154、N-43、A-106、K-115、P-14、Y-5、K-137、E-141、E-87、E-73。
高度溶剂暴露且保守(＞70％)的57个氨基酸：
K-129、E-60、N-47、K-65、P-108、N-159、D-93、K-123、K-32、D-125、R-145、D-109、E-127、Q-36、E-131、L-152、E-6、E-96、D-156、P-63、H-76、E-8、K-134、E-45、T-10、V-12、K-20、S-155、H-126、P-50、N-78、K-119、V-2、L-24、E-42、N-4、A-153、I-44、E-138、G-61、A-130、R-70、N-28、P-35、S-149、K-103、Y-150、H-154、N-43、A-106、K-115、P-14、Y-5、K-137、E-141、E-87、E-73。
进行的23个突变：
Y5V、T10P、D25E、N28T、K32Q、E42S、E45S、N47S、K55N、K65N、T77A、N78K、E96L、K97S、K103V、P108G、D109N、K123I、D125Y、K134E、R145E、D156H、+160N。
表1以下降顺序表示Bet v 1氨基酸的溶剂暴露程度的列表。第1列列出起始于氨基末端的氨基酸号码，第2列以单字母缩写列出了氨基酸，第3列列出正规化的溶剂暴露指数，第4列列出了已知序列在该位置具有保守氨基酸的百分数。
表1：Bet v 1
NO AA Solv_exp Cons％
129K 1,000 90
60E 0,986 97
47N 0,979 100
65K 0,978 100
108P 0,929 100
159N 0,869 100
93D 0,866 100
123K 0,855 100
32K 0,855 100
125D 0,821 74
145R 0,801 90
109D 0,778 82
77T 0,775 56
127E 0,760 100
36Q 0,749 95
131E 0,725 100
152L 0,718 97
6E 0,712 100
96E 0,696 100
156D 0,693 97
63P 0,692 97
76H 0,683 90
8E 0,638 97
134K 0,630 100
45E 0,623 100
10T 0,613 97
12V 0,592 100
20K 0,584 100
62L 0,575 5
155S 0,568 97
126H 0,551 95
50P 0,541 100
78N 0,538 100
119K 0,529 100
2V 0,528 100
24L 0,528 100
42E 0,519 100
4N 0,517 95
153A 0,513 100
44I 0,508 97
138E 0,496 100
61G 0,488 100
130A 0,479 97
70R 0,474 100
28N 0,469 90
35P 0,467 100
149S 0,455 92
103K 0,447 100
150Y 0,438 100
154H 0,436 100
43N 0,412 100
106A 0,411 95
115K 0,411 100
14P 0,410 97
5Y 0,410 100
137K 0,396 100
141E 0,387 95
87E 0,385 100
73E 0,384 100
16A 0,367 100
79F 0,362 100
3F 0,355 100
158Y 0,346 100
105V 0,336 100
101E 0,326 100
64F 0,325 100
86I 0,322 100
39S 0,314 100
124G 0,310 100
72D 0,308 97
142T 0,293 67
66Y 0,289 100
55K 0,288 100
7T 0,279 67
40S 0,274 95
25D 0,271 87
135A 0,267 92
68K 0,262 100
97K 0,247 100
46G 0,235 100
27D 0,232 97
1G 0,227 100
113I 0,225 77
51G 0,220 100
92G 0,218 100
80K 0,212 100
110G 0,211 100
107T 0,203 85
94T 0,202 92
41V 0,201 97
48G 0,198 100
91I 0,192 18
31P 0,188 100
75D 0,188 97
33V 0,183 100
49G 0,176 100
17R 0,172 100
99S 0,158 64
89G 0,154 100
53I 0,154 100
121H 0,153 100
9T 0,150 72
74V 0,148 97
132Q 0,146 72
57S 0,137 49
148E 0,135 100
82N 0,133 41
128V 0,125 64
117S 0,124 87
90P 0,117 67
116I 0,112 100
122T 0,107 100
139M 0,104 62
95L 0,104 97
54K 0,096 100
146A 0,095 100
59P 0,088 97
157A 0,088 100
133V 0,077 44
88G 0,068 100
140G 0,053 85
37A 0,042 95
81Y 0,041 100
23I 0,036 95
104I 0,036 92
15A 0,036 97
58F 0,029 100
29L 0,028 100
19F 0,027 100
100N 0,022 97
22F 0,021 97
71V 0,014 100
111G 0,014 100
13I 0,014 100
18L 0,014 97
114L 0,014 100
11S 0,007 100
151L 0,007 97
144L 0,007 90
52T 0,007 100
84S 0,007 97
118N 0,007 97
102I 0,007 100
21A 0,000 97
26G 0,000 97
30F 0,000 44
34A 0,000 100
38I 0,000 87
56I 0,000 100
67V 0,000 97
69D 0,000 62
83Y 0,000 95
85V 0,000 72
98I 0,000 95
112S 0,000 77
120Y 0,000 95
136S 0,000 67
143L 0,000 100
147V 0,000 100
Der p 2
高度溶剂暴露的55个氨基酸：
R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、D-114、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109、K-15。
高度溶剂暴露且保守(＞70％)的57个氨基酸：
R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109、K-15。
进行的6个突变：
K6A、K15E、H30N、E62S、H74N、K82N
表2以下降顺序表示Des p 2氨基酸的溶剂暴露程度的列表。第1列列出起始于氨基末端的氨基酸号码，第2列以单字母缩写列出氨基酸，第3列列出正规化的溶剂暴露指数，第4列列出了已知序列在该位置具有保守氨基酸的百分数。
表2：Der p 2
NO AA Solv_exp Cons％
128R 1,000 100
129D 0,965 100
11H 0,793 100
30H 0,712 100
1S 0,700 100
77K 0,694 100
75Y 0,681 100
31R 0,677 100
82K 0,658 100
6K 0,645 100
96K 0,643 100
48K 0,642 100
55K 0,641 100
89K 0,627 100
85Q 0,624 100
92W 0,610 100
97I 0,581 100
22H 0,568 100
65V 0,559 100
24S 0,557 100
74H 0,542 100
26K 0,542 100
61L 0,539 100
26P 0,516 100
93N 0,513 100
64D 0,509 100
28I 0,504 100
14K 0,493 100
100K 0,489 100
62E 0,454 100
127I 0,439 100
102E 0,428 100
25E 0,428 100
66P 0,427 100
114D 0,418 57
17L 0,412 100
60G 0,390 100
95P 0,388 100
53E 0,377 100
81V 0,377 100
51K 0,370 100
103N 0,369 100
2Q 0,366 100
46N 0,360 100
42E 0,357 100
91T 0,340 100
87D 0,334 100
10N 0,333 100
111M 0,325 71
8C 0,323 100
124H 0,315 100
68I 0,313 100
79P 0,307 100
109K 0,307 100
15K 0,302 100
49T 0,292 100
44N 0,291 100
113D 0,290 100
63V 0,286 100
105V 0,280 100
19P 0,270 100
84Q 0,264 100
76M 0,262 86
7D 0,251 100
116V 0,244 100
78C 0,238 100
36Q 0,235 100
45Q 0,233 100
40V 0,223 57
57S 0,212 100
38E 0,205 100
69D 0,203 100
9A 0,196 100
71N 0,190 100
98A 0,186 100
115G 0,180 100
13I 0,179 100
123T 0,179 100
34P 0,178 100
4D 0,157 100
20G 0,150 100
107T 0,143 100
12E 0,137 100
94V 0,137 100
121I 0,136 100
83G 0,128 100
70P 0,128 100
73C 0,120 100
3V 0,116 100
35F 0,111 100
59D 0,099 100
29I 0,098 100
23G 0,085 100
54I 0,075 100
5V 0,075 100
101S 0,074 100
72A 0,069 100
27C 0,060 100
32G 0,059 100
99P 0,058 100
86Y 0,056 100
16V 0,052 100
50A 0,040 100
90Y 0,039 100
18V 0,035 100
33K 0,033 100
52I 0,029 100
58I 0,029 100
104V 0,024 100
112G 0,023 100
21C 0,023 100
88I 0,023 100
117L 0,016 100
56A 0,011 100
41F 0,011 100
120A 0,006 100
119C 0,006 100
67G 0,005 100
122A 0,005 100
37L 0,000 100
39A 0,000 100
43A 0,000 100
47T 0,000 29
80L 0,000 100
106V 0,000 100
108V 0,000 100
110V 0,000 100
118A 0,000 100
125A 0,000 100
Ves v 5
高度溶剂暴露的89个氨基酸：
K-16、K-185、K-11、K-44、K-210、R-63、K-13、F-6、K-149、K-128、E-184、K-112、K-202、F-157、E-3、K-29、N-203、N-34、K-78、K-151、L-15、L-158、Y-102、W-186、K-134、D-87、K-52、T-67、T-125、K-150、Y-40、Q-48、L-65、K-81、Q-101、Q-208、K-144、N-8、N-70、H-104、Q-45、K-137、K-159、E-205、N-82、A-111、D-131、K-24、V-36、N-7、M-138、T-209、V-84、K-172、V-19、D-56、P-73、G-33、T-106、M-170、L-28、T-43、Q-114、C-10、K-60、N-31、K-47、E-5、D-145、V-38、A-127、D-156、E-204、P-71、G-26、Y-129、D-141、F-201、R-68、N-200、D-49、S-153、K-35、S-39、Y-25、V-37、G-18、W-85、I-182。
高度溶剂暴露且保守(＞70％)的88个氨基酸：
K-16、K-185、K-11、K-44、K-210、R-63、K-13、F-6、K-149、K-128、E-184、K-1 12、F-157、E-3、K-29、N-203、N-34、K-78、K-151、L-15、L-158、Y-102、W-186、K-134、D-87、K-52、T-67、T-125、K-150、Y-40、Q-48、L-65、K-81、Q-101、Q-208、K-144、N-8、N-70、H-104、Q-45、K-137、K-159、E-205、N-82、A-111、D-131、K-24、V-36、N-7、M-138、T-209、V-84、K-172、V-19、D-56、P-73、G-33、T-106、M-170、L-28、T-43、Q-114、C-10、K-60、N-31、K-47、E-5、D-145、V-38、A-127、D-156、E-204、P-71、G-26、Y-129、D-141、F-201、R-68、N-200、D-49、S-153、K-35、S-39、Y-25、V-37、G-18、W-85、I-182。
进行的9个突变：
K29A、T67A、K78A、V84S、Y102A、K112S、K144A、K202M、N203G
表3以下降顺序表示Ves v 5氨基酸的溶剂暴露程度的列表。第1列列出了起始于氨基末端的氨基酸号码，第2列以单字母缩写列出了氨基酸，第3列列出了正规化的溶剂暴露指数，第4列列出了已知序列在该位置具有保守氨基酸的百分数。
表3：Ves v 5
NO AA Solv_exp
16K 1,000 100
185K 0,989 100
11K 0,978 100
44K 0,978 100
210K 0,962 100
63R 0,956 100
13K 0,951 100
6F 0,868 100
149K 0,868 100
128K 0,857 100
184E 0,841 100
112K 0,824 100
202K 0,824 50
157F 0,819 100
3E 0,802 100
29K 0,797 100
203N 0,797 100
34N 0,775 100
78K 0,775 100
151K 0,753 100
15L 0,714 100
158L 0,714 100
102Y 0,687 100
186W 0,665 100
134K 0,654 100
87D 0,621 100
52K 0,615 100
67T 0,610 100
125T 0,610 100
150K 0,604 100
40Y 0,593 100
48Q 0,593 100
65L 0,593 100
81K 0,588 100
101Q 0,577 100
208Q 0,566 100
144K 0,560 100
8N 0,555 100
70N 0,549 100
104H 0,549 100
45Q 0,538 100
137K 0,538 100
159K 0,533 100
205E 0,511 100
82N 0,500 100
111A 0,500 100
131D 0,495 100
24K 0,489 100
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138M 0,473 100
209T 0,473 100
84V 0,462 100
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60K 0,407 100
31N 0,396 100
47K 0,396 100
5E 0,390 100
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49D 0,302 100
153S 0,302 100
35K 0,297 100
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18G 0,275 100
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46E 0,264 100
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183Q 0,231 100
12I 0,225 100
197P 0,225 100
130D 0,220 100
148P 0,214 100
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23C 0,209 100
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113Y 0,209 100
108R 0,203 100
188K 0,203 100
51L 0,198 100
59Q 0,198 100
121L 0,198 100
122T 0,198 100
154G 0,192 100
53E 0,170 100
72G 0,170 100
41G 0,165 100
86N 0,165 100
147N 0,165 100
173E 0,165 100
27S 0,159 100
94Q 0,159 100
187H 0,159 100
142E 0,154 100
64G 0,148 100
17G 0,143 100
133V 0,137 100
42L 0,121 100
155N 0,121 100
55N 0,115 100
91Y 0,115 100
69G 0,110 100
103G 0,110 100
198S 0,110 100
109D 0,093 100
207Y 0,082 100
96W 0,077 100
161G 0,077 100
140E 0,071 100
152F 0,071 100
80M 0,066 100
117Q 0,066 100
4A 0,060 100
32C 0,055 100
90A 0,055 100
206L 0,055 100
22A 0,049 100
110V 0,044 100
146Y 0,044 100
14C 0,038 100
9Y 0,033 100
62A 0,033 100
132P 0,033 100
57F 0,027 100
99Q 0,027 100
100C 0,027 100
199G 0,027 100
77A 0,022 100
105D 0,022 100
119V 0,022 100
20H 0,016 100
83L 0,016 100
120A 0,016 100
139W 0,016 100
176C 0,016 100
178S 0,016 100
181Y 0,016 100
95V 0,011 100
115V 0,011 100
116G 0,011 100
165Q 0,011 100
169A 0,011 100
189H 0,011 100
66E 0,005 100
74Q 0,005 100
89L 0,005 100
92V 0,005 100
98N 0,005 100
118N 0,005 100
168W 0,005 100
21T 0,000 100
50I 0,000 100
54H 0,000 100
58R 0,000 100
61I 0,000 100
93A 0,000 100
97A 0,000 100
107C 0,000 100
135L 0,000 100
136V 0,000 100
143V 0,000 100
160T 0,000 100
163Y 0,000 100
164T 0,000 100
166M 0,000 100
167V 0,000 100
171T 0,000 100
174V 0,000 100
175G 0,000 100
177G 0,000 100
179I 0,000 100
190Y 0,000 100
191L 0,000 100
192V 0,000 100
193C 0,000 100
194N 0,000 100
195Y 0,000 100
196G 0,000 100
实施例4
本实施例描述了制备和表征根据本发明的重组突变体Bet v 1变态反应原，即包含至少4个初级突变且具有减小的IgE结合亲和力的变态反应原。
用于Bet v 1定点突变的氧基酸残基的选择
Bet v 1的氨基酸残基的溶剂可接近性如实施例3表1所示。氨基酸保守的比率基于用ClustalW算法以BLAST搜索在ExPaSyMolecular Biology Server(http：//www.expasy.ch/)上进行的序列比对，其中用Bet v 1.2801野生型氨基酸序列作为输入序列。该比对包括来自Fagales目中物种(Bet v 1：白桦(Betula verrucosa)；Carb 1：桦叶鹅耳枥(Carpinus betulus)；Cor a 1：Corylus avellana；Aln g 1：胶桤木(Alnus glutinosa))的67个变态反应原序列(39个Bet v 1序列、11个Car b 1序列、6个Cor a 1序列和13个Aln g1序列)。考虑到在实施例中显示的突变重组Bet v 1变态反应原，用于替换的目标残基基于≥95％的氨基酸一致性。
如在实施例1中所描述的，将来自相关物种的花粉变态反应原之间具有高溶剂暴露程度的和高度保守性的氨基酸残基选来用于定点突变。不认为具有低溶剂暴露程度的(＜20％)残基与诱变相关，这是由于可能的三级结构破坏或抗体相互作用的缺乏。
引入的残基都存在于一组称为病理相关(PR-10)蛋白质的植物蛋白质同种型的相应位置。分子模型暗示Fagales变态反应原和PR-10蛋白质的三级结构近乎相同。Bet v 1与PR-10蛋白质共享显著的序列一致性(20-40％)。然而，没有对这些PR-10蛋白质的变态反应交叉反应性的报道。因而，来自Bet v 1的高度保守和溶剂暴露的氨基酸与PR-10蛋白质中相应位置上的氨基酸的交换导致一个突变的Bet v 1蛋白质，其α-碳主链三级结构没有改变但具有减小的IgE结合亲和力。
体外诱变
体外诱变用插入了Bet v 1的重组pMAL-c作为模板通过PCR来进行。包含5～9个初级突变的重组变态反应原突变体的制备包括两个PCR步骤：步骤I和步骤II。首先，分别用包含每个突变的有义和反义突变特异性寡核苷酸引物连同包含上游或下游临近突变或Betv 1的N-末端/C-末端的有义和反义寡核苷酸引物，将单一的突变(或者几个突变，如果它们在DNA序列中紧密靠在一起)引入到Bet v1.2801或Bet v 1.2801衍生物连续的DNA序列中，如在图17中示意性阐明的(I)。其次，将来自PCR反应I的PCR产物纯化、混合并用作另外的PCR反应(II)的模板，其寡核苷酸引物包含Bet v 1的N-末端和C-末端，如在图17中示意性阐明的(II)。将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳和PCR凝胶纯化(Life Technologies)和随后的乙醇沉淀进行纯化，用限制性内切酶(Sac I/EcoR I)或(Sac I/Xba I)进行切割，并定向地连接入用相同的酶限制酶切的pMAL-c中。
图18表示合成的寡核苷酸引物和对构建具有5～9个初级突变的Bet v 1突变体的示意性阐明。突变的氨基酸优选地选自特征在于如实施例3所述具有高度溶剂暴露和保守性的氨基酸。Bet v 1突变体为如下在括弧中陈述的一次和二级突变：
突变体Bet v 1(2628)：Tyr5Val、Glu45Ser、Lys65Asn、Lys97Ser、Lys134Glu。
突变体Bet v 1(2637)：Ala16Pro、(Asn28Thr，Lys32Gln)、Lys103Thr、Pro108Gly、(Leu152Lys，Ala153Gly，Ser155Pro)。
突变体Bet v 1(2733)：(Tyr5Val，Lys134Glu)、(Asn28Thr，Lys32Gln)、Glu45Ser、Lys65Asn、(Asn78Lys，Lys103Val)、Lys97Ser、Pro108Gly、Arg145Glu、(Asp156His，+160Asn)。
突变体Bet v 1(2744)：Tyr5Val，Lys134Glu)、(Glu42Ser，Glu45Ser)、(Asn78Lys，Lys103Val)、Lys123Ile、(Asp156His，+160Asn)。
突变体Bet v 1(2753)：(Asn28Thr，Lys32Gln)、Lys65Asn、(Glu96Leu，Lys97Ser)、(Pro108Gly，Asp109Asn)、(Asp125Tyr，Glu127Ser)、Arg145Glu。
核苷酸测序
对Bet v 1编码基因核苷酸序列的确定分别在亚克隆前后及随后的体外诱变中进行。
按照供应商的建议，将来自10ml在补充了0.1g/l氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜至饱和的细菌培养物的质粒DNA用Qiagen-tip20柱进行纯化，并用均来自(Perkin Elmer)的快速反应染料终止子循环测序试剂盒(Ready reaction dye terminator cycle sequencingkit)和荧光测序仪(Fluoresence Sequencer)AB PRISM 377进行测序。
重组Bet v 1和突变体的表达和纯化
如在参考文献15中所描述的，将重组Bet v 1(Bet v 1 No.2801和突变体)在大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α中过量表达，融合到麦芽糖结合蛋白质上并纯化。简要地，使重组的大肠杆菌细胞在37℃生长到600nm时光密度为0.8，随之由添加IPTG来诱导Bet v1融合蛋白质的表达。在诱导后3小时通过离心来收集细胞，重悬于裂解缓冲液中并用超声断裂。在超声处理和额外的离心之后，通过直链淀粉亲和层析分离重组的融合蛋白质并随后通过与因子Xa的温育来切割(参考文献15)。在F Xa切割后，将重组Bet v 1用凝胶过滤来分离，并进行另一轮的直链淀粉亲和层析以除去痕量的麦芽糖结合蛋白质。
将纯化的重组Bet v 1超滤浓缩为约5mg/ml并贮存于4℃。纯化的重组Bet v 1制备物的终产量为每升大肠杆菌细胞培养物2～5mg。
纯化的重组Bet v 1制备物经银染SDS-聚丙烯酰胺电泳后显示单一的表现分子量为17.5kDa的条带。
我们在前面显示(参考文献15)重组Bet v 1 No.2801与天然存在的Bet v 1在免疫化学上不能相区别。
Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)突变体
图19表示在Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)分子表面引入点突变。在突变体Bet v 1(2628)中，在Bet v 1的一半上引入5个初级突变而另一半没有改变。在突变体Bet v 1(2637)中，在Bet v 1的另一半上引入5个初级和3个二级突变，而第一半不改变。通过这个途径，在突变体Bet v 1(2628)和突变体Bet v 1(2637)中的突变分别影响Bet v 1表面的不同的一半。
重组Bet v 1(2628)突变体的结晶和结构确定
重组Bet v 1(2628)的晶体于25℃蒸气扩散来生长，基本如在(Spangfort等人1996b，参考文献21)中所描述。将浓度为5mg/ml的Bet v 1(2628)与相同体积的2.2M的硫酸铵、0.1M的柠檬酸钠、1％(v/v)的二氧六环，pH6.3的溶液混合，并对100x体积的2.2M的硫酸铵、0.1M的柠檬酸钠、1％(v/v)的二氧六环，pH6.3的溶液进行平衡。平衡24小时之后，通过采用在参考文献21中所描述的加晶种技术来诱导晶体生长，这里用重组体的野生型Betv 1作为晶种来源。
约4个月后，收获晶体并用如参考文献21所描述的从Rigaku旋转阳极生成的X-射线进行分析，且该结构用分子置换(molecularreplacement)来解析。
Bet v 1(2628)突变体的结构
突变的结构作用通过生长三维Bet v 1(2628)蛋白质晶体而陈述，当用旋转阳极生成的X-射线进行分析时该晶体衍射为2.0的分辨率。替换Tyr5Val、G1u45Ser、Lys65Asn、Lys97Ser、Lys134Glu是通过Bet v 1(2628)的结构电子密度图象证实的，该图象也显示总的α-碳主链三级结构是保守的。
Bet v 1(2637)突变体的结构分析
纯化的Bet v 1(2637)突变体的结构完整性用圆二色(CD)谱分析。图20显示以近乎相同的浓度记录的重组Bet v 1.2801(野生型)和Bet v 1(2637)突变体的CD谱。来自2个重组蛋白质的CD谱中峰幅和位置的交迭显示这2种制备物含有相同量的二级结构，这强有力地暗示α-碳主链三级结构没有受到氨基酸替换引入的影响。
Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)突变体的IgE结合性质
在液相IgE抑制测定中比较Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)以及Bet v 1(2628)与Bet v 1(2637)的1∶1混合物同重组野生型Bet v 1.2801的IgE结合性质，该测定使用衍生自桦木变态反应患者的血清IgE库。
如在实施例1中所描述，重组Bet v 1.2801以摩尔比为1∶5进行生物素化(Bet v 1 no.2801：生物素)。抑制测定如下进行：将血清样品(25μ1)与固相抗IgE温育，洗涤，重悬并进一步同生物素化的Bet v 1.2801和给定的突变体或两种突变体的1∶1混合物温育。结合到固相的生物素化的Bet v 1.2801的量通过在温育后用丫啶酯标记的链酶抗生物素测量RLU来估计。抑制的程度计算为用缓冲液和突变体作抑制备物所获得的RLU比率。
图21表示由非生物素化的Bet v 1.2801和Bet v 1(2628)、Betv 1(2637)以及Bet v 1(2628)与Bet v 1(2637)的1∶1混合物抑制生物素化的重组Bet v 1.2801与来自变态反应患者库的血清IgE的结合。
对存在于血清库中的血清IgE的结合达到50％的抑制所必需的各个重组蛋白质的量有明显的差别。重组Bet v 1.2801在约5ng即达到了50％的抑制，而相应的Bet v 1(2628)突变体的浓度为约15-20ng。这显示在Bet v 1(2628)突变体中引入的点突变以约3-4倍的系数降低了特异性血清IgE的亲和力。
由Bet v 1(2628)突变体达到的最高抑制水平与重组Bet v1.2801相比明显较低。这可能显示由于点突变的引入，一些存在于血清库中的特异性IgE不能识别Bet v 1(2628)突变体。
Bet v 1(2637)在约400-500ng达到50％的抑制，显示在Bet v1(2637)突变体中引入的点突变使其与Bet v 1.2801相比将对特异性血清IgE的亲和力降低了80～100倍。在IgE结合中的巨大差异进一步由Bet v 1.2801的抑制曲线相比于Bet v 1(2637)突变体蛋白质的抑制曲线所得的明显的倾角差别的支持。提供证据表明IgE结合减少的不同的倾角归因于与Bet v 1.2801相比突变体显然不同的抗原决定部位的模式。
除用单独修饰的变态反应原的进行抑制测定之外，对分别与Betv 1(2628)或Bet v 1(2637)的样品具有等摩尔浓度的Bet v 1的Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)的1∶1混合物进行检验，它们显示完全能抑制rBet v 1.2801对IgE的结合(100％)。完全抑制IgE结合的能力清楚表明所有存在于Bet v 1.2801上的活性抗原决定部位也存在于1∶1的变态反应原混合物中。进一步的证明来自Bet v1.2801和变态反应原混合物两抑制曲线的可相比较的倾角。混合的变态反应原样品减少的IgE反应性通过当与Bet v 1.2801相比时，为得到50％的IgE结合抑制需要高4-倍浓度的变态反应原混合物来证明。
用突变的重组Bet v 1变态反应原进行T细胞增殖测定
该分析以如参考文献15所述方法进行。Bet v 1(2628)和Bet v1(2637)两者均能够诱导来自桦木花粉变态反应患者中的T细胞系的增殖，其刺激指数与重组体的和天然存在的情况相似。这暗示Betv 1(2628)和Bet v 1(2637)突变体蛋白质均能起始抗体生产所必需的细胞免疫反应。
人嗜碱性粒细胞的组胺释放测定
嗜碱白细胞组胺释放如下进行。从每个桦木花粉变态反应患者取肝素化的血液(20ml)，贮存于室温，并在24小时内使用。将25微升肝素化的全血置于玻璃纤维覆盖的微量滴定孔中(ReferenceLaboratory，Copenhagen，丹麦)并与25微升的变态反应原或抗-IgE于37℃温育1小时。其后漂洗平板并去除干扰物质。最后，结合到微纤维上的组胺进行荧光分光光度测量。
Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)突变体蛋白质的组胺释放性
质
组胺释放的数据在图22和图23中显示。Bet v 1(2628)和Betv 1(2637)突变体蛋白质在来自两个桦木花粉变态反应患者的人嗜碱性粒细胞中诱导组胺释放的潜能与Bet v 1.2801的释放曲线相比明显地右移。该移动表明Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)的潜能减少了3～10倍。
突变体Bet v 1(2744)和突变体Bet v 1(2753)
Bet v 1(2744)和突变体Bet v 1(2753)同样构建用作混合的变态反应原疫苗。在这些突变变态反应原中，点突变如图24和25所示以一种全表面排列的方式分布，并再次设计为分别在两个分子中影响不同的表面，如在图26中所示。然而，这些修饰的变态反应原也可单独用作单一变态反应原疫苗。
Bet v 1(2744)突变体蛋白质的结构分析
纯化的Bet v 1(2744)突变体的结构完整性用圆二色(CD)谱学分析。图27显示以近乎相同的浓度记录的重组Bet v 1.2801(野生型)和Bet v 1(2744)突变体的CD谱。来自2个重组蛋白质的CD谱中峰幅和位置的交迭显示2种制备物含有相同量的二级结构，这强有力地暗示α-碳主链三级结构没有受到氨基酸替换引入的影响。
Bet v 1(2744)的组胺释放性质
从来自5种不同的花粉变态反应患者的嗜碱白细胞的5个实验中得来的组胺释放数据在图29和图29A-D中显示。已检验了Bet v 1(2744)突变体蛋白质在人嗜碱性粒细胞中诱导组胺释放的潜能。突变的变态反应原的释放曲线与Bet v 1.2801的释放曲线相比明显地右移，这表明Bet v 1(2744)释放组胺的潜能减少了3～5倍。
突变体Bet v 1(2733)
已构建并重组表达了具有9个初级突变的突变体Bet v 1(2733)。突变体Bet v 1(2733)中点突变的分布留下了几个组成＞4002的没有改变的表面区域。图30表示在Bet v 1(2733)分子表面引入的点突变。
实施例5
本实施例描述了编码来自屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)的Der p 2的基因的克隆和具有减少的IgE结合亲和力的突变体的构建。
从屋尘螨第一链cDNA合成所得的PCR扩增产物得自Dr.Wendy-Anne Smith和Dr.Wayne Thomas(TVW Telethon Institutefor Child Health Research，100 Roberts Rd，Subiaco，WesternAustralia 6008)。在第一链cDNA文库的扩增中，Der p 2被选择性地用Der p 2特异性引物进行扩增。随后将PCR片段克隆入pUC19的BamH I位点(New England BioLabs)。Der p 2的DNA测序用载体特异性有义(5’-GGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGG-3’)和反义引物(5’-GGAAACAGCTATGACCATGATTACGCC-3’)进行。
确定了总共7种独特的Der p 2同种型，称为ALK-101、ALK-102、ALK-103、ALK-104、ALK-113、ALK-114、ALK-120。将标号为ALK-114的克隆选作起始点以生成低亲和力的IgE突变体，这是由于其与具有数据库访问号1A9V的Der p 2 NMR结构的高度序列一致性。与ALK-114相比，6个其他天然存在的同种型包含如下替换：
ALK-101：M76V。
ALK-102：V40L、T47S。
ALK-103：M111L、D114N。
ALK-104：T47S、M111T、D114N。
ALK-113：T47S。
ALK-120：V40L、T47S、D114N。
将Der p 2插入pGAPZα-A
将编码Der p 2(ALK-114)的基因随后插入pGAPZα-A载体中(Invitrogen)以得到Der p 2在毕赤巴斯德酵母(Pichiapastoris)中的分泌表达。将该基因是用分别相应于Der p 2多肽的氨基-和羧基端的有义引物OB27(5’-GGAATTCCTCGAGAAAAGAGATCAAGTCGATGTCAAAGATTGTGCC-3’)和反义引物OB28(5’-CGTTCTAGACTATTAATCGCGGATTTTAGCATGAGTTGC-3’)进行扩增。将引物在5’-端延长以分别包含限制酶切位点Xho I和Xba I。Xho I限制酶切位点使Der p 2的第一个密码子以符合阅读框形式与编码pGAPZα-A的KEX2切割位点(LYS-ARG)的核酸序列融合。单轮的PCR反应在100微升(μl)体积进行的：0.1mg的模板ALK-114 DNA，1X Expand聚合酶缓冲液(得自BoehringerMannheim)，各0.2毫摩尔(mM)的4种dNTPs，各0.3微摩尔(μM)的有义和反义引物和2.5单位的Expand聚合酶(得自Boehringer Mannheim)。DNA在25个循环中扩增：95℃15秒，45℃30秒，72℃1分钟，随后1个72℃循环7分钟。将结果所得的475碱基对的ALK-114 PCR片段用QIAquick旋转纯化程序(得自Qiagen)进行纯化。然后将纯化的DNA片段用Xho I和Xba I消化，凝胶纯化并连接入以相似方式消化的pGAPZα-A中。将连接反应转化入大肠杆菌菌株DH5α，结果得到质粒pCBo06。
Der p 2的核苷酸序列通过在克隆前后及随后的体外诱变中的DNA测序来证实(见下文)。
Der p 2序列
SEQ ID NO 1相应于Der p 2的核酸序列(ALK-114)：
1 gatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaaaagttttggtaccagga
61 tgccatggttcagaaccatgtatcattcatcgtggtaaaccattccaattggaagccgtt
121 ttcgaagccaaccaaaacacaaaaaccgctaaaattgaaatcaaagcctcaatcgatggt
181 ttagaagttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattacatgaaatgcccattg
241 gttaaaggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccgaaaattgcaccaaaa
301 tctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttatgggtgatgatggtgttttggcctgtgct
361 attgctactcatgctaaaatccgcgattaa
SEQ ID NO 2相应于推定的Der p 2氨基酸序列(ALK-114)：
1 dqvdvkdcanheikkvlvpgchgsepciihrgkpfqleavfeanqntktakieikasidg
61 levdvpgidpnachymkcplvkgqqydikytwnvpkiapksenvvvtvkvmgddgvlaca
121 iathakird
将pGAPZα-A-Der p 2插入到毕赤巴斯德酵母中
将载体pCBo06用AvrII限制性内切酶线性化并转化到感受态毕赤巴斯德酵母菌株X-33中，如在Invitrogen使用手册中所述。选择对100微克每毫升(μg/ml)的Zeocin具抗性的重组细胞，将菌落在含有100μg/ml Zeocin的新鲜YPD平板上纯化。
重组Der p 2的表达和纯化
将250ml含有100μg/ml Zeocin的YPD培养基(1％的酵母提取物、2％的蛋白胨、2％的葡萄糖)用表达Der p 2的重组酵母细胞过夜培养物进行接种。使培养物在30℃生长72小时以获得适当的Der p 2表达。细胞通过离心收集，将结果所得的培养物上清夜用50％的硫酸铵饱和。在用3000xg离心30分钟之后，将上清夜用80％的硫酸铵饱和。离心后，将沉淀重悬于150毫摩尔(mM)的NH4HCO3中并在用相同的缓冲液平衡的Superdex 75凝胶过滤柱上分级分离。
Der p 2作为相应于其预期分子量的主要峰洗脱。Der p 2的洗脱通过随后进行银染的SDSPAGE电泳和用Der p 2特异性多克隆抗体的免疫印迹进行监控。
用于定点突变的氨基酸残基的选择
用于定点突变的氨基酸残基的选择基于对来自屋尘螨(Der p 2/f2和Eur m 2)和贮存螨(storage mite)(Tyr p 2、Lep d 2、Gly d2)的变态反应原中高度溶剂暴露和高度保守性的残基的确定。高度溶剂暴露的残基通过Der p 2 NMR结构(#1.9，1A9V.pdb)的分子表面的分析直观确定。选择了12个氨基酸残基用于诱变：K6A、N10S、K15E、S24N、H30N、K48A、E62S、H74N、K77N、K82N、K100N和R128Q。
定点突变
具有单个初级突变和其多重组合的重组突变变态反应原的构建描述如下。
编码Der p 2突变体的表达质粒是用pCBo06作为DNA模板而生产的。PCR反应用插入了特定突变的有义和反义引物进行。用于PCR反应以生成特定突变的引物对列在图31中。突变以粗体标明，且用于随后的克隆步骤的限制酶切位点在图中加下划线。对于突变体K6A、K15E、H30N、H74N和K82N的构建，PCR反应基本是如在“将Der p 2克隆入pGAPZα-A”部分中所描述的那样进行的。将纯化的PCR片段在标明的限制性酶切位点(参见图31)消化、凝胶纯化、连接入用相似消化的pCBo06并转化入大肠杆菌DH5α。
突变E62S是以在实施例1中对Bet v 1突变体的生成所描述的另一种PCR诱变方法学生成。合成了两个覆盖特定的突变的突变特异性寡核苷酸引物(OB47和OB48，在图31中列出)。两个用于二次扩增步骤的额外引物为OB27和OB28如在“将Der p 2插入pGAPZα-A”部分中所描述。
生产的变态反应原突变体用如在实施例4中所描述的相同方法来描述特性，如圆二色(CD)谱、结晶、IgE结合性质的测量、组胺释放、T细胞增殖刺激能力等。
实施例6
具有对特异性变态反应疫苗改善的安全性的突变的重组螨变态
反应原(Der p 2)
在本实施例中，当前发明对屋尘螨变态反应原概念的应用由一个变态反应原Der p 2作为例子。对其他屋尘螨变态反应原的处理可通过相当的程序进行。
突变的重组Der p 2分子的设计
SED ID NO.3表示Der p 2-ALK-G克隆的核苷酸和推定的氨基酸序列，该克隆是野生型的同种型。
SED ID NO.3：Der p 2-ALK-G的核苷酸和推定的氨基酸序列。
GAT CAA GTC GAT GTC AAA GAT TGT GCC AAT CAT GAA ATC AAA AAA 45
D Q V D V K D C A N H E I K K 15
GTT TTG GTA CCA GGA TGC CAT GGT TCA GAA CCA TGT ATC ATT CAT 90
V L V P G C H G S E P C I I H 30
CGT GGT AAA CCA TTC CAA TTG GAA GCT TTA TTC GAA GCC AAT CAA 135
R G K P F Q L E A L F E A N Q 45
AAC TCA AAA ACA GCT AAA ATT GAA ATC AAA GCT TCA ATC GAT GGT 180
N S K T A K I E I K A S I D G 60
TTA GAA GTT GAT GTT CCC GGT ATC GAT CCA AAT GCA TGC CAT TAT 225
L E V D V P G I D P N A C H Y 75
ATG AAA TGT CCA TTG GTT AAA GGA CAA CAA TAT GAT ATT AAA TAT 270
M K C P L V K G Q Q Y D I K Y 90
ACA TGG AAT GTT CCA AAA ATT GCA CCA AAA TCT GAA AAT GTT GTC 315
T W N V P K I A P K S E N V V 105
GTC ACT GTT AAA GTT TTG GGT GAT AAT GGT GTT TTG GCC TGT GCT 360
V T V K V L G D N G V L A C A 120
ATT GCT ACT CAT GCT AAA ATC CGC GAT 387
I A T H A K I R D 129
图32表示用ClustalW算法以BLAST搜索在ExPaSy MolecularBiology Server(http：//www.expasy.ch/)上进行的序列比对，其中用表示于SED ID NO.3中的Der p 2-ALK-G的氨基酸序列作为输入序列。该比对包括来自屋尘螨物种的序列，即Der p 2、Der f 2和Eurm 2。在图32中，与Der p 2-ALK-G蛋白质序列相同位置上氨基酸相同的氨基酸残基在灰色背景上用黑体突出。不相同的氨基酸以白色背景用黑色印刷。
表面结构图象
代表屋尘螨类群2变态反应原的氨基酸序列具有超过85％的相似性，且一些分子表面保守(灰色带)，参见图33。图33表示当将Der p 2-ALK-G蛋白质序列添加到发表的PDB：1A9v NMR结构上时，即10个包含在PDB文件中编号为1的结构，从4个不同的角度观察的表面外形。
将保守的和高度溶剂暴露的氨基酸选来用于突变，这些氨基酸在空间上在25-30范围的距离内分布在整个表面。在下面的部分中，给出了下述信息：认为适合用于突变的氨基酸列表(A)、设计的突变的列表(B)和代表设计的突变的DNA序列(C)。图34表示作为例子的以1号突变体的分子外形。灰色显示保守的氨基酸残基。黑色显示选来用于突变的氨基酸残基。
A.选来用于突变的氨基酸列表
K15、S24、H30、R31、K48、E62、H74、K77、K82、K100、R128
B.设计的突变的列表
突变体1：
K15E，S24N，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，K100N
突变体2：
K15E，S24N，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，R128Q
突变体3：
K15E，S24N，H30G，K48A，K77N，K82N，K100N，R128Q
突变体4：
K15E，S24N，H30G，E62S，K77N，K82N，K100N，R128Q
突变体5：
K15E，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，K100N，R128Q
突变体6：
S24N，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，K100N，R128Q
突变体7：
K15E，S24N，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，K100N
突变体8：
K15E，S24N，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，R128Q
突变体9：
K15E，S24N，R31S，K48A，H74N，K82N，K100N，R128Q
突变体10：
K15E，S24N，R31S，E62S，H74N，K82N，K100N，R128Q
突变体11：
K15E，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，K100N，R128Q
突变体12：
S24N，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，K100N，R128Q
C.突变体的核苷酸序列
突变体1：
K15E，S24N，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，K100N
GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatgAACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatccgcgat
突变体2：
K15E，S24N，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，R128Q
GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcCattatatgAACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaaaatctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat
突变体3：
K15E，S24N，H30G，K48A，K77N，K82N，K100N，R128Q
GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttagaagttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatgAACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat
突变体4：
K15E，S24N，H30G，E62S，K77N，K82N，K100N，R128Q
GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaaaaacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatgAACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat
突变体5：
K15E，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，K100N，R128Q
GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggttcagaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatgAACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat
突变体6：
S24N，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，K100N，R128Q
GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaaaagttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatgAACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat
突变体7：
K15E，S24N，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，K100N
GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatgaaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatccgcgat
突变体8：
K15E，S24N，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，R128Q
GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatgaaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaaaatctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat
突变体9：
K15E，S24N，R31S，K48A，H74N，K82N，K100N，R128Q
GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttagaagttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatgaaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctaCtcatgCtaaaatcCAGgat
突变体10：
K15E，S24N，R31S，E62S，H74N，K82N，K100N，R128Q
GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttagaagttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatgaaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtCtgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat
突变体11：
K15E，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，K100N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggttcagaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatgaaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat
突变体12：
S24N，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，K100N，R128Q
GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaaaagttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatgaaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttCCaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat
实施例7
具有对特异性变态反应疫苗改善的安全性的突变的重组螨变态
反应原(Der p 1)
在本实施例中，当前发明对屋尘螨变态反应原概念的应用由一个变态反应原Der p 1作为例子。对其他屋尘螨变态反应原的处理可通过相当的程序进行。
突变的重组Der p 1分子的设计
SED ID NO.4表示Der p 1-ALK克隆的核苷酸和推定的氨基酸序列，该克隆是野生型的同种型。
SED ID NO.4：Der p 1-ALK的核苷酸和推定的氨基酸序列。
ACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT 45
T N A C S I N G N A P A E I D 15
TTG CGA CAA ATG CGA ACT GTC ACT CCC ATT CGT ATG CAA GGA GGC 90
L R Q M R T V T P I R M Q G G 30
TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT GCC GCA ACT GAA TCA 135
C G S C W A F S G V A A T E S 45
GCT TAT TTG GCT TAC CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180
A Y L A Y R N Q S L D L A E Q 60
GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC 225
E L V D C A S Q H G C H G D T 75
ATT CCA CGT GGT ATT GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA 270
I P R G T E Y I Q H N G V V Q 90
GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA CGA GAA CAA TCA TGC CGA CGA 315
E S Y Y R Y V A R E Q S C R R 105
CCA AAT GCA CAA CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360
R N A Q R F G I S N Y C Q I Y 120
CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CGT GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC 405
P P N V N K I R E A L A Q T H 135
AGC GCT ATT GCC GTC ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC 450
S A I A V I I G I K D L D A F 150
CGT CAT TAT GAT GGC CGA ACA ATC ATT CAA CGC GAT AAT GGT TAC 495
R H Y D G R T I I Q R D N G Y 165
CAA CCA AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540
Q P N Y H A V N I V G Y S N A 180
CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT 585
Q G V D Y W I V R N S W D T N 195
TGG GGT GAT AAT GGT TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG 630
W G D N G Y G Y F A A N I D L 210
ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC ATT CTC 666
M M I E E Y P Y V V I L 222
图35表示用ClustalW算法以BLAST搜索在ExPaSy MolecularBiology Server(http：//www.expasy.ch/)上进行的序列比对，其中用表示于SED ID NO.4中的Der p 1-ALK的氨基酸序列作为输入序列。该比对包括来自屋尘螨物种的序列，即Der p 1、Der f 1和Eurm 1。在图35中，与Der p 1-ALK蛋白质序列相同位置上氨基酸相同的氨基酸残基在灰色背景上用黑体突出。不相同的氨基酸以白色背景用黑色印刷。
表面结构图象
代表屋尘螨类群1变态反应原的氨基酸序列具有某些程度的相似性，且一些分子表面是保守的(灰色带)，参见图36。图36表示当将Der p 1-ALK蛋白质序列迭加到Der p 1分子结构模型上时从4个不同的角度观察的表面外形。
将保守的和高度溶剂暴露的氨基酸选来用于突变，这些氨基酸在空间上在25-30范围的距离内分布在整个表面。在下面的部分中，给出了下述信息：认为适合用于突变的氨基酸列表(A)、设计的突变的列表(B)和代表设计的突变的DNA序列(C)。图37以编号为11的突变体作为例子表示分子外形。灰色显示保守的氨基酸残基。黑色显示选来用于突变的氨基酸残基。
A.选择来用于突变的氨基酸列表
E13、P24、R20、Y50、S67、R78、R99、Q109、R128、R156、R161、P167、W192
B.设计的突变的列表
突变体1：
P24T、Y50V、R78E、R99Q、R156Q、R161E、P167T
突变体2：
P24T、Y50V、R78Q、R99E、R156E、R161Q、P167T
突变体3：
R20E、Y50V、R78Q、R99Q、R156E、R161E、P167T
突变体4：
R20Q、Y50V、R78E、R99E、R156Q、R161Q、P167T
突变体5：
P24T、Y50V、S67N、R99E、R156Q、R161Q、P167T
突变体6：
R20E、Y50V、S67N、R99E、R156Q、R161E、P167T
突变体7：
R20Q、Y50V、S67N、R99Q、R156E、R161E、P167T
突变体8：
E13S、P24T、Y50V、R78E、R99Q、Q109D、R128E、R156Q、R161E、P167T
突变体9：
E13S、P24T、Y50V、R78Q、R99E、Q109D、R128Q、R156E、R161Q、P167T
突变体10：
E13S、P24T、Y50V、R78E、R99Q、Q109D、R128E、R156Q、R161E、P167T、W192F
突变体11：
E13S、P24T、Y50V、R78Q、R99E、Q109D、R128Q、R156E、R161Q、P167T、W192F
C.突变体的核苷酸序列
突变体1：
P24T，Y50V，R78E，R99Q，R156Q，R161E，P167T
ACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA 60ACT GTC ACT ACC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA GAA GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA CAG GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA CAA CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CGT GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC CAG ACA ATC ATT CAA 480GAA GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666
突变体2：
P24T，Y50V，R78Q，R99E，R156E，R161Q，P167T
ACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA 60ACT GTC ACT ACC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA CAG GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA GAA GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA CAA CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CGT GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC GAA ACA ATC ATT CAA 480CAG GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC SSC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666
突变体3：
R20E，Y50V，R78Q，R99Q，R156E，R161E，P167T
ACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT TTG CGA CAA ATG GAA 60ACT GTC ACT CCC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GGT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA CAG GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA CAG GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA CAA CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CGT GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC GAA ACA ATC ATT CAA 480CAG GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666
突变体4：
R20Q，Y50V，R78E，R99E，R156Q，R161Q，P167T
ACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT TTG CGA CAA ATG CAG 60ACT GTC ACT CCC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA GAA GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA GAA GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA CAA CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CGT GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC CAG ACA ATC ATT CAA 480CAG GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666
突变体5：
P24T，Y50V，S67N，R99E，R156Q，R161Q，P167T
ACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA 60ACT GTC ACT ACC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT AAC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA CGT GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA GAA GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA CAA CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CGT GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC CAG ACA ATC ATT CAA 480CAG GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666
突变体6：
R20E，Y50V，S67N，R99E，R156Q，R161E，P167T
ACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT TTG CGA CAA ATG GAA 60ACT GTC ACT CCC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT AAC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA CGT GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA GAA GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA CAA CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CGT GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC CAG ACA ATC ATT CAA 480GAA GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666
突变体7：
R20Q，Y50V，S67N，R99Q，R156E，R161E，P167T
ACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT TTG CGA CAA ATG CAG 60ACT GTC ACT CCC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT AAC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA CGT GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA CAG GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA CAA CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CGT GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC GAA ACA ATC ATT CAA 480GAA GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666
突变体8：
E13S，P24T，Y50V，R78E，R99Q，Q109D，R128E，R156Q，R161E，P167T
ACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT AGC ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA 60ACT GTC ACT ACC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA GAA GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA CAG GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA GAT CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT GAA GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC CAG ACA ATC ATT CAA 480GAA GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666
突变体9：
E13S，P24T，Y50V，R78Q，R99E，Q109D，R128Q，R156E，R161Q，P167T
ACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT AGC ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA 60ACT GTC ACT ACC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA CAG GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA GAA GAA 300CAA TCAT GC CGA CGA CCA AAT GCA GAT CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CAG GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC GAA ACA ATC ATT CAA 480CAG GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666
突变体10：
E13S，P24T，Y50V，R78E，R99Q，Q109D，R128E，R156Q，R161E，P167T，W192F
ACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT AGC ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA 60ACT GTC ACT ACC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA GAA GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA CAG GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA GAT CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT GAA GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC CAG ACA ATC ATT CAA 480GAA GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TTT GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666
突变体11：
E13S，P24T，Y50V，R78Q， R99E，Q109D，R128Q，R156E，R161Q，P167T，W192F
ACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT AGC ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA 60ACT GTC ACT ACC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA CAG GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA GAA GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA GAT CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CAG GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC GAA ACA ATC ATT CAA 480CAG GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TTT GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666
实施例8
具有对特异性变态反应疫苗改善的安全性的突变的重组草变态
反应原(Phl p 5)
在本实施例中，当前发明对草花粉变态反应原概念的应用由一个变态反应原Phl p 5作为例子。对其他草花粉变态反应原的处理可通过相当的程序进行。
突变的重组Phl p 5分子的设计
SED ID NO.5表示Phl p 5.0103克隆的核苷酸和推定的氨基酸序列，该克隆是野生型的同种型。
SED ID NO.5：Phl p 5.0103的核苷酸和推定的氨基酸序列。
gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60
A D L G Y G P A T P A A P A A G Y T P A 20
acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120
T P A A P A G A E P A G K A T T E E Q K 40
ctgatcgagaagatcaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180
L I E K I N A G F K A A L A A A A G V P 60
ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240
P A D K Y R T F V A T F G A A S N K A F 80
gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300
A E G L S G E P K G A A E S S S K A A L 100
acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360
T S K L D A A Y K L A Y K T A E G A T P 120
gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcgaggcgctccgcatcatcgccggc 420
E A K Y D A Y V A T V S E A L R I I A G 140
accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480
T L E V H A V K P A A E E V K V I P A G 160
gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540
E L Q V I E K V D A A F K V A A T A A N 180
gccgcccccgccaacgacaagttcaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600
A A P A N D K F T V F E A A F N D A I K 200
gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660
A S T G G A Y E S Y K F I P A L E A A V 220
aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720
K Q A Y A A T V A T A P E V K Y T V F E 240
accgcactgaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcacagaaggctgccaagcccgcc 780
T A L K K A I T A M S E A Q K A A K P A 260
gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840
A A A T A T A T A A V G A A T G A A T A 280
gctactggtggctacaaagtc 861
A T G G Y K V
图32表示用ClustalW算法以BLAST搜索在ExPaSy MolecularBiology Server(http：∥www.expasy.ch/)上进行的序列比对，其中用表示于SED ID NO.5中的Phl p 5.0103的氨基酸序列作为输入序列。该比对包括来自草物种类群5变态反应原的序列，即Phl p 5、Poa p 5、Lol p 5、Hol l 5、Pha a 5、Hor v 9和Hor v 5。在图38中，与Phl p 5.0103蛋白质序列相同位置上氨基酸相同的氨基酸残基在灰色背景上用黑体突出。不相同的氨基酸以白色背景用黑色印刷。
表面结构图象
代表草花粉类群5变态反应原的氨基酸序列具有某些程度的相似性，且一些分子表面保守(灰色带)，参见图39。图39表示当将Phl p 5.0103蛋白质序列迭加到Phl p 5分子结构模型上时，从4个不同的角度观察的表面外形。该结构模型以两个半部包含该分子，模型A(氨基酸34-142)在图39A中表示，且模型B(氨基酸149-259)在图39B中表示
将高度溶剂暴露的氨基酸选来用于突变，这些氨基酸在空间上25-30范围的距离内分布在整个表面。在下面的部分中，给出了下述信息：认为适合用于突变的氨基酸列表(A)、设计的突变的列表(B)和代表设计的突变的DNA序列(C)。图40A和B分别表示作为例子的1号突变体模型A和模型B分子外形。灰色显示保守的氨基酸残基。黑色显示选来用于突变的氨基酸残基。
A.选来用于突变的氨基酸列表
I45、R66、E133、R136、I137、D186、F188、K211、P214、Q222、P232、L243、Q254
B.设计的突变的列表
突变体1：
I45K，E133S，F188I，Q222K，L243E，Q254K
突变体2：
R66N，E133S，F188I，Q222K，L243E，Q254K
突变体3：
I45K，R136S，F188I，Q222K，L243E，Q254K
突变体4：
I45K，I137K，F188I，Q222K，L243E，Q254K
突变体5：
I45K，E133S，D186H，Q222K，L243E，Q254K
突变体6：
I45K，E133S，Q222K，P232G，L243E，Q254K
突变体7：
I45K，E133S，F188I，P214G，L243E，Q254K
突变体8：
I45K，E133S，F188I，K211N，L243E，Q254K
突变体9：
R66N，R136S，F188I，Q222K，L243E，Q254K
突变体10：
R66N，I137K，F188I，Q222K， L243E，Q254K
突变体11：
I45K，E133S，D186H，P214G，L243E，Q254K
突变体12：
I45K，E133S，D186H，K211N，L243E，Q254K
突变体13：
I45K，E133S，P214G，P232G，L243E，Q254K
突变体14：
I45K，E133S，K211N，P232G，L243E， Q254K
C.突变体的核苷酸序列
突变体1：
I45K，E133S，F188I，Q222K，L243E，Q254K：
gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861
突变体2：
R66N，E133S，F188I，Q222K，L243E，Q254K：
gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagatcaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacAACacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861
突变体3：
I45K，R136S，F188I，Q222K，L243E，Q254K：
gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcgaggcgctcAGCatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861
突变体4：
I45K，I137K，F188I，Q222K，L243E，Q254K：
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突变体5：
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突变体6：
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突变体7：
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突变体8：
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突变体9：
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突变体10：
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突变体11：
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突变体13：
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突变体14：
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实施例9
重组体和突变体Bet v 1的T-细胞反应性：
目的：
在增殖和细胞因子生产方面研究对突变的变态反应原的体外T细胞反应。
方法：
来自变态反应患者的PBL(外周血淋巴细胞)被用于下面的研究。
为了维持T-细胞所呈对的bet v 1同种型的多样性，用具有天然纯化的bet v 1的PBL建立了8个bet v 1特异性T细胞系，如以前发表的流程所述(26)。
将10个PBL和8个T-细胞系用桦木提取物(Bet v)、天然纯化的bet v 1(nbet v 1)、重组Bet v 1(rBet v 1或wt；27)和rBetv 1的4种不同的突变体(在别处所述)：2595、2628、2637、2744、2773来刺激。随后发现2637突变体部分解折叠，将不予讨论。
简单扼要地：在一个具有96圆底孔的平板上每孔加入2×105的PBL。以4份重复(quadropplicates)的3种不同的浓度加入不同的桦木样品并使其生长6天。在第6天，将具有最高浓度的桦木的每孔半数体积(100μl)的细胞收获以用于细胞因子的生产。将放射性标记的胸苷加入到孔中。第二天(第7天)在滤器中收获细胞。将闪烁液加入到滤器中，其放射性用闪烁计数器进行测量。
同样地，在一个具有96圆底孔的平板上每孔加入3×104的T-细胞，并用自身辐射的PBL(1×105细胞/孔)和3种不同浓度的不同桦木样品来刺激。1天后，将来自各孔具有最高浓度的桦木的细胞收获以用于细胞因子的生产。将放射性标记的胸苷加入到孔中。在第2天在滤器中收获细胞。将闪烁液加入到滤器中并以如在PBL中描述的方法计数。
收集来自4等份(quadropplicates)的上清夜，并用来自Becton Dickinson的CBA(细胞因子珠阵列(cytokine beadarray))试剂盒来测量细胞因子。
结果：
10个PBL培养物显示对桦木的特异性刺激。通常，对不同桦木样品的PBL增殖相似，尽管可看到变化。在3个PBL中，nBet v 1比rBet v 1和突变体更好刺激增殖。突变体桦木样品几乎与rBet v 1一样刺激了PBL(图41)。图41表示上述Bet v 1制备物的刺激指数。刺激指数(SI)是刺激的样品的增殖(cpm：每分钟的读数)除以培养基(medium)对照的增殖(cpm)来计算的。PPD指来自结核分枝杆菌(mucobacterium tuberculosis)的纯化的蛋白质衍生物，它充当正对照。
细胞因子的生产是由IFN-gamma控制的且随PBL增殖按比例增加。Th1/Th2替换的信号不明显(图42-44)。图42表示具有Th0状况的患者，图43表示Th1状况且图44表示Th2状况。细胞因子生产用显示为条形图的pg/ml测量的且IL-5/IFN-gamma之间的比率是较下面的虚线(Y-轴右边)。用cpm测量的增殖在Y-轴右边表示为实线。培养基(medium)和MBP(麦芽糖结合蛋白质)作为背景对照而包括。
8个T-细胞系建立在nBet v 1上，且除一个之外，其余的全部对所有桦木样品同样好地增殖。4个T-细胞系基于IL-5和IFN-gamma的比率(Th2＞5、5＞Th0＞0.2、0.2＞Th1)而分泌Th0样的细胞因子。3个T-细胞系分泌Th1的细胞因子且1个T-细胞系分泌Th2细胞因子。IL-5/IFN-gamma的比率不受不同桦木样品的影响。
结论：
对nBet v 1显示特异性刺激的所有PBL培养物和7/8个T-细胞系也对rBet v 1和突变体起反应。这些数据暗示对于T-细胞的刺激，Bet v 1的同种型或这4个突变体可替换在天然变态反应原制备物中发现的单独的同种型的混合物。因而，基于重组变态反应原或这4个突变体的疫苗将针对现存的Bet v 1特异性T-细胞群体。
实施例10
用重组和突变体Bet v 1蛋白质在免疫接种后诱导Bet v 1特异性
IgG抗体和阻断抗体
在本部分中，术语“阻断抗体”定义为与IgE抗体不同的抗体，它能够结合到抗原并阻止人IgE抗体对该抗原的结合。
重组Bet v 1 2227野生型蛋白质(rBet v 1)和Bet v 1 2595、2628、2744及2773突变体蛋白质诱导Bet v 1特异性IgG抗体和阻断抗体的能力在小鼠中的免疫接种实验中检验。
通过用重组Bet v 1 2227野生型蛋白质或4个突变体蛋白质对BALB/cA小鼠(每组8个)腹膜内注射进行免疫接种。该小鼠以14天的剂量间隔免疫接种4次。将不同的蛋白质缀合到1.25mg/ml的铝胶上(氢氧化铝凝胶，1.3％pH8.0-8.4，Superfos Biosector)。该小鼠用或者1μg的蛋白质/剂量或者10μg的蛋白质/剂量来免疫接种。血液样品在第0、14、35、21、49和63天从眶放血(orbital bleed)获取。
特异性IgG抗体水平用rBet v 1包被的微量滴定板和生物素化的兔抗小鼠IgG抗体(Jackson)作为探测抗体通过直接的ELISA来分析。用重组Bet v 1 2227野生型蛋白质或4种突变体蛋白质的免疫接种诱导了强的rBet v 1特异性IgG反应。该发现证明4种突变的蛋白质能够诱导与Bet v 1 2227野生型蛋白质具有高度交叉反应性的抗体。
为了估计阻断抗体的诱导，将来自桦木变态反应患者的血清样品与包被了单克隆小鼠抗人IgE抗体的顺磁珠温育。温育后，将珠子洗涤并重悬于缓冲液或来自未免疫接种的小鼠(对照)或上述免疫接种的小鼠的小鼠血清的稀释样品(1∶100)中。然后将生物素化的rBet v 1加入到该珠和小鼠血清抗体的混合物中。温育之后，将珠子洗涤，其结合的生物素化的rBet v 1用丫啶(acridinium)标记的链酶抗生物素来探测。珠子和来自未免疫接种的小鼠的血清的温育没有改变rBet v 1与珠子的结合。相反的，珠子与来自用重组Bet v 1 227野生型蛋白质或4种突变体蛋白质免疫接种的小鼠血清的温育显著地减少了Bet v 1与珠子的结合，这证明了在血清样品中存在Bet v 1特异性阻断抗体。因而，在第63天，来自所有高剂量(10μg/剂量)免疫接种组的一种或多种血清样品能够减少超过80％的Bet v 1与珠子的结合。这些发现证明4种突变的蛋白质能够诱导可充当Bet v 1特异性阻断抗体的抗体。
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Claims (65)
1.重组变态反应原，其特征在于它是天然存在的变态反应原的突变体，其中该变态反应原突变体具有至少4个初级突变，与该天然存在的变态反应原的IgE结合能力相比，这里的每一个突变都减少了变态反应原突变体的特异的IgE结合能力；其中每一个初级突变都是用其他的残基替换一个表面暴露的氨基酸残基，在该天然存在的变态反应原所源自的分类学物种中用作替换的残基不发生于任何已知同源蛋白质氨基酸序列的相同位置上；其中每一个初级突变都与任一其他的初级突变间隔至少15；且其中初级突变这样放置，以使得至少一个具有8002面积的圆形表面区域不包含突变。
2.根据权利要求1的重组变态反应原，其中初级突变以20间隔，优选25且最优选30。
3.根据权利要求1或2的重组变态反应原，其包含许多二级突变，与该天然存在的变态反应原的IgE结合能力相比，这其中的每一个二级突变都减少了变态反应原突变体的特异的IgE结合能力；其中每一个二级突变都是用其他的残基替换一个表面暴露的氨基酸残基，在该天然存在的变态反应原所源自的分类学物种中该用作替换的残基不发生于任何已知同源蛋白质氨基酸序列的相同位置上；其中的二级突变位于所述圆形表面区域之外。
4.根据权利要求1-3中任何一项的重组变态反应原，其中至少一个在天然存在的变态反应原中要被替换的表面暴露的氨基酸具有超过20％的溶剂可接近性，优选超过30％，更优选超过40％且最优选超过50％。
5.根据权利要求1-4中任何一项的重组变态反应原，其中至少一个在天然存在的变态反应原中要被替换的表面暴露的氨基酸在该天然存在的变态反应原所源自的物种中所有已知的同源蛋白质中具有保守性超过70％，优选80％且最优选为90％。
6.根据权利要求1-5中任何一项的重组变态反应原，它基本上具有与该天然存在的变态反应原相同的α-碳主链三级结构。
7.根据权利要求1-6中任何一项的重组变态反应原，其中每一个要插入变态反应原突变体的氨基酸残基在该天然存在的变态反应原所源自的分类学属，优选亚科，更优选科，更优选总科，更优选军团(legion)，更优选亚目且最优选目中都不发生于任何已知同源蛋白质氨基酸序列的相同位置上。
8.根据权利要求1-7中任何一项的重组变态反应原，其特征在于对突变的变态反应原的特异的IgE结合减少至少5％，优选至少10％。
9.根据权利要求6的重组变态反应原，其特征在于当比较突变体和天然存在的变态反应原分子的α-碳主链三级结构时，原子坐标的平均根均方偏差优选低于2。
10.根据权利要求1-9中任何一项的重组变态反应原，其特征在于所述圆形表面区域包含15～25个氨基酸残基的原子。
11.根据权利要求1-10中任何一项的重组变态反应原，其特征在于将表面暴露的氨基酸残基以溶剂可接近性分级，并将处于较高的溶剂可接近性的一个或多个氨基酸替换。
12.根据权利要求1-11中任何一项的重组变态反应原，其特征在于将表面暴露的氨基酸残基以在该天然存在的变态反应原所源自的物种中的所有已知同源蛋白质中的保守程度分级，将处于较高保守性的氨基酸中的一个或多个替换。
13.根据权利要求1-12中任何一项的重组变态反应原，其中的变态反应原突变体是非天然存在的变态反应原。
14.根据权利要求1-13中任何一项的重组变态反应原，其包含5～20个，优选6～15个，更优选7～12个，且最优选8～10个初级突变。
15.根据权利要求1-14中任何一项的重组变态反应原，其特征在于该变态反应原突变体包含1～4个二级突变对应每个初级突变。
16.根据权利要求1-15中任何一项的重组变态反应原，其特征在于一个或多个替换由定点突变实现。
17.根据权利要求1-16中任何一项的重组变态反应原，其特征在于一个或多个替换由DNA改组实现。
18.根据权利要求1-17中任何一项的重组变态反应原，其特征在于它是吸入型变态反应原的突变体。
19.根据权利要求18的重组变态反应原，其特征在于它是花粉变态反应原的突变体。
20.根据权利要求19的重组变态反应原，其特征在于它是源自分类目Fagales、Oleales和Pinales的花粉变态反应原的突变体。
21.根据权利要求20的重组变态反应原，其特征在于它是Bet v 1的突变体。
22.根据权利要求21的重组变态反应原，其特征在于一种或多种替换选自V2、D72、E87、K-129、E-60、N-47、K-65、P-108、N-159、D-93、K-123、K-32、D-125、R-145、D-109、E-127、Q-36、E-131、L-152、E-6、E-96、D-156、P-63、H-76、E-8、K-134、E-45、T-10、V-12、K-20、S-155、H-126、P-50、N-78、K-119、V-2、L-24、E-42、N-4、A-153、I-44、E-138、G-61、A-130、R-70、N-28、P-35、S-149、K-103、Y-150、H-154、N-43、A-106、K-115、P-14、Y-5、K-137、E-141、E-87和E-73。
23.根据权利要求19的重组变态反应原，其特征在于它是源自分类目Poales的花粉变态反应原的突变体。
24.根据权利要求19的重组变态反应原，其特征在于它是源自分类目Asterales和Urticales的花粉变态反应原的突变体。
25.根据权利要求18的重组变态反应原，其特征在于它是屋尘螨变态反应原的突变体。
26.根据权利要求25的重组变态反应原，其特征在于它是源自嗜皮螨属(Dermatophagoides)的螨变态反应原的突变体。
27.根据权利要求18的重组变态反应原，其特征在于它是蟑螂变态反应原的突变体。
28.根据权利要求18的重组变态反应原，其特征在于它是动物变态反应原的突变体。
29.根据权利要求28的重组变态反应原，其特征在于它是源自猫、狗或马的动物变态反应原的突变体。
30.根据权利要求1-17中任何一项的重组变态反应原，其特征在于它是毒液变态反应原的突变体。
31.根据权利要求30的重组变态反应原，其特征在于它是源自分类学膜翅目(Hymenoptera)的毒液变态反应原的突变体。
32.根据权利要求31的重组变态反应原，其特征在于它是来自分类学目胡蜂(Vespidae)、蜜蜂(Apidae)和蚁(Formicoidae)的毒液变态反应原的突变体。
33.根据权利要求30-32中任何一项的重组变态反应原，其特征在于它是Ves v 5的突变体。
34.根据权利要求33的重组变态反应原，其特征在于一或多个替换选自K-16、K-185、K-11、K-44、K-210、R-63、K-13、F-6、K-149、K-128、E-184、K-112、F-157、E-3、K-29、N-203、N-34、K-78、K-151、L-15、L-158、Y-102、W-186、K-134、D-87、K-52、T-67、T-125、K-150、Y-40、Q-48、L-65、K-81、Q-101、Q-208、K-144、N-8、N-70、H-104、Q-45、K-137、K-159、E-205、N-82、A-111、D-131、K-24、V-36、N-7、M-138、T-209、V-84、K-172、V-19、D-56、P-73、G-33、T-106、N-170、L-28、T-43、Q-114、C-10、K-60、N-31、K-47、E-5、D-145、V-38、A-127、D-156、E-204、P-71、G-26、Y-129、D-141、F-201、R-68、N-200、D-49、S-153、K-35、S-39、Y-25、V-37、G-18、W-85和I-182。
35.根据权利要求1-34中任何一项用作药物的重组变态反应原。
36.根据权利要求1-34中任何一项的重组变态反应原的用途，用于制备预防和/或治疗变态反应的药物。
37.包含两种或更多根据权利要求1-34中任何一项的重组变态反应原突变体的组合物，其中每一个变体都以具有至少一个初级突变而定义，该突变在至少一个其他的变体中不存在；其中对于每一个变体，在每一个不存在的初级突变的15的半径之内不存在二级突变。
38.根据权利要求37的组合物，包含2～12个，优选3～10个，更优选4～8个且最优选5～7个变体。
39.根据权利要求37或38的用作药物的组合物。
40.根据权利要求37或38的组合物的用途，用以制备预防和/或治疗变态反应的药物。
41.药物组合物，其特征在于它包含根据权利要求1-34中任何一项的重组变态反应原或根据权利要求37或38的组合物，可选结合药物学上可接受的载体和/或赋形剂，以及可选结合佐剂。
42.根据权利要求41的药物组合物，其特征在于它为抗变态反应疫苗的形式，该变态反应由天然存在的变态反应原在遭受变态反应的患者中引起。
43.在被试者中产生免疫反应的方法，包含向被试者施用根据权利要求1-34中任何一项的重组变态反应原、根据权利要求37或38的组合物或根据权利要求41或42的药物组合物。
44.对被试者进行的疫苗接种或治疗，包含向被试者施用根据权利要求1-34中任何一项的重组变态反应原、根据权利要求37或38的组合物或根据权利要求41或42的药物组合物。
45.制备根据权利要求41或42的药物组合物的方法，其包含将根据权利要求1-34中任何一项的重组变态反应原或根据权利要求37或38的组合物与药物学上可接受的物质和/或赋形剂混合。
46.由根据权利要求45的方法可获得的药物组合物。
47.在被试者中治疗、预防或减轻变态反应的方法，包含向被试者施用根据权利要求1-34中任何一项的重组变态反应原、根据权利要求37或38的组合物或根据权利要求41或42中任何一项的药物组合物。
48.制备根据权利要求1-34中任何一项重组变态反应原的方法，其特征在于
a)确定天然存在的变态反应原中的一些氨基酸残基，其具有至少20％的溶剂可接近性；
b)以这样的方式选择至少4个确定的氨基酸残基，以使得每个所选氨基酸与其他所选氨基酸相互间隔至少15，且所选氨基酸以这种方式分布，以使得至少一个具有8002面积的圆形表面区域不包含所选氨基酸；和
c)对每个所选氨基酸进行初级突变，使变态反应原突变体的特异的IgE结合能力与天然存在的变态反应原的IgE结合能力相比减少，其中每个初级突变都是用其他的氨基酸替换所选氨基酸残基，前者在该天然存在的变态反应原所源自的分类学物种中不发生于任何已知同源蛋白质氨基酸序列的相同位置上。
49.根据权利要求48的方法，其特征在于以溶剂可接近性对所述确定的氨基酸残基进行分级，且将具有较大溶剂可接近性的一或多个氨基酸替换。
50.根据权利要求48或49的方法，其特征在于选择确定的氨基酸残基，它们在该天然存在的变态反应原所源自的物种中的所有已知同源蛋白质中以超过70％的一致性保守。
51.根据权利要求50的方法，其特征在于以在该天然存在的变态反应原所源自的物种中的所有已知同源蛋白质中的保守程度来对其中确定的氨基酸残基进行分级，且将具有较大保守性的一或多个氨基酸替换。
52.根据权利要求48-51中任何一项的方法，包含选择确定的氨基酸以形成变态反应原突变体，后者具有与天然存在的变态反应原基本上相同的α-碳主链三级结构。
53.根据权利要求48-52中任何一项的方法，其特征在于对氨基酸残基的替换通过定点突变实现。
54.制备根据权利要求1-34中任何一项的重组变态反应原的方法，其特征在于该变态反应原从由编码相应的天然存在的变态反应原的DNA的进行DNA改组(DNA shuffling)(分子培育)所获得的DNA序列生产。
55.编码根据权利要求1-34中任何一项的重组变态反应原的DNA序列、其衍生物、其部分序列、其简并的序列或在严紧条件下与其杂交的序列，其中该衍生物、部分序列、简并序列或杂交序列编码具有至少一个B细胞抗原决定部位的肽。
56.根据权利要求55的DNA序列，它是编码天然存在的变态反应原的DNA序列的衍生物。
57.根据权利要求56的DNA序列，其中的衍生物通过对编码天然存在的变态反应原的DNA的定点突变而获得。
58.根据权利要求55-57中任何一项的DNA序列，其中该序列是图3所示序列的衍生物，其中该DNA序列经突变而编码具有至少4个突变的变态反应原，这些突变选自：V2、D72、E87、K-129、E-60、N-47、K-65、P-108、N-159、D-93、K-123、K-32、D-125、R-145、D-109、E-127、Q-36、E-131、L-152、E-6、E-96、D-156、P-63、H-76、E-8、K-134、E-45、T-10、V-12、K-20、S-155、H-126、P-50、N-78、K-119、V-2、L-24、E-42、N-4、A-153、I-44、E-138、G-61、A-130、R-70、N-28、P-35、S-149、K-103、Y-150、H-154、N-43、A-106、K-115、P-14、Y-5、K-137、E-141、E-87和E-73。
59.根据权利要求55-57中任何一项的DNA序列，其中的序列是图13所示序列的衍生物，其中该DNA序列经突变而编码具有至少4个突变的变态反应原，这些突变选自：K-16、K-185、K-11、K-44、K-210、R-63、K-13、F-6、K-149、K-128、E-184、K-112、F-157、E-3、K-29、N-203、N-34、K-78、K-151、L-15、L-158、Y-102、W-186、K-134、D-87、K-52、T-67、T-125、K-150、Y-40、Q-48、L-65、K-81、Q-101、Q-208、K-144、N-8、N-70、H-104、Q-45、K-137、K-159、E-205、N-82、A-111、D-131、K-24、V-36、N-7、M-138、T-209、V-84、K-172、V-19、D-56、P-73、G-33、T-106、N-170、L-28、T-43、Q-114、C-10、K-60、N-31、K-47、E-5、D-145、V-38、A-127、D-156、E-204、P-71、G-26、Y-129、D-141、F-201、R-68、N-200、D-49、S-153、K-35、S-39、Y-25、V-37、G-18、W-85和I-182。
60.根据权利要求55-57中任何一个的DNA序列，其中的序列是图16所示序列的衍生物，其中的DNA序列经突变而编码具有至少4个突变的变态反应原，这些突变选自：R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109和R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109和K-15。
61.包含根据权利要求55-60中任何一项的DNA的表达载体。
62.包含权利要求61的表达载体的宿主细胞。
63.生产重组变态反应原突变体的方法，该方法包含培养根据权利要求62的宿主细胞的步骤。
64.根据权利要求1-34中任何一项或由根据权利要求55-60中任何一项的DNA序列编码的重组变态反应原，其包含至少一种T细胞抗原决定部位，该抗原决定部位能够刺激特异于该天然存在的变态反应原的T细胞克隆或T细胞系。
65.用根据权利要求1-34中任何一项的重组变态反应原突变体或根据权利要求37或38的组合物来估计对被试者治疗的适当性、安全性或结果的诊断测定，其中将被试者的含IgE的样品与该突变体或该组合物混合并估计该样品中的IgE和该突变体的反应性水平。
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