PL212139B1 - Zrekombinowany alergen, zastosowanie zrekombinowanego alergenu, kompozycja zawierająca dwa lub więcej wariantów zrekombinowanych zmutowanych alergenów, zastosowanie takiej kompozycji, kompozycja farmaceutyczna zawierająca zrekombinowany alergen lub wymienioną kompozycję, zastosowanie zrekombinowanego alergenu, kompozycji lub kompozycji farmaceutycznej, sposób przygotowania kompozycji farmaceutycznej, sposób przygotowania zrekombinowanego alergenu, sposób przygotowania biblioteki zrekombinowanego alergenu, sekwencja DNA kodująca zrekombinowany alergen, wektor ekspresyjny obejmujący wymienione DNA, komórka gospodarza zawierająca taki wektor ekspresyjny, sposób produkcji zrekombinowanego mutanta alergenu, oraz oznaczenie diagnostyczne do oceny odpowiedniości, bezpieczeństwa lub wyniku terapii - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest zrekombinowany alergen, zastosowanie zrekombinowanego alergenu, kompozycja zawierająca dwa lub więcej wariantów zrekombinowanych, zmutowanych alergenów, zastosowanie takiej kompozycji, kompozycja farmaceutyczna zawierająca zrekombinowany alergen lub wymienioną kompozycję, zastosowanie zrekombinowanego alergenu, kompozycji lub kompozycji farmaceutycznej, sposób przygotowania kompozycji farmaceutycznej, sposób przygotowania zrekombinowanego alergenu, sposób przygotowania biblioteki zrekombinowanego alergenu, sekwencja DNA kodująca zrekombinowany alergen, wektor ekspresyjny obejmujący wymienione DNA, komórka gospodarza zawierająca taki wektor ekspresyjny, sposób produkcji zrekombinowanego mutanta alergenu oraz oznaczenie diagnostyczne do oceny odpowiedniości, bezpieczeństwa lub wyniku terapii.

Tak więc, niniejszy wynalazek dotyczy diagnostyki i terapii alergii. Bardziej dokładnie, wynalazek zapewnia sposoby uzyskania zmutowanych cząsteczek alergenów odpowiednich do tych celów. Ponadto, wynalazek dotyczy nowych zrekombinowanych alergenów, które są mutantami naturalnie występujących alergenów, jak i ich zastosowania. Wynalazek dotyczy także kompozycji zawierającej mieszaninę nowych zmutowanych alergenów. Ponadto, wynalazek dotyczy sposobu przygotowania takich zrekombinowanych zmutowanych alergenów, jak i kompozycji farmaceutycznych, obejmujących szczepionki, zawierających zrekombinowane zmutowane alergeny. W dalszych wykonaniach, niniejszy wynalazek dotyczy sposobów generowania odpowiedzi odpornościowych u osobnika, szczepienia lub leczenia osobnika, jak i procesów przygotowania kompozycji według wynalazku.

Stan techniki

Osoby o genetycznych predyspozycjach stają się uczulone (alergiczne) na antygeny pochodzące z szeregu źródeł środowiskowych, na alergeny, na które są eksponowane te osoby. Reakcja alergiczna zachodzi, gdy uprzednio uczulona osoba jest ponownie eksponowana na ten sam lub homologiczny alergen. Odpowiedzi alergiczne sięgają od kataru siennego, zapalenia nosa i spojówek, nieżytu nosa i astmy do ogólnoustrojowej anafilaksji i śmierci, na przykład w odpowiedzi na ukąszenie przez, na przykład, pszczołę lub szerszenia albo przez owada. Reakcja jest natychmiastowa i może być powodowana przez różne alergeny atopowe, takie jak związki pochodzące z traw, drzew, owadów, pokarmów, leków, chemikaliów i perfum.

Jednak odpowiedzi nie zachodzą, gdy osobnik eksponowany jest na alergen po raz pierwszy. Wstępna odpowiedź przystosowawcza zajmuje jakiś czas i na ogół nie powoduje żadnych objawów. Jednak, gdy przeciwciała i komórki T zdolne do reakcji z alergenem zostają wyprodukowane, to każda dowolna późniejsza ekspozycja może powodować objawy. Tak więc, odpowiedzi alergiczne wykazują, że sama odpowiedź odpornościowa może powodować znaczące stany patologiczne, które mogą stanowić zagrożenie dla życia.

Przeciwciała biorące udział w alergii atopowej należą przede wszystkim do immunoglobulin klasy IgE. IgE wiąże specyficzne receptory na powierzchni komórek tucznych i bazofili. Po wytworzeniu kompleksu specyficznego alergenu z IgE związanym z komórkami tucznymi, połączenie poprzeczne receptorów na powierzchni komórki powoduje sygnalizację przez receptory i odpowiedź fizjologiczną komórek docelowych. Degranulacja powoduje uwolnienie, na przykład, histaminy, heparyny, czynnika chemotaktycznego dla leukocytów kwasochłonnych, leukotrienów C4, D4 i E4, które powodują przedłużone zwężenie mięśni gładkich oskrzelików. Powstałe efekty mogą mieć charakter ogólnoustrojowy lub miejscowy.

Reakcje nadwrażliwości z udziałem przeciwciał mogą być podzielone na cztery klasy, a mianowicie typu I, typu II, typu III i typu IV. Reakcja alergiczna typu I jest klasyczną bezpośrednią reakcją nadwrażliwości zachodzącą w ciągu sekund lub minut po ekspozycji na antygen. W tych objawach bierze udział IgE specyficzny w stosunku do alergenu.

Powszechnie reakcje alergiczne obserwowane są jako odpowiedź na alergeny białkowe obecne, na przykład, w pyłkach, w roztoczach kurzu domowego, we włosach i w łupieżu zwierząt, w jadach i produktach spożywczych.

Aby zmniejszyć lub wyeliminować reakcje alergiczne, często stosowane jest starannie kontrolowane i powtórzone podawanie szczepionek na alergię. Szczepienie na alergię tradycyjnie przeprowadzane jest przez podawanie pozajelitowe, donosowe, lub podjęzykowe we wzrastających dawkach przez całkiem długi okres czasu i powoduje odczulenie pacjenta. Dokładny mechanizm odpornościoPL 212 139 B1 wy nie jest znany, ale indukowane różnice w fenotypie komórek T specyficznych względem alergenu uważane są za szczególnie ważne.

Szczepienie przeciw alergiom

Koncepcja szczepienia oparta jest na dwóch podstawowych cechach układu odpornościowego, a mianowicie specyficzności i pamięci. Szczepienie jest bodźcem dla układu odpornościowego biorcy i po powtórzonej ekspozycji na podobne białka układ odpornościowy będzie w stanie odpowiadać bardziej intensywnie na prowokację, na przykład, przez zakażenie mikroorganizmem. Szczepionki są mieszaninami białek przeznaczonych do użycia w szczepieniu dla celów uzyskania takiej odpowiedzi ochronnej u biorcy. Ochrona będzie zawierała tylko składniki obecne w szczepionce i antygeny homologiczne.

W porównaniu z innymi rodzajami szczepień, szczepienie przeciw alergiom jest skomplikowane przez istnienie będącej w toku odpowiedzi odpornościowej u pacjentów alergicznych. Ta odpowiedź odpornościowa charakteryzowana jest przez obecność specyficznych dla alergenów IgE biorących udział w uwalnianiu objawów alergicznych po ekspozycji na alergeny. Tak więc, szczepienie na alergie stosujące alergeny z naturalnych źródeł ma własne ryzyko efektów ubocznych mających w ostatecznej konsekwencji efekt zagrożenia życiu pacjenta.

Podejścia zmierzające do obejścia tego problemu mogą być podzielone na trzy kategorie. W praktyce często łączy się środki z więcej niż jednej kategorii. Pierwsza kategoria środków obejmuje podanie kilku małych dawek przez przedłużony okres czasu, aby osiągnąć znaczącą dawkę zakumulowaną. Druga kategoria środków obejmuje fizyczną modyfikację alergenów przez włączenie alergenów do substancji żelowych, takich jak wodorotlenek glinu. Formuły z wodorotlenkiem glinu mają efekt adiuwantu i efekt depotu wolnego uwalniania alergenu zmniejszając stężenie tkankowe aktywnych składników alergenu. Trzecia kategoria środków obejmuje modyfikacje chemiczne alergenów w celu zmniejszenia alergenności, tzn. wiązania IgE.

Szczegółowy mechanizm leżący u podstaw udanych szczepień na alergię pozostaje kontrowersyjny. Jest zgoda co do tego, że komórki T odgrywają kluczową rolę w ogólnej regulacji odpowiedzi odpornościowych. Według obecnego konsensusu, stosunek między dwoma skrajnościami fenotypów komórek T, Th1 i Th2, określa status alergiczny osobnika. Po stymulacji alergenem komórki Th1 wydzielają interleukiny zdominowane przez interferon-γ prowadząc do ochronnej odporności i osobnik jest zdrowy. Z drugiej strony komórki Th2 wydzielają przede wszystkim interleukinę 4 i 5 prowadząc do syntezy IgE i eozynofilii i osobnik jest alergiczny. Badania in vitro wykazały możliwość zmiany odpowiedzi komórek T specyficznych na alergen przez prowokację pochodzącymi od alergenu peptydami zawierającymi odpowiednie epitopy komórek T. Obecne podejścia do nowych szczepionek na alergię są więc w znacznym stopniu oparte na adresowaniu komórek T, przy czym celem jest wyciszenie komórek T (indukcja anergii) lub przesunięcie odpowiedzi z fenotypu Th2 do fenotypu Th1.

Epitopy wiążące przeciwciała (epitopy komórek B)

Badania krystalograficzne z promieniami Rentgena kompleksów Fab-antygen zwiększyły zrozumienie epitopów wiążących przeciwciało. Według tego typu analizy epitopy wiążące przeciwciało mogą być definiowane jako część powierzchni antygenu obejmująca atomy z reszt 15-25 aminokwasów, które są w obrębie odległości od atomów przeciwciała pozwalając na bezpośrednią interakcję. Powinowactwo interakcji antygen-przeciwciało nie może być przewidziane z entalpii wnoszonej przez same interakcje van der Waalsa, wiązania wodorowe lub wiązania jonowe. Entropia związana z nieomal całkowitym wyrzuceniem cząsteczek wody z powierzchni międzyfazowej przedstawia wkład energii podobnej pod względem wielkości. Oznacza to, że doskonałe dopasowanie między konturami oddziałujących komórek jest głównym czynnikiem leżącym u podstaw interakcji wysokiego powinowactwa antygen-przeciwciało.

W publikacji WO 97/30150 (poz. 1 literatury) zastrzegana jest populacja cząsteczek białek, które to cząsteczki białka mają rozmieszczenie specyficznych mutacji w sekwencji aminokwasów w porównaniu z białkiem rodzicielskim. Z opisu widać, że wynalazek dotyczy produkcji analogów, które są modyfikowane w porównaniu z białkiem rodzicielskim, ale które są pobierane, trawione i prezentowane komórkom T w taki sam sposób, jak białko rodzicielskie (naturalnie występujące alergeny). W ten sposób uzyskiwana jest zmodyfikowana odpowiedź komórek T. Biblioteki zmodyfikowanych białek przygotowuje się stosując technikę określaną jako PM (Parsimonious Mutagenesis - oszczędna mutageneza).

W publikacji WO 92/02621 (poz. 2 literatury) opisane są zrekombinowane cząsteczki DNA, które to cząsteczki zawierają DNA kodujące polipeptyd mający co najmniej jeden epitop alergenu z drzew

PL 212 139 B1 z rzędu Fagales, alergen wybrany jest z Aln g 1, Cor a 1 i Bet v 1. Opisane tu zrekombinowane cząsteczki wszystkie mają sekwencję aminokwasów lub część sekwencji aminokwasów, która odpowiada sekwencji naturalnie występującego alergenu.

Publikacja WO 90/11293 (poz. 3 literatury) dotyczy m.in. izolowanych alergenicznych peptydów pyłku ambrozji i modyfikowanych peptydów pyłku ambrozji. Peptydy tam ujawnione mają sekwencję aminokwasów odpowiadającą albo sekwencji naturalnie występującego alergenu albo jego naturalnie występujących izoform.

Chemiczna modyfikacja alergenów

Podjęto kilka podejść do chemicznej modyfikacji alergenów. Podejścia we wczesnych latach siedemdziesiątych obejmują chemiczne łączenie alergenów stosując formaldehyd, etc., produkując tak zwane „alergoidy”. Rozumowaniem, na którym oparte były te podejścia, było losowe niszczenie epitopów wiążących IgE przez przyłączenie ligandu chemicznego, w ten sposób zmniejszając wiązanie IgE przy zatrzymaniu immunogenności przez zwiększoną masę kompleksów. Nieodłączne wady produkcji „alergoidów” związane są z trudnościami w kontroli procesu chemicznego połączenia poprzecznego i trudnościami w analizie i standaryzacji powstałych kompleksów o wysokiej masie cząsteczkowej. „Alergoidy” są obecnie stosowane klinicznie i ze względu na losowe niszczenie epitopów IgE mogą być podawane wyższe dawki w porównaniu ze szczepionkami konwencjonalnymi, ale parametry bezpieczeństwa i skuteczności nie są poprawione w stosunku do użycia szczepionek konwencjonalnych.

Niedawne podejścia do modyfikacji chemicznej alergenów mają na celu całkowitą dysrupcję struktury trzeciorzędowej alergenu, w ten sposób eliminując wiązanie IgE zakładając, że niezbędny cel terapeutyczny jest komórką T specyficzną względem alergenu. Takie szczepionki zawierają peptydy syntetyczne pochodzące z sekwencji alergenu reprezentujące minimalne epitopy komórek T, dłuższe peptydy reprezentujące połączone epitopy komórek T, syntetyczne peptydy pochodzące od dłuższych sekwencji alergenów reprezentujące regiony immunodominujących epitopów komórek T lub cząsteczki alergenu przecięte na dwie połowy za pomocą technik rekombinacji. Innym podejściem opartym na takim rozumowaniu było zaproponowanie stosowania izoform zrekombinowanych o „niskim wiązaniu IgE”. W ostatnich latach stało się jasne, że naturalne alergeny są heterogenne, zawierają izoalergeny i warianty mające podstawione aż do około 25% swoich aminokwasów. Niektóre zrekombinowane izoalergeny okazały się mniej wydajne w wiązaniu IgE, być może ze względu na nieodwracalną denaturację i wynikającą z tego całkowitą dysrupcję struktury trzeciorzędowej.

Mutageneza in vitro i szczepienia przeciw alergii

Próby zmniejszania alergenności za pomocą mutagenezy ukierunkowanej in vitro były wykonane stosując kilka alergenów, w tym Der f 2 (Takai i wsp., poz. 4 literatury), Der p 2 (Smith i wsp., poz. 5 literatury), alergen 39 kDa Dermatophagoides farinae (Aki i wsp., poz. 6 literatury), fosfolipazę A2 jadu pszczoły (Forster i wsp., poz. 7 literatury), Ara h 1 (Burks i wsp., poz. 8 literatury), Ara h 2 (Stanley i wsp., poz. 9 literatury), Bet v 1 (Ferreira i wsp., poz. 10 i 11 literatury), profilinę brzozy (Wiedemann i wsp., poz. 12 literatury) i Ory s 1 (Alvarez i wsp., poz. 13 literatury).

Rozumowanie, na którym oparte były te podejścia, jest ponowne adresowanie komórek T specyficznych względem alergenu, zarazem zmniejszając ryzyko efektów ubocznych z udziałem IgE przez dysrupcję struktury trzeciorzędowej zrekombinowanego zmutowanego alergenu.

Praca Ferreira i wsp. (poz. 11 literatury) opisuje zastosowanie mutagenezy ukierunkowanej w celu zmniejszenia wiązania IgE. Chociaż w tej pracy wymieniana jest trójwymiarowa struktura Bet v 1, autorzy nie stosują tej struktury do przewidywania eksponowanych na rozpuszczalnik reszt aminokwasów do mutowania, z których połowa ma niski stopień ekspozycji na rozpuszczalnik. Stosują raczej metodę opracowaną dla przewidywania reszt funkcjonalnych w białkach. Choć autorzy dyskutują zachowanie struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla, ta koncepcja nie jest częścią strategii terapeutycznej, ale jest tylko włączona, aby ocenić wiązanie IgE in vitro. Ponadto, przedstawione dowody nie są wystarczające, ponieważ normalizacja widm CD uniemożliwia ocenę denaturacji części próbki, co jest powszechnym problemem. Nie jest wspomniana strategia terapeutyczna z celem indukowania tolerancji w alergenospecyficznych komórkach T i inicjacji nowej odpowiedzi odpornościowej.

Praca autorstwa Wiedemann i wsp. (poz. 12 literatury) opisuje zastosowanie mutagenezy ukierunkowanej i syntezy peptydów w celu charakterystyki epitopu przeciwciał monoklonalnych. Badania wykazują, że podstawienie aminokwasu eksponowanego na powierzchni ma zdolność modyfikowania właściwości wiązania przeciwciała monoklonalnego, co nie jest zadziwiające uwzględniając powszechną wiedzę. Opisane doświadczenia nie są zaprojektowane, aby ocenić modulację wiązania

PL 212 139 B1 przeciwciał poliklonalnych, takich jak IgE surowicy alergicznych pacjentów. Jedno z zawartych doświadczeń stosuje IgE surowicy i choć to doświadczenie nie jest odpowiednie dla oceny ilościowej, wykonane mutacje nie wydają się wpływać na wiązanie IgE.

Praca Smith'a i wsp. (poz. 5 literatury) opisuje stosowanie mutagenezy ukierunkowanej w celu mapowania epitopów przeciwciała monoklonalnego i zmniejszenia wiązania IgE. Autorzy nie znają struktury trzeciorzędowej i nie czynią żadnych prób oceny konserwacji struktury trzeciorzędowej szkieletu a-węgla. Stosowany algorytm nie zapewnia, że aminokwasy wybrane do mutacji są faktycznie eksponowane na powierzchni cząsteczki. Tylko jeden z opisanych mutantów prowadzi do znaczącego zmniejszenia wiązania IgE. Ten mutant jest defektywny w wiązaniu wszystkich testowanych przeciwciał wskazując, że zaburzona jest struktura trzeciorzędowa. Autorzy nie określają strategii terapeutycznej i nie wspominają o inicjacji nowej odpowiedzi odpornościowej.

Praca autorstwa Colombo i wsp. (poz. 14 literatury) opisuje badanie epitopu wiążącego IgE przez stosowanie mutagenezy ukierunkowanej i syntezy peptydów. Autorzy stosują trójwymiarowy model komputerowy struktury oparty na strukturze kryształu białka homologicznego, aby zilustrować obecność epitopu na powierzchni cząsteczki. Dalsza obecność epitopu na innym alergenie wykazującym homologię struktury pierwszorzędowej adresowana jest przez zastosowanie syntetycznych peptydów reprezentujących epitop. Strategia terapeutyczna oparta jest na leczeniu z wykorzystaniem tego syntetycznego peptydu reprezentującego monowalencyjny epitop wiążący IgE.

Praca Spangforf'a i wsp. (poz. 15 literatury) opisuje trójwymiarową strukturę i konserwowane grupy eksponowane na powierzchni głównego alergenu brzozy. Praca nie wymienia mutagenezy ukierunkowanej, ani też nie adresuje zastosowań terapeutycznych.

W żadnych z opisanych powyżej badań wiązanie IgE nie jest obniżane przez podstawienie aminokwasów eksponowanych na powierzchni przy zachowaniu struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla. Nie jest też wymienione inicjowanie nowej ochronnej odpowiedzi odpornościowej.

Publikacja WO 01/83559 ujawnia sposób selekcji wariantu białka ze zmodyfikowaną immunogennością przez stosowanie sekwencji peptydowych wiążących przeciwciała do lokalizacji sekwencji epitopów na 3-wymiarowej strukturze wyjściowego białka. Następnie, definiuje się obszar epitopu i mutuje się jeden lub więcej z aminokwasów określających obszar epitopu. Wynalazek ilustrują enzymy przemysłowe, które działają jako alergeny.

Publikacja WO 99/47680 ujawnia wprowadzanie syntetycznych podstawień aminokwasów do zdefiniowanych krytycznych pozycji podczas utrzymywania struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla alergenu. W szczególności WO 99/47680 ujawnia zrekombinowany alergen, który jest nie występującym naturalnie mutantem pochodzącym od naturalnie występującego alergenu, gdzie co najmniej jedna eksponowana na powierzchni konserwowana reszta aminokwasu epitopu komórki B podstawiona jest przez inną resztę, która nie występuje w tej samej pozycji w sekwencji aminokwasów żadnego znanego białka homologicznego w obrębie rzędu taksonomicznego, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen, przy czym ten zmutowany alergen ma zasadniczo taką samą strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla jak ten naturalnie występujący alergen i specyficzne wiązanie IgE do zmutowanego alergenu jest zmniejszone w porównaniu z wiązaniem tego naturalnie występującego alergenu.

Zrekombinowany alergen ujawniony w WO 99/47680 jest do uzyskania przez:

a) identyfikację reszt aminokwasów w naturalnie występującym alergenie, które konserwowane są z identycznością większą od 70% we wszystkich znanych białkach homologicznych w obrębie rzędu taksonomicznego, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen;

b) zdefiniowanie co najmniej jednej grupy konserwowanych reszt aminokwasów, które połączo₂ ne są spójnie na co najmniej 400 A powierzchni trójwymiarowej cząsteczki alergenu, co jest zdefiniowane przez posiadanie dostępności dla rozpuszczalnika co najmniej 20%, przy czym ta co najmniej jedna grupa obejmuje co najmniej jeden epitop komórek B i przez

c) podstawienie co najmniej jednej reszty aminokwasu w tej co najmniej jednej grupie przez inny aminokwas, który jest nie konserwowany w danej pozycji podczas, gdy zasadniczo zachowuje ogólną strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla cząsteczki alergenu.

Zgłoszenie patentowe PCT/DK 01/00764 dotyczy mutantów naturalnie występujących alergenów. Ujawnione są w nim następujące specyficzne mutanty Bet v 1:

Mutant A: Asn28Thr, Lys32Gln, Asn78Lys, Lys103Val, Arg145Glu, Asp156His, +160Asn.

Mutant B: Tyr5Val, Glu42Ser, Glu45Ser, Asn78Lys, Lys103Val, Lys123Ile, Lys134Glu, Asp156His.

PL 212 139 B1

Mutant 2628: Tyr5Val, Glu45Ser, Lys65Asn, Lys97Ser, Lys134Glu.

Mutant 2637: Alal6Pro, Asn28Thr, Lys32Gln, Lys103Thr, Pro108Gly, Leu152Lys, Ala153Gly, Ser155Pro.

Mutant 2724: N28T, K32Q, N78K, K103V, P108G, R145E, D156H, +160N.

Mutant 2733: Tyr5Val, Lys134Glu, Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Lys65Asn, Asn78Lys, Lys103Val, Lys97Ser, Pro108Gly, Arg145Glu, Asp156His, +160Asn.

Mutant 2744: Tyr5Val, Lys134Glu, Glu42Ser, Glu45Ser, Asn78Lys, Lys103Val, Lys123Ile, Asp156His, +160Asn.

Mutant 2753: Asn28Thr, Lys32Gln, Lys65Asn, Glu96Leu, Lys97Ser, Pro108Gly, Asp109Asn, Asp125Tyr, Glu127Ser, Arg145Glu.

Mutant 2744 + 2595: Y5V, N28T, K32Q, E42S, E45S, N78K, K103V, P108G, K123I, K134E, D156H, +160N.

Mutant 2744 + 2628: Y5V, E42S, E45S, K65N, N78K, K97S, K103V, K123I, K134E, D156H, +160N.

Mutant 2744 + 2595 + 2628: Y5V, N28T, K32Q, E42S, E45S, K65N, N78K, K97S, K103V, P108G, K123I, K134E, D156H, +160N.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia model teoretyczny reakcji między alergenem i komórkami tucznymi przez wiązanie poprzeczne IgE; fig. 2 przedstawia (z lewej) powierzchnię cząsteczki Bet v 1 z umieszczeniem grup 1 do 10 przedstawionym na czarno i szaro; (z prawej) widok reszt aminokwasów stanowiących grupy 1 do 10; grupy są oznaczone 1 do 10; fig. 3 przedstawia startery oligonukleotydowe specyficzne do mutowania Bet v 1; zmutowane nukleotydy podkreślono; fig. 4 przedstawia dwa startery do ogólnego stosowania (określone jako „cały sensowny” i „cały nonsensowny”), które były syntetyzowane i stosowane do wszystkich mutantów; fig. 5 przedstawia sekwencję DNA i aminokwasów naturalnie występującego alergenu Bet v 1 jak i szereg mutacji Bet v 1; fig. 6 przedstawia hamowanie wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE surowicy z puli alergicznych pacjentów przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta Bet v 1 Glu45Ser; fig. 7 przedstawia hamowanie wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE surowicy z puli alergicznych pacjentów przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln; fig. 8 przedstawia hamowanie wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE surowicy z puli alergicznych pacjentów przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta Bet v 1 Pro108Gly; fig. 9 przedstawia hamowanie wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE surowicy z puli alergicznych pacjentów przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta Bet v 1 Glu60Ser; fig. 10 przedstawia widma CD zrekombinowanego i mutanta (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly) zapisane w prawie równych stężeniach; fig. 11 przedstawia hamowanie wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE surowicy z puli alergicznych pacjentów przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly); fig. 12 przedstawia graficzną ilustrację techniki mutacji z 2-etapowym PCR stosowane do generowania zmutowanych alergenów Bet v 1; fig. 13 przedstawia graficzną ilustracje zdarzeń mutacji PCR prowadzących do sklonowania Bet v 1 (3004), (3005), (3007) i (3009); podano startery stosowane do wprowadzania mutacji punktowych; fig. 14 przedstawia graficzną ilustracje zdarzeń mutacji PCR prowadzących do sklonowania Bet v 1 (3031) do (3045); podano zdegenerowane startery służące do wprowadzania losowych mutacji w pozycjach 10, 20, 36, 73, 87, 129 i 149, a możliwy efekt mutacji dla każdej pozycji przedstawiono u góry; fig. 15 schematycznie przedstawia startery stosowane do wytwarzania mutacji, przy czym (I) pokazuje startery sensowne i nonsensowne, a (II) pokazuje ostateczne zrekombinowane białko niosące mutacje we wskazanych pozycjach; fig. 16 przedstawia ilustrację konstrukcji mutantów Bet v 1 i listę stosowanych starterów; mutanty zawierają od pięciu do dziewięciu aminokwasów; fig. 17 przedstawia wprowadzone mutacje punktowe na powierzchni Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637); w mutancie Bet v 1 (2628) wprowadzono pięć mutacji pierwotnych w jednej połowie Bet v 1 pozostawiając drugą połowę niezmienioną, a w mutancie Bet v 1 (2637) wprowadzono pięć pierwotnych i trzy wtórne mutacje w drugiej połowie, pozostawiając pierwszą połowę niezmienioną; fig. 18 przedstawia widma dichroizmu kołowego (CD) zrekombinowanego Bet v 1.2801 (typ dziki) i mutanta Bet v 1 (2637) zapisane przy prawie identycznych stężeniach; fig. 19 przedstawia hamowanie wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1.2801 (typ dziki) do IgE surowicy z puli alergicznych pacjentów przez niebiotynylowany Bet v 1.2801 i przez Bet v 1 (2628), Bet v 1 (2637), i mieszaninę 1:1 Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637); fig. 20 przedstawia uwalnianie histaminy w ludzkich komórkach bazofili dla Bet v 1.2801 (typ dziki), Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637);

PL 212 139 B1 fig. 21 przedstawia uwalnianie histaminy w ludzkich komórkach bazofili Bet v 1.2801 (typ dziki), Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637); fig. 22 przedstawia mutacje punktowe na powierzchni Bet v 1 (2744); fig. 23 przedstawia mutacje punktowe na powierzchni Bet v 1 (2753); fig. 24 przedstawia mutacje punktowe na powierzchni Bet v 1 (2744) i Bet v 1 (2753); fig. 25 przedstawia widma dichroizmu kołowego (CD) zrekombinowanego Bet v 1.2801 (typ dziki) i Bet v 1 (2744), zapisane przy prawie równych stężeniach; fig. 26 przedstawia uwalnianie histaminy w ludzkich komórkach bazofili dla Bet v 1.2801 (typ dziki) i mutanta Bet v 1 (2744); fig. 27 przedstawia uwalnianie histaminy w ludzkich komórkach bazofili dla Bet v 1.2801 (typ dziki) i mutanta Bet v 1 (2744); fig. 28 przedstawia mutacje punktowe na powierzchni Bet v 1 (2733); fig. 29 przedstawia proliferację limfocytów krwi obwodowej wyrażanych jako Indeks Stymulacji (SI) dla różnych preparatów Bet v 1; fig. 30-32 przedstawiają profil cytokin komórek T stymulowanych różnymi preparatami Bet v 1, przy czym fig. 30 przedstawia pacjenta z profilem ThO, fig. 31 profil Th1, a fig. 32 profil Th2; fig. 33 przedstawia spektroskopię dichroizmu kołowego (CD) rBet v 1.2801 (•) (typ dziki) i mutanta rBet v 1 (3007) [Δ] z 12 mutacjami, zapisane przy równych stężeniach; pokazano nałożenie na siebie widm dichroizmu kołowego (CD) uzyskanych w 15°C; fig. 34 przedstawia hamowanie wiązania biotynylowanego rBet v 1.2801 do połączonej surowicy IgE z pacjentów uczulonych na brzozę przez rBet v 1.2801 (•) (typ dziki) lub mutanta rBet v 1 (3007) [Δ] z 12 mutacjami.

Cel wynalazku

Celem wynalazku jest zapewnienie ulepszonych zmutowanych białek alergenu.

Rozumowanie, na którym opiera się wynalazek

Niniejszy wynalazek oparty jest na unikalnym rozumowaniu. Według tego rozumowania mechanizm udanego szczepienia przeciwko alergiom nie jest zmianą będącej w toku odpowiedzi odpornościowej typu Th2, ale raczej równoległą inicjacją nowej odpowiedzi odpornościowej obejmującej rozpoznanie epitopów trzeciorzędowych przez komórki B i wytwarzanie przeciwciał. Uważa się, że ta nowa odpowiedź odpornościowa jest częściowo odpowiedzią odpornościową typu Th1. Gdy szczepionka (lub kompozycje farmaceutyczne) jest podawana inną drogą niż przez drogi oddechowe, przypuszcza się, że nowa odpowiedź odpornościowa ewoluuje w miejscu fizycznie oddzielonym od będącej w toku odpowiedzi Th2, pozwalając w ten sposób na równoległe występowanie dwóch odpowiedzi.

Co więcej, wynalazek oparty jest na odkryciu, że objawy alergiczne wywoływane są przez wiązanie poprzeczne alergenu z co najmniej dwoma specyficznymi IgE związanymi z powierzchnią komórek efektorowych tzn. komórek tucznych i bazofili przez receptor IgE o wysokim powinowactwie, FcεRI. Dla zilustrowania, nawiązuje się do fig. 1, która przedstawia teoretyczny model alergenu z trzema epitopami wiążącymi IgE. Indukcja uwalniania mediatora z komórki tucznej i stąd objawy alergiczne przeprowadzana jest przez powodowane przez alergen wiązanie poprzeczne IgE związanej z powierzchnią komórki tucznej - patrz fig. 1A. W sytuacji przedstawionej na fig. IB zmutowano dwa z epitopów, aby zmniejszyć ich zdolność do wiązania IgE i stąd też zapobiega się wiązaniu poprzecznemu powodowanemu przez alergen. W związku z tym należy zauważyć, że alergeny na ogół zawierają więcej niż trzy epitopy komórek B.

Po to, aby zmutowany alergen mógł wywoływać nową odpowiedź odpornościową, w tym odpowiedź IgG, zmutowany alergen musi zawierać co najmniej jeden epitop nienaruszony lub epitop, który jest tylko umiarkowanie zmieniony. Topografia powierzchni umiarkowanie zmienionego epitopu korzystnie podobna jest do epitopu oryginalnego, pozwalając na powstawanie nowych bardziej licznych przeciwciał IgG. Te nowe przeciwciała IgG mają specyficzności, które mogą współzawodniczyć z i w pewnym stopniu wykluczać wiązanie IgE do naturalnie występującego alergenu. Dalej można założyć, że im więcej epitopów, które zmutowano tak, aby eliminować lub zmniejszyć ich zdolność do wiązania IgE, tym niższe ryzyko wiązania poprzecznego powodowanego przez alergen i wynikających z tego objawów alergicznych po podaniu szczepionki alergenowej.

Według tego rozumowania niezbędne jest, aby zmutowany alergen miał strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla, która jest zasadniczo taka sama jak naturalnego alergenu.

Uprzednio zakładano, że pozycje odpowiednie do mutacji umieszczone są wyłącznie w obszarach złożonych z konserwowanych reszt aminokwasów, uważanych za niosące dominujący epitop wiążący IgE. Jednak według niniejszego wynalazku wydaje się, że reszty aminokwasów eksponowane na powierzchni odpowiednie do mutacji obejmują zarówno wysoce konserwatywne reszty i reszty, które nie są konserwowane lub tylko konserwowane w mniejszym stopniu. Takie reszty aminokwasów wydają się być rozmieszczone na całej powierzchni cząsteczki z tendencją do tworzenia małych grup pokrywających określony obszar na powierzchni cząsteczki.

PL 212 139 B1

Tak więc, zgodnie z wynalazkiem, eksponowane na powierzchni aminokwasy odpowiednie do mutacji mogą być podzielone na grupy, jak zilustrowano na fig. 2. Grupy te oparte są na tendencji tych reszt aminokwasów do tworzenia oddzielnych obszarów i te grupy są poza tym niezależne od stopnia konserwacji reszt aminokwasów. Każda grupa przedstawia szereg reszt aminokwasów eksponowanych na powierzchni, które znajdują się w ograniczonym obszarze na powierzchni alergenu. Każda indywidualna grupa najbardziej prawdopodobnie zawiera część co najmniej jednego epitopu lub co najmniej jeden nienaruszony epitop. Każda oddzielna grupa może także zawierać pozycje aminokwasów, które spowodują umiarkowanie zmieniony epitop po mutacji, jak i pozycje aminokwasów, które dadzą bardziej radykalne zmiany epitopu po mutacji. Pojedyncza reszta aminokwasu zwykle powoduje umiarkowaną zmianę epitopu, jeśli oryginalna reszta aminokwasu podstawiona jest przez aminokwas, który posiada podobne cechy chemiczne (na przykład, zmiana aminokwasu hydrofobowego na inną resztę aminokwasu hydrofobowego). Konkludując, przez wybranie mutacji wśród reszt aminokwasów z co najmniej czterech ze zdefiniowanych grup zapewnia się narzędzie do czynienia bardzo prawdopodobnym, że zmutowany alergen według wynalazku pozostaje zmutowany w kilku epitopach komórek B i ma strukturę szkieletu α-węgla podobną do naturalnie występującego alergenu.

Ponadto, ważnym aspektem niniejszego wynalazku jest to, że alergen zachowuje ciągły obszar powierzchni z powierzchnią około 400-800 A², która albo nie zawiera mutacji, albo ma tylko mutacje umiarkowane. Uważa się, że alergen zawiera szereg potencjalnych miejsc wiązania dla specyficznych IgE, gdzie każdy region ma powierzchnię około 800 A².

Idea wynalazcza niniejszego wynalazku oparta jest na rozpoznaniu, że zmutowany alergen ma mutacje zmniejszające wiązanie IgE w co najmniej 4 zdefiniowanych grupach, każda grupa zawiera eksponowane na powierzchni aminokwasy odpowiednie do mutacji, ale zachowujące co najmniej jeden nienaruszony lub umiarkowanie zmieniony epitop, aby z jednej strony, zmniejszyć spowodowane przez alergeny wiązanie poprzeczne i, z drugiej strony, pozwolić na wywołanie odpowiedzi IgG ze zdolnością wiązania współzawodniczącą ze zdolnością IgE. Tak więc, ten zmutowany alergen stanowi wysoce korzystny alergen w tym, że ryzyko reakcji anafilaktycznych jest bardzo silnie zmniejszone. Zmutowany alergen ma potencjał do podawania we względnie wyższych dawkach poprawiając jego skuteczność w generowaniu ochronnej odpowiedzi bez upośledzania bezpieczeństwa.

Również, niniejszy wynalazek oparty jest na rozpoznaniu, że szczepionka zawierająca mieszaninę różnych takich zmutowanych alergenów, gdzie idealnie wiele lub wszystkie epitopy reprezentowane są jako nienaruszone, lub epitopy, które są tylko umiarkowanie zmienione na różnych zmutowanych alergenach, byłaby równie skuteczna w swej zdolności do indukowania ochrony przeciwko alergicznym objawom jak naturalnie występujący alergen, z którego pochodzą zmutowane alergeny.

Istota wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy wprowadzania podstawień aminokwasów do alergenów. Podstawienia aminokwasów wybrane są z co najmniej czterech grup aminokwasów odpowiednich do podstawienia aminokwasów. Celem jest zmniejszenia specyficznej zdolności wiązania IgE każdego zmutowanego epitopu przy zachowaniu co najmniej jednego niezmienionego lub umiarkowanie zmienionego epitopu na zmutowanym alergenie.

W szczególności niniejszy wynalazek dotyczy zrekombinowanego alergenu Bet v 1, który jest mutantem naturalnie występującego alergenu Bet v 1, przy czym ten zrekombinowany alergen wykazuje zdolność do wywoływania nowej odpowiedzi przeciwciała IgE po podaniu jako szczepionkę alergenową, gdzie:

- mutant zachowuje zasadniczo tę samą budowę szkieletu α-węgla jak naturalnie występujący alergen,

- mutant zachowuje zasadniczo tę samą strukturę szkieletu α-węgla jak naturalnie występujący alergen,

- mutant zawiera co najmniej cztery mutacje pierwotne, a każda mutacja pierwotna położona jest w obrębie pojedynczej grupy eksponowanych na powierzchni aminokwasów, które są częścią co najmniej jednego epitopu lub zawierają cały epitop, i każda mutacja pierwotna jest w stanie zmniejszyć swoistą zdolność wiązania IgE zmutowanego alergenu w porównaniu ze zdolnością wiązania IgE tego naturalnie występującego alergenu Bet v 1, przy czym swoista zdolność wiązania IgE mutanta zmniejszona jest co najmniej o 10% w porównaniu ze zdolnością tego naturalnie występującego alergenu Bet v 1,

- każda mutacja pierwotna jest podstawieniem jednej lub więcej reszt eksponowanych na powierzchni aminokwasów inną resztą,

PL 212 139 B1

- mutacje umieszczone są w taki sposób, że co najmniej jeden ciągły obszar powierzchni o obszarze 400-800 A² albo nie zawiera żadnych mutacji, albo zawiera mutację umiarkowaną, dając w rezultacie umiarkowanie zmieniony epitop nie wykazujący znaczącego zmniejszenia swojej swoistej zdolności wiązania IgE w porównaniu z odpowiadającym mu epitopem niezmutowanym,

- mutacje pierwotne wybrane są z co najmniej 4 z następujących 10 grup, przy czym każda grupa obejmuje eksponowane na powierzchni pozycje aminokwasów w obrębie oddzielnych obszarów powierzchni cząsteczki odpowiednich dla podstawień aminokwasów:

grupa 1: A130, E131, K134, A135, K137, E138, E141, T142, R145; grupa 2: V2, F3, N4, Y5, E6, T7, K119;

grupa 3: D27, S39, S40, Y41, E42, N43, 144, E45, G46, N47, P50, G51, K55, D72, E73;

grupa 4: E8, T10, V12, P14, V105, A106, T107, P108, D109, G110,I113, K115;

grupa 5: A16, K20, S149, Y150, L152, A153, H154, S155, D156, Y158, N159, +160, gdzie +160 przedstawia dodatek aminokwasu N-końcowego; grupa 6: L24, D25, N28, K32; grupa 7: H76, T77, N78, F79, K80, E101, K103; grupa 8: K68, R70,186, E87, E96, K97;

grupa 9: G1, G92, D93, T94, K123, G124, D125, H126, E127, K129; grupa 10: P35, Q36, E60, G61, P63, F64, K65, Y66;

z zastrzeżeniem, że zrekombinowany alergen Bet v 1 nie jest jednym z następujących mutantów specyficznych:

(Asn28Thr, Lys32Gln, Asn78Lys, Lys103Val, Arg145Glu, Asp156His, +160Asn);

(Tyr5Val, Glu42Ser, Glu45Ser, Asn78Lys, Lys103Val, Lys123IIe, Lys134Glu, Asp156His); (Tyr5Val, Glu45Ser, Lys65Asn, Lys97Ser, Lys134Glu);

(Ala16Pro, Asn28Thr, Lys32Gln, Lys103Thr, Pro108Gly, Leu152Lys, Ala153Gly, Ser155Pro); (N28T, K32Q, N78K, K103V, P108G, R145E, D156H, +160N);

(Tyr5Val, Lys134Glu, Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Lys65Asn, Asn78Lys, Lys103Val,

Lys97Ser, Pro108Gly, Arg145Glu, Asp156His, +160Asn);

(Tyr5Val, Lys134Glu, Glu42Ser, Glu45Ser, Asn78Lys, Lys103Val, Lys123IIe, Asp156His, +160Asn);

(Asn28Thr, Lys32Gln, Lys65Asn, Glu96Leu, Lys97Ser, Pro108Gly, Asp109Asn, Asp125Tyr,

Glu127Ser, Arg145Glu);

(Y5V, N28T, K32Q, E42S, E45S, N78K, K103V, P108G, K123I, K134E, D156H, +160N);

(Y5V, E42S, E45S, K65N, N78K, K97S, K103V, K123I, K134E, D156H, +160N); i (Y5V, N28T, K32Q, E42S, E45S, K65N, N78K, K97S, K103V, P108G, K123I, K134E, D156H, +160N).

Korzystnie, mutacje pierwotne wybrane są z co najmniej 4 z następujących 10 grup, przy czym każda grupa obejmuje eksponowane na powierzchni pozycje aminokwasów odpowiednie dla podstawień aminokwasów:

grupa 1: A130, K134, A135, K137, E138, E141, T142, R145; grupa 2: V2, F3, N4, Y5, E6, T7, K119;

grupa 3: D27, Y41, E42, N43,144, E45, G46, N47, P50, G51, K55, D72, E73; grupa 4 : E8, T10, P108, D109, I113, K115; grupa 5: H154, S155, D156, N159, +160; grupa 6: D25, N28, K32;

grupa 7: H76, T77, N78, K80, E101, K103; grupa 8: K68, R70,186, E87, E96, K97; grupa 9: G1, G92, T94, K123, G124, D125, H126; grupa 10: K65, Y66.

Korzystnie, mutacje pierwotne wybrane są z co najmniej 4 z następujących 10 grup, przy czym każda grupa obejmuje eksponowane na powierzchni pozycje aminokwasów odpowiednie dla podstawień aminokwasów:

grupa 1: A130, K134, A135, K137, E138, E141, T142; grupa 2: V2, F3, N4, Y5, E6, T7, K119;

grupa 3: D27, Y41, N43, I44, E45, G46, N47, P50, G51, K55, D72, E73; grupa 4: E8, P108, I113, K115; grupa 5: H154, S155, N159, +160;

PL 212 139 B1 grupa 6: D25, N28; grupa 7: H76, N78, K80, E101, K103; grupa 8: K68, R70,186, E87, E96, K97; grupa 9 :G1, G92, T94, G124, D125, H126; grupa 10: Y66.

Korzystnie, mutacje pierwotne wybrane są z co najmniej 4 z następujących 10 grup, przy czym każda grupa obejmuje eksponowane na powierzchni pozycje aminokwasów odpowiednie dla podstawień aminokwasów:

grupa 1: A130, A135, K137, E138, E141, T142; grupa 2: F3, N4, E6, T7, K119;

grupa 3: D27, Y41, N43, 144, G46, P50, G51, D72, E73;

grupa 4 : E8, I113, K115;

grupa 5: H154, S155,N159;

grupa 7: H76, N78, K80, E101;

grupa 8: K68, R70, 186, E87;

grupa 9: G1, G92, D93, G124, H126;

grupa 10: Y66

Bardziej dokładnie, niniejszy wynalazek dotyczy zrekombinowanego alergenu Bet v 1, gdzie mutacje pierwotne wybrane są z co najmniej 4 z następujących 10 grup, przy czym każda grupa obejmuje eksponowane na powierzchni pozycje aminokwasów odpowiednie dla następujących specyficznych podstawień aminokwasów:

grupa 1: A130: A130V, A130G, A1301, A130L, A130S, A130H, A130T; E131; E131D, E131H: E131K, E131R, E131S; K134: K134R, K134H, K134S, K134Q, K134I, K134E; A135: A135V, A135G, A135I, A135L, A135S, A135H, A135T; K137: K137R, K137H, K137S, K137Q, K137I, K137E; E138: E138D, E138H, E138K, E138R, E138S, E138N; E141: E141D, E141H, E141K, E141R, E141S; T142: T142A, T142S, T142L, T142V, T142D, T142K, T142N; R145: R145K, R145H, R145T, R145D, R145E; grupa 2: V2: V2A, V2I, V2K, V2L, V2R, V2T; F3: F3H, F3W, F3S, F3D; N4: N4H, N4K, N4M,

N4Q, N4R; Y5: Y5D, Y5G, Y5H, Y5I, Y5K, Y5V; E6: E6D, E6H, E6K, E6R, E6S; T7: T7P, T7S, T7L, T7V, T7D, T7K, T7N; K119: K119R, K119H, K119S, K119Q, K119I, K119E, K119N;

grupa 3: D27: D27E, D27H, D27K, D27R, D27S; S39: S39T, S39L, S39V, S39D, S39K; S40: S40T, S40L, S40V, S40D, S40K; Y41: Y41D, Y41G, Y41H, Y411, Y41K, Y41V; E42: E42S, E42D, E42H, E42K, E42R; N43: N43H, N43K, N43M, N43Q, N43R; 144: 144L, 144K, 144R, 144D; E45: E45S, E45D, E45H, E45K, E45R; G46: G46N, G46H, G46K, G46M, G46Q, G46R; N47: N47H, N47K, N47M, N47Q, N47R; P50: P50G; G51: G51N, G51H, G51K, G51M, G51Q, G51R; K55: K55R, K55H, K55S, K55Q, K55I, K55E, K55N; D72: D72E, D72S, D72H, D72R, D72K; E73: E73D, E73S, E73H, E73R, E73K;

grupa 4: E8: E8D, E8H, E8K, E8R, E8S; T10: T10P, T10S, T10L, T10V, T10D, T10K, T10N; V12: V12A, V12I, V12K, V12L, V12R, V12T; P14: P14G; V105: V105A, V105I, V105K, V105L, V105R, V105T; A106: A106V, A106G, A106I, A106L, A106S, A106H, A106T; T107: T107A, T107S, T107L, T107V, T107D, T107K, T107N; P108: P108G; D109: D109N D109E, D109S, D109H, D109R, D109K; G110: G110N, G110H, G110K, G110M, G110Q, G110R; 1113: I113L, I113K, I113R, I113D, K115: K115R, K115H, K115S, K115Q, K115I, K115E, K115N;

grupa 5: A16: A16V, A16G, A161, A16L, A16S, A16H, A16T; K20: K20R, K20H, K20S, K20Q, K20I, K20E, K20N; S149: S149T, S149L, S149V, S149D, S149K; Y150: Y150T, Y150L, Y150V, Y150D, Y150K; L152: L152A, L152V, L152G, L152I, L152S, L152H, L152T; A153: A153V, A153G, A153I, A153L, A153S, A153H, A153T; H154: H154W, H154F, H154S, H154D; S155: S155T, S155L, S155V, S155D, S155K; D156: D156H, D156E, D156S, D156R, D156K; Y158: Y158D, Y158G, Y158H, Y158I, Y158K, Y158V; N159: N159H, N159K, N159M, N159Q, N159R, N159G, +160N;

grupa 6: L24: L24A, L24V, L24G, L24I, L24S, L24H, L24T; D25: D25E, D25H, D25K, D25R, D25S; N28: N28H, N28K, N28M, N28Q, N28R, N28T; K32: K32Q, K32R, K32N, K32H, K32S, K32I, K32E;

grupa 7: H76: H76W, H76F, H76S, H76D; T77: T77A, T77S, T77L, T77V, T77D, T77K, T77N; N78: N78H, N78K, N78M, N78Q, N78R; F79: F79H, F79W, F79S, F79D; K80: K80R, K80H, K80S, K80Q, K80I, K80E, K80N; E101: E101D, E101H, E101K, E101R, E101S; K103: K103R, K103H, K103S, K103Q, K103I, K103E, K103V;

PL 212 139 B1 grupa 8: K68: K68R, K68H, K68S, K68Q, K68I, K68E, K68N; R70: R70K, R70H, R70T, R70D, R70E, R70N; 186: 186L, 186K, 186R, 186D; E87: E87D, E87H, E87K, E87R, E87S, E87A; E96: E96D, E96H, E96K, E96R, E96S, E96L; K97: K97R, K97H, K97S, K97Q, K97I, K97E;

grupa 9: G1: G1N, G1H, G1K, G1M, G1Q, G1R; G92: G92N, G92H, G92K, G92M, G92Q, G92R; D93: D93N, D93E, D93S, D93H, D93R, D93K; T94: T94A, T94S, T94L, T94V, T94D, T94K, T94N; K123: K123R, K123H, K123S, K123Q, K123I, K123E; G124: G124N, G124H, G124K, G124M, G124Q, G124R; D125: D125E, D125H, D125K, D125R, D125S, D125Y; H126: H126W, H126F, H126S, H126D; E127: E127D, E127H, E127K, E127R, E127S; K129: K129R, K129H, K129S, K129Q, K129I, K129E, K129N;

grupa 10: P35: P35G; Q36: Q36K, Q36R, Q36N, Q36H, Q36S, Q36I, Q36E; E60: E60H, E60K, E60M, E60Q, E60R; G61: G61N, G61H, G61K, G61M, G61Q, G61R; P63: P63G; F64: F64H, F64W, F64S, F64D; K65: K65R, K65H, K65S, K65Q, K65I, K65E, K65N; Y66: Y66D, Y66G, Y66H, Y66I, Y66K, Y66V.

Korzystnie, mutacje pierwotne wybrane są z co najmniej 4 z następujących 10 grup, przy czym każda grupa obejmuje eksponowane na powierzchni pozycje aminokwasów odpowiednie dla następujących specyficznych podstawień aminokwasów:

grupa 1: A130: A130V, A130G, A130I, A130L, A130S, A130H, A130T; K134: K134R, K134H, K134S, K134Q, K134I, K134E; A135: A135V, A135G, A135I, A135L, A135S, A135H, A135T; K137: K137R, K137H, K137S, K137Q, K137I, K137E; E138: E138D, E138H, E138K, E138R, E138S, E138N; E141: E141D, E141H, E141K, E141R, E141S; T142: T142A, T142S, T142L, T142V, T142D, T142K, T142N; R145: R145K, R145H, R145T, R145D, R145E;

grupa 2: V2: V2A, V2I, V2K, V2L, V2R, V2T; F3: F3H, F3W, F3S, F3D; N4: N4H, N4K, N4M, N4Q, N4R; Y5: Y5D, Y5G, Y5H, Y5I, Y5K, Y5V; E6: E6D, E6H, E6K, E6R, E6S; T7: T7P, T7S, T7L, T7V, T7D, T7K, T7N; K119: K119R, K119H, K119S, K119Q, K1191, K119E, K119N;

grupa 3: D27: D27E, D27H, D27K, D27R, D27S; Y41: Y41D, Y41G, Y41H, Y41I, Y41K, Y41V; E42: E42S, E42D, E42H, E42K, E42R; N43: N43H, N43K, N43M, N43Q, N43R; 144: 144L, 144K, 144R, 144D; E45: E45S, E45D, E45H, E45K, E45R; G46: G46N, G46H, G46K, G46M, G46Q, G46R; N47: N47H, N47K, N47M, N47Q, N47R; P50: P50G; G51: G51N, G51H, G51K, G51M, G51Q, G51R; K55: K55R, K55H, K55S, K55Q, K55I, K55E, K55N; D72: D72E, D72S, D72H, D72R, D72K; E73: E73D, E73S, E73H, E73R, E73K;

grupa 4: E8: E8D, E8H, E8K, E8R, E8S; T10: T10P, T10S, T10L, T10V, T10D, T10K, T10N; P108: P108G; D109: D109N D109E, D109S, D109H, D109R, D109K; 1113: I113L, I113K, I113R, I113D, K115: K115R, K115H, K115S, K115Q, K1151, K115E, K115N;

grupa 5: H154: H154W, H154F, H154S, H154D; S155: S155T, S155L, S155V, S155D, S155K; D156: D156H, D156E, D156S, D156R, D156K; N159: N159H, N159K, N159M, N159Q, N159R, N159G, +160N;

grupa 6: D25: D25E, D25H, D25K, D25R, D25S; N28: N28H, N28K, N28M, N28Q, N28R, N28T; K32: K32Q, K32R, K32N, K32H, K32S, K32I, K32E;

grupa 7: H76: H76W, H76F, H76S, H76D; T77: T77A, T77S, T77L, T77V, T77D, T77K, T77N; N78: N78H, N78K, N78M, N78Q, N78R; K80: K80R, K80H, K80S, K80Q, K80I, K80E, K80N; E101: E101D, E101H, E101K, E101R, E101S; K103: K103R, K103H, K103S, K103Q, K103I, K103E, K103V;

grupa 8: K68: K68R, K68H, K68S, K68Q, K68I, K68E, K68N; R70: R70K, R70H, R70T, R70D, R70E, R70N; 186: 186L, 186K, 186R, 186D; E87: E87D, E87H, E87K, E87R, E87S, E87A; E96: E96D, E96H, E96K, E96R, E96S, E96L; K97: K97R, K97H, K97S, K97Q, K97I, K97E;

grupa 9: G1: G1N, G1H, G1K, G1M, G1Q, G1R; G92: G92N, G92H, G92K, G92M, G92Q, G92R; T94: T94A, T94S, T94L, T94V, T94D, T94K, T94N; K123: K123R, K123H, K123S, K123Q, K123I, K123E; G124: G124N, G124H, G124K, G124M, G124Q, G124R; D125: D125E, D125H, D125K, D125R, D125S, D125Y; H126: H126W, H126F, H126S, H126D;

grupa 10: K65: K65R, K65H, K65S, K65Q, K65I, K65E, K65N; Y66: Y66D, Y66G, Y66H, Y66I, Y66K, Y66V.

Korzystnie, mutacje pierwotne wybrane są z co najmniej 4 z następujących 10 grup, przy czym każda grupa obejmuje eksponowane na powierzchni pozycje aminokwasów odpowiednie dla następujących specyficznych podstawień aminokwasów:

grupa 1: A130: A130V, A130G, A130I, A130L, A130S, A130H, A130T; K134: K134R, K134H, K134S, K134Q, K134I, K134E; A135: A135V, A135G, A135I, A135L, A135S, A135H, A135T; K137: K137R, K137H, K137S, K137Q, K137I, K137E; E138: E138D, E138H, E138K, E138R, E138S,

PL 212 139 B1

E138N; E141: E141D, E141H, E141K, E141R, E141S; T142: T142A, T142S, T142L, T142V, T142D, T142K, T142N;

grupa 2: V2: V2A, V2I, V2K, V2L, V2R, V2T; F3: F3H, F3W, F3S, F3D; N4: N4H, N4K, N4M, N4Q, N4R; Y5: Y5D, Y5G, Y5H, Y5I, Y5K, Y5V; E6: E6D, E6H, E6K, E6R, E6S; T7: T7P, T7S, T7L, T7V, T7D, T7K, T7N; K119: K119R, K119H, K119S, K119Q, K191, K119E, K119N;

grupa 3: D27: D27E, D27H, D27K, D27R, D27S; Y41: Y41D, Y41G, Y41H, Y41I, Y41K, Y41V; N43: N43H, N43K, N43M, N43Q, N43R; 144: 144L, 144K, 144R, 144D; E45: E45S, E45D, E45H, E45K, E45R; G46: G46N, G46H, G46K, G46M, G46Q, G46R; N47: N47H, N47K, N47M, N47Q, N47R; P50: P50G; G51: G51N, G51H, G51K, G51M, G51Q, G51R; K55: K55R, K55H, K55S, K55Q, K55I, K55E, K55N; D72: D72E, D72S, D72H, D72R, D72K; E73: E73D, E73S, E73H, E73R, E73K;

grupa 4: E8: E8D, E8H, E8K, E8R, E8S; P108: P108G; I113: I113L, I113K, I113R, I113D, K115: K115R, K115H, K115S, K115Q, K115I, K115E, K115N;

grupa 5: H154: H154W, H154F, H154S, H154D; S155: S155T, S155L, S155V, S155D, S155K; N159: N159H, N159K, N159M, N159Q, N159R, N159G, +160N;

grupa 6: D25: D25E, D25H, D25K, D25R, D25S; N28: N28H, N28K, N28M, N28Q, N28R, N28T; grupa 7: H76: H76W, H76F, H76S, H76D; N78: N78H, N78K, N78M, N78Q, N78R; K80: K80R,

K80H, K80S, K80Q, K80I, K80E, K80N; E101: E101D, E101H, E101K, E101R, E101S; K103: K103R, K103H, K103S, K103Q, K103I, K103E, K103V;

grupa 8: K68: K68R, K68H, K68S, K68Q, K68I, K68E, K68N; R70: R70K, R70H, R70T, R70D, R70E, R70N; 186: 186L, 186K, 186R, 186D; E87: E87D, E87H, E87K, E87R, E87S, E87A; E96: E96D, E96H, E96K, E96R, E96S, E96L; K97: K97R, K97H, K97S, K97Q, K97I, K97E;

grupa 9: G1: G1N, G1H, G1K, G1M, G1Q, G1R; G92: G92N, G92H, G92K, G92M, G92Q, G92R; T94: T94A, T94S, T94L, T94V, T94D, T94K, T94N; G124: G124N, G124H, G124K, G124M, G124Q, G124R; D125: D125E, D125H, D125K, D125R, D125S, D125Y; H126: H126W, H126F, H126S, H126D;

grupa 10: Y66: Y66D, Y66G, Y66H, Y66I, Y66K, Y66V.

Korzystnie, mutacje pierwotne wybrane są z co najmniej 4 z następujących 10 grup, przy czym każda grupa obejmuje eksponowane na powierzchni pozycje aminokwasów odpowiednie dla następujących specyficznych podstawień aminokwasów:

grupa 1: A130: A130V, A130G, A130I, A130L, A130S, A130H, A130T; A135: A135V, A135G, A135I, A135L, A135S, A135H, A135T; K137: K137R, K137H, K137S, K137Q, K137I, K137E; E138: E138D, E138H, E138K, E138R, E138S, E138N; E141: E141D, E141H, E141K, E141R, E141S; T142: T142A, T142S, T142L, T142V, T142D, T142K, T142N;

grupa 2: F3: F3H, F3W, F3S, F3D; N4: N4H, N4K, N4M, N4Q, N4R; E6: E6D, E6H, E6K, E6R, E6S; T7: T7P, T7S, T7L, T7V, T7D, T7K, T7N; K119: K119R, K119H, K119S, K119Q, K1191, K119E, K119N;

grupa 3: D27: D27E, D27H, D27K, D27R, D27S; Y41: Y41D, Y41G, Y41H, Y41I, Y41K, Y41V; N43: N43H, N43K, N43M, N43Q, N43R; 144: 144L, 144K, 144R, 144D; G46: G46N, G46H, G46K, G46M, G46Q, G46R; N47: N47H, N47K, N47M, N47Q, N47R; P50: P50G; G51: G51N, G51H, G51K, G51M, G51Q, G51R; D72: D72E, D72S, D72H, D72R, D72K; E73: E73D, E73S, E73H, E73R, E73K;

grupa 4: E8: E8D, E8H, E8K, E8R, E8S; I113: I113L, I113K, I113R, I113D, K115: K115R, K115H, K115S, K115Q, K115I, K115E, K115N;

grupa 5: H154: H154W, H154F, H154S, H154D; S155: S155T, S155L, S155V, S155D, S155K; N159: N159H, N159K, N159M, N159Q, N159R, N159G, +160N;

grupa 7: H76: H76W, H76F, H76S, H76D; N78: N78H, N78K, N78M, N78Q, N78R; K80: K80R, K80H, K80S, K80Q, K80I, K80E, K80N; E101: E101D, E101H, E101K, E101R, E101S;

grupa 8: K68: K68R, K68H, K68S, K68Q, K68I, K68E, K68N; R70: R70K, R70H, R70T, R70D, R70E, R70N; 186: 186L, 186K, 186R, 186D; E87: E87D, E87H, E87K, E87R, E87S, E87A;

grupa 9: G1: G1N, G1H, G1K, G1M, G1Q, G1R; G92: G92N, G92H, G92K, G92M, G92Q, G92R; D93: D93N, D93E, D93S, D93H, D93R, D93K; G124: G124N, G124H, G124K, G124M, G124Q, G124R; H126: H126W, H126F, H126S, H126D;

grupa 10: Y66: Y66D, Y66G, Y66H, Y66I, Y66K, Y66V.

Korzystnie, zrekombinowany alergen Bet v 1 zawiera następujące mutacje:

Y5V, E45S, N78K, K97S, K103V, K134E, + 160N.

PL 212 139 B1

Korzystnie, ponadto zawiera on co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku:

E8/K115, D125/H126, E138/K137/E141, D25/N28, E87/K55, S155/H154/N159, N47/P50/H76/N43/144/R70, E87/K55, E73/P50/D72, A130, N28/D25, P108, V2/K119/N4/E6/E96.

Zrekombinowany alergen Bet v 1 korzystnie ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku:

T10P, K65N, N28/D25/K32Q/E141/K137/E138, D125/K1231/H126, P108/D109N,

E42S/K55/144/N43, E73/D72, E87, E96/K119, A130, V2/E6, E8/K115, N47/P50/R70/H76/T77A, S155/D156H/N159, E6/V2.

Zrekombinowany alergen Bet v 1 korzystnie zawiera też następujące mutacje:

Y5V, N28T, K32Q, E45S, N78K, K97S, K103V, K134E, +160N.

Zrekombinowany alergen Bet v 1 ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku:

E8/K115, D125/H126, E138/K137/E141, E87/K55, S155/H154/N159, N47/P50/H76/N43/144/R70, K55, E73/P50/D72, A130, D25, P108, Y2/K119/N4/E6/E96.

Korzystnie, zrekombinowany alergen Bet v 1 ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia wymienione są na początku:

T10P, K65N, E141/K137/E138, D125/K1231/H126, P108/D109N, E42S/K55/144/N43, E73/D72, E87, V2/E6, N47/P50/R70/H76/T77A, E96/K119, A130, E8/K115, S155/D156H/H154/N159, E6/V2.

Zrekombinowany alergen Bet v 1 zawiera następujące mutacje:

Y5V, N28T, K32Q, E45S, N78K, E87S, K97S, K103V, K134E, N159G, + 160N.

Korzystnie, zrekombinowany alergen Bet v 1 ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku:

K55, A138/K137/E141, D125/H126, P108, V2/N4/K119/E6, S155/H154, N47/P50/H76, E73, R70, A130, E8/K115, E96.

Zrekombinowany alergen Bet v 1 ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia wymienione są na początku:

K65N, T10P, D125, K123I, P108, D109N, N47/P50/H76, E138/K137/E141, E42S/K55/144/N43, S155/D156H, E73/D72, E6/V2, E96.

Korzystnie, zrekombinowany alergen Bet v 1 zawiera następujące mutacje:

Y5V, N28T, K32Q, E45S, N78K, K97S, K103V, P108G, D125Y, K134E, +160N.

Zrekombinowany alergen Bet v 1 ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku:

E87, E141, K55, N47/N43/I44/H76, S155/HIS154, A130, E8, E73, V2/K119.

Korzystnie, ponadto zawiera on co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku:

K65N, T10P/E8, E87, S155/D156H, E141, E42S, A130, E8/T10P, N47, H76T, V2.

Zrekombinowany alergen Bet v 1 zawiera następujące mutacje:

Y5V, N28T, K32Q, E45S, E73S, E96S, P108G, D125Y, N159G, +160N.

Korzystnie, zrekombinowany alergen Bet v 1 ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku:

K134, N78, E87, K119, E8, K55X, E141, N47, S155, E6, K103, A130, V2.

Korzystnie, zrekombinowany alergen Bet v 1 ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku:

K65N/K55, T10P/E8/E141, E138/K134, E87, E42S/K55/144, S155/D156H, N78, K119N2/N4, N47/P50, H76/T77A, A130, E6/K115/K103.

Zrekombinowany alergen Bet v 1 zawiera następujące mutacje:

Y5V, N28T, K32Q, E45S, E96S, P108G, +160N.

Korzystnie, zrekombinowany alergen Bet v 1 ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku:

K134, N78, E87, KI 19, E8, K55X, E141, S155, N47, E6, K103, A130, V2, R70, D125.

Korzystnie, ponadto zawiera on co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku:

N78/T77A, K103X, K134/E138, K65N/K55, T10P, D125/H126, E42S/K55, S155/D156H/HIS154, KI 19N2, E87, N47/P50/H76, A130.

PL 212 139 B1

Zrekombinowany alergen Bet v 1 zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień:

Y5, N28, K32, E45, E96/K97, P108/D109, N159/+160, E60, T10, K103/K115, K65, K129, K134, E42/K55, S149/A153/L152, D125/K123, N47/L24, T77/N78, K119, E87, A16/K20/P14, Q36/G61/P63, E73, D93, V2.

Korzystnie, zrekombinowany alergen Bet v 1 zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień:

Y5V, N28T, K32Q, E45S, E96S/K97S, P108G/D109N, N159G/+160N, E60S, T10N, K103V/K115N, K129N, K134E, E42S/K55N, S149T/A153V/L152A, D125Y/K123I, N47K/L24A, T77N/N78K, K119N, E87A, A16G/K20S/P14G, Q36N/G61S/P63G, E73S, D93S, V2L.

Zrekombinowany alergen Bet v 1 zawiera podstawienia, które wybrane są z co najmniej czterech z następujących 10 grup:

grupa 1: A130V, K134E, E141N, grupa 2: V2L, Y5V, E6S, K119N, grupa 3: E42S, E45S, N47K, K55N, E73S, E73T, E73S, grupa 4 : E8S, T10P, P14G, P108G, D109N, K115N, grupa 5: A16G, K20S, S149T, L152A, A153V, S155T, N159G, +160N, grupa 6: L24A, D25E, N28T, K32Q, grupa 7: T77A, T77N, N78K, K103V, grupa 8: R70N, E87A, E96S, K97S, grupa 9: D93S, K123I, D125Y, K129N, grupa 10: Q36N, E60S, G61S, P63G.

Zrekombinowany alergen Bet v 1 zawiera podstawienia, które wybrane są z co najmniej czterech z następujących 10 grup:

grupa 1: K134E, grupa 2: Y5 V, K119N, V2L, grupa 3: E45S, E42S, K55N, N47K, E73S, grupa 4: E96S, K97S, P108G, D109N, T10N, K115N, P14G, grupa 5: N159G, +160N, S149T, A153V, L152A, A16G, K20S, grupa 6: N28T, K32Q, L24A, grupa 7: K103V, T77N, N78K, grupa 8: E96S, K97S, E87A, grupa 9: K129N, D125Y, K123I, D93S, grupa 10: E60S, Q36N, G61S, P63G.

Zrekombinowany alergen Bet v 1 zawiera co najmniej 5 mutacji pierwotnych, korzystnie co najmniej 6 mutacji pierwotnych, bardziej korzystnie co najmniej 7 mutacji pierwotnych, a najbardziej korzystnie co najmniej 8-10 mutacji pierwotnych.

Zrekombinowany alergen Bet v 1 ponadto zawiera co najmniej jedną mutację drugorzędową, a korzystnie, że ponadto zawiera co najmniej jedną mutację drugorzędową wybraną z wyżej podanych grup.

Zrekombinowany alergen Bet v 1 ponadto zawiera co najmniej jedną dodatkową mutację, przy czym mutacja ta jest addycją lub delecją reszty aminokwasu pętli eksponowanej na powierzchni.

Zrekombinowany alergen Bet v 1 określony powyżej przewidziany jest do stosowania jako lek.

Niniejszy wynalazek obejmuje ponadto następujące rozwiązania, którymi są:

Zastosowanie zrekombinowanego alergenu określonego powyżej, do przygotowania leku do zapobiegania i/lub leczenia alergii na pyłek Fagales.

Zastosowanie zrekombinowanego alergenu określonego powyżej, do przygotowania leku do zapobiegania i/lub leczenia alergii na pyłek brzozy.

Kompozycja zawierająca dwa lub więcej wariantów zrekombinowanych zmutowanych alergenów Bet v 1 określonych powyżej, która charakteryzuje się tym, że każdy wariant definiowany jest przez posiadanie co najmniej jednej mutacji pierwotnej, która jest nieobecna w co najmniej jednym z innych wariantów.

Korzystnie, kompozycja taka zawiera 2-12 wariantów, korzystniej 3-10 wariantów, jeszcze korzystniej 4-8 wariantów, a najkorzystniej 5-7 wariantów.

Kompozycja taka przewidziana jest do stosowania jako lek.

Zastosowanie kompozycji określonej powyżej, do przygotowania leku do zapobiegania i/lub leczenia alergii na pyłek Fagales.

PL 212 139 B1

Zastosowanie kompozycji określonej powyżej, do przygotowania leku do zapobiegania i/lub leczenia alergii na pyłek brzozy.

Kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera zrekombinowany alergen określony powyżej lub kompozycję określoną powyżej, opcjonalnie w kombinacji z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem i/lub zaróbką, i opcjonalnie z adiuwantem.

Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna jest w postaci szczepionki przeciwko reakcjom alergicznym wywoływanym przez naturalnie występujący alergen Bet v 1 u pacjentów cierpiących na alergię na pyłek brzozy.

Zastosowanie zrekombinowanego alergenu określonego powyżej, kompozycji określonej powyżej lub kompozycji farmaceutycznej zdefiniowanej powyżej, do wytwarzania leku do generowania odpowiedzi immunologicznej u osobnika.

Zastosowanie zrekombinowanego alergenu określonego powyżej, kompozycji określonej powyżej lub kompozycji farmaceutycznej zdefiniowanej powyżej, do wytwarzania szczepionki dla lub do leczenia osobnika.

Sposób przygotowania kompozycji farmaceutycznej określonej powyżej, obejmujący zmieszanie zrekombinowanego alergenu zdefiniowanego powyżej, lub kompozycji określonej powyżej z farmaceutycznie dopuszczalnymi substancjami i/lub zarobkami.

Zastosowanie zrekombinowanego alergenu określonego powyżej, kompozycji podanej powyżej lub kompozycji farmaceutycznej zdefiniowanej powyżej, do wytwarzania leku do leczenia, do zapobiegania lub łagodzenia reakcji alergicznych u osobnika.

Sposób przygotowania zrekombinowanego alergenu Bet v 1 określonego powyżej, charakteryzuje się tym, że podstawienie aminokwasów przeprowadzane jest za pomocą mutagenezy ukierunkowanej.

Sposób przygotowania zrekombinowanego alergenu Bet v 1 określonego powyżej, charakteryzuje się tym, że alergen produkowany jest z sekwencji DNA uzyskanej przez tasowanie DNA (inżynieria molekularna).

Sposób przygotowania biblioteki zrekombinowanego alergenu Bet v 1 określonego powyżej, charakteryzuje się tym, że alergen produkowany jest przez stosowanie starterów oligonukleotydowych włączających losowe podstawienia co najmniej czterech reszt aminokwasów.

Korzystnie, w sposobie tym reszty aminokwasów wybrane są z grupy złożonej z:

Y5, T10, K20, N28, K32, Q36, E42, E45, E73, K65, N78, E87, K97, K103, P108, K123, K129, K134, S149, D156 i +160.

Sekwencja DNA kodująca zrekombinowany alergen Bet v 1 określony powyżej, lub sekwencja, która do niej hybrydyzuje w warunkach ostrych, która to sekwencja hybrydyzująca koduje peptyd mający co najmniej jeden epitop komórek B.

Korzystnie, sekwencja DNA charakteryzuje się tym, że sekwencja hybrydyzująca uzyskana jest przez mutagenezę ukierunkowaną DNA kodującego naturalnie występujący alergen Bet v 1.

Wektor ekspresyjny obejmujący DNA określone powyżej.

Komórka gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny zdefiniowany powyżej.

Sposób produkcji zrekombinowanego mutanta alergenu Bet v 1, obejmujący etap hodowania komórki gospodarza określonej powyżej.

Zrekombinowany alergen Bet v 1 określony powyżej, lub zrekombinowany alergen Bet v 1 kodowany przez sekwencję DNA określoną powyżej, zawierający co najmniej jeden epitop komórek T wykazujący zdolność do stymulacji klonu komórki T lub linii komórek T specyficznej dla naturalnie występującego alergenu Bet v 1.

Oznaczenie diagnostyczne do oceny odpowiedniości, bezpieczeństwa lub wyniku terapii osobnika stosując zrekombinowany mutant alergenu Bet v 1 określony powyżej, lub kompozycję określoną powyżej, charakteryzujące się tym, że próbka zawierająca IgE osobnika mieszana jest z wymienionym mutantem lub z wymienioną kompozycją, i oceniania jest pod kątem poziomu reaktywności między IgE w wymienionej próbce a wymienionym mutantem.

Tak więc, rozwiązania według wynalazku obejmują:

Warianty zrekombinowanych alergenów Bet v 1, które mogą być stosowane jako farmaceutyk i do przygotowania farmaceutyku do zapobiegania i/lub leczenia alergii na pyłek brzozy.

Kompozycję zawierającą dwa lub więcej zrekombinowane warianty alergenów mutanta Bet v 1 według wynalazku, gdzie każdy wariant ma co najmniej jedną pierwotną mutację, która jest nieobecna w co najmniej jednym z innych wariantów. Kompozycja zawiera 2-12, korzystnie 3-10, korzystniej 4-8,

PL 212 139 B1 a najkorzystniej 5-7 wariantów. Kompozycja według wynalazku może być stosowana jako farmaceutyk i do przygotowania farmaceutyku do zapobiegania i/lub leczenia alergii na pyłek brzozy. Kompozycja farmaceutyczna korzystnie zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i/lub zaróbkę i dowolnie adiuwant.

Kompozycję farmaceutyczną w postaci szczepionki przeciwko reakcjom alergicznym wywoływanym przez naturalnie występujący alergen Bet v 1 u pacjentów cierpiących na alergię na pyłki brzozy.

Sposoby generacji odpowiedzi odpornościowej u osobnika obejmujące podanie osobnikowi zrekombinowanego alergenu, kompozycji lub kompozycji farmaceutycznej.

Szczepienie lub leczenie osobnika obejmujące podanie osobnikowi zrekombinowanego alergenu, kompozycji lub kompozycji farmaceutycznej.

Sposób przygotowania kompozycji farmaceutycznej obejmujący zmieszanie zrekombinowanego alergenu lub kompozycji z farmaceutycznie dopuszczalnymi substancjami i/lub zaróbkami.

Sposób leczenia, zapobiegania lub łagodzenia reakcji alergicznych u osobnika obejmujący podanie osobnikowi zrekombinowanego alergenu Bet v 1, kompozycji lub kompozycji farmaceutycznej.

Sposób przygotowania zrekombinowanego alergenu Bet v 1, w którym podstawienie aminokwasów przeprowadzone jest przez mutagenezę ukierunkowaną lub tasowanie DNA (inżynierię molekularną) (Punnonen i wsp., poz. 25 literatury).

Sekwencję DNA kodującą zrekombinowany alergen Bet v 1, jego pochodną, jego częściową sekwencję, jego sekwencję zdegenerowaną lub sekwencję, która do niej hybrydyzuje w warunkach ostrych, gdzie ta pochodna, częściowa sekwencja, zdegenerowana sekwencja lub hybrydyzująca sekwencja koduje peptyd mający co najmniej jeden epitop komórek B.

Sekwencję DNA, która jest pochodną sekwencji DNA kodującej naturalnie występujący alergen. Sekwencja DNA kodująca pochodną uzyskiwana jest przez mutagenezę ukierunkowaną DNA kodującego naturalnie występujący alergen Bet v 1.

Wektor ekspresyjny zawierający DNA kodujący zrekombinowany wariant Bet v 1, komórkę gospodarza zawierającą wektor ekspresyjny i sposób produkcji zrekombinowanego zmutowanego alergenu Bet v 1 obejmujący hodowlę komórki gospodarza.

Zrekombinowany alergen Bet v 1 lub zrekombinowany alergen Bet v 1, który jest kodowany przez sekwencję DNA obejmujący co najmniej jeden epitop komórek T zdolny do stymulacji klonu komórek T lub linii komórek T specyficznej dla naturalnie występującego alergenu Bet v 1.

Oznaczenie diagnostyczne dla oceny odpowiedniości, bezpieczeństwa, lub wyniku terapii osobnika stosując zrekombinowany zmutowany alergen Bet v 1 lub kompozycję, gdzie próbka zawierająca IgE osobnika mieszana jest z tym mutantem lub tą kompozycją i ocenia się poziom reaktywności między IgE w tej próbce i tym mutantem.

Szczegółowy opis wynalazku

W związku z niniejszym wynalazkiem określenie „zmniejszyć specyficzne wiązanie IgE w porównaniu ze zdolnością wiązania IgE tego naturalnie występującego alergenu” oznacza, że obniżenie jest mierzalne w sposób statystycznie znaczący (p < 0,05) w co najmniej jednym immunooznaczeniu stosując surowicę z osobnika alergicznego na naturalnie występujący alergen.

Korzystnie, zdolność wiązania IgE jest zmniejszona o przynajmniej 10%, korzystniej o co najmniej 30%, jeszcze korzystniej o co najmniej 50%, a najkorzystniej o co najmniej 70%.

Określenie „aminokwas eksponowany na powierzchni” oznacza, że reszta aminokwasu umieszczona jest na powierzchni trójwymiarowej struktury w taki sposób, że gdy alergen jest w roztworze, co najmniej część co najmniej jednego atomu reszty aminokwasu dostępna jest dla kontaktu z otaczającym rozpuszczalnikiem.

Korzystnie, reszta aminokwasu w strukturze trójwymiarowej ma dostępność dla rozpuszczalnika (wody) co najmniej 20%, odpowiednio co najmniej 30%, odpowiedniej co najmniej 40%, a najkorzystniej co najmniej 50%.

Określenie „dostępność dla rozpuszczalnika” definiowane jest jako obszar cząsteczki dostępny dla kuli z promieniem porównywalnym do cząsteczki rozpuszczalnika (woda, r = 1,4 A). Określenie „eksponowany na powierzchni” lub „eksponowany na rozpuszczalnik” stosowane są wymiennie.

„Grupa aminokwasów” powinna być rozumiana jako dział eksponowanych na powierzchni aminokwasów odpowiednich do zmutowania w grupach. Każda grupa reprezentuje pewną ilość eksponowanych na powierzchni reszt aminokwasów, które znajdowane są w ograniczonym obrębie powierzchni alergenu. Indywidualna grupa może też obejmować powierzchnię, która zawiera cały epitop. Jedna lub więcej mutacji w obrębie pojedynczej grupy definiuje się jako mutację pierwotną. ZmutowaPL 212 139 B1 ny alergen z co najmniej czterema pierwotnymi mutacjami zapewnia więc, że kilka epitopów będzie miało obniżone powinowactwo do wiązania IgE. Mutacja aminokwasów z co najmniej czterech grup może dalej zapewnić w przybliżeniu równe rozmieszczenie mutacji na powierzchni cząsteczki i zapewni, że kilka epitopów jest zmutowanych, i w ten sposób powoduje obniżone powinowactwo wiązania IgE kilku epitopów w porównaniu z mutantami z mniej niż czterema mutacjami.

Określenie „gatunek taksonomiczny, z którego taki naturalny alergen pochodzi” oznacza gatunek w układzie taksonomicznym, korzystnie podrodzinę, korzystniej rodzinę, bardziej korzystnie nadrodzinę, jeszcze bardziej korzystnie legion, bardziej korzystnie podrząd, a najbardziej korzystnie rząd, z którego pochodzi taki naturalnie występujący alergen.

Określenie „umiarkowanie zmienione epitopy” oznacza epitopy, które zachowują zasadniczo taką samą strukturę trzeciorzędową i topografię powierzchni jak odpowiednie nie zmutowane epitopy. Umiarkowane zmiany są ogólnie uzyskiwane przez zastąpienie aminokwasu innym aminokwasem z podobnymi cechami chemicznymi jak oryginalny aminokwas. Jeden sposób uzyskania tego jest przez wymianę jednego lub więcej aminokwasów eksponowanych na powierzchni na aminokwasy, które mogły by być znalezione w taksonomicznym rzędzie, w którym spotykany jest naturalnie występujący alergen. Umiarkowanie zmieniony epitop może także zawierać podstawienia aminokwasów, gdzie jeden lub więcej z podstawionych aminokwasów nie jest spotykany w rzędzie taksonomicznym, w którym spotykany jest naturalnie występujący alergen, o ile podstawienie tylko nieznacznie wpływa na strukturę trzeciorzędową epitopu i/lub powinowactwo wiązania IgE. Przeciwne umiarkowanie zmienionym epitopom są epitopy, które są zmienione w sposób bardziej radykalny, na przykład, mutacje, które znacząco obniżają powinowactwo wiązania IgE. Zwykle, radykalne zmiany epitopów obejmują podstawienia aminokwasów, gdzie jeden lub więcej aminokwasów było wymienionych na aminokwasy z innymi właściwościami chemicznymi.

Dalej, określenie „zmutowany alergen mający zasadniczo taką samą strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla jak ten naturalnie występujący alergen” oznacza, że gdy porównuje się struktury, średni pierwiastek odchylenia kwadratowego współrzędnych atomowych jest poniżej 2 A. Zachowanie struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla najlepiej jest oznaczać przez uzyskanie identycznych struktur za pomocą krystalografii promieni rentgenowskich lub NMR przed i po mutagenezie. Przy braku danych strukturalnych opisujących mutanta nierozróżnialne widma CD lub dane immunochemiczne, na przykład, reaktywność przeciwciał może czynić konserwację struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla prawdopodobną, jeśli porównane są do danych uzyskanych przez analizę określonej strukturalnie cząsteczki.

W związku z niniejszym wynalazkiem określenie „mutacja” oznacza delecję, podstawienie lub dodanie aminokwasu w porównaniu z sekwencją aminokwasów naturalnie występującego alergenu. Określenia „mutacja” i „podstawienie” stosowane są wymiennie. Zrekombinowany zmutowany alergen Bet v 1, według wynalazku, może dalej zawierać insercje aminokwasów lub delecję aminokwasu w poszczególnych regionach eksponowanych na powierzchni cząsteczek, na przykład, „regionach pętli”. Regiony pętli łączą elementy struktury drugorzędowej, na przykład, kartki β, α-helisy i struktury zwoju losowego. Regiony w pętli w Bet v 1 są: Vall2 do ala16, val33 do ser40, glu45 do Thr52, pro54 do tyr66, his76 do asn78, gly89 do glu96, vall05 do gly111, thr122 do glu131. Warianty mutantów mogą zawierać 1-5, korzystniej 1-3, a najkorzystniej 1-2 podstawienia w regionie pętli.

Mutacja pierwotna definiowana jest jako jedna lub więcej mutacji w pojedynczej grupie eksponowanych na powierzchni aminokwasów odpowiednich do podstawienia. Każda grupa z co najmniej jednego zmutowanego aminokwasu będzie miała obniżone powinowactwo do wiązania IgE w porównaniu z tą samą grupą bez mutacji. Korzystnie, zrekombinowany alergen według wynalazku zawiera od 5 do 10, korzystniej od 6 do 10, jeszcze korzystniej od 7 do 10, a najkorzystniej od 8 do 10 mutacji pierwotnych.

Mutacje drugorzędowe definiowane są jako dodatkowe mutacje w pojedynczej grupie. Zrekombinowany alergen korzystnie zawiera szereg mutacji drugorzędowych, z których każda obniża specyficzną zdolność wiązania IgE zmutowanego alergenu w porównaniu ze zdolnością wiązania tego naturalnie występującego alergenu. Tak więc, pierwotna mutacja, która obejmuje kilka drugorzędowych mutacji będzie w wielu przypadkach miała bardziej obniżoną zdolność powinowactwa wiązania IgE niż pierwotna mutacja, która ma tylko jedną mutację. Zrekombinowany alergen według wynalazku zawiera od 1 do 15, korzystniej 1-10, a najkorzystniej 1-5 mutacji drugorzędowych na mutację pierwotną.

Reszty konserwowane. Reszty konserwowane w naturalnie występującym alergenie konserwowane są z ponad 70%, korzystniej 80%, a najkorzystniej 90% identycznością we wszystkich znanych

PL 212 139 B1 białkach homologicznych w obrębie gatunku, z którego pochodzi alergen. Reszty aminokwasów, które są wysoce eksponowane na rozpuszczalnik i konserwowane stanowią cele do podstawiania.

Innym sposobem oceny obniżonego wiązania IgE i zmniejszonej zdolności pośredniczenia w wiązaniu poprzecznym mutanta jest zdolność mutanta do inicjowania uwalniania histaminy (histamine release - HR). Uwalnianie histaminy można mierzyć w kilku oznaczeniach uwalniania histaminy. Obniżone uwalnianie histaminy mutantów wynika ze zmniejszonego powinowactwa w stosunku do specyficznej IgE związanej z powierzchnią komórki, jak i z ich zmniejszonej zdolności do ułatwiania wiązania poprzecznego. HR korzystnie obniżone jest o 5-100%, korzystniej o 25-100%, jeszcze korzystniej o 50-100%, a najkorzystniej o 75-100% dla mutantów według wynalazku w porównaniu z naturalnie występującymi alergenami.

W korzystnym wykonaniu wynalazku, region powierzchniowy nie zawierający mutacji lub tylko umiarkowane mutacje ma powierzchnię 800 A², korzystniej 600 A², jeszcze korzystniej 500 A², a najkorzystniej 400 A². Typowo region powierzchniowy z powierzchnią 800 A² nie zawierający mutacji lub tylko umiarkowane mutacje zawiera atomy 15-25 reszt aminokwasów.

W innym wykonaniu co najmniej jedna reszta aminokwasu, która ma być włączona do zmutowanego alergenu nie występuje w tej samej pozycji w sekwencji aminokwasów żadnego znanego białka homologicznego w obrębie rodzaju taksonomicznego korzystnie podrodziny, korzystniej rodziny, jeszcze korzystniej nadrodziny, jeszcze bardziej korzystnie legionu, bardziej korzystnie podrzędu, a najkorzystniej rzędu, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen.

Według wynalazku, eksponowane na powierzchni reszty aminokwasów szeregowane są względem dostępności dla rozpuszczalnika i co najmniej cztery aminokwasy wśród bardziej dostępnych dla rozpuszczalnika są podstawione.

W dalszym wykonaniu zrekombinowany alergen według wynalazku charakteryzuje się tym, że eksponowane na powierzchni reszty aminokwasów są szeregowane względem stopnia konserwacji we wszystkich znanych homologicznych białkach w obrębie gatunku, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen i że jeden lub więcej aminokwasów wśród bardziej konserwatywnych są podstawione.

Zasada ujawniona w tym wynalazku obejmuje mutację eksponowanych na powierzchni reszt aminokwasów wybranych z co najmniej czterech grup aminokwasów, gdzie każda grupa reprezentuje oddzielne obszary na powierzchni cząsteczki. Zasada ta może być też stosowana do alergenów innych niż Bet v 1. Zrekombinowany alergen według wynalazku może być odpowiednio mutantem alergenu inhalacyjnego pochodzącego, między innymi, z drzew, traw, ziół, grzybów, roztoczy kurzu domowego, karaluchów i włosów, i łupieżu zwierząt. Ważne alergeny pyłku z drzew, traw i ziół są to takie pochodzące z rzędów taksonomicznych Fagales, Oleales i Pinales obejmując, między innymi, brzozę (Betula), olchę (Alnus), leszczynę (Corylus), grab (Carpinus) i oliwkę (Olea), rząd Poales obejmujący, między innymi, trawy z rzędów Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis i Secale, rzędy Asterales i Urticales obejmujące, między innymi, zioła z rzędów Ambrosia i Artemisia. Ważne alergeny inhalacyjne z grzybów są, między innymi, takie pochodzące z rzędów Alternaria i Cladosporium. Inne ważne alergeny inhalacyjne są to te z roztoczy kurzu domowego z rzędu Dermatophagoides, te z karaluchów i te z ssaków takich jak kot, pies i koń. Dalej zrekombinowane alergeny według wynalazku mogą być mutantami alergenów jadu obejmując takie pochodzące z owadów kłujących lub gryzących takich jak te z rzędów taksonomicznych Hymenoptera obejmując pszczoły (nadrodzina Apidae), osy (nadrodzina Vespidea) i mrówki (nadrodzina Formicoidae).

Specyficzne składniki alergenów obejmują, na przykład, Bet v 1 (B. verrucosa, brzoza), A In g 1 (Alnus glutinosa, olcha), Cor a 1 (Corylus avelana, leszczyna) i Car b 1 (Carpinus betulus, grab) rzędu Fagales. Inne to Cry j 1 (Pinales), Amb a 1 i 2, Art v 1 (Asterales), Par j 1 (Urticales), Ole e 1 (Oleales), Ave e 1, Cyn d 1, Dac g 1, Fes p 1, Hol l 1, Lolp 1 i 5, Pas n 1, Phip 1 i 5, Poa p 1, 2 i 5, Sec c 1 i 5, i Sor h 1 (różne pyłki trawy), Alt di W Cla h 1 (grzyby), Der f 1 i 2, Der p 1 i 2 (roztocza kurzu domowego, D. farinae i D. pteronyssinus, odpowiednio), Eur m 1 (roztocze, Euroglyphus maynei), (Lep d I i 2 (Lepidoglyphus destructor; roztocze magazynów), Bla g 1 i 2, Per a 1 (karaluchy, Blatella germanica i Periplaneta americana, odpowiednio), Fel d 1 (kot), Can f 1 (pies), Equ c 1, 2 i 3 (koń), Apis m 1 i 2 (pszczoła miodowa), Fes v 1, 2 i 5, Pol v 1, 2 i 5 (wszystko osy) i Sol i 1, 2, 3 i 4 (mrówka czerwona).

Pewne przykłady dodania dalszych podstawień do danego mutanta

W jednym wykonaniu wynalazku dalsze podstawienia dodawane są do zmutowanych alergenów w taki sposób, że zapewnia się, iż podstawienia ostatecznego zmutowanego alergenu są równomiernie rozmieszczone na powierzchni cząsteczki i że grupy zawierają zasadniczo tę samą liczbę

PL 212 139 B1 wprowadzonych mutacji. Jest to ilustrowane w następujących przykładach, gdzie mutanty zawierające specyficzne podstawienia korzystnie powinny mieć dodane dalsze podstawienia z listy, gdzie kolejność aminokwasów jest odbiciem korzystnej kolejności dodawania dalszych podstawień. Bez ograniczania niniejszego wynalazku, te wynalazki reprezentują jedną aplikację jak projektować mutanty i specjalista z tej dziedzinie może wybrać nieco inne podejście, aby zapewnić równe rozmieszczenie podstawień. Mogą więc być zaprojektowane mutanty zawierające jedno lub więcej podstawień z list podanych poniżej.

Zmutowane alergeny Bet v 1 („3004A”) obejmują następujące podstawienia:

Y5V, E45S, N78K, K97S, K103V, K134E, + 160N.

Dalsze podstawienia mogą obejmować jeden lub więcej z następujących:

E8 lub K115, D125, lub H126, E138, lub K137, lub E141, D25, lub N28, E87, lub K55, S155, lub

H154, lub N159, N47, lub P50, lub H76, lub N43, lub 144, lub R70, E73, lub P50, lub D72, A130, N28, lub D25, P108, V2, lub K119, lub N4, lub E6, lub E96.

Zmutowane alergeny Bet v 1 („3004B”) obejmują następujące podstawienia:

Y5V, E45S, L62F, N78K, K97S, K103V, K134E, + 160N.

Dalsze podstawienia mogą obejmować jeden lub więcej z następujących:

T10P, K65N, N28 lub D25, lub K32Q, lub E141X, lub K137X, lub E138X, D125X, lub K123I, lub

H126, P108X, lub D109N, E42S, lub K55X, lub 144X, lub N43X, E73X, lub D72X, E87X, E96X, lub K119, A130X, V2X, lub E6X, E8X, lub K115, N47X, lub P50X, lub R70X, lub H76X, lub T77A, S155X, lub D156H, lub N159X, E6X, lub V2X.

Zmutowane alergeny Bet v 1 („3005A”) obejmują następujące podstawienia:

Y5V, N28T, K32Q, E45S, L62F, N78K, K97S, K103V, K134E, + 160N.

Dalsze podstawienia mogą obejmować jeden lub więcej z następujących:

E8X lub K115X, D125, lub H126, E138X, lub K137X, lub E141X, E87X, lub K55X, S155X, lub

H154X, lub N159X, N47X, lub P50X, lub H76X, lub N43X, lub 144X, lub R70X, E73X, lub P50X, lub D72X, A130X, D25X, P108X, V2X, lub K119X, lub N4X, lub E6X, lub E96X.

Zmutowane alergeny Bet v 1 („3005B”) obejmują następujące podstawienia:

Y5V, N28T, K32Q, E45S, L62F, N78K, K97S, K103V, K134E, + 160N.

Dalsze podstawienia mogą obejmować jeden lub więcej z następujących:

T10P, K65N, E141X lub K137X, lub E138X, D125X, lub K123I, lub H126X, P108X, lub D109N,

E42S, lub K55X, lub 144X, lub N43X, E73X, lub D72X, E87X, E96X, lub K119X, A130X, V2X lub E6X, E8X, lub K115X, N47X, lub P50X, lub R70X, lub H76X, lub T77A, S155X, lub D156H, lub N159X, E6X, lub V2X.

Zmutowane alergeny Bet v 1 („3006A”) obejmują następujące podstawienia:

Y5V, N28T, K32Q, E45S, N78K, E87S, K97S, K103V, K134E, N159G, + 160N.

Dalsze podstawienia mogą obejmować jeden lub więcej z następujących:

K55, A138 lub K137, lub E141, D125, lub H126, P108, V2, lub N4, lub K119, lub E6, S155, lub H154, N47, lub P50, lub H76, E73, R70, A130, E8, lub K115, E96.

Zmutowane alergeny Bet v 1 („3006B”) obejmują następujące podstawienia:

Y5V, N28T, K32Q, E45S, N78K, E87S, K97S, K103V, K134E, K159G, + 160N.

Dalsze podstawienia mogą obejmować jeden lub więcej z następujących:

K65N, T10P, D125, K123I, P108, D109N, N47 lub P50, lub H76, E138, lub K137, lub E141, E42S, lub K55, lub 144, lub N43, S155, lub D156H, E73, lub D72, E6, lub V2, E96.

Zmutowane alergeny Bet v 1 („3007A”) obejmują następujące podstawienia:

Y5V, N28T, K32Q, E45S, L62F, N78K, K97S, K103V, P108G, D125Y, K134E, + 160N.

Dalsze podstawienia mogą obejmować jeden lub więcej z następujących:

E87, E141, E138, K55, N47 lub N43X, lub 144, lub H76, S155, lub H154, A130, E8, E73, V2, lub K119, D25.

Zmutowane alergeny Bet v 1 („3007B”) obejmujące następujące podstawienia:

Y5V, N28T, K32Q, E45S, L62F, N78K, K97S, K103V, P108G, D125Y, K134E, + 160N.

Dalsze podstawienia mogą obejmować jeden lub więcej z następujących:

K65N, T10P lub E8, E87, S155, lub D156H, E138, E141, E42S, A130, E8, lub T10P, N47, H76, R70, E96.

Zmutowane alergeny Bet v 1 („3008A”) obejmują następujące podstawienia:

Y5V, N28T, K32Q, E45S, L62F, E73S, E96S, P108G, D125Y, N159G, + 160N.

PL 212 139 B1

Dalsze podstawienia mogą obejmować jeden lub więcej z następujących:

E134, N78, E87, K119, E8, K55, E138, E141, S155, N47, E6, K103, D25, A130, V2, R70.

Zmutowane alergeny Bet v 1 („3008B”) obejmują następujące podstawienia:

Y5V, N28T, K32Q, E45S, L62F, E73S, E96S, P108G, D125Y, N159G, + 160N.

Dalsze podstawienia mogą obejmować jeden lub więcej z następujących:

K65N lub K55, T10P, lub E8, lub E141, E138, lub K134, E87, E42S, lub K55, lub 144, S155, lub D156H, N78, K119, lub V2, lub N4, N47, lub P50, H76, lub T77A, A130, D25, E6 lub K115, lub K103.

Zmutowane alergeny Bet v 1 („3009A”) obejmują następujące podstawienia:

Y5V, N28T, K32Q, E45S, L62F, E96S, P108G, + 160N.

Dalsze podstawienia mogą obejmować jeden lub więcej z następujących:

E134, N78, E87, K119, E8, K55, E138, E141, S155, N47, E6, K103, D25, A130, V2, R70.

Zmutowane alergeny Bet v 1 („3009B”) obejmują następujące podstawienia:

Y5V, N28T, K32Q, E45S, L62F, E96S, P108G, + 160N.

Dalsze podstawienia mogą obejmować jeden lub więcej z następujących:

N78 lub T77A, K103, E134, lub E138, K65N, lub K55, T10P, D125, lub H126, S155, lub D156H, lub HIS154, K119, lub V2, E87, N47, lub P50, lub H76, E42S, lub K55, 144, lub N43, A130.

Mutacje w pętli

W innym wykonaniu wynalazku zmutowane alergeny według wynalazku dalej zawierają insercje aminokwasów lub delecję aminokwasów w poszczególnych regionach eksponowanych na powierzchni cząsteczek, na przykład, regionach pętli. Regiony pętli łączą elementy struktury drugorzędowej, na przykład, kartki β, α-helisy i struktury losowego zwoju. Regiony w pętli w Bet v 1 są: val12 do ala16, val33 do ser40, glu45 do Thr52, pro54 do tyr66, his76 do asn78, gly89 do glu96, val105 do gly111, thr122 do glu131. Warianty mutantów według tego wykonania zawierają 1-5, korzystniej 1-3, a najkorzystniej 1-2 podstawienia w regionie pętli. W korzystnych wykonaniach, zmutowane alergeny zawierają co najmniej cztery mutacje wybrane z 10 grup jak i szereg dodatkowych „mutacji w pętli”. Przykładami takich „mutacji pętli”, gdzie x przedstawia dodaną resztę aminokwasu są:

Bet v 1 (3007-L1) z insercją aminokwasu między resztą E60 i resztą G61:

GVFNVETETTSVIPAARLFKAFILDGDTLFPQVAPQAISSVENISGNGGPGTI

KKISFPExGFPFKYVKDRVDEVDHTKFKYNYSVIEGGPIGDTLESISNEIVIVA

TGDGGSILKISNKYHTKGYHEKAEQVEASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNN.

Bet v 1 (3007-L2) z insercją aminokwasu między resztą D93 i resztą T94: fGVFNVETETTSVIPAARLFKAFILDGDTLFPQVAPQAISSVENISGNGGPGTI KKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTKFKYNYSVIEGGPIGDxTLESISNEIVIVA TGDGGSILKISNKYHTKGYHEVKAEQVEASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNN.

Bet v 1 (3007-L3) z insercją aminokwasu między resztą V12 i resztą 113:

GVFNVETETTSVxIPAARLFKAFILDGDTLFPQVAPQAISSVENISGNGGPGT

IKKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTKFKYNYSVIEGGPIGDTLESISNEIVIVA

TGDGGSILKISNKYHTKGYHEVKAEQVEASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNN

Bet v 1 (3007-L4) z insercją aminokwasu między resztą 156 i resztą S57 i między resztą K65 i resztą T66:

GVFNVETETTSVIPAARLFKAFILDGDTLFPQVAPQAISSVENISGNGGPGTI

KKIxSFPExGFPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIEGGPIGDTLESISNEIVIV

ATGDGGSILKISNKYHTKGYHEVKAEQVEASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNN.

Bet v 1 (3007-L5) z delecjąaminokwasu reszty G111:

GVFNVETETTSVIPAARLFKAFILDGDTLFPQVAPQAISSVENISGNGGPGTI

KKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTKFKYNYSVIEGGPIGDTLESISNEIVIVAT

GDGSILKISNKYHTKGYHEVKAEQVEASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNN.

Sposób przygotowania alergenu według wynalazku

Eksponowane na powierzchni aminokwasy odpowiednie do podstawienia według wynalazku mogą być identyfikowane na podstawie informacji o ich dostępności dla rozpuszczalnika (wody), która wyraża stopień ekspozycji na powierzchni. Korzystne wykonanie sposobu według wynalazku jest charakteryzowane przez szeregowanie tych zidentyfikowanych reszt aminokwasów względem dostępności dla rozpuszczalnika i podstawienie jednego lub więcej aminokwasów wśród bardziej dostępnych dla rozpuszczalnika.

Dalej, szczególnie korzystne wykonanie sposobu według wynalazku jest charakteryzowane w uszeregowaniu tych zidentyfikowanych reszt aminokwasów pod względem stopnia konserwacji we

PL 212 139 B1 wszystkich znanych homologicznych białkach w obrębie gatunku, z którego ten naturalnie występujący alergen pochodzi i podstawienie jednego lub więcej aminokwasów wśród najbardziej konserwowanych.

Dalsze korzystne wykonanie sposobu według wynalazku obejmuje wybranie zidentyfikowanych aminokwasów tak, aby tworzyć zmutowany alergen, który ma zasadniczo tę samą strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla, jak ten naturalnie występujący alergen.

Inne korzystne wykonanie sposobu według wynalazku charakteryzuje się tym, że podstawienie reszt aminokwasów przeprowadzane jest przez mutagenezę ukierunkowaną.

Alternatywne korzystne wykonanie sposobu według wynalazku charakteryzuje się tym, że podstawienie reszt aminokwasów przeprowadzane jest przez tasowanie DNA lub przez przygotowanie biblioteki obejmującej odpowiednie pozycje i ich korzystne podstawienia.

Kryteria dla podstawienia

Dla cząsteczek, dla których struktura trzeciorzędowa określona była, na przykład, krystalografia promieni rentgenowskich lub mikroskopia elektronowa NMR) mutant niosący podstawiony(e) aminokwas(y) powinien korzystnie spełniać następujące kryteria:

1. Ogólna struktura trzeciorzędowa szkieletu α-węgla jest korzystnie konserwowana. Konserwowana jest definiowana jako odchylenie średnie pierwiastka odchylenia kwadratowego współrzędnych atomowych poniżej 2A porównując struktury zmutowanego alergenu i naturalnie występującego alergenu. To jest ważne z dwóch powodów:

a) oczekuje się, że cała powierzchnia naturalnego alergenu stanowi zachodzące na siebie kontinuum potencjalnych epitopów wiążących przeciwciało. Na większość powierzchni cząsteczki podstawienia (podstawienie) nie wpływają i w związku z tym zachowuje ona swoje właściwości wiążące przeciwciało, co jest ważne dla generacji nowych ochronnych specyficzności przeciwciał skierowanych na epitopy obecne także na naturalnym alergenie,

b) stabilność, zarówno o ile chodzi o przechowywanie jak i po wstrzyknięciu do płynów ciała.

Konserwacja struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla jest najlepiej określana przez uzyskanie identycznych struktur za pomocą krystalografii promieniowania rentgenowskiego lub NMR przed i po mutagenezie. Przy nieobecności danych strukturalnych opisujących mutanta, nierozróżnialne widma CD lub dane immunochemiczne, na przykład, reaktywność przeciwciał mogą uczynić prawdopodobnym konserwację struktury trzeciorzędowej α-węgla w porównaniu z danymi uzyskanymi przez analizę strukturalnie określonej cząsteczki.

2. Aminokwasy, które mają być podstawione są korzystnie umieszczone na powierzchni i są w ten sposób dostępne do wiązania przeciwciał. Aminokwasy umieszczone na powierzchni w trójwymiarowej strukturze mają zazwyczaj dostępność dla rozpuszczalnika (wody) co najmniej 20%, odpowiednio 20-80%, a bardziej odpowiednio 30-80%. Dostępność dla rozpuszczalnika definiowana jest jako powierzchnia cząsteczki dostępna dla kuli o promieniu porównywalnym z cząsteczką rozpuszczalnika (woda, r = 1,4 A).

3. Podstawione aminokwasy wybrane są z co najmniej czterech grup. Każda grupa reprezentuje szereg korzystnych reszt aminokwasów eksponowanych na powierzchni, które znajdują się w ograniczonym obszarze powierzchni alergenu. Jedna lub więcej mutacji w pojedynczej grupie definiowana jest jako jedna mutacja pierwotna. Indywidualna grupa obejmuje szereg aminokwasów, które są częścią co najmniej jednego epitopu. Indywidualna grupa może też obejmować cały epitop. Zmutowany alergen z co najmniej czterema pierwotnymi mutacjami w ten sposób zapewnia, że kilka epitopów będzie miało obniżone powinowactwo wiązania IgE. Mutacja aminokwasów z co najmniej czterech grup dalej zapewnia w przybliżeniu równe rozmieszczenie mutacji na powierzchni cząsteczki i zapewnia, że kilka epitopów będzie zmutowanych i w ten sposób uzyskuje się obniżone powinowactwo wiązania IgE kilku epitopów.

Mając na celu zasadniczo zachowanie struktury trzeciorzędowej alergenu, aminokwas do włączenia może być wybrany na zasadzie porównania z białkiem, które jest homologiem strukturalnym alergenu, na przykład, białkiem, które należy do tego samego rzędu jak alergen i który nie ma reaktywności krzyżowej z alergenem.

Szczepionki

Przygotowanie szczepionek jest ogólnie dobrze znane w tej dziedzinie. Szczepionki są zwykle przygotowywane jako do wstrzyknięcia albo jako płynne roztwory, albo zawiesiny. Takie szczepionki mogą być też emulgowane lub formułowane tak, aby pozwolić na podawanie donosowe jak i doustne, w tym ustne i podjęzykowe. Omawiany składnik immunogenny (zrekombinowany alergen jak tu zdefiniowano) może być odpowiednio zmieszany z zaróbkami, które są farmaceutycznie dopuszczalne

PL 212 139 B1 i ponadto kompatybilne ze składnikiem czynnym. Przykłady odpowiednich zaróbek to woda, sól fizjologiczna, dekstroza, glicerol, etanol i tym podobne, jak i ich kombinacje. Szczepionka może dodatkowo zawierać inne substancje takie, jak czynniki zwilżające, czynniki emulgujące, czynniki buforujące lub adiuwanty wzmagające skuteczność szczepionki.

Szczepionki najczęściej podawane są pozajelitowo przez zastrzyk podskórny lub domięśniowy. Formuły, które są odpowiednie do podawania inną drogą obejmują formuły doustne i czopki. Szczepionki do podawania doustnego mogą być odpowiednio formułowane z zarobkami normalnie stosowanymi do takich formuł, na przykład, farmaceutyczne klasy mannitolu, laktozy, skrobi, stearynianu magnezu, sacharyny sodowej, celulozy, węglanu magnezu i tym podobne. Kompozycja może być formułowana jako roztwory, zawiesiny, emulsje, tabletki, pigułki, kapsułki, formuły o podtrzymywanym uwalnianiu, aerozole, proszki lub granulaty.

Szczepionki podawane są w taki sposób, aby były kompatybilne z formułą dawki i w takiej ilości, aby były terapeutycznie skuteczne i immunogenne. Ilość składnika czynnego zawartego w szczepionce zależy od osobnika, który ma być leczony, m. in. od zdolności układu odpornościowego osobnika do odpowiedzi na terapię, szlaku podania i wieku i wagi osobnika. Odpowiednie zakresy dawki mogą wahać się w zakresie od około 0,0001 μg do 1000 μg.

Jak wymieniono powyżej, zwiększony efekt może być uzyskany przez dodatek adiuwantów do formuły. Przykładami takich adiuwantów są wodorotlenek i fosforan glinu (ałun) lub fosforan wapnia jako roztwór 0,05 do 0,1 procentowy w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej, syntetyczne polimery cukrów lub glikolid polilaktydowy (PLG) stosowany jako roztwór 0,25 procentowy. Mieszanina z komórkami bakterii, takimi jak C. parvum, endotoksyny lub składniki lipopolisacharydowe bakterii gram-ujemnych, emulsje w fizjologicznie dopuszczalnych nośnikach olejowych takich, jak monooleinian monoalejanu (Aracel A) lub emulsja z 20 procentowym roztworem perfluorowęgla (na przykład Fluosol-DA) stosowana jako zastąpienie bloku mogą też być stosowane. Emulsje w oleju takie jak MF-59 mogą być także wykorzystane. Inne adiuwanty takie, jak całkowity adiuwant Freunda i niecałkowite adiuwanty takie, jak saponiny takie, jak QuilA, QS-21 i ISCOM i RIBI mogą być także stosowane.

Najczęściej konieczne będzie wielokrotne podawanie szczepionki, aby uzyskać odpowiedni efekt. Często szczepionka podawana jest jako pierwsze podanie, po którym następują kolejne szczepienia lub inne podania. Liczba szczepień będzie zwykle w zakresie od 1 do 50, zazwyczaj nie przekraczając 35 szczepień. Szczepienia będą normalnie przeprowadzane od co dwa tygodnie do dwóch razy w miesiącu, przez okres 3 miesięcy do 5 lat. To jest rozważane, aby dać pożądany poziom efektu profilaktycznego lub terapeutycznego.

Zrekombinowany alergen może być stosowany jako preparat farmaceutyczny, który jest odpowiedni do dostarczenia pewnej ochrony na odpowiedzi alergiczne w okresie roku kiedy występują objawy (profilaktyka). Zazwyczaj terapia będzie musiała być powtarzana co rok, aby utrzymać efekt ochronny. Preparaty formułowane dla aplikacji nosowej, ustnej i pod językiem są szczególnie odpowiednie do tego celu.

DNA według wynalazku

Sekwencja DNA według wynalazku jest mutantem sekwencji DNA kodującej naturalnie występujący alergen Bet v 1. Przykłady naturalnie występujących cząsteczek Bet v 1 są SEQ ID NO: 1 (numer dostępu bazy danych Z80104) i SEQ ID NO: 2 (numer dostępu bazy danych P15494). Inne warianty Bet v 1 obejmują sekwencje Bet v 1 z następującymi numerami dostępu bazy danych:

P15494=X15877=180106, Z80101, AJ002107, Z72429, AJ002108, Z80105, Z80100, Z80103, AJ001555, Z80102, AJ002110, Z72436, P43183=X77271, Z72430, AJ002106,

P43179=X77268, P43177=X77266, Z72438, P43180=X77269, AJ001551,

AJ001557, Z72434, AJ001556, Z72433=P43186, AJ001554, X81972, Z72431,

P43184=X77272, P43176=X77265, S47250, S47251, Z72435, Z72439, Z72437 i S47249.

Korzystnie, pochodna DNA uzyskiwana jest przez mutagenezę ukierunkowaną lub półlosową DNA kodującego naturalnie występujący alergen.

„Biblioteka zmutowana” jest biblioteką zmutowanych alergenów. Bibliotekę konstruuje się stosując zdegenerowane startery oligonukleotydowe, które pozwalają na wprowadzenie zera, pojedynczej lub kilku różnych reszt aminokwasów w każdej pozycji. Takie podejście biblioteki pozwala na podstawianie reszt aminokwasów konserwatywne lub nie konserwatywne. Jako, że na integralność strukturalną wprowadzenie konserwatywnych mutacji może wpływać w mniejszym stopniu takie „miękkie” lub umiarkowane mutacje w pewnych pozycjach mogą zwiększać szanse uzyskania stabilnych mutantów. Konstrukcja bibliotek mutantów może być jednym sposobem przezwyciężenia problemów ze stabilnoP43178=X77267,

P43185=X77273,

P45431=X77200,

PL 212 139 B1 ścią białka zmutowanych alergenów spowodowanych przez pojedyncze lub kombinacji kilku mutacji. „Biblioteka półlosowa” oznacza, że pozycje, które mają być zmutowane ograniczone są do reszt aminokwasów, które eksponowane są na powierzchni. To podejście dalej zwiększa prawdopodobieństwo uzyskania stabilnych zmutowanych alergenów. „Półlosowy” może też oznaczać, że oznaczone startery pozwalają, aby wybrana liczba aminokwasów była podstawiona w wybranej pozycji. Dwa półlosowe podejścia mogą być stosowane niezależnie lub w kombinacji. Teoretycznie biblioteka według wynalazku zawiera szereg zmutowanych alergenów rBet v 1, z których każdy ma przynajmniej 4 podstawienia aminokwasów w porównaniu z niezmutowanym Bet v 1.

W jednym wykonaniu skonstruowano półlosową bibliotekę opartą na rBet v 1 (2744) (zmutowany w pozycjach Y5, E42, E45, N78, K103, K123, L134, D156, +160) i rBet v 1 (2628) (zmutowany w pozycjach Y5, E45, K65, K97, K134), gdzie adresowano 7 dodatkowych pozycji na powierzchni alergenu: T10, K20, Q36, E73, E87, K129 i S149. Te siedem pozycji wybrano z obszarów powierzchniowych, które są poza obszarem spójnych obszarów powierzchniowych, które są częste wśród alergenów Fagales. Biblioteka była oparta o stosowanie zdegenerowanych starterów oligonukleotydowych DNA pozwalających na wprowadzenie kilku różnych reszt aminokwasów w każdej pozycji. Dodatkowo kilka zmutowanych pozycji reszt aminokwasów w rBet v 1 (2744) i rBet v 1 (2628) mogły albo być utrzymane albo zmutowane z powrotem do reszt spotykanych w WT rBet v 1 1.2801.

W innym wykonaniu skonstruowano półlosową bibliotekę opartą na rBet v 1 (2744) i rBet v 1 (2628) i rBet v 1 (2595), tzn. N28, K32, E45, P108, gdzie adresowano 7 dodatkowych pozycji na powierzchni alergenu: T10, K20, Q36, E73, E87, K129 i S149.

Mutanty

Przykłady specyficznych mutantów alergenowych Bet v 1 według wynalazku podano poniżej. Zmutowane pozycje aminokwasów wskazano małym drukiem wytłuszczonym:

Bet v 1 („3004”) (SEQ ID NO 3):

GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPQAISSVsNIEGNGGPGTIK

KISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEIvIVATPD

GGSILKISNKYHTKGDHEVKAEQVeASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNn

Bet v 1 („3005”) (SEQ ID NO 4):

GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK

ISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEIvIVATPDG

GSILKISNKYHTKGDHEVKAEQVeASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNn

Bet v 1 („3007”) (SEQ ID NO 5):

GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK

ISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEIvIVATgDG

GSILKISNKYHTKGyHEVKAEQVeASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNn

Bet v 1 („3009”) (SEQ ID NO 6):

GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK

ISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLsKISNEIKIVATgD

GGSILKISNKYHTKGDHEVKAEQVKASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNn

Bet v 1 („3006”) (SEQ ID NO 7):

GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK

ISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEMVATPDG

GSILKISNKYHTKGDHEVKAEQVeASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYgn

Bet v 1 („3008”) (SEQ ID NO 8):

GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPkVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK

ISFPEG£PFKYVKDRVDsVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLsKISNEIKIVATgDG

GSILKISNKYHTKGyHEVKAEQVKASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYgn

Niniejszy wynalazek obejmuje następujące specyficzne mutanty:

Bet v 1 („3005-7”) (SEQ ID NO 9):

Y5V, N28T, K32Q, E45S, N78K, K97S, K103V, K134E, +160N, E8S, D125Y, E141S, D25T, E87A, S155T, N47K, K55N.

GVFNvETsTTSVIPAARLFKAFILtGDtLFPqVAPQAISSVENIsGkGGPGTIKnIS

FPEGLPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLEsISNEIvIVATPDGG

ILKISNKYHTKGyHEVKAEQVeASKEMGsTLLRAVESYLLAHtDAYNn

PL 212 139 B1

Bet v 1 („3005-12”) (SEQ ID NO 10):

Y5V, N28T, K32Q, E45S, N78K, K97S, K103V, K134E, +160N, E8S, D125Y, E141S, D25T, E87A, S155T, N47K, K55N, E73T, A130V, P108G, V2L.

GIFNvETsTTSVIPAARLFKAFILtGDtLFPqVAPQAISSVENIsGkGGPGTIKnIS FPEGLPFKYVKDRVDtVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLEsISNEIvIVATgDGGS ILKISNKYHTKGyHEVKvEQVeASKEMGsTLLRAVESYLLAHtDAYNn Betv 1 („3005-22”) (SEQ ID NO 11):

Y5V, N28T, K32Q, E45S, N78K, K97S, K103V, K134E, +160N, T10K, K65N, E141N, KI231, D109N, E42S, E73T, E87A, V2L, N47K.

GIFNvETETpSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGkGGPGTIKKI SFPEGLPFnYVKDRVDtVDHTtFKYNYSVIaGGPIGDTLEsISNEIvIVATPnGG SILKISNKYHTiGDHEVKAEQVeASKEMGnTLLRAVESYLLAHSDAYNn Bet v 1 („3005-27”) (SEQ ID NO 12):

Y5V, N28T, K32Q, E45S, N78K, K97S, K103V, K134E, +160N, T10K, K65N, E141N, K1231, D109N, E42S, E73T, E87A, K119N, A130V, V2L, E8S, N47K, D156H, E6S.

GIFNvsTsTpSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGkGGPGTIKKIS FPEGLPFnYVKDRVDtVDHTtFKYNYSVIaGGPIGDTLEsISNEIvIVATPnGGSI LKISNKYHTiGDHEVKAEQVeASKEMGnTLLRAVESYLLAHShAYNn Bet v 1 („3007-6”) (SEQ ID NO 13):

Y5V, N28T, K32S, E45S, N78K, K97S K103V, P108G, D125Y, K134E, +160N, E87A, E141N, K55N, N47K, S155T.

GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGkGGPGTIKnI SFPEGLPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLEsISNEIvIVATgDG GSILKISNKYHTKGyHEVKAEQVeASKEMGnTLLRAVESYLLAHtDAYNn Bet v 1 („3007-10”) (SEQ ID NO 14):

Y5V, N28T, K32S, E45S, N78K, K97S K103V, P108G, D125Y, K134E, +160N, E87A, E141N, K55N, N47K, S155T, A130V, E8S, E73T, V2L.

GIFNvETsTTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGkGGPGTIKnIS FPEGLPFKYVKDRVDtVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLEsISNEIvIVATgDGGS ILKISNKYHTKGyHEVKvEQVeASKEMGnTLLRAVESYLLAHtDAYNn Betv 1 („3007-17”) (SEQ ID NO 15):

Y5V, N28T, K32Q, E45S, N78K, K97S, K103V, P108G, D125Y, K134E, +160N, K65N, T10P, E87A, D156H, E141N, E42S.

GVFNvETETpSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGNGGPGTIKK ISFPEGLPFnYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLEsISNEIvIVATgDG GSILKISNKYHTKGyHEVKAEQVeASKEMGnTLLRAVESYLLAHShAYNn Bet v 1 („3007-22”) (SEQ ID NO 16):

Y5V, N28T, K32Q, E45S, N78K, K97S, K103V, P108G, D125Y, K134E, +160N, K65N, T10P E87A, D156H, E141N, E42S, A130V, E8S, N47K, H76T, V2L.

GIFNvETsTpSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGkGGPGTIKKIS FPEGLPFnYVKDRVDEVDtTkFKYNYSVIaGGPIGDTLEsISNEIvIVATgDGGS ILKISNKYHTKGyHEVKvEQVeASKEMGnTLLRAVESYLLAHShAYNn Bet v 1 („3008-8”) (SEQ ID NO 17):

Y5V, N28T, K32Q, E45S, E73S, E96S, P108G, D125Y, N159G, +160N, K134E, N78K, E87A, K119N, E8S, K55N, E141N, N47K.

GVFNvETsTTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGkGGPGTIKnI FPEGLPFKYVKDRVDsVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLsKISNEIKIVATgDG GSILKISNnYHTKGyHEVKAEQVeASKEMGnTLLRAVESYLLAHSDAYgn Bet v 1 („3008-13”) (SEQ ID NO 18):

Y5V, N28T, K32Q, E45S, E73S, E96S, P108G, D125Y, N159G, +160N, K134E, N78K, E87A, K119N, E8S, K55N, E141N, N47K, S155T, E6S, K103V, A130V, V2L.

GIFNvsTsTTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGkGGPGTIKnIS FPEGLPFKYVKDRVDsVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLsKISNEIvIVATgDGG SILKISNn YHTKGyHE VKvEQVeASKEMGnTLLRAVESYLLAHtDAYgn

PL 212 139 B1

Bet v 1 („3008-20”) (SEQ ID NO 19):

Y5V, N28T, K32Q, E45S, E73S, E96S, P108G, D125Y, N159G, +160N, K65N, T10P, E138N, E87A, E42S, D156H, N78K.

GVFNvETETpSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGNGGPGTIKK ISFPEGLPFnYVKDRVDsVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLsKISNEIKIVATgDG GSILKISNK YHTKGyHE VKAEQVKASKnMGETLLRAVESYLLAHShAYgn

Bet v 1 „3008-25”) (SEQ ID NO 20):

Y5V, N28T, K32Q, E45S, E73S, E96S, P108G, D125Y, N159G, +160N, K65N, T10P, E138N, E87A, E42S, D156H, N78K, K119N, N47K, T77A, E130V, K115N.

GIFNvsTETpSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGNGGPGTIKKI SFPEGLPFnYVKDRVDsVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLsKISNEIvIVATgDG GSILKISNK YHTKGyHE VKvEQVKASKnMGETLLRAVESYLLAHthAYgn

Bet v 1 („3009-9”) (SEQ ID NO 21):

Y5V, N28T, K32Q, E45S, E96S, P108G, +160N, K134E, N78K, E87A, K119N, E8S, K55N, E138N, E141N, S155T, N47K, E6S, K103V, A130V, V2L, R70N, D125Y.

GVFNvETsTTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGkGGPGTIKnI

SFPEGLPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLsKISNEIKIVATgDG

GSILKISNnYHTKGDHEVKAEQVeASKnMGnTLLRAVESYLLAHtDAYNn

Bet v 1 („3009-15”) (SEQ ID NO 22):

Y5V, N28T, K32Q, E45S, E96S, P108G, +160N, K134E, N78K, E87A, K119N, E8S, K55N, E138N, E141N, S155T, N47K, E6S, K103V, A130V, V2L, R70N, D125Y.

GIFNvsTsTTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGkGGPGTIKnIS

FPEGLPFKYVKDnVDEVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLsKISNEIvIVATgDGG

SILKISNnYHTKGyHEVKvEQVeASKnMGnTLLRAVESYLLAHtDAYNn

Bet v 1 („3009-22”) (SEQ ID NO 23):

Y5V, N28T, K32Q, E45S, E96S, P108G, +160N, T77A, K103V, E138N, K65N, T10P, D125Y,

E42S.

GVFNvETETpSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGNGGPGTIKK

ISFPEGLPFnYVKDRVDEVDHaNFKYNYSVIEGGPIGDTLsKISNEIvIVATgD

GGSILKISNKYHTKGyHEVKAEQVKASKnMGETLLRAVESYLLAHSDAYNn

Bet v 1 („3009-28”) (SEQ ID NO 24):

Y5V, N28T, K32Q, E45S, E96S, P108G, +160N, T77A, K103V, E138N, K65N, T10P, D125Y, D156H, K119N E87A, E42S, A130V.

GVFNvETETpSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGNGGPGTIKK

ISFPEGLPFnYVKDRVDEVDHaNFKYNYSVIaGGPIGDTLsKISNEIvIVATgDG

GSILKISNnYHTKGyHEVKvEQVKASKnMGETLLRAVESYLLAHShAYNn

Bet v 1 klon („3031”) (SEQ ID NO 25):

GVFNVETETASVIPAARLFNAFILDGDTLFPQVAPQAISSVSNISGNGGPGTI

KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLESISNErVIVAT

PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEPYLLAHSHAYNN

Bet v 1 klon („3032”) (SEQ ID NO 26): GVFNVETETASVIPAARLFLAFILDGDTLFPQVAPPAISSVSMSGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDPVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNErVIVAT PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEGYLLAHSHAYNN

Bet v 1 klon („3033”) (SEQ ID NO 27):

GVFNVETETPSVIPAARLFHAFILDGDTLFPQVAPKAISSVSNISGNGGPGTI

KKISFPEGLPFNYVKDRVDRVDHTKFKYNYSVIEGGPIGDTLESISNEIVIVAT

PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEGYLLAHSHAYNN

Bet v 1 klon („3034”) (SEQ ID NO 28):

GVFNVETETTSVIPAARLFHAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI

KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT

PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYNN

Bet v 1 klon („3035”) (SEQ ID NO 29):

GVFNVETETPSVIPAARLFMAFILDGDTLFPQVAPPAISSVSNISGNGGPGTI

KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTNFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT

PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEAYLLAHSHAYNN

PL 212 139 B1

Bet v 1 klon („3036”) (SEQ ID NO 30): GVFNVETETPSVIPAARLFLAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDTVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYNN Bet v 1 klon („3037”) (SEQ ID NO 31):

GVFNVETETPSVIPAARLFQAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTNFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEPYLLAHSHAYNN Bet v 1 klon („3038”) (SEQ ID NO 32):

GVFNVETETASVIPAARLFLAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDGVDHTKFKYNYSVIDGGPIGDTLESISNEIVIVAT PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYNN Bet v 1 klon („3039”) (SEQ ID NO 33):

GVFNVETETASVIPAARLFLAFILDGDTLFPQVAPEAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYYKDRYDGYDHTNFKYNYSYIGGGPIGDTLESISNEIVIVA TPDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEAYLLAHSHAYNN Bet v 1 klon („3040”) (SEQ ID NO 34):

GVFNVETETPSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT PDGGSILKISNKYHTIGDHE VEAEQVEASKEMGETLLRAVETYLLAHSHAYNN Bet v 1 klon „3041”) (SEQ ID NO 35):

GVFNVETETPSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDRVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNErVIVAT PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYNN Bet v 1 klon („3042”) (SEQ ID NO 36):

GVFNVETETPSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDRVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYNN Bet v 1 klon („3043”) (SEQ ID NO 37):

GWNVETETPSVIPAARLFLAFILDGDTLFPQVAPKAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDRVDHTKFKYNYSVIDGGPIGDTLESISNEIVIVAT PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEPYLLAHSHAYNN Bet v 1 klon („3044”) (SEQ ID NO 38):

GVFNVEiElPSVIPAARLFLAFILDGDTLFPQVAPKAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDGVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVA TPDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVETYLLAHSHAYNN Bet v 1 klon („3045”) (SEQ ID NO 39):

GVFNVETETPSVIPAARLFMAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDGVDHTKFKYNYSVIDGGPIGDTLESISNEIVIVAT PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEGYLLAHSHAYNN Bet v 1 (3010) (SEQ ID NO 40):

Y5V, N28T, K32Q, E45S, K97S, P108G, +160N, E60S, T10N, K103V, K65N, K129N, D125Y, E42S, S149T.

GVFNvETETnSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGNGGPGTIKK

ISFPsGLPFnYVKDRVDEVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEIvIVATgDG

GSILKISNKYHTKGyHEVnAEQVKASKEMGETLLRAVEtYLLAHSDAYNn

Bet v 1 (3011) (SEQ ID NO 41):

Y5V, N28T, K32Q, E45S, K97S, P108G, +160N, E60S, T10N, K103V, K65N, K129N, D125Y, E42S, S149T, K134E, N47K, T77N, V2L.

GIFNvETETnSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGkGGPGTIKKI

SFPsGLPFnYVKDRVDEVDHnNFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEMVATgDG

GSILKISNKYHTKGyHEVnAEQVeASKEMGETLLRAVEtYLLAHSDAYNn

Betv 1(3012) (SEQ ID NO 42):

Y5V, N28T, K32Q, E45S, K97S, P108G, +160N, E60S, T10N, K103V, K65N, K129N, D125Y, E42S, S149T, K134E, N47K, T77N, V2L, E87A, A16G, Q36N, E73S, D93S.

GIFNvETETnSVIPAgRLFKAFILDGDtLFPqVAPnAISSVsNIsGkGGPGTIKKIS

PL 212 139 B1

FPsGLPFnYVKDRVDsVDHnNFKYNYSVIaGGPIGsTLEsISNEIvIVATgDGGS

ILKISNKYHTKGyHEVnAEQVeASKEMGETLLRAVEtYLLAHSDAYNn.

Oznaczenie diagnostyczne

Ponadto, zrekombinowane zmutowane alergeny według wynalazku mają możliwości i korzyści diagnostyczne. Szczepionki przeciw alergii według stanu techniki oparte są na ekstraktach naturalnie występującego źródła alergenu i w ten sposób reprezentują szeroki zakres izoform. Osobnik alergiczny był pierwotnie uczulony i ma IgE na jedną lub kilka z obecnych izoform. Niektóre z izoform mogą być związane z reakcjami alergicznymi osobnika alergicznego ze względu na homologię i następnie reaktywność krzyżową z izoformą, na którą osobnik jest alergiczny podczas, gdy inne izoformy mogą nie być związane jako, że nie niosą żadnych epitopów wiążących IgE, na które osobnik ma specyficzne IgE. Ze względu na heterogenność specyficzności populacji IgE, niektóre izoformy mogą więc być bezpieczne do podawania, to znaczy nie powodują odpowiedzi alergicznej poprzez IgE podczas, gdy inne izoformy mogą być szkodliwe powodując niepożądane efekty uboczne.

Tak więc, mutacje według wynalazku i kompozycje według wynalazku mające być podane terapeutycznie mogą być też stosowane dla oznaczenia diagnostycznego in vivo lub in vitro, aby badać odpowiedniość, bezpieczeństwo lub wynik terapii takimi mutantami lub kompozycjami. Próbki diagnostyczne do stosowania obejmują próbki ustrojowe takie, jak krew lub surowice.

Tak więc, wynalazek dotyczy także oznaczenia diagnostycznego do ocenienia odpowiedniości, bezpieczeństwa i wyniku terapii osobnika stosując zmutowany zrekombinowany alergen według wynalazku, które charakteryzuje się tym, że próbka zawierająca IgE osobnika jest mieszana z tym mutantem lub tą kompozycją i oceniana jest pod kątem poziomu reaktywności między IgE w tej próbce i tym mutantem. Ocena poziomu reaktywności między IgE w próbce i mutantem może być przeprowadzona stosując dowolne znane immunooznaczenie.

Niniejszy wynalazek jest poniżej zilustrowany przez następujące nie ograniczające przykłady wykonania.

P r z y k ł a d 1

Ten przykład opisuje charakterystykę zrekombinowanych zmutowanych alergenów Bet v 1 ze zwiększoną zdolnością do wiązania IgE. Specyficzne zmutowane alergeny są także ujawnione w PCT/DKO1/00764. Poniższy opis stanowi ilustrujący przykład przygotowania mutantów według wynalazku.

Identyfikacja wspólnych epitopów w obrębie alergenów pyłku Fagales

Główny alergen pyłku brzozy Bet v 1 wykazuje około 90% identyczności sekwencji aminokwasów z głównymi alergenami z pyłków taksonomicznie spokrewnionych drzew, tzn. Fagales (na przykład, leszczyna i grab) i pacjenci alergiczni na pyłek brzozy często wykazują kliniczne objawy krzyżowej reakcji alergicznej na te białka homologiczne do Bet v 1.

Bet v 1 wykazuje także około 50-60% identyczności sekwencji z białkami alergicznymi obecnymi w niektórych owocach (na przykład jabłka i czereśnie) i jarzynach (na przykład seler i marchewka) i są kliniczne dowody na alergiczną reaktywność krzyżową między Bet v 1 i tymi białkami związanymi z pożywieniem. Ponadto, Bet v 1 wykazuje znaczącą identyczność sekwencji (20-40%) z grupą białek roślinnych zwanych białkami związanymi z patogenezą (PR-10), jednak nie ma doniesień o krzyżowej reaktywności alergicznej do tych białek PR-10.

Modelowanie molekularne sugeruje, że struktury Fagales i alergenów pokarmowych i białek PR-10 są nieomal identyczne ze strukturą Bet v 1.

Podstawa strukturalna reaktywności krzyżowej Bet v 1 opisana została w publikacji Gajhede i wsp. 1996 (poz. 17 literatury). Tak więc, dowolny IgE rozpoznający te grupy na Bet v 1 byłby zdolny do reagowania krzyżowego i wiązania innych głównych alergenów pyłku Fagales i powodowania objawów alergicznych.

Selekcja reszt aminokwasów dla mutagenezy ukierunkowanej

Reszty aminokwasów dla mutagenezy ukierunkowanej były wybrane spośród reszt eksponowanych na powierzchni obecnych w Bet v 1. Względna orientacja i procent ekspozycji na rozpuszczalnik każdej reszty aminokwasu z odpowiedniej grupy była wyliczona w oparciu o ich współrzędne atomowe. Reszty mające niski stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (< 20%) nie były uważane za odpowiednie do mutagenezy ze względu na możliwą dysrupcję struktury lub brak interakcji z przeciwciałem. Pozostałe reszty uszeregowano według ich stopnia ekspozycji na rozpuszczalnik.

PL 212 139 B1

Porównanie sekwencji

Sekwencje homologiczne do sekwencji testowanej (Bet v 1 Nr 2801, WHO IUIS Nomenclature

Subcommittee on Allergens - Podkomitet ds. Nazewnictwa Alergenów) pochodziły z baz danych Gen-Bank i EMBL za pomocą poszukiwania BLAST (Altschul i wsp., poz. 18 literatury). Wszystkie sekwencje z BLAST z prawdopodobieństwem mniejszym niż 0,1 zostały uwzględnione i skonstruowano jedną listę zawierającą nienadmiarową listę sekwencji homologicznych. Były one porównane za pomocą CLUSTAL W (Higgins i wsp., poz. 19 literatury) i wyliczono procent identyczności dla każdej pozycji w sekwencji uwzględniając pełną listę lub tylko spokrewnione taksonomicznie gatunki. Łącznie 122 sekwencje były homologiczne do Bet v 1 Nr 2801, z czego 57 sekwencji pochodzi z taksonomicznie pokrewnych gatunków.

Klonowanie genu kodującego Bet v 1

Przygotowano RNA z pyłku Betula verrucosa (Allergon, Szwecja) za pomocą ekstrakcji fenolem i strącania LiCl. Przeprowadzono chromatografię powinowactwa na oligo-(dT) celulozie partiami w probówkach Eppendorfa i dwuniciowy cDNA syntetyzowano stosując handlowo dostępny zestaw (Amersham). DNA kodujący Bet v 1 amplifikowano za pomocą PCR i sklonowano. Pokrótce, przeprowadzono PCR stosując cDNA jako matrycę i startery zaprojektowane, aby pasowały do sekwencji cDNA w pozycjach odpowiadających, odpowiednio, N-końcowi Bet v 1 i regionowi 3' nie ulegającemu translacji. Startery przedłużano na końcach 5', aby uwzględnić miejsca restrykcyjne (Ncol i HindUI) dla ukierunkowanego wklonowania do pKK233-2.

Subklonowanie do pMAL-c

Gen kodujący Bet v 1 następnie subklonowano w wektorze fuzyjnym z białkiem wiążącym maltozę pMAL-c (New England Biolabs). Gen zamplifikowano za pomocą PCR i subklonowano w fazie z malE, aby wygenerować operony fuzyjne białko wiążące maltozę (MBP)-Bet v 1, w których MBP i Bet v 1 były oddzielone przez miejsce cięcia dla proteazy Xa umieszczone tak, aby przywróciło autentyczną N-końcową sekwencję Bet v 1 po cięciu, jak opisano w poz. 15 literatury. Pokrótce, przeprowadzono PCR stosując pKK233-3 z wstawionym Bet v 1 jako matrycę i startery odpowiadające N- i C-końcowi białka, odpowiednio. Starter bliski promotora przedłużany był w kierunku 5' końca, aby zmieścić 4 kodony kodujące w fazie miejsce cięcia dla proteazy Xa. Oba startery ponadto dalej przedłużono na końcach 5', aby zmieścić miejsca restrykcyjne (Kpnl) w celu klonowania. Geny kodujące Bet v 1 subklonowano stosując 20 cykli PCR, aby zmniejszyć częstość artefaktów PCR.

Mutageneza in vitro

Mutagenezę in vitro przeprowadzono za pomocą PCR stosując zrekombinowany pMAL-c z Bet v 1 wstawionym jako matryca. Każdy zmutowany gen Bet v 1 wygenerowano za pomocą 3 reakcji PCR stosując 4 startery. Podane poniżej przykłady mutantów należą do stanu techniki PCT/DK01/00764. Mutanty według wynalazku można przygotować i oznaczyć w podobny sposób.

Syntetyzowano dwa specyficzne względem mutacji startery oligonukleotydowe uwzględniając każdą mutację, jedną dla każdej nici DNA, patrz fig. 3 i 4. Stosując zmutowany nukleotyd(y) jako punkt wyjścia oba startery były wydłużony o 7 nukleotydów w stronę 5' końca i 15 nukleotydów w stronę 3' końca. Wydłużające nukleotydy były identyczne pod względem sekwencji z genem Bet v 7 w samym regionie.

Dodatkowo, syntetyzowano dwa ogólnie stosowalne startery („cały sensowny” i „cały nonsensowny” na fig. 4) i stosowano dla wszystkich mutantów. Te startery miały 15 nukleotydów długości i odpowiadały pod względem sekwencji regionom wektora pMAL-c około 1 kilobazę powyżej i poniżej Bet v 1. Sekwencja startera powyżej pochodzi z nici sensownej, a sekwencja startera poniżej pochodzi z nici nonsensownej, patrz fig. 4.

Dwie niezależne reakcje PCR przeprowadzono zasadniczo według procedur standardowych (Saiki i wsp. 1988, poz. 20 literatury) z wyjątkiem tego, że przeprowadzono tylko 20 cykli temperatury, aby zmniejszyć częstość artefaktów PCR. Każda reakcja PCR stosowała pMAL-c z wstawionym Bet v 1 jako matrycę i jeden specyficzny względem mutacji i jeden ogólnie stosowalny starter w znaczących kombinacjach.

Wprowadzenie czterech podstawień aminokwasów (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly) w mutancie przeprowadzone było tak jak to opisano powyżej w procesie etap po etapie. Najpierw wprowadzono mutację Glu45Ser, a następnie Pro108Gly i na koniec mutację Asn28Thr, Lys32Gln stosując pMAL-c ze wstawionym Bet v 1 Nr 2801, Bet v 1 (Glu45Ser), Bet v 1 (Glu45Ser, Pro108Gly) jako matryce, odpowiednio.

PL 212 139 B1

Produkty PCR oczyszczono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i elektroelucji, po czym nastąpiło strącanie etanolem. Przeprowadzono trzecią reakcję PCR stosując połączone produkty PCR z dwóch pierwszych reakcji PCR jako matrycę i oba ogólnie stosowalne startery. Ponownie stosowano 20 cykli PCR. Produkt PCR oczyszczono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i elektroelucji, po czym nastąpiło strącanie etanolem, przecięcie enzymami restrykcyjnymi (BsiWI/EcoRI) i ligacja kierunkowa do pMAL-c z wstawionym Bet v 1 przeciętym tymi samymi enzymami.

Figura 5 przedstawia poglądowo wszystkie 9 mutacji Bet v 1, które są jak następuje: Thr10Pro, Asp25Gly, Asn28Thr + Lys32Gln, Glu45Ser, Asn47Ser, Lys55Asn, Glu60Ser, Thr77Ala i Pro108Gly. Przygotowano także dodatkowo mutanta z czterema mutacjami (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly). Z tego wybrano pięć mutantów do dalszego testowania: Asn28Thr + Lys32Gln, Glu45Ser, Glu60Ser, Pro108Gly i mutanta trzech grup Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly.

Sekwencjonowanie nukleotydów

Określenie sekwencji nukleotydów genu kodującego Bet v 1 przeprowadzono przed i po subklonowaniu i po mutagenezie in vitro, odpowiednio.

DNA plazmidowe z 10 ml hodowli bakterii wyhodowanej do nasycenia przez noc w podłożu LB uzupełnionym 0,1 g/l ampicyliny oczyszczono w 20 kolumnach w końcówce Qiagen i sekwencjonowano stosując zestaw do sekwencjonowania Sequenase version 2.0 DNA (USB) według instrukcji producenta.

Ekspresja i oczyszczanie zrekombinowanego Bet v 1 i mutantów

Zrekombinowany Bet v 1 (Bet v 1 nr 2801 i mutanty) nadeksprymowano w Escherichia coli DH 5a w formie fuzji z białkiem wiążącym maltozę i oczyszczono, jak opisano w poz. 15 Literatury. Pokrótce, zrekombinowane komórki E. coli hodowano w 37°C do gęstości optycznej 1,0 przy 436 nm, po czym indukowano ekspresję białka fuzyjnego przez dodanie IPTG. Komórki zebrano przez wirowanie 3 godziny po indukcji, ponownie zawieszono w buforze do lizy i rozbito za pomocą sonikacji. Po sonikacji i dodatkowym wirowaniu, zrekombinowane białko fuzyjne wyizolowano za pomocą chromatografii powinowactwa na amylozie i następnie cięto przez inkubację z czynnikiem Xa (poz. 15 literatury). Po cięciu F Xa, zrekombinowany Bet v 1 izolowano przez sączenie w żelu i jeśli uważano to za konieczne, poddawano drugiej rundzie chromatografii powinowactwa na amylozie w celu usunięcia śladowych ilości białka wiążącego maltozę.

Oczyszczony zrekombinowany Bet v 1 zatężono przez ultrasączenie do około 5 mg/ml i przechowywano w 4°C. Ostateczne wydajności preparatów oczyszczonego zrekombinowanego Bet v 1 wynosiły między 2-5 mg na litr hodowli komórek E. coli.

Oczyszczone zrekombinowane preparaty Bet v 1 pojawiły się jako pojedyncze prążki po elektroforezie w żelu poliakryloamidowym SDS barwionym srebrem z pozorną masą cząsteczkową 17,5 kDa. Sekwencjonowanie N-końca wykazało oczekiwane sekwencje jak wyprowadzono z sekwencji nukleotydow cDNA i ilościowa analiza aminokwasów wykazała oczekiwany skład aminokwasów.

Poprzednio (poz. 15 literatury) wykazano, że zrekombinowany Bet v 1 nr 2801 jest immunochemicznie nie do rozróżnienia od naturalnie występującego Bet v 1. Immunoelektroforeza stosująca poliklonalne przeciwciała królika.

Siedem zmutowanych Bet v 1 wyprodukowano jako zrekombinowane białka Bet v 1 i oczyszczono, jak opisano powyżej, oraz testowano pod kątem reaktywności w stosunku do poliklonalnych przeciwciał królika uzyskanych na Bet v 1 wyizolowanym z pyłku brzozy. W analizie za pomocą immunoelektroforezy (elektroforeza kometowa) w warunkach natywnych, przeciwciała królika były zdolne do strącenia wszystkich mutantów wskazując, że mutanty miały zakonserwowane struktury trzeciorzędowe szkieletu α-węgla.

Aby zanalizować efekt na odpowiedź ludzkich poliklonalnych IgE, do dalszej analizy wybrane ostały mutanty Glu45Ser, Pro108Gly, Asn28Thr+Lys32Gln i Glu66Ser.

Mutant Bet v 1 Glu45Ser

Kwas glutaminowy w pozycji 45 wykazuje wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (40%). Stwierdzono, że grupa serynowa zajmuje pozycję 45 w Bet v 1 niektórych z homologicznych białek PR-10, co sugeruje, że kwas glutaminowy może być zastąpiony przez serynę bez zaburzenia struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla. Dodatkowo żaden ze znanych alergenów Fagales nie ma seryny w pozycji 45, podstawienie kwasu glutaminowego seryną daje w efekcie nie występującą naturalnie cząsteczkę Bet v 1.

PL 212 139 B1

Oznaczenie proliferacji komórek T stosując zrekombinowany mutant Bet v 1 Glu45Ser

Analizę przeprowadzono jak opisano w Spangfort i wsp., 1996a. Stwierdzono, że zrekombinowany mutant Bet v 1 Glu45Ser był zdolny do indukowania proliferacji w liniach komórek T z trzech różnych pacjentów alergicznych na pyłek brzozy ze wskaźnikami stymulacji podobnym do zrekombinowanych i naturalnie występujących.

Krystalizacja i strukturalne oznaczenie zrekombinowanego Bet v 1 Glu45Ser

Kryształy zrekombinowanego Bet v 1 Glu45Ser hodowano przez dyfuzję par w 25°C. zasadniczo jak opisano w Spangfort i wsp. 1996b, poz. 21 literatury. Bet v 1 Glu45Ser w stężeniu 5 mg/ml zmieszany został z równą objętością 2,0 M siarczan amonu, 0,1 M cytrynian sodu, 1% (obj./obj.) dioksan, pH 6,0 i równoważony wobec 100x objętości 2,0 M siarczanu amonu, 0,1 M cytrynianu sodu, 1% (obj./obj.) dioksan, pH 6,0. Po 24 godzinach równoważenia wzrost kryształu indukowano przez stosowanie techniki zaszczepiania opisanej w poz. 21 Literatury, stosując kryształy zrekombinowanego Bet v 1 typu dzikiego jako źródło zarodzi.

Po około 2 miesiącach zebrano kryształy i analizowano je stosując promienie rentgenowskie wygenerowane z anody obrotowej Rigaku jak opisano w poz. 21 literatury i struktura była rozwiązana stosując zastąpienie molekularne.

Stuktura mutanta Bet v 1 Glu45Ser

Wpływ mutacji na strukturę adresowano przez hodowlę trójwymiarowych kryształów białka Bet v 1 Glu45Ser rozpraszających do rezolucji 3,0 A, gdy analizowane są przez promienie rentgenowskie generowane z anody obrotowej. Podstawienie kwasu glutaminowego przez serynę w pozycji 45 sprawdzono przez mapę gęstości elektronów Bet v 1 Glu45Ser, która także pokazała, że jest zachowana ogólna struktura trójwymiarowa szkieletu α-węgla.

Właściwości wiązania IgE mutanta Bet v 1 Glu45Ser

Właściwości wiązania mutanta Bet v 1 Glu45Ser porównano ze zrekombinowanym Bet v 1 w oznaczeniu w fazie płynnej hamowania stosując pulę surowicy IgE pochodzącej z pacjentów alergicznych na brzozę.

Zrekombinowany Bet v 1 nr 2801 biotynylowano w molowym stosunku 1:5 (Bet v 1 nr 2801: biotyna). Oznaczenie hamowania przeprowadzono jak następuje: próbkę surowicy (25 μΐ) inkubowano z anty IgE w fazie stałej, płukano, zawieszano ponownie i dalej inkubowano z mieszaniną biotynylowanego Bet v 1 nr 2801 (3,4 nM) i danego mutanta (0-28,6 nM). Ilość biotynylowanego Bet v 1 nr 2801 wiązanego do fazy stałej oceniano z pomiaru RLU po inkubacji ze streptawidyną oznakowaną estrem akrydyny. Stopień hamowania wyliczono jako stosunek między RLU otrzymanym z zastosowaniem buforu i mutanta jako inhibitora.

Figura 6 przedstawia hamowanie wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE surowicy z puli pacjentów alergicznych przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta Bet v 1 Glu45Ser.

Istnieje wyraźna różnica w ilości odpowiednich zrekombinowanych białek potrzebnych do uzyskania 50% inhibicji wiązania surowicy IgE obecnej w puli surowicy. Zrekombinowany Bet v 1 osiąga 50% inhibicji przy wartości około 6,5 ng podczas, gdy odpowiednie stężenie dla mutanta Bet v 1 Glu45Ser wynosi około 12 ng. To wykazuje, że mutacja punktowa wprowadzona w mutancie Bet v 1 Glu45Ser wyraźnie obniża powinowactwo w stosunku do specyficznej IgE surowicy o czynnik 2.

Maksymalny poziom hamowania osiągany przez mutanta Bet v 1 Glu45Ser jest wyraźnie niższy w porównaniu ze zrekombinowanym Bet v 1. To może wskazywać, że po podstawieniu Glu45Ser część specyficznej IgE obecnej w puli surowicy jest niezdolna do rozpoznania mutanta Bet v 1 Glu45Ser.

Mutant Bet v 1 AsnThr+Lys32Gln

Asparaginian i lizyna w pozycjach 28 i 32 odpowiednio wykazują wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (odpowiednio, 35% i 50%). W strukturze asparaginian 28 i lizyna 32 umieszczone są blisko siebie na powierzchni molekularnej i najprawdopodobniej oddziałują za pomocą wiązań wodorowych. Znaleziono resztę treoniny i glutaminy w pozycjach 28 i 32, odpowiednio w niektórych z homologicznych do Bet v 1 białek PR-10, co przemawia za tym, że asparaginian i lizyna mogą być podstawione odpowiednio treoniną i glutaminą, bez zaburzenia struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla. Dodatkowo, jako że żadna z naturalnie występujących sekwencji izoalergenów nie ma treoniny i glutaminianu w pozycjach 28 i 32, odpowiednio, podstawienia dają cząsteczkę Bet v 1 nie występującą naturalnie.

PL 212 139 B1

Właściwości wiązania IgE mutanta Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln

Właściwości wiązania IgE mutanta Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln porównano ze zrekombinowanym Bet v 1 w oznaczeniu inhibicji IgE fazy ciekłej stosując pulę surowicy IgE pochodzącej z pacjentów alergicznych na brzozę, jak to opisano powyżej.

Figura 7 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE surowicy z puli alergicznych pacjentów przez niebiotynylowany Bet v 1 i mutanta Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln.

Występuje wyraźna różnica w odpowiedniej ilości zrekombinowanych białek potrzebnych do uzyskania 50% hamowania wiązania do IgE surowicy obecnej w puli surowic. Zrekombinowany Bet v 1 osiąga 50% hamowania przy około 6,5 ng podczas, gdy odpowiednie stężenie dla mutanta Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln wynosi około 12 ng. To wykazuje, że mutacje punktowe wprowadzone do mutanta Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln obniżają powinowactwo dla specyficznej IgE surowicy o czynnik około 2.

Maksymalny poziom inhibicji osiągany przez mutanta Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln jest wyraźnie niższy w porównaniu ze zrekombinowanym Bet v 1. To może wskazywać, że po podstawieniach Asn28Thr+Lys32Gln część ze specyficznych IgE obecnych w puli surowic nie wykazuje zdolności do rozpoznania mutanta Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln.

Mutant Bet v 1 Pro108Gly

Prolina w pozycji 108 wykazuje wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (60%). Znaleziono resztę glicyny w pozycji 108 w niektórych białkach PR-10 homologicznych do Bet v 1 sugerując, że prolina może być zastąpiona przez glicynę bez zaburzenia struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla. Dodatkowo, jako, że żadna z naturalnie występujących sekwencji izoalergenów nie ma glicyny w pozycji 108 podstawienie proliny glicyną powoduje powstanie nie występującej naturalnie cząsteczki Bet v 1.

Właściwości wiązania IgE mutanta Bet v 1 Pro108Gly

Właściwości wiązania IgE mutanta Bet v 1 Pro108Gly porównano ze zrekombinowanym Bet v 1 w oznaczeniu w fazie płynnej hamowania stosując pulę surowicy IgE pochodzącą z pacjentów alergicznych na brzozę opisanych powyżej.

Figura 8 przedstawia hamowanie wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE surowicy z puli pacjentów alergicznych przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta Bet v 1

Pro108Gly.

Występuje wyraźna różnica w ilości odpowiednich zrekombinowanych białek potrzebnych do uzyskania 50% inhibicji wiązania surowicy IgE obecnej w puli surowicy. Zrekombinowany Bet v 1 osiąga 50% inhibicji przy około 6,5 ng podczas, gdy odpowiednie stężenie dla mutanta Bet v 1 Pro108Gly wynosi około 15 ng. To wykazuje, że pojedyncza mutacja punktowa wprowadzona w mutancie Bet v 1 Pro108Gly obniża powinowactwo dla specyficznej IgE surowicy o czynnik około 2.

Maksymalny poziom hamowania osiągany przez mutanta Pro108Gly Bet v 1 jest nieco niższy w porównaniu ze zrekombinowanym Bet v 1. To może wskazywać, że po substytucji Pro108Gly część specyficznej IgE w puli surowicy nie wykazuje zdolności do rozpoznania mutanta Bet v 1 Pro108Gly.

Mutant Bet v 1 Glu60Ser

Kwas glutaminowy w pozycji 60 wykazuje wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (60%). Znaleziono resztę seryny w pozycji 60 w niektórych białkach PR-10 homologicznych do Bet v 1 sugerując, że kwas glutaminowy może być zastąpiony przez serynę bez zaburzenia struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla. Dodatkowo, jako że żadna z naturalnie występujących sekwencji izoalergenów nie ma seryny w pozycji 60, podstawienie kwasu glutaminowego seryną powoduje powstanie nie występującej naturalnie cząsteczki Bet v 1.

Właściwości wiązania IgE mutanta Bet v 1 Glu60Ser

Właściwości wiązania IgE mutanta Glu60Ser porównano ze zrekombinowanym Bet v 1 w oznaczeniu w fazie ciekłej hamowania stosując pulę surowicy IgE pochodzącej z pacjentów alergicznych na brzozę opisanych powyżej.

Figura 9 przedstawia hamowanie wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE surowicy z puli pacjentów alergicznych przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta Glu60Ser Bet v 1. W przeciwieństwie do mutantów Glu45Ser, Pro108Gly i Asn28Thr+Lys32Gln, podstawienie kwasu glutaminowego 60 przez serynę nie wykazuje żadnych znaczących efektów na właściwości wiązania IgE.

PL 212 139 B1

Analiza strukturalna mutanta Bet v 1 Glu45Ser, Asn28Thr+Lys32Gln i Pro108Gly

Integralność strukturalną oczyszczonego zrekombinowanego białka badano za pomocą spektroskopii dichroizmu kołowego (CD). Fig. 10 pokazuje widma CD zrekombinowanego mutanta i zrekombinowanego naturalnie występującego białka zapisane w stężeniach prawie równych. Zachodzenie na siebie amplitud szczytów i pozycji w widmach CD z dwóch zrekombinowanych białek wykazuje, że dwa preparaty zawierają równe ilości struktur drugorzędowych silnie sugerując, że wprowadzone podstawienia aminokwasów nie wpływają na strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla.

Właściwości wiązania IgE mutanta Bet v 1 Glu45Ser, Asn28Thr+Lys32Gln i Pro108Gly

Właściwości wiązania IgE mutanta Bet v 1 porównano ze zrekombinowany m Bet v 1 w oznaczeniu w fazie płynnej hamowania stosując pulę surowicy IgE pochodzącej z pacjentów alergicznych na brzozę opisanych powyżej.

Figura 11 przedstawia hamowanie wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE surowicy z puli pacjentów alergicznych przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta Bet v 1. W odróżnieniu od pojedynczych mutantów opisanych powyżej, krzywa inhibicji mutanta nie jest już równoległa względem rekombinanta. Wykazuje to, że podstawienia wprowadzone w mutancie zmieniły właściwości wiązania IgE i profil epitopu w porównaniu z rekombinantem. Brak równoległości czyni trudnym oznaczenie ilościowe spadku powinowactwa mutanta do specyficznej IgE surowicy.

Zrekombinowany Bet v 1 osiąga 50% hamowania przy około 6 ng, podczas gdy odpowiednie stężenie dla Bet v 1 (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly) wynosi 30 ng, to znaczy obniżenie powinowactwa o czynnik 5. Jednak, aby osiągnąć 80% hamowania odpowiednie wartości wynoszą odpowiednio 20 ng i 400 ng, to znaczy spadek o czynnik 20.

Oznaczenie proliferacji komórek T stosując zrekombinowany Bet v 1 Glu45Ser, Asn28Thr + Lys32Gln i Pro108Gly

Analizę przeprowadzono jak opisano w poz. 15 literatury. Stwierdzono, że zrekombinowany mutant Bet v 1 był zdolny do indukowania proliferacji komórek T z trzech różnych pacjentów alergicznych na pyłki ze wskaźnikami podobnymi do zrekombinowanych i naturalnie występujących. To sugeruje, że mutant może inicjować odpowiedź odpornościową komórkową potrzebną do produkcji przeciwciał.

P r z y k ł a d 2

Mutageneza in vitro mutantów według niniejszego wynalazku

Mutagenezę in vitro przeprowadzono za pomocą PCR stosując zrekombinowany pMAL-c z Bet v 1 wstawionym jako matrycę. Przygotowanie zmutowanych zrekombinowanych alergenów obejmowało dwa etapy: etap I i etap II. Najpierw każda pojedyncza mutacja (lub kilka mutacji, jeśli są umieszczone blisko siebie w sekwencji DNA) wprowadzono do kolejnych sekwencji DNA Bet v 1.2801 lub pochodnych Bet v 1 (2595) lub Bet v 1 (2628) lub Bet v 1 (2733) stosując startery oligonukleotydowe sensowne i nonsensowne specyficzne dla mutacji zawierające albo położone w pobliżu mutacje sąsiadujące powyżej lub poniżej lub N-koniec/C-koniec Bet v 1, odpowiednio jak przedstawiono na schemacie na fig. 12 (I). Po drugie, produkty PCR z reakcji PCR I były oczyszczone, zmieszane i stosowane jako matryce dla dodatkowej reakcji PCR (II) ze starterami oligonukleotydowymi mieszczącymi N-koniec i C-koniec Bet v 1, jak schematycznie zilustrowano na fig. 13 (II). Produkty PCR oczyszczono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i oczyszczono w żelu po PCR (Life Technologies) po strącaniu etanolem, pocięto enzymami restrykcyjnymi (SacI/EcoRl) lub (Sacl/Xbal) i ligowano kierunkowo do pMAL-c strawionego tymi samymi enzymami.

Figura 13 przedstawia syntetyzowane startery oligonukleotydowe i schematycznie ilustruje konstrukcję mutantów Bet v 1. Sklonowano i zsekwencjonowano następujące mutanty Bet v 1 (sekwencjonowanie cząsteczek kwasu nukleinowego jest opisane w przykładzie 1).

Bet v 1 (3004):

GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPQAISSVsNIEGNGGPGTIK

KISFPEGflPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEIvIVATPD

GGSILKISNKYHTKGDHEVKAEQVeASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNn

Bet v 1 (3005):

GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK

ISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEIvIVATPDGJ

GSILKISNKYHTKGDHEVKAEQVeASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNn

Bet v 1 (3007):

GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK

PL 212 139 B1

ISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEIvIVATgDG

GSILKISNK YHTKGyHE VKAEQVeASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNn

Bet v 1 (3009):

GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK

ISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLsKISNEIKIVATgD

GSILKISNKYHTKGDHEVKAEQVKASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNn

Bet v 1 (3006):

GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK

ISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEIvIVATPDG

GSILKISNK YHTKGDHEVKAEQVeASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYgn

Bet v 1 (3008):

GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPkVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK

ISFPEGfPFKYVKDRVDsVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLsKISNEIKIVATgDG

GSILKISNK YHTKGyHE VKAEQVKASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYgn.

Dalsze mutanty przygotowane według wynalazku

Wprowadzenie wielokrotnych mutacji do Bet v 1 może potencjalnie destabilizować wzór zwijania szkieletu a-węgla cząsteczki. Wprowadzenie losowych podstawień aminokwasów zwiększa szanse wygenerowania stabilnych cząsteczek Bet v 1. Wygenerowano więc bibliotekę mutantów Bet v 1 zawierającą mutanty Bet v 1 z 17-20 mutacjami punktowymi, którymi aminokwasy były losowo podstawione w 7 pozycjach. Biblioteka zawierała setki różnych klonów. Uzyskano piętnaście mutantów Bet v 1 nazwanych Bet v 1 (3031) do (3045) z tej biblioteki Bet v 1 wygenerowanej stosując zdegenerowane startery oligonukleotydowe. Te startery mieściły w sobie losowe podstawienia reszt aminokwasów w pozycjach T10, K20, Q36, E73, E87, K129 i S149 Bet v 1 (fig. 14 i 15). Te pozycje nie zachodziły na mutacje punktowe już wprowadzone do Bet v 1 (3002) i Bet v 1 (2595), które były stosowane jako matryce DNA do mutagenezy ukierunkowanej reakcji PCR przedstawionych na fig. 15.

Procedura klonowania była taka sama jak ilustrowana na fig. 12 poza tym, że startery stosowane w pierwszej rundzie PCR były zdegenerowane w pewnych pozycjach jak wskazano na fig. 15 przez litery inne niż G, C, T lub A. Stosowanie innych liter niż G, C, T lub A wskazuje, że startery zawierają kilka różnych nukleotydów w tych pozycjach. Osiem produktów PCR obejmujących gen Bet v 1 wyprodukowano i oczyszczono w pierwszej rundzie PCR i następnie zmontowano stosując startery do końców (3076s i 3067a) i drugą reakcję PCR, gdzie osiem produktów PCR z pierwszej rundy stosowano jako matrycę.

Mutanty Bet v 1 3031 do 3045 poddano sekwencjonowaniu DNA, jak opisano dla mutantów Bet v 1 3004, 3005, 3007 i 3007, aby sprawdzić liczbę oraz charakter wprowadzonych mutacji punktowych:

Bet v 1 klon („3031”) (SEQ ID NO 25):

GVFNVETETASVIPAARLFNAFILDGDTLFPQVAPQAISSVSNISGNGGPGTI

KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLESISNErVIVAT

PDGGSILKISNK YHTIGDHE VEAEQVEASKEMGETLLRAVEPYLLAHSHAYNN

Bet v 1 klon („3032”) (SEQ ID NO 26):

GVFNVETETASVIPAARLFLAFILDGDTLFPQVAPPAISSVSNISGNGGPGTI

KKISFPEGLPFNYVKDRVDPVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT

PDGGSILKISNK YHTIGDHE VEAEQVEASKEMGETLLRAVEGYLLAHSHAYNN

Bet v 1 klon („3033”) (SEQ ID NO 27):

GVFNVETETPSVIPAARLFHAFILDGDTLFPQVAPKAISSVSNISGNGGPGTI

KKISFPEGLPFNYVKDRVDRVDHTKFKYNYSVIEGGPIGDTLESISNEIVIVAT

PDGGSILKISNK YHTIGDHE VEAEQVEASKEMGETLLRAVEGYLLAHSHAYNN

Bet v 1 klon („3034”) (SEQ ID NO 28):

GVFNVETETTSVIPAARLFHAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI

KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT

PDGGSILKISNK YHTIGDHE VEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYNN

Bet v 1 klon („3035”) (SEQ ID NO 29):

GVFNVETETPSVIPAARLFMAFILDGDTLFPQVAPPAISSVSNISGNGGPGTI

KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTNFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT

PDGGSILKISNK YHTIGDHE VEAEQVEASKEMGETLLRAVEAYLLAHSHAYNN

PL 212 139 B1

Bet v 1 klon („3036”) (SEQ ID NO 30):

GVFNVETETPSVIPAARLFLAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDTVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT PDGGSILKISNK YHTIGDHE VEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYNN Bet v 1 klon („3037”) (SEQ ID NO 31):

GWNVETETPSVIPAARLFQAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTIJ KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTNFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT PDGGSILKISNK YHTIGDHE VEAEQVEASKEMGETLLRAVEPYLLAHSHAYNN Bet v 1 klon („3038”) (SEQ ID NO 32):

GVFNVETETASVIPAARLFLAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDGVDHTKFKYNYSVIDGGPIGDTLESISNEIVIVAT PDGGSILKISNK YHTIGDHE VEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYNN Bet v 1 klon („3039”) (SEQ ID NO 33):

GVFNVETETASVIPAARLFLAFILDGDTLFPQVAPEAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDGVDHTNFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVA TPDGGSILKISNK YHTIGDHE VEAEQVEASKEMGETLLRAVEAYLLAHSHAYNN Bet v 1 klon („3040”) (SEQ ID NO 34):

GWNVETETPSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT PDGGSILKISNKYHTIGDHE VEAEQVEASKEMGETLLRAVETYLLAHSHAYNN Bet v 1 klon „3041”) (SEQ ID NO 35):

GVFNVETETPSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDRVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT PDGGSILKISNK YHTIGDHE VEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYNN Bet v 1 klon („3042”) (SEQ ID NO 36):

GVFNVETETPSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDRVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT PDGGSILKISNK YHTIGDHE VEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYNN Bet v 1 klon („3043”) (SEQ ID NO 37):

GVFNVETETPSVIPAARLFLAFILDGDTLFPQVAPKAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDRVDHTKFKYNYSVIDGGPIGDTLESISNEIVIVAT PDGGSILKISNK YHTIGDHE VEAEQVEASKEMGETLLRAVEPYLLAHSHAYNN Bet v 1 klon („3044”) (SEQ ID NO 38):

GVFNVETETPSVIPAARLFLAFILDGDTLFPQVAPKAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDGVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVA TPDGGSILKISNK YHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVETYLLAHSHAYNN Bet v 1 klon („3045”) (SEQ ID NO 39):

GVFNVETETPSVIPAARLFMAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI KKISFPEGLPFNYVKDRVDGVDHTKFKYNYSVIDGGPIGDTLESISNEIVIVAT PDGGSILKISNK YHTIGDHE VEAEQVEASKEMGETLLRAVEGYLLAHSHAYNN P r z y k ł a d 3

Identyfikacja i wybór aminokwasów do podstawienia

Parametry dostępności rozpuszczalnika i stopień konserwacji stosowano do identyfikacji i wybrania eksponowanych na powierzchni aminokwasów odpowiednich do podstawienia dla alergenów

Bet v 1, Der p 2 i Ves v 5.

Dostępność dla rozpuszczalnika

Dostępność dla rozpuszczalnika wyliczono stosując oprogramowanie InsightII, version 97.0 (MSI) i promień sondy 1,4 A (powierzchnia Connolly'ego).

Wewnętrzne jamki wykluczono z analiz przez wypełnienie sondami stosując oprogramowanie

PASS (Putative Active Sites with Spheres - domniemane aktywne miejsca ze sferami). Sondy na powierzchni następnie usuwano ręcznie.

Konserwacja

Bet v 1: Struktura 3-D jest oparta na numerze dostępu Z80104 (1bv1.pdb).

innych sekwencji Bet v 1 objętych przez analizę konserwowanych reszt obejmuje numery dostępu:

PL 212 139 B1

P15494=X 15877=Z80106, Z80101, AJ002107, Z72429, AJ002108, Z80105, Z80100, Z80103, AJ001555, Z80102, AJ002110, Z72436, P43183=X77271, Z72430, AJ002106, P43178=X77267, P43179=X77268, P43177=X77266, Z72438, P43180=X77269, AJ001561, P43185=X77273, AJ001557, Z72434, AJ001556, Z72433=P43186, AJ001554, X81972, Z72431, P45431=X77200, P43184=X77272, P43176=X77265, S47250, S47251, Z72435, Z72439, Z72437, S47249.

Bet v 1: 59 aminokwasów wysoce eksponowanych na rozpuszczalnik:

K-129, E-60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D-125, R-145, D-109, T-77, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D-156, P-63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, L-62, S-155, H-126, P-50, N-78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153, 1-44, E-138, G-61, A-130, R-70, N-28, P-35, S-149, K-103, Y-150, H-154, N-43, A-106, K-115, P-14, Y-5, K-137, E-141, E-87, E-73.

aminokwasów wysoce eksponowanych na rozpuszczalnik i konserwowanych (> 70%):

K-129, E-60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D-125, R-145, D-109, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D-156, P-63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, S-155, H-126, P-50, N-78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153, 1-44, E-138, G-61, A-130, R-70, N-28, P-35, S-149, K-103, Y-150, H-154, N-43, A-106, K-115, P-14, Y-5, K-137, E-141, E-87, E-73.

Tabela 1 przedstawia listę w malejącej kolejności ekspozycji na rozpuszczalnik aminokwasów Bet v 1. Kolumna 1 wylicza liczbę aminokwasu startując od N-końca, kolumna 2 podaje aminokwasy w skrótach 1 literowych, kolumna 3 podaje normalizowany wskaźnik ekspozycji na rozpuszczalnik, kolumna 4 wylicza procent znanych sekwencji mających dany aminokwas w tej pozycji.

T a b e l a 1

Nr	AA	Eks. na rozp.	Kons. %
1	2	3	4
129	K	1,000	90
60	E	0,986	97
47	N	0,979	100
65	K	0,978	100
108	P	0,929	100
159	N	0,869	100
93	D	0,866	100
123	K	0,855	100
32	K	0,855	100
125	D	0,821	74
145	R	0,801	90
109	D	0,778	82
77	T	0,775	56
127	E	0,760	100
36	Q	0,749	95
131	E	0,725	100
152	L	0,718	97
6	E	0,712	100
96	E	0,696	100
156	D	0,693	97
63	P	0,692	97
76	H	0,683	90
8	E	0,638	97

PL 212 139 B1 cd tabeli 1

1	2	3	4
134	K	0,630	100
45	E	0,623	100
10	T	0,613	97
12	V	0,592	100
20	K	0,584	100
62	L	0,575	5
155	S	0,568	97
126	H	0,551	95
50	P	0,541	100
78	N	0,538	100
119	K	0,529	100
2	V	0,528	100
24	L	0,528	100
42	E	0,519	100
4	N	0,517	95
153	A	0,513	100
44	I	0,508	97
138	E	0,496	100
61	G	0,488	100
130	A	0,479	97
70	R	0,474	100
28	N	0,469	90
35	P	0,467	100
149	S	0,455	92
103	K	0,447	100
150	Y	0,438	100
154	H	0,436	100
43	N	0,412	100
106	A	0,411	95
115	K	0,411	100
14	P	0,410	97
5	Y	0,410	100
137	K	0,396	100
141	E	0,387	95
87	E	0,385	100
73	E	0,384	100
16	A	0,367	100
79	F	0,362	100

PL 212 139 B1 cd tabeli 1

1	2	3	4
3	F	0,355	100
158	Y	0,346	100
105	V	0,336	100
101	E	0,326	100
64	F	0,325	100
86	I	0,322	100
39	S	0,314	100
124	G	0,310	100
72	D	0,308	97
142	T	0,293	67
66	Y	0,289	100
55	K	0,288	100
7	T	0,279	67
40	S	0,274	95
25	D	0,271	87
135	A	0,267	92
68	K	0,262	100
97	K	0,247	100
46	G	0,235	100
27	D	0,232	97
1	G	0,227	100
113	I	0,225	77
51	G	0,220	100
92	G	0,218	100
80	K	0,212	100
110	G	0,211	100
107	T	0,203	85
94	T	0,202	92
41	V	0,201	97
48	G	0,198	100
91	I	0,192	18
31	P	0,188	100
75	D	0,188	97
33	V	0,183	100
49	G	0,176	100
17	R	0,172	100
99	S	0,158	64
89	G	0,154	100

PL 212 139 B1 cd tabeli 1

1	2	3	4
53	I	0,154	100
121	H	0,153	100
9	T	0,150	72
74	V	0,148	97
132	Q	0,146	72
57	s	0,137	49
148	E	0,135	100
82	N	0,133	41
128	V	0,125	64
117	S	0,124	87
90	P	0,117	67
116	I	0,112	100
122	T	0,107	100
139	M	0,104	62
95	L	0,104	97
54	K	0,096	100
146	A	0,095	100
59	P	0,088	97
157	A	0,088	100
133	V	0,077	44
88	G	0,068	100
140	G	0,053	85
37	A	0,042	95
81	Y	0,041	100
23	I	0,036	95
104	I	0,036	92
15	A	0,036	97
58	F	0,029	100
29	L	0,028	100
19	F	0,027	100
100	N	0,022	97
22	F	0,021	97
71	V	0,014	100
111	G	0,014	100
13	I	0,014	100
18	L	0,014	97
114	L	0,014	100
11	S	0,007	100

PL 212 139 B1 cd tabeli 1

1	2	3	4
151	L	0,007	97
144	L	0,007	90
52	T	0,007	100
84	S	0,007	97
118	N	0,007	97
102	I	0,007	100
21	A	0,000	97
26	G	0,000	97
30	F	0,000	44
34	A	0,000	100
38	I	0,000	87
56	I	0,000	100
67	V	0,000	97
69	D	0,000	62
83	Y	0,000	95
85	V	0,000	72
98	I	0,000	95
112	S	0,000	77
120	Y	0,000	95
136	S	0,000	67
143	L	0,000	100
147	V	0,000	100

P r z y k ł a d 4

Ten przykład opisuje przygotowanie i charakterystykę zrekombinowanych zmutowanych alergenów Bet v 1 z więcej niż czterema mutacjami i obniżoną zdolnością do wiązania IgE według stanu techniki PCT/DKO1/00764. Mutanty według wynalazku przygotowano i oznaczono odpowiednio.

Wybór reszt aminokwasów do ukierunkowanej mutagenezy Bet v 1

Reszty aminokwasów wybrano jak opisano w przykładzie 1.

Mutageneza in vitro

Mutagenezę in vitro przeprowadzono za pomocą PCR stosując zrekombinowany pMAL-c z Bet v 1 wstawionym jako matrycą. Przygotowanie zrekombinowanych zmutowanych alergenów zawierających pięć do dziewięciu pierwotnych mutacji obejmowało dwa etapy PCR: etap I i II. Najpierw każdą pojedynczą mutację (lub kilka mutacji, jeśli są umieszczone blisko siebie w sekwencji DNA) wprowadzono do kolejnych sekwencji DNA Bet v 1.2801 lub pochodnych Bet v 1.2801 stosując startery oligonukleotydowe sensowne i nonsensowne specyficzne dla mutacji zawierające położone w pobliżu mutacje sąsiadujące powyżej lub poniżej lub N-koniec/C-koniec Bet v 1, odpowiednio, jak przedstawiono na schemacie na fig. 15 (I). Po drugie, produkty PCR z reakcji PCR I były oczyszczone, zmieszane i stosowane jako matryce dla dodatkowej reakcji PCR (II) ze starterami oligonukleotydowymi mieszczącymi N-koniec i C-koniec Bet v 1 jak zilustrowano schematycznie na fig. 15 (II). Produkty PCR oczyszczono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i oczyszczono w żelu po PCR (Life Technologies) po strącaniu etanolem, pocięto enzymami restrykcyjnymi (SacI/EcoRl) lub (Sacl/Xbal) i ligowano w sposób ukierunkowany do pMAL-c strawionego tymi samymi enzymami.

PL 212 139 B1

Figura 16 przedstawia syntetyzowane startery oligonukleotydowe i schematycznie ilustruje konstrukcję mutantów Bet v 1 z więcej niż czterema pierwotnymi mutacjami. Zmutowane aminokwasy były korzystnie wybrane z grupy złożonej z aminokwasów, które charakteryzują się tym, że są wysoce eksponowanymi na rozpuszczalnik i konserwowane jak opisano w przykładzie 3. Mutanty Bet v 1 są jak następuje:

Mutant Bet v 1 (2628): Tyr5Val, Glu45Ser, Lys65Asn, Lys97Ser, Lys134Glu.

Mutant Bet v 1 (2637): Ala16Pro, Asn28Thr, Lys32Gln, Lys103Thr, Pro108Gly, Leu152Lys, Ala153Gly, Ser155Pro.

Mutant Bet v 1 (2733): Tyr5Val, Lys134Glu, Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Lys65Asn, Asn78Lys, Lys103Val, Lys97Ser, Pro108Gly, Arg145Glu, Asp156His, +160Asn.

Mutant Bet v 1 (2744): Tyr5Val, Lys134Glu, Glu42Ser, Glu45Ser, Asn78Lys, Lys103Val, Lys123Ile, Asp156His, +160Asn.

Mutant Bet v 1 (2753): Asn28Thr, Lys32Gln, Lys65Asn, Glu96Leu, Lys97Ser, Pro108Gly, Asp109Asn, Asp125Tyr, Glu127Ser, Arg145Glu.

Sekwencjonowanie nukleotydów i ekspresja i oczyszczanie zrekombinowanego Bet v 1 i mutantów

Sekwencjonowanie i ekspresję zrekombinowanego białka przeprowadzono jak opisano w przykładzie 1.

Mutanty Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637)

Figura 17 przedstawia wprowadzone mutacje punktowe na powierzchni molekularnej Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637).

Krystalizacja i określenie strukturalne zrekombinowanego białka mutanta Bet v 1(2628)

Określenie strukturalne przeprowadzono jak opisano w przykładzie 1.

Struktura mutanta Bet v 1 (2628)

Efekt strukturalny mutacji adresowano przez hodowlę trójwymiarowych kryształów białka Bet v 1 (2628) rozpraszających do rozdzielczości do 2,0 A, gdy analizowane są przez promienie rentgenowskie generowane z anody obrotowej. Podstawienia Tyr5Val, Glu45Ser, Lys65Asn, Lys97Ser, Lys134Glu sprawdzono przez mapę gęstości elektronów Bet v 1 (2628), która także pokazała, że jest zachowana ogólna struktura trójwymiarowa szkieletu α-węgla.

Analiza strukturalna mutanta Bet v 1 (2637)

Integralność strukturalną oczyszczonego mutanta Bet v 1 (2637) badano za pomocą spektroskopii dichroizmu kołowego (CD). Fig. 18 przedstawia widma CD zrekombinowanego Bet v 1.2801 (typ dziki) i mutanta Bet v 1 (2637) zapisane w prawie równych stężeniach. Zachodzenie na siebie amplitud szczytów i pozycji w widmach CD z dwóch zrekombinowanych białek wykazuje, że dwa preparaty zawierają równe ilości struktur drugorzędowych silnie sugerując, że wprowadzone podstawienia aminokwasów nie wpływają na strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla.

Właściwości wiązania IgE mutantów Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637)

Właściwości wiązania IgE mutanta Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637) jak i mieszaniny 1:1 Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637) porównano ze zrekombinowanym Bet v 1.2801 typu dzikiego w oznaczeniu w fazie płynnej hamowania stosując pulę surowicy IgE pochodzącej z pacjentów alergicznych na brzozę.

Jak opisano w przykładzie 1, zrekombinowany Bet v 1.2801 biotynylowano w molowym stosunku 1:5 (Bet v 1 nr 2801:biotyna). Oznaczenie hamowania przeprowadzono jak następuje: próbkę surowicy (25 μΓ> inkubowano z anty IgE fazy stałej, płukano, zawieszano ponownie i dalej inkubowano z mieszaniną biotynylowanego Bet v 1.2801 i danego mutanta lub mieszaniną 1:1 dwóch mutantów. Ilość biotynylowanego Bet v 1.2801 związanego z fazą stałą oceniano z pomiaru RLU po inkubacji ze streptawidyną oznakowaną estrem akrydyny. Stopień hamowania wyliczono jako stosunek między RLU otrzymanych z zastosowaniem buforu i mutanta jako inhibitora.

Figura 19 przedstawia hamowanie wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1.2801 do IgE surowicy z puli alergicznych pacjentów przez niebiotynylowany Bet v 1.2801 i przez Bet v 1 (2628), Bet v 1 (2637), i mieszaninę 1:1 Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637).

Istnieje wyraźna różnica w ilości odpowiednich zrekombinowanych białek potrzebnych do uzyskania 50% inhibicji wiązania surowicy IgE obecnej w puli surowicy. Zrekombinowany Bet v 1.2801 osiąga 50% inhibicji przy około 5 ng podczas, gdy odpowiednie stężenie dla mutanta Bet v 1 (2628) wynosi około 15-20 ng. To wykazuje, że mutacja punktowa wprowadzona w mutancie Bet v 1 (2628) obniża powinowactwo dla specyficznej IgE surowicy o czynnik o około 3-4.

PL 212 139 B1

Maksymalny poziom hamowania osiągany przez zmutowane białko Bet v 1 (2628) jest wyraźnie niższy w porównaniu ze zrekombinowanym Bet v 1.2801. To może wskazywać, że część specyficznej IgE w puli surowicy nie wykazuje zdolności do rozpoznania mutanta Bet v 1 (2628) ze względu na wprowadzone mutacje punktowe.

Bet v 1 (2637) osiąga 50% hamowania przy około 400-500 ng wykazując, że mutacja punktowa wprowadzona u mutanta Bet v 1 (2637) obniża powinowactwo do specyficznej IgE surowicy około 80 do 100 razy w porównaniu z Bet v 1.2801. Duża różnica we wiązaniu IgE jest dalej wspierana przez wyraźną różnicę w nachyleniu krzywej hamowania uzyskanej ze zmutowanym białkiem Bet v 1 (2637) w porównaniu z krzywą hamowania dla Bet v 1.2801. Różne nachylenia dostarczają dowód, że obniżenie wiązania IgE jest wynikiem wyraźnie innego wzoru epitopu mutanta w porównaniu z Bet v 1.2801.

Oprócz hamowania z pojedynczymi modyfikowanymi alergenami, odpowiednio, badano mieszaninę 1:1 Bet 1 (2628) i Bet v 1 (2637) mających takie same molowe stężenia Bet v 1 jak każda z próbek z Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637) i wykazywano pełną (100%) zdolność hamowania wiązania IgE do rBet v 1.2801. Zdolność do pełnego hamowania wiązania IgE jest jasnym wskazaniem, że wszystkie reaktywne epitopy obecne na Bet v 1.2801 były obecne w mieszaninie alergenów 1:1. Dalsze poparcie pochodzi z porównywalnego nachylenia obu krzywych hamowania dla Bet v 1.2801 i mieszaniny alergenów. Zmniejszona reaktywność IgE mieszanej próbki alergenu wykazywana jest przez potrzebę czterokrotnie wyższego stężenia mieszaniny alergenów w porównaniu z Bet v 1.2801, dla uzyskania 50% hamowania wiązania IgE.

Oznaczenie proliferacji komórek T stosując alergeny zrekombinowanego mutanta Bet v 1

Analizę przeprowadzono jak opisano w poz. 15 literatury. Oba białka mutanta Bet v 1 (2628) i Bet v 1(2637) były zdolne do indukowania proliferacji w liniach komórek T z pacjentów alergicznych na pyłek brzozy ze wskaźnikami stymulacji podobnymi do zrekombinowanych i naturalnie występujących. Sugeruje to, że zarówno zmutowane białka Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637) mogą inicjować komórkową odpowiedź odpornościową potrzebną do produkcji przeciwciał.

Oznaczenia uwalniania histaminy z ludzkimi bazofilami

Uwalnianie histaminy z bazofilowych leukocytów przeprowadzono jak następuje. Heparynizowaną krew (20 ml) pobrano z każdego pacjenta uczulonego na pyłek brzozy, przechowywano w temperaturze pokojowej i zużyto w ciągu 24 godzin. Dwadzieścia pięć mikrolitrów heparynizowanej całej krwi zastosowano do powleczonych włóknami szklanymi studzienek płytek mikrotytracyjnych (Reference Laboratory, Kopenhaga, Dania) i inkubowano z 25 mikrolitrami alergenu lub anty-IgE przez 1 godzinę w 37°C. Następnie płytki płukano i usunięto substancje interferujące. Na koniec mierzono histaminę związaną z płytkami mikrotytracyjnymi spektrofotofluorymetrycznie.

Właściwości uwalniania histaminy zmutowanych białek Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637)

Dane o uwalnianiu histaminy przedstawiono na fig. 20 i 21. Testowano zdolność zmutowanych białek Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637) do indukcji uwalniania histaminy z ludzkich bazofili z dwóch pacjentów alergicznych na pyłek brzozy. W obu przypadkach krzywe uwalniania zmutowanych alergenów indukujących uwalnianie histaminy są wyraźnie przesunięte w prawo w porównaniu z krzywą uwalniania Bet v 1.2801. Przesunięcie wskazuje, że siła Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637) jest obniżona 3 do 10 krotnie.

Mutant Bet v 1 (2744) i mutant Bet v 1 (2753)

Mutanta Bet v 1 (2744) i mutanta Bet v 1 (2753) podobnie skonstruowano do stosowania jako mieszaną szczepionkę alergenu. W tych zmutowanych alergenach mutacje punktowe były umieszczone w sposób rozmieszczony na całej powierzchni jak przedstawiono na fig. 22 i 23 i ponownie były zaprojektowane, aby wpływać na różne obszary powierzchni dwóch cząsteczek, odpowiednio, jak przedstawiono na fig. 24. Jednak te zmodyfikowane alergeny mogły być także indywidualnie stosowane jako pojedyncze szczepionki alergenów.

Analiza strukturalna zmutowanego białka Bet v 1 (2744)

Integralność strukturalną oczyszczonego mutanta Bet v 1 (2744) badano za pomocą spektroskopii dichroizmu kołowego (CD). Fig. 25 przedstawia widma CD zrekombinowanego Bet v 1.2801 (typ dziki) i mutanta Bet v 1 (2744) zapisane w stężeniach bliskich równym. Zachodzenie na siebie amplitud szczytów i pozycji w widmach CD z dwóch zrekombinowanych białek wykazują, że dwa preparaty zawierają równe ilości struktur drugorzędowych silnie sugerując, że wprowadzone podstawienia aminokwasów nie wpływają na strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla.

PL 212 139 B1

Właściwości uwalniania histaminy Bet v 1 (2744)

Właściwości uwalniania histaminy z pięciu doświadczeń z bazofilowymi leukocytami z pięciu różnych pacjentów alergicznych na pyłek brzozy przedstawiono na fig. 26 i fig. 27 A-D. Testowano zdolność zmutowanego białka Bet v 1 (2744) do indukcji uwalniania histaminy z ludzkich bazofili. Krzywe uwalniania zmutowanych alergenów histaminy są wyraźnie przesunięte w prawo w porównaniu z krzywą uwalniania Bet v 1.2801 wskazując, że siła Bet v 1 (2744) uwalniania histaminy jest obniżona 3 do 5 krotnie.

Mutant Bet v 1 (2733)

Skonstruowano i wyrażono w sposób zrekombinowany mutanta Bet v 1 (2733) z dziewięcioma pierwotnymi mutacjami. Rozmieszczenie mutacji punktowych na Bet v 1 (2733) pozostawia kilka obszarów powierzchni zawierających > 400 A² bez zmian. Fig. 28 przedstawia wprowadzone mutacje punktowe na powierzchni cząsteczki Bet v 1 (2733).

P r z y k ł a d 5

Ten przykład opisuje charakterystykę zrekombinowanego zmutowanego alergenu Bet v 1 z więcej niż czterema mutacjami i zmniejszonym powinowactwem wiązania IgE według stanu techniki PCT/DK01/00764. Mutanty według wynalazku przygotowuje się i oznacza odpowiednio.

Reaktywność wobec komórek T zrekombinowanego i zmutowanego Bet v 1 Cel

Zbadanie odpowiedzi komórek T in vitro na zmutowane alergeny pod kątem proliferacji i produkcji cytokin.

Metody

PBL (Peripheral Blood Lymphocytes - Limfocyty Krwi Obwodowej) z alergicznych pacjentów stosowano w następującym badaniu.

Ustalono osiem linii komórek T specyficznych dla Bet v 1 z PBL z naturalnie oczyszczonym Bet v 1, aby utrzymać różnorodność izoform Bet v 1, które są prezentowane komórkom T, jak opisano w uprzednio opublikowanym protokole (26).

Dziesięć linii PBL i osiem komórek T stymulowano ekstraktem brzozy (Bet v), naturalnie oczyszczonym bet v 1 (nBet v 1), rekombinantem Bet v 1 (rBet v 1 lub wt; 27) i czterema różnymi zmutowanymi formami rBet v 1 (opisane gdzie indziej): 2595, 2628, 2637, 2744, 2773. Później stwierdzono, że mutant 2637 jest częściowo rozwinięty i nie będzie on omawiany.

₅

Pokrótce: do 96-studzienkowej płytki okrągłodennej dodano PBL w ilości 2 x 10⁵/studzienkę. Różne próbki brzozy dodawano w trzech różnych stężeniach w czterech powtórzeniach i pozwalano im na rośnięcie przez 6 dni. W dniu 6 połowa objętości komórek (100 μΓ) z każdej studzienki z najwyższym stężeniem brzozy była zbierana do produkcji cytokin. Radioaktywna znakowana tymidyna była dodawana do studzienek. Następnego dnia (dzień 7) komórki zbierano na sączku. Dodawano płyn scyntylacyjny i mierzono radioaktywność w liczniki scyntylacyjnym.

Podobnie, w 96-studzienkowej płytce okrągłodennej dodano komórki T w ilości 3 x 10⁴ na stu₅ dzienkę i stymulowano napromieniowanymi autologicznymi PBL (1 x 10⁵ komórek /studzienkę) i 3 różnymi stężeniami różnych próbek brzozy. Po 1 dniu komórki z każdej studzienki z najwyższym stężeniem brzozy zebrano do produkcji cytokin. Do studzienek dodano radioaktywną znakowaną tymidynę. W dniu 2 komórki zebrano na sączku i liczono jak opisano dla PBL.

Supematanty z czterech powtórzeń łączono i mierzono cytokiny stosując zestaw CBA (cytokine bead array - ułożenie paciorków do cytokin) z firmy Becton Dickinson.

Wyniki

Dziesięć hodowli PBL wykazało specyficzną stymulację przez brzozę. Ogólnie proliferacja PBL z różnymi próbkami brzozy była podobna, choć widoczne były pewne różnice. W 3 PBL nBet v 1 stymulował proliferację lepiej niż rBet v 1 i mutanty. Zmutowane próbki brzozy stymulowały PBL nieomal identycznie jak rBet v 1 (fig. 29). Fig. 29 przedstawia Indeks Stymulacji dla wymienionych powyżej preparatów Bet v 1. Indeks stymulacji (SI) wylicza się jako proliferację (cpm: count per minute - zliczeń na minutę) stymulowanej próbki (najwyższe stężenie) podzielone przez proliferację (cpm) kontroli z podłożem. PPD oznacza oczyszczoną pochodną białek z Mycobacterium tuberculosis, która służy jako kontrola dodatnia.

Produkcja cytokin zdominowana była przez IFN-gamma i wzrastała proporcjonalnie z proliferacją PBL. Nie było oznak przesunięcia Th1/Th2 (fig. 30-32). Fig. 30 przedstawia pacjenta z profilem Th0, fig. 31 profil Th1 i fig. 32 profil Th2. Produkcja cytokin mierzona w pg/ml wskazana jako sztabki i stosunek między IL-5/IFN-gamma jest dolną linią kreskowaną (oś Y z prawej). Proliferacja mierzona

PL 212 139 B1 w cpm widziana jest na osi Y z prawej jako linia ciągła mierzona w cpm. Podłoże i MBP (białko wiążące maltozę) włączone zostały jako kontrole tła.

Osiem linii komórek T ustalono na nBet v 1 i wszystkie poza jedną proliferowały równie dobrze na wszystkich próbkach brzozy. Cztery linie komórek T wydzielały cytokiny podobne do Th0 w oparciu o stosunek IL-5 i IFN-gamma (Th2 > 5, 5 > ThO > 0,2, 0,2 > Th1). Trzy linie komórek T wydzielały cytokiny Th1 i jedna linia komórek T wydzielały cytokiny Th2. Różne próbki brzozy nie wpływały na stosunek między IL-5/IFN-gamma.

Wniosek

Wszystkie hodowle PBL i 7/8 linii komórek T, które wykazywały specyficzną stymulację przez nBet v 1 także odpowiadały na rBet v 1 i mutanty. Te dane sugerują, że dla stymulacji komórek T pojedyncza izoforma Bet v 1 lub te 4 mutanty mogą zastąpić mieszaninę indywidualnych izoform spotykanych w naturalnych preparatach alergenów. Tak więc szczepionki oparte na zrekombinowanych alergenach lub tych 4 mutantach będą adresowały istniejącą populację komórek T specyficznych dla Bet v 1.

P r z y k ł a d 6

Ten przykład opisuje charakterystykę alergenów zrekombinowanego zmutowanego Bet v 1 z więcej niż czterema mutacjami i zmniejszoną zdolnością wiązania IgE według stanu techniki PCT/DKO1/00764. Mutanty według wynalazku przygotowuje się i oznacza odpowiednio.

Indukcja przeciwciał IgG specyficznych dla Bet v 1 i przeciwciał blokujących po immunizacji zrekombinowanymi i zmutowanymi białkami Bet v 1

W tej części definiuje się określenie „przeciwciała blokujące” jako przeciwciała, inne niż ludzkie przeciwciała IgE, które są zdolne do wiązania antygenu i zapobiegania wiązania ludzkich przeciwciał IgE do tego antygenu.

Zdolność białka typu dzikiego Bet v 1 2227 (rBet v 1) i zmutowanych białek Bet v 1 2595, 2628, 2744 i 2773 do indukcji specyficznych dla Bet v 1 przeciwciał IgG i przeciwciał blokujących testowano w doświadczeniach z immunizacją myszy.

Myszy BALB/cA (8 w każdej grupie) immunizowano przez dootrzewnowe zastrzyki ze zrekombinowanym białkiem Bet v 1 2227 typu dzikiego lub czterema zmutowanymi białkami. Myszy immunizowano cztery razy z odstępem dawki 14 dni. Różne białka koniugowano do 1,25 mg/ml Alhydrogel, (żel wodorotlenku glinu, 1,3% pH 8,0-8,4, Superfos Biosector). Myszy immunizowano albo 1 μg białka/dawkę albo 10 ug białka/dawkę. Próby krwi pobierano przez skrwawianie z oczodołu w dniu 0, 14, 35, 21, 49 i 63.

Specyficzne poziomy IgG przeciwciał analizowano za pomocą bezpośredniej ELISA stosując płytki mikrotytracyjne powleczone rBet v 1 i biotynylowane przeciwciała królika anty mysi IgG (Jackson) jako przeciwciało do detekcji. Immunizacja zrekombinowanym białkiem typu dzikiego Bet vl 2227 lub czterema zmutowanymi białkami indukowała silną odpowiedź IgG specyficzną dla r Bet v 1. Ten wynik wykazuje, że cztery zmutowane białka są zdolne do indukcji przeciwciał, które silnie reagują krzyżowo z białkiem typu dzikiego Bet v 1 2227.

Aby ocenić indukcję przeciwciał blokujących, próbki surowicy z pacjentów alergicznych na pyłki brzozy inkubowano z paciorkami paramagnetycznymi powleczonymi monoklonalnym przeciwciałem myszy anty-ludzki IgE. Po inkubacji paciorki płukano i ponownie zawieszono w buforze lub rozcieńczonych próbkach (1:100) surowicy myszy z nie immunizowanych myszy (kontrola) lub myszy immunizowanych jak opisano powyżej. Biotynylowany r Bet v 1 dodano następnie do tej mieszaniny paciorków i przeciwciał z surowicy myszy. Po inkubacji paciorki płukano i wykrywano związany biotynylowany rBet v 1 stosując streptawidynę znakowaną akry dyną. Inkubacja paciorków z surowicą z nie immunizowanych myszy nie zmieniała wiązania r Bet v 1 do paciorków. Przeciwnie, inkubacja paciorków z surowicą z myszy immunizowanych zrekombinowanymi białkami Bet v 1 2227 typu dzikiego lub czterema białkami zmutowanymi znacząco zmniejszała wiązane r Bet v 1 do paciorków wykazując obecność przeciwciał specyficznie blokujących Bet v 1 w próbkach surowicy. Tak więc, w dniu 63 jedna lub więcej próbek surowicy ze wszystkich grup immunizowanych wysoką dawką (10 μg/dawkę) była zdolna do zmniejszenia wiązania r Bet v 1 do paciorków o ponad 80%. Te wyniki wykazują, że cztery zmutowane białka są zdolne do indukcji przeciwciał, które mogą działać jako przeciwciała specyficznie blokujące Bet v 1.

PL 212 139 B1

P r z y k ł a d 7

Ten przykład opisuje charakterystykę strukturalną i zdolności wiązania IgE mutanta według wynalazku mającego 12 mutacji punktowych. Mutacje wprowadzone do mutanta 3007 opisano w przykładzie 2.

Analiza strukturalna zmutowanego białka Bet v 1 (3007)

Integralność strukturalną oczyszczonego mutanta Bet v 1 (3007) badano za pomocą spektroskopii dichroizmu kołowego jak opisano w przykładzie 1. Fig. 33 przedstawia widma CD zrekombinowanego Bet v 1.2801 (typ dziki) i mutanta Bet v 1 (3007) zapisane w stężeniach prawie równych jak opisano uprzednio w przykładzie 1. Zachodzenie na siebie amplitud szczytów i pozycji w widmach CD z dwóch zrekombinowanych białek wykazuje, że dwa preparaty zawierają równe ilości struktur drugorzędowych silnie sugerując, że wprowadzone podstawienia aminokwasów nie wpływają na strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla.

Analiza wiązania IgE zmutowanego białka Bet v 1 (3007)

Figura 34 przedstawia hamowanie wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1.2801 do IgE surowicy z puli alergicznych pacjentów przez niebiotynylowany Bet v 1.2801 (typ dziki) i przez mutanta Bet v 1 (3007) według metod opisanych w przykładzie 4. Istnieje wyraźna różnica w ilości odpowiednich zrekombinowanych białek potrzebnych do uzyskania 50% inhibicji wiązania surowicy IgE obecnej w puli surowicy. Zrekombinowany Bet v 1.2801 osiąga 50% inhibicji przy około 5 ng podczas, gdy odpowiednie stężenie dla mutanta Bet v 1 (3007) wynosi około 200 ng. Poziom hamowania osiągany przez zmutowane białko Bet v 1 (3007) jest wyraźnie niższy w porównaniu ze zrekombinowanym Bet v 1.2801. To wskazuje, że 12 mutacji punktowych wprowadzonych w mutancie Bet v 1 (3007) obniża powinowactwo względem specyficznej surowicy IgE.

Literatura

1. WO 97/30150 (Pangenetics B. V., Molecules for the induction of immunological tolerance).

2. WO 92/02621 (Biomay Biotechnik Produktions- und Handelsgesellschaft mbH, Allergens of Alder pollen and applications thereof).

3. WO 90/11293 (Immunologie Pharmaceutical Corporation, The University of North Carolina at Chapel Hill, Allergenic proteins from ragweed and uses thereof).

4. Takai T., Yokota T., Yasue M., Nishiyama C., Yuuki T., Mori A., Okudaira H., Okumura Y.: „Engineering of the major house dust mite allergen Der f 2 for allergen-specific immunotherapy”. Nat

Biotechnol 15, 754-758 (1997).

5. Smith A. M., Chapman M. D.: „Localization of antigenic sites on Der p 2 using oligonucleotide-directed mutagenesis targeted to predicted surface residues”. Clin. Exp. Allergy 27, 593-599 (1997).

6. Aki T., Ono K., Hidaka Y., Shimonishi Y., Jyo T., Wada T., Yamashita M., Shigeta S.,

Murooka Y., Oka S.: „Structure of IgE epitopes on a new 39-kD allergen molecule from the house dust mite, Dermatophagoides farinae''. Int Arch Allergy Immunol 103, 357-364 (1994).

7. Forster E., Dudler T., Gmachl M., Aberer W., Urbanek R., Suter M.: „Natural and recombinant enzymatically active or inactive bee venom phospholipase A2 has the same potency to release histamine from basophils in patients with Hymenoptera allergy”. J. Allergy Clin. Immunol. 95, 1229-1235 (1995).

8. Burks A. W., Shin D., Cockrell G., Stanley J. S., Heim RM, Bannon GA: „Mapping and mutational analysis of the IgE-binding epitopes on Ara h 1, a legume vicilin protein and a major allergen in peanut hypersensitivity”. Eur. J. Biohem. 245,334-339(1997).

9. Stanley J. S., King N., Burks A. W., Huang S. K., Sampson H., Cockrell G., Heim R. M., West

C. M., Bannon G. A.: „Identification and mutational analysis of the immunodominant IgE binding epitopes of the major peanut allergen Ara h 2”. Arch. Biochem. Biophys. 342, 244-253 (1997).

10. Ferreira F., Rohlfs A., Hoffmann-Sommergruber K., Schenk S., Ebner C., Mza P., Jilek A.,

Kraft D., Breitenbach M., Scheiner O.: „Modulation of IgE- binding properties of tree pollen allergens by site-directed mutagenesis”. Adv. Exp. Med. Biol. 409, 127-135 (1996).

11. Ferreira F., Ebner C., Kramer B., Casari G., Briza P., Kungl A. J., Grimm R., Jah-Schmid B.,

Breiteneder H., Kraft D., Breitenbach M., Rheinberger H.-J., Scheiner D., „Modulation of IgE reactivity of allergens by site-directed mutagenesis: Potential use of hypeallergenic variants for immunotherapy”, FASEB Journal for Experimental Biology Vol. 12, No. 2, February 1998, 231-242 (1998).

PL 212 139 B1

12. Wiedemann P., Giehl K., Almo S. C., Fedorov A. A., Girvin M., Steinberger P., Rudiger M.,

Ortner M., Sippl M., Dolecek C., Kraft D., Jockusch B., Valenta R.: „Molecular and structural analysis of a continuous birch profilin epitope defined by a monoclonal antibody”, J. Biol. Chem. 271, 29915-29921 (1996).

13. Alvarez A. M., Fukuhara E., Nakase M., Adachi T., Aoki N., Nakamura R., Matsuda T.: „Four rice seed cDNA clones belonging to the alpha-amylase/trypsin inhibitor gene family encode potential rice allergens”. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 1304-1308 (1995).

14. Colombo P., Kennedy D., Ramsdale T., Costa M. A., Djro G., Izzo V., Salvadori S., Guerrini R., Cocchiara R., Mirisola M. G., Wood S., Geraci D., Journal of Immunology Vol. 160, No. 6, 15 March 1998, 2780-2875.

15. Spangfort M. D., Ipsen H., Sparholt S. H., Aasmul-Olsen S., Larsen M. R., Mortz E.,

Roepstorff P., Larsen J. N.: „Characterization of Purified Recombinant Bet v 1 with Authentic Nterminus, Cloned in Fusion with Maltose-Binding Protein”. Prot. Exp. Purification 8, 365-373 (1996a).

16. Ipsen H., Wihl J.-A., Petersen B. N., Lowenstein H.: „Specificity mapping of patients IgE response towards the tree pollen major allergens Aln g I, Bet v I and Cor a I.” Clin. Exp. Allergy 22, 391-9, (1992)

17. Gajhede M., Osmark P., Poulsen F. M., Ipsen H., Larsen J. N., Joost van Neerven R. J., Schou C., Lownstein H. and Spangfort M. D.: „X-ray and NMR structure of Bet v 1, the origin of birch pollen allergy”. Nature Structural Biology 3, 1040-1045 (1996).

18. Altschul S. F., Gish W., Miller W., Myers E. W. and Lipman D. J.: „Basic local alignment search tool”. J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990).

19. Higgins D., Thompson J., Gibson T., Thompson J. D., Higgins D. G. and Gibson T. J.: „CLUSTAL w: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice”. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680 (1994).

20. Saiki R. K., Gelfand D. H., Stoffel S., Scharf S. J., Higuchi R., Horn G. T., Mullis K. B., Erlich H. A.: „Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase”. Science 239, 487-491 (1988).

21. Spangfort M. D., Larsen J. N., Gajhede M.: „Crystallization and Preliminary X-ray Investigation at 2.0 A Resolution of Bet v 1, a Birch Pollen Protein Causing IgE-Mediated Allergy”. PROTEINS, Struc. Func. Genet. 26, 358-360 (1996b).

22. Monsalve R. I., Lu G. and King T. P.: „Recombinant venom allergen, antigen 5 of yellow jacket (Vespula vulgaris) and paper wasp (Polistes annularis) by expression in bacteria or yeast” (1999) Submitted.

23. Fang K. S. F., Vitale M., Fehlner P. and King T. P.: „cDNA cloning and primary structure of a white-face homet venom allergen, antigen 5”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 895 (1988).

24. Lu G., Villalba M., Coscia M. R., Hoffman D. R. and King T. P.: „Sequence Analysis and Antigenic Cross-reactivity of a Venom Allergen, Antigen 5, from Homets, Wasps, and Yellow Jackets”. Journal of Immunology 150, 2823-2830 (1993).

25. Punnonen J.: „Molecular Breeding of Allergy Vaccines and Antiallergic Cytokines”. Int. Arch. Allergy Immunol. 2000; 121:173-182.

26. P. A. Wurtzen, M. Wissenbach, H. Ipsen, A. Bufe, J. Amved, and R. J. J. vanNeerven. J. Allergy Clin. Immunol., 1999; 104: 115-23.

27. Sparholt S. H., Larsen J. N., Ipsen H., Schou C., van Neerven R. J., Clin. Exp. Allergy 1997

Claims (65)

1. Zrekombinowany alergen Bet v 1, znamienny tym, że jest mutantem naturalnie występującego alergenu Bet v 1, przy czym ten zrekombinowany alergen wykazuje zdolność do wywoływania nowej odpowiedzi przeciwciała IgG po podaniu jako szczepionkę alergenową, gdzie:

a. mutant zachowuje zasadniczo tę samą strukturę szkieletu α-węgla, jak naturalnie występujący alergen,

b. mutant zawiera co najmniej cztery mutacje pierwotne, a każda mutacja pierwotna położona jest w obrębie pojedynczej grupy eksponowanych na powierzchni aminokwasów, które są częścią co

PL 212 139 B1 najmniej jednego epitopu lub zawierają cały epitop i każda mutacja pierwotna jest w stanie zmniejszyć swoistą zdolność wiązania IgE zmutowanego alergenu w porównaniu ze zdolnością wiązania IgE tego naturalnie występującego alergenu Bet v 1, przy czym swoista zdolność wiązania IgE mutanta zmniejszona jest co najmniej o 10% w porównaniu ze zdolnością tego naturalnie występującego alergenu

Bet v 1,

c. każda mutacja pierwotna jest podstawieniem jednej lub więcej reszt eksponowanych na powierzchni aminokwasów inną resztą,

d. mutacje umieszczone są w taki sposób, że co najmniej jeden ciągły obszar powierzchni o obszarze 400-800 A² albo nie zawiera żadnych mutacji, albo zawiera mutację umiarkowaną, dając w rezultacie umiarkowanie zmieniony epitop nie wykazujący znaczącego zmniejszenia swojej swoistej zdolności wiązania IgE w porównaniu z odpowiadającym mu epitopem niezmutowanym,

e. mutacje pierwotne wybrane są z co najmniej 4 z następujących 10 grup, przy czym każda grupa obejmuje eksponowane na powierzchni pozycje aminokwasów w obrębie oddzielnych obszarów powierzchni cząsteczki odpowiednich dla podstawień aminokwasów:

grupa 1: A130, E131, K134, A135, K137, E138, E141, T142, R145; grupa 2: V2, F3, N4, Y5, E6, T7, K119;

grupa 3: D27, S39, S40, Y41, E42, N43, 144, E45, G46, N47, P50, G51, K55, D72, E73;

grupa 4: E8, T10, V12, P14, V105, A106, T107, P108, D109, G110, I113, K115;

grupa 5: A16, K20, S149, Y150, L152, A153, H154, S155, D156, Y158, N159, +160, gdzie +160 przedstawia dodatek aminokwasu N-końcowego;

grupa 6: L24, D25, N28, K32;

grupa 7: H76, T77, N78, F79, K80, E101, K103;

grupa 8: K68, R70,186, E87, E96, K97;

grupa 9: G1, G92, D93, T94, K123, G124, D125, H126, E127, K129; grupa 10: P35, Q36, E60, G61, P63, F64, K65, Y66;

z zastrzeżeniem, że zrekombinowany alergen Bet v 1 nie jest jednym z następujących mutantów specyficznych:

(Asn28Thr, Lys32Gln, Asn78Lys, Lys103Val, Arg145Glu, Asp156His, +160Asn);

(Tyr5Val, Glu42Ser, Glu45Ser, Asn78Lys, Lys103Val, Lys123IIe, Lys134Glu, Asp156His);

(Tyr5Val, Glu45Ser, Lys65Asn, Lys97Ser, Lys134Glu);

(Ala16Pro, Asn28Thr, Lys32Gln, Lys103Thr, Pro108Gly, Leu152Lys, Ala153Gly, Ser155Pro);

(N28T, K32Q, N78K, K103V, P108G, R145E, D156H, +160N);

(Tyr5Val, Lys134Glu, Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Lys65Asn, Asn78Lys, Lys103Val, Lys97Ser, Pro108Gly, Arg145Glu, Asp156His, +160Asn);

(Tyr5Val, Lys134Glu, Glu42Ser, Glu45Ser, Asn78Lys, Lys103Val, Lys123IIe, Asp156His, +160Asn);

(Asn28Thr, Lys32Gln, Lys65Asn, Glu96Leu, Lys97Ser, Pro108Gly, Asp109Asn, Asp125Tyr, Glu127Ser, Arg145Glu);

(Y5V, N28T, K32Q, E42S, E45S, N78K, K103V, P108G, K123I, K134E, D156H, +160N);

(Y5V, E42S, E45S, K65N, N78K, K97S, K103V, K123I, K134E, D156H, +160N); i (Y5V, N28T, K32Q, E42S, E45S, K65N, N78K, K97S, K103V, P108G, K123I, K134E, D156H, +160N).

2. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 1, znamienny tym, że mutacje pierwotne wybrane są z co najmniej 4 z następujących 10 grup, przy czym każda grupa obejmuje eksponowane na powierzchni pozycje aminokwasów odpowiednie dla podstawień aminokwasów:

grupa 1: A130, K134, A135, K137, E138, E141, T142, R145; grupa 2: V2, F3, N4, Y5, E6, T7, K119;

grupa 3: D27, Y41, E42, N43,144, E45, G46, N47, P50, G51, K55, D72, E73; grupa 4 : E8, T10, P108, D109, I113, K115; grupa 5: H154, S155, D156, N159, +160; grupa 6: D25, N28, K32;

grupa 7: H76, T77, N78, K80, E101, K103; grupa 8: K68, R70, I86, E87, E96, K97; grupa 9: G1, G92, T94, K123, G124, D125, H126; grupa 10: K65, Y66.

PL 212 139 B1

3. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że mutacje pierwotne wybrane są z co najmniej 4 z następujących 10 grup, przy czym każda grupa obejmuje eksponowane na powierzchni pozycje aminokwasów odpowiednie dla podstawień aminokwasów:

grupa 1: A130, K134, A135, K137, E138, E141, T142; grupa 2: V2, F3, N4, Y5, E6, T7, K119;

grupa 3: D27, Y41, N43,144, E45, G46, N47, P50, G51, K55, D72, E73;

grupa 4: E8, P108, I113, K115;

grupa 5: H154, S155, N159, +160;

grupa 6: D25, N28;

grupa 7: H76, N78, K80, E101, K103;

grupa 8: K68, R70,186, E87, E96, K97;

grupa 9 :G1, G92, T94, G124, D125, H126;

grupa 10: Y66.

4. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według jednego z zastrz. 1-3, znamienny tym, że mutacje pierwotne wybrane są z co najmniej 4 z następujących 10 grup, przy czym każda grupa obejmuje eksponowane na powierzchni pozycje aminokwasów odpowiednie dla podstawień aminokwasów:

grupa 1: A130, A135, K137, E138, E141, T142; grupa 2: F3, N4, E6, T7, K119;

grupa 3: D27, Y41, N43,144, G46, P50, G51, D72, E73;

grupa 4 : E8, I113, K115;

grupa 5: H154, S155, N159;

grupa 7: H76, N78, K80, E101;

grupa 8: K68, R70, I86, E87;

grupa 9: G1, G92, D93, G124, H126;

grupa 10: Y66.

5. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 1, znamienny tym, że mutacje pierwotne wybrane są z co najmniej 4 z następujących 10 grup, przy czym każda grupa obejmuje eksponowane na powierzchni pozycje aminokwasów odpowiednie dla następujących specyficznych podstawień aminokwasów:

grupa 1: A130: A130V, A130G, A130I, A130L, A130S, A130H, A130T; E131: E131D, E131H, E131K, E131R, E131S; K134: K134R, K134H, K134S, K134Q, K134I, K134E; A135: A135V, A135G, A135I, A135L, A135S, A135H, A135T; K137: K137R, K137H, K137S, K137Q, K137I, K137E; E138: E138D, E138H, E138K, E138R, E138S, E138N; E141: E141D, E141H, E141K, E141R, E141S; T142: T142A, T142S, T142L, T142V, T142D, T142K, T142N; R145: R145K, R145H, R145T, R145D, R145E; grupa 2: V2: V2A, V2I, V2K, V2L, V2R, V2T; F3: F3H, F3W, F3S, F3D; N4: N4H, N4K, N4M,

N4Q, N4R; Y5: Y5D, Y5G, Y5H, Y5I, Y5K, Y5V; E6: E6D, E6H, E6K, E6R, E6S; T7: T7P, T7S, T7L, T7V, T7D, T7K, T7N; K119: K119R, K119H, K119S, K119Q, K1191, K119E, K119N;

grupa 3: D27: D27E, D27H, D27K, D27R, D27S; S39: S39T, S39L, S39V, S39D, S39K; S40: S40T, S40L, S40V, S40D, S40K; Y41: Y41D, Y41G, Y41H, Y41I, Y41K, Y41V; E42: E42S, E42D, E42H, E42K, E42R; N43: N43H, N43K, N43M, N43Q, N43R; 144: 144L, 144K, 144R, 144D; E45: E45S, E45D, E45H, E45K, E45R; G46: G46N, G46H, G46K, G46M, G46Q, G46R; N47: N47H, N47K, N47M, N47Q, N47R; P50: P50G; G51: G51N, G51H, G51K, G51M, G51Q, G51R; K55: K55R, K55H, K55S, K55Q, K55I, K55E, K55N; D72: D72E, D72S, D72H, D72R, D72K; E73: E73D, E73S, E73H, E73R, E73K;

grupa 4: E8: E8D, E8H, E8K, E8R, E8S; T10: T10P, T10S, T10L, T10V, T10D, T10K, T10N; V12: V12A, V12I, V12K, V12L, V12R, V12T; P14: P14G; V105: V105A, V105I, V105K, V105L, V105R, V105T; A106: A106V, A106G, A106I, A106L, A106S, A106H, A106T; T107: T107A, T107S, T107L, T107V, T107D, T107K, T107N; P108: P108G; D109: D109N D109E, D109S, D109H, D109R, D109K; G110: G110N, G110H, G110K, G110M, G110Q, G110R; 1113: I113L, I113K, I113R, I113D, K115: K115R, K115H, K115S, K115Q, K1151, K115E, K115N;

grupa 5: A16: A16V, A16G, A16I, A16L, A16S, A16H, A16T; K20: K20R, K20H, K20S, K20Q, K20I, K20E, K20N; S149: S149T, S149L, S149V, S149D, S149K; Y150: Y150T, Y150L, Y150V, Y150D, Y150K; L152: L152A, L152V, L152G, L152I, L152S, L152H, L152T; A153: A153V, A153G, A153I, A153L, A153S, A153H, A153T; H154: H154W, H154F, H154S, H154D; S155: S155T, S155L, S155V, S155D, S155K; D156: D156H, D156E, D156S, D156R, D156K; Y158: Y158D, Y158G, Y158H, Y158I, Y158K, Y158V; N159: N159H, N159K, N159M, N159Q, N159R, N159G, +160N;

PL 212 139 B1 grupa 6: L24: L24A, L24V, L24G, L24I, L24S, L24H, L24T; D25: D25E, D25H, D25K, D25R, D25S; N28: N28H, N28K, N28M, N28Q, N28R, N28T; K32: K32Q, K32R, K32N, K32H, K32S, K32I, K32E;

grupa 7: H76: H76W, H76F, H76S, H76D; T77: T77A, T77S, T77L, T77V, T77D, T77K, T77N; N78: N78H, N78K, N78M, N78Q, N78R; F79: F79H, F79W, F79S, F79D; K80: K80R, K80H, K80S, K80Q, K80I, K80E, K80N; E101: E101D, E101H, E101K, E101R, E101S; K103: K103R, K103H, K103S, K103Q, K103I, K103E, K103V;

grupa 8: K68: K68R, K68H, K68S, K68Q, K68I, K68E, K68N; R70: R70K, R70H, R70T, R70D, R70E, R70N; 186: 186L, 186K, 186R, 186D; E87: E87D, E87H, E87K, E87R, E87S, E87A; E96: E96D, E96H, E96K, E96R, E96S, E96L; K97: K97R, K97H, K97S, K97Q, K97I, K97E;

grupa 9: G1: G1N, G1H, G1K, G1M, G1Q, G1R; G92: G92N, G92H, G92K, G92M, G92Q, G92R; D93: D93N, D93E, D93S, D93H, D93R, D93K; T94: T94A, T94S, T94L, T94V, T94D, T94K, T94N; K123: K123R, K123H, K123S, K123Q, K123I, K123E; G124: G124N, G124H, G124K, G124M, G124Q, G124R; D125: D125E, D125H, D125K, D125R, D125S, D125Y; H126: H126W, H126F, H126S, H126D; E127: E127D, E127H, E127K, E127R, E127S; K129: K129R, K129H, K129S, K129Q, K129I, K129E, K129N;

grupa 10: P35: P35G; Q36: Q36K, Q36R, Q36N, Q36H, Q36S, Q36I, Q36E; E60: E60H, E60K, E60M, E60Q, E60R; G61: G61N, G61H, G61K, G61M, G61Q, G61R; P63: P63G; F64: F64H, F64W, F64S, F64D; K65: K65R, K65H, K65S, K65Q, K65I, K65E, K65N; Y66: Y66D, Y66G, Y66H, Y66I, Y66K, Y66V.

6. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że mutacje pierwotne wybrane są z co najmniej 4 z następujących 10 grup, przy czym każda grupa obejmuje eksponowane na powierzchni pozycje aminokwasów odpowiednie dla następujących specyficznych podstawień aminokwasów:

grupa 1: A130: A130V, A130G, A130I, A130L, A130S, A130H, A130T; K134: K134R, K134H, K134S, K134Q, K134I, K134E; A135: A135V, A135G, A135I, A135L, A135S, A135H, A135T; K137: K137R, K137H, K137S, K137Q, K137I, K137E; E138: E138D, E138H, E138K, E138R, E138S, E138N; E141: E141D, E141H, E141K, E141R, E141S; T142: T142A, T142S, T142L, T142V, T142D, T142K, T142N; R145: R145K, R145H, R145T, R145D, R145E;

grupa 2: V2: V2A, V2I, V2K, V2L, V2R, V2T; F3: F3H, F3W, F3S, F3D; N4: N4H, N4K, N4M, N4Q, N4R; Y5: Y5D, Y5G, Y5H, Y5I, Y5K, Y5V; E6: E6D, E6H, E6K, E6R, E6S; T7: T7P, T7S, T7L, T7V, T7D, T7K, T7N; K119: K119R, K119H, K119S, K119Q, K1191, K119E, K119N;

grupa 3: D27: D27E, D27H, D27K, D27R, D27S; Y41: Y41D, Y41G, Y41H, Y41I, Y41K, Y41V; E42: E42S, E42D, E42H, E42K, E42R; N43: N43H, N43K, N43M, N43Q, N43R; 144: 144L, 144K, 144R, 144D; E45: E45S, E45D, E45H, E45K, E45R; G46: G46N, G46H, G46K, G46M, G46Q, G46R; N47: N47H, N47K, N47M, N47Q, N47R; P50: P50G; G51: G51N, G51H, G51K, G51M, G51Q, G51R; K55: K55R, K55H, K55S, K55Q, K55I, K55E, K55N; D72: D72E, D72S, D72H, D72R, D72K; E73: E73D, E73S, E73H, E73R, E73K;

grupa 4: E8: E8D, E8H, E8K, E8R, E8S; T10: T10P, T10S, T10L, T10V, T10D, T10K, T10N; P108: P108G; D109: D109N D109E, D109S, D109H, D109R, D109K; 1113: I113L, I113K, I113R, I113D, K115: K115R, K115H, K115S, K115Q, K1151, K115E, K115N;

grupa 5: H154: H154W, H154F, H154S, H154D; S155: S155T, S155L, S155V, S155D, S155K; D156: D156H, D156E, D156S, D156R, D156K; N159: N159H, N159K, N159M, N159Q, N159R, N159G, +160N;

grupa 6: D25: D25E, D25H, D25K, D25R, D25S; N28: N28H, N28K, N28M, N28Q, N28R, N28T; K32: K32Q, K32R, K32N, K32H, K32S, K32I, K32E;

grupa 7: H76: H76W, H76F, H76S, H76D; T77: T77A, T77S, T77L, T77V, T77D, T77K, T77N; N78: N78H, N78K, N78M, N78Q, N78R; K80: K80R, K80H, K80S, K80Q, K80I, K80E, K80N; E101: E101D, E101H, E101K, E101R, E101S; K103: K103R, K103H, K103S, K103Q, K103I, K103E, K103V; grupa 8: K68: K68R, K68H, K68S, K68Q, K68I, K68E, K68N; R70: R70K, R70H, R70T, R70D,

R70E, R70N; 186: I86L, I86K, I86R, I86D; E87: E87D, E87H, E87K, E87R, E87S, E87A; E96: E96D, E96H, E96K, E96R, E96S, E96L; K97: K97R, K97H, K97S, K97Q, K97I, K97E;

grupa 9: G1: G1N, G1H, G1K, G1M, G1Q, G1R; G92: G92N, G92H, G92K, G92M, G92Q, G92R; T94: T94A, T94S, T94L, T94V, T94D, T94K, T94N; K123: K123R, K123H, K123S, K123Q, K123I, K123E; G124: G124N, G124H, G124K, G124M, G124Q, G124R; D125: D125E, D125H, D125K, D125R, D125S, D125Y; H126: H126W, H126F, H126S, H126D;

PL 212 139 B1 grupa 10: K65: K65R, K65H, K65S, K65Q, K65I, K65E, K65N; Y66: Y66D, Y66G, Y66H, Y66I, Y66K, Y66V.

7. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według jednego z zastrz. 1-3, znamienny tym, że mutacje pierwotne wybrane są z co najmniej 4 z następujących 10 grup, przy czym każda grupa obejmuje eksponowane na powierzchni pozycje aminokwasów odpowiednie dla następujących specyficznych podstawień aminokwasów:

grupa 1: A130: A130V, A130G, A130I, A130L, A130S, A130H, A130T; K134: K134R, K134H, K134S, K134Q, K134I, K134E; A135: A135V, A135G, A135I, A135L, A135S, A135H, A135T; K137: K137R, K137H, K137S, K137Q, K137I, K137E; E138: E138D, E138H, E138K, E138R, E138S, E138N; E141: E141D, E141H, E141K, E141R, E141S; T142: T142A, T142S, T142L, T142V, T142D, T142K, T142N;

grupa 2: V2: V2A, V2I, V2K, V2L, V2R, V2T; F3: F3H, F3W, F3S, F3D; N4: N4H, N4K, N4M, N4Q, N4R; Y5: Y5D, Y5G, Y5H, Y5I, Y5K, Y5V; E6: E6D, E6H, E6K, E6R, E6S; T7: T7P, T7S, T7L,

T7V, T7D, T7K, T7N; K119: K119R, K119H, K119S, K119Q, K1191, K119E, K119N;

grupa 3: D27: D27E, D27H, D27K, D27R, D27S; Y41: Y41D, Y41G, Y41H, Y41I, Y41K, Y41V;

N43: N43H, N43K, N43M, N43Q, N43R; 144: 144L, 144K, 144R, 144D; E45: E45S, E45D, E45H, E45K, E45R; G46: G46N, G46H, G46K, G46M, G46Q, G46R; N47: N47H, N47K, N47M, N47Q, N47R; P50: P50G; G51: G51N, G51H, G51K, G51M, G51Q, G51R; K55: K55R, K55H, K55S, K55Q, K55I, K55E, K55N; D72: D72E, D72S, D72H, D72R, D72K; E73: E73D, E73S, E73H, E73R, E73K;

grupa 4: E8: E8D, E8H, E8K, E8R, E8S; P108: P108G; 1113: I113L, I113K, I113R, I113D, K115: K115R, K115H, K115S, K115Q, K1151, K115E, K115N;

grupa 5: H154: H154W, H154F, H154S, H154D; S155: S155T, S155L, S155V, S155D, S155K; N159: N159H, N159K, N159M, N159Q, N159R, N159G, +160N;

grupa 6: D25: D25E, D25H, D25K, D25R, D25S; N28: N28H, N28K, N28M, N28Q, N28R, N28T; grupa 7: H76: H76W, H76F, H76S, H76D; N78: N78H, N78K, N78M, N78Q, N78R; K80: K80R,

K80H, K80S, K80Q, K80I, K80E, K80N; E101: E101D, E101H, E101K, E101R, E101S; K103: K103R, K103H, K103S, K103Q, K103I, K103E, K103V;

grupa 8: K68: K68R, K68H, K68S, K68Q, K68I, K68E, K68N; R70: R70K, R70H, R70T, R70D, R70E, R70N; 186: 186L, 186K, 186R, 186D; E87: E87D, E87H, E87K, E87R, E87S, E87A; E96:

E96D, E96H, E96K, E96R, E96S, E96L; K97: K97R, K97H, K97S, K97Q, K97I, K97E;

grupa 9: G1: G1N, G1H, G1K, G1M, G1Q, G1R; G92: G92N, G92H, G92K, G92M, G92Q,

G92R; T94: T94A, T94S, T94L, T94V, T94D, T94K, T94N; G124: G124N, G124H, G124K, G124M, G124Q, G124R; D125: D125E, D125H, D125K, D125R, D125S, D125Y; H126: H126W, H126F, H126S, H126D;

grupa 10: Y66: Y66D, Y66G, Y66H, Y66I, Y66K, Y66V.

8. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według jednego z zastrz. 1-4, znamienny tym, że mutacje pierwotne wybrane są z co najmniej 4 z następujących 10 grup, przy czym każda grupa obejmuje eksponowane na powierzchni pozycje aminokwasów odpowiednie dla następujących specyficznych podstawień aminokwasów:

grupa 1: A130: A130V, A130G, A130I, A130L, A130S, A130H, A130T; A135: A135V, A135G, A135I, A135L, A135S, A135H, A135T; K137: K137R, K137H, K137S, K137Q, K137I, K137E; E138: E138D, E138H, E138K, E138R, E138S, E138N; E141: E141D, E141H, E141K, E141R, E141S; T142: T142A, T142S, T142L, T142V, T142D, T142K, T142N;

grupa 2: F3: F3H, F3W, F3S, F3D; N4: N4H, N4K, N4M, N4Q, N4R; E6: E6D, E6H, E6K, E6R, E6S; T7: T7P, T7S, T7L, T7V, T7D, T7K, T7N; K119: K119R, K119H, K119S, K119Q, K1191, K119E, K119N;

grupa 3: D27: D27E, D27H, D27K, D27R, D27S; Y41: Y41D, Y41G, Y41H, Y41I, Y41K, Y41V; N43: N43H, N43K, N43M, N43Q, N43R; 144: 144L, 144K, 144R, 144D; G46: G46N, G46H, G46K, G46M, G46Q, G46R; N47: N47H, N47K, N47M, N47Q, N47R; P50: P50G; G51: G51N, G51H, G51K, G51M, G51Q, G51R; D72: D72E, D72S, D72H, D72R, D72K; E73: E73D, E73S, E73H, E73R, E73K;

grupa 4: E8: E8D, E8H, E8K, E8R, E8S; 1113: I113L, I113K, I113R, I113D, K115: K115R, K115H, K115S, K115Q, K115I, K115E, K115N;

grupa 5: H154: H154W, H154F, H154S, H154D; S155: S155T, S155L, S155V, S155D, S155K; N159: N159H, N159K, N159M, N159Q, N159R, N159G, +160N;

grupa 7: H76: H76W, H76F, H76S, H76D; N78: N78H, N78K, N78M, N78Q, N78R; K80: K80R, K80H, K80S, K80Q, K80I, K80E, K80N; E101: E101D, E101H, E101K, E101R, E101S;

PL 212 139 B1 grupa 8: K68: K68R, K68H, K68S, K68Q, K68I, K68E, K68N; R70: R70K, R70H, R70T, R70D, R70E, R70N; 186: 186L, 186K, 186R, 186D; E87: E87D, E87H, E87K, E87R, E87S, E87A;

grupa 9: G1: G1N, G1H, G1K, G1M, G1Q, G1R; G92: G92N, G92H, G92K, G92M, G92Q, G92R; D93: D93N, D93E, D93S, D93H, D93R, D93K; G124: G124N, G124H, G124K, G124M,

G124Q, G124R; H126: H126W, H126F, H126S, H126D;

grupa 10: Y66: Y66D, Y66G, Y66H, Y66I, Y66K, Y66V.

9. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera następujące mutacje: Y5V, E45S, N78K, K97S, K103V, K134E, + 160N.

10. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 9, znamienny tym, że ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku: E8/K115, D125/H126, E138/K137/E141, D25/N28, E87/K55, S155/H154/N159, N47/P50/H76/N43/144/R70, E87/K55, E73/P50/D72, A130, N28/D25, P108, V2/K119/N4/E6/E96.

11. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 9 albo 10, znamienny tym, że ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku: T10P, K65N, N28/D25/K32Q/E141/K137/E138,

D125/K123I/H126, P108/D109N, E42S/K55/144/N43, E73/D72, E87, E96/K119, A130, V2/E6, E8/K115, N47/P50/R70/H76/T77A, S155/D156H/N159, E6/V2.

12. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera następujące mutacje: Y5V, N28T, K32Q, E45S, N78K, K97S, K103V, K134E, +160N.

13. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 12, znamienny tym, że ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku: E8/K115, D125/H126, E138/K137/E141, E87/K55, S155/H154/N159, N47/P50/H76/N43/144/R70, K55, E73/P50/D72, A130, D25, P108, V2/K119/N4/E6/E96.

14. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia wymienione są na początku: T10P, K65N, E141/K137/E138, D125/K123I/H126, P108/D109N, E42S/K55/144/N43, E73/D72, E87, V2/E6, N47/P50/R70/H76/T77A, E96/K119, A130, E8/K115, S155/D156H/H154/N159, E6/V2.

15. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera następujące mutacje: Y5V, N28T, K32Q, E45S, N78K, E87S, K97S, K103V, K134E, N159G, +160N.

16. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 15, znamienny tym, że ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku: K55, A138/K137/E141, D125/H126, P108, V2/N4/K119/E6, S155/H154, N47/P50/H76, E73, R70, A130, E8/K115, E96.

17. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 15 albo 16, znamienny tym, że ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia wymienione są na początku: K65N, T10P, D125, K123I, P108, D109N, N47/P50/H76, E138/K137/E141, E42S/K55/144/N43, S155/D156H, E73/D72, E6/Y2, E96.

18. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera następujące mutacje: Y5V, N28T, K32Q, E45S, N78K, K97S, K103V, P108G, D125Y, K134E, +160N.

19. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 18, znamienny tym, że ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku: E87, E141, K55, N47/N43/144/H76, S155/HIS154, A130, E8, E73, V2/K119.

20. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 18 albo 19, znamienny tym, że ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku: K65N, T10P/E8, E87, S155/D156H, E141, E42S, A130,

E8/T10P, N47, H76T, V2.

21. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera następujące mutacje: Y5V, N28T, K32Q, E45S, E73S, E96S, P108G, D125Y, N159G, +160N.

22. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 21, znamienny tym, że ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku: K134, N78, E87, K119, E8, K55X, E141, N47, S155, E6, K103, A130, V2.

23. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 21 albo 22, znamienny tym, że ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do

PL 212 139 B1 wykonania wymienione są na początku: K65N/K55, T10P/E8/E141, E138/K134, E87, E42S/K55/144,

S155/D156H, N78, K119N2/N4, N47/P50, H76/T77A, A130, E6/K115/K103.

24. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera następujące mutacje: Y5V, N28T, K32Q, E45S, E96S, P108G, +160N.

25. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 24, znamienny tym, że ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku: K134, N78, E87, K119, E8, K55X, E141, S155, N47, E6, K103, A130, V2, R70, D125.

26. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 24 albo 25, znamienny tym, że ponadto zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień, gdzie najbardziej korzystne podstawienia do wykonania wymienione są na początku: N78/T77A, K103X, K134/E138, K65N/K55, T10P,

D125/H126, E42S/K55, S155/D156H/HIS154, K119N2, E87, N47/P50/H76, A130.

27. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według jednego z poprzednich zastrzeżeń, znamienny tym, że zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień: Y5, N28, K32, E45, E96/K97,

P108/D109, NI59/+160, E60, T10, K103/K115, K65, K129, K134, E42/K55, S149/A153/L152, D125/K123, N47/L24, T77/N78, K119, E87, A16/K20/P14, Q36/G61/P63, E73, D93, V2.

28. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według jednego z poprzednich zastrzeżeń, znamienny tym, że zawiera co najmniej jedno z następujących podstawień: Y5V, N28T, K32Q, E45S,

E96S/K97S, P108G/D109N, N159G/+160N, E60S, T10N, K103V/K115N, K129N, K134E, E42S/K55N, S149T/A153V/L152A, D125Y/K123I, N47K/L24A, T77N/N78K, K119N, E87A, A16G/K20S/P14G, Q36N/G61S/P63G, E73S, D93S, V2L.

29. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera podstawienia, które wybrane są z co najmniej czterech z następujących 10 grup:

grupa 1: A130V, K134E, E141N, grupa 2: V2L, Y5V, E6S, KI 19N, grupa 3: E42S, E45S, N47K, K55N, E73S, E73T, E73S, grupa 4 : E8S, T10P, P14G, P108G, D109N, K115N, grupa 5: A16G, K20S, S149T, L152A, A153V, S155T, N159G, +160N, grupa 6: L24A, D25E, N28T, K32Q, grupa 7: T77A, T77N, N78K, K103V, grupa 8: R70N, E87A, E96S, K97S, grupa 9: D93S, KI231, D125Y, K129N, grupa 10: Q36N, E60S, G61S, P63G.

30. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera podstawienia, które wybrane są z co najmniej czterech z następujących 10 grup:

grupa 1: K134E, grupa 2: Y5V, K119N, V2L, grupa 3: E45S, E42S, K55N, N47K, E73S, grupa 4: E96S, K97S, P108G, D109N, T10N, K115N, P14G, grupa 5: N159G, +160N, S149T, A153V, L152A, A16G, K20S, grupa 6: N28T, K32Q, L24A, grupa 7: K103V, T77N, N78K, grupa 8: E96S, K97S, E87A, grupa 9: K129N, D125Y, K123I, D93S, grupa 10: E60S, Q36N, G61S, P63G.

31. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według jednego z zastrz. 1-30, znamienny tym, że zawiera co najmniej 5 mutacji pierwotnych.

32. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według jednego z zastrz. 1-30, znamienny tym, że zawiera co najmniej 6 mutacji pierwotnych.

33. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według jednego z zastrz. 1-30, znamienny tym, że zawiera co najmniej 7 mutacji pierwotnych.

34. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według jednego z zastrz. 1-30, znamienny tym, że zawiera co najmniej 8-10 mutacji pierwotnych.

35. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według jednego z zastrz. 1-34, znamienny tym, że ponadto zawiera co najmniej jedną mutację drugorzędową.

PL 212 139 B1

36. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według jednego z zastrz. 1-35, znamienny tym, że ponadto zawiera co najmniej jedną mutację drugorzędową wybraną z grup podanych w zastrz. 1, zastrz. 2 lub w zastrz. 3.

37. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według jednego z zastrz. 1-36, znamienny tym, że ponadto zawiera co najmniej jedną dodatkową mutację, przy czym mutacja ta jest addycją lub delecją reszty aminokwasu pętli eksponowanej na powierzchni.

38. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według jednego z poprzednich zastrzeżeń, do stosowania jako lek.

39. Zastosowanie zrekombinowanego alergenu według jednego z zastrz. 1-37, do przygotowania leku do zapobiegania i/lub leczenia alergii na pyłek Fagales.

40. Zastosowanie zrekombinowanego alergenu według jednego z zastrz. 1-37, do przygotowania leku do zapobiegania i/lub leczenia alergii na pyłek brzozy.

41. Kompozycja zawierająca dwa lub więcej wariantów zrekombinowanych zmutowanych alergenów Bet v 1 według jednego z zastrz. 1-37, znamienna tym, że każdy wariant definiowany jest przez posiadanie co najmniej jednej mutacji pierwotnej, która jest nieobecna w co najmniej jednym z innych wariantów.

42. Kompozycja według zastrz. 41, znamienna tym, że zawiera 2-12 wariantów.

43. Kompozycja według zastrz. 41, znamienna tym, że zawiera 3-10 wariantów.

44. Kompozycja według zastrz. 41, znamienna tym, że zawiera 4-8 wariantów.

45. Kompozycja według zastrz. 41, znamienna tym, że zawiera 5-7 wariantów.

46. Kompozycja według zastrz. 41-45, do stosowania jako lek.

47. Zastosowanie kompozycji według zastrz. 41-46, do przygotowania leku do zapobiegania i/lub leczenia alergii na pyłek Fagales.

48. Zastosowanie kompozycji według zastrz. 41-46, do przygotowania leku do zapobiegania i/lub leczenia alergii na pyłek brzozy.

49. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera zrekombinowany alergen według jednego z zastrz. 1-37 lub kompozycję według zastrz. 41-46, opcjonalnie w kombinacji z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem i/lub zaróbką, i opcjonalnie z adiuwantem.

50. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 49, znamienna tym, że jest w postaci szczepionki przeciwko reakcjom alergicznym wywoływanym przez naturalnie występujący alergen Bet v 1 u pacjentów cierpiących na alergię na pyłek brzozy.

51. Zastosowanie zrekombinowanego alergenu według jednego z zastrz. 1-37, kompozycji według zastrz. 41-46 lub kompozycji farmaceutycznej według zastrz. 49-50, do wytwarzania leku do generowania odpowiedzi immunologicznej u osobnika.

52. Zastosowanie zrekombinowanego alergenu według jednego z zastrz. 1-37, kompozycji według zastrz. 41-46 lub kompozycji farmaceutycznej według zastrz. 49-50, do wytwarzania szczepionki dla lub do leczenia osobnika.

53. Sposób przygotowania kompozycji farmaceutycznej według zastrz. 49-50, obejmujący zmieszanie zrekombinowanego alergenu według jednego z zastrz. 1-37 lub kompozycji według jednego z zastrz. 40-45 z farmaceutycznie dopuszczalnymi substancjami i/lub zaróbkami.

54. Zastosowanie zrekombinowanego alergenu według jednego z zastrz. 1-37, kompozycji według zastrz. 41-46 lub kompozycji farmaceutycznej według zastrz. 49-50, do wytwarzania leku do leczenia, do zapobiegania lub łagodzenia reakcji alergicznych u osobnika.

55. Sposób przygotowania zrekombinowanego alergenu Bet v 1 według jednego z zastrz. 1-37, znamienny tym, że podstawienie aminokwasów przeprowadzane jest za pomocą mutagenezy ukierunkowanej.

56. Sposób przygotowania zrekombinowanego alergenu Bet v 1 według jednego z zastrz. 1-37, znamienny tym, że alergen produkowany jest z sekwencji DNA uzyskanej przez tasowanie DNA (inżynieria molekularna).

57. Sposób przygotowania biblioteki zrekombinowanego alergenu Bet v 1 według jednego z zastrz. 1-37, znamienny tym, że alergen produkowany jest przez stosowanie starterów oligonukleotydowych włączających losowe podstawienia co najmniej czterech reszt aminokwasów.

58. Sposób według zastrz. 57, znamienny tym, że reszty aminokwasów wybrane są z grupy złożonej z: Y5, T10, K20, N28, K32, Q36, E42, E45, E73, K65, N78, E87, K97, K103, P108, K123, K129, K134, S149, D156 i +160.

PL 212 139 B1

59. Sekwencja DNA kodująca zrekombinowany alergen Bet v 1 według jednego z zastrz. 1-37 lub sekwencja, która do niej hybrydyzuje w warunkach ostrych, przy czym ta sekwencja hybrydyzująca koduje peptyd mający co najmniej jeden epitop komórek B.

60. Sekwencja DNA według zastrz. 59, w której sekwencja hybrydyzująca uzyskana jest przez mutagenezę ukierunkowaną DNA kodującego naturalnie występujący alergen Bet v 1.

61. Wektor ekspresyjny obejmujący DNA według jednego z zastrz. 59-60.

62. Komórka gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny według zastrz. 61.

63. Sposób produkcji zrekombinowanego mutanta alergenu Bet v 1, obejmujący etap hodowania komórki gospodarza według zastrz. 62.

64. Zrekombinowany alergen Bet v 1 według jednego z zastrz. 1-37 lub zrekombinowany alergen Bet v 1 kodowany przez sekwencję DNA według jednego z zastrz. 59-60, zawierający co najmniej jeden epitop komórek T wykazujący zdolność do stymulacji klonu komórki T lub linii komórek T specyficznej dla naturalnie występującego alergenu Bet v 1.

65. Oznaczenie diagnostyczne do oceny odpowiedniości, bezpieczeństwa lub wyniku terapii osobnika stosując zrekombinowany mutant alergenu Bet v 1 według jednego z zastrz. 1-37 lub kompozycję według zastrz. 41-46, znamienne tym, że próbka zawierająca IgE osobnika mieszana jest z wymienionym mutantem lub z wymienioną kompozycją i oceniania jest pod kątem poziomu reaktywności między IgE w wylenionej próbce a wymienionym mutantem.