CN102762225B - 用于针对桦树过敏的疫苗的肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含用于预防或治疗对桦树过敏的肽的组合物，且特别涉及用于预防或治疗所述过敏的肽的最佳组合。
Description
发明领域
本发明涉及用于预防或治疗对桦树过敏的组合物。
发明背景
T细胞抗原识别需要抗原递呈细胞(APC)将抗原片段(肽)递呈到其细胞表面上与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合。T细胞使用其抗原特异性T细胞受体(TCR)识别由APC递呈的抗原片段。这种识别起免疫系统的引发剂作用以产生一系列的反应来清除已被识别的抗原。
生物体例如人的免疫系统对外来抗原的识别在某些情况下可导致称为特异反应性病症的疾病。后者的实例是变应性疾病包括哮喘、特应性皮炎和过敏性鼻炎。在这组疾病中，B淋巴细胞产生结合外源抗原的IgE类抗体(在人类中)，由于外源抗原引发过敏反应，在此上下文中将这些分子称为过敏原。过敏原特异性IgE的产生依赖于也被所述过敏原活化(对其特异)的T淋巴细胞。过敏原特异性IgE抗体凭借细胞例如嗜碱性粒细胞和肥大细胞表达IgE的表面受体而结合到这些细胞的表面上。
表面结合的IgE分子被过敏原交联致使这些效应细胞脱粒，导致释放炎症介质例如组胺、5-羟色胺和脂质介质例如硫桥白三烯(sulphidoleukotriene)。除了IgE-依赖性事件，某些过敏性疾病例如哮喘的特征为非IgE-依赖性事件。
目前用提供症状减轻或预防的剂治疗过敏性IgE介导的疾病。这些剂的实例是抗组胺剂、β2激动剂和糖皮质激素。另外，某些IgE介导的疾病通过包括周期性注射过敏原组分或提取物的脱敏程序治疗。脱敏治疗可引起与IgE竞争过敏原的IgG反应，或其可诱导阻断针对过敏原的IgE的合 成的特异性抑制性T细胞。这种形式的治疗并不总是有效的且具有引发严重的副作用特别是一般的过敏性休克的风险。这可能是致命的，除非立即被确定并用肾上腺素治疗。将减少或消除对特定过敏原的不想要的过敏性免疫反应而本身并不改变对其他外来抗原的免疫活性或引发过敏反应的治疗性治疗对于过敏性个体将是非常有益的。
花粉过敏原被认为是人类和动物的变应性疾病，包括哮喘、过敏性鼻炎和过敏性皮炎的主要原因。美国人口的至少10％在不同的时间和不同程度上患花粉过敏。存在于特别是来自山毛榉目的树木例如桦树、赤杨、榛树、鹅耳枥和橡树的树木花粉中的蛋白质是特别重要的。在这些种类中，桦树花粉过敏原是树木花粉过敏性反应的最经常的引发剂(Jarolim等人：Allergy 1989；44(6)：385-95)。例如，约25％的花粉症患者对桦树花粉反应。花粉症是用于特征是打喷嚏、流鼻涕和眼睛痒的季节性过敏症形式的常用术语。春季月份期间的树木花粉过敏是最难对付的，桦树花粉季节通常发生在四月份左右(在北半球)。然而，某些相关类型的树木例如赤杨和榛树可早在一月份释放气传花粉(北半球)。这些之后是三月份的榆树、柳树和白蜡木，橡树在四月下旬和五月上旬。
已计算出对于美国的成人，花粉症是第五大主要慢性病并且是工作缺勤的主要原因，导致每年错过或损失将近四百万个工作日，在总的损失生产力中产生大于$700,000,000的总费用。过敏症也是儿童中最经常报道的慢性病，限制了其大于40％的活动。每年，在美国过敏造成多于1700万次门诊随访；季节性过敏例如花粉症占据这些过敏随访的一半以上。
所以治疗性或预防性治疗对于患树木过敏或处于患树木过敏的风险的人将是非常有益的。
发明概述
本发明人已发现衍生自桦树种的花粉中的主要过敏原的某些肽片段在使个体对这些过敏原脱敏方面是有用的。衍生自桦树(科名：桦木科(Betulaceae))的Bet v2、Bet v1、Bet v3、Bet v4、Bet v6和Bet v7的肽 片段是特别有用的。
通过使用计算机模拟分析(in silico analysis)预测肽-MHC相互作用和MHC II类结合试验，本发明的肽被选择为MHC II类-结合的T细胞表位。其他表位通过同源性鉴定。
与基于肽接种的脱敏方法有关的困难在于如何选择免疫原的合适尺寸和区域作为待用于免疫接种的肽的基础。所选择的肽的尺寸是至关重要的。如果肽太小，疫苗在引发免疫反应方面将是无效的。如果肽太大，或如果将整个抗原引入到个体体内，存在引发可能致命的有害反应例如过敏反应的风险。
已选择本发明的多肽来保持T细胞的特异性同时尺寸上足够小以不具有将促使其保持整体分子的IgE结合表位的构象的有意义的三级结构。因此本发明的多肽不会引起细胞例如肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的相邻特异性IgE分子的大幅交联，且因此不会造成大量的组胺释放。
本发明的优点是所述肽广泛地靶向主要组织相容性复合体(MHC)分子的能力。T细胞受体(TCR)在其特异性方面是高度可变的。与抗体分子一样，通过细胞内的基因重组事件产生变异性。TCR识别与主要组织相容性复合体(MHC)的基因编码的分子结合的短肽形式的抗原。这些基因产物是造成移植中使用的“组织类型”且还被称作人白细胞抗原分子(HLA)的相同分子，这些术语可互换地使用。单个MHC体分子具有肽结合槽，由于该肽结合槽的形状和电荷，其只能够结合有限的一组肽。被一个MHC分子结合的肽可能不一定被其他MHC分子结合。
当蛋白质分子例如抗原或过敏原被抗原递呈细胞例如B淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞摄取时，该分子在细胞内被酶降解。降解的过程产生了该分子的肽片段，如果这些片段具有合适的尺寸、电荷和形状，则其可结合在某些MHC分子的肽结合槽内并随后被展示在抗原递呈细胞的表面上。如果肽/MHC复合体以足够的数目存在于抗原递呈细胞表面上，则其可激活携带合适的肽/MHC特异性T细胞受体的T细胞。
由于MHC的多形态性质，远系繁殖群体例如人的个体将在其细胞表 面上表达MHC分子的不同组合。因为不同的MHC分子可以基于肽的尺寸、电荷和形状结合来自同一分子的不同肽，不同个体将显示出与其MHC分子结合的不同肽库。鉴定远系繁殖群体例如人中的普通MHC-结合的肽表位比在近系繁殖动物(例如实验室小鼠的某些品系)中更难。基于个体之间的差异性MHC表达和其带来的肽结合和递呈方面的内在差异，不太可能鉴定可用于人的脱敏治疗的单一肽。
然而，本发明的肽通过靶向多种不同的MHC分子而提供了对人类群体覆盖面广泛的效力。因此用本发明的肽配制的疫苗将具有广泛的实用性。因此，本发明提供了适合用于通过致耐受作用(tolerisation)预防或治疗桦树花粉过敏的组合物，该组合物包括：
i)多肽SEQ ID NO：74(BIR12B；AKYMVIQGEPGRVIRGK)、SEQ ID NO：72(BIR11；FPQFKPQEITGIMK)、SEQ ID NO：71(BIR10；GSVWAQSSSFPQFK)、SEQ ID NO：73(BIR12A；PTGMFVAGAKYMVIQGR)、SEQ ID NO：75(BIR13；IKYMVIQGEAGAVIRGK)和SEQ ID NO：76(BIR14；EAGAVIRGKKGSGGIT)或其任一个的变体中的至少一种，和
ii)多肽SEQ ID NO：53(Bir02J；PAARMFKAFILEGDKLVPK)、SEQ ID NO：48(Bir01I；FNYETETTSVIPAARK)、SEQ ID NO：54(Bir04；PGTIKKISFPEGFPFKYV)、SEQ ID NO：67(Bir09；ETLLRAVESYLLAHSDAY)、SEQ ID NO：60(BIR07；SNEIKIVATPDGGSILK)和SEQ ID NO：63(Bir07C；SNEIKIVTPEGGSILK)或其任一个的变体中的至少一种，其中所述变体是：
I)包含(i)或(ii)中指出的相应多肽的序列的长度最多为30个氨基酸的更长的多肽，或
II)包含与(i)或(ii)中指出的相应多肽的序列具有至少65％同源性的序列的长度为9至30个氨基酸的多肽，该序列能够对所述相应多肽致耐受；或
III)包含(i)或(ii)中指出的相应多肽的序列的至少9个连续氨基酸的序列，或与(i)或(ii)中指出的相应多肽的序列的至少9个连续氨基酸具有至少65％同源性的序列的长度为9至30个氨基酸的多肽，所述至少9个连续氨基酸的序列或同源序列能够对所述相应多肽致耐受。
还提供了适合用于通过致耐受作用预防或治疗桦树花粉过敏的组合物，该组合物包括至少三种不同多肽，所述至少三种不同多肽选自：
(a)Bir12B(AKYMVIQGEPGRVIRGK)，或其变体；
(b)Bir02J(PAARMFKAFILEGDKLVPK)，或其变体；
(c)Bir01I(FNYETETTSVIPAARK)或其变体；
(d)Bir04(PGTIKKISFPEGFPFKYV)或其变体；
(e)Bir09(ETLLRAVESYLLAHSDAY)或其变体；
(f)Bir16A(AERERIFKRFDANGEGK)或其变体；
(g)Bir07(SNEIKIVATPDGGSILK)或其变体；
(h)Bir07C(SNEIKIVATPEGGSILK)或其变体；
(i)Bir011(FPQFKPQEITGIMK)或其变体；
(j)Bir15(SLNTLRLRRIFDLFDK)或其变体；
其中所述变体是：
I)包含(a)至(j)中指出的相应多肽的序列的长度最多为30个氨基酸的更长的多肽，或
II)包含与(a)至(j)中指出的相应多肽的序列具有至少65％同源性的序列的长度为9至30个氨基酸的多肽，所述序列能够对所述相应多肽致耐受；或
III)包含(a)至(j)中指出的相应多肽的序列的至少9个连续氨基酸的序列，或与(a)至(j)中指出的相应多肽的序列的至少9个连续氨基酸具有至少65％同源性的序列的长度为9至30个氨基酸的多肽，所述至少9个连续氨基酸的序列或同源序列能够对所述相应多肽致耐受。
本文提到的序列的说明
SEQ ID NO：1至80提供了表1至8中列出的本发明的多肽序列。SEQ ID NO：1至34和SEQ ID NO：45至70对应于衍生自Bet v1的肽。SEQ ID NO：71至76对应于衍生自Bet v2的肽。SEQ ID NO：35、36和77对应于衍生自Bet v3的肽。SEQ ID NO：37至39、SEQ ID NO：78和79对应于衍生自Bet v4的肽。SEQ ID NO：40至43和SEQ ID NO：80对应于衍生自Betv6的肽。SEQ ID NO：44对应于衍生自Bet v7的肽。
发明详述
本发明涉及可用于致耐受的肽。这些肽可包含SEQ ID NO：1至80中任一个所示出的序列，由其组成或主要由其组成。还可使用这些特异性肽的变体。这些变体可包含作为SEQ ID NO：1至80中任一个或SEQ ID NO：1至80中任一个的同源物的片段的序列，由其组成或主要由其组成。
本发明还提供了包含本发明的多肽的产品和制剂以及包含能够表达用于通过致耐受作用预防或治疗桦树过敏的本发明的多肽的多核苷酸的组合物、产品和载体。这种致耐受将通常针对SEQ ID NO：1至80任一个中存在的表位(例如，MHC II类-结合的T细胞表位)。
树木种类
来自桦木科、通常称为桦树的树木种类造成了全世界高比例的树木过敏，特别是与树木花粉有关的过敏，例如花粉症。其他重要的树木种类包括赤杨、榛树、鹅耳枥和橡树。
桦树，例如银桦树(垂枝桦(Betula pendula))耐受具有从约3.5至约7的土壤pH的广泛范围的栖息地。它们原产自欧洲大部分和亚洲的部分地区，但是是全世界常见的，发现于北半球的温带、北方生物带和北极区，尤其是加拿大和北美的其他部分。桦树通常在四月份与五月份之间开花(北半球)。
桦树花粉过敏原的肽片段
本发明人已鉴定到包含MHC II类-结合的T细胞表位的某些桦树花粉过敏原蛋白质的区域。本发明人还已表明对应于主要桦树花粉过敏原内的MHC II类-结合的T细胞表位的区域在所述过敏原的不同同种型之间是高度保守的。基于该信息，衍生自每种蛋白质的相关区域的肽适合用于通过对该蛋白质的所有同种型致耐受来预防或治疗桦树过敏。
本发明的肽从蛋白质过敏原Bet v2(SEQ ID NO：71至76)、Bet v1(SEQ ID NO：1至34和SEQ ID NO：45至70)、Bet v3(SEQ ID NO：35、36和77)、Bet v4(SEQ ID NO：37至39、SEQ ID NO：78和79)、Bet v6(SEQ ID NO：40至43和SEQ ID NO：80)、Bet v7(SEQ ID NO：44)直接获得或通过与其同源获得。术语“肽”和“多肽”在本文中互换地使用。本文还将以上蛋白质称为“过敏原”。表1至7列出了本发明的肽的序列(SEQ ID NO：1至80)，指出了每个肽所来源的亲本蛋白质。本发明的组合物包含选自SEQ ID NO：1至80的至少一种多肽或其任何变体。
换句话说，本发明提供了用于通过致耐受作用预防或治疗桦树过敏的组合物，该组合物包含选自SEQ ID NO：1至80任一个或其任一个的变体中至少三种、优选至少四种不同的多肽。优选所选择的多肽都不是具有SEQ ID NO：1至80中任何一个所定义的相同原始序列的变体。换句话说，优选所述三种或四种多肽的每一个都是SEQ ID NO：1至80中任何一个所定义的不同原始基准序列，或是SEQ ID NO：1至80中任何一个所定义的不同原始基准序列的变体。
优选地，该组合物将包含衍生自多于一种过敏原的多肽。例如，该组合物可包含衍生自Bet v 2的一种或多种多肽或其变体和衍生自Bet v1的一种或多种多肽或其变体。可任选地包括衍生自Bet v3、Bet v4、Bet v6和/或Bet v7的其他多肽。因此，在某些实施方式中，该组合物包含
i)多肽SEQ ID NO：74、72、71、73、75和76(衍生自Bet v2)或如本文所定义的其任何变体的至少一种；和
ii)多肽SEQ ID NO：1至34和SEQ ID NO：45至70(衍生自Bet v1) 或其任一个的变体的中的至少一种；和任选地
iii)下列多肽中的至少一种：
(a)SEQ ID NO：35、36和77(衍生自Bet v3)，或如本文所定义的其任一个的变体；和/或
(b)SEQ ID NO：37至39、SEQ ID NO：78和79(衍生自Bet v4)，或如本文所定义的其任一个的变体；和/或
(c)SEQ ID NO：40至43和SEQ ID NO：80(衍生自Bet v6)，或如本文所定义的其任一个的变体；和/或
(d)SEQ ID NO：44(衍生自Bet v7)，或如本文所定义的其变体。
因此该组合物可包含选自如上定义的组(i)的一种或多种多肽、选自如上定义的组(ii)的一种或多种多肽和任选的来自如上定义的组(iii)的(a)至(d)的一种或多种多肽的任何组合。如上所述，组(i)、(ii)和(iii)(a)至(d)对应于衍生自不同Bet过敏原的肽。组合衍生自不同Bet过敏原的多肽可通过提供来自多于一种桦树花粉过敏原的致耐受表位而允许广泛覆盖在一般群体中观察到的桦树花粉过敏。
如以上定义的选择的组合物的非限制性实例包括：选自SEQ ID NO：74、72、71、73、75和76的一种、两种或更多种多肽或其任一个的变体，选自组(ii)的至少一种多肽或其任一个的变体，和任选的选自组(iii)(a)和/或(b)的至少一种多肽或其变体；或
选自SEQ ID NO：74、72、71、73、75和76的一种、两种或更多种多肽或其任一个的变体和选自组(ii)的两种、三种、四种或五种多肽或其任一个的变体和任选的选自组(iii)(a)和/或(b)的至少一种多肽或其任一个的变体；或
选自SEQ ID NO：74、72、71、73、75和76的一种、两种或更多种多肽或其任一个的变体和选自组(ii)的两种、三种、四种或五种多肽或其任一个的变体和选自组(iii)b)的至少一种多肽。
在一个实施方式中，组合物包含：
i)多肽SEQ ID NO：74(BIR12B；AKYMVIQGEPGRVIRGK)、SEQ ID NO：72(BIR11；FPQFKPQEITGIMK)、SEQ ID NO：71(BIR10；GSVWAQSSSFPQFK)、SEQ ID NO：73(BIR12A；PTGMFVAGAKYMVIQGR)、SEQ ID NO：75(BIR13；IKYMVIQGEAGAVIRGK)和SEQ ID NO：76(BIR14；EAGAVIRGKKGSGGIT)或其任一个的变体中的至少一种，和ii)多肽SEQ ID NO：53(Bir02J；PAARMFKAFILEGDKLVPK)、SEQ ID NO：48(Bir01I；FNYETETTSVIPAARK)、SEQ ID NO：54(Bir04；PGTIKKISFPEGFPFKYV)、SEQ ID NO：67(Bir09；ETLLRAVESYLLAHSDAY)、SEQ ID NO：60(BIR07；SNEIKIVATPDGGSILK)和SEQ ID NO：63(Bir07C；SNEIKIVTPEGGSILK)或其任一个的变体中的至少一种。在另一个实施方式中，组合物还包含以上未选择的(i)或(ii)中的至少一种其他多肽或其变体。在另一个实施方式中，组合物还包含SEQ ID NO：77(BIR15；SLNTLRLRRIFDLFDK)或SEQ ID NO：78(BIR16A ；AERERIFKRFDANGEGK)中的至少一种其他多肽或其任一个的变体。在优选的实施方式中，组合物包含：
(a)多肽Bir12B(AKYMVIQGEPGRVIRGK)，或其变体；
(b)多肽Bir02J(PAARMFKAFILEGDKLVPK)，或其变体；和
(c)多肽Bir01I(FNYETETTS VIPAARK)，或其变体。
在特别优选的实施方式中，组合物含多肽Bir12B(AKYMVIQGEPGRVIRGK)或其变体、多肽Bir02J(PAARMFKAFILEGDKLVPK)或其变体、多肽Bir01I(FNYETETTSVIPAARK)或其变体、多肽Bir04(PGTIKKISFPEGFPFKYV)或其变体、多肽Bir09(ETLLRAVESYLLAHSDAY)或其变体、多肽Bir07C(SNEIKIVATPEGGSILK)或其变体和多肽Bir16A(AERERIFKRFDANGEGK)或其变体，且任选地不含其他多肽。
在另外的特别优选的实施方式中，组合物包含多肽Bir12B(AKYMVIQGEPGRVIRGK)或其变体、多肽Bir02J(PAARMFKAFILEGDKLVPK)或其变体、多肽Bir01I(FNYETETTSVIPAARK)或其变体、多肽Bir04(PGTIKKISFPEGFPFKYV)或其变体、多肽Bir07C(SNEIKIVATPEGGSILK)或其变体、多肽Bir16A(AERERIFKRFDANGEGK)或其变体和多肽Bir09B(KEMGETLLRAVESYLLAHS)或其变体，且任选地不含其他多肽。
在另外的特别优选的实施方式中，组合物包含多肽Bir12B(AKYMVIQGEPGRVIRGK)或其变体、多肽Bir02J(PAARMFKAFILEGDKLVPK)或其变体、多肽Bir01I(FNYETETTSVIPAARK)或其变体、多肽Bir04(PGTIKKISFPEGFPFKYV)或其变体、多肽Bir07C(SNEIKIVATPEGGSILK)或其变体和多肽Bir16A(AERERIFKRFDANGEGK)或其变体，且任选地不含其他多肽。
本发明还提供了包含根据本发明的肽、变体或组合物的产品。本发明提供了一种产品，该产品包含：
i)多肽SEQ ID NO：74(BIR12B；AKYMVIQGEPGRVIRGK)、SEQ ID NO：72(BIR11；FPQFKPQEITGIMK)、SEQ ID NO：71(BIR10；GSVWAQSSSFPQFK)、SEQ ID NO：73(BIR12A ；PTGMFVAGAKYMVIQGR)、SEQ ID NO：75(BIR13；IKYMVIQGEAGAVIRGK)和SEQ ID NO：76(BIR14；EAGAVIRGKKGSGGIT)或如(I)至(III)中所定义的其任一个的变体中的至少一种，和
ii)多肽SEQ ID NO：53(Bir02J；PAARMFKAFILEGDKLVPK)、SEQ ID NO：48(Bir01I；FNYETETTSVIPAARK)、SEQ ID NO：54(Bir04；PGTIKKISFPEGFPFKYV)、SEQ ID NO：67(Bir09；ETLLRAVESYLLAHSDAY)、SEQ ID NO：60(BIR07；SNEIKIVATPDGGSILK)和SEQ ID NO：63(Bir07C； SNEIKIVATPEGGSILK)或如(I)至(III)中所定义的其任一个的变体中的至少一种，其中每个不同多肽是为了同时、单独或顺序地用于通过致耐受作用预防或治疗桦树花粉过敏。
本文提到了SEQ ID NO：1至80的多肽的变体。SEQ ID NO：1至80中的任一个的变体将通常是有功能的。有功能是指所述变体是这样的变体：
(a)包含与SEQ ID NO：1至80的相应多肽结合相同的MHC II类分子的序列，或由其组成；和/或
(b)包含被识别SEQ ID NO：1至80的相应多肽的T细胞所识别的序列，或由其组成；和/或
(c)能够引发患桦树过敏的个体的晚期反应；和/或
(d)能够使个体对所述相应多肽耐受。
T细胞识别可通过测量肽或变体在T细胞样品中引发T细胞增殖的能力来测试。当T细胞样品取自患桦树过敏的个体时还可以以这种方式测试晚期反应的引发。测试引发T细胞增殖的方法是本领域熟知的且实施例8示例了一种这样的方法。
SEQ ID NO：1至80的变体可以是通过截短，例如通过去除多肽的N和/或C末端的一个或多个氨基酸而获得的片段。片段还可通过一个或多个内部缺失产生，只要基本上未破坏组成T细胞表位的9个核心氨基酸。
例如，SEQ ID NO：1的变体可包含SEQ ID NO：1的片段，即更短的序列。这可包括从SEQ ID NO：1的N末端或从SEQ ID NO：1的C末端缺失一个、两个、三个或四个氨基酸。可从SEQ ID NO：1的两个末端进行这种缺失。
SEQ ID NO：1的变体可包括越过SEQ ID NO：1的末端延伸的其他氨基酸(例如，来自衍生所述肽的亲本蛋白质的序列)。多肽变体通常可以是包含SEQ ID NO：1至80的相应多肽序列的长度达20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的更长的多肽。
变体可包括以上讨论的缺失和添加的组合。例如，可从SEQ ID NO：1 的一端敲除氨基酸，而可在SEQ ID NO：1的另一端添加来自全长亲本蛋白质序列的其他氨基酸。以上对变体的相同讨论也适用于SEQ ID NO：2至80。
可选择地，变体可以是包含与SEQ ID NO：1至80的相应多肽的序列具有至少65％的序列同一性的长度为9至30、11至20或13至17个氨基酸的多肽。更优选地，合适的变体可包含与SEQ ID NO：1至80的相应多肽的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的氨基酸同一性。
变体可以是包含SEQ ID NO：1至80的相应多肽的序列的至少9个(例如，至少10、11、12或13个)或更多个连续氨基酸的序列或与之具有至少65％的序列同一性的序列的长度为9至30、11至20或13至17个氨基酸的多肽。这些连续氨基酸通常可包含例如结合本文提到的任何MHC分子的MHC II类表位。
变体肽可包括来自SEQ ID NO：1至80中任一个或其片段的氨基酸序列的一个或多个氨基酸置换。变体肽可包含与SEQ ID NO：1至80中任一个的至少9个或更多个连续氨基酸具有至少65％的序列同一性的序列。更优选地，合适的变体可包含与SEQ ID NO：1至80中任一个的至少9个连续氨基酸的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％氨基酸同一性。这种氨基酸同一性的水平可见于肽的任何区段，尽管优选其是核心区域。取决于对比肽的尺寸，氨基酸同一性的水平是在至少9个连续氨基酸上且其可以是至少10、11、12、13、14、15或至少16或17个氨基酸。因此，任何以上指出的同一性水平可贯穿序列的全长。
结合氨基酸序列，“序列同一性”是指当使用ClustalW(Thompson等人，1994，同前)以下列参数评价时具有指定值的序列：成对比对参数-方法：精确，矩阵：PAM，空位开放罚分(Gap open penalty)：10.00，空位延伸罚分：0.10；多比对参数-矩阵：PAM，缺口开放罚分：10.00，％延迟同一性(identity for delay)：30，处罚末端空位：开，空位间隔距离：0，负矩阵：无，空位延伸罚分：0.20，残基特异性空位罚分：开， 亲水性空位罚分：开，亲水性残基：GPSNDQEKR。特定残基处的序列同一性旨在包括简单衍生化的相同残基。
变体肽可包含来自SEQ ID NO：1至80中任一个的1、2、3、4、5或更多个，或多至10个氨基酸置换。置换变体优选地包括用相同数目的氨基酸取代一个或多个氨基酸并进行保守氨基酸置换。例如，某个氨基酸可被具有相似性质的替代氨基酸例如另一个碱性氨基酸、另一个酸性氨基酸、另一个中性氨基酸、另一个带电氨基酸、另一个亲水性氨基酸、另一个疏水性氨基酸、另一个极性氨基酸、另一个芳族氨基酸或另一个脂族氨基酸置换。可用来选择合适置换物的20个主要氨基酸的一些性质如下：
| Ala | 脂族、疏水、中性 | Met | 疏水、中性 |
| Cys | 极性、疏水、中性 | Asn | 极性、亲水、中性 |
| Asp | 极性、亲水、带(-)电荷 | Pro | 疏水、中性 |
| Glu | 极性、亲水、带(-)电荷 | Gln | 极性、亲水、中性 |
| Phe | 芳族、疏水、中性 | Arg | 极性、亲水、带(+)电荷 |
| Gly | 脂族、中性 | Ser | 极性、亲水、中性 |
| His | 芳族、极性、亲水、带(+)电荷 | Thr | 极性、亲水、中性 |
| Ile | 脂族、疏水、中性 | Val | 脂族、疏水、中性 |
| Lys | 极性、亲水、带(+)电荷 | Trp | 芳族、疏水、中性 |
| Leu | 脂族、疏水、中性 | Tyr | 芳族、极性、疏水 |
其他变体包括其中出现在序列中的氨基酸不是天然存在的氨基酸而是其结构类似物的那些变体。只要没有明显不利地影响肽的功能，用于序列中的氨基酸也可被修饰，例如，被标记。
当肽具有不同于SEQ ID NO：1至80任一个或其片段的序列时，置换可遍布序列全长、在SEQ ID NO：1至80任一个的序列之内或SEQ ID NO：1至80任一个的序列之外发生。例如，本文所述的变异例如添加、缺失、置换和修饰可发生在SEQ ID NO：1至80任一个的序列之内。变体肽可包含其中已进行一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸置换的SEQ ID NO：1至80任一个的氨基酸序列或主要由其组成。变体肽可包含大于SEQ ID NO：1至80任一个的亲本蛋白质的片段。在该实施方式中，本文所述的变 异，例如置换和修饰可发生在SEQ ID NO：1至80任一个的序列之内和/或之外。例如，一个或多个带正电荷的残基可被添加到SEQ ID NO：1至80任一个的肽的天然序列的N端和/或C端。
本发明的变体肽长度是9至30个(含9和30个)氨基酸。优选地，它们可以是长度为9至20或更优选地13至17个氨基酸。这些肽可以与SEQ ID NO：1至80任一个的肽序列长度相同。
这些肽可例如通过蛋白酶裂解以化学方式衍生自多肽过敏原，或可在理性意义上自所述多肽过敏原衍生，例如通过利用多肽过敏原的氨基酸序列并基于该序列合成肽。可使用本领域熟知的方法合成肽。
术语“肽”不仅包括其中氨基酸残基通过肽键(-CO-NH-)连接的分子而且包括其中肽键被反转的分子。可使用本领域已知的方法，诸如例如Meziere等人(1997)J.Immunol.159，3230-3237中描述的那些方法制备这些逆反类肽物(retro-inverso peptidomimetic)。该方法包括制备包含主链变化而不是侧链取向变化的伪肽。Meziere等人(1997)表明至少对于MHC II类和辅助性T细胞应答，这些伪肽是有用的。包含NH-CO键而不是CO-NH肽键的逆反肽更能抵制蛋白酶解。
相似地，只要使用保留氨基酸残基的碳原子之间的间隙的合适接头部分，肽键可被全部省略；如果接头部分具有与肽键基本相同的电荷分布和基本相同的平面度，它是特别优选的。还应理解，可方便地在其N或C端对肽封端以帮助降低对外切蛋白酶消化的敏感性。例如，可通过与羧酸反应来保护肽的N端氨基，且可通过与胺反应来保护肽的C端羧基。其他修饰实例包括糖基化和磷酸化。另一个可能的修饰是R或K的侧链胺上的氢可被亚甲基取代(-NH2→-NH(Me)或-N(Me)2)。
根据本发明的肽的类似物还可包括增长或缩短肽的体内半衰期的肽变体。能够增长根据本发明所使用的肽的半衰期的类似物的实例包括肽的拟肽类似物、肽的D-氨基酸衍生物和肽-拟肽杂交体。根据本发明使用的变体多肽的其他实施方式包含多肽的D-氨基酸形式。使用D-氨基酸而不是L-氨基酸制备多肽极大地降低了该剂通过正常代谢过程的不想要的分解，减少了需要施用的剂的量以及其施用频率。
本发明所提供的肽可衍生自由编码亲本蛋白质链的初级转录物的选择性剪接产生的mRNA所编码的所述亲本蛋白质的剪接变体。肽还可衍生自至少保留了过敏原的MHC-结合特性的亲本蛋白质的氨基酸突变体、糖基化变体和其他共价衍生物。示例性衍生物包括其中本发明的肽通过置换、化学、酶学或其他合适的手段被除了天然存在的氨基酸以外的部分共价修饰的分子。还包括在不同的螨虫中发现的亲本蛋白质的天然存在的变体。这样的变体可由等位基因变体编码或代表选择性剪接变体。
可在合成肽期间或通过产生后修饰，或当所述肽是重组形式时，使用已知的定点诱变、随机诱变或酶裂解和/或核酸连接技术来制备上述变体。
在本发明的任何实施方式中，本文所述的变体的典型实例可以是如下：
-Bir01I的变体是Bir01F(FNYETEATSVIPAARK)、Bir01G(FNYEIEATSVIPAARK)或Bir01H(FNYEIETTSVIPAARK)；和/或
-Bir02J的变体是Bir02E(PAARLFKAFILEGDTLIPK)、Bir02G(PAARLFKAFILEGDNLIPK)、Bir02I(PAARMFKAFILD)或Bir02D(PAARMFKAFILDGDKLVPK)；和/或
-Bir09的变体选自Bir09A(GETLLRAVESYLLAHS)、Bir09B(KEMGETLLRAVESYLLAHS)或Bir09C(KEKGETLLRAVESYLLAHS)；和/或
-Bir16B的变体是Bir16A(AERERIFKRFDANGEGK)。
将应理解SEQ ID NO：1至80是包含由通常9个氨基酸的核心组成的T细胞表位的多肽序列，所述9个氨基酸是MHC II类结合所必需的最小必需序列。然而，SEQ ID NO：1至80的多肽还可包含在所述核心侧翼的其他残基。因此肽可包括含有T细胞表位的区域，其中某些残基可被修饰而不影响表位的功能。因此，例如，可改变SEQ ID NO：1至80任一个的序列以提高其溶解度且因此SEQ ID NO：1至80任一个的变体将优选地比SEQID NO：1至80的相应多肽在同等条件下更可溶。评价肽的溶解度的方法是本领域熟知的并在实施例9示例了一种这样的方法。
提高的溶解度对于受治疗者对衍生本发明的肽的过敏原的耐受是有利的，因为对受治疗者施用溶解差的剂导致不期望的、不致耐受的炎症反应。可通过改变包含T细胞表位的区域侧翼的残基来提高肽的溶解度。本发明的肽可被改造为更可溶以致于其包含：
i)T细胞表位侧翼的肽的残基的N端：一至六个连续氨基酸，它们与衍生所述肽的蛋白质序列中所述残基的N端紧邻的一至六个连续氨基酸对应；和/或
ii)T细胞表位侧翼的肽的残基的C端：一至六个连续氨基酸，它们与衍生所述肽的蛋白质序列中所述残基的C端紧邻的一至六个连续氨基酸对应；或
iii)T细胞表位侧翼的肽的残基的N端和C端，选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的至少一个氨基酸。
任选地，所述肽可被另外改造为更可溶以致于：
i)所述肽的天然序列中的任何半胱氨酸残基被丝氨酸或2-氨基丁酸取代；和/或
ii)未包括在T细胞表位中的、所述肽的天然序列的N端或C端的前三个(upto three)氨基酸中的任何疏水残基被缺失；和/或
iii)未包括在T细胞表位中的、所述肽的天然序列的N端或C端的前四个氨基酸中的包含序列Asp-Gly的任何两个连续氨基酸被缺失；和/或
iv)一个或多个带正电荷的残基被添加在所述肽的天然序列的N端和/或C端。
优选地本发明的肽和变体能够在至少20％的T细胞样品中导致T细胞增殖，其中每个样品从群体中不同的桦树过敏个体获得。本发明的组合物优选地能够在30％或更多的从一组桦树过敏个体获得的T细胞样品中引发T细胞增殖。更优选地，该组合物能够在35％或更多、40％或更多、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％或更多的从小组中的致敏个体获得的样品中引发T细胞增殖。一组桦树过敏个体中的个体数目可以是大于1的任何数，例如至少2、3、5、10、15、20、30、 50、80或至少100个个体。
如果本发明的肽、变体和组合物导致T细胞增殖，但不导致从致敏个体的富集嗜碱性粒细胞或肥大细胞制品中释放组胺，则其是优选的。可以存在一定的组胺释放，但优选所述肽、变体和组合物不导致大量的组胺释放。大量的组胺释放可以认为是当用组合物体外刺激来自个体的白细胞样品时释放总的可获得的白细胞组胺的20％或更多。当用组合物体外刺激来自个体的白细胞样品时，优选本发明的肽、变体或组合物导致释放小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的总的可获得的白细胞组胺。正常个体通常具有约150ng/107细胞的白细胞组胺含量。
可经验性地获得或根据已知标准选择能够结合TCR的合适的肽或变体。在单一肽内存在有助于在MHC抗原结合槽内的结合的某些残基和与T细胞受体的高度可变区相互作用的其他残基(Allen等人(1987)Nature 327：713-5)。
在有助于T细胞受体相互作用的残基中，已表明一种与T细胞活化对特定肽残基置换的依赖性有关的层级(hierarchy)。使用已使一个或多个T细胞受体接触残基被不同氨基酸取代的肽，多个组已证明对T细胞活化过程有深刻影响。Evavold&Allen(1991)Nature 252：1308-10阐述了T细胞增殖与细胞因子产生的不相关。在该体外模型中，用其中已进行天冬氨酸保守置换成谷氨酸的肽类似物刺激对血红蛋白的残基64-76特异的T细胞克隆(就I-Ek来讲)。该置换不明显干扰所述类似物与I-Ek结合的能力。
用该类似物体外刺激T细胞克隆之后，虽然维持了IL-4分泌但未检测到增殖，也未检测到所述克隆帮助B细胞应答的能力。在随后的研究中，同一组证明了T细胞介导的细胞溶解与细胞因子产生之间的分离。在这种情况下，前者保持不变而后者被阻碍。McDevitt和同事在EAE(实验性过敏性脑脊髓炎)的鼠模型中最先阐述了改变的肽配体在体内的效力(Smilek等人(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88：9633-9637)。在该模型中，EAE因接种MBP(髓鞘碱性蛋白)的致脑炎肽Ac1-11引起。在位置4(赖氨酸)用丙氨酸残基置换产生了一种肽，该肽与其限制性元件(AαuAβu)良好结合但在敏感的PL/JxSJLF1系中是非免疫原性的且其当在接种致脑炎肽之 前或之后施用时还阻止了EAE发作。因此，可识别出肽中影响所述肽引发多种T细胞功能的能力的残基。
有利地，可设计肽以利于T细胞增殖并引发脱敏。Metzler和Wraith已表明了其中已进行了增加肽-MHC亲和力的置换的肽的提高的致耐受能力(Metzler&Wraith(1993)Int Immunol～：1159-65)。Sloan-Lancaster等人(1993)Nature 363：156-9表明改变的肽配体可在所克隆的T细胞中导致长期且深远的无反应性。
本发明的组合物能够引发对过敏原致敏的个体的晚期反应。术语“晚期反应”包括在Allergy and Allergic Diseases(1997)A.B.Kay(编辑)，Blackwell Science，第1113-1130页中提供的含义。所述晚期反应可以是任何晚期反应(LPR)。优选地，所述肽能够引发迟发哮喘反应(LAR)或迟发鼻炎反应或晚期皮肤反应或晚期眼部反应。可使用本领域熟知的方法确定特定的肽是否可以引起LPR；特别优选的方法是Cromwell O，Durham SR，Shaw RJ，Mackay J和Kay AB.Provocation tests and measurements of mediators from mast cells and basophils in asthma and allergic rhinitis.在：Handbook of Experimental Immunology(4)第127章，编辑：Weir DM，Blackwell Scientific Publications，1986中所述的方法。
因此，优选地，本发明的单个肽和变体能够在已对过敏原致敏的个体内引发LPR。个体是否已对过敏原致敏可通过熟知的方法，例如过敏原提取物溶液的皮刺试验、皮肤LPR的引发、临床病史、过敏原刺激和用于测量过敏原特异性IgE的放射过敏原吸附试验(RAST)确定。特定个体是否被期望从治疗受益可由医师基于例如这些试验确定。
使个体对过敏原脱敏或耐受是指抑制或减轻由过敏原在适当致敏的个体中引起的过敏组织反应。已表明T细胞可被选择性地活化并然后使之不反应。另外，使这些T细胞无反应性或将其消除导致患者对特定过敏原脱敏。脱敏其本身呈现为当第二次并进一步施用过敏原或过敏原衍生的肽时，对该过敏原或过敏原衍生的肽的反应减轻或更优选地消除了该反应。第二次施用可在已经过一段合适的时间后进行以促使脱敏发生；优选这是一天和几周之间的任何时间。约两周的间隔是优选的。
尽管本发明的组合物能够在桦树过敏个体中引发LPR，应当理解当使用组合物治疗患者时，优选使用足够低浓度的所述组合物以致于不会发生观察到的LPR，但该反应将足以使T细胞部分地脱敏以使得可给予下一(优选更高的)剂量，等等。以这种方式，建立了提供完全脱敏从来不会在患者体内引发LPR的剂量。但是，所述组合物或肽能够在高于所施用浓度的更高浓度下做到这些。
优选本发明的组合物能够在来自该群体的一组桦树过敏个体的50％或更多个体中引发晚期反应。更优选地，该组合物能够在小组中55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多或90％或更多的致敏个体中引发LPR。组合物是否能够在某一百分比的一组受治疗者中引发LPR可通过本领域熟知的方法确定。
核酸和载体
组成本发明的组合物和产品的单个肽可被直接施用，或可通过由编码序列表达而被间接施用。例如，可提供编码本发明的肽例如任何上述肽的多核苷酸。因此本发明的肽可由编码并能够表达它的多核苷酸产生或以所述多核苷酸的形式递送。本文对使用、递送或施用本发明的肽的任何表述旨在包括通过由编码该肽的多核苷酸表达来间接使用、递送或施用该肽。
因此，本发明提供了用于通过致耐受作用预防或治疗对桦树过敏的组合物，该组合物包括当表达时导致产生用于通过致耐受作用预防或治疗对桦树过敏的根据本发明的组合物的至少一种多核苷酸序列。
术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文互换地使用并指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物的任何长度的核苷酸的多聚形式。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。本发明的多核苷酸可以以分离或纯化形式提供。“编码”所选择的多肽的核酸序列是当被置于合适调控序列的控制下时被体内转录(就DNA来讲)和翻译(就mRNA来讲)成多肽的核酸分子。编码序列的边 界由5′(氨基)端的起始密码子和3′(羧基)端的翻译终止密码子确定。为了本发明的目的，这些核酸序列可包括但不限于来自病毒的cDNA、原核或真核mRNA、来自病毒的基因组序列或原核DNA或RNA和甚至合成的DNA序列。转录终止序列可位于编码序列的3′端。
可根据本领域熟知的方法合成本发明的多核苷酸，如Sambrook等人(1989，Molecular Cloning-a laboratory manual；Cold Spring Harbor Press)中通过实例描述的方法。
本发明的多核苷酸分子可以以表达盒的形式提供，所述表达盒包括与插入序列可操作地连接的控制序列，从而允许本发明的肽在靶受治疗者体内表达。反过来这些表达盒通常被提供在适合用作核酸接种试剂的载体(例如，质粒或重组病毒载体)中。可以对宿主受治疗者直接施用这种表达盒。可选择地，可对宿主受治疗者施用包含本发明的多核苷酸的载体。优选地使用基因载体制备和/或施用所述多核苷酸。合适的载体可以是能够携带足量的基因信息并允许表达本发明的肽的任何载体。
表达载体是分子生物学领域常规构建的并可包括例如使用质粒DNA和合适的起始子(initiator)、启动子、增强子和可能是必要的并以正确的取向布置以允许表达本发明的肽的其他元件，诸如例如多聚腺苷酸化信号。其他合适的载体对于本领域技术人员将是明显的。关于这点的另外的实例我们参考Sambrook等人。
因此，通过将这样的载体递送到细胞并允许发生从该载体的转录，可提供本发明的多肽。因此，本发明还提供了用于通过致耐受作用预防或治疗桦树花粉过敏的载体，该载体包括编码本发明的不同多肽的四种或更多种多核苷酸序列。优选地，载体中本发明的多核苷酸或用于本发明的多核苷酸与能够提高宿主细胞对编码序列的表达的控制序列可操作地连接，即所述载体是表达载体。
“可操作地连接”是指其中如此描述的部件被布置以实施其通常的功能的元件排列。因此，与核酸序列可操作地连接的给定调控序列例如启动子当存在合适的酶时能够实现该序列的表达。只要启动子发挥功能指导该序列的表达，其不必与该序列连在一起。因此，例如，间插的不翻译但转录 的序列可存在于所述启动子序列和核酸序列之间且仍可认为启动子序列与编码序列“可操作地连接”。
本领域中已描述了几种表达系统，其每一种通常由包含与表达控制序列可操作地连接的感兴趣的基因或核苷酸序列的载体组成。这些控制序列包括转录启动子序列和转录起始和终止序列。本发明的载体可以是例如，拥有复制起点、任选地用于表达所述多核苷酸的启动子和任选地启动子的调控因子的质粒、病毒或噬菌体载体。“质粒”是染色体外基因元件形式的载体。载体可包含一种或多种选择性标记基因，例如，细菌质粒情况下的氨苄西林抗性基因或用于真菌载体的抗性基因。载体可体外使用例如以产生DNA或RNA或用来转染或转化宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞。载体还可适合体内使用以例如允许多肽的体内表达。
“启动子”是启动并调控编码多肽的多核苷酸的转录的核苷酸序列。启动子可包括诱导型启动子(其中与所述启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调控蛋白等诱导)、阻抑型启动子(其中与所述启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达被分析物、辅因子、调控蛋白等阻抑)和组成型启动子。术语“启动子”或“控制元件”预期包括全长启动子区域和这些区域的功能性(例如控制转录或翻译)片段。
根据本发明的多核苷酸、表达盒或载体可另外包含信号肽序列。信号肽序列通常以与启动子可操作地连接的方式插入，以使信号肽被表达并促进由也与启动子可操作地连接的编码序列编码的多肽的分泌。
通常信号肽序列编码10至30个氨基酸例如15至20个氨基酸的肽。通常这些氨基酸主要是疏水的。在通常情况下，信号肽将携带所述信号肽的增长中的多肽链靶向到表达细胞的内质网。信号肽在内质网中被裂解下来，促使多肽通过高尔基体分泌。因此本发明的肽可通过被个体内的细胞表达并由那些细胞分泌而提供给所述个体。
可选择地，本发明的多核苷酸可以以适合的方式表达以允许本发明的肽被MHC II类分子递呈在抗原递呈细胞表面。例如，本发明的多核苷酸、表达盒或载体可被靶向到抗原递呈细胞，或可优先在这些细胞中刺激或诱导所编码的肽的表达。
在某些实施方式中，所述多核苷酸、表达盒或载体将编码佐剂，或将以其他方式提供佐剂。如本文所用的，术语“佐剂”是指能够特异性或非特异性地改变、增强、定向、重定向、加强或引发抗原特异性免疫反应的任何材料或组合物。
目的多核苷酸可体外、在活体外或体内用于产生本发明的肽。这些多核苷酸可被施用或用于通过致耐受作用预防或治疗过敏。
基因递送的方法是本领域已知的。参见例如美国专利第5,399,346、5,580,859和5,589,466号。可将核酸分子通过例如标准肌肉内或皮内注射、经皮肤颗粒递送、吸入、局部或通过口服、鼻内或粘膜施用方式直接引入到接受的受治疗者。可选择地，可将该分子在活体外引入到已从受治疗者取出的细胞中。例如，可将本发明的多核苷酸、表达盒或载体在活体外引入到个体的APC中。将包含目的核酸分子的细胞重新引入到所述受治疗者以致于可针对由该核酸分子编码的肽建立免疫反应。在本文中用于这种免疫接种的核酸分子通常称为“核酸疫苗”。
本发明的多肽、多核苷酸、载体或细胞可以以基本上分离的形式存在。它们可以与不干扰其预期用途的载体或稀释剂混合且仍被认为是基本上分离的。它们还可以是基本上纯化的形式，在这种情况下，它们将通常占蛋白质、多核苷酸、细胞或制剂干重的至少90％，例如至少95％、98％或99％。
抗原递呈细胞(APC)
本发明包括在其表面上递呈本发明的肽的APC群体的方法的体外使用，该APC群体随后可用于治疗。可对已从受治疗者获得的细胞样品在活体外实施该方法。所以以这种方式产生的APC形成可用于通过致耐受治疗或预防桦树过敏的药剂。这些细胞应被个体的免疫系统接受，因为它们衍生自该个体。因此以这种方式产生的细胞向最初获得它们的个体的递送形成了本发明的治疗性实施方式。
制剂和组合物
可将本发明的肽、多核苷酸、载体和细胞单独或组合地向个体提供。可将本发明的每种分子或细胞以分离、基本上分离、纯化或基本上纯化的形式向个体提供。例如，可向个体提供基本不含其它肽的本发明的肽。可选择地，可使用标准的肽偶联剂将组合物中的四种或更多种肽化学偶联在一起以提供包含优选表位的单一的肽。将按照单独的肽来筛选这些肽的嗜碱性粒细胞组胺释放以确定其没有组胺释放。在另一实施方式中，可将组合物中的四种或更多种肽提供为单一多肽链的一部分，即通过重组方法由编码多核苷酸提供。所述四种或更多种肽可邻接地融合，或可选择地被合适的接头隔开。
虽然以原始形式提供根据本发明的肽、多核苷酸或组合物是可能的，但是优选将它们作为药物制剂提供。因此，根据本发明的另一方面，本发明提供了用于通过致耐受作用预防或治疗对桦树过敏的药物制剂，该药物制剂包含根据本发明的组合物、载体或产品以及一种或多种药学可接受的载体或稀释剂和任选地一种或多种其他治疗性成分。在能够与所述制剂的其他成分相容且对其受体无害的意义上，载体必须是‘可接受的’。通常，用于注射的载体和最终制剂是无菌且无热原的。优选地，所述载体或稀释剂是硫代甘油或苯硫基甲烷(thioanisole)。
包含本发明的肽、多核苷酸或细胞的组合物的配制可使用合理水平的技术人员都易于获得的标准药物制剂化学和方法学实施。
例如，包含本发明的一种或多种分子或细胞的组合物可与一种或多种药学可接受的赋形剂或媒介物(vehicle)组合。辅助性物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质及类似物可存在于赋形剂或媒介物中。这些赋形剂、媒介物和辅助性物质通常是在接受所述组合物的个体内不引发免疫反应且可被施用而无过度毒性的药剂。药学可接受的赋形剂包括但不限于液体例如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油、硫代甘油和乙醇。其中还可包括药学可接受的盐，例如无机酸盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐及类似物；和有机酸的盐例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐及类似物。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991) 中可获得对药学可接受的赋形剂、媒介物和辅助性物质的充分讨论。
可将这些组合物以适合弹丸施用或连续施用的形式制备、包装或出售。可将注射组合物以单位剂型例如在安瓿或包含防腐剂的多剂量容器中制备、包装或出售。组合物包括但不限于油性或含水媒介物中的悬浮液、溶液、乳液、糊剂和可植入的缓释制剂或可生物降解的制剂。这些组合物还可包含一种或多种其他成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的组合物的一个实施方式中，活性成分以干燥形式(例如，粉末或颗粒)提供以在肠胃外施用重构的组合物之前用合适的媒介物(例如，无菌无热原的水)重构。可将这些组合物以无菌注射的水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或出售。这种悬浮液或溶液可根据已知技术配制，且除了活性成分以外可包含其他成分例如本文所述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。可使用无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂诸如例如水或1，3-丁二醇制备这些无菌注射制剂。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和固定油例如合成的甘油单酯或甘油二酯。
有用的其他肠胃外可施用的组合物包括包含微晶形式的、脂质体制剂中的或作为可生物降解的聚合物体系的组分的活性成分的那些组合物。用于缓释或植入的组合物可包含药学可接受的聚合或疏水性材料例如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。
可选择地，可将本发明的肽或多核苷酸包封在微粒载体中，或被其吸附或与其结合。合适的微粒载体包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的那些微粒载体，以及衍生自聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)的PLG微颗粒。参见，例如Jeffery等人.(1993)Pharm.Res.10：362-368。还可使用其他微粒体系和聚合物，例如，聚合物例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺以及这些分子的缀合物。
本文提及的任何肽、多核苷酸或细胞的制剂将取决于例如物质的性质和递送方法的因素。任何此类物质可以以多种剂型施用。其可口服(例如，作为片剂、糖锭、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散粉末或颗粒)局部、肠胃外、皮下、通过吸入、静脉内、肌肉内、胸骨内、经皮肤、皮内、舌 下、鼻内、含服或通过输注技术施用。还可以作为栓剂施用所述物质。医师将能够决定每个特定个体所需的施用途径。
本发明的制剂的组合物将包含有效而不引起有害反应的合适浓度的每种肽/多核苷酸/细胞。通常，组合物中每种肽的浓度将在0.03至200nmol/ml的范围内。更优选地在0.3至200nmol/ml、3至180nmol/ml、10至150nmol/ml、50至200nmol/ml或30至120nmol/ml的范围内。所述组合物或制剂应具有大于95％或98％的纯度或至少99％的纯度。
在本发明的一个方面，可将佐剂与本发明的多肽/多核苷酸/细胞组合使用。佐剂优选以足以增强本发明的多肽/多核苷酸/细胞的作用的量施用或反之亦然。佐剂或其他治疗剂可以是增强本发明的分子的作用的剂。例如，其他剂可以是增强对本发明的肽或细胞的反应的免疫调节分子或佐剂。
所以，在一个实施方式中，将本发明的肽、多核苷酸、细胞或组合物与一种或多种其他治疗剂组合用于治疗。所述剂可被单独、同时或顺序施用。其可在相同或不同的组合物中施用。因此，在本发明的方法中，还可用其他治疗剂治疗受治疗者。
因此可配制包含本发明的分子和/或细胞且还有一种或多种其他治疗性分子的组合物。可替代地，本发明的组合物可以与作为组合治疗的一部分的一种或多种其他治疗性组合物同时、顺序地或分别使用。
佐剂的非限制性实例包括维生素D、雷帕霉素和糖皮质激素、类固醇例如地塞米松、氟替卡松、布地奈德、莫米松、倍氯米松、氢化可的松、醋酸可的松、强的松、波尼松龙、甲基波尼松龙、倍他米松和去炎松。优选的糖皮质激素是地塞米松。
治疗方法和待治疗的个体
本发明涉及能够使人类个体对上述过敏原脱敏或耐受且因此用于预防或治疗桦树过敏的肽、多核苷酸、载体和细胞。本发明提供了用于通过致耐受作用预防或治疗桦树过敏的组合物、产品、载体和制剂。本发明还 提供了使桦树过敏个体耐受或脱敏的方法，该方法包括单独或组合地施用上述本发明的多肽/多核苷酸/细胞。
待治疗或被提供本发明的组合物或制剂的个体优选是人。应理解待治疗的个体可能已知对过敏原致敏，处于致敏或疑似致敏的风险之中。可使用本领域熟知的技术和如本文所述的技术测试所述个体的致敏。可选择地，所述个体可具有对桦树过敏的家族史。因为当个体暴露于桦树时可表现出过敏的症状，所以测试该个体对桦树的致敏可能是不必要的。暴露是指接近例如桦树植被或衍生自桦树植被的物质或产品，或含有或包含以上任一种的物质或产品。衍生自桦树植被的物质或产品通常是桦树花粉。接近是指距离上述物品10米或更少、5米或更少、2米或更少、1米或更少或0米。过敏的症状可包括眼睛痒、流鼻涕、呼吸困难、皮肤红痒或皮疹。
待治疗的个体可以是任何年龄。然而，优选地，所述个体可以处于1至90、5至60、10至40岁或更优选地18至35岁的年龄组。
优选地，待治疗的个体来自具有代表高加索人群的频率范围内的MHC等位基因频率的人群。表1中示出了11个常见DRB1等位基因家族的参考人群的等位基因频率(数据来自HLA Facts Book，Parham和Barber)。
表1
| DRB1 | 1 | 3 | 4 | 7 | 8 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 |
| ％ | 6.4 | 14.7 | 15.7 | 8.8 | 3.4 | 8.3 | 3.9 | 14.7 | 2.9 | 17.6 | 2.5 |
| 参考人群％ | 9.4 | 11.1 | 12.8 | 13.2 | 3.7 | 13.4 | 2.3 | 10.2 | 3.2 | 10.7 | 3.6 |
参考频率通过分析报告频率的多个研究获得且所示出的数字是平均值。因此优选地，待治疗的个体来自具有与表1提及的等位基因(例如至少1、2、3、4、5或全部的等位基因)的参考人群相当的MHC等位基因频率的人群，例如在那些数字加上或减去1、2、3、5、10、15或20％的范围内。
优选地个体来自以下人群，其中下列DRB1等位基因的等位基因频率为：
4-至少9％
7-至少10％
11-至少8％。
所述个体可能已患桦树过敏至少2周、1个月、6个月、1年或5年。所述个体可患由所述过敏导致的皮疹、鼻塞、流鼻涕和/或咳嗽。所述个体可能被施用或可能未被施用治疗桦树过敏的其他组合物/化合物。所述个体可居住在具有：
-温带气候、北方气候或北极气候，和/或：
-约3.5至约7.5范围内的典型土壤pH的地理区域内。
所述个体通常在特定季节患桦树花粉过敏。该季节通常对应于桦树的开花季节，其通常是春季，优选是早春(例如北半球的四月至五月)。过敏个体通常对来自桦木(Betula)亚属的任何树木例如垂枝桦或欧洲桦(Betula pubescens)的桦树花粉过敏。
组合免疫治疗
由于许多个体对多种多肽抗原过敏或可能需要对这些多肽抗原脱敏，本发明还提供了使对多种抗原过敏的个体脱敏的方法。在个体体内引发的对第一多肽抗原或过敏原的“耐受”可在所述个体体内产生“致耐受环境”，其中对其他抗原的不当免疫反应可被下调以提供对其他抗原的耐受。
该发现意味着可在极大缩短的时间段内治疗对多种过敏原过敏的个体，并且意味着对某些过敏原(例如，花生)严重过敏而对其他过敏原(例如，猫皮屑)较轻度过敏的个体可受益于其中建立了对较轻度过敏原的耐受并然后使用该致耐受环境提供对其他更严重的过敏原的耐受的治疗。另外，还对无关抗原或过敏原致敏(或以其他形式对其免疫)的患自身免疫病的个体可受益于其中先建立对所述无关抗原或过敏原的耐受并然后使用该致耐受环境提供对与自身免疫病有关的自身抗原的耐受的治疗方案。
因此提供了用于使对上述桦树过敏原和一种或多种其他不同的多肽抗原过敏的桦树过敏个体脱敏的方法。所述方法在第一步骤中需要对所述 个体施用如本文所述的根据本发明的组合物/产品/制剂(主要组合物)且其中以足以产生对桦树过敏原的低反应状态的方式进行施用。一旦对桦树过敏原建立低反应状态，或至少发生朝向脱敏的转变，该方法需要施用包含所述个体将对其致敏的第二种不同多肽抗原的第二组合物。以这种方式进行第二组合物的施用以利用通过使用主要组合物建立的致耐受环境，现在在该环境中建立对第二种不同多肽抗原的耐受是可能的。第二组合物与第一主要组合物或桦树过敏原的较大片段共同施用。“共同施用”是指同时或并行施用，例如，当该二者存在于同一组合物中或在单独的组合物中几乎同时但在不同部位施用时以及在不同的时间在单独的组合物中递送多肽抗原。例如，可以在相同或不同部位递送第一组合物之前或之后递送第二组合物。递送之间的时间安排可从间隔约几秒钟至间隔约几分钟、间隔几小时或甚至间隔几天而变化。此外，可采用不同的递送方法。
优选第二多肽抗原是不同于桦树过敏原的过敏原。当然可以使用已知方法获得和/或产生用于本发明的方法中的合适过敏原。合适过敏原的种类包括但不限于尘螨过敏原、花粉、动物皮屑(尤其是猫皮屑)、草过敏原、霉菌、灰尘、抗生素、针昆虫毒液和各种环境(包括化学品和金属)、药物和食品过敏原。常见的树木过敏原包括来自棉白杨、杨树、白蜡木、桦树、枫树、橡树、榆树、胡桃木和山核桃树的花粉；常见的植物过敏原包括来自艾蒿、豕草、英格兰车前草、酸模(sorrel-dock)和藜的那些过敏原；植物接触性过敏原包括来自毒橡树、毒葛和荨麻的那些过敏原；常见的草过敏原包括黑麦草、梯牧草、约翰逊草、百慕大草、羊茅草和蓝草过敏原；常见过敏原还可从霉菌或真菌获得，例如链格孢属(Alternaria)、镰孢菌属(Fusarium)、着色芽生菌属(Hormodendrum)、曲霉属(Aspergillus)、小多孢菌属(Micropolyspora)、毛霉属(Mucor)和嗜热放线菌属(thermophilic actinomycetes)；表皮过敏原可从室内尘埃或有机粉尘(通常是真菌来源)或从动物来源例如羽毛和狗皮屑获得；常见的食物过敏原包括牛奶和奶酪(乳制品)、蛋、小麦、坚果(例如花生)、海产品(例如，贝壳类)、豌豆、大豆和面筋过敏原；常见的环境过敏原包括金属(镍和金)、化学品(甲醛、三硝基苯酚和松节油)、乳胶、橡胶、纤维(棉或羊毛)、粗麻布、毛发染料、化妆品、清洁剂和香水过敏原；常 见的药物过敏原包括局部麻醉剂和水杨酸盐过敏原；抗生素过敏原包括青霉素、四环素和磺胺过敏原；和常见的昆虫过敏原包括蜜蜂、黄蜂和蚂蚁毒液以及蟑螂萼过敏原。特别充分表征的过敏原包括但不限于主要的猫过敏原Fel d1、蜜蜂毒液磷脂酶A2(PLA)(Akdis等人.(1996)J.Clin.Invest. 98：1676-1683)和多表位重组草过敏原rKBG8.3(Cao等人.(1997)Immunology 90：46-51)。这些过敏原和其他合适的过敏原是可商购的和/或可易于根据已知技术制备成提取物。
优选地，第二多肽过敏原是选自以下过敏原序列和数据登记号(NCBI Entrez登记号)的列表的完整树木花粉过敏原或过敏原片段。NCBI是美国国家生物技术信息中心并且是美国国立卫生研究院的部门。NCBI网站是www.ncbi.nlm.nih.gov/.，可寻求从该网站进入数据库。过敏原序列和数据库登记号(NCBI Entrez登记号)：
橄榄树
橄榄序列
416610 Ole e1
EDIPQPPVSQFHIQGQVYCDTCRAGFITELSEFIPGASLRLQCKDKENGDVTFTEVGYTRAEGLYSMLVERDHKNEFCEITLISSGRKDCNEIPTEGWAKPSLKFKLNTVNGTTRTVNPLGFFKKEALPKCAQVYNKLGMYPPNM
树木过敏原序列(主要是桦树)序列：
130975 Bet v2
MSWQTYVDEHLMCDIDGQASNSLASAIVGHDGSVWAQSSSFPQFKPQEITGIMKDFEEPGHLAPTGLHLGGIKYMVIQGEAGAVIRGKKGSGGITIKKTGQALVFGIYEEPVTPGQCNMVVERLGDYLIDQGL
1942360 Bet v2
MSWQTYVDEHLMCDIDGQGEELAASAIVGHDGSVWAQSSSFPQFKPQEITGIMKDFEEPGHLAPTGLHLGGIKYMVIQGEAGAVIRGKKGSGGITIKKTGQALVFGIYEEPVTPGQCNMVVERLGDYLIDQGL
166953 Bet v2
MSWQTYVDEHLMCDIDGQASNSLASAIVGHDGSVWAQSSSFPQFKPQEITGIMKDFEEPGHLAPTGLHLGGIKYMVIQGEAGAVIRGKKGSGGITIKKTGQALVFGIYEEPVTPGQCNMVVERLGDYLIDQGL
541814 Bet v2
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2488678 Bet v2
MSWQTYVDEHLMCDIDGQASNSLASAIVGHDGSVWAQSSSFPQFKPQEITGIMKDFEEPGHLAPTGLHLGGIKYMVIQGEAGAVIRGKKGSGGITIKKTGQALVFGIYEEPVTPGQCNMVVERLGDYLIDQGL
1829894 Bet v2
MSWQTYVDEHLMCDIDGQASNSLASAIVGHDGSVWAQSSSFPQFKPQEITGIMKDFEEPGHLAPTGLHLGGIKYMVIQGEAGAVIRGKKGSGGITIKKTGQALVFGIYEEPVTPGQCNMVVERLGDYLIDQGL
1168696 Bet v3
MPCSTEAMEKAGHGHASTPRKRSLSNSSFRLRSESLNTLRLRRIFDLFDKNSDGIITVDELSRALNLLGLETDLSELESTVKSFTREGNIGLQFEDFISLHQSLNDSYFAYGGEDEDDNEEDMRKSILSQEEADSFGGFKVFDEDGDGYISARELQMVLGKLGFSEGSEIDRVEKMIVSVDSNRDGRVDFFEFKDMMRSVLVRSS
809536 Bet v4
MADDHPQDKAERERIFKRFDANGDGKISAAELGEALKTLGSITPDEVKHMMAEIDTDGDGFISFQEFTDFGRANRGLLKDVAKIF
543675Que aI-白橡树(Quercus alba)＝橡树(片段)
GVFTXESQETSVIAPAXLFKALFL
543509Car bI-欧洲鹅耳枥(Carpinus betulus)＝鹅耳枥(片段)
GVFNYEAETPSVIPAARLFKSYVLDGDKLIPKVAPQAIXK
543491Aln gI-普通赤杨(Alnus glutinosa)＝赤杨树(片段)
GVFNYEAETPSVIPAARLFKAFILDGDKLLPKVAPEAVSSVENI
1204056核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)
VQCMQVWPPLGLKKFETLSYLPPLS SEQLAKEVDYLLRKNLIPCLEFELEHGFVYREHNRSPGYYDGRYWTMWKLPMFGCNDS SQVLKELEECKKAYPSAFIRIIGFDDK
其他树木过敏原序列(NCBI Entrez登记号)：
131919；128193；585564；1942360；2554672；2392209；2414158；1321728；
1321726；1321724；1321722；1321720；1321718；1321716；1321714；1321712；3015520；2935416；464576；1705843；1168701；1168710；1168709；1168708；1168707；1168706；1168705；1168704；1168703；1168702；1842188；2564228；2564226；2564224；2564222；2564220；2051993；1813891；1536889；534910；534900；534898；1340000；1339998；2149808；66207；2129477；1076249；1076247；629480；481805；81443；1361968；1361967；1361966；1361965；1361964；1361963；1361962；1361961；1361960；1361959；320546；629483；629482；629481；541804；320545；81444；541814：；629484；474911；452742；1834387；298737；298736；1584322；1584321；584320；1542873；1542871；1542869；1542867；1542865；1542863；1542861；1542859；1542857；1483232；1483230；1483228；558561；551640；488605；452746；452744；452740；452738；452736；452734；452732；452730；452728；450885；17938；17927；17925；17921；297538；510951；289331；289329；166953。
杉木序列
493634Cryj IB前体
MDSPCLVALLVFSFVIGSCFSDNPIDSCWRGDSNWAQNRMKLADCAVG FGSSTMGGKGGDLYTVTNSDDDPVNPPGTLRYGATRDRPLWIIFSGNMNIKLKMPMYIAGYKTFDGRGAQVYIGNGGPCVFIKRVSNVIIHGLYLYGCSTSVLGNVLINESFGVEPVHPQDGDALTLRTATNIWIDHNSFSNSSDGLVDVTLTSTGVTISNNLFFNHHKVMSLGHDDAYSDDKSMKVTVAFNQFGPNCGQRMPRARYGLVHVANNNYDPWTIYAIGGSSNPTILSEGNSFTAPNESYKKQVTIRIGCKTSSSCSNWVWQSTQDVFYNGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVENGNATPHLTQNAGVLTCSLSKRC
493632 Cry j IA前体
MDSPCLVALLVLSFVIGSCFSDNPIDSCWRGDSNWAQNRMKLADCAVGFGSSTMGGKGGDLYTVTNSDDDPVNPAPGTLRYGATRDRPLWIIFSGNMNIKLKMPMYIAGYKTFDGRGAQVYIGNGGPCVFIKRVSNVIIHGLHLYGCSTSVLGNVLINESFGVEPVHPQDGDALTLRTATNIWIDHNSFSNSSDGLVDVTLSSTGVTISNNLFFNHHKVMLLGHDDAYSDDKSMKVTVAFNQFGPNCGQRMPRARYGLVHVANNNYDPWTIYAIGGSSNPTILSEGNSFTAPNESYKKQVTIRIGCKTSSSCSNWVWQSTQDVFYNGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVENGNATPQLTKNAGVLTCSLSKRC
1076242Cry j II前体-日本柳杉
MAMKLIAPMAFLAMQLIIMAAAEDQ SAQIMLDSVVEKYLRSNRSLRKVEHSRHDAINIFNVEKYGAVGDGKHDCTEAFSTAWQAACKNPSAMLLVPGSKKFVVNNLFFNGPCQPHFTFKVDGIIAAYQNPASWKNNRIWLQFAKLTGFTLMGKGVIDGQGKQWWAGQCKWVNGREICNDRDRPTAIKFDFSTGLIIQGLKLMNSPEFHLVFGNCEGVKIIGISITAPRDSPNTDGIDIFASKNFHLQKNTIGTGDDCVAIGTGSSNIVIEDLICGPGHGISIGSLGRENSRAEVSYVHVNGAKFIDTQNGLRIKTWQGGSGMASHIIYENVEMINSENPILINQFYCTSASACQNQRSAVQIQDVTYKNIRGTSATAAAIQLKCSDSMPCKDIKLSDISLKLTSGKIASCLNDNANGYFSGHVIPACKNLSPSAKRKESKSHKHPKTVMVENMRAYDKGNRTRILLGSRPPNCTNKCHGCSPCKAKLVIVHRIMPQEYYPQRWICSCHGKIYHP
1076241Cry j II蛋白质-日本柳杉
MAMKFIAPMAFVAMQLIIMAAAEDQSAQIMLDSDIEQYLRSNRSLRKVEHSRHDAINIFNVEKYGAVGDGKHDCTEAFSTAWQAACKKPSAMLLVPGNKKFVVNNLFFNGPCQPHFTFKVDGIIAAYQNPASWKNNRIWLQFAKLTGFTLMGKGVIDGQGKQWWAGQCKWVNGREICNDRDRPTAIKFDFSTGLIIQGLKLMNSPEFHLVFGNCEGVKIIGISITAPRDSPNTDGIDIFASKNFHLQKNTIGTGDDCVAIGTGSSNIVIEDLICGPGHGISIGSLGRENSRAEVSYVHVNGAKFIDTQNGLRIKTWQGGSGMASHIIYENVEMINSENPILINQFYCTSASACQNQRSAVQIQDVTYKNIRGTSATAAAIQLKCSDSMPCKDIKLSDISLKLTSGKIASCLNDNANGYFSGHVIPACKNLSPSAKRKESKSHKHPKTVMVKNMGAYDKGNRTRILLGSRPPNCTNKCHGCSPCKAKLVIVHRIMPQEYYPQRWMC SRHGKIYHP
541803Cry j I前体-日本柳杉
MDSPCLVALLVLSFVIGSCFSDNPIDSCWRGDSNWAQNRMKLADCAVGFGSSTMGGKGGDLYTVTNSDDDPVNPPGTLRYGATRDRPLWIIFSGNMNIKLKMPMYIAGYKTFDGRGAQVYIGNGGPCVFIKRVSNVIIHGLHLYGCSTSVLGNVLINESFGVEPVHPQDGDALTLRTATNIWIDHNSFSNSSDGLVDVTLSSTGVTISNNLFFNHHKVMLLGHDDAYSDDKSMKVTVAFNQFGPNCGQRMPRARYGLVHVANNNYDPWTIYAIGGSSNPTILSEGNSFTAPNESYKKQVTIRIGCKTSSSCSNWVWQSTQDVFYNGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVENGNATPQLTKNAGVLTCSLSKRC
541802Cry j I前体-日本柳杉
MDSPCLVALLVFSFVIGSCFSDNPIDSCWRGDSNWAQNRMKLADCAVGFGSSTMGGKGGDLYTVTNSDDDPVNPAPGTLRYGATRDRPLWIIFSGNMNIKLKMPMYIAGYKTFDGRGAQVYIGNGGPCVFIKRVSNVIIHGLYLYGCSTSVLGNVLINESFGVEPVHPQDGDALTLRTATNIWIDHNSFSNSSDGLVDVTLTSTGVTISNNLFFNHHKVMSLGHDDAYSDDKSMKVTVAFNQFGPNCGQRMPRARYGLVHVANNNYDPWTIYAIGGSSNPTILSEGNSFTAPNESYKKQVTIRIGCKTSSSCSNWVWQSTQDVFYNGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVENGNATPHLTQNAGVLTCSLSKRC
递送方法
一旦被配制，可使用多种已知途径和技术对受治疗者体内递送本发明的组合物。例如，可将组合物以注射溶液、悬浮液或乳液提供并使用常规的针头和注射器或使用液体喷射注射系统或使用贴剂经肠胃外、皮下、表皮、皮内、肌肉内、动脉内、腹膜内、静脉内注射施用。还可将组合物局部递送至皮肤或粘膜组织，例如经鼻、气管内、肠内、直肠或阴道，或将其提供成适合呼吸或肺部施用的细碎喷雾。其他施用方式包括口服施用、栓剂、舌下施用和主动或被动经皮递送技术。
当施用本发明的肽时，优选将所述肽施用到身体内的如下部位：在那里它将具有接触合适的抗原递呈细胞的能力以及在那里它或它们将具有接触个体的T细胞的机会。当施用APC时，优选将所述APC施用到身体内的如下部位：在那里其将具有接触并活化个体的适当T细胞的能力。
递送方案
可通过上述任何合适的方法施用所述肽/多核苷酸/细胞(例如包含多个肽的组合物)。可经验性地确定肽的合适量，但通常在以下提供的范围内。单次施用每种肽可能足以对患者产生有益效果，但应理解如果多于一次地施用所述肽可能是有益的，在这种情况下，典型的施用方案可以是例如每6个月一周一次或两次持续2-4周，或每四至六个月一天一次持续一周。如应理解的，可对患者单独或组合地施用每种肽或多核苷酸或肽和/或多核苷酸的组合。
施用剂量将取决于多个因素，包括组合物的性质、施用途径和施用方案的时间表和时间安排。本发明的分子的合适剂量可在每次施用中多至15μg、多至20μg、多至25μg、多至30μg、多至50μg、多至100μg、多至500μg或更多的量级。合适的剂量可小于15μg，但至少1ng、或至少2ng、或至少5ng、或至少50ng、或至少100ng、或至少500ng、或至少1μg、或至少10μg。对于本发明的某些分子，所使用的剂量可以更高，例 如，多至1mg、多至2mg、多至3mg、多至4mg、多至5mg或更高。可将这些剂量以液体制剂提供，其浓度适合允许通过所选择的途径施用适当的体积。
药盒
本发明还涉及适合用于本发明的治疗中，以药盒的形式包装在容器中的本文所述的组分的组合。这些药盒可包含允许本发明的治疗的一系列组分。例如，药盒可包含本发明的一种或多种不同的肽，多核苷酸和/或细胞，或本发明的一种或多种肽、多核苷酸或细胞以及适合同时施用或顺序施用或单独施用的一种或多种其他治疗剂。所述药盒可任选地包含其他合适的试剂或说明书及类似物。
通过以下实施例阐述了本发明：
实施例1
MHC II类结合搜索
本研究的目的是鉴定对八种最常见的人MHC II类HLA-DRB1*同种异型具有强的亲和力的一组独特的肽。为了鉴定到主要桦树过敏原Bet v1、Bet v2、Bet v3、Bet v4、Bet v6中的结合肽，使用商购的EpiMatrix算法(EpiVax Inc.)进行了计算机模拟分析。这是对来自某序列的肽被容纳在MHC II类HLA-DR分子的结合槽内的潜力的生物信息学分析。
EpiMatrix是一种基于矩阵的算法，该算法根据结合于每个所选择的MHC分子的估计概率而将来自任何多肽序列的具有8个氨基酸重叠的9个氨基酸残基的序列排序。(De Groot等人，AIDS Research and Human Retroviruses 13：539-41(1997))。Schafer等人，Vaccine 16：1880-4(1998)发表了形成矩阵基序的步骤。在该实施例中，评价了对HLA DR1、DR3、DR4、DR7、DR8、DR11、DR13和DR15的结合潜力。通过对蛋白质序列的每9-mer框打分选择推定的MHC配体。通过将所述9-mer序列与已知结合每个MHC等位基因的氨基酸序列的矩阵进行比较来获得该得分。回顾性研究已表明EpiMatrix准确地预测了已公布的MHC配体(Jesdale等人，在 Vaccines′97(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1997)中)。还已证实结合多种MHC分子的肽的成功预测。
将每种过敏原的EpiMatrix数据表示为：
具有对每个等位基因的结合(Z)得分和对八个等位基因的‘击中(hit)’数目(等于或大于所预测的结合肽的前5％的Z得分)的重叠9mer肽数据；或
聚类(cluster)报告，其中将来自分析数据库的多个序列的数据“聚类”以提供对蛋白质的所有变体的结合的概括。“EpiMatrix击中”是指该序列内八个等位基因的高的预测Z结合得分的数目，而“EpiMatrix聚类得分”来源于对聚类的长度标准化的击中数。因此聚类得分是相对于随机肽标准物预测的总MHC结合特性的余量或差量。高于10的聚类得分被认为表示广泛的MHC结合特性。
对Bet v1的已知同种型的全序列进行了EpiMatrix分析：以下列出了其相应的NCBI登记号：
还对由表2中的登记号索引的其他已知Bet v1序列进行了Epimatrix分析。
这些分析鉴定了衍生自被预测为具有良好的MHC II类结合的以上序列的核心肽(和其侧翼序列)。以下在表1和2中示出了这些序列。如所示，鉴定到的许多肽在不同的Bet v1同种型之间是高度保守的。
在表1和2中：
“主序列中的残基”提供了肽在所分析的序列内的位置。核心肽(加下划线的粗体中间氨基酸)定义了在分析期间鉴定到的实际结合序列。稳定性侧翼(N端和C端，非粗体)被包括以与核心序列一起使用并且通常是帮助制造所述肽所需要的。“击中数”是指序列内对所测试的所有MHC类型都具有高的预测结合亲和力的数目。“EpiMatrix聚类得分”来源于对聚类的长 度标准化的击中数。因此聚类得分是相对于随机肽标准物预测的总MHC结合特性的余量或差量。高于10的聚类得分被认为表示广泛的MHC结合特性。
表1-Bet v1
表1A
Bet v1序列：P15494的EpiMatrix分析：预测的多HLADR等位基因结合区域：FNYETETTSVIPAARLFKAFILDGDNLF(4-31)。
表2-Bet v1
实施例2
对Bet v3的已知同种型的全序列(NCBI登记号：P43187)进行了上述EpiMatrix分析。这些分析鉴定到了衍生自以上序列的被预测为具有良好的MHC II类结合的核心肽(和其侧翼序列)。以下在表3中示出了该序列。表3的标题和说明与上述表1相同。
表3-Bet v3
还预测到P43187的残基80至94的序列TVKSFTREGNIGLQF(肽ID NO.P55，SEQ ID NO：36)具有良好的MHC II类结合。此处示出了另外对来自Bet v3的其他桦树过敏原序列的计算机模拟分析。
表3A
Bet v3序列：GI1168696_SPP43187的EpiMatrix分析：预测的多HLADR等位基因结合区域SLNTLRLRRIFDLFDK(35-50)。
实施例3
对Bet v4的已知同种型的全序列(NCBI登记号：Q39419，CAA73147) 进行了上述EpiMatrix分析。这些分析鉴定到了衍生自以上序列的被预测为具有良好的MHC II类结合的核心肽(和其侧翼序列)。以下在表4中示出了这些序列。表4的标题和说明与上述表1相同。
表4-Bet v4
实施例4
对Bet v6的已知同种型的全序列(NCBI登记号：O65002)进行了上述EpiMatrix分析。这些分析鉴定到了衍生自以上序列的被预测为具有良好的MHC II类结合的核心肽(和其侧翼序列)。以下在表5示出了这些序列。表5的标题和说明与上述表1相同。
表5-Bet v6
实施例5
对Bet v7的已知同种型的全序列(NCBI登记号：CAC84116)进行了上述EpiMatrix分析。这些分析鉴定到了衍生自以上序列的被预测为具有良好的MHC II类结合的核心肽(和其侧翼序列)。以下在表6示出了这些序列。表6的标题和说明与上述表1相同。
表6-Bet v7
实施例5A
此处示出了另外对来自Bet v2的其他桦树过敏原序列的计算机模拟分析：
表6A
Bet v2序列GI1942360_PDDB1CQA的EpiMatrix分析：预测的多HLADR等位基因结合区域：SVWAQSSSFPQFKPQEITGIMK(33-54)。
表6R
Bet v2序列GI1942360_PDDB1CQA的EpiMatrix分析：预测的多HLADR等位基因结合区域：IKYMVIQGEAGAVIRGKKGSGG(72-93)。
实施例6
基于在实施例1至5A中进行的分析，设计了表7中所示的下列肽以 在随后的试验中筛选。设计过程包括修饰天然序列以增强溶解度和其他物理化学特征。例如，对于Bir12A，亲本62-77R中的残基表明Bir12A的肽序列对应于亲本序列的残基62至77，另外的R残基添加在C端以提高溶解度。相似地，对于Bir01F、G、H和I，亲本4-18K中的残基表明这些肽序列对应于亲本序列的残基4至18，另外的K残基添加在C端以提高溶解度。
表7
| 肽 | 序列 | 残基 | SEQ.ID.NO |
| BIR01F | FNYETEATSVIPAARK | 4-18K (P43185)Bet v1 | 45 |
| BIR01G | FNYEIEATSVIPAARK | 4-18K (P43179)Bet v1 | 46 |
| BIR01H | FNYEIETTSVIPAARK | 4-18K (P43177)Bet v1 | 47 |
| BIR01I | FNYETETTSVIPAARK | 4-18K (P15494)Bet v1 | 48 |
| BIR02D | PAARMFKAFILDGDKLVPK | 15-33(P43185)Bet v1 | 49 |
| BIR02E | PAARLFKAFILEGDTLIPK | 15-33(P43184)Bet v1 | 50 |
| BIR02G | PAARLFKAFILEGDNLIPK | 15-33(P41380)Bet v1 | 51 |
| BIR02I | PAARMFKAFILD | 15-26(P41385)Bet v1 | 52 |
| BIR02J | PAARMFKAFILEGDKLVPK | BIR02D的D置换成E的变体 | 53 |
| BIR04 | PGTIKKISFPEGFPFKYV | 51-68(P43185)Bet v1 | 54 |
| BIR05 | SPFKYVKERVDEVDHA | 63-78(P43186)Bet v1 | 55 |
| BIR05A | FPFKYVKDRVDEVDHT | 63-78(P43185)Bet v1 | 56 |
| BIR06 | ANFKYSYSMIEGGALGD | 78-94(P43186)Bet v1 | 57 |
| BIR06B | TNFKYSYSVIEGGPVGD | 78-94(P43183)Bet v1 | 58 |
| BIR06D | TNFKYNYSVIEGGPIG | 78-93(P)Bet v1 | 59 |
| BIR07 | SNEIKIVATPDGGSILK | 100-116Bet v1 | 60 |
| BIR07A | SNEIKIVATPNGGSILK | 100-116Bet v1 | 61 |
| BIR07B | SNEIKIVATPQGGSILK | 100-116Bet v1 | 62 |
| BIR07C | SNEIKIVATPEGGSILK | 100-116Bet v1 | 63 |
| BIR07D | SNEIKIVATPGGGSILK | 100-116Bet v1 | 64 |
| BIR08 | GSILKINNKYHTKGD | 112-126Bet v1 | 65 |
| BIR08A | SILKISNKYHTKGD | 113-125(P43186)Bet v1 | 66 |
| BIR09 | ETLLRAVESYLLAHSDAY | 142-159Bet v1 | 67 |
| BIR09A | GETLLRAVESYLLAHS | 141-156Bet v1 | 68 |
| BIR09B | KEMGETLLRAVESYLLAHS | 138-156Bet v1 | 69 |
| BIR09C | KEKGETLLRAVESYLLAHS | 上述的M置换成K的变体 | 70 |
| BIR10 | GSVWAQSSSFPQFK | 33-45(P25816)Bet v 2 | 71 |
| BIR11 | FPQFKPQEITGIMK | 41-54(AAB44348)Bet v2 | 72 |
| BIR12A | PTGMFVAGAKYMVIQGR | 62-77R(P35079)Phl p12 | 73 |
| BIR12B | AKYMVIQGEPGRVIRGK | 70-86(P35079)Phl p12 | 74 |
| BIR13 | GIKYMVIQGEAGAVIRGK | 71-88(AAB44348)Bet v2 | 75 |
| BIR14 | EAGAVIRGKKGSGGIT | 80-95(P25816)Bet v2 | 76 |
| BIR15 | SLNTLRLRRIFDLFDK | 35-50Betv3 | 77 |
| BIR16A | AERERIFKRFDANGEGK | Bet v4的10-26D置换成E的变体 | 78 |
| BIR16B | AERERIFKRFDAGGEGK | 上述的N置换成G的变体 | 79 |
| BIR17 | VKGKLVEKFKGLGVTLLHG | 44-62Betv6 | 80 |
实施例7
体外结合分析
在含水的酸性环境中预筛选被鉴定为可能的MHC II类结合的肽的溶解度并在体外MHC II类结合试验中测试这些肽。
方法
所采用的试验是竞争性MHC II类结合试验，其中分析每个肽替代来自所研究的每个人类MHC II类同种异型的已知对照结合肽(control binder)的能力。用于该研究中的同种异型和对照肽通常是以下示出的那些：
用于体外结合试验中的对照肽
| 同种异型 | 对照肽 | 序列 |
| DRB1*0301 | 结核分枝杆菌/麻风分枝杆菌hsp 652-16 | AKTIAYDEEARRGLE |
| DRB1*1101 | 流感血凝素307-319 | PKYVKQNTLKLAT |
| DRB1*1501 | 人髓鞘碱性蛋白85-99 | ENPVVHFFKNIVTPR |
在竞争试验中分析了来自表1至7的每个肽并筛选了与对照肽相比的相对结合。由于竞争性试验的性质，每个肽的数据被确定为其自身IC50与对照肽的IC50的比。因此，具有与对照肽相等的IC50值的肽具有相同的结合亲和力，而具有小于1的比值的肽具有更高的亲和力且具有大于1的比值的肽具有更低的亲和力。
在水溶液中的溶解度是肽作为有效的治疗剂的重要标准。因此，作为溶解度筛选的结果，将排除在多个结合记录中具有高频率的大疏水氨基酸残基的非常疏水的肽。这是泛宿主性(promiscuous)HLA-DRB1*结合肽的特征。鉴定了与一个或多个MHC II类同种异型结合的肽。预期这些肽将具有通过MHC结构的同源性与未进行测试的相似同种异型结合的能力。
实施例8
下列方法应用于与实施例7中相同的肽。
细胞增殖试验
对PBMC进行细胞增殖试验(对于待测试的所有参数需要140x106个细胞)。通过掺入放射标记化合物3H-胸苷测量增殖。更详细地，将100μl的合适抗原或肽浓度分配到96孔板的合适的孔中。然后将板放到设置为37℃的加湿的5％CO2培养箱中持续最多4小时。室温下在完全培养基中将如上所述分离的PBMC制备成2x106细胞/ml的浓度。然后将100μl的细胞溶液分配到包含抗原/肽的96孔板的每个孔中。然后孵育板6至8天。通过向每个孔中加入10μl的氚化的胸苷的储存溶液(于无血清RPMI培养基中1.85MBq/ml)，用氚化的胸苷溶液对培养物进行脉冲。然后将板放回培养箱持续8和16小时之间。然后使用Canberra Packard FilterMate 196细胞收集器收集培养物。使用合适的β闪烁计数器计数干燥的滤垫。
将来自含有肽的孔的计数与只含有培养基的孔的计数进行统计学上的对比(每组12个孔)。使用非参数Mann-Whitney检验。对所有受治疗者使用相同的统计学检验。只有培养基的孔和肽刺激的孔之间的统计学上显著的差异被认为是肽对PBMC的阳性刺激。
细胞因子释放试验
少量地制备36种肽(约10mg批量大小，非GMP)。按照HPLC每种肽的纯度为至少95％。提前制备含有肽和对照(阴性对照是培养基且阳性对照是葡萄球菌肠毒素B(SEB)25ng/ml和完整桦树花粉过敏原提取物100μg/ml)的96孔培养板并在测定当天之前储存在-20℃。将肽以100μl体积包含浓度为200μg/ml的肽加入到孔中，以致于随后加入100μl细胞将产生100μg/ml的最终试验浓度。
通过Ficoll密度梯度离心从肝素化血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。然后将100μl等份的5x106细胞/ml的PBMC悬液加入到每个孔中并将板放到37℃下的加湿的5％CO2培养箱中持续5天。刺激后，收集培养物上清液(100μl)以通过多重珠试验(multiplex bead assay)来测试。
根据厂家说明对解冻的培养物上清液进行多重细胞因子珠试验(IL-10、IL-13、γ干扰素(IFN-g))。对每个培养物上清液样品进行单次测量。完成多重试验后，通过来自试验中产生的标准曲线的插值 (interpolation)确定单个细胞因子的水平。对于IL-13和IFN-g试验，设定阳性结果为大于100pg/ml或对于IL-10试验为＞4倍的背景。计算在所测试的47个桦树过敏受治疗者中每个肽对三个细胞因子的反应者的数目。表9中总结了IL-13或IFN-g的结果。
表8
％反应者表示其中每个肽诱导高出100pg/ml阈值水平的IL-13或IFN-g的受治疗者的比例。
| 肽 | ％反应者 | 肽 | ％反应者 |
| Bir02J | 48 | Bir15 | 27 |
| Bir01I | 42 | Bir16B | 27 |
| Bir01F | 38 | Bir01H | 25 |
| Bir12B | 38 | Bir06D | 25 |
| Bir01G | 33 | Bir07B | 25 |
| Bir04 | 33 | Bir07D | 25 |
| Bir09 | 33 | Bir10 | 25 |
| Bir02E | 31 | Bir14 | 25 |
| Bir02G | 31 | Bir17 | 25 |
| Bir02I | 31 | Bir05A | 23 |
| Bir07 | 31 | Bir06 | 23 |
| Bir07C | 31 | Bir07A | 23 |
| Bir09A | 31 | Bir13 | 23 |
| Bir09B | 31 | Bir06B | 19 |
| Bir11 | 31 | Bir08A | 19 |
| Bir16A | 31 | Bir05 | 17 |
| Bir02D | 29 | Bir08 | 17 |
| Bir09C | 27 | Bir12A | 17 |
在高比例的受治疗者中引发阳性反应的肽被期望包括在疫苗中。如所示，表现最佳的肽是Bir02J(02系列之首)、Bir 01I(01系列之首)和Bir12B。理想地，任何疫苗的核心应含有这些肽。表现第二好的肽是Bir04和Bir09(09系列之首)，可将它们添加到Bir02J、Bir01I和Bir12B的核心混合物中。表现第三好的肽是Bir07、Bir07C、Bir11和Bir16A。可将来自该组的另外的肽添加到疫苗混合物中以进一步增加覆盖率。Bir15是表现第四好的肽且也可添加到疫苗混合物中。就不同系列的其他肽来讲，Bir01F、01G或01H以该优先顺序是有用的Bir01I变体；Bir02E、02G、02I或最后的02D是有用的Bir02J变体；Bir09A、09B或最后的09C是有用的Bir09变体；且Bir16B是有用的Bir16A变体。因此可能的优选混合物将包括Bir02J、Bir01I、Bir12B、Bir04、Bir09、Bir07C和Bir16A。Bir11和/或Bir15也可以被包括，或可选择地替代Bir07C和/或Bir16A。
就IL-10释放来讲，以上作为用于IL-13或IFN-g产生的前3个肽之一列出的Bir01I在49％的个体中引发IL-10反应。Bir02I也在高比例(43％)的个体中引发IL-10产生。包括强的IL-10引发肽可有助于在接种疫苗后引起耐受。
实施例9-溶解度筛选
A)介绍
表9-1：溶解度测试中所包括的桦树肽
B )
溶解度测试
如附件2中所示，制备包含260mM海藻糖且pH范围跨度为3.0至7.0加用2mM HCI调节的溶液的一系列基质。根据附件1评价9种肽中每一种在每种基质中的溶解度。当最初达到了溶解度，但肽随后从溶液中沉淀出来时，则加入额外量的相关基质以尝试并达到肽的溶解度为约200μM。
表9-2中示出了所使用的桦树参考肽的细节。所有的肽由Bachem AG，Bubendorf，Switzerland制造。
表9-2.桦树肽的细节
C)结果
下表9-3至9-8示出了溶解度筛选的结果：
表3：2mM HCI和260mM二水合海藻糖，pH 2.65
表4a 10mM柠檬酸钠和260mM二水合海藻糖，pH 3.01
表4b10mM柠檬酸钠和260mM二水合海藻糖，pH 3.99
表5：10mM柠檬酸钠和260mM二水合海藻糖，pH 5.02
表6：10mM柠檬酸钠和260mM二水合海藻糖，pH 6.01
表7：10mM磷酸二氢钾和260mM二水合海藻糖，pH 6.03
表8：10mM磷酸二氢钾和260mM二水合海藻糖，pH 7.03
实施例9-附件1
肽溶解度研究
溶解度方法学
制备制剂的媒介物并进行pH测量。
·肽的称重。
-每次评价需要约1mg。
-将材料分配到适合用于随后的溶解度评价的容器中，即透明的玻璃HPLC小瓶(带有螺旋盖)。
·溶解度评价(对于每种基质)。
-如需要的话，加入小份基质(50至100～L)。
-通过目测解释肽溶解度。
-记录加入每小份溶剂后的样品特征描述。
-24小时后重复溶解度视觉评价。
·当24小时后肽从溶液中沉淀出来时，加入额外的缓冲液以产生约0.2mM的最终浓度(每mL200nmol应等于约0.35mg/mL)。
·肽溶解度计算(初步评价)。
-基于所称量的粉末的绝对量。
-使用肽分子质量与肽含量和纯度值确定达到溶解度的摩尔浓度
计算
实施例9-附件2
用于初始溶解度和稳定性筛选的缓冲液
以10mM浓度的缓冲剂制备每种基质。每种缓冲液包含260mM二水合海藻糖(FW 378.3)。
基质的制备
所提供的步骤用于制备100mL的每种缓冲液，但可通过调整量制备可选体积。
·制备柠檬酸钠和磷酸二氢钾的0.1M储存溶液。
·将重量等同于260mM的二水合海藻糖转移到含有70-80mL蒸馏去离子水的合适混合容器中并使之溶解。
·向混合容器中加入10mL的合适0.1M储存缓冲溶液并搅拌。
·视需要通过加入2mM盐酸或0.1M氢氧化钠将基质的pH调节到期望值。
·最后将溶液稀释到100g重量并重新测定pH。
用于初始溶解度和稳定性筛选的缓冲液，以缓冲盐或pH调节剂/pH示出：
2mM HCl和260mM二水合海藻糖/pH 2.65
10mM柠檬酸钠和260mM二水合海藻糖/pH 3.01
10mM柠檬酸钠和260mM二水合海藻糖/pH 3.99
10mM柠檬酸钠和260mM二水合海藻糖/pH 5.02
10mM柠檬酸钠和260mM二水合海藻糖/pH 6.01
10mM磷酸二氢钾和260mM二水合海藻糖/pH 6.03
10mM磷酸二氢钾和260mM二水合海藻糖/pH 7.03
实施例10-组胺释放测定
该测定的目的是鉴定能够活化血液嗜碱性粒细胞(作为组织肥大细胞的替代品)从而导致组胺释放的组合物，所述组胺释放可能在治疗期间产生过敏反应。包含频繁地引发组胺释放的肽的混合物的组合物可能被认为不适合用作疫苗。
组胺释放需要相邻的特异性IgE分子在嗜碱性粒细胞表面上的交联。所评价的肽是小的(长度为11至18个氨基酸)且因此不应具有将使得其能够保持整个分子的IgE结合表位的构象的大的三级结构。另外，溶液中的肽单体即使被IgE结合，也不应能够交联相邻的IgE分子。
评价了来自桦树过敏受治疗者的新鲜外周全血的组胺释放。将外周血嗜碱性粒细胞用作对试验来说不实用的组织肥大细胞的替代品。将血液与基于以上实施例1至9的结果被鉴定为适合的肽的混合物一起体外孵育。特别地，测定了下列混合物：
混合物1-BIR01I、BIR02J、BIR04、BIR12B、BIR16A、BIR07C
混合物2-BIR01I、BIR02J、BIR04、BIR12B、BIR16A、BIR07C、BIR09
混合物3-BIR01I、BIR02J、BIR04、BIR12B、BIR16A、BIR07C、BIR09B
混合物4-BIR01I、BIR02I、BIR04、BIR12B、BIR16A、BIR07C
混合物5-BIR01I、BIR02I、BIR04、BIR12B、BIR16A、BIR07C、BIR09
混合物6-BIR01I、BIR02I、BIR04、BIR12B、BIR16A、BIR07C、BIR09B
测量了每个受治疗者响应于完整桦树过敏原提取物的组胺释放以确认嗜碱性粒细胞致敏。每个试验中包括阳性对照，代表通过冷冻/解冻细胞两次产生的总的组胺释放。通过在仅缓冲液中孵育细胞产生用于自发性组胺释放的阴性对照。
使用Immunotech的组胺释放免疫测定试剂盒根据厂家说明进行该试验。在微量滴定板的孔中用肽混合物、完整过敏原或缓冲液体外刺激血液嗜碱性粒细胞之后，去除上清液且样品中的组胺被转化成酰基组胺。通过竞争性酰基组胺ELISA测试酰基化的样品。
测定肽混合物在5log10范围内(1至10,000ng/ml)引发组胺释放的能力。该测定浓度范围基于治疗期间可能达到的肽的理论体内剂量选择。例如，进入5升血液体积的每种肽的31μg剂量(约3nmol/肽当量)将产生组胺释放试验剂量范围下端的6ng/ml的血液浓度。在相同的浓度范围内使用完整桦树过敏原提取物。
对每种稀释液(dilution)进行单次测量。完成ELISA后，通过ELISA试验中产生的标准曲线的插值确定单独的组胺水平。调整样品的结果以允许稀释。当肽/过敏原制剂的两个或更多个连续稀释引发＞在冷冻解冻的阳性对照中看到的总组胺释放的15％时(＞阳性对照的15％)，或当在所测试的最高浓度(对于肽为10μg/mL)达到＞阳性对照的15％的单一值时，这被认为是“阳性组胺释放”。
在研究期间完成了总共40个组胺释放试验。由于未能达到合适的QC对照，例如，由于在培养基加缓冲液的阴性对照孔中自发释放的不可接受的高水平(＞阳性对照的15％)放弃这些组胺释放试验中的5个试验。
所测试的混合物都表现出良好的组胺释放特性。研究结果总结如下：(WA＝完整过敏原)
| 混合物 | 肽浓度：μg/ml | 平均％组胺释放 | 混合物 | 肽浓度：μg/ml | 平均％组胺释放 |
| 1 | 10 | 1％ | 5 | 10 | 2％ |
| 1 | 1 | 2％ | 5 | 1 | 2％ |
| 1 | 0.1 | 3％ | 5 | 0.1 | 2％ |
| 1 | 0.01 | 3％ | 5 | 0.01 | 2％ |
| 1 | 0.001 | 2％ | 5 | 0.001 | 2％ |
| 2 | 10 | 2％ | 6 | 10 | 3％ |
| 2 | 1 | 2％ | 6 | 1 | 2％ |
| 2 | 0.1 | 3％ | 6 | 0.1 | 1％ |
| 2 | 0.01 | 3％ | 6 | 0.01 | 1％ |
| 2 | 0.001 | 2％ | 6 | 0.001 | 2％ |
| 3 | 10 | 4％ | WA | 10 | 65％ |
| 3 | 1 | 2％ | WA | 1 | 38％ |
| 3 | 0.1 | 3％ | WA | 0.1 | 38％ |
| 3 | 0.01 | 2％ | WA | 0.01 | 42％ |
| 3 | 0.001 | 2％ | WA | 0.001 | 43％ |
| 4 | 10 | 2％ | |||
| 4 | 1 | 2％ | |||
| 4 | 0.1 | 2％ | |||
| 4 | 0.01 | 1％ | |||
| 4 | 0.001 | 1％ |
Claims (26)
1.一种适合用于通过致耐受作用预防或治疗桦树花粉过敏的组合物，包含：
i)多肽SEQ ID NO:74；和
ii)多肽SEQ ID NO:48，或者
多肽SEQ ID NO:45，或者
多肽SEQ ID NO:53，或者
多肽SEQ ID NO:48和多肽SEQ ID NO:53的组合，或者
多肽SEQ ID NO:45和多肽SEQ ID NO:53的组合。
2.根据权利要求1所述的组合物，还包含SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:63中的至少一种其他多肽。
3.根据权利要求1所述的组合物，还包含SEQ ID NO:77或SEQ IDNO:78中的至少一种其他多肽。
4.根据权利要求1所述的组合物，包含：
(a)多肽SEQ ID NO:74；
(b)多肽SEQ ID NO:53；和
(c)多肽SEQ ID NO:48。
5.根据权利要求1所述的组合物，包含多肽SEQ ID NO:74、多肽SEQID NO:53、多肽SEQ ID NO:48、多肽SEQ ID NO:54、多肽SEQ ID NO:67、多肽SEQ ID NO:63和多肽SEQ ID NO:78。
6.根据权利要求1所述的组合物，包含多肽SEQ ID NO:74、多肽SEQID NO:53、多肽SEQ ID NO:48、多肽SEQ ID NO:54、多肽SEQ ID NO:63、多肽SEQ ID NO:78和多肽SEQ ID NO:69。
7.根据权利要求1所述的组合物，包含多肽SEQ ID NO:74、多肽SEQID NO:53、多肽SEQ ID NO:48、多肽SEQ ID NO:54、多肽SEQ ID NO:63和多肽SEQ ID NO:78。
8.根据权利要求1所述的组合物，包含多肽SEQ ID NO:74、多肽SEQID NO:52、多肽SEQ ID NO:48、多肽SEQ ID NO:54、多肽SEQ ID NO:67、多肽SEQ ID NO:63和多肽SEQ ID NO:78。
9.根据权利要求1所述的组合物，包含多肽SEQ ID NO:74、多肽SEQID NO:52、多肽SEQ ID NO:48、多肽SEQ ID NO:54、多肽SEQ ID NO:63、多肽SEQ ID NO:78和多肽SEQ ID NO:69。
10.根据权利要求1所述的组合物，包含多肽SEQ ID NO:74、多肽SEQID NO:52、多肽SEQ ID NO:48、多肽SEQ ID NO:54、多肽SEQ ID NO:63和多肽SEQ ID NO:78。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多肽中的一个或多个具有选自以下的一种或多种修饰：
(i)N端乙酰化；
(ii)C端酰胺化；
(iii)精氨酸和/或赖氨酸的侧链胺上的一个或多个氢被亚甲基取代；
(iv)糖基化；和
(v)磷酸化。
12.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物是包含在0.03至200nmol/ml范围内的浓度的每个多肽的溶液。
13.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物是包含在0.3至200nmol/ml范围内的浓度的每个多肽的溶液。
14.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物是包含在50至200nmol/ml范围内的浓度的每个多肽的溶液。
15.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物是包含在30至120nmol/ml范围内的浓度的每个多肽的溶液。
16.根据权利要求5-10中任一项所述的组合物，所述组合物不包含其他肽。
17.根据权利要求1-15中的任一项所述的组合物，还包含药学可接受的载体或稀释剂。
18.一种用于通过致耐受作用预防或治疗桦树花粉过敏的药物制剂，包含
i)多肽SEQ ID NO:74；和
ii)多肽SEQ ID NO:48，或者
多肽SEQ ID NO:45，或者
多肽SEQ ID NO:53，或者
多肽SEQ ID NO:48和多肽SEQ ID NO:53的组合，或者
多肽SEQ ID NO:45和多肽SEQ ID NO:53的组合；
和药学可接受的载体或稀释剂。
19.根据权利要求18所述的制剂，还包含SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:63中的至少一种其他多肽。
20.根据权利要求18所述的制剂，还包含SEQ ID NO:77或SEQ IDNO:78中的至少一种其他多肽。
21.根据权利要求18所述的制剂，包含：
(a)多肽SEQ ID NO:74；
(b)多肽SEQ ID NO:53；以及
(c)多肽SEQ ID NO:48。
22.根据权利要求18所述的制剂，包含：
(a)多肽SEQ ID NO:74、多肽SEQ ID NO:53、多肽SEQ ID NO:48、多肽SEQ ID NO:54、多肽SEQ ID NO:67、多肽SEQ ID NO:63和多肽SEQID NO:78；或者
(b)多肽SEQ ID NO:74、多肽SEQ ID NO:53、多肽SEQ ID NO:48、多肽SEQ ID NO:54、多肽SEQ ID NO:63、多肽SEQ ID NO:78和多肽SEQID NO:69；或者
(c)多肽SEQ ID NO:74、多肽SEQ ID NO:53、多肽SEQ ID NO:48、多肽SEQ ID NO:54、多肽SEQ ID NO:63和多肽SEQ ID NO:78；或者
(d)多肽SEQ ID NO:74、多肽SEQ ID NO:52、多肽SEQ ID NO:48、多肽SEQ ID NO:54、多肽SEQ ID NO:67、多肽SEQ ID NO:63和多肽SEQID NO:78；或者
(e)多肽SEQ ID NO:74、多肽SEQ ID NO:52、多肽SEQ ID NO:48、多肽SEQ ID NO:54、多肽SEQ ID NO:63、多肽SEQ ID NO:78和多肽SEQID NO:69；或者
(f)多肽SEQ ID NO:74、多肽SEQ ID NO:52、多肽SEQ ID NO:48、多肽SEQ ID NO:54、多肽SEQ ID NO:63和多肽SEQ ID NO:78。
23.根据权利要求18所述的制剂，所述制剂是包含在0.03至200nmol/ml范围内的浓度的每个多肽的溶液。
24.根据权利要求18所述的制剂，其中所述制剂被配制为用于肠胃外施用。
25.根据权利要求18所述的制剂，其中所述制剂被配制为用于皮下施用或皮内施用。
26.根据权利要求1中所述的组合物，另外包含其他多肽过敏原以用于使个体对所述其他多肽过敏原耐受。
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