MX2012009431A

MX2012009431A - Peptidos para vacuna contra alergia a abedul.

Info

Publication number: MX2012009431A
Application number: MX2012009431A
Authority: MX
Inventors: Roderick Peter Hafner; Paul Laidler; Mark Larche; Guy Layton
Original assignee: Circassia Ltd
Priority date: 2010-02-15
Filing date: 2011-02-15
Publication date: 2012-09-12
Also published as: SI2536429T1; NZ602380A; GB201102657D0; EP3056213A1; WO2011098778A2; GB201002559D0; GB2481475B; JP2016166194A; US20130243798A1; KR20120120965A; CN102762225B; DK2536429T3; EA201290792A1; HRP20160481T1; HUE029138T2; CA2789353A1; US20150196635A1; JP5926198B2; JP2013519717A; US9017689B2

Abstract

La presente invención se relaciona con composiciones que comprenden péptidos para evitar o tratar alergia a abedul y en particular con combinaciones óptimas de péptidos para tratar o evitar esta alergia.

Description

PEPTIDOS PARA VACUNA CONTRA ALERGIA A ABEDUL CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con composiciones para evitar o tratar alergia a abedul .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El reconocimiento de antígeno por linfocitos T requiere que las células presentadoras de antígeno (las APC, por sus siglas en inglés) presenten fragmentos (péptidos) de antígeno sobre su superficie celular en asociación con moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (CPH) . Los linfocitos T utilizan sus receptores de linfocitos T específicos para antígeno (los TCR, por sus siglas en inglés) para reconocer los fragmentos de antígeno presentados por las APC. Este reconocimiento actúa como un activador para que el sistema inmunitário genere una gama de respuestas para erradicar el antígeno el cual ha sido reconocido.

El reconocimiento de antígenos externos por el sistema inmunitário de un organismo, tal como el humano en algunos casos puede resultar en enfermedades, conocidas como condiciones atópicas. Los ejemplos de estas últimas son las enfermedades alérgicas que incluyen asma, dermatitis atópica y rinitis alérgica. En el grupo de enfermedades, los linfocitos B generan anticuerpos de la clase IgE (en humanos) los cuales unen antígenos derivados externamente, los cuales REF: 233614 se denominan en este contexto como alérgenos puesto que estas moléculas inducen una respuesta alérgica. La producción de IgE específica de alérgeno depende de los linfocitos T los cuales también son activados (son específicos para) el alérgeno. Los ánticuerpos IgE específicos para alérgeno se unen a la superficie de células tales como basófilos y mastocitos en virtud de la expresión por estas células de los receptores de superficie para IgE.

El reticulado de moléculas de IgE unidas a la superficie por alérgenos resulta en la desgranulación de estas células efectoras lo que provoca liberación de mediadores inflamatorios tales como histamina, 5-hidroxitriptamina y mediadores lipidíeos tales como los sulfuroleucotrienos . Además de los eventos dependientes de IgE, algunas enfermedades alérgicas tales como el asma están caracterizadas por eventos independientes de IgE.

Las enfermedades alérgicas mediadas por IgE actualmente son tratadas con agentes los cuales proporcionan alivio sintomático o prevención. Los ejemplos de estos agentes son antihistamínicos , agonistas ß2 y glucocorticosteroides . Además, algunas enfermedades mediadas por IgE son tratadas por procedimientos de desensibilización que involucran la inyección periódica de los componentes del alérgeno o extractos. Los tratamientos de desensibilización pueden inducir una respuesta IgG que compite con IgE por el alérgeno o pueden inducir linfocitos T supresores específicos que bloquean la síntesis de IgE dirigida contra el alérgeno. Esta forma de tratamiento no siempre es eficaz y presenta el riesgo de provocar efectos secundarios graves, particularmente choque anafiláctico general. Esto puede ser mortal a menos que se reconozca de inmediato y sea tratado con adrenalina. Un tratamiento terapéutico que puede disminuir o eliminar la respuesta alérgica-inmunitaria no deseada a un alérgeno particular, sin alterar la reactividad inmunitaria a otros antígenos extraños o activar una respuesta alérgica en si misma puede ser de gran beneficio para individuos alérgicos.

Los alérgenos de polen se reconocen como una causa principal de enfermedades alérgicas en humanos y animales que incluyen asma, rinitis alérgica y dermatitis alérgica. Por lo menos 10% de la población en los Estados Unidos padece de alergia a polen en diversos momentos y en grados variables . Las proteínas presentes en polen de árboles, en particular en árboles del orden Fágales, por ejemplo abedul, aliso, avellano, carpe y roble son particularmente importantes. De estas especies, en los alérgenos al polen de abedul son los iniciadores más frecuentes de respuestas alérgicas a polen de árbol (Jarolim et al: Allergy 1989; 44 (6) : 385-95) . Por ejemplo, aproximadamente 25% de quienes padecen fiebre de heno responden al polen de abedul. La fiebre de heno es el término común para una forma de alergia estacional caracterizada por estornudos, escurrimiento nasal y ojos con prurito. La alergia al polen de árbol es más problemática durante los meses de primavera con la estación de polen de abedul que típicamente se presenta a mediados de abril (en el hemisferio boreal) . No obstante, algunos tipos relacionados de árboles tales como el aliso y el avellano pueden liberar polen transportado por el aire en épocas tan tempranas como enero (hemisferio boreal) , Esto es seguido por colmo, sauce y fresno en marzo, con roble a fines de abril y a principios de mayo .

Se ha calculado que para los adultos en los Estados Unidos, la fiebre de heno es la quinta de las enfermedades crónicas principales y una causa mayor de ausentismo en el trabajo, lo que resulta en aproximadamente 4 millones de días de trabajo perdidos cada año, lo que resulta en un costo total de más de $700 millones en pérdida total de productividad. Las alergias también son la condición crónica reportada con mayor frecuencia en niños, lo que limita las actividades en más de 40% de ellos. Cada año, las alergias constituyen más de 17 millones de visitas de pacientes ambulatorios a consultorios en los Estados Unidos; las alergias estaciónales tales como la fiebre de heno constituyen más de la mitad de estas consultas por alergia.

Por lo tanto, un tratamiento terapéutico o riesgo de inducir reacciones adversas, tales como anafilaxia, las cuales pueden ser mortales.

Los polipéptidos de la invención se han seleccionado por retener especificidad por linfocitos T y al mismo tiempo ser de un tamaño suficientemente pequeño que no represente estructura terciaria significativa que los pueda obligar a retener la conformación de un epítopo que une IgE de la molécula completa. Los polipéptidos de la invención por lo tanto no inducen reticulado significativo de moléculas IgE específicas adyacentes sobre células tales como mastocitos y basófilos y en consecuencia no provocan liberación significativa de histamina.

Una ventaja de la invención es la capacidad de los péptidos para dirigir de manera amplia moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (CPH) . Los receptores de linfocito T (TCR, por sus siglas en inglés) son altamente variables en cuanto a su especificidad. La variabilidad se genera, al igual que con moléculas de anticuerpo, mediante eventos de recombinación de genes dentro de la célula. Los TCR reconocen antígeno en forma de péptidos cortos unidos a las moléculas codificadas ' por los genes del complejo principal de histocompatibilidad (CPH) . Estos productos de genes son las mismas moléculas que dan lugar a "tipos de tejido" utilizados en transplantes y también se les denomina como moléculas de antígeno leucocitario humano (HLA, por sus preventivo sería de gran beneficio para humanos quienes padecen o quienes se encuentran en riesgo de padecer de alergia a árboles.

SUMARIO DE LA INVENCION Los presentes inventores han descubierto que algunos fragmentos de péptido derivados de alérgenos principales en los pólenes de especies de abedul son útiles para desensibilizar individuos a estos alérgenos. Son particularmente útiles los fragmentos peptídicos derivados de Bet v2, Bet vi, Bet v3 , Bet v4 , Bet v6 y Bet v7 de abedul (nombre de la familia: Betulaceae) .

Los péptidos de la invención se seleccionan como epítopos de linfocitos T que unen CPH clase II mediante el uso de análisis in silico para predecir las interacciones péptido-CPH y los análisis de unión a CPH clase II. Se identificaron por homología epítopos adicionales.

Una dificultad asociada con los enfoques a desensibilización basados en inmunización peptídica se basa en de que manera seleccionar un tamaño y región apropiados del alérgeno como la base para el péptido que va a ser utilizado para inmunización. El tamaño del péptido de elección es crucial. Si el péptido es demasiado pequeño, la vacuna no será eficaz para inducir una respuesta inmunológica . Si los péptidos son demasiado grandes o si el antígeno completo se introduce en un individuo, existe el siglas en inglés) , términos los cuales pueden ser utilizados de manera intercambiable. Las moléculas de CPH individuales presentan surcos de unión de péptidos los cuales, debido a su forma y carga son capaces únicamente de unir un grupo limitado de péptidos. Los péptidos unidos por una molécula de CPH pueden no necesariamente estar unidos por otras moléculas de CPH.

Cuando una molécula de proteína tal como un antígeno o un alérgeno es captada por células presentadoras de antígeno tales como los linfocitos B, células dendríticas, monocitos y macrófagos, la molécula es degradada enzimáticamente dentro de la célula. El proceso de degradación genera fragmentos peptídicos de la molécula los cuales, si son apropiados en cuanto a tamaño, carga y forma se pueden unir después dentro del surco que une el péptido de ciertas moléculas de CPH y posteriormente se presentan en la superficie de las células presentadoras de antígeno. Si los complejos de péptido/CPH están presentes sobre la superficie de células presentadoras de antígeno en números suficientes, pueden entonces activar linfocitos T que presentan los receptores de linfocitos T peptídicos/específieos de CPH apropiados.

Debido a la naturaleza polimórfica del CPH, los individuos en una población exogámica tal como el hombre expresarán diferentes combinaciones de moléculas de CPH sobre sus superficies celulares. Puesto que diferentes moléculas de CPH pueden unir diferentes péptidos de la misma molécula en base en el tamaño, carga y forma del péptido, diferentes individuos mostrarán un repertorio diferente de péptidos unidos a sus moléculas de CPH. La identificación de epítopos peptídicos que unen CPH universales en una población exogámica tal como el hombre es más difícil que en animales endogámicos (tales como algunas cepas de ratones de laboratorio).. En base en la expresión diferencial de CPH entre individuos y las diferencias inherentes en la unión peptídica y la presentación la cual genera esto, es poco probable que un péptido único pueda ser identificado el cual sea de uso para tratamiento de desensibilización en el hombre .

No obstante, los péptidos de la invención proporcionan una cobertura amplia de eficacia sobre la población humana al dirigir moléculas CPH diferentes múltiples. Una vacuna formulada con un péptido de la invención por lo tanto tendría una amplia utilidad. En consecuencia, la presente invención proporciona una combinación adecuada para uso para prevenir o tratar alergia a polen de abedul por tolerización, que comprende: i) por lo menos uno de los polipéptidos de la SEC ID NO: 74 (BIR 12B; AKYMVIQGEPGRVIRGK) , SEC ID NO: 72 (BIR11; FPQFKPQEITGI K) , SEC ID NO: 71 (BIR10; GSVWAQSSSFPQFK) , SEC ID NO: 73 (BIR12A; PTGMFVAGAKYMVIQGR) , SEC ID NO: 75 (BIR13; IKYMVIQGEAGAVIRGK y SEC ID NO: 76 (BIR14; EAGAVIRGKKGSGGIT) o una variante de cualquiera de los anteriores, y ii) por lo menos uno de los polipéptidos de la SEC ID NO: 53 (Bir02J; PAARMFKAFILEGDKLVPK) , SEC ID NO: 48 (BirOlI; FNYETETTSVIPAARK) , SEC ID NO: 54 (Bir04 ; PGTIKKISFPEGFPFKYV) , SEC ID NO: 67 (Bir09; ETLLRAVESYLLAHSDAY) , SEC ID NO: 60 (BIR07; SNEIKIVATPDGGSILK) y SEC ID NO: 63 (Bir07C; SNEIKIVATPGGSILK) o una variante de cualquiera de los anteriores, en donde la variante es: I) un polipéptido más grande de hasta 30 aminoácidos de longitud el cual comprende las secuencias del polipéptido correspondiente especificado en (i) o (ii) , o II) un polipéptido de 9 a 30 aminoácidos de longitud el cual comprende una secuencia que tiene por lo menos 65% de homología con la secuencia del polipéptido correspondiente especificado en (i) o (ii) , secuencia la cual es capaz de tolerizar al polipéptido correspondiente; o III) un polipéptido de longitud de 9 a 30 aminoácidos el cual comprende una secuencia de, o una secuencia que tiene por lo menos 65% de homología con, o por lo menos 9 aminoácidos contiguos de la secuencia del polipéptido correspondiente especificado en (i) o (ii), secuencia la cual de por lo menos 9 aminoácidos contiguos o a una secuencia homologa es capaz de tolerizar con respecto al polipéptido correspondiente.

También se proporciona una composición adecuada para uso en la prevención o tratamiento de alergia a polen de abedul por tolerización que comprende por lo menos tres polipéptidos diferentes que se seleccionan de: (a) Bir 12B (AKYMVIQGEPGRVIRGK) , o una variante del mismo; (b) Bir02J: (PAARMFKAFILEGDKLVPK) , o una variante el mismo; (c) BirOlI: (FNYETETTSVIPAARK) , o una variante del mismo; (d) Bir04: (PGTIKKISFPEGFPFKYV) , o una variante del mismo; (e) Bir09: (ETLLRAVESYLLAHSDAY) , o una variante del mismo; (f) Birl6A (AERERIFKRFDA GEGK) o una variante del mismo; (g)- BIR07: (SNEIKIVATPDGGSILK) o una variante del mismo; (h) Bir07C: (SNEIKIVATPGGSILK) o una variante del mismo; (i) BirOll (FPQFKPQEITGIMK) o una variante del mismo; (j) Birl5 (SLNTLRLRRIFDLFDK) o una variante del mismo; en donde la variante es: I) un polipéptido más largo de hasta 30 aminoácidos de longitud el cual comprende la secuencia del polipéptido correspondiente especificado en los incisos (a) a (j), o II) un polipéptido de 9 a 30 aminoácidos de longitud el cual comprende la secuencia que tiene por lo menos 65% de homología con la secuencia del polipéptido correspondiente especificado en (a) a (j), secuencia la cual es capaz de tolerizar hacia al polipéptido correspondiente; o III) un polipéptido con una longitud de 9 a 30 aminoácidos el cual comprende una secuencia de, o una secuencia que tiene por lo menos 65% de homología, o por lo menos 9 aminoácidos contiguos de la secuencia del polipéptido correspondiente especificado en (a) a (j), secuencia la cual es de por lo menos 9 aminoácidos contiguos o una secuencia homologa que es capaz de tolerizar al polipéptido correspondiente .

BREVE DESCRIPCION DE LAS SECUENCIAS DE POLIPEPTIDOS Las SEC ID NOS: 1 a 80 proporcionan las secuencias de polipéptidos de la invención como se establecen en las tablas 1 a 8. Las SEC ID NOS: 1 a 34 y 45 a 70 corresponden a los péptidos derivados de Bet vi. Las SEC ID NOS: 71 a 76 corresponden a los péptidos derivados de Bet v2. Las SEC ID NOS: 35, 36 y 77 corresponden a los péptidos derivados de Bet v3. Las SEC ID NOS: 37 a 39, 78 y 79 corresponden a los péptidos derivados de Bet v4. Las SEC ID NOS: 40 a 43 y 80 corresponden a los péptidos derivados de Bet v6. La SEC ID NO: 44 corresponde a un péptido derivado de Bet v7.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención se relaciona con péptidos los cuales pueden ser utilizados en tolerización . Estos péptidos pueden comprender, consistir de o consisten esencialmente de las secuencias mostradas en cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80. También se pueden utilizar variantes de estos péptidos específicos. Las variantes pueden comprender, consistir o consisten esencialmente de secuencias las cuales son fragmentos de ya sea cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80 u homólogos de cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80.

La invención también proporciona productos y formulaciones que comprenden los polipéptidos de la invención y composiciones, productos y vectores que comprenden polinucleótidos capaces de expresar los polipéptidos de la invención para uso en prevenir o tratar alergia a abedul por tolerización. La tolerización típicamente será a un epítopo (por ejemplo, un epítopo de linfocito T que une CPH clase II) presente en cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80.

ESPECIES DE ARBOLES Las especies de árboles de la familia Betulaceae, conocida comúnmente como abedul, son las responsables de una alta proporción de alergias a árboles en el mundo, particularmente alergias asociadas con polen de árbol tal como fiebre de heno. Otras especies de árboles importantes incluyen aliso, avellano, carpe y roble.

Los árboles de abedul, por ejemplo abedul plateado {Betula. péndula) , toleran una amplia gama de habitat, con pH de suelo de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 7. Son nativos de la mayor parte de Europa y parte de Asia pero son comunes en todo el mundo, encontrándose en zonas templadas, boreales y árticas del Hemisferio Boreal, especialmente en Canadá y otras partes de América del Norte. Los árboles de abedul típicamente florecen entre abril y mayo (en el Hemisferio Boreal) .

FRAGMENTOS PEPTIDICOS DE ALERGENOS DE POLEN DE ABEDUL Los presentes inventores han identificado las regiones en ciertas proteínas de alérgeno de polen de abedul las cuales comprenden epítopos de linfocitos T que unen CPH clase II. Los presentes inventores también han demostrado que regiones que corresponden a etítopos de linfocitos T de unión clase II CPH dentro de los alérgenos de polen de abedul mayor están altamente conservados entre isoformas diferentes de los alérgenos. En base en esta información, los péptidos derivados de las regiones relevantes de cada proteína son adecuados para evitar o tratar alergia de abedul por tolerización de todas las isoformas de esa proteína.

Los péptidos de la invención se derivan directamente o por homología de alérgenos de proteína Bet v2 (SEC ID NO: 71 a 76), Bet vi (SEC ID NO: 31 a 34 y 45 a 70), Bet v3 (SEC ID NO: 35, 36 y 77), Bet v4 (SEC ID NO: 37 a 39, 78 y 79), Bet v6 (SEC ID NO: 40 a 43 y 80) y Bet v7 (SEC ID NO: 44) . El término "péptido" y "polipéptido" se utilizan de manera intercambiable en la presente. Las proteínas anteriores también se denominan en la presente como "los alérgenos". Las tablas 1 a 7 establecen las secuencias de los péptidos de la invención (SEC ID NOS: 1 a 80), indicando la proteína de orige de la cual se deriva el péptido. La composición de la invención comprende por lo menos un polipéptido que se selecciona de las SEC ID NOS: 1 a 80 o una variante de cualquiera de las mismas.

En otras palabras, la invención proporciona una composición para uso en la prevención o tratamiento de alergia a abedul por tolerización que comprende por lo menos tres, preferiblemente por lo menos cuatro polipéptidos diferentes que se seleccionan de cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80, o una variante de cualquiera de las mismas. Se prefiere que ninguno de los polipéptidos seleccionados sean variantes de la misma secuencia original definida por cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80. En otras palabras, se prefiere que cada uno de los tres o cuatro polipéptidos sean secuencias de línea de base originales diferentes definidas por cualquiera de las SEC ID NOS : 1 a 80 o sean variantes de secuencias de línea de base original diferentes definidas por cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80.

Preferiblemente, la composición comprenderá polipéptidos los cuales se derivan de más de un alérgeno. Por ejemplo, la composición puede comprender uno o más polipéptidos o variantes de los mismos derivados de Bet v2 y uno o más polipéptidos o variantes de los mismos derivados de Bet vi. Los polipéptidos adicionales opcionalmente .se pueden incluir los cuales se derivan de Bet. v3 , Bet v4 , Bet v6 y/o Bet v7. En consecuencia, en algunas modalidades, la composición comprende: i) por lo menos uno de los polipéptidos de la SEC ID NOS: 74, 72, 71, 73, 75 y 76 (las cuales se derivan de Bet v 2) o una variante de cualquiera de los mismos como se define en la presente; y ii) por lo menos uno de los polipéptidos de las SEC ID NO: 1 a 34 y 45 a 70 (las cuales se derivan de Bet v 1) o una variante de cualquiera de los mismos; y opcionalmente iii) por lo menos uno de los polipéptidos de: (a) las SEC ID NOS: 35, 36 y 77 (las cuales se derivan de Bet v 3) o una variante de cualquiera de las mismas como se define en la presente; y/o (b) las SEC ID NOS: 37 a 39, 78 y 79 (las cuales se derivan de Bet v 4) o una variante de cualquiera de las mismas como se define en la presente; y/o (c) las SEC ID NOS: 40 a 43 y 80 (las cuales se derivan de Bet v 6) o una variante de cualquiera de las mismas como se define en la presente; y/o (d) la SEC ID NO: 44 (la cual se derivan de Bet v 7) o una variante de la misma como se define en la presente.

La composición de esta manera puede comprender cualquier combinación de uno o más polipéptidos que se seleccionan del grupo (i), uno o más polipéptidos que se seleccionan del grupo (ii) y opcionalmente uno o más polipéptidos del grupo (iii) (a) a (d) como se define en lo anterior. Los grupos (i), (ii) y (iii) (a) a (d) corresponden a péptidos derivados de alérgenos Bet diferentes, como se describe en lo anterior. La combinación de polipéptidos derivados de alérgenos Bet diferentes puede permitir una cobertura amplia de alergia de polen a abedul observada en la población general al proporcionar epítopos tolerizantes a partir de más de un alérgeno de polen de abedul.

Los ejemplos no limitantes de composiciones seleccionadas como se define en lo anterior incluyen: uno, dos o más polipéptidos que se seleccionan de' la SEC ID NO: 74, 72, 71, 73, 75 y 76 o variantes de cualquiera de las mismas, por lo menos un polipéptido que se selecciona del grupo (ii) o una variante de cualquiera de las mismas, y opcionalmente por lo menos un polipéptido o variante del mismo que se selecciona de los grupos (iii) (a) y/o (b) ; o Uno, dos o más polipéptidos que se seleccionan de la SEC ID NO: 74, 72, 71, 73, 75 y 76 o variantes de cualquiera de los mismos y dos, tres, cuatro o cinco polipéptidos que se selecciona del grupo (ii) o variantes de cualquiera de los mismos, y opcionalmente por lo menos un polipéptido o variante del mismo que se selecciona · de los grupos (iii) (a) y/o (b) ; o Uno, dos o más polipéptidos que se seleccionan de la SEC ID NO: 74, 72, 71, 73, 75 y 76 o variantes de cualquiera de los mismos y dos, tres, cuatro o cinco polipéptidos que se selecciona del grupo (ii) o variantes de cualquiera de los mismos, y por lo menos un polipéptido del grupo (iii) b) .

En una modalidad, la composición comprende: i) por lo menos uno polipéptido de la SEC ID NO: 74 (BIR 12B; AKYMVIQGEPGRVIRGK) , SEC ID NO: 72 (BIR11; FPQFKPQEITGIMK) , SEC ID NO: 71 (BIR10; GSV AQSSSFPQFK) , SEC ID NO: 73 (BIR12A; PTGMFVAGAKYMVIQGR) , SEC ID NO: 75 (BIR13; IKYMVIQGEAGAVIRGK y SEC ID NO: 76 (BIR14 ; EAGAVIRGKKGSGGIT) o una variante de cualquiera de los mismos, y ii) por lo menos uno de los polipéptidos de la SEC ID NO: 53 (Bir02J; PAARMFKAFILEGDKLVPK) , SEC ID NO: 48 (BirOlI; FNYETETTSVIPAARK) , SEC ID NO : 54 (Bir04; PGTIK ISFPEGFPFKYV) , SEC ID NO : 67 (Bir09; ETLLRAVESYLLAHSDAY) , SEC ID NO : 60 (BIR07; SNEIKIVATPDGGSILK) y SEC ID NO: 63 (Bir07C; SNEIKIVATPGGSILK) o una variante de cualquiera de los mismos. En otra modalidad, la composición comprende además por lo menos un polipéptido adicional de (i) o (ii) o una variante del mismo no seleccionada antes. En otra modalidad, la composición comprende además por lo menos un polipéptido adicional de la SEC ID NO: 77 (SLNTLRLRRIFDLFDK) O SEC ID NO: 78 (BÍrl6A (AERERIFKRFDANGEGK) o una variante de cualquiera de los mismos. En una modalidad preferida, la composición comprende: (a) el polipéptido BIR12B AKYMVIQGEPGRVIRGK o una variante del mismo; (b) el polipéptido (Bir02J; PAARMFKAFILEGDKLVPK) , o una variante del mismo; y (c) el polipéptido (BirOlI; FNYETETTSVIPAARK) , o una variante del mismo.

En una modalidad particularmente preferida, la composición comprende el polipéptido BIR12B (AKYMVIQGEPGRVIRGK) o una variante del mismo, el polipéptido Bir02J (PAARMFKAFILEGDKLVPK) , o una variante del mismo; el polipéptido BirOlI (FNYETETTSVIPAARK) , o una variante del mismo, el polipéptido Bir04 (PGTIKKISFPEGFPFKYV) o una variante del mismo, el polipéptido Bir09 (ETLLRAVESYLLAHSDAY) o una variante del mismo, el polipéptido BIR07 (SNEIKIVATPDGGSILK) o una variante del mismo, el polipéptido Bir07C (SNEIKIVATPGGSILK) o una variante del mismo y el polipéptido Birl6A (AERERIFKRFDA GEGK) o una variante del mismo y opcionalmente sin polipéptidos adicionales.

En una modalidad preferida particularmente adicional, la composición comprende el polipéptido BIR12B (AKYMVIQGEPGRVIRGK) o una variante del mismo, el polipéptido Bir02J (PAARMFKAFILEGDKLVPK) , o una variante del mismo; el polipéptido BirOlI (FNYETETTSVIPAARK) , o una variante del mismo, el polipéptido Bir04 (PGTIKKISFPEGFPFKYV) o una variante. del mismo, el polipéptido BIR07C (SNEIKIVATPEGGSILK) o una variante del mismo y el polipéptido Birl6A (AERERIFKRFDANGEGK) o una variante del mismo y el polipéptido Bir09B (KEMGETLLRAVESYLLAHS) o una variante del mismo y opcionalmente sin polipéptidos adicionales.

En una modalidad preferida particularmente adicional, la composición comprende el polipéptido BIR12B (AKYMVIQGEPGRVIRGK) o una variante del mismo, el polipéptido Bir02J (PAARMFKAFILEGDKLVPK), o una variante del mismo; el polipéptido BirOlI (FNYETETTSVIPAARK) , o una variante del mismo, el polipéptido Bir04 (PGTIKKISFPEGFPFKYV) o una variante del mismo, el polipéptido BIR07C (SNEIKIVATPEGGSILK) o una variante del mismo, y el polipéptido Birl6A (AERERIFKRFDANGEGK) o una variante, del mismo y opcionalmente sin polipéptidos adicionales.

La invención también proporciona un producto que comprende un péptido, una variante o composición de acuerdo con la invención. La invención proporciona un producto que comprende : i) por lo menos uno de los polipéptidos de la SEC ID NO: 74 (BIR 12B; AKYMVIQGEPGRVIRGK) , la SEC ID NO: 72 (BIR11; FPQFKPQEITGIMK) , SEC ID NO: 71 (BIR10; GSVWAQSSSFPQFK) , SEC ID NO : 73 (BIR12A; PTGMFVAGAKYMVIQGR) , SEC ID NO: 75 (BIR13; IKYMVIQGEAGAVIRGK y SEC ID NO: 76 (BIR14; EAGAVIRGKKGSGGIT) o una variante de cualquiera de los mismos como se define en (I) a (III), y ii) por lo menos uno de los polipéptidos de la SEC ID NO: 53 (Bir02J; PAARMFKAFILEGDKLVPK) , SEC ID NO: 48 (BirOlI; FNYETETTSVIPAARK) , SEC ID NO: 54 (Bir04 ; PGTIKKISFPEGFPFKYV) , SEC ID NO: 67 (Bir09; ETLLRAVESYLLAHSDAY) , SEC ID NO: 60 (BIR07; SNEIKIVATPDGGSILK) y SEC ID NO: 63 (Bir07C; SNEIKIVATPEGGSILK) o una variante de cualquiera de los mismos como se definen en (I) a (III) , en donde cada polipéptido diferente es para uso simultáneo, separado o secuencial en la prevención o tratamiento de alergia al polen de abedul por tolerización.

Las variantes de los polipéptidos de las SEC ID NOS: 1 a 80 se mencionan en la presente. Una variante de cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80 típicamente será funcional. Por funcional se quiere indicar que la variante es una la cual : (a) comprende o consiste de una secuencia la cual se une a la misma molécula de CPH clase II que el polipéptido correspondiente de las SEC ID NOS: 1 a 80; y/o (b) comprende o consiste de una secuencia la cual es reconocida por un linfocito T el cual reconoce el polipéptido correspondiente de las SEC ID NOS: 1 a 80; y/o (c) es capaz de inducir una respuesta de fase tardía en un individuo con alergia a abedul; y/o (d) es capaz de tolerizar a un individuo al polipéptido correspondiente.

El reconocimiento por un linfocito T se puede probar al medir la capacidad de un péptido o variante para inducir proliferación de linfocitos T en una muestra de linfocitos T. La inducción de una respuesta de fasé tardía también se puede probar de esta manera cuando la muestra de linfocitos T se toma de un individuo con alergia a abedul. Los métodos de prueba de inducción de proliferación de linfocitos T son bien conocidos en el ámbito y uno de estos métodos se ejemplifica en el ejemplo 8.

Las variantes de las SEC ID NOS: 1 a 80 pueden ser fragmentos derivados por corte, por ejemplo por separación de uno o más aminoácidos desde los extremos de la parte N-terminal y/o C-terminal de un polipéptido. Los fragmentos también se pueden generar por uno o más supresiones internas que se proporcionan en el núcleo de 9 aminoácidos que constituye el epítopo de linfocito T que no está sustancialmente bloqueado.

Por ejemplo, una variante de la SEC ID NO: 1 puede comprender un fragmento de la SEC ID NO: 1, es decir, una secuencia más corta. Esta puede incluir una supresión de uno, dos, tres o cuatro aminoácidos del extremo N-terminal de la SEC ID NO: o desde el extremo C-terminal de la SEC ID NO: 1. Estas supresiones se pueden realizar desde ambos extremos de la SEC ID NO: 1, Una variante de la SEC ID NO : 1 puede incluir aminoácidos adicionales (por ejemplo, de la secuencia de la proteína original de la cual se deriva el péptido) que se extiende sobrepasando uno o varios de los extremos de la SEC ID NO : 1. Una variante de un polipéptido típicamente puede tener un polipéptido más grande de hasta 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 aminoácidos de longitud el cual comprende la secuencia del polipéptido correspondiente de las SEC ID NOS: 1 a 80.

Una variante puede incluir una combinación de las supresiones y adiciones descritas en lo anterior. Por ejemplo, se pueden suprimir los aminoácidos de un extremo de la SEC ID NO: 1, pero se pueden agregar aminoácidos adicionales desde la secuencia de proteína original de longitud completa en el otro extremo de la SEC ID NO: 1. La misma discusión de variantes anteriores también se aplica a las SEC ID NOS: 2 a 80.

De manera alternativa una variante puede comprender ser un polipéptido de 9 a 30, 11 a 20 ó 13 a 17 aminoácidos de longitud la cual comprende una secuencia que tiene por lo menos 65% de identidad de secuencia con la secuencia del polipéptido correspondiente de las SEC ID NOS: 1 a 80. De manera más preferible, una variante adecuada puede comprender por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% de identidad de aminoácidos con el polipéptido correspondiente de las SEC ID NOS: 1 a 80.

Una variante puede ser un polipéptido de longitud de 9 a 30, de 11 a 20 ó de 13 a 17 aminoácidos el cual comprende una secuencia de, o una secuencia que tiene por lo menos 65% de identidad de secuencia con por lo menos 9 (por ejemplo por lo menos 10, 11, 12 ó 13) o más aminoácidos contiguos de la secuencia del polipéptido correspondiente de las SEC ID NOS: 1 a 80. Estos aminoácidos contiguos típicamente pueden comprender un epítopo de CPH clase II, por ejemplo el cual se une a cualquiera de las moléculas de CPH mencionadas en la presente.

Un péptido variante puede incluir una o más sustituciones de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80 o un fragmento de la misma. Un péptido variante puede comprender una secuencia que tiene por lo menos 65% de identidad de secuencia con por lo menos 9 o más aminoácidos contiguos en cualquiera de las SEC 5 ID NOS: 1 a 80. De manera más preferible, una variante adecuada puede comprender por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% de identidad de aminoácidos con por lo menos 9 aminoácidos contiguos de conformidad con l'O cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80. Este nivel de identidad de aminoácidos se puede observar en cualquier sección del péptido, aunque preferiblemente es en la región del núcleo. El nivel de identidad de aminoácidos es superior a por lo menos 9 aminoácidos contiguos pero puede ser de por lo menos 15 10, 11, 12, 13, 14, 15 o por lo menos 16 ó 17 aminoácidos, dependiendo del tamaño de los péptidos de comparación. En consecuencia, cualquiera de los niveles de identidad especificados en lo anterior puede ser a través de la longitud completa de la secuencia. 20 En relación con la secuencias de aminoácidos, la "identidad de secuencia" se refiere a secuencias las cuales tienen el valor establecido cuando se determinan utilizando el programa Clustal (Thompson et al, 1994 supra) con los siguientes parámetros: 25 parámetros de alineación pareada - método:- preciso, matriz: PAM, castigo por abertura de separación: 10.00, m castigo por extensión de separación: 0.10; parámetros de alineación múltiple - matriz : PAM, castigo por abertura de separación; 10.00, % de identidad para retraso: 30, castigo por fin de separaciones: activado, distancia de separación de espacio: 0, matriz negativa: no, castigo por extensión de separación: 0.20, castigos por separación específica de residuo: activada, castigos por separación hidrofílica : activada, residuos hidrofílieos : GPSNDQEKR. La identidad de secuencia en un residuo particular se pretende que incluya residuos idénticos los cuales han sido simplemente derivatizados .

Un péptido variante puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o más de hasta 10 sustituciones de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80. Las variantes de sustitución preferiblemente involucran la sustitución de uno o más aminoácidos con el mismo número de aminoácidos y producen sustituciones conservadoras de aminoácidos. Por ejemplo, un aminoácido puede ser sustituido con un aminoácido alternativo que tenga propiedades similares, por ejemplo, otro aminoácido básico, otro aminoácido ácido, otro aminoácido neutro, otro aminoácido cargado, otro aminoácido hidrofílico, otro aminoácido hidrofóbico, otro aminoácido polar, otro aminoácido aromático u otro aminoácido alifático. Algunas propiedades de los 20 aminoácidos principales los cuales se pueden utilizar para seleccionar sustituyentes adecuados son las siguientes: Las variantes adicionales incluyen aquellas en las cuales, en vez de los aminoácidos que se encuentran de manera natural, el aminoácido el cual aparece en la secuencia es un análogo estructural del mismo. Los aminoácidos utilizados en las secuencias también se pueden modificar, por ejemplo etiquetar con la condición de que la función del péptido no se afecte de manera adversa significativamente.

Cuando el péptido tiene una secuencia que varía de la secuencia de cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80 o un fragmento de las mismas, la sustitución puede producirse a través de la longitud completa de la secuencia, dentro de la secuencia de cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80 o fuera de la secuencia de cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80. Por ejemplo, las variaciones descritas en la presente, tales como adiciones, supresiones, sustituciones y modificaciones se pueden presentar dentro de la secuencia de cualquiera de las SEC · ID NOS: 1 a 80. Un peptido variante puede comprender o consistir esencialmente de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80 en las cuales se han realizado una, dos, tres, cuatro o más sustituciones de aminoácidos. Un peptido variante puede comprende un fragmento de la proteína original que es más grande que cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80. En esta modalidad, las variaciones descritas en la presente, tales como la sustituciones y modificaciones se pueden producir dentro y/o fuera de la secuencia de cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80. Por ejemplo, uno o más residuos cargados positivamente se pueden agregar a la parte N-terminal y/o C-terminal de la secuencia nativa del péptido de cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80.

Los péptidos variantes de la invención son de una longitud de 9 a 30 aminoácidos, inclusive. Preferiblemente, pueden ser de 9 a 20, de manera más preferible de 13 a 17 aminoácidos de longitud. Los péptidos pueden tener la misma longitud que las secuencias peptídicas en cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80.

Los péptidos pueden ser derivados químicamente del alérgeno polipeptídico, por ejemplo por separación proteolítica o se pueden derivar en un sentido intelectual del alérgeno polipeptídico, por ejemplo haciendo uso de la secuencia de aminoácidos del alérgeno polipeptídico y sintetizando péptidos basados en la secuencia. Los péptidos se pueden sintetizar utilizando métodos bien conocidos en el ámbito .

El término "péptido" incluye no solo moléculas en las cuales se unen los residuos aminoácidos por enlaces peptídicos (-CO-NH-) sino también moléculas en las cuales se invierte la unión peptídica. Tales peptidomiméticos retro-inversos se pueden elaborar utilizando métodos conocidos en el ámbito, por ejemplo tales como los descritos en Meziere et al (1977) J. Immunol . 159, 3230-3237. Este enfoque involucra elaborar pseudopéptidos que contienen cambios que involucran la estructura principal y no la orientación de las cadenas laterales. Meziere et al (1997) demostraron que, por lo menos para las respuestas de CPH clase II y los linfocitos T cooperadores (hé'lper) , estos pseudopéptidos son útiles. Los péptidos retro- inversos, los cuales contienen enlaces NH-CO en vez de los enlaces peptídicos CO-NH son mucho más resistentes a proteolisis.

De manera similar, el enlace peptídico se puede suministrar con la condición de antemano de que una porción enlazante apropiada la cual retenga la separación entre los átomos de carbono de los residuos aminoácidos se utilice; se prefiere particularmente que la porción enlazante tenga sustancialmente la misma distribución de carga y sustancialmente la misma planaridad que una unión peptídica. También se apreciará que el péptido se puede bloquear convenientemente en su parte N- o C-terminal de manera que ayuda a reducir la susceptibilidad a digestión exoproteolitica . Por ejemplo, el grupo amino N-terminal de los péptidos puede ser protegido al reaccionar con un ácido carboxílico y el grupo carboxilo C-terminal del péptido se puede proteger al reaccionar con una amina. Otros ejemplos de modificaciones incluyen glucosilación y fosforilación. Otra modificación potencial es que el hidrógeno en las aminas de cadena lateral de R o K se puede sustituir con grupos metileno (-NH2? -NH (Me) o -N(Me)2).

Los análogos de los péptidos de acuerdo con la invención también pueden incluir variantes peptídicas que incrementan o disminuyen la vida media del péptido in vivo. Los ejemplos de análogos capaces de aumentar la vida media de los péptidos utilizados de acuerdo con la invención incluyen análogos peptoides de los péptidos, derivados de D-aminoácido de los péptidos e híbridos péptido-peptoide . Una modalidad adicional de los polipéptidos variantes utilizados de acuerdo con la invención comprende formas D-aminoácido del polipéptido. La preparación de los polipéptidos utilizando D-aminoácidos en vez de L-aminoácidos disminuye en gran medida cualquier descomposición no deseada del agente por procedimientos metabólicos normales, disminuye las cantidades de agente que necesitan ser administradas, junto con la frecuencia de su administración.

Los péptidos proporcionados por la presente invención se pueden derivar de variantes de empalme de las proteínas originales codificadas por AR m generadas por empalme alternativo de los transcritos primarios que codifican para las cadenas de proteína originales. Los péptidos también se pueden derivar de mutantes de aminoácidos, variantes de glucosilación y otros derivados covalentes de las proteínas originales las cuales retienen por lo menos la propiedad de unión de CPH de los alérgenos . Los derivados ejemplares incluyen moléculas en donde los péptidos de la invención son modificados covalentemente por sustitución, medios químicos, enzimáticos u otros medios apropiados con üna porción diferente a la del aminoácido como se encuentra de modo natural . Se incluye adicionalmente las variantes que se producen de modo natural de las proteínas originales en diferentes ácaros . Tal variante puede ser codificada por una variante alélica o representar una variante de empalme alternativa.

Las variantes como se describen en lo anterior se pueden preparar durante la síntesis del péptido o por una modificación posterior a la producción o cuando el péptido está en forma recombinante utilizando técnicas conocidas de mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis aleatoria o separación enzimática y/o ligación de ácidos nucleicos.

En cualquiera de las modalidades de la invención, los ejemplos típicos de variantes como se describen en la presente pueden ser como sigue: una variante de BirOlI es. BirOlF: (FNYETEATSVIPAARK) , BirOlG (F YEIEATSVIPAARK) o BirOlH (FNYEIETTSVIPAARK) ; y/o - una variante de Bir02J es Bir02E PAARLFKAFILEGDTLIPK) , Bir02G (PAARLFKAFILEGDNLIPK) , Bir02I (PAARKMFAFILD) o Bir02D (PAARMFKAFILDGDKLVPK) ; y/o una variante de Bir09 se selecciona de Bir09A (GETLLRAVESYLLAHS) , Bir09B (KEMGETLLRAVESYLLASH) o Bir09C (KEKGETLLRAVESYLLAHS) ; y/o una variante de Bisl6B es Birl6A (AERERIFKRFDANGEGK) .

Se entenderá que las SEC ID NOS: 1 a 80 son secuencias polipeptídicas las cuales comprenden un epítopo de linfocito T que consiste de un núcleo de típicamente 9 aminoácidos los cuales son la secuencia esencial mínima necesaria para unión a CPH clase II. No obstante, los polipéptidos de las SEC ID NOS: 1 a 80 también pueden comprender residuos adicionales que flanqueen al núcleo. Por lo tanto los péptidos pueden comprender una región que contiene un epítopo de linfocito T en el cual algunos residuos pueden ser modificados sin afectar la función del epítopo. Así, por ejemplo, las secuencias de cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80 se pueden alterar para mejorar su solubilidad y en consecuencia una variante de cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80 preferiblemente será más soluble que el polipéptido correspondiente de las SEC ID NOS: 1 a 80 bajo condiciones equivalentes. Los métodos para evaluar la solubilidad de péptidos es bien conocida en el ámbito y uno de estos métodos se ejemplifica en el ejemplo 9.

La solubilidad mejorada es ventajosa para la tolerización de sujetos a alérgenos a partir de los cuales se derivan los péptidos de la invención, puesto que la administración de agentes escasamente solubles a sujetos provoca respuestas inflamatorias no tolerizantes , indeseables. La solubilidad de los péptidos puede mejorar al alterar los residuos los cuales flanquean la región que contiene un epítopo de linfocitos T. Un péptido de la invención se puede manipular para que sea más soluble de manera que comprende: i) N-terminal en los residuos del péptido los cuales flanquean un epítopo de linfocitos T: uno a seis aminoácidos contiguos que corresponden a uno a seis aminoácidos contiguos inmediatamente N-terminal a los residuos en la secuencia de la proteína de la cual se deriva el péptido; y/o ii) C-terminal a los residuos del péptido los cuales flanquean un epítopo de linfocitos T: uno a seis aminoácidos contiguos que corresponden a uno a seis aminoácidos contiguos inmediatamente C-terminal respecto a los residuos en la secuencia de la proteína de la cual se derivan los péptidos; y iii) tanto N-terminal como C-terminal respecto a los residuos del péptido los cuales flanquean un epítopo de linfocitos T, por lo menos un aminoácido que se selecciona de arginina, lisina, histidina, glutamato y aspartato.

Opcionalmente , los péptidos adicionalmente se pueden manipular para que sean más solubles de manera que: i) cualquiera de los residuos cisteína en la secuencia nativa del péptido está sustituida con serina o ácido 2 -aminobutírico ; y/o ii) cualquier residuo hidrofóbico de hasta tres aminoácidos en N-terminal o C-terminal de la secuencia nativa del péptido los cuales no están comprendidos en un epítopo de linfocitos T se suprimen; y/o iii) cualquiera dos aminoácidos consecutivos que comprendan la secuencia Asp-Gly en hasta cuatro aminoácidos en la parte N- o C-terminal de la secuencia nativa del péptido, los cuales no estén comprendidos en un epítopo de linfocitos T, se suprimen; y/o (iv) uno o más residuos cargados positivamente se agregan en N- y/o C-terminal de la secuencia nativa del péptido.

Preferiblemente, los péptidos y variantes de la invención son capaces de provocar proliferación de linfocitos T en por lo menos 20% de las muestras de linfocitos T, en donde cada muestra se obtiene de individuos diferentes alérgicos a abedul en la población. Las composiciones de la invención preferiblemente son capaces de inducir proliferación de linfocitos. T en 30% o más de las muestras de linfocitos T obtenidos de un conjunto de individuos alérgicos a abedul. De manera más preferible, las composiciones son capaces de inducir proliferación de linfocitos T en 35% o más, 40% o más, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o 90% o más de las muestras obtenidas de individuos sensibilizados en un conjunto. La cantidad de individuos en un conjunto de individuos alérgicos a abedul puede ser cualquier cantidad mayor de uno, por ejemplo por lo menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 80 o por lo menos 100 individuos.

Se prefiere si los péptidos, variantes y composiciones de la invención provocan proliferación de linfocitos T, pero no llevan a liberación de histamina a partir de preparaciones enriquecidas de basófilos o mastocitos a partir de un individuo sensibilizado. Puede existir cierta liberación de histamina pero preferiblemente los péptidos, variantes y composiciones no provocan que se liberen cantidades significativas de histamina. Una liberación de histamina significativa se puede considerar que es la liberación de 20% o más de la histamina leucocítica disponible total cuando la muestra de leucocitos de un individuo es estimulada con una composición in vitro. Un péptido, variante, o composición de la invención preferiblemente provoca la liberación de menos de 5%, menos de 4%, menos de 3%, menos de 2%, menos de 1% de la histamina leucocítica disponible total cuando una muestra de leucocitos de un individuo se estimula con una composición in vitro. Un individuo normal típicamente tiene un contenido de histamina leucocítica aproximado de 150 ng/107 células.

Los péptidos o variantes adecuados capaces de unirse a los TCR se pueden derivar empíricamente o se pueden seleccionar de acuerdo con criterios conocidos. Dentro de un péptido único existen ciertos residuos los cuales contribuyen a la unión dentro del surco de unión a antígeno de CPH y otros residuos los cuales interactúan con regiones hipervariables del receptor de linfocitos T (Alien et al (1987) Nature 327:713-5).

Dentro de los residuos que contribuyen a la interacción del receptor de linfocitos T se ha demostrado una jerarquía la cual pertenece a la dependencia de activación de linfocitos T ante la sustitución de un residuo peptídico dado. Utilizando péptidos los cuales tienen uno o más residuos de contacto de receptor de linfocitos T sustituidos con un aminoácido diferente, varios grupos han demostrado efectos profundos sobre el proceso de activación de linfocitos T. Evavold & Alien (1991) Nature 252:1308-10) demostraron la disociación de proliferación de linfocitos T y producción de citocina. En este modelo in vitro, un clon de linfocitos T específico para los residuos 64-76 de hemoglobina (en el contexto de I-Ek) fue expuesto con un análogo peptídico en el cual se ha realizado una sustitución conservadora de ácido aspártico para ácido glutámico. Esta sustitución no interfiere significativamente con la capacidad del análogo para unirse a I-Ek.

Después de la exposición in vitro de un clon de linfocitos T con este análogo, no se detectó proliferación, auque se mantuvo la secreción de IL-4, así como la capacidad del clon para ayudar a las respuestas de los linfocitos B. En un estudio subsecuente el mismo grupo demostró la separación de citólisis mediada por linfocitos T con respecto a la producción de citocina. En este caso, la primera permaneció sin alteraciones mientras que la última se deterioró. La eficacia de los ligandos peptídicos alterados in vivo inicialmente se demostró en un modelo murino de EAE (encefalomielitis alérgica experimental) por McDevitt y colaboradores (Smilek et al (1991) Proc . Nati. Acad Sci USA 88:9633-9637). En este modelo, se indujo EAE por inmunización con el péptido encefalitogénico Acl-11 de MBP (por sus siglas en inglés de proteína básica de mielina) . La sustitución en la posición 4 (lisina) con un residuo alanina genera un péptido el cual se une bien a su elemento limitante (?a??ß") pero el cual es no inmunogénico en la cepa PL/JxSJLFl susceptible y el cual además evitó el inicio de EAE cuando se administró ya sea antes o después de la inmunización con el péptido encefalitogénico . De esta manera se pueden identificar residuos en péptidos los cuales afectan la capacidad de los péptidos para inducir diversas funciones de los linfocitos T.

Ventajosamente, se pueden diseñar péptidos que favorezcan la proliferación de linfocitos T y la inducción de de desensibilización. Metzler y Wraith han demostrado capacidad tolerogénica mejorada de péptidos en los cuales se han realizado sustituciones que incrementan la afinidad péptido-CPH (Metzler & Wraith (1993) Int Immunol ~: 1159-65). El hecho de que un ligando peptídico alterado pueda provocar alergia a largo plazo y profunda en linfocitos T clonados se demostró por Sloan-Lancaster et al (1993) Nature 363:156-9.

Las composiciones de la invención son capaces de inducir una respuesta en fase tardía en un individuo que es sensibilizado a los alérgenos. El término "respuesta en fase tardía" incluye el significado que se establece en Allergy and Allergic Diseases (1997) A. B. Kay (Ed.), Blackwell Science, pp . 1113-1130. La respuesta en fase tardía puede ser cualquier respuesta en fase tardía (LPR, por sus siglas en inglés) . Preferiblemente, los péptidos son capaces de inducir una respuesta asmática tardía (LAR, por sus siglas en inglés) o una respuesta rinítica tardía, o una respuesta cutánea en fase tardía o una respuesta ocular en fase tardía. Que un péptido particular puede o no dar lugar a una LPR se puede determinar utilizando métodos bien conocidos en el ámbito; un método preferido particularmente es el que se describe en Cromwell O, Durham SR, Shaw RJ, Mackay J y Kay AB . Provocation tests and measurements of mediators from mast cells and basophils in asthma and allergic rhinitis. En: Handbook of Experimental Inmunology (4) Chapter 127, Editor: Weir DM, Blackwell Scientific Publications , 1986.

De esta manera, preferiblemente los péptidos individuales y las variantes de la invención son capaces de inducir una LPR en un individuo quien ha sido sensibilizado a los alérgenos. Que un individuo haya sido sensibilizado o no a los alérgenos se puede determinar por procedimientos bien conocidos tales como la prueba de picadura cutánea con soluciones de extractos de alérgeno, inducción de los LPR cutánea, antecedentes clínicos, exposición a alérgeno y la prueba radioalergosorbente (RAST, por sus siglas en inglés) para medición de IgE específica para el alérgeno. Si un individuo particular se espera que se beneficie o no del tratamiento se puede determinar por el médico en base, por ejemplo, en estas pruebas.

La desensibilización o tolerización de un individuo a los alérgenos significa inhibición o amortiguamiento de las reacciones tisulares alérgicas inducidas por los alérgenos en individuos sensibilizados apropiadamente. Se ha demostrado que los linfocitos T pueden ser activados selectivamente y después se vuelven inertes o incapaces de responder. Además, el anergizado o eliminación de estos linfocitos T producen desensibilización del paciente para un alérgeno particular. La desensibilización se manifiesta a si misma como una reducción en la respuesta a un alérgeno o un péptido derivado de alérgeno, o preferiblemente una eliminación de la respuesta, sobre una segunda administración y administraciones adicionales del alérgeno o del péptido derivado de alérgeno. La segunda administración se puede realizar después de que ha transcurrido un periodo de tiempo adecuado para permitir que se produzca la desensibilización; preferiblemente este es cualquier período entre un día y varias semanas. Se prefiere un intervalo de aproximadamente dos semanas .

Aunque las composiciones de la invención son capaces de inducir una LPR en un individuo alérgico a abedul, deberá apreciarse que cuando se utiliza una composición para tratar a un paciente es preferible que se utilice una concentración suficientemente baja de la composición de manera que no se produzca una LPR observable pero que la respuesta sea suficiente para desensibilizar parcialmente los linfocitos T de manera que se pueda suministrar la siguiente dosis (preferiblemente más grande) y así sucesivamente. De. esta manera la dosis se incrementará para proporcionar desensibilización completa pero con frecuencia sin incluso inducir una LPR en el paciente. No obstante, la composición o péptido es capaz de hacer esto a una concentración mayor que la que se administra.

Las composiciones de la invención preferiblemente son capaces de inducir una respuesta de fase tardía en 50% o más de un conjunto de individuos alérgicos a abedul de una población. De modo más preferible, las composiciones son capaces de inducir una LPR en 55% o más, 60% o más, 65% o más, 70% o más, 75% o más, 80% o más, 85% o más o 90% o más de los individuos sensibilizados en un conjunto. El hecho de que las composiciones sean o no de inducir una LPR en un cierto porcentaje de un conjunto de sujetos se puede determinar por métodos los cuales son bien conocidos en el ámbito.

ACIDOS NUCLEICOS Y VECTORES Los péptidos individuales que constituyen las composiciones y productos de la invención se pueden administrar directamente o se pueden administrar indirectamente por expresión a partir de una secuencia codificante. Por ejemplo, se puede proporcionar un polinucleótido que codifica para un péptido de la invención, tal como cualquiera de los péptidos descritos en lo anterior.. Un péptido de la invención de esta manera se puede producir a partir o se puede suministrar en forma de un polinucleótido el cual lo codifica y es capaz de expresarlo. Cualquier referencia en la presente al uso, suministro o administración de un péptido de la invención se pretende que incluya el uso, suministro o administración indirectos del péptido vía expresión a partir de un polinucleótido que lo codifica.

En consecuencia, la invención proporciona una composición para uso en la prevención o tratamiento de alergia a abedul por tolerización que comprende por lo menos una secuencia polinucleotídica la cual, cuando se expresa, provoca la producción de una composición de acuerdo con la invención para uso en la prevención o tratamiento de alergia a abedul por tolerización.

Los términos "molécula de ácido nucleico" y "polinucleótido" se utilizan de manera intercambiable en la presente y hacen referencia a una forma polimérica de nucleótidós de cualquier longitud, ya sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de los mismos. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, un fragmento de un gen, un ARN mensajero (AR m) , ADNc, polinucleótidos recombinantes , plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido de la invención se puede proporcionar en forma aislada o purificada. Una secuencia de ácido nucleico la cual "codifica" para un polipéptido seleccionado es una molécula de ácido nucleico la cual es transcrita (en caso de ADN) y traducida (en caso de ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas. Los limites de la secuencia codificante se determinan por el codón de inicio en el extremo 5' (amino) terminal y un codón de detención de traducción en el extremo 3' (carboxi) terminal . Para los propósitos de la invención, tales secuencias de ácido nucleico pueden incluir, pero no se limitan a ADNc, a partir de ARNm viral, procariótico o eucariótico, secuencias genómicas a partir de ADN o ARN viral o procariótico o incluso secuencias de ADN sintéticas. Una secuencia de finalización de transcripción se puede localizar 3' respecto a la secuencia codificante.

Los polinucleótidos de la invención se . pueden sintetizar de acuerdo con métodos bien conocidos en el ámbito, como se describe a modo de ejemplo en Sambrook et al (1931, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press) .

Las moléculas polinucleotídicas de la presente invención se pueden proporcionar en forma de un cásete de expresión el cual incluye secuencias de control unidas operablemente a la secuencia insertada y de esta manera se permite la expresión del péptido de la invención in vivo en un sujeto objetivo. A su vez, estos casetes de expresión típicamente se proporcionan dentro de vectores (por ejemplo plásmidos o vectores virales recombinantes) los cuales son adecuados para uso como reactivos para inmunización de ácido nucleico. El cásete de expresión se puede administrar directamente a un sujeto hospedador. De manera alternativa, un vector que comprende un polinucleótido de la invención se puede administrar a un sujeto hospedador. Preferiblemente el polinucleótido se prepara y/o administra utilizando un vector genético. Un vector adecuado puede ser cualquier vector el cual es capaz de transportar una cantidad suficiente de información genética y permite la expresión de un péptido de la invención.

Los vectores de expresión se construyen habitualmente en el ámbito de biología molecular y por ejemplo pueden involucrar el uso de ADN plasmídico e iniciadores, promotores, mejoradores y otros elementos, apropiados, tales como, por ejemplo, señales de poliadenilación las cuales pueden ser necesarias y las cuales se colocan en la orientación correcta con el fin de permitir la expresión de un péptido de la invención. Otros vectores adecuados serán evidentes para las personas expertas en el ámbito. A modo de ejemplo adicional, a este respecto se hace referencia a Sambrook et al.

Por lo tanto, un polipéptido de la invención se puede proporcionar al suministrar un vector con una célula y permitir que se produzca la transcripción desde del vector. De esta manera, la invención también proporciona un vector para uso en la prevención o tratamiento de alergia al polen de abedul por tolerización que comprende cuatro · o más secuencias polinucleotídicas las cuales codifican para un polipéptido diferente de la invención. Preferiblemente, un polinucleótido de la invención o para uso en la invención en un vector está unido operablemente a una secuencia de control la cual es capaz de proporcionar para la expresión de la secuencia codificante por la célula hospedadora, es decir, el vector es un vector de expresión.

El término "unido operablemente" se refiere a una distribución de elementos en donde los componentes así descritos de esta manera están configurados de manera que realizan su función habitual. De este modo, una secuencia reguladora dada, tal como un promotor unido operablemente a una secuencia de ácido nucleico es capaz de llevar a cabo la expresión de esa secuencia cuando están presentes las enzimas adecuadas. El promotor no necesita estar contiguo a la secuencia en la medida en que funcione para dirigir la expresión de la misma. Así, por ejemplo, las secuencias intermedias no traducidas aunque transcritas pueden estar presentes entre la secuencia promotora y la secuencia de ácido nucleico y la' secuencia promotora aún se puede considerar "unida operablemente" a la secuencia codificante.

En el ámbito se han descrito numerosos sistemas de expresión, cada uno de los cuales habitualmente consiste de un vector que contiene un gen o una secuencia nucleotídica de interés unida operablemente a secuencias de control de expresión. Estas secuencias de control incluyen secuencias promotoras transcripcionales y secuencias de inicio y finalización transcripcionales. Los vectores de la invención pueden ser, por ejemplo, un plásmido, virus o vectores de fago proporcionados con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión del polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor. Un "plásmido" es un vector en forma de un elemento genético extracromosómico . Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables , por ejemplo un gen de resistencia a ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia para un vector micótico. Los vectores se pueden utilizar in vitro, por ejemplo para la producción de ADN o A N o se pueden utilizar para transfectar o transformar una célula hospedadora, por ejemplo, una célula hospedadora de mamífero. Los vectores también se pueden adaptar para ser utilizados in vivo, por ejemplo para permitir la expresión in vivo del polipéptido.

Un "promotor" es una secuencia nucleotídica la cual inicia y regula la transcripción de un polinucleótido que codifica para un polipéptido. Los promotores pueden incluir promotores inducibles (en donde la expresión de una secuencia polinucleotídica unida operablemente al promotor se induce por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), promotores reprimibles (en donde la expresión de una secuencia polinucleotídica unida operablemente al promotor se reprime por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), y promotores constitutivos. Se pretende que el término "promotor" o "elemento de control" incluya regiones promotoras de longitud completa y segmentos funcionales (por ejemplo controles de transcripción o traducción) de estas regiones .

Un polinucleótido, cásete de expresión o vector de acuerdo con la presente invención adicionalmente puede comprender una secuencia de péptido señal. La secuencia de péptido señal generalmente se inserta en unión operable con el promotor de manera que el péptido señal' se expresa y facilita la secreción de un polipéptido codificado por la secuencia codificante también en un enlace operable con el promotor.

Típicamente, una secuencia de péptido señal codifica para un péptido de 10 a 30 aminoácidos, por ejemplo de 15 a 20 aminoácidos. Con frecuencia los aminoácidos son predominantemente hidrofóbicos . En una situación típica, un péptido señal se dirige a una cadena polipeptídica en crecimiento que presenta el péptido señal al retículo endoplasmico de la célula que realiza la expresión. El péptido señal se separa en el retículo endoplásmico, lo que permite la secreción del polipéptido por medio del aparato de Golgi . De esta manera, un péptido de la invención se puede proporcionar a un individuo por expresión a partir de células dentro del individuo y secreción a partir de estas células.

De manera alternativa, los polinucleótidos de la invención se pueden expresar de una manera adecuada para permitir la presentación de un péptido de la invención por una molécula de CPH clase II en la superficie de una célula presentadora de antígeno. Por ejemplo, un polinucleótido, un cásete de expresión o un vector de la invención pueden dirigirse a células presentadoras de antígeno, o la expresión del péptido codificado puede ser estimulada o inducida de modo preferencial en estas células.

En algunas modalidades, el polinucleótido, el cásete de expresión o el vector codificarán para un adyuvante o se proporcionará dé alguna otra manera un adyuvante. De la manera en que se utiliza en la presente, el término "adyuvante" se refiere a cualquier material o composición capaz, de una manera específica o no específica, de alterar, mejorar, dirigir, redirigir, potenciar o iniciar una respuesta inmunitaria específica a antígeno.

Los polinucleótidos de interés pueden ser utilizados in vi tro, ex vivo o in vivo en la elaboración de un péptido de la invención. Los polinucleótidos se pueden administrar o utilizar en la prevención o tratamiento de alergia por tolerización .

Los métodos para el suministro de genes se conocen en el ámbito. Véanse, por ejemplo, las patentes de E.U.A. números 5,399,346; 5,580,859 y 5,589,466. La molécula de ácido nucleico se puede introducir directamente en el sujeto receptor, por ejemplo mediante inyección convencional intramuscular o intradérmica; suministro transdérmico de partículas; inhalación; tópicamente o por modos de administración oral, intranasal o por mucosa. De manera alternativa, la molécula se puede introducir ex vivo en células que han sido extraídas de un sujeto. Por ejemplo, un polinucleótido, un cásete de expresión o un vector de la invención se pueden introducir en APC de un individuo ex vivo. Las células que contienen la molécula de ácido nucleico de interés se reintroducen en el sujeto de manera que se puede generar una respuesta inmunitaria contra el péptido codificado por la molécula de ácido nucleico. Las moléculas de ácido . nucleico utilizadas en la inmunización generalmente se denominan en la presente como "vacunas de ácido nucleico" .

Los polipéptidos , polinucleótidos , vectores o células de la invención pueden estar presentes en forma sustancialmente aislada. Se pueden mezclar con portadores o diluyentes los cuales no interferirán con su uso destinado y aún se considerarán como sustancialmente aisladas. También pueden estar en una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso generalmente comprenderán por lo menos 90%, por ejemplo por lo menos 95%, 98% o 99% de las proteínas, polinucleótidos , células o masa seca de la preparación.

CELULAS PRESENTADORAS DE ANTIGENOS (APC, por sus siglas en inglés) La invención abarca el uso in vitro de un método para producir una población de APC que presenten los péptidos de la invención sobre su superficie, y que posteriormente se puedan utilizar en terapia. Tal método se puede llevar a cabo ex vivo sobre una muestra de células que han sido obtenidas de un paciente. Las APC producidas de esta manera por lo tanto forman un agente farmacéutico que puede ser. utilizado en el tratamiento o prevención de alergia a abedul por tolerización . Las células deben ser aceptadas por el sistema inmunitario del individuo debido a que' se derivan del mismo individuo. El suministro de células que han sido producidas de esta manera al individuo de quien originalmente se obtuvieron, de esta maneras forma una modalidad terapéutica de la invención.

FORMULACIONES Y COMPOSICIONES Los péptidos, polinucleótidos , vectores y células de la invención se pueden proporcionar a un individuo de maneras sola o en combinación. Cada molécula o célula de la invención se puede proporcionar a un individuo de una forma aislada, sustancialmente aislada, purificada o sustancialmente purificada. Por ejemplo, un péptido de la invención se puede proporcionar a un individuo sustancialmente en forma libre de otros péptidos. De manera alternativa, cuatro o más péptidos en la composición se pueden acoplar químicamente uniéndose utilizando reactivos de acoplamiento peptídico estándar, para proporcionar un péptido único que contiene los epítopos preferidos. Los péptidos se pueden cribar para liberación de histamina basofílica para confirmar la carencia de liberación de histamina en lo que respecta a los péptidos individuales. En una modalidad adicional, se pueden proporcionar cuatro o más péptidos en la composición como parte de una cadena polipeptídica única, es decir, por medios recombinantes a partir de un polinucleótido codificante. Los cuatro o más péptidos se pueden fusionar de manera contigua o de manera alternativa se pueden separar por enlazantes apropiados.

Aunque es posible que los péptidos, polinucleótidos o composiciones de acuerdo con la invención se puedan presentar en forma sin tratar, es preferible presentarlos como una formulación farmacéutica. Así, de acuerdo con un aspecto adicional de la invención, la presente invención proporciona una formulación farmacéutica para uso en la prevención o tratamiento de . alergias a abedul por tolerización que comprende una composición, vector o un producto de acuerdo con la invención junto con uno o más portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables y opcionalmente uno o más ingredientes terapéuticos adicionales. Uno o varios de los portadores deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la formulación y no perjudiciales a quien los reciba. Típicamente, los portadores para inyección y la formulación final son estériles y libres de pirógenos. Preferiblemente, el portador o diluyente es tioglicerol o tioanisol .

La formulación de una composición que comprende el péptido, los polinucleótidos o células de la invención se puede llevar a cabo utilizando química de formulación farmacéutica estándar y metodologías la totalidad de las cuales están disponibles fácilmente para experto en el ámbito .

Por ejemplo, las composiciones que contienen una o más moléculas o células de la invención se pueden combinar con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Las sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes , sustancias amortiguadoras de pH y similares pueden estar presentes en el excipiente o vehículo. Estos excipientes, vehículos y sustancias auxiliares generalmente son agentes farmacéuticos que no inducen una respuesta inmunitaria en el individuo quien recibe la composición y las cuales se pueden administrar sin toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a líquidos tales como agua, solución salina, polietilenglicol , ácido hialurónico, glicerol, tioglicerol y etanol . Las sales farmacéuticamente aceptables también se pueden incluir en la presente, por ejemplo sales de ácido mineral tales como clorhidratos, bromhidratos , fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Una discusión exhaustiva de excipientes, vehículos y sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

Las composiciones se pueden preparar, envasar o vender en una forma adecuada para administración en bolo o para administración continua. Las composiciones inyectables se pueden preparar, envasar o vender en forma de dosificación unitaria, tal como en ampolletas o en recipientes de dosis múltiples que contienen un conservador. Las composiciones incluyen pero no se limitan a suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y formulaciones de liberación sostenida o biodegradables implantables . Estas composiciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales que incluyen pero que no se limitan a agentes que mejoren la suspensión, la estabilización o agentes que mejoran la dispersión. En una modalidad de una composición para administración parenteral, el ingrediente activo se proporciona en forma seca (para, por ejemplo, un polvo o gránulos) para reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo agua estéril libre de pirógenos) antes de su administración parenteral de la composición reconstituida. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar, envasar o vender en forma de una suspensión o solución acuosa u oleosa inyectable estéril. Esta suspensión o solución se puede formular de acuerdo con la técnica conocida y puede comprender, además del ingrediente activo, ingredientes adicionales tales ' como los agentes de suministro, agentes humectantes o agentes que mejoren la suspensión descritos en la presente. Las formulaciones inyectables estériles se pueden preparar utilizando un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable tal como agua o 1 , 3 -butanodiol , por ejemplo. Otros diluyentes o disolventes aceptables incluyen, pero no se limitan a solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio y aceites fijos tales como mono- o di-glicéridos sintéticos.

Otras composiciones administrables por vía parenteral las cuales son útiles incluyen aquellas las cuales comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina, en una preparación liposómica o como un componente de sistemas de poliméros biodegradables . Las composiciones para liberación sostenida o implantación pueden comprender materiales poliméricos o hidrofóbicos farmacéuticamente aceptables tales como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero escasamente soluble o una sal escasamente soluble .

De manera alternativa, los péptidos o polinucleótidos de la presente invención pueden estar encapsulados , adsorbidos en o asociados con portadores particulados. Los portadores particulados adecuados incluyen aquellos derivados de polímeros de metacrilato de polimetilo así como micropartículas de PLG derivadas de poli (láctidas) y poli (láctida-co-glicólidas) . Véase, por ejemplo, Jeffrey et al. (1993) Pharm. Res. 10:362-368. Otros sistemas particulados y polímeros también se pueden utilizar, por ejemplo polímeros tales como polilisina, poliarginina, poliornitina , espermina, espermidina así como conjugados de estas moléculas.

La formulación de cualquiera de los péptidos, polinucleótidos o células mencionadas en la presente dependerá de factores tales como la naturaleza de la sustancia y el método de suministro. Cualquiera de estas sustancias se puede administrar en una diversidad de formas de dosificación. Se pueden administrar oralmente (por ejemplo como tabletas, trociscos, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables) tópicamente, por vía parenteral, subcutánea, por inhalación, intravenosa, intramuscular, intraesternal , transdérmica, intradérmica , sublingual, intranasal, bucal o por técnicas de infusión.

La sustancia también se puede administrar como supositorios . Un médico será capaz de determinar la vía de administración adecuada para cada individuo particular.

Las composiciones de formulaciones de la invención comprenderán una concentración adecuada de cada péptido/polinucleótido/célula para que sea eficaz sin provocar reacciones adversas. Típicamente, la concentración de cada péptido en la composición estará en el intervalo de 0.03 a 200 nmol/ml . De manera más preferible, en el intervalo de 0.3 a 200 nmol/ml, de 3 a 180 nmol/ml, de 10 a 150 nmol/ml, 50 a 200 nmol/ml o 30 a 120 nmol/ml. La composición o formulaciones pueden tner una pureza de más de 95% o 98% o una pureza de por lo menos 99%.

En un aspecto de la invención se puede utilizar un adyuvante en combinación con el polipéptido/polinucleótidos/células de la invención. El adyuvante preferiblemente se administra en una cantidad la cual es suficiente para aumentar el efecto del polipéptido/polinucleótidos/células de la invención o viceversa. El adyuvante ú otro agente terapéutico puede ser un agente que potencie los efectos de la molécula de la invención. Por ejemplo, el otro agente puede ser una molécula inmunomoduladora o un adyuvante el cual incremente la respuesta del péptido o la célula de la invención.

En una modalidad, por lo tanto, los péptidos, polinucleótidos, células o composiciones de la invención se utilizan para terapia en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los agentes se pueden administrar por separado, simultáneamente o de modo secuencial. Se pueden administrar en composiciones iguales o diferentes. En consecuencia, en un método de la invención, el sujeto también puede ser tratado con un agente terapéutico adicional.

Por lo tanto, se puede formular una composición la cual comprende una molécula y/o una célula de la invención y también una o más moléculas terapéuticas adicionales. Una composición de la invención puede ser utilizada de manera alternativa de modo simultáneo, secuencial o separado con una o más composiciones terapéuticas adicionales como parte del tratamiento combinado.

Los ejemplos no limitantes de adyuvantes incluyen vitamina D, rapamicina y glucocorticoides esteroides tales como dexametasona, fluticasona, budesonida, mometasona, beclometasona, hidrocortisona, acetato de cortisona, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, betametasona y triamcinolona . Un glucocorticoide preferido es dexametasona.

METODOS TERAPEUTICOS E INDIVIDUOS QUE VAN A SER TRATADOS La presente invención se relaciona con péptidos, polinucleótidos, vectores y células que son capaces de desensibilizar o tolerizar a individuos humanos a los alérgenos descritos en lo anterior y por lo tanto son útiles en la prevención o tratamiento de alergia a abedul . La invención proporciona composiciones, productos, vectores y formulaciones para uso en la prevención o tratamiento de alergia a abedul por tolerización . La invención también proporciona un método de tolerización o desensibilización a personas alérgicas a abedul que comprende administrar, ya sea de maneras única o en combinación de los polipéptidos/polinucleótidos/células de la invención como se describe en lo anterior.

El individuo a ser tratado o al que se le proporciona la composición o la formulación de la invención preferiblemente es un humano. Se apreciará que el individuo al cual va a ser tratado puede ser conocido por estar sensibilizado a los alérgenos, en riesgo de estar sensibilizado o que se sospecha que ha sido sensibilizado. El individuo puede ser analizado para determinar sensibilización utilizando técnicas bien conocidas en el ámbito y como se describe en la presente. De manera alternativa, el individuo puede tener antecedentes familiares de alergia a abedul. Puede no ser necesario realizar la prueba a un individuo para sensibilización a abedul debido a que el individuo puede mostrar síntomas de alergia cuando se expone a abedul. La exposición puede significar proximidad, por ejemplo, a una planta de abedul o una sustancia o producto derivado de una planta de abedul o una sustancia o producto que contenga o que comprenda cualquiera de los anteriores. La sustancia o producto derivado de una planta de abedul típicamente es polen de abedul. Por proximidad se quiere indicar 10 metros o menos, 5 metros o menos, 2 metros o menos, 1 metro o menos o 0 metros de los artículos descritos antes. Los síntomas de alergia pueden incluir ojos rojos, flujo en la nariz, dificultades para respirar, piel con prurito enrojecida o exantema .

El individuo que va a ser tratado puede ser de cualquier edad. No obstante, de modo preferible el individuo puede estar en un grupo de edades de 1 a 90, 5 a 60, 10 a 40 o de manera más preferible 18 a 35 años.

Preferiblemente, el individuo que va a ser tratado es de una población que presenta frecuencias de alelo de CPH dentro del intervalo de frecuencias que son representativas de la población caucásica. Las frecuencias de alelo de la población de referencia para 11 familias de alelo DRB1 comunes se muestran en la tabla 1 (datos de HLA Facts Book, Pharman and Barber) .

TABLA 1 Las frecuencias de referencia se obtienen por análisis de estudios múltiples que reportan frecuencias y las cantidades que se muestran son medias de valores. Preferiblemente, por lo tanto, el individuo que va a ser tratado es de una población que tiene frecuencias de alelo de CPH equivalentes como la población de referencia para los alelos a los que se hace referencia en la tabla 1 (tal como, para al menos, 1, 2, 3, 4, 5 o la totalidad de los alelos), por ejemplo dentro de los intervalos de estas cantidades más o menos 1, 2, 3, 5, 10, 15 o 20%.

Preferiblemente, el individuo es de una población en donde las frecuencias de alelo de los siguientes alelos DRB1 son: 4 - por lo menos 9% 7 - por lo menos 10% 11 - por lo menos 8%.

El individuo puede haber tenido alergia a abedul durante por lo menos 2 semanas, 1 mes, 6 meses, 1 año o 5 años. El individuo pudo haber padecido de exantema, congestión nasal, descargas nasales y/o tos causada por la alergia. Al individuo pueden o no habérsele administrado otras composiciones/compuestos con los cuales se trata alergia de abedul . El individuo puede haber vivido en la región geográfica la cual tiene: un clima templado, boreal o ártico; y/o un pH típico del suelo en el intervalo de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 7.5.

El individuo típicamente padece de alergia a polen de abedul en una estación particular. La estación típicamente corresponde a la estación de fluoración del abedul, la cual típicamente es primavera, preferiblemente inicios de primavera (por ejemplo de abril a mayo en el hemisferio boreal) . El individuo alérgico típicamente es alérgico a polen de abedul de cualquier árbol del subgénero Betula, por ejemplo Betula péndula o Betula pubescens.

IN Ü OTERAPIA DE COMBINACION Dado que muchos individuos son alérgicos o pueden requerir desensibilización a varios antígenos polipeptídicos , la presente invención también proporciona un medio para desensibilizar individuos que son alérgicos a antígenos múltiples. La "tolerancia" inducida en un individuo a un primer antígeno polipeptídico o alérgeno puede crear en el individuo un "ambiente tolerogénico" en donde las respuestas inmunitarias inapropiadas a otros antígenos pueden ser reguladas por disminución con el fin de proporcionar tolerancia a los otros antígenos.

Este hallazgo significa que los individuos alérgicos a alérgenos múltiples pueden ser tratados en un período de tiempo muy reducido y que los individuos gravemente alérgicos a algunos alérgenos (por ejemplo, a cacahuate) pero alérgicos de manera más moderada a otros alérgenos (por ejemplo pelos de gato) se pueden beneficiar de un tratamiento en donde se establece tolerancia al alérgeno más moderado y que este ambiente tolerogénico se utiliza para proporcionar tolerancia a otro alérgeno más extremo. Además, los individuos quienes padecen de un trastorno autoinmune y quienes adicionalmente están sensibilizados (o de alguna otra manera presentan una respuesta inmunitaria) a un antígeno o alérgeno no relacionado se pueden beneficiar de un régimen de tratamiento en donde se establece primero tolerancia a un antígeno o alérgeno no relacionado y después este ambiente tolerogénico se utiliza para proporcionar tolerancia al autoantígeno asociado con el trastorno autoinmune .

Por lo tanto, se proporciona un método para desensibilidad un individuo alérgico a abedul, al alérgeno de abedul, como se describe en lo anterior y uno o más antígenos polipeptídicos diferentes adicionales. En una primera etapa, el método implica administrar al individuo una composición/producto/formulación (composición primaria) de acuerdo con esta invención, como se describe en la presente y en donde la administración se lleva a cabo de una manera suficiente para generar un estado de hiporrespuesta contra el alérgeno de abedul. Una vez que se ha establecido un estado hiporrespuesta hacia el alérgeno de abedul o se ha producido por lo menos un desplazamiento hacia la desensibilización, el método implica la administración de una composición secundaria que comprende un segundo antígeno polipeptídico diferente al cual se va a sensibilizar al individuo. La administración de la composición secundaria se lleva a cabo de manera tal que aprovecha el ambiente tolerogénico establecido por el uso de la composición primaria, en donde ahora es posible establecer tolerancia al segundo antígeno polipeptídico diferente. La composición secundaria se coadministra ya sea con la primera composición primaria o un fragmento más grande del alérgeno de abedul . Mediante el término "coadministrar11 significa ya sea administración simultánea o concurrente, por ejemplo, cuando los dos están presentes en la misma composición o se administran en composiciones separados casi al mismo tiempo pero en sitios diferentes, así como el suministro de antígenos polipeptídicos en composiciones separadas en momentos diferentes. Por ejemplo, la composición secundaria se puede suministrar antes de o subsecuente al suministro de la primera composición en el mismo sitio o en uno diferente. La sincronización entre suministros puede variar desde aproximadamente varios segundos de separación hasta aproximadamente varios minutos de separación, varias horas de separación o incluso varios días de separación. Además se pueden utilizar diferentes métodos de suministro.

El segundo antígeno polipeptídico preferiblemente es un alérgeno diferente del alérgeno de abedul. Los alérgenos adecuados para uso en los métodos de la invención por supuesto se pueden obtener y/o producir utilizando métodos conocidos. Las clases de alérgenos adecuados incluyen, pero no se limitan a otros alérgenos de ácaros del polvo, pólenes, pelos de animales (especialmente pelo de gato), alérgenos de pasto, mohos, polvos, antibióticos, venenos de insectos picadores y una variedad de alérgenos ambientales (que incluyen sustancias químicas y metales) , en medicamentos y en alimentos. Los alérgenos de árbol común incluyen polen de madera de algodón, álamo,, fresno, abedul, alce, roble, olmo, nuez dura y árboles de nuez lisa; los alérgenos de plantas comunes incluyen aquellos de artemisa, ambrosía, plátano inglés, acedera común y cenizo; alérgenos de plantas de contacto incluyen aquellos de roble venenoso, hiedra venenosa y ortigas; alérgenos de pasto común que incluye ballico, fleo, sorgo de Alepo, grama, cañuela y alérgenos de hierba azulada; los alérgenos comunes también se pueden obtener de mohos u hongos tales como Alternaría, Fusarium, Hormodendrum, Aspergillus, Micropolyspora, Mucor y actinomicetos termofílieos ; los alérgenos epidérmicos se pueden obtener de polvos caseros u orgánicos (típicamente de origen micótico) o de fuentes animales tales como plumas y pelo de perro, alérgenos de alimentos comunes incluyen leche y queso (lácteos), huevo, trigo, nueces (por ejemplo cacahuate) , alimentos marinos (por ejemplo shellfish) , chícharo, frijol y alérgenos de gluten; los alérgenos ambientales comunes incluyen metales (níquel y oro) , sustancias químicas (formaldehído, trinitrofenol y turpentina) , látex, caucho, fibra (algodón o lana) , arpillera, colorantes^ para el pelo, cosméticos, alérgenos detergentes y de perfumes; los alérgenos de medicamentos comunes incluyen alérgenos de anestésicos locales y salicilato; los alérgenos de antibióticos incluyen alérgenos de penicilina, tetraciclina y sulfonamida; y los alérgenos de insectos comunes incluyen veneno de abeja, de avispa y de hormigas y alérgenos a cucarachas. Los alérgenos particularmente bien caracterizados incluyen, pero no se limitan a alérgeno de gato mayor Fel di, fosfolipasa A2 (PLA) de veneno de abeja (Akdis et al. (1996) J. Clin. Invest. 98^:1676-1683), y el alérgeno de pasto recombinante multiepitópico rKBG8.3 (Cao et al. (1997) Immunology 90:46-51) . Estos y otros alérgenos adecuados están disponibles comercialmente y/o se pueden preparar fácilmente como extractos siguiendo técnicas conocidas.

Preferiblemente, el segundo alérgeno polipeptídico es un alérgeno de polen de árbol completo o un fragmento de alérgeno que se selecciona de la lista de secuencias de alérgeno y números de acceso de bases de datos (números de acceso NCBI Entrez) siguientes. NCBI es el National Center for Biotechnology information y es una división del US National Institutes of Health. El sitio de la red de NCBI, desde el cual se puede tener acceso a la base de datos se puede buscar y es www.ncbi.nlm.nih.gov/. Las secuencias de alérgeno y los números de acceso de base de datos (números de acceso NCBI Entrez) : Arbol de olivo Secuencias de olivo 416610 Ole e l EDIPQPPVSQFMQGQVYCDTCRAGFITEI^EFIPOASL LQC D ENGDVTFTE VGYTRAEGLYSMLVERDHKNEFCEITLISSGRK C EIPTEGWAKPSLKFKLNT V GTTRT NPLGFFK EALPKCAQVYN lGlvryTPNM Secuencias de alérgeno de árboles (principalmente abedul) 130975 Bet v 2 MSWQTYVDEHLMCD1DGQASNSLASAIVGHDGSVWAQSSSFPQFKPQEITGIM KDFEEPGHLAPTGLHLGGIKYMVIQGEAGAVI GKKGSGGITI TGQALVFGI YEEPVTPGQC MVVERLGDYLEDQGL 1942360 Bet v 2 MSWQTYVDEHLMCDI GQGEELAASAIVGHDGSVWAQSSSFPQFKPQE1TGI K FEEPGHLAPTGLHLGGIKY VIQGEAGAVI G KGSGGÍTIKKTGQAI.VFGI YEEPVTPGQCNMVVERLGDYLEDQGL 166953 Bet v 2 MSWQTYVDEHLMCDIDGQASNSLASAIVGHDGSVWAQSSSFPQFKPQEITGIM FEEPGHLAPTGLHLC JKYMVIQGEAGAVIRGKKGSGGITI KTGQALVFGI YEEPVTPGQCNMVVERLGDYLIDQGL 541814 Bet v 2 MSWQTYVDEHLMCDIDGQASNSLASAIVGHDGSVWAQSSSFPQFKPQEITGIM KDFEEPGHLAPTGLBLGGIKYMVIQGEAGAVIRGKKGSGGITTKKTGQALVFGI YEEPVTPGQCNMVVERLGDYLIDQGL 2488678 Betv 2 MSWQTYVDEI^MCDIDGQASNSLASArVGHDGSVWAQSSSFPQFKPQEITGnví DFEEPGFQLAPTGLHLGGIKYMVlQGEAGAVn GK GSGGITIKKTGQALVFGI YEEPVTPGQCNMVVERLGDYLIDQGL 1829894 Bet v 2 MSWQTYVDEHLMCDIDGQASNSLASAIVGHDGSVWAQSSáFPQF PQEITGIM DFEEPGHLAPTGLHLGGIKYMVIQGEAGAmGKKGSGGrriKKTGQALVFGI YEEPVTPGQCNMVVERLGDYLIDQGL 1168696 Bet v 3 MPCSTEAME AGHGHASTPRKRSLSNSS IITVDELSR^NLLGLETDLSEIJEST Sm YGGEDEDD^EDMRKSILSQEEADSFGGFKVFDEDGDGYISARELQ VLGKL GFSEGSEmRVE I^SVDSNIU)GRVDFFEFKl>MMRSVLVRSS 809536 Bet v 4 MADDHPQDKAERERIFKRFDANGDGKISAAELGEALKTLGSITPDEVKHMMA EIDTDGDGFISFQEFTDFGRANRGLLKDVAKIF 543675 Que a I - Quercus alba = árboles de roble (fragmento) GVFTXESQETSVIAPAXLFKALFL 543509 Car b I - Carpinus betulus = árboles de carpe (fragmento) GVFNYEAETPSVIPAARLFKSYVLDGDKLIPKVAPQAIXK 543491 Aln g I Alnus glutinosa = árboles de aliso (fragmento) GVFNYEAETPSVEPAARLFKAFILDGDKLLPKVAPEAVSSVENI 1204056 Rubisco VQCMQVWPPLGLKKFETLSYLPPLSSEQLAKEVDYLLRK LIPCLEFELEHGFV YREHNRSPGYYDGRYWTMWKLPMFGCNDSSQVLKELEECKAYPSAFIRIIGF DDK Las secuencias de alérgenos de árboles adicionales (número de acceso NCBI entrez) : 131919; 128193; 585564; 1942360; 2554672; 2392209; 2414158; 1321728; 1321726; 1321724; 1321722; 1321720; 1321718; 1321716; 1321714; 1321712; 3015520; 2935416; 464576; 1705843; 1168701; 1168710; 1168709; 1168708; 1168707; 1168706; 1168705; 1168704; 1168703; 1168702; 1842188; 2564228; "2564226; 2564224; 2564222; 2564220; 2051993; 1813891; 1536889; 534910; 534900; 534898; 1340000; 1339998; 2149808; 66207; 2129477; 1076249; 1076247; 629480; 481805; 81443; 1361968; 1361967; 1361966; 1361965; 1361964; 1361963; 1361962; 1361961; 1361960; 1361959; 320546; 629483; 629482; 629481; 541804; 320545; 81444; 541814; 629484; 474911; 452742; 1834387; 298737; 298736; 1584322; 1584321; 584320; 1542873; 1542871; 1542869; 1542867; 1542865; 1542863; 1542861; 1542859; 1542857; 1483232; 1483230; 1483228; 558561; 551640; 488605; 452746; 452744; 452740; 452738; 452736; 452734; 452732; 452730; 452728; 450885; 17938; 17927; 17925; 17921; 297538; 510951; 289331; 289329; 166953.

Secuencias de cedro precursor 493634 Cry j IB MDSPCLVALLVFSFVIGSCFSDNPIDSCW GDSNWAQNRM LADCAVGFGSST MGG GGDLYTVTNSDDDPVNPPGTLRYGATRDRPLWIIFSGN NIKXK^MY IAGYKTFDGRGAQVYIGNGGPCVFIKRVSNVIIHGLYLYGCSTSVLGNVLINESF GVEPVHPQDGDALTLRTAT IWIDHNSFSNSSDGLVDVTLTSTGVTISNNLFFN HHKVMSLGHDDAYSDDKSMKVTTVAJFNQFGPNCGQRMPRARYGLVHVANNN YDPWTIYAIGGSSNPTILSEGNSFTAPNESYKKQVTIRIGCKTSSSCSNWVWQST QDWY GAYFVSSGKYEGGNIYTTKEAF VF^GNATPHLTQNAGV^^ RC precursor 493632 Cry j IA ^SPCLVAIiVLSFVIGSCFSDWroSCWRGDSNWAQNRMKLADCAVGFGSS TMGGKGGDLYTVTOSDDDPVNPAPGTLRYGATRD ÍLVvaiFSGNMNTKL MP MmGYKTFDGRGAQVYIGNGGPCWKRVS VimGLHLYGCSTSVLGNVLIN ESFGVEPVHPQDGDALTLRTATOIW1DHNSFS FNHHKVMLLGHDDAYSDDKS KVTVAFNQFGPNCGQR PRARYGLVHVAN NNTYDPWTrVAIGGSSOTTTLSEGNSFTAP QSTQD YNGAYFVSSGKYEGG^??TKKEAFN^ LS RC precursor 1076242 Cry J II - cedro Japonés MAMKIIAPMAFLAMQLDMAAAEDQSAQ HDAINIFNVE YGAVGDGKHDCTEAPSTAW NLFFNGPCQPHFTFKVDGIIAAYQNPASWK NRIWLQFAj TGFTLM GQG QW AGQC WVNGREICNDRDRPTAlKFDFSTGLnQGL LMNSPEFHL WGNCEGViaiGISrTAPRDSPNTDGroiFASKNFHLQI NTIGTGDDCVAIGTGSS NIVIEDLICGPGHGISIGSLGRENSRAEVSYVHWGAK^^ GMASHirre V^MI SENPmi QFYCTSASACQNQRSAVQIQDVTYKNm TAAAIQL CSDS IPC DIKLSDISLKLTSGmSCLNDNANGYFSGHVIPACKÍÍL SPSAKJKESKSHKHP TVX VE RAYDKGmTRILLGSRPPNCTN CHGCSP C AKLVrVHR PQEYYPQRWlCSCHGKIYHP proteína 1076241 Cry J II - cedro Japonés MAMKFIAPMAF AMQUINl^AAEDQSAQIMLDSDrEQYL SNRSLRKVEHSRH DAINnWEKYGAVGDGIOlDCTEAFSTAWQAAC KPSAMLLVPGNKI^ NLFFNGPCQPHFTF VDGIIAAYQNPASW NRIWLQFAKLTGFTLMG GVro GQGKQWWAGQCKWWGREIC TORDRP AIKFDFSTGLnQGLKLMNSPEFHL VFGNCEGV nGISITAPRDSP>rriXroiFASK>^HLQ nGTGDDCVAIGTGSS NTV1EDLICGPGHGISIGSLGRENSRAEVSYVHVNGAKFIDTQNGLRIKTWQGGS G^ÍASmIYE^G^MINSEWILINQFYCTSASACQNQRSAVQIQDVTYKNIRGTSA TAAAIQLKCSDSMPCKDKl^DISLKLTSGK^ SPSAKi KESKJSHKHPKTV VXNnvíGATO CKAKLVIVHR1 PQEYYPQRWMCSRHG ÍYHP precursor 541803 Cry J I - cedro Japonés MDSPCLVALLVLSFVIGSCFSDNProSCWGDSN AQNRMKLADCAVGFGSS TMGGKGGDLYTVTNSDDDPVNPPGTLRYGATRDRPLWEPSGN^ mGY TFDGRGAQVYIGNGGPC IKRVS mmGLHLYGCSTSVLGNVLINES FGVEPVHPQDGDALTLRTAT IWIDH SFSNSSDGLVDVTLSSTGVnSN LFF NHHKVMLLGHDDAYSDDKSMKVWAI^QFGPNCC ÍRMPRARYGLVHVANN NYDPWTTYAIGGSSOTmSEGNSFTAPNESYKKQVTIRIGCKTSSSCSNWVWQS TQDVFYNGAYTVSSG YEGGMYTKKEAFNVENGNATPQLTKNAGVLTCSLS KRC precursor 541802 Cry J. I - cedro Japonés lvIDSPCLVALLWSFVIGSCFSDNPIDSCWRGDS rWAQ ni KLADCAVGFGSST MGGKGGDLYT TNSDDDPVNPAPGTLRYGATRD^ Y GY TFDGRGAQVYIGNGGPCVFIKRVSWIIHGLYLYGCSTSVLG VIJ ES FGVEPVHPQDGDALTLRTATOIWIDHNSFSNSSDGLVDVTLTSTGV?SNNLFF NHHKVMSLGHDDAYSDDKSMKVTVAFNQFGPNCGQR PRARYGLVHVA N METODOS DE SUMINISTRO Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden suministrar a un sujeto in vivo utilizando una diversidad de rutas y técnicas conocidas. Por ejemplo, se puede proporcionar una composición como una solución, suspensión o emulsión inyectable y se puede administrar por vía parenteral, subcutánea, epidérmica, intradérmica, intramuscular, intraarterial , intraperitoneal , inyección intravenosa utilizando una aguja convencional y una jeringa o utilizando un sistema de inyección de chorro de líquido o utilizando un parche. Las composiciones también se pueden administrar tópicamente a la piel o al tejido de la mucosa, tal como por vía nasal, intratraqueal , intestinal, rectal o vaginal o se pueden proporcionar como una aspersión finamente dividida adecuada para administración respiratoria o pulmonar. Otros modos de administración incluyen administración oral, supositorios, administración sublingual y técnicas de suministro transdérmico activo o pasivo.

Cuando se va a administrar un péptido de la invención se prefiere administrar el péptido a un sitio en el cuerpo en donde tendrá la capacidad de hacer contacto con células presentadoras de antígeno adecuadas y en donde una o varias tendrán la oportunidad de ponerse en contacto con los linfocitos T del individuo. Cuando se va a administrar una APC, se prefiere administrar la APC al sitio en el cuerpo en donde tendrá la capacidad de ponerse en contacto y activar linfocitos T adecuados del individuo.

REGIMENES DE SUMINISTRO La administración de péptidos/polinucléotidos/células (tales como la composición que contiene una pluralidad de péptidos) puede ser por cualquier método adecuado como se describe en lo anterior. Las cantidades adecuadas del péptido se pueden determinar empíricamente, pero habitualmente están en un intervalo que se proporciona más adelante. Una administración única de cada péptido puede ser suficiente para tener un efecto benéfico para el paciente pero se apreciará que puede ser benéfico si el péptido se administra más de una vez, en cuyo caso los regímenes de administración típica pueden ser, por ejemplo, una o dos veces a la semana durante 2-4 semanas, cada 6 veces, o una vez al día durante una semana cada cuatro a seis meses. Como se apreciará, cada péptido o polinucleótido, o combinación de péptidos y/o polinucleótidos se pueden administrar a un paciente solos o en combinación.

Las dosificaciones para administración dependerán de varios factores que incluyen la naturaleza de la composición, la vía de administración y el protocolo y temporización del régimen de administración. Las dosis adecuadas de una molécula de la invención pueden estar en el orden de hasta 15 ig, hasta 20 µg, hasta 25 µg, hasta 30 ug, hasta 50 µg, hasta 100 µg o hasta 500 g o más por administración. Las dosis adecuadas pueden ser menores de 15 µ<3, pero por lo menos 1 ng, o por lo menos 2 ng, o por lo menos 5 ng o por lo menos 50 ng, o por lo menos 100 ng, o por lo menos 500 ng o por lo menos 1 µg o por lo menos 10 µg. Para algunas moléculas de la invención, la dosis utilizada puede ser mayor, por ejemplo de hasta 1 mg, hasta 2 mg, hasta 3 mg, hasta 4 mg o hasta 5 mg o mayor. Las dosis se pueden proporcionar en una formulación líquida, en una concentración adecuada para permitir un volumen apropiado para administración por la vía seleccionada.

KITS La invención también se relaciona con una combinación de componentes descritos en la presente adecuados para uso en el tratamiento de la invención los cuales son empacados en forma de un kit en un recipiente. Los kits pueden comprender una serie de componentes que permiten el tratamiento de la invención. Por ejemplo, un kit puede comprender uno o más péptidos, polinucleótidos y/o células de la invención diferentes, o uno o más péptidos, polinucleótidos o células de la invención y uno o más agentes terapéuticos adicionales adecuados para administración simultánea o para administración secuencial o separada. Opcionalmente el kit puede contener uno o varios reactivos adecuados adicionales o instrucciones y similares.

La invención se ilustra por los siguientes Ej emplos : EJEMPLO 1 Búsqueda de Unión de CPH Clase II El objetivo de este estudio es identificar un panel de péptidos distinto con fuertes afinidades por ocho de los alotipos HLA-DRB1* CPH Clase II humanos más comunes. Con el fin de identificar las propiedades de unión en los alérgenos de abedul mayores Bet vi, Bet v2 , Bet v3 , Bet v4 , Bet v6 , se lleva a cabo un enfoque in silico utilizando el algoritmo disponible comercialmente EpiMatrix (EpiVAx Inc.). Este es un análisis bioinformático de péptidos a partir de una secuencia para determinar el potencial que se va a encontrar dentro del surco de unión de moléculas HLA-DR CPH clase II.

EpiMatrix es un algoritmo basado en matriz que clasifican 9 secuencias de residuos aminoácidos, superpuestos por 8 aminoácidos desde cualquier secuencia polipeptídica por probabilidad calculada de unión a cada una de las moléculas CPH seleccionadas (De Groot et al., AIDS Research and Human Retroviruses 13:539-41 (1997). El procedimiento para desarrollar motivos de matriz fue publicado por Schafer et al, Vaccine 16:1880-4 (1998). En este ejemplo, se. determina el potencial de unión para HLA DRl, DR3 , DR4 , DR7 , DR8 , DR11, DR13 y DR15. Los posibles ligandos del CPH se seleccionan al calificar cada marco de 9 unidades en una secuencia de proteínas. Esta clasificación se deriva al comparar la secuencia de las 9 unidades con la matriz de secuencias de aminoácidos conocidas para unión a cada alelo de CPH. Estudios en retrospectiva han demostrado que EpiMatrix predice con precisión ligandos CPH publicados (Jesdale et al., in Vaccines '97 (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1997) ) . La predicción exitosa de péptidos los cuales se unen a moléculas múltiples de CPH también se ha confirmado .

Los datos EpiMatrix para cada alérgeno se muestran ya sea: Como datos de un péptido de 9 unidades superpuesto con la clasificación de unión (Z) para cada alelo y el número de (aciertos) para los 8 alelos (clasificaciones Z de igual a o mayor que 5% superior de los enlazantes predichos) : o Como un reporte de grupo en donde los datos a partir de analizar secuencias múltiples de la base de datos se "agrupan" para proporcionar una revisión de la unión de todas las variantes de la proteína. El término "aciertos EpiMatrix" se refiere al número de clasificaciones de unión Z predichas altas para los 8 alelos dentro de . esa secuencia mientras que la "clasificación de grupo EpiMatrix" se deriva del número de aciertos normalizados para la longitud del conjunto. La clasificación de conjunto por lo tanto es el exceso o el faltante en las propiedades de unión de CPH agregado predicho en relación a un péptido estándar aleatorio. Una clasificación de conjunto superior a 10 se considera que indica propiedades de unión a CPH amplias.

El análisis EpiMatrix se realizó sobre secuencias completas de isoformas conocidas de Bet vi, enumeradas a continuación, con sus números de acceso NCBI correspondientes: Bet vi L P43185; Bet vl E P43178; Bet vl M/N P43186 ; Bet vl D/H P43177; Betvl K P43184; Bet vl C P43176; Bet vl J P43183; Bet vl B P45431; Bet vl G P43180; Bet vl A P15494 ; Bet vl F/I P43179; El análisis EpiMatrix también se realizó en secuencias Bet vl conocidas adicionales indexadas por el número de acceso en la tabla 2.

Este análisis identificó péptidos de núcleo (y sus secuencias flanqueantes) derivadas de las secuencias anteriores las cuales se predice que tienen buena unión a CPH clase II. Estas secuencias se muestran a continuación en las tablas 1 y 2. Como se muestra, muchos de los péptidos identificados están altamente conservados entre diferentes isoformas de Bet vl .

En las tablas 1 y 2 : "Residuos en la secuencia principal" proporciona la ubicación del péptido dentro de las secuencias que se analizaron. El péptido de núcleo (subrayado en la parte media del aminoácido en negrillas) define las secuencias de unión real que se identificó durante el análisis. Los flancos estabilizantes (N-terminal y C-terminal, con letra normal) se incluyen para uso con la secuencia de núcleo y típicamente se requieren para ayudar en la elaboración de los péptidos . El "número de aciertos" se refiere al número de afinidades de unión predichas altas para todos los tipos de CPH probados dentro de la secuencia. La "clasificación de conjunto EpiMatrix" se deriva del número de aciertos normalizados para la longitud del conjunto. De esta manera, la clasificación del conjunto es el exceso o el faltante en las propiedades de unión de CPH de agregado predichas en relación a un estándar de péptido aleatorio. Una clasificación superior a 10 se considera que indica propiedades de unión a CPH amplias.

TABLA 1 - Be vi TABLA 1A Análisis EpiMatrix de Bet vi Secuencia: P15494 : región de unión de alelo HLA DR múltiple predicho: FNYETETTSVIPAARLFKAFILDGDNLF (4-31) 5 TABLA 2 - Bet vi 15 20 25 EJEMPLO 2 Un análisis EpiMatrix como en lo anterior se realizó sobre la totalidad de la secuencia de una isoforma conocida de Bet v3 (NCBI acceso número: P43187) . Este análisis identificó un péptido de núcleo (y su secuencia flanqueante) derivada de la secuencia anterior la cual se predice que tiene una buena unión a CPH clase II. La secuencia se muestra a continuación en la tabla 3. Los encabezados y notas para la tabla 3 son como los de la tabla 1 anterior.

TABLA 3 - Bet v3 Una secuencia en los residuos 80 a 94 de P43187, TVKSFTREGNIGLQF (péptido ID NO. P55, SEC ID NO: 36) también se predice que tiene una buena unión a CPH Clase II. El análisis in silíco adicional de otras secuencias de alérgeno de abedul a partir de Bet v3 se muestra aquí : TABLA 3A Análisis EpiMatrix de la secuencia Bet v3 : G1168696_SPP43187 : región de unión de alelo HLA · DR múltiple predicha SLNTLRLRRIFDLFDK (35-50) EJEMPLO 3 Un análisis EpiMatrix como el anterior se realizó en la totalidad de secuencias de isoformas conocidas de Bet v4 (NCBI, número de acceso: Q39419, CAA73147) . Estos análisis identificaron péptidos de núcleo (y sus secuencias flanqueantes) derivadas de las secuencias anteriores las cuales se predice que tienen una buena unión a CPH clase II. Estas secuencias se muestran a continuación en la tabla 4. Los encabezados y notas para la tabla 4 son como en la tabla 1 anterior.

TABLA 4 - Bet v 4 EJEMPLO 4 Un análisis EpiMatrix como el anterior se realizó sobre la totalidad de la secuencia de una isoforma conocida de Bet v6 (NCBI, número de acceso: 065002). Este análisis identificó péptidos de núcleo (y sus secuencias flanqueantes) derivadas de las secuencias anteriores las cuales se predice que tienefr una buena unión a CPH clase II. Estas secuencia se muestran más adelante en la tabla 5. Los encabezados y notas para la tabla 5 son como en la tabla 1 anterior.

TABLA 5 - Bet v 6 EJEMPLO 5 Un análisis EpiMatrix como el anterior se realizó sobre la totalidad de la secuencia de una isoforraa conocida de Bet v7 (NCBI, número de acceso: CAC84116) . Este análisis identificó un péptido de núcleo (y sus secuencia flanqueante) derivada de la secuencia anterior las cuales se predice que tienen una buena unión a CPH clase II. Estas secuencia se muestran a continuación en la tabla 6. Los encabezados y notas para la tabla 6 son como en la tabla 1 anterior.

TABLA 6 - Bet v 7 EJEMPLO 5A Un análisis adicional in silico de otras secuencias de alérgeno de abedul a partir de Bet v 2 se muestran aquí: TABLA 6A Análisis EpiMatrix de la secuencia Bet v2 : GI1942360_PDB1CQA: Región de unión de alelo HLA DR múltiple precicha: SV AQSSSFPQFKPQEITGIMK (33-54) TABLA 6B Análisis EpiMatrix de la secuencia Bet v2 : GI1942360_PDB1CQA: Región de unión de alelo HLA DR múltiple precicha: IKYMVIQGEAGAVIRGKKGSGG (72-93) EJEMPLO 6 En base en el análisis realizado en los ejemplos 1 a 5A los siguientes péptidos mostrados en la tabla 7 se diseñaron para cribado en análisis subsecuentes. El proceso de diseño involucra la modificación de secuencias nativas para incrementar la solubilidad y otras características fisicoquímicas. Por ejemplo, para Birl2A, los residuos en el original 62-77R indican que la secuencia peptídica de Birl2A corresponde a los residuos 62 a 77 de la secuencia original con un residuo R adicional agregado a la parte C-terminal para mejorar la solubilidad. Simi 1 ármente , para BirOlF, G, H e I, los residuos en 4-18K original indican que estas secuencias peptídicas corresponden a los residuos 4 a 18 de la secuencia original, con un residuo K adicional agregado en la parte C-terminal para mejorar solubilidad.

TABLA 7 EJEMPLO 7 Análisis de unión in vi tro Los péptidos identificados que son unión potencia a CPH clase II se criban previamente para solubilidad en un medio ácido acuoso y los péptidos se prueban en un análisis de unión a CPH clase II in vitro.

Métodos El análisis utilizado es un análisis de unión CPH clase II competitivo en donde cada péptido es analizado por su capacidad para desplazar un aglutinante control conocido de cada uno de los alotipos CPH clase II humanos investigados. Los alotipos y los péptidos control utilizados en este estudio son típicamente los que se muestran a continuación : Péptidos control utilizados en los análisis de unión in vitro Cada uno de los péptidos de las tablas 1 a 7 se analizan en el análisis de competencia y se criban para unión relativa en comparación con los péptidos control. Debido a la naturaleza del análisis competitivo los datos para cada péptido se determinan como la relación de su CI50 propia respecto a la del péptido control. De esta manera, un péptido que presenta un valor CI50 que es paridad al péptido control tiene una afinidad de unión idéntica mientras que los péptidos con una relación menor de uno tienen una afinidad mayor de aquellos con una relación mayor de uno tienen una afinidad menor.

La solubilidad en solución acuosa es un criterio esencial para un péptido para que sea un agente terapéutico eficaz. Por lo tanto, como una consecuencia del cribado de solubilidad se eliminarán péptidos muy hidrofóbicos con una frecuencia elevada de residuos aminoácidos hidrofóbicos grandes en registros de unión múltiples. Esta es una característica de los aglutinantes HLA-DRBI* promiscuos. Se identifican los péptidos los cuales se unen a uno o más de los alotipos CPH clase II. Se esperaría que tales péptidos tengan la capacidad de unir alotipos similares que no han sido probados a través de la homología de estructuras de CPH.

EJEMPLO 8 Se aplican los siguientes métodos a los mismos péptidos que en el ejemplo 7.

Análisis de proliferación celular El análisis de proliferación celular se realiza sobre PBMC (140 x 106 células requeridas para todos los parámetros que se prueban) . La proliferación se mide por la incorporación del compuesto radiomarcado 3H-timidina. Con mayor detalle, 100 µ? de la concentración de antígeno o péptido apropiada se distribuye sobre los pozos apropiados de placas de 96 pozos. Las placas después se colocan en un incubador humidificado, con C02 5% ajustado a 37°C durante un máximo de 4 horas. Los PBMC aislados como se ha descrito antes se preparan a una concentración de 2 x 106 células/ml en medio completo a temperatura ambiente. Un volumen de 100 µ? de solución de célula se distribuye después dentro de cada uno de los pozos de las placas de 96 pozos que contienen antígeno/péptido . Las placas después se incuban durante 6 a 8 días. Los cultivos adquieren radiación por pulsos con solución de timidina tritiada al agregar 10 µ? de solución concentrada de timidina tritiada (1.85 MBq/ml en media RPMI libre de suero) a cada pozo. Las placas después se regresan al incubador durante entre 8 y 16 horas. Los cultivos después se cosechan utilizando un cosechador de células Canberra Packard FilterMate 196. Las esteras de filtro secas se someten a conteo utilizando un contador de centelleo beta apropiado .

Las cuentas de los pozos que contienen péptido se comparan estadísticamente con pozos que únicamente contienen medio (12 pozos por grupo) . Se utiliza la prueba no paramétrica de Mann-Whitney. La misma prueba estadística se utiliza para todos los sujetos. Una diferencia estadísticamente significativa entre los pozos únicamente con medio y los pozos estimulados con péptido se considera una estimulación positiva de PBMC por el péptido.

Análisis de liberación de citocina Los 36 péptidos se fabrican a pequeña escala (un tamaño de lote de aproximadamente 10 mg, sin GPM) . La pureza de cada péptido es de por lo menos 95% por CLAR. Las placas de cultivo de 96 pozos que contienen los péptidos y controles (el control negativo es medio de cultivo y los controles positivos son enterotoxina B estafilococcíca (SEB) , 25 ng/ml y extracto de alérgeno de polen de abedul entero, 100 g/ml) se preparan por adelantado y se almacenan a -20°C antes del día del análisis. Los péptidos se agregan a los pozos en un volumen de 100 µ? que contienen péptidos en una concentración de 200 µg/ml de manera que la adición subsecuente de 100 µ? puede crear una concentración de análisis final de 100 µg/ml .

Se aislan células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) de sangre heparinisada por medio de centrifugación de un gradiente de densidad Ficoll. Después se agrega a cada pozo una alícuota de 100 µ? de una suspensión de PBMC, 5 x 106 células/ml y las placas se colocan en un incubador con C02 5%, humidificado, a 37°C durante 5 días. Posterior a la estimulación los sobrenadantes de cultivo (100 µ?) se cosechan para pruebas por análisis de esferas multiplex.

Los análisis de esferas de citocina multiplex (IL-10, IL-13, interferón gamma (IFN-g) ) se realizan en sobrenadantes de cultivo recalentados de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizan . mediciones únicas para cada muestra de sobrenadante de cultivo. Después de completar el análisis multiplex, se determinan niveles de citocina individuales por interpolación a partir de la curva estándar generada en el análisis. Se toma un resultado positivo el cual es mayor de 100 pg/ml para los análisis de IL-13 e INF-g o > 4 veces el fondo de los análisis IL-10. El número de pacientes quienes responden de los 47 sujetos alérgicos a abedul examinados se calcula para péptido para las tres citocinas. En la tabla 9 se resumen los resultados de IL-13 o IFN-g.

TABLA 8 El % de pacientes que responden indican la proporción de sujetos en los cuales cada péptido indujo IL-13 o IFN-g por encima de un nivel umbral de 100 pg/ml Los péptidos los cuales inducen una respuesta positiva en una proporción alta de sujetos son deseables para inclusión en una vacuna. Como se muestra, los péptidos que funcionan mejor son Bir02J (parte superior de la serie 02) , BirOlI (parte superior de la serie 01) y Birl2B. El núcleo de cualquier vacuna idealmente debe contener estos péptidos. Los segundos péptidos que funcionan mejor son Bir04 y Bir09 (parte superior de la serie 09) los cuales se pueden agregar a la mezcla de núcleo de Bir02J, BirOlI y Birl2B. Los terceros péptidos que funcionan mejor son Bir07, Bir07C, Birll y Birl6A. Los péptidos adicionales de este grupo se pueden agregar a la mezcla de vacuna para incrementar aún más la cobertura. Birl5 es el cuarto péptido que funciona mejor y también se puede agregar a la mezcla de vacuna. En términos de los otros péptidos en las diversas series, BirOlF, 01G y 01H, en ese orden de preferencia, son variantes útiles de BirOlI; Bir02E, 02G, 021 o finalmente 02D son variantes útiles de Bir02J; Bir09A, 09B o finalmente 09C son variantes útiles de Bir09; y Birl6B es una variante útil de Birl6A. Una posible mezcla preferida por- lo tanto incluirá Bir02J, BirOlI, Birl2B, Bir04, Bir09, Bir07C y Birl6A. También se pueden incluir Birll y/o Birl5, o de manera alternativa se pueden sustituir por Bir07C y/o Birl6A.

En términos de liberación de IL-10, BirOlI, enumerado anterior es uno de los tres péptidos principales para producción de IL-13 o IFN-g, respuesta inducidas por IL.10 en 49% de individuos. Bir02I también indujo producción de IL-10 en una alta proporción de individuos (43%) . La inclusión de un péptido que induce IL-10 fuertemente puede ayudar en la inducción de tolerancia después de la vacuna.

EJEMPLO 9 - CRIBADO DE SOLUBIDAD A) Introducción TABLA 9-1: Péptidos de abedul para ser incluidos en la prueba de solubilidad B) Prueba de solubilidad Una serie de matrices que contienen trehalosa 260 mM y que abarcan un intervalo de pH de 3.0 a 7.0 más una solución modificada con HC1 2 mM se prepara como se indica en el apéndice 2. La solubilidad de cada uno de los nueve péptidos se evalúa en cada una de las matrices de' acuerdo con el apéndice 1. Cuando la solubilidad se alcanza inicialmente , pero el péptido se separa por precipitación de la solución subsecuentemente después una cantidad adicional de la matriz relevante se agrega para intentar obtener solubilidad del péptido en aproximadamente 200 µ?.

Los detalles de los péptidos de referencia ' de abedul utilizados se indican en la tabla 9-2. Todos los péptidos se fabrican por Bachem AG, Bubéndorf , Suiza.

TABLA 9-2. Detalles de los péptidos de abedul C) Resultados Los resultados del cribado de solubilidad se muestran en las tablas 9-3 a 9-8 a continuación: TABLA 3; HC1 2 mM y dihidrato de trehalosa 260 mM, pH 2.65 TABLA 4a citrato de sodio lOmM y dihidrato de trehalosa 260 mM, pH 3.01 TABLA 4b cibrato de sodio lOmM y dihidrato de trehalosa 260 mM, pH 3.99 TABLA 5: citrato de sodio lOmM y dihidrato de trehalosa 260 itiM, pH 5.02 TABLA 6 : citrato de sodio lOmM y dihidrato de trehalosa 260 mM, pH 6.01 TABLA 7; fosfato diácido de potasio lOmM y dihidrato de trehalosa 260 mM, pH 6.03 TABLA 8; fosfato diácido de potasio lOmM y dihidrato de trehalosa 260 ro , pH 7.03 EJEMPLO 9 - ANEXO 1 ESTUDIOS DE SOLUBILIDAD DE PEPTIDOS Metodología de solubilidad Los vehículos de formulación se prepararon y se realizó medición de pH.

• Pesado de los péptidos Se requiere aproximadamente 1 mg para cada evaluación.

Los materiales fueron suministrados en recipientes adecuados para evaluación subsecuente de solubilidad, es decir, frascos de CLAR de vidrio transparente (con tapa roscada.

• Evaluación de solubilidad (para cada matriz) Se agregaron alícuotas de matriz (50 a 100 ~1) según se requería.

La solubilidad del péptido se interpreta por inspección visual .

Se registra la descripción de las características de la muestra después de la adición de cada alícuota del solvente.

Se repite determinación visual de solubilidad después de 24 horas • Cuando un péptido se separa por precipitación de la solución después de 24 horas se agrega amortiguador adicional para producir una concentración final de aproximadamente 2.0 mM (200 nmol por mi debe igualar a aproximadamente 0.35 mg/ml) .

Cálculo de las solubilidades de péptido (evaluación inicial) En base en la cantidad absoluta de polvo pesado.

Determinación de la concentración molar a la cual se obtiene solubilidad utilizando las masas moleculares de los péptidos y el contenido de péptido y los valores de pureza.

Cálculos peso(mg) Solubilidad mg/ml "tal cual x 1000 dilución(/ ) peso{mg) Solubilidad mg/ml = x 1000 x contenido dilución(jul) x %pureza pesoimg) Solubilidad µp???/??? = dilución^) X 1 0 0 0 X rcontenido x Ipureza x x 1000 pesomolecular EJEMPLO 9 - ANEXO 2 AMORTIGUADORES PARA SOLUBILIDAD INICIAL Y CRIBADO DE ESTABILIDAD Cada matriz se prepara a una concentración de 10 mM del agente amortiguador. Cada amortiguador contiene dihidrato de trehalosa 260 mM (FW 378.3).

Preparación de matriz El procedimiento indicado es para la preparación de 100 mi de cada amortiguador, pero los volúmenes alternativos se pueden preparar al ajustar las cantidades.

• Se prepararon soluciones concentradas 0.1 M de citrato de sodio y fosfato diácido de potasio.

• El peso de dihidrato de trehalosa equivalente a 260 mM se transfiere a un recipiente de mezclado apropiado que contiene 70-80 mi de agua desionizada destilada y se permite que se disuelva. • 10 mi del concentrado apropiado de la solución amortiguadora 0.1 M se agrega al recipiente de mezclado y se agita .

· El pH de la matriz se ajusta al valor deseado al agregar ácido clorhídrico 2 mM o hidróxido de sodio 0.1 M según se requiera.

• Las soluciones finalmente se diluyen a 100 g de peso y se vuelve a determinar el pH.

En los amortiguadores para solubilidad inicial y cribado de estabilidad, mostrado como sal de amortiguador o modificador de pH/pH: HC1 2 mM y dihidrato de trehalosa 260 mM/pH 2.65 citrato de sodio 10 mM y dihidrato de trehalosa 260 mM/pH 3.01 citrato de sodio 10 mM y dihidrato de trehalosa 260 mM/pH 3.99 .citrato de sodio 10 mM y dihidrato de trehalosa 260 mM/pH 5.02 citrato de sodio 10 mM y dihidrato de trehalosa 260. mM/pH 6.01 fosfato diácido de potasio 10 mM y dihidrato de trehalosa 260 mM/pH 6.03 fosfato diácido de potasio 10 mM y dihidrato de trehalosa 260 mM/pH 7.03 EJEMPLO 10 - ANALISIS DE LIBERACION DE HISTAMINA El propósito de este análisis es identificar composiciones que son capaces de activar basofilos en sangre (como un sustituto para mastocitos tisulares) lo que resulta en liberación de histamina que puede resultar en reacciones alérgicas durante la terapia. Una composición que comprende una mezcla de péptidos que inducen liberación de histamina frecuentemente se pueden considerar no adecuados para uso como una vacuna .

La liberación de histamina requiere el reticulado de moléculas de IgE específicas adyacentes sobre la superficie del basofilo. Los péptidos que son evaluados son pequeños (11 a 18 aminoácidos de longitud) y por lo tanto no deben presentar estructura terciaria significativa que pueda permitir que retengan la conformación de un epítopo que se une a IgE de la molécula completa. Además, los monómeros peptídicos en solución, incluso si se unen por IgE, no deben ser capaces de reticular moléculas de IgE adyacentes.

Se evaluó la liberación de histamina de sangre completa periférica fresca de sujetos alérgicos a abedul. Se utilizaron basofilos de sangre periférica como un sustituto para mastocitos tisulares los cuales no son prácticos de analizar. La sangre se incuba in vitro con mezclas de péptidos identificados como adecuados en base a los resultados de los ejemplos 1 a 9 anteriores. Específicamente se analizaron las siguientes mezclas: Mezcla 1 - BIR01I, BIR02J, BIR04 , BIR12B, BIR16A, BIR07C Mezcla 2 - BIR01I, BIR02J, BIR04, BIR12B, BIR16A, BIR07C, BIR09 Mezcla 3 - BIROIT, BIR02J, BIR04, BIR12B, BIR16A, BIR07C, BIR09B Mezcla 4 - BIR01I, BIR02I, BIR04 , BIR12B, BIR16A, BIR07C Mezcla 5 - BIR01I, BIR02I, BIR04 , BIR12B, BIR16A, BIR07C, BIR09 Mezcla 6 - BIR01I, BIR02I, BIR04 , BIR12B, BIR16A, BIR07C, BIR09B La liberación de histamina en respuesta al extracto de alérgeno de abedul completo se mide en cada sujeto para confirmar sensibilización de basofilos. Un control positivo, que representa la liberación total de histamina, generada por congelamiento/recalentamiento de células dos veces, se incluye en cada análisis. Un control negativo para liberación espontánea de histamina se genera al incubar células únicamente en amortiguador.

El análisis se realiza utilizando el kit de Immunotech Histamine Reléase Immunoassay de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la exposición in vi tro de basofilos de sangre con mezclas peptídicas, alérgeno completo o amortiguador en pozos de placa de microtitulación los sobrenadantes se separan y la histamina en las muestras se convierte a acilhistamina . Las muestras aciladas se prueban por una prueba de ELISA acilhistamina .competitiva .

Las mezclas de péptidos se analizan para su capacidad para inducir liberación de histamina sobre un intervalo de 5 logaritmo 10 (1 a 10,000 ng/ml) . El intervalo de concentración analizado se selecciona en base en las dosis in vivo teóricas de péptido que se pueden obtener durante la terapia. Por ejemplo, una dosis de 31 µ9 (aproximadamente o equivalente a 3 nmol/péptido) de cada péptido que entra a un volumen de sangre de 5 litros puede resultar en una concentración de sangre de 6 ng/ml en el extremo inferior del intervalo de dosis de análisis de liberación de histamina. El extracto de alérgeno de abedul completo se utiliza sobre el mismo intervalo de concentración.

Se realizan mediciones únicas para cada dilución. Después de completar la prueba de ELISA, se determinan las concentraciones de histamina individuales por interpolación a partir de una curva estándar generada en el análisis de ELISA. Los resultados de la muestra se ajustan para permitir la dilución. Cuando dos o más diluciones consecutivas de una preparación de péptido/alérgeno inducen > 15% de la liberación de histamina total observada en el control positivo congelado y recalentado (> 15% del control positivo) o cuando se obtiene un valor único de > 15% de control positivo a la concentración más alta probada (10 µ9/t?1 para los péptidos) esto se considera una "liberación positiva de histamina" .

Un total de 40 análisis de liberación de histamina se completaron durante el estudio. De estos 5 análisis fueron rechazados debido a la falla de cumplir con controles de QC apropiados, por ejemplo debido a concentraciones inaceptablemente altas (> 15% del control positivo) de liberación espontánea -en el medio más pozos de control negativos de amortiguador.

Las mezclas probadas mostraron todas buenas propiedades de liberación de histamina. Los hallazgos del estudio se resumen como sigue: ( A, por sus siglas en inglés = alérgeno completo) Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una composición adecuada para usarse en la prevención o tratamiento de alergia a polen de abedul por tolerización, en donde la composición comprende: i) por lo menos uno de los polipéptidos de la SEC ID NO: 74 (BIR 12B; AKYMVIQGEPGRVIRGK) , SEC ID NO: 72 (BIRll; FPQFKPQEITGIMK) , SEC ID NO: 71 (BIR10; GSVWAQSSSFPQFK) , SEC ID NO: 73 (BIR12A; PTGMFVAGAKYMVIQGR) , SEC ID NO: 75 (BIR13 ; IKYMVIQGEAGAVIRGK y SEC ID NO: 76 (BIR14; EAGAVIRGKKGSGGIT) o una variante de cualquiera de los mismos, y ii) por lo menos uno de los polipéptidos de la SEC ID NO: 53 (Bir02J; PAARMFKAFILEGDKLVPK) , SEC ID NO: 48 (BirOlI; FNYETETTSVIPAARK) , SEC ID NO: 54 (Bir04 ; PGTIKKISFPEGFPFKYV) , SEC ID NO: 67 (Bir09; ETLLRAVESYLLAHSDAY) , SEC ID NO: 60 (BIR07 ; SNEIKIVATPDGGSILK) y SEC ID NO: 63 (Bir07C; SNEIKIVATPEGGSILK) o una variante de cualquiera de los anteriores, en donde la variante es: I) un polipéptido más largo, con una longitud de hasta 30 aminoácidos el cual comprende la secuencia del polipéptido correspondiente especificado en (i) o (ii) , o · II) un polipéptido con una longitud de 9 a 30 aminoácidos el cual comprende una secuencia que tiene por lo menos 65% de homología con la secuencia del polipéptido correspondiente especificado en (i) o (ii) , secuencia la cual es capaz de tolerizar al polipéptido correspondiente; o III) un polipéptido de longitud de 9 a 30 aminoácidos el cual comprende una secuencia de por lo menos 9 aminoácidos contiguos de la secuencia del polipéptido correspondiente especificado en (i) o (ii) , o a una secuencia que tiene por lo menos 65% de homología con por lo menos 9 aminoácidos contiguos, secuencia la cual de por lo menos 9 aminoácidos contiguos o secuencia homologa es capaz de tolerizar al polipéptido correspondiente.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además por lo menos un polipéptido adicional de (i) o (ii) o una variante del mismo que no se selecciona en la reivindicación 1.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque comprende además por lo menos un polipéptido adicional de la SEC ID NO: 77 (BIR15; SLNTLRLR IFDLFKD) O la SEC ID NO: 78 (BIR16A; AERERIFKRFDANGEGK) o una variante de cualquiera de las mismas .

4. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende : (a) el polipéptido BIR12B (AKYMVIQGEPGRVIRGK) o una variante del mismo; (b) el polipéptido BIR02J (PAARMFKAFILEGDKLVPK) , o una variante del mismo; y (c) el polipéptido BIR01I (FNYETETTSVIPAARK) o una variante del mismo.

5. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque - la variante de BirOlI es BirOlF: (FNYETEATSVIPAARK) , BirOlG (FNYEIEATSVIPAARK) o BirOlH (FNYEIETTSVIPAARK) ; y/o la variante de Bir02J es Bir02E PAARFKAFILEGDTLIPK) , Bir02G (PAARLFKAFILEGDNLIPK) , Bir02I (PAARMFKAFILD) o Bir02D (PAARMFKAFILDGDKLVPK) ; y/o la variante de Bir09 se selecciona de Bir09A (GETLLRAVESYLLAHS) , Bir09B (KEMGETLLRAVESYLLAHS) o Bir09C (KEKGETLLRAVESYLLAHS) ; y/o la variante de Bisl6B es Birl6A (AERERIFKRFDAGGEGK) .

6. Una composición adecuada para usarse en la prevención o •tratamiento de alergia a polen de abedul por tolerización en donde la composición comprende por lo menos tres polipéptidos diferentes que se seleccionan de: (a) Bir 12B (AKYMVIQGEPGRVIRGK) ,. o una variante del mismo; (b) Bir02J: (PAARMFKAFILEGDKLVPK) , o una variante el mismo; (c) BirOlI: (FNYETETTSVIPAARK) , o una variante del mismo; (d) Bir04: (PGTIKKISFPEGFPFKYV) , o una variante del mismo; (e) Bir09: (ETLLRAVESYLLAHSDAY), o una variante del mismo; (f) Birl6A (AERERIFKRFDA GEGK) o una variante del mismo; (g) BIR07: (SNEIKIVATPDGGSILK) o una variante del mismo; (h) Bir07C: (SNEIKIVATPEGGSILK) o una variante del mismo; (i) BirOll (FPQFKPQEITGIMK) o una variante del mismo; (j) Birl5 (SLNTLRLRRIFDLFDK) o una variante del mismo; en donde la variante es: I) un polipéptido más largo con una longitud de hasta 30 aminoácidos el cual comprende la secuencia del polipéptido correspondiente especificado en los incisos (a) a (j) , o II) un polipéptido con una longitud de 9 a 30 aminoácidos el cual comprende la secuencia que tiene por lo menos 65% de homología con la secuencia del polipéptido correspondiente especificado en (a) a (j), secuencia la cual es capaz de tolerizar hacia al polipéptido correspondiente; o III) un polipéptido con una longitud de 9 a 30 aminoácidos el cual comprende una secuencia de por lo menos 9 aminoácidos contiguos de la secuencia del polipéptido correspondiente especificado en (a) a (j), o una secuencia que tiene por lo menos 65% de homología con por lo menos 9 aminoácidos contiguos, secuencia de por lo menos 9 aminoácidos contiguos o una secuencia homologa que es capaz de tolerizar al polipéptido correspondiente.

7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque comprende: (a) el polipéptido BIR12B (AKYMVIQGEPGRVIRGK) o una variante del mismo ; (b) por lo menos uno de los polipéptidos Bir02J (PAAR FKAFILEGDKLVPK) , y BirOlI (FNYETETTSVIPAARK) , o una variante de cualquiera de los mismos; y (c) por lo menos un polipéptido adicional de a) a j) no seleccionado en lo anterior.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque comprende el polipéptido BIR12B (AKYMVIQGEPGRVIRGK) o una variante del mismo, el polipéptido Bir02J (PAARMFKAFILEGDKLVPK) , o una variante del mismo; el polipéptido BirOlI (FNYETETTSVIPAARK) , o una variante del mismo, y por lo menos un polipéptido adicional de a) a j) no seleccionado en lo anterior.

9. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada porque comprende el polipéptido BIR12B (AKYMVIQGEPGRVIRGK) o una variante del mismo, el polipéptido Bir02J (PAARMFKAFILEGDKLVPK) , o una variante del mismo; el polipéptido BirOlI (FNYETETTSVIPAARK) , o una variante del mismo, el polipéptido Bir04 (PGTIKKISFPEGFPFKYV) o una variante del mismo, el polipéptido Bir09 (ETLLRAVESYLLAHSDAY) o una variante del mismo, el polipéptido BIR07C (SNEIKIVATPEGGSILK) o una variante del mismo y el polipéptido Birl6A (AERERIFKRFDANGEGK) o una variante del mismo; y opcionalmente sin polipéptidos adicionales.

10. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada porque BIR12B (AKYMVIQGEPGRVIRGK) o una variante del mismo, el polipéptido Bir02J (PAARMFKAFILEGDKLVPK) , o una variante del mismo; el polipéptido BirOlI (FNYETETTSVIPAARK) , o una variante del mismo, el polipéptido Bir04 (PGTIKKISFPEGFPFKYV) o una variante del mismo, el polipéptido BIR07C (SNEIKIVATPEGGSILK) o una variante del mismo, y el polipéptido Birl6A (AERERIFKRFDANGEGK) o una variante del mismo, y el polipéptido Bir09B (KEMGETLLRAVESYLLAHS) o una variante del mismo y opcionalmente sin polipéptidos adicionales.

11. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada porque comprende el polipéptido BIR12B (AKYMVIQGEPGRVIRGK) o una variante del mismo, el polipéptido Bir02J (PAARMFKAFILEGDKLVPK) , o una variante del mismo; el polipéptido BirOlI (FNYETETTSVIPAARK) , o una variante del mismo, el polipéptido Bir04 (PGTIKKISFPEGFPFKYV) o una variante del mismo, el polipéptido BIR07C (SNEIKIVATPEGGSILK) o una variante del mismo, y el polipéptido Birl6A (AERERIFKRFDANGEGK) o una variante del mismo y opcionalmente sin polipéptidos adicionales.

12. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, caracterizada porque: la variante de BirOlI es BirOlF (FNYETEATSVIPAARK) , BirOlG (FNYEIEATSVIPAARK) O BirOlH (FNYEIETTSVIPAARK) ; y/o la variante de Bir02J es Bir02E PAARLFKAFILEGDTLIPK) , Bir02G (PAARLFKAFILEGDNLIPK) , Bir02I (PAARMFKAFILD) o Bir02D (PAARMFKAFILDGDKLVPK) ; y/o - la variante de Bir09 se selecciona de Bir09A (GETLLRAVESYLLAHS) , Bir09B (KEMGETLLRAVESYLLASH) o Bir09C (KEKGETLLRAVESYLLAHS) ; y/o la variante de Bisl6B es Birl6A (AERERIFKRFDANGEGK) .

13. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque: es capaz de tolerizar por lo menos 50% o por lo menos 60% de un conjunto de individuos alérgicos a polen de abedul en la población, y/o - comprende por lo menos un polipéptido adicional de hasta un total de 13 polipéptidos únicos/diferentes, en donde el polipéptido además: (a) comprende una secuencia que tiene por lo menos 65% de identidad de secuencia con por lo menos 9 o más aminoácidos contiguos en cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80 no seleccionados antes; y (b) tiene una longitud de 9 a 30 aminoácidos.

14. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende por lo menos uno de los polipéptidos el cual tiene una longitud de 9 a 20 o de 13 a 17 aminoácidos y/o en donde el polipéptido tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 80.

15. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque uno o más de los polipéptidos tienen una o más modificaciones que se seleccionan de las siguientes: (i) acetilación en la parte N-terminal; (ii) amidación en la parte C-terminal ; (iii) uno o más hidrógenos en las aminas de la cadena lateral de arginina y/o lisina sustituidos con un grpo metileno; (iv) glucosilación; y (v) fosforilación.

16. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque por lo menos uno de los péptidos ha sido manipulado para ser soluble de manera que comprende: i) N-terminal a los residuos del péptidos los cuales flanquean un epítopo de linfocitos T: uno a seis aminoácidos contiguos que corresponden a los dos a seis aminoácidos contiguos inmediatamente N-terminal respecto a los residuos en la secuencia de la proteína de la cual se deriva el péptido; y/o ii) C-terminal a los residuos del péptidos los cuales flanquean un epítopo de linfocitos T: uno a seis aminoácidos contiguos que corresponden a uno a seis aminoácidos contiguos inmediatamente C-terminal a los residuos en la secuencia de la proteína de la cual se deriva el péptido; o iii) tanto N- como C-terminal a los residuos del péptido los cuales flanquean un epítopo de linfocitos T: por lo menos un aminoácido que se selecciona de arginina, lisina, histidina, glutamato y aspartato, en donde el polipéptido tiene una solubilidad de por lo menos 3.5 mg/ml y el epítopo de linfocito T tiene una solubilidad de menos de 3.5 mg/ml.

17. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque por lo menos uno de los péptidos ha sido manipulado para ser soluble de manera que, adicionalmente : i) cualquiera de los residuos cisteína en la secuencia nativa del péptido es sustituido con serina o ácido 2 -aminobutírico; y/o ii) cualquiera de los residuos hidrófóbicos en hasta tres aminoácidos en N- o C-terminal de la secuencia nativa del péptido, los cuales no están comprendidos en un epítopo de linfocito T, se suprimen; y iii) cualesquiera dos aminoácidos consecutivos que comprenden la secuencia Asp-Gly en hasta cuatro aminoácidos en N- o C-terminal de la secuencia nativa del péptido, los cuales no están comprendidos en un epítopo de linfocitos T, se suprimen; y/o iv) uno o más residuos cargados positivamente se agregan en las partes N-terminal y/o C-terminal de la secuencia nativa del péptido.

18. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque cada polipéptido tiene una concentración en el intervalo de 0.03 a 200 mmol/ml, 0.3 a 200 nmol/ml, 50 a 200 nmol/ml o 30 a 120 nmol/ml.

19. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende además un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y/u opcionalmente uno o más adyuvantes que se seleccionan de un glucocorticoide , vitamina D y/o rapamicina y/o que no comprenden péptidos adicionales.

20. Una composición para usarse en la prevención o tratamiento de alergia al polen de abedul por tolerización en donde la composición comprende por lo menos una secuencia polinucleotídica la cual, cuando se expresa, provoca la producción de una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

21. Un vector para usarse en la prevención o tratamiento de alergia a polen de abedul por tolerización, en donde el vector comprende cuatro o más secuencias polinucleotídicas las cuales codifican para un polipéptido diferente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

22. Un producto, caracterizado porque comprende: i) por lo menos uno de los polipéptidos de la SEC ID NO: 74 (BIR 12B; AKYMVIQGEPGRVIRGK) , la SEC ID NO: 72 (BIR11; FPQFKPQEITGIMK) , SEC ID NO: 71 (BIR1.0; GSVWAQSSSFPQFK) , SEC ID NO: 73 (BIR12A; PTGMFVAGAKYMVIQGR) , SEC ID NO: 75 (BIR13; IKYMVIQGEAGAVIRGK y SEC ID NO: 76 (BIR14; EAGAVIRGKKGSGGIT) o una variante de cualquiera de los mismos como se define en la reivindicacióin 1 (I) a (III), y ii) por lo menos uno de los polipéptidos de la SEC ID NO: 53 (Bir02J; PAARMFKAFILEGDKLVPK) , SEC ID NO: 48 (BirOlI; FNYETETTSVIPAARK) , SEC ID NO: 54 (Bir04; PGTIKKISFPEGFPF YV) , SEC ID NO: 67 (Bir09; ETLLRAVESYLLAHSDAY) , SEC ID NO: 60 (BIR07; SNEIKIVATPDGGSILK) y SEC ID NO: 63 (Bir07C; SNEIKIVATPEGGSILK) o una variante de cualquiera de los de conformidad con la reivindicación 1(1) a (III), en donde cada polipéptido diferente es para uso simultáneo, separado o secuencial en la prevención o tratamiento de alergia al polen de abedul por tolerización.

23. Una formulación farmacéutica para usarse en la prevención o tratamiento de alergia a polen de abedul por tolerización en donde la formulación comprende una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20; un vector de conformidad con la reivindicación 21; o un producto de conformidad con la reivindicación 22, y un portador, diluyente farmacéuticamente aceptable y de manera opcional uno o más adyuvantes que se seleccionan de un glucocorticoide, vitamina D y rapamicina.

24. La formulación de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque se formula para administración oral, administración nasal, administración tópica, administración subcutánea, administración sublingual, administración dntradérmica, administración bucal, administración epidérmica o para administración por inhalación, por inyección o por un parche.

25. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, o el producto de conformidad con la reivindicación 22, que comprende adicionalmente un alérgeno polipeptídico adicional para usarse en la tolerización de un individuo a un alérgeno polipeptídico adicional.

26. Un método in vitro para determinar si linfocitos T reconocen una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende' poner en contacto los linfocitos T con la composición y detectar si los linfocitos T son estimulados por la composición.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque se lleva a cabo para determinar si un individuo tiene o se encuentra en riesgo de tener una alergia a polen de abedul .