CN105407904A - 以毒素为主的治疗性肽的眼科用途和其药用组合物 - Google Patents
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Abstract
本文公开通过投与包括以毒素为主的治疗性肽的药用组合物来治疗如干眼和葡萄膜炎的眼科病症的方法。所述肽可包括位于C-端的酸或酰胺且可附接到具有阴离子电荷的有机或无机化学实体。
Description
相关申请案的交叉参考
本申请案主张2013年7月22日申请的美国临时专利申请案序号61/857,157的优先权,所述案是以其全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本文中所公开的方法涉及一种以毒素为主的治疗性肽特别在治疗包括干眼和葡萄膜炎的眼科病症的用途。所述的以毒素为主的治疗性肽可以包括以ShK为主的肽。还公开含有所述以毒素为主的治疗性肽的药用组合物。
背景技术
眼睛的泪液分泌可保护并维持包括角膜、角膜缘、结膜、血管和眼睑的眼表面组织的完整性。泪液分泌对保护眼睛免受感染性因子和环境损伤影响具有重要性。通过泪液形成的液膜还为提供平滑光学表面和维持细胞健康所必需。
一种最常见的眼科病症为干眼综合症(也称为干燥性角膜结膜炎和“干眼”)。干眼是由会导致眼睛炎症和损伤的泪液不足或缺乏所定义。
干眼可能具有许多种病因。例如,干眼的暂时形式可能因眼睛创伤或感染的炎症反应所引起。其中,暂时性干眼可(例如)在局部眼自体免疫病症形成时变为长期性的。
干眼还可能因全身性病症引起。例如,休格伦氏综合症(Sjogren’ssyndrome)为通过其两种最常见症状眼干和口干识别的自体免疫疾病。休格伦氏综合症会导致对眼睛和口的粘膜和水分分泌腺造成免疫系统损伤。细胞和组织损伤会导致泪液和唾液生成减少。休格伦氏综合症通常伴随着其它的如类风湿关节炎和红斑狼疮的免疫系统疾病。
针对因休格伦氏综合症引起的干眼的当前治疗包括药品,如毛果芸香碱(Pilocarpine)、环孢霉素或西维美林(Cevimeline),这两者在经口服使用的情况下主要增加唾液生成。毛果芸香碱可呈滴眼剂形式投与,但必需考虑瞳孔的收缩和癫痫类型效应风险。
休格伦氏综合症仅为导致干眼的病症的一个实例,其缺乏无不可接受副反应的有效治疗。作为另一个实例,在美国约10%的视力受损是因葡萄膜炎(葡萄膜炎症)所致。葡萄膜包括虹膜、睫状体和脉络膜。葡萄膜炎在解剖学上最常被分类为前部、中间、后部或弥漫性。前部葡萄膜炎主要位于眼睛前段且包括虹膜炎和虹膜睫状体炎。中间葡萄膜炎(也称为周边葡萄膜炎)集中在紧接于睫状体和平坦部区域中虹膜和晶状体之后的区域,因此还可使用替代术语“睫状体炎”和“平坦部炎”。后部葡萄膜炎表示葡萄膜炎的许多种形式,包括视网膜炎、脉络膜炎和视神经炎。弥漫性葡萄膜炎意味着涉及眼睛所有部分(包括前部、中间和后部结构)的炎症。针对于葡萄膜炎的当前治疗包括主要局部应用和/或全身性类固醇疗法。
在美国,约6%的葡萄膜炎病例发生在儿童中,而国际人群中2.2到33.1%的葡萄膜炎病例发生在儿童和青少年中。小儿葡萄膜炎的一种主要病因是与包括以下的自体免疫疾病相关联:幼年特发性关节炎、反应性关节炎、僵直性脊椎炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(Crohnsdisease)、儿童期类肉瘤病和川崎病(Kawasakidisease)。小儿葡萄膜炎为儿童的主要健康问题,因为并发症包括带状角膜病变、青光眼、结核、白内障形成、黄斑水肿和视神经退化。慢性葡萄膜炎会导致致病和视力损失。
发明内容
本发明提供治疗包括干眼、葡萄膜炎、巩膜炎和眼睛的其它炎症病症的眼科病症的方法。本发明进一步提供治疗全身性自体免疫疾病的眼表现(如表层巩膜炎、角膜炎、视网膜血管炎或其它的涉及角膜、视网膜、巩膜和/或眼窝炎症的疾病)的方法。所述方法通过投与治疗有效量的含有以毒素为主的治疗性肽的药用组合物来治疗眼科病症。还提供识别将从所述治疗获益的个体的方法。
附图说明
图1提供一组显示ShK-186对经毒胡萝卜素刺激的人全血中炎症性细胞激素含量的效应的四个图。ShK-186是以剂量依赖方式抑制炎症性细胞激素介白素(IL)-2、IL-17、IL-4和干扰素(IFN)-γ。
图2提供一组显示ShK-186对经毒胡萝卜素刺激的人周边血液单核细胞(PBMC)中炎症性细胞激素含量的效应的四个图。ShK-186是以剂量依赖方式抑制炎症性细胞激素IL-2、IL-17、IL-4和IFN-γ。
图3A到3D显示依指示每天局部投与ShK-186或ShK-198三次后局部(眼睛)和全身(血浆)流体中ShK-186和ShK-198的定量。图3A显示发现局部投与的ShK-186以显著浓度存于经处理的右眼(RE)之前房房水中而不存于左眼(LE)或血浆(P)中,表明药物的眼内递送。图3B显示在取自未经处理的左眼(LE)的样本中不存在可检测的ShK-186但在经处理的右眼(RE)中存在显著量的药物。在给药21天后收集样本。图3C显示局部投与0.1%ShK-186或1%ShK-186持续7天导致眼睛前房中药物浓度以浓度依赖方式增加。全身暴露量低于检测水平(未显示)。1-1到1-4:经生理盐水媒剂处理;3-1到3-3:在P6N中的ShK-1860.1%溶液;4-1到4-4:在P6N中的ShK-1861%溶液。在第19天用29号针头回收前房房水,稀释并通过标准ELISA方法分析。图3D显示每天局部投与0.1%ShK-198或1%ShK-198三次持续7天导致眼睛中药物浓度以浓度依赖方式增加。全身暴露量低于检测水平(未显示)。2-1到2-4:经P6N媒剂处理;5-1到5-4:在P6N中的ShK-1980.1%溶液;6-1到6-4:在P6N中的ShK-1981%溶液。在第19天用29号针头回收房水,稀释并通过标准ELISA方法分析。
图4A到4D显示实验前部葡萄膜炎模型中局部投与ShK-186的疗效。图4A:ShK-186的局部投与使得实验自体免疫前部葡萄膜炎(EAAU)大鼠模型中的临床得分值减小。在通过免疫接种辅助黑色素相关抗原(MAA)乳液诱发EAAU后第11天、第13天、第15天和第18天使用裂隙灯对每只动物进行临床观察。基于瞳孔功能(缩小)、虹膜结构、前房中细胞的存在和前房中蛋白质的存在(红肿)来给出眼睛个别得分值。接着将得分值转换为每天综合临床得分值。发现从第0到第8天每天经0.1%ShK-186处理眼睛三次和从第9到第18天每天经1%ShK-186局部处理眼睛三次的动物的综合得分值明显低于用媒剂处理的那些。N=8只大鼠/16只眼睛。图4B:ShK-186的局部投与使得实验自体免疫葡萄膜炎的大鼠模型中总病理减低。左图:每天三次用媒剂(P6N)对动物给药。在免疫接种后第18天,观察到动物3-2具有13的综合临床得分值:缩小的瞳孔完全充满蛋白质(得分值=4),有一定程度损伤的充盈虹膜血管(得分值=3),许多浸润细胞存于前房中(得分值=4;未描绘出)和轻度红肿(得分值=2;未描绘出)。右图:动物从免疫接种诱发EAAU后第0天到(且包括)第8天接受0.1%ShK186继而在第9天开始接受1%ShK-186直到(且包括)第18天。在免疫接种后第18天,观察到动物4-8具有0的综合临床得分值:正常瞳孔(得分值=0),正常虹膜血管和结构(得分值=0),前房中不存在可见的细胞或蛋白质(各分别为得分值=0;未描绘出)。图4C:ShK-186的局部投与使得EAAU组织病理减低。将免疫接种辅助MAA后第19天收集于10%福尔马林中的眼睛切片并使用苏木精和伊红染色。观察眼睛切片且基于虹膜及睫状体结构和炎症性细胞浸润到虹膜和/或睫状体和前房的基质的程度(基于金姆(Kim)等人,韩国眼科学杂志(KoreanJ.Ophthalmol.)12,14-18(1998)中所概述的参数)由独立兽医病理学家来评分。(1.)对照健康眼睛(10X);(2.)及(4.)对来自经媒剂处理的动物的眼睛给出的组织病理学得分值为2(10X、40X);(3.)及(5.)对来自每天经0.1%ShK-186处理三次持续9天接着每天经1%ShK-186处理三次持续10天的动物的眼睛给出的组织病理学得分值为0(10X、40X)。(6.)基于对来自媒剂处理组(P6N)或如上所示ShK-186处理组(1%ShK-186)的四只眼睛的组织病理学分析的综合临床得分值。图4D:ShK-198的局部投与使得EAAU大鼠模型中的临床得分值减小。在通过免疫接种辅助MAA乳液诱发EAAU后第13天使用裂隙灯对每只动物进行临床观察。基于前房中细胞的存在(上图)和前房中蛋白质的存在或红肿(下图)来给出眼睛个别得分值。每天使用P6N媒剂或1%ShK-198局部处理大鼠眼睛三次。N=10只大鼠/20只眼睛。
具体实施方式
泪液分泌是通过具有紧密神经连接的复杂系统来调节,此由对身体、环境、微生物和情绪刺激的快速泪液分泌反应得到证实。泪液分泌组织包括泪腺、睑板腺、结膜杯状细胞和上皮细胞。泪液形成系统的完全或部分破坏会导致泪液生成不足,一种称为干眼的病症。
干眼可能是因局部性或全身性病症引起。例如,呈局部性病症的干眼可能是因眼表面应力所导致。这种眼睛应力可能是因感染和/或炎症因子(如细胞激素及趋化细胞激素)的调节受到破坏所致。这种病症可能是暂时的。然而,在其它实例中,在眼表面破坏期间,抗原呈现细胞(APC)可得以活化且使经过处理并呈现的自体抗原内化,由此促进自体免疫反应。所产生的组织损伤会引起持续自体免疫反应,从而导致对包括角膜、杯状细胞和上皮细胞的眼组织的破坏。这种破坏会最终导致持续干眼和炎症性眼睛疾病的其它表现。
干眼还可能是因包括休格伦氏综合症、眼瘢痕性类天疱疮和史蒂芬-强森综合症(Stevens-Johnsonsyndrome)的全身性自体免疫疾病所致。导致干眼的全身性自体免疫性还可能是起因于干细胞移植中的同种异体移植,表现为移植物抗宿主疾病。
导致干眼的局部性和全身性自体免疫反应一般使得自体反应性T-和/或B-细胞活化。一般来说在干眼中且更特定来说在休格伦氏综合症中,自体反应性T-细胞活化、分化和归巢到眼表面组织是与包括干扰素(IFN)-γ和介白素(IL)-17的细胞激素的增加相关联。IFN-γ改变角膜上皮细胞上的粘蛋白从而导致组织损伤和减小的杯状细胞密度。
关于干眼小鼠模型的实验进一步支持T-细胞在病症的发展和病理中的作用。斯特恩(Stern)等人(国际免疫学评论(Int.Rev.Immunol.)32:19-41,2013)通过暴露于产生干燥应力的条件来诱发小鼠干眼。数天后,小鼠呈现T-细胞浸润和增加的细胞激素含量(IFN-γ、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-17)。眼表面呈现细胞凋亡和细胞死亡,且泪液生成减少。
衍生自这些干眼小鼠(供者小鼠)的淋巴结及脾脏的CD4+T-细胞经移除并注射到T-细胞缺乏小鼠(受者小鼠)中。受者小鼠发展出与供者小鼠类似的干眼病症,包括T-细胞归巢到眼表面组织、增加的细胞激素含量、减低的杯状细胞密度、减低的泪液生成和减低的泪液更换。斯特恩等人的结论为衍生自供者小鼠的CD4+T-细胞足以诱发受者小鼠的干眼。所述结论与观测到活化CD4+T-细胞位于干眼患者的眼表面组织中一致。
与T-细胞浸润和活化相关联的炎症性眼睛疾病或病症包括棘阿米巴虫(acanthamoeba)感染、急性视网膜色素上皮炎、过敏、关节炎、细菌感染、贝塞特氏病(Behcet'sdisease)、贝塞特氏病相关视网膜炎、睑炎、化学品暴露、脉络膜炎、脉络膜视网膜炎症、克罗恩病(Crohn'sdisease)、结膜炎、糖尿病性视网膜病变、干眼、表层巩膜炎、眼睛瘀伤、眼睛创伤、食物过敏、异物暴露、真菌感染、荨麻疹、虹膜睫状体炎、虹膜炎、幼年特发性关节炎、角膜炎、狼疮、分枝杆菌感染、视神经视网膜炎、寄生虫感染、手术后病症、后部睫状体炎、视网膜血管炎、视网膜炎、类风湿关节炎、类肉瘤病、类肉瘤病相关视网膜炎、季节性过敏、巩膜炎、螺旋体感染、毒素暴露、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎和病毒感染。
许多种免疫相关疾病和代谢疾病(包括T-细胞介导的眼科病症)至少部分地归因于记忆T-细胞的作用。已知的记忆T-细胞的两种类别为:中央记忆T-细胞(TCM)和效应子记忆T-细胞(TEM)。
常在罹患免疫相关疾病的患者中观察到TEM扩增群体,且在一些情况中,这是影响调节T-细胞(Treg)的疾病的结果。Treg为抑制其它细胞(包括TEM)的免疫反应的T-细胞的一种类型。在不存在正常含量的Treg下,身体免疫反应变得不受控制并侵袭健康组织和器官。Treg功能的这种破坏会导致多种自体免疫疾病(包括眼科病症)。
活化后,TEM上调其Kv1.3K+离子通道表达。引起并造成损伤自体免疫过程结果的TEM高度依赖这些Kv1.3通道以维持为活化、增殖和细胞激素生成所需的细胞内钙含量。因此,TEM的增殖对Kv1.3K+通道阻断剂敏感。伍尔夫(Wulff)等人,临床研究杂志(J.Clin.Invest.),111,1703-1713(2003)。可表达Kv1.3通道且对炎症具重要性的其它细胞类型包括巨噬细胞、树突细胞、类别转换记忆B-细胞和小神经胶质细胞。
在不受理论约束下,认为本文中所公开的以毒素为主的治疗性肽可通过阻断Kv1.3K+通道有效地治疗干眼和其它炎症性眼科病症(包括与上调的TEM相关联的那些)。因此,本发明提供使用以毒素为主的治疗性肽来治疗如干眼和葡萄膜炎的免疫介导的眼科病症的方法。所述的以毒素为主的治疗性肽提供针对于免疫介导的眼科病症的新颖治疗选项,其可以比现有治疗更有利的安全特性减低自体免疫相关的眼睛损伤和干眼。
以毒素为主的治疗性肽
用于本文所公开的方法中的以毒素为主的治疗性肽的特定实例结合电压闸控通道。示例性的电压闸控通道包括Kv1.1、Kv1.2、Kv1.3、Kv1.4、Kv1.5、Kv1.6、Kv1.7、Kv2.1、Kv3.1、Kv3.2、Kv11.1、Kc1.1、Kc2.1、Kc3.1、Nav1.2、Nav1.4和Cav1.2。
毒素肽可由多种生物体产生并已演进成与离子通道和受体结合。衍生自蛇、蝎、蜘蛛、蜜蜂、蜗牛和海葵的天然毒素肽通常为10到80个氨基酸长且包含2到5个建立紧凑分子结构的二硫键。这些肽似乎已从小数目的结构架构演进。所述的肽丛集成为折迭形式的家族,其透过半胱氨酸/二硫回路结构保守以维持造成效能、稳定性和选择性结果的三维结构(彭宁顿(Pennington)等人,生物化学(Biochemistry),38,14549-14558(1999);图尔多(Tudor)等人,欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.),251,133-141(1998);及贾丁(Jaravine)等人,生物化学,36,1223-1232(1997))。
如本文中所使用,“以毒素为主的治疗性肽”包括表1的以毒素为主的肽(或其变体、D取代类似物、具有羧基末端的酰胺、修饰物、衍生物或药学上可接受的盐)或表2的以ShK为主的肽(或其变体、D取代类似物、具有羧基末端的酰胺、修饰物、衍生物或药学上可接受的盐)。以毒素为主的治疗性肽可以是合成或天然存在的。
“以毒素为主的肽”包括任何合成或天然已知的毒素肽和公开于表1中的那些肽和其变体、D取代类似物、具有羧基末端的酰胺、修饰物、衍生物和药学上可接受的盐。用于本文所公开的方法中的特定示例性的以毒素为主的治疗性肽包括列于表1中且如序列表中以SEQIDNO:225到256所显示的以毒素为主的肽。在各种实施例中,治疗眼科病症的方法包括投与以毒素为主的治疗性肽,包括表1的以毒素为主的肽(SEQIDNO:225到256)。在各种实施例中,表1的以毒素为主的肽(SEQIDNO:225到256)可用于制造可治疗眼科病症的药用组合物(或药物)。
“ShK”肽为也可用于本文所述的方法和药用组合物中的毒素肽的亚型。ShK肽最初是从加勒比海葵(Stichodactylahelianthus)单离得到的。ShK肽充当Kv1.3通道的抑制剂。通过抑制Kv1.3通道,ShK在某些实施例中可以皮摩尔浓度抑制TEM或通过TEM的活化、增殖和/或细胞激素生成。
如本文中所使用,“抑制剂”为任何的可减低或消除通常基于化合物与受体相互作用而产生的生物活性的以毒素为主的治疗性肽,所述生物活性包括生物合成和/或催化活性、受体或信号转导路径活性、基因转录或转译、细胞蛋白质输送等等。
天然ShK肽述于(例如)彭宁顿等人,国际肽蛋白质研究杂志(Int.J.Pept.ProteinRes.),46,354-358(1995)中。属于本发明范围的示例性的ShK结构还公开于比顿(Beeton)等人,分子药理学(Mol.Pharmacol.),67,1369-1381(2005);第2008/0221024号美国公开案;第WO/2012/170392号PCT公开案;和第8,080,523号和第8,440,621号美国专利中。
“以ShK为主的肽”包括任何合成或天然已知的ShK肽和其变体、D取代类似物、具有羧基末端的酰胺、修饰物、衍生物和药学上可接受的盐。
与本文中所公开的方法和药用组合物并用的特定示例性的以ShK为主的肽可包括列于表2中且如序列表中以SEQIDNO:1到224所显示的那些肽。在各种实施例中,一种治疗眼科病症的方法包括投与治疗有效量的表2的以ShK为主的肽(SEQIDNO:1到224)。在各种实施例中,表2的以ShK为主的肽(SEQIDNO:1到224)可用于制造可治疗眼科病症的药用组合物(或药物)。用于本文所公开的特定实施例中的以ShK为主的肽包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:49、SEQIDNO:210、SEQIDNO:217和SEQIDNO:221的那些肽。
所属领域的技术人员了解用于设计具有改良性质的以毒素为主的治疗性肽的技术,如丙氨酸扫描、使用已知序列和/或分子建模基于比对介导的突变形成的合理设计。例如,以毒素为主的治疗性肽可经设计以移除蛋白酶裂解部位(例如,在K或R残基处的胰蛋白酶裂解部位和/或在F、Y或W残基处的胰凝乳蛋白酶裂解部位)。非水解性磷酸盐取代还赋予对磷酸基团的稳定效应和抗磷酸酶的稳定性。非水解性磷酸基团包括磷酸酪氨酸的膦酸盐类似物,如4-膦酰基甲基苯丙氨酸(Pmp)、4-膦酰基二氟甲基苯丙氨酸(F2Pmp)、对膦酰基苯丙氨酸、单氟膦酰基甲基苯丙氨酸、磺基(二氟甲基)苯丙氨酸(F2Smp)和羟基膦酰基甲基苯丙氨酸。在其它实施例中,可使用磷酸酪氨酸拟似物,如(例如)OMT、FOMT和其它的如布尔克(Burke)和李(Lee),化学研究评论(Acc.Chem.Res.),36,426-433(2003)中所述的使用羧酸基以复制磷酸官能度的类似物。在另一个实施例中,非水解性类似物包括甲基-、芳氧基-和硫乙基膦酸。在另一个实施例中,非水解性磷酸盐衍生物包括二氟亚甲基膦酸和二氟亚甲基磺酸。
为增进以毒素为主的治疗性肽的结构的药物动力学和药效动力学(PK/PD)性质,可针对于对降解性质敏感的残基进行取代、置换或修饰。以酰胺修饰C-端酸官能基还可赋予稳定性。这些针对以毒素为主的治疗性肽的一级结构的改变可与N-端处阴离子性部分组合以得到稳定且具有选择性的Kv1.3阻断剂。为了制得具有较高活体内半衰期的以毒素为主的治疗性肽,可制得所述肽的变体或修饰物,其中关键蛋白质分解消化部位可经取代以降低蛋白酶感受性。这可包括非必需残基由保守电子等排置换物取代(例如,Lys置换为Lys(乙酰基)或Gln)和或由中性置换物(Ala)取代。
本文中所公开的以毒素为主的治疗性肽的“变体”包括相较本文中所公开的以毒素为主或以ShK为主的肽具有一个或多个氨基酸添加、缺失、终止位置或取代的肽。
氨基酸取代可以是保守或非保守取代。本文中所公开的以毒素为主的治疗性肽的变体可包括具有一个或多个保守氨基酸取代的那些肽。如本文中所使用,“保守取代”包括以下保守取代组别中一组中所存在的取代:组别1:丙氨酸(Ala;A)、甘氨酸(Gly;G)、丝氨酸(Ser;S)、苏氨酸(Thr;T);组别2:天冬氨酸(Asp;D)、谷氨酸(Glu;E);组别3:天冬酰氨酸(Asn;N)、谷氨酰胺(Gln;Q);组别4:精氨酸(Arg;R)、赖氨酸(Lys;K)、组氨酸(His;H);组别5:异白氨酸(Ile;I)、白氨酸(Leu;L)、甲硫氨酸(Met;M)、缬氨酸(Val;V);及组别6:苯丙氨酸(Phe;F)、酪氨酸(Tyr;Y)、色氨酸(Trp;W)。
另外,氨基酸可依类似功能、化学结构或组成(例如,酸性、碱性、脂肪族、芳香族、含硫)分组为保守取代组别。例如,出于取代的目的,脂肪族分组可包括Gly、Ala、Val、Leu和Ile。包含被视为对于另一种氨基酸的保守取代的氨基酸的其它组别包括:含硫:Met与Cys;酸性:Asp、Glu、Asn和Gln;小脂肪族、非极性或略为极性的残基:Ala、Ser、Thr、Pro和Gly;极性、带负电荷的残基和其酰胺:Asp、Asn、Glu和Gln;极性、带正电荷的残基:His、Arg和Lys;大脂肪族、非极性残基:Met、Leu、Ile、Val和Cys;和大芳香族残基:Phe、Tyr和Trp。其它信息可参见克赖顿(Creighton)(1984)蛋白质(Proteins),W.H.弗里曼公司(W.H.FreemanandCompany)。
本文中所公开的以毒素为主的治疗性肽的变体还包括相对本文中所公开的肽序列具有至少70%序列一致性、至少80%序列一致性、至少85%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的肽。
适合与本文中所公开的基于以毒素为主的肽的方法并用的以毒素为主的治疗性肽的变体包括共享以下序列一致性的肽:相对SEQIDNO:225到256中任一者70%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者75%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者80%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者81%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者82%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者83%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者84%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者85%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者86%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者87%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者88%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者89%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者90%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者91%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者92%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者93%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者94%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者95%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者96%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者97%序列一致性;相对SEQIDNO:225到256中任一者98%序列一致性;或相对SEQIDNO:225到256中任一者99%序列一致性。
适合与本文中所公开的基于以ShK为主的肽的方法并用的以毒素为主的治疗性肽的变体包括共享以下序列一致性的肽:相对SEQIDNO:1到224中任一者80%序列一致性;相对SEQIDNO:1到224中任一者81%序列一致性;相对SEQIDNO:1到224中任一者82%序列一致性;相对SEQIDNO:1到224中任一者83%序列一致性;相对SEQIDNO:1到224中任一者84%序列一致性;相对SEQIDNO:1到224中任一者85%序列一致性;相对SEQIDNO:1到224中任一者86%序列一致性;相对SEQIDNO:1到224中任一者87%序列一致性;相对SEQIDNO:1到224中任一者88%序列一致性;相对SEQIDNO:1到224中任一者89%序列一致性;相对SEQIDNO:1到224中任一者90%序列一致性;相对SEQIDNO:1到224中任一者91%序列一致性;相对SEQIDNO:1到224中任一者92%序列一致性;相对SEQIDNO:1到224中任一者93%序列一致性;相对SEQIDNO:1到224中任一者94%序列一致性;相对SEQIDNO:1到224中任一者95%序列一致性;相对SEQIDNO:1到224中任一者96%序列一致性;相对SEQIDNO:1到224中任一者97%序列一致性;相对SEQIDNO:1到224中任一者98%序列一致性;或相对SEQIDNO:1到224中任一者99%序列一致性。
特定的示例性的实施例包括以毒素为主的治疗性肽,其中所述肽相对式SEQIDNO:208共享80%序列一致性、85%序列一致性、86%序列一致性、87%序列一致性、88%序列一致性、89%序列一致性、90%序列一致性、91%序列一致性、92%序列一致性、93%序列一致性、94%序列一致性、95%序列一致性、96%序列一致性、97%序列一致性、98%序列一致性或99%序列一致性。在另一个实施例中,与本文中所公开的方法并用的变体包括相对式SEQIDNO:209共享80%序列一致性、85%序列一致性、86%序列一致性、87%序列一致性、88%序列一致性、89%序列一致性、90%序列一致性、91%序列一致性、92%序列一致性、93%序列一致性、94%序列一致性、95%序列一致性、96%序列一致性、97%序列一致性、98%序列一致性或99%序列一致性的肽。在另一个实施例中,适合与本文中所公开的方法并用的变体包括相对式SEQIDNO:217共享80%序列一致性、85%序列一致性、86%序列一致性、87%序列一致性、88%序列一致性、89%序列一致性、90%序列一致性、91%序列一致性、92%序列一致性、93%序列一致性、94%序列一致性、95%序列一致性、96%序列一致性、97%序列一致性、98%序列一致性或99%序列一致性的肽。在另一个实施例中,适合与本文中所公开的方法并用的变体包括相对式SEQIDNO:210共享80%序列一致性、85%序列一致性、86%序列一致性、87%序列一致性、88%序列一致性、89%序列一致性、90%序列一致性、91%序列一致性、92%序列一致性、93%序列一致性、94%序列一致性、95%序列一致性、96%序列一致性、97%序列一致性、98%序列一致性或99%序列一致性的肽。在另一个实施例中,适合与本文中所公开的方法并用的变体包括相对式SEQIDNO:218共享80%序列一致性、85%序列一致性、86%序列一致性、87%序列一致性、88%序列一致性、89%序列一致性、90%序列一致性、91%序列一致性、92%序列一致性、93%序列一致性、94%序列一致性、95%序列一致性、96%序列一致性、97%序列一致性、98%序列一致性或99%序列一致性的肽。
“序列一致性%”是指两个或两个以上序列之间的关系,如通过比对所述序列来确定。在本技术中,“一致性”还意味着肽序列之间的序列相关程度,如通过这类序列的序列串之间的匹配来确定。“一致性”(通常称为“相似性”)可由已知的方法容易地计算得到,所述方法包括述于以下文献中的方法:计算分子生物学(ComputationalMolecularBiology)(莱斯克A.M.(Lesk,A.M.)编辑)(牛津大学出版社,纽约(1988));生物计算:信息学和基因组计划(Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects)(史密斯D.W.(Smith,D.W.)编辑)(学术出版社,纽约(1994));序列数据之计算机分析,部分I(ComputerAnalysisofSequenceData,PartI)(格里芬A.M.(Griffin,A.M.)及格里芬H.G.(Griffin,H.G.)编辑)(胡马纳出版社(HumanaPress),新泽西州(1994));分子生物学中的序列分析(SequenceAnalysisinMolecularBiology)(范海涅G.(VonHeijne,G.)编辑)(学术出版社(1987));和序列分析引物(SequenceAnalysisPrimer)(哥博斯科夫M.(Gribskov,M.)和德弗罗J.(Devereux,J.)编辑)(牛津大学出版社,纽约(1992))。确定序列一致性的优选的方法是经设计以提供所测试序列之间的最佳匹配。确定序列一致性和相似性的方法是以可公开取得的计算机程序编码。序列比对和百分比一致性计算可使用激光基因(LASERGENE)生物信息计算软件包的美哥比对(Megalign)程序(丹斯达公司(DNASTAR,Inc.),威斯康星州麦迪逊)来进行。所述序列的多重比对还可使用克勒斯特(Clustal)比对法(希金斯和锋利奇迹博物馆(HigginsandSharpCABIOS),5,151-153(1989)以预设参数(GAPPENALTY=10,GAPLENGTHPENALTY=10)进行。相关程序还包括GCG程序套组(威斯康辛州(Wisconsin)软件包9.0版,遗传学计算机集团(GeneticsComputerGroup)(GCG),威斯康星州麦迪逊);BLASTP、BLASTN、BLASTX(阿尔丘尔(Altschul)等人,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215:403-410(1990);丹斯达(丹斯达公司,威斯康星州麦迪逊);和并有史密斯-华特曼(Smith-Waterman)算法的FASTA程序(皮尔森(Pearson),基因组学研究计算方法(Comput.MethodsGenomeRes.),[国际学术研讨会(Proc.Int.Symp.)](1994),会议日期1992年,111-20.编辑:舒豪伊、桑德尔(Suhai,Sandor)出版人:全体会议(Plenum),纽约。在本发明上下文中,应理解在使用序列分析软件来分析的情况下,分析的结果是基于所提及程序的“默认值”的。如本文中所使用,“默认值”将意味着在首次初始化时原本与软件一起负载的任何值或参数集。
“D取代类似物”包括具有一个或多个L-氨基酸经D-氨基酸取代的本文中所公开的以毒素为主的治疗性肽。D-氨基酸可以是与存于肽序列中的氨基酸相同的氨基酸类型或可以为不同的氨基酸。据此,D-类似物也为变体。
“修饰物”包括本文中所公开的以毒素为主的治疗性肽,其中一个或多个氨基酸已用非氨基酸组分置换,或其中所述氨基酸已与官能团共轭或官能团是以其它方式与氨基酸或肽结合。经修饰的氨基酸可以为(例如)糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分共轭的氨基酸、与人血清白蛋白共轭的氨基酸或与有机衍生剂共轭的氨基酸。经修饰的氨基酸的存在可有利于(例如)(a)延长肽血清半衰期和/或功能活体内半衰期、(b)降低肽抗原性、(c)增进肽储存稳定性、(d)增进肽溶解性、(e)延长循环时间、和/或(f)提高生物可使用性(例如,增加曲线下方面积(AUCsc))。氨基酸可例如在重组体产生期间进行共转译或转译后修饰(例如,在哺乳动物细胞中的表达期间在N-X-S/T基序处N-连接糖基化)或通过合成方法来修饰。经修饰的氨基酸可在序列中或在序列的末端。修饰物可包括如述于本文别处的衍生物。
C-端可为羧酸或酰胺基团,就各以毒素为主的治疗性肽来说,优选的是羧酸基团。本发明还涉及进一步经(i)对C-端进行如Tyr、碘-Tyr、荧光标签的添加、或(ii)对N-端进行如Tyr、碘-Tyr、焦谷氨酸盐或荧光标签的添加来修饰的以毒素为主的治疗性肽。
此外,可添加所属领域的技术人员所熟知的可提高稳定性的残基或残基群组到C-端和/或N-端。此外,可添加所属领域的技术人员所熟知的可增进口服利用率的残基或残基群组到C-端和/或N-端。
在特定的实施例中,C-端为酸(例如,COOH)或酰胺(例如,CONH2)。“酰胺”是指酸的C-端羟基(OH)由NH2取代。这种取代在本文中用术语“酰胺”来表示或表示为C-端氨基酸-NH2,如呈“–Cys-NH2”形式。
已研究多种治疗性肽的安全性、效能和特异性,且已显示肽附接到具有阴离子电荷的有机或无机化学实体可改良用于药用组合物中的适合性。附接位点可为N-端,但修饰并不受限于这一位点上的附接。
适当的化学实体的实例包括L-Pmp(OH2);D-Pmp(OH2);D-Pmp(OHEt);Pmp(Et2);D-Pmp(Et2);L-Tyr;L-Tyr(PO3H2)(对磷酸酪氨酸);L-Phe(p-NH2);L-Phe(p-CO2H);L-天冬氨酸;D-天冬氨酸;L-谷氨酸;和D-谷氨酸。使用的缩写定义如下:Pmp(对膦酰基甲基苯丙氨酸);和Ppa(对磷脂酰基苯丙氨酸)。PmP和Ppa的替代品包括Pfp(对膦酰基(二氟甲基)苯丙氨酸)和Pkp(对磷酸基甲基酮基苯丙氨酸)。
示例性的化学实体可借助于如氨基乙基氧基乙基氧基-乙酰基连接子(本文中称为AEEAc)的连接子、或通过任何其它适当的方法来附接。化学实体/连接子组合的实例包括AEEAc-L-Pmp(OH2);AEEAc-D-Pmp(OH2);AEEAc-D-Pmp(OHEt);AEEAc-L-Pmp(Et2);AEEAc-D-Pmp(Et2);AEEAc-L-Tyr;AEEAc-L-Tyr(PO3H2);AEEAc-L-Phe(p-NH2);AEEAc-L-Phe(p-CO2H);AEEAc-L-天冬氨酸;AEEAc-D-天冬氨酸;AEEAc-L-谷氨酸;和AEEAc-D-谷氨酸。一般在氨基酸残基具有手性中心的化学实体中,可使用氨基酸残基的D和/或L对映异构体。
本文中所公开的所有以毒素为主的治疗性肽可通过N-端附接氨基乙基氧基乙基氧基乙酸和/或C-端附接酰胺(例如,ShK-186;SEQIDNO:217)来修饰。AEEAc在用于描述形成过程中的连接子的情况下可互换地表示氨基乙基氧基乙基氧基乙酸和Fmoc-氨基乙基氧基乙基氧基乙酸。在用于指代呈最终状态的特异性肽中的连接子的情况下,所述术语是指氨基乙基氧基乙基氧基乙酸。
本文中所公开的所有以毒素为主的治疗性肽可通过添加聚乙二醇、人血清白蛋白、抗体、脂肪酸、包含Fab和Fc区的抗体片段、羟乙基淀粉、聚葡萄糖、低聚糖、聚唾液酸、透明质酸、糊精、聚(2-乙基2-噁唑酮)、聚谷氨酸(PGA)、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HPMA)、氨基酸(特定包括氨基酸Ala、Glu、Gly、Ser和Thr)的非结构化亲水性序列、和如施密特S.R.(Schmidt,S.R.)(编辑),针对于生物制药之融合蛋白:应用和挑战(FusionProteinTargetingforBiopharmaceuticals:ApplicationsandChallenges),约翰威利和圣子(JohnWileyandSons):新泽西州霍博肯,2013中所述的许多其它连接子和添加来修饰。可使用:(a)PEG碳酸琥珀酰亚胺酯、(b)PEG碳酸苯并三唑酯、(c)PEG二氯三嗪、(d)PEG三氟乙磺酸酯、(e)PEG碳酸对硝基苯酯、(f)PEG碳酸三氯苯酯、(g)PEG羰基咪唑和(h)PEG琥珀酸琥珀酰亚胺酯,将PEG基附接到赖氨酸的ε氨基。PEG基可经包括氨基甲酸苄酯的对-或邻-二硫化物的可分解连接子附接到半胱氨酸。PEG的定点引入可通过使用PEG-醛的还原烷基化或通过在存在氰基硼氢化钠下甘油醛修饰α-氨基来实现。聚乙二醇化化学已述于许多出版物中,包括罗伯特(Robert)等人,先进药物递送评论(AdvancedDrugDeliveryReviews),54,459-476(2002)。低聚糖可以是N-连接或O-连接。包括聚唾液酸的N-连接低聚糖是通过借助于附接到Asn-Xxx-Ser/Thr(其中Xxx为除脯氨酸外的任何者)的一致序列制造细胞株而添加。O-连接低聚糖附接到Ser或Thr。
特定的实施例包括经由氨基乙基氧基乙基氧基乙酰基连接子(称为AEEAc)附接到具有阴离子电荷的有机或无机化学实体的SEQIDNO:1-224的以毒素为主的治疗性肽。
以毒素为主的治疗性肽的另一个实例为ShK-186的以ShK为主的DOTA共轭物(称为ShK-221)。“DOTA”是指可经氨基己酸附接到本文所公开的治疗性肽的N-端的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸。DOTA共轭可提供用于螯合如铟或钆的金属原子的位置。可共轭到本文所公开的治疗性肽的其它分子包括二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、氮川三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、亚氨基二乙酸(IDA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N',N″-三乙酸(NOTA)和相关分子。
本发明进一步涉及所公开的以毒素为主的治疗性肽的衍生物。衍生物包括具有非环状排列的以毒素为主的治疗性肽,其中环状排列保留天然ShK肽的天然桥接形式。在一个实施例中,环化的以毒素为主的治疗性肽包括直链的以毒素为主的治疗性肽和肽连接子,其中所述直链的以毒素为主的治疗性肽的N-和C-端是经肽连接子连接以形成酰胺环化肽主链。在一些实施例中,肽连接子包括选自Gly、Ala和其组合的氨基酸。
各种环化方法可应用于本文所述的以毒素为主的治疗性肽。本文中所述的以毒素为主的治疗性肽可使用BOC-化学引入Ala、Gly或Ala/Gly桥和其组合或如由施耐泽(Schnolzer)等人,国际肽蛋白质研究杂志,40,180-193(1992)所述的其它残基而容易地环化。使以毒素为主的治疗性肽环化,可增进其稳定性、口服生物利用率且减低蛋白水解敏感性,而不会对以毒素为主的治疗性肽针对其特异性标靶的亲和力造成影响。
本文中所公开的各以毒素为主的治疗性肽还可包括于包括本文所公开的以毒素为主的治疗性肽序列的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、或60的任何位置上的添加、缺失、终止位置、取代、置换、共轭、缔合或排列。因此,在特定的实施例中,各以毒素为主的治疗性肽的各个氨基酸位置可为Xaa位置,其中Xaa表示所述氨基酸在特定位置上的添加、缺失、终止位置、取代、置换、共轭、缔合或排列。在特定的实施例中,各以毒素为主的治疗性肽在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、或60中的一个或多个位置上具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、或60个Xaa位置。
以毒素为主的治疗性肽可具有一处以上改变(添加、缺失、终止位置、取代、置换、共轭、缔合或排列)且称为变体、D取代类似物、具有羧基末端的酰胺、修饰物和/或衍生物中的一者或多者。也就是说,变体、D取代类似物、具有羧基末端的酰胺、修饰物和/或衍生物中一种类别的包含不排除包含在其它类别中且所有在本文中统称为“以毒素为主的治疗性肽”。一个实例包括SEQIDNO:1,其中在位置21上的氨基酸为正亮氨酸和/或在位置22上的氨基酸经二氨基丙酸置换。
在位置21上为Met的任何肽中,Met可经取代以赋予抗氧化的稳定效应。在一个实施例中,位置21上的Met经Nle取代。在位置21上具有Met的SEQIDNO:1到256中的任一者中,所述Met可经Nle取代。在位置22上具有Lys的SEQIDNO:1到256中的任一者中,所述Lys可经二氨基丙酸取代。因此,本文中所公开的一个实施例包括SEQIDNO:1,其中在位置21上的Met经Nle取代,酰胺存于C-端和/或阴离子部分存于N-端。
“非官能性氨基酸残基”是指具有缺乏酸性、碱性或芳香族基团的侧链的呈D-或L-形式的氨基酸残基。示例性的非官能性氨基酸残基包括M、G、A、V、I、L和Nle。
药用组合物
对于在所公开的方法中使用,可将以毒素为主的治疗性肽提供于药用组合物中。还可使用以毒素为主的治疗性肽的前药,且可通过添加酯基以增进其亲脂性因而在一些实施例中增进其跨角膜递送来制造。可使用合成的以毒素为主的治疗性肽、天然的以毒素为主的治疗性肽或天然和合成的以毒素为主的治疗性肽的混合物。
药用组合物包含以毒素为主的治疗性肽和至少一种药学上可接受的载剂。药学上可接受的载剂包括无论用于研究、预防性和/或治疗性治疗目的均不产生超出投与益处的明显不良、过敏或其它不希望呈现的反应的那些载剂。示例性的药学上可接受的载剂和相关配制品公开于特洛伊D.B.(Troy,D.B.)和贝林格P.(Beringer,P.)(编辑)雷明顿(Remington):科学和药学实践(TheScienceandPracticeofPharmacy)(利平科特(Lippincott));费城,2006.第21版中。所制得的药用组合物满足如生物标准品的美国食品和药品管理局(U.S.FoodandDrugAdministration)(FDA)和/或其它相关国外管理机构要求的灭菌、热原性和/或一般安全性和纯度标准。
典型地,可将以毒素为主的治疗性肽与基于所选投药模式选择的一种或多种药学上可接受的载剂混合。关于递送方法的实例,请参见第5,844,077号美国专利。
示例性的一般使用的药学上可接受的载剂包括任何和所有的吸收延迟剂、抗氧化剂、粘结剂、缓冲剂、增积剂、螯合剂、共溶剂、涂料、着色剂、崩解剂、分散介质、乳化剂、填充剂、调味剂、凝胶、等渗剂、润滑剂、香料、防腐剂、释放剂、盐、溶剂、稳定剂、甜味剂、表面活性剂、润湿剂等等。
示例性的缓冲剂包括柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、富马酸盐缓冲剂、葡萄糖酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐。
示例性的防腐剂包括苯酚、苄醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯化十八烷基二甲基苄铵、卤化苄烷铵、氯化六甲铵、对羟基苯甲酸烷酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
用于眼用溶液的防腐剂的更特定的实例包括苯扎氯铵(≤0.025%)、山梨酸、苄索氯铵(≤0.01%)、氯丁醇(≤0.5%)、乙酸苯汞(≤0.004%)、硝酸苯汞(≤0.004%)、硫柳汞(≤0.01%)、对羟基苯甲酸甲酯(0.1到0.2%)和对羟基苯甲酸丙酯(≤0.04%)。其它防腐剂还可充作经由破坏角膜上皮的疏水屏障的渗透促进剂且因此在眼科药用组合物中发挥双重作用。可使用的其它防腐剂包括汞衍生物、醇、对羟基苯甲酸酯、四级铵化合物、聚四级铵盐化合物、氯己啶、普瑞特(PURITE)(爱力根公司(Allergan,Inc.),加州尔湾市)和索菲亚(SOFZIA)(爱尔康公司(Alcon,Inc.),瑞士休伦堡(Hünenberg))防腐剂系统。防腐剂的包含在将药用组合物制备为包装在多剂量容器中的眼用溶液的情况下可特别有益于防止污染(例如,细菌污染)。
示例性的等渗剂包含多元糖醇、三元糖醇或更高级糖醇,如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
示例性的稳定剂包括有机糖、多元糖醇、聚乙二醇、含硫还原剂、氨基酸、低分子量多肽、蛋白质、免疫球蛋白、亲水性聚合物和多醣。
示例性的抗氧化剂包括α-生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、柠檬酸、半胱氨酸盐酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)、卵磷脂、金属螯合剂、甲硫氨酸、油可溶性抗氧化剂、磷酸、五倍子酸丙酯、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、山梨糖醇、酒石酸和维他命E。抗氧化剂的更特定的实例/量包括乙二胺四乙酸(≤0.1%)、亚硫酸氢钠(≤0.1%)、偏亚硫酸氢钠(≤0.1%)和硫脲(≤0.1%)。
示例性的润滑剂包括月桂基硫酸钠和硬脂酸镁。
示例性的药学上可接受的盐包括无机和有机加成盐,如乙酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、盐酸盐、羟乙基磺酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、磷酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、茶碱乙酸盐和三氟乙酸盐。还可使用低碳烷基季铵盐。
在特定的实施例中,可添加粘度增强剂到药用组合物,以使药用组合物在眼睛中留存得更久并延长药物与眼组织接触的时间继而增进药物渗透眼组织。在各种实施例中,在眼用溶液中的希望的粘度在25与50厘泊之间。示例性的粘度增强剂包括羧甲基纤维素(≤1%)、羟乙基纤维素(≤0.8%)、羟丙基甲基纤维素(≤1%)、甲基纤维素(≤2%)、聚乙烯醇(≤1.4%)、聚卡波菲、结兰胶、黄原胶、卡波姆(carbopol)、聚(苯乙烯-二乙烯苯)磺酸和聚乙烯吡咯烷酮(≤1.7%)。
适合与本文所述的以毒素为主的治疗性肽并用的渗透促进剂可包括可依照述于托马索(Tommaso)等人,眼科学调查与视力科学(InvestigativeOphthalmology&VisualScience),53(4),2292-2299(2012年4月)中的方法建构的基于经甲氧基聚乙二醇-己基取代的聚乳酸交酯(MPEG-hexPLA)的胶束配制品。还可使用二乙二醇单乙醚(TranscutolP)作为渗透促进剂。
可在药用组合物中使用增溶剂,包括泊洛沙姆-407(Poloxamer-407)、普尼克F68(PuronicF68)、普洛尼克F127(PluronicF127)、聚山梨醇酯、聚乙烯-35-蓖麻油、羟丙基-β-环糊精、甲基-β环糊精、琥珀酸正辛烯酯淀粉、其它环糊精、泰洛沙泊(tyloxapol)、琥珀酸α-生育酚聚乙二醇酯、中等链三酸甘油酯、芝麻油、花生油、红花子油、芥子油、大豆油、向日葵油、其它油、磷脂、表面活性剂、罗芬类(rofams)和含增溶剂的水包油型乳液。
以纳米颗粒及纳米乳液为主的系统可用于递送以毒素为主的治疗性肽,包括以聚ε己内酯、N-异丙基丙烯酰胺、乙烯基吡咯烷酮、丙烯酸、优特奇RS100(EudragitRS100)、优特奇RL100、聚(乳酸/乙醇酸)和诺法索伯(Novasorb)TM为主的那些。涂布聚-L-赖氨酸、藻酸盐或甲壳素的阳离子纳米乳液可使纳米乳液稳定并促使其与角膜相互作用。适用于以毒素为主的治疗性肽纳米乳液的其它阳离子脂质和赋形剂包括硬脂酰胺、油酰胺、聚乙烯亚胺、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N三甲铵(DOTAP)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、西曲溴胺(cetrimide)、苯扎氯铵、苄索氯铵、西他氯铵(cetalkoniumchloride)、苯度氯铵(benzododeciniumchloride)和十六烷基吡啶(cetylpyridinium)。可用于药用组合物中的其它纳米-或微米乳液组分包括渗透剂(甘露糖醇、甘油、山梨糖醇、丙二醇、右旋糖);油(中等链三酸甘油酯、三乙酸甘油酯、矿物油及植物油);和表面活性剂(聚山梨醇酯、克林莫佛(cremephore)、泊洛沙姆、泰洛沙泊、维生素-E-TPGS)。
可通过使用以结兰胶或聚丙烯酸聚合物为主的经离子活化的原位胶凝系统来增加以毒素为主的治疗性肽的角膜前滞留时间。以毒素为主的治疗性肽在眼表面的暴露可进一步通过使用卡多普(cardopol)凝胶、纤维素衍生物、海藻糖、羟甲基纤维素、泊洛沙姆407、聚山梨糖醇酯80、丙二醇、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮作为药用组合物的组分来增进。
可将多相分散载剂溶液用于药用组合物,包括索菲森(Sophisen)TM、3A奥拓诺(3AOfteno)TM和摩多斯克-A奥拓诺(Modusik-AOfteno)TM。
脂质体配制品(包括阳离子脂质体)可用作用于以毒素为主的治疗性肽的载剂,且包括l-α-二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、磷脂、胆固醇、司盘40(Span40)、硬脂胺和脱氧胆酸。
以毒素为主的治疗性肽还可经配制为储积制剂(depotpreparation)。储积制剂可用适当的聚合或疏水物质(例如,呈在可接受油中的乳液形式)或离子交换树脂配制、或可经配制为可微溶衍生物(例如,呈可微溶盐形式)。这类长效药用组合物可以任何适当的方式投与。
适合眼睛投与以毒素为主的治疗性肽的药用组合物还包含可增进药物接触且吸收进入眼表面的软膏。眼用软膏可包含矿物油、白矿脂或羊毛脂且可具有接近体温的熔化温度。
可使用生物可降解聚合物实现以毒素为主的治疗性肽的持续释放。实例包括明胶、白蛋白、聚原酸酯、聚酸酐、聚乙烯醇、聚酯、D-、L-及DL-乳酸的聚合物、和乳酸和乙醇酸的共聚物。这类聚合物可用于结膜下和眼内植入物。
另外,可使用固体聚合物的半渗透基质将以毒素为主的治疗性肽配制为持续释放型系统。已确立各种持续释放型材料且为所属领域的技术人员所熟知。持续释放型系统可根据其化学性质在投与后释放出以毒素为主的治疗性肽达数周到超过100天。
本文中所公开的药用组合物还可使用微胶囊化(参见:例如,第4,352,883号、第4,353,888号和第5,084,350号美国专利);连续释放型聚合物植入物(参见:例如,第4,883,666号美国专利);和大胶囊化(参见:例如,第5,284,761号、第5,158,881号、第4,976,859号和第4,968,733号美国专利和已公开的PCT专利申请案WO92/19195、WO95/05452)。
在特定的实施例中,药用组合物可经制备为滴眼剂、结膜下植入物、眼内植入物、眼内注射液、玻璃体内注射液、玻璃体内植入物、眼球筋膜囊下(sub-Tenon’scapsule)注射液和在泪管塞(punctualplug)中。
用于眼睛投与的适当的药用组合物包括溶液和悬浮液。溶液为无菌的且不含颗粒。悬浮液为包含固体颗粒的水性配制品。所述颗粒尺寸一般为小于10微米以防止刺激作用,例如10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1微米、或小于1微米。在各种实施例中,所述颗粒尺寸为大于10微米。在一个实施例中,颗粒尺寸均等。在另一个实施例中,所有所述颗粒是在平均颗粒尺寸的1微米范围内。在另一个实施例中,所有所述颗粒是在平均颗粒尺寸的2微米范围内。对于直接投与眼睛来说,药用组合物可为滴眼剂。
用于注射的药用组合物可以单位剂型(例如)以玻璃安瓿或多剂量容器(例如玻璃小瓶)呈现。用于注射的药用组合物可采用如在油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液的形式,且可包含如悬浮剂、稳定剂、防腐剂和/或分散剂的配制剂。
以毒素为主的治疗性肽和/或药用组合物可呈适合在递送时复水的粉末形式。在另一个实施例中,以毒素为主的治疗性肽的单位剂型可为在灭菌、气密式密封安瓿或灭菌针筒中的含于适当的稀释剂中的以毒素为主的治疗性肽的溶液。
在另一个实施例中,冻干药用组合物包含小于5%水含量。在另一个实施例中,冻干药用组合物包含小于4.0%水含量。在另一个实施例中,冻干药用组合物包含小于2%水含量。在一个实施例中,冻干药用组合物包含8到12%乙酸盐含量(以重量计)。在另一个实施例中,冻干药用组合物包含10到11%乙酸盐含量(以重量计)。
就非经肠投与来说,可使以毒素为主的治疗性肽溶解于药学上可接受的载剂中并呈溶液或悬浮液形式投与。示例性的药学上可接受的载剂包括水、生理盐水、右旋糖溶液、果糖溶液、乙醇、或动物油、植物油、或合成油。载剂还可包含其它成分,例如,防腐剂、悬浮剂、增溶剂、缓冲剂等。
就口服投与来说,以毒素为主的治疗性肽可经配制为如胶囊、丸剂、片剂、口含片、颗粒、熔体、粉末、悬浮液、或乳液的固体或液体制剂。在呈口服剂型的组合物的制备中,可使用任何常见药学上可接受的载剂,例如,就口服固体制剂(例如粉末、胶囊及片剂)来说,载剂,如,淀粉、糖、稀释剂(如蔗糖、乳糖、或淀粉)、粒化剂、润滑剂(如硬脂酸镁)、粘结剂、崩解剂、缓冲剂等;或就口服液体制剂(例如乳液、糖浆、悬浮液、酏剂和溶液)来说,水、二醇、油、醇、防腐剂、着色剂、悬浮剂等。此类组合物还可包含佐剂,如润湿剂、甜味剂、调味剂和香料。片剂和胶囊因为其易于投与而可代表有利的口服单位剂型,在所述情况中,显然可使用固体药用载剂。必要时,片剂可通过标准技术包覆糖衣或肠衣。
用于口服投与的制剂可经适当配制以提供以毒素为主的治疗性肽的可控释放。举例来说,以毒素为主的治疗性肽可经囊封使其稳定以通过胃肠道而在某些实施例中同时允许越过血脑屏障。参见(例如)WO96/11698。
就经颊内投与来说,组合物可采用以常规方法配制的片剂或口含片的形式。
就经鼻或经肺投与或任何其它经吸入投与来说,以毒素为主的治疗性肽可方便地在使用适当的推进剂,例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳、或其它适当的气体或气体混合物下呈用于加压包装或喷雾器的气雾剂特征的形式递送。
在经鞘内投与以毒素为主的治疗性肽的情况下,还可将其溶解在脑脊髓液中。还可使用移植到CNS的裸或未经囊封的细胞移植物。参见:例如,第5,082,670号和第5,618,531号美国专利。
如pH、渗透压和粘度的药用组合物属性可经调整,以使以毒素为主的治疗性肽稳定;以可有效递送到眼睛和其结构;且可改善个体舒适度。可添加缓冲剂到药用组合物以调整pH为在4.5与11.5之间的范围,且一般是在6.5到8.5范围内。
呈眼用溶液的包含以毒素为主的治疗性肽的示例性的药用组合物包含磷酸盐作为缓冲剂,其中pH经调整为6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。溶液的渗透压可通过添加0.9%氯化钠(可接受浓度范围为从0.6到1.8%氯化钠)实现与泪液等渗或等张。
“呈单位剂型的药用组合物”意味着适合医疗投与的物理离散相干单位,各单位包含治疗有效量、或倍数(多达四倍)或分数(低到四十分之一)治疗有效量的以毒素为主的治疗性肽以及药学上可接受的载剂。药用组合物是包含日剂量、或(例如)一半、三分之一或四分之一日剂量将取决于药用组合物是否分别每天投与一次或(例如)两次、三次或四次。
药用组合物中以毒素为主的治疗性肽的量和浓度可基于临床相关因素、所述以毒素为主的治疗性肽在载剂中的溶解度、所述以毒素为主的治疗性肽的效能和活性和所述药用组合物的投与方式进行选择。仅需要所述以毒素为主的治疗性肽构成治疗有效量,也就是说,使得适当的有效剂量将与以单或多单位剂量使用的剂型一致。
药用组合物一般将包含以总组合物重量计0.0001到99重量%、优选地0.001到50重量%、更优选地0.01到10重量%的以毒素为主的治疗性肽。
在各种实施例中,以毒素为主的治疗性肽可以从0.001mg/ml到500mg/ml的含量存在。在其它实施例中,以毒素为主的治疗性肽可以0.001、0.01、0.1、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、150、200、250、300、350、400、450或500mg/ml的含量提供。
用于本文所公开的方法中的具有最佳稳定性和溶解度的一种示例性的药用组合物包含显示于表3中的组分:
表3.实例药用组合物
其它以毒素为主的治疗性肽可与相同或类似配制品并用。
除了以毒素为主的治疗性肽之外,药用组合物还可包含其它药物或生物活性剂。其它药物或生物活性剂的实例包括镇痛剂、细胞激素和在所有重要临床药物领域的治疗剂。混合液(cocktail)为任何一种以毒素为主的治疗性肽与另一种药物或生物活性剂的混合物。在这一实施例中,常见投药媒剂(例如,丸剂、片剂、植入物、泵、注射溶液等等)可包含与其它药物或生物活性剂组合的以毒素为主的治疗性肽两者。
使用方法
本发明的药用组合物适用于治疗眼科病症的方法。这类方法包括投与有需要的个体治疗有效量的含有以毒素为主的治疗性肽的药用组合物。在一个特定的实施例中,药学上可接受的盐可为乙酸盐,如乙酸钾或乙酸钠,且所述药用组合物是在水性载剂中提供。
可依本文所公开的方法治疗的眼科病症包括干眼、葡萄膜炎、巩膜炎和其它炎症性眼睛疾病,如眼内炎、瘢痕性类天疱疮、莫伦氏溃疡(Mooren’sulcer)、巨大细胞病毒介导的视网膜炎和其它病毒介导的炎症性眼睛疾病。本发明进一步提供用于治疗全身性自体免疫疾病的眼睛表现(如表层巩膜炎、角膜炎、视网膜血管炎或其它涉及角膜、视网膜、巩膜和眼窝的炎症的疾病)的方法。具有眼睛表现的全身性自体免疫疾病的实例包括全身性红斑狼疮、显微镜下多血管炎、结节性多动脉炎、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)(肉芽肿病合并多血管炎)、类肉瘤病、贝塞特氏综合症、伏格特-小柳-原田病(Vogt-Koyanagi-Haradadisease)、高安氏动脉炎(Takayasu'sarteritis)、类风湿关节炎、休格连氏综合症(Sjorgen’ssyndrome)、复发性多软骨炎、僵直性脊椎炎、银屑病和彻奇-斯全司综合症(Churg-Strausssyndrome)。所治疗的干眼可能是因局部性或全身性免疫反应所致,或可能具有其它病因。
在不限制上文的情况下,可依本文所公开的方法治疗的炎症性眼科病症包括与T细胞浸润和活化相关联的眼睛疾病或眼科病症且还包括与局部性和/或全身性自体免疫疾病相关联的眼科病症。炎症性眼科病症为眼科病症的子组。示例性的炎症性眼科病症包括以下和/或是与以下相关联(例如,是因以下引起):棘阿米巴虫感染、急性视网膜色素上皮炎、过敏、干细胞移植中的同种异体移植表现为移植物抗宿主疾病、僵直性脊椎炎、关节炎、细菌感染、贝赛特氏病、与贝赛特氏病相关的视网膜炎、睑炎、瘢痕性类天疱疮、化学品暴露、脉络膜炎、脉络膜视网膜炎症、彻奇-斯全司综合症、克罗恩氏病、结膜炎、巨大细胞病毒介导的视网膜炎、糖尿病性视网膜病变、干眼、眼内炎、表层巩膜炎、眼睛瘀伤、眼睛创伤、食物过敏、异物暴露、真菌感染、荨麻疹、虹膜睫状体炎、虹膜炎、幼年特发性关节炎、川崎病、角膜炎、干燥性角膜结膜炎、狼疮、显微镜下多血管炎、莫伦氏溃疡、分枝杆菌感染、视神经视网膜炎、寄生虫感染、小儿葡萄膜炎、结节性多动脉炎、手术后病变、后部睫状体炎、银屑病、反应性关节炎、复发性多软骨炎、视网膜血管炎、视网膜炎、类风湿关节炎、类肉瘤病、与类肉瘤病相关的视网膜炎、季节性过敏、巩膜炎、休格连氏综合症、螺旋体感染、史蒂芬-琼森综合症、全身性红斑狼疮、高安氏动脉炎、毒素暴露、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、病毒感染、伏格特-小柳-原田病和韦格纳氏肉芽肿病(肉芽肿病合并多血管炎)。
本文中所公开的方法包括使用本文中所公开的药用组合物治疗个体(人、兽类动物(狗、猫、爬行动物、鸟类等等)、活家畜(马、牛、山羊、猪、鸡等等)和研究动物(猴、大鼠、小鼠、鱼等等)。治疗个体包括递送治疗有效量的药用组合物。治疗有效量包括那些可提供有效量、预防性治疗和/或治疗性治疗的治疗有效量。
“有效量”为在个体中实现所预期生理改变所需的药用组合物量。有效量通常是出于研究目的投与。本文中所公开的有效量实现打算研究药用组合物在治疗眼科病症中的有效性的研究试验中所希望的生理改变。有效量可减少TEM群体(也就是说,减低增殖);减低TEM的活化,如通过细胞激素生成(例如,IFN-γ;IL-2;IL-4;IL-10;IL-17和IL-21)和/或穿孔蛋白生成测得;和/或减低Kv1.3通道的表达。可基于与源自相同个体的先前测量的参考水平或相较于从群体数据库得到的参考水平的比较来观察所述减低情况。
“预防性治疗”包括投与给未呈现眼科病症的征兆或症状或仅呈现眼科病症的早期征兆或症状的个体的治疗使得出于消除、预防、或降低进一步发展出眼科病症风险的目的来投与所述治疗。因此,预防性治疗是充当针对于眼科病症的预防性治疗。作为一个实例,针对如干眼的炎症性眼科病症的预防性治疗可消除、预防或降低发展出如以下的会导致干眼诊断的症状风险:眼睛刺痛或灼伤;好像有东西在眼睛中的沙粒感;在严重干眼期后过量流泪的发作;眼睛丝粘性排出物;眼睛疼痛和泛红;视力障碍发作;和/或沉重眼睑,这是为所属领域的技术人员所了解的。假如个体极大机率地暴露于会导致干眼的条件,如季节性改变、自体免疫疾病的发展或突发、暴露于病毒或受病毒感染、暴露于花粉或导致季节性过敏的其它刺激等,其存在发展出会导致干眼诊断的症状的风险。作为另一实例,针对如葡萄膜炎的炎症性眼科病症的预防性治疗可消除、防止或降低发展出如以下的会导致葡萄膜炎诊断的症状的风险:眼睛泛红;眼睛疼痛;对光敏感;视力障碍;视野暗、漂浮点(漂浮性黑影(floater));视力下降;和/或在眼睛内侧眼睛着色区域下部(虹膜)前方的略带白色区域(前房积脓),这是为所属领域的技术人员所了解的。如所属领域的技术人员所了解,可通过熟知的客观和/或主观测量法来评估这些所述参数中的每一种。
“治疗性治疗”包括投与给呈现眼科病症症状或征兆的个体的治疗且是出于减轻或消除那些眼科病症征兆或症状的目的而投与。治疗性治疗可减低、控制或消除眼科病症的呈现或活性和/或减低、控制或消除眼科病症的副作用。作为一实例,对如干眼的炎症性眼科病症的治疗性治疗可减低、控制或消除会导致干眼诊断的症状,如眼睛刺痛或灼伤;好像有东西在眼睛中的沙粒感;在严重干眼期后过量流泪的发作;眼睛丝粘性排出物;眼睛疼痛和泛红;视力障碍发作;和/或沉重眼睑,这是为所属领域的技术人员所了解的。作为另一实例,对如葡萄膜炎的炎症性眼科病症的治疗性治疗可减低、控制或消除会导致葡萄膜炎诊断的症状,如眼睛泛红;眼睛疼痛;对光敏感;视力障碍;漂浮性黑影;视力下降;和/或在眼睛内侧虹膜下部前方的前房积脓,这是为所属领域的技术人员所了解的。如所属领域的技术人员所了解,可通过熟知的客观和/或主观测量法来评估这些所述参数中的每一种。
对于投药来说,有效量和治疗有效量(本文中也称为剂量)可在一开始时根据活体外分析和/或动物模型研究结果进行估计。例如,剂量可经过在动物模型中配制以实现循环浓度范围,所述循环浓度范围包括如在细胞培养中测得的抗活化、增殖、细胞激素生成和/或TEM的穿孔蛋白生成的IC50。这一信息可用于更准确地确定在受关注个体中的有用剂量。
以治疗有效量投与给特定个体的实际量可由医师、兽医或研究人员考虑如物理和生理因素(包括标靶、体重、病症严重度、眼科病症类型、先前治疗性干预或并用的治疗性干预、个体自发病和投药途径)的参数来确定。
剂量可经过适当调整以在局部或全身得到所预期的以毒素为主的治疗性肽含量。典型地,本发明的以毒素为主的治疗性肽在从0.001mg/kg到250mg/kg,优选地从0.01mg/kg到100mg/kg以毒素为主的治疗性肽,更优选地从0.05mg/kg到75mg/kg以毒素为主的治疗性肽的剂量范围下呈现其疗效。一适当剂量可以每天分多次子剂量投与。典型地,剂量或子剂量可包含0.1mg到500mg以毒素为主的治疗性肽/单位剂型。一种更优选的剂量将包含0.5mg到100mg以毒素为主的治疗性肽/单位剂型。
其它有用的剂量常在0.001到10,000微克(μg)以毒素为主的治疗性肽/千克(kg)身体质量范围,在1到5,000μg/kg身体质量范围内、在1到1,000μg/kg身体质量范围内或在1到100μg/kg身体质量范围内。通常,剂量可在从0.1到5μg/kg或从0.5到1μg/kg范围内。在其它实例中,剂量可包括1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、60μg/kg、65μg/kg、70μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、85μg/kg、90μg/kg、95μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、250μg/kg、300μg/kg、350μg/kg、400μg/kg、450μg/kg、500μg/kg、550μg/kg、600μg/kg、650μg/kg、700μg/kg、750μg/kg、800μg/kg、850μg/kg、900μg/kg、950μg/kg、1,000μg/kg、1,500μg/kg、2,000μg/kg、2,500μg/kg、3,000μg/kg、3,500μg/kg、4,000μg/kg、5,000μg/kg、6,000μg/kg、7,000μg/kg、8,000μg/kg、9,000μg/kg、10,000μg/kg、0.1到5mg/kg或0.5到1mg/kg。在其它实例中,剂量可包括1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg或50mg/kg。
当使用混合物时,常见投与媒剂(例如,丸剂、片剂、植入物、泵、可注射溶液等等)可同时包含以毒素为主的治疗性肽和其它药物或药剂。所述混合物的个别组分可个别地以治疗有效量投与或其组合投与可产生治疗有效量。
在特定的实施例中,剂量可以较低水平开始接着增加直到实现所预期效果。如果在所述剂量下个体中的反应过低,则可在个体耐受性允许的程度上使用甚至更高的剂量(或有效较高剂量,通过不同的更局部的递送途径)。预期在例如24小时连续给药或每天多次剂量以实现以毒素为主的治疗性肽的适当的全身性或组织特异性含量。
治疗有效量可通过在治疗疗程中投与单次或多次剂量(例如,每天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次、每天八次、每天九次、每天十次、每2天一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每周一次、每2周一次、每3周一次、每月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次、每10个月一次、每11个月一次或每年一次)来实现。
药用组合物可结合一种或多种可缓解眼科病症症状的全身或局部用产品如人工泪液、抗生素、环孢霉素或皮质类固醇投与。
可实行多种投药途径。所选的特定模式可取决于递送的特定药用组合物、所治疗眼科病症的严重度和提供治疗有效量所需要的剂量。可使用医学上可接受的任何投药模式,意味着可提供治疗有效量的以毒素为主的治疗性肽,而根据合理医学判断不会产生超过投药效益的临床上不可接受副作用的任何模式。示例性的投药途径包括动脉内、皮内、病灶内、淋巴内、肌肉内、鼻内、结内、眼内、非经肠式、腹膜内、前列腺内、直肠内、鞘内、瘤内、阴道内、静脉内、囊泡内、玻璃体内、经口、皮下、舌下和/或经局部投与,且更特定来说是通过动脉内、皮内、病灶内、淋巴内、肌肉内、鼻内、结内、眼内、非经肠式、腹膜内、前列腺内、直肠内、鞘内、瘤内、阴道内、静脉内、囊泡内、玻璃体内、经口、皮下和/或舌下注射。
药用组合物可以呈滴眼剂、结膜下植入物、眼内植入物、眼内注射液、玻璃体内注射液、玻璃体内植入物、眼球筋膜囊下注射液和在泪管塞中经局部递送到眼睛和附器。药用组合物的递送还可通过超音或离子导入来促进。
对于药用组合物的投与来说,一种适当的途径为注射。执业医师根据个体和如皮下、静脉内等等的注射类型当可了解经由注射的投药方法。第7,918,824号美国专利公开适用于个体使用的针筒。
以毒素为主的治疗性肽的投与还可使用泵来实现(参见:例如,鲁尔(Luer)等人,药物疗法年报(TheAnnalsofPharmacotherapy),27,912(1993),齐默(Zimm)等人,癌症研究(CancerResearch),44,1698(1984)和埃廷格(Ettinger)等人,癌症(Cancer),41,1270(1978))。
或者,可使用靶向疗法,以通过使用如抗体或细胞特异性配体的靶向系统将以毒素为主的治疗性肽更特定地递送到特定细胞类型。
药用组合物还可在以细胞为基础的递送系统中进行投与,其中引入编码以毒素为主的治疗性肽的核苷酸序列到经设计用于植入个体体内(例如,植入眼睛中)的细胞中。在其它实施例中,可投与核苷酸序列并经转染进入个体细胞中。
适当的核苷酸序列可以各别以毒素为主的治疗性肽以所公开序列和已知基因码为基础合成制得。简单地说,术语“基因”是指编码以毒素为主的治疗性肽的核酸序列。所述定义包括各种序列多态性、突变和/或序列变体,其中这类改变不会影响经编码的以毒素为主的治疗性肽的功能。术语“基因”可不仅包括编码序列而且包括如启动子、增强子和终止区域的调控区域。所述术语可进一步包括从mRNA转录接合的所有内含子和其它DNA序列和起因于替代接合位点的变体。编码以毒素为主的治疗性肽的核酸序列可为引导以毒素为主的治疗性肽的表达的DNA或RNA。这些核酸序列可为转录为RNA的DNA股序列或转译为蛋白质的RNA序列。核酸序列包括全长核酸序列和衍生自全长蛋白质的非全长序列。所述序列还包括天然序列或可经引入以于特定细胞类型中优先提供密码子的序列的简并密码子。编码本文所公开的以毒素为主的治疗性肽的基因序列可于可公开取得的数据库和公开案中取得。
在一些实施例中,多核苷酸包括质体、cDNA或mRNA,其可包括(例如)用于表达以毒素为主的治疗性肽的序列(例如,基因)。适当的质体包括可用于将基因转移到细胞的标准质体载体和微环(minicircle)质体。多核苷酸(例如,微环质体)可进一步包括任何其它序列信息以促使遗传物质(例如,编码以毒素为主的治疗性肽的序列)转移到细胞。例如,多核苷酸可包括启动子,如一般启动子、组织特异性启动子、细胞特异性启动子和/或对细胞核或细胞质具特异性的启动子。启动子和质体(例如,微环质体)为所属领域熟知的且可使用常规技术制得。如本文中进一步所述,多核苷酸可用于转染细胞。除非另作指明,否则术语转染、经过转染或使……转染可用于指示细胞中存在外源多核苷酸或由其表达的肽。已知许多种载体能够介导基因到细胞的转移,正如所属领域所知。
在特定的实施例中,这种递送方法可用于脊髓区域。适当的递送系统述于第5,550,050号美国专利及已公开的PCT申请案号WO92/19195、WO94/25503、WO95/01203、WO95/05452、WO96/02286、WO96/02646、WO96/40871、WO96/40959和WO97/12635中。
本发明还提供筛选罹患干眼或其它眼科病症的个体以评估本文所公开的方法在所筛选个体中的潜在治疗效益的方法。在一个实施例中,Kv1.3通道在个体的T-细胞群体中的表达水平是使用检测所述通道的表面表达的抗体来评估。可实施这些方法的抗钾通道Kv1.3(细胞外)抗体可从Alomone(以色列)购得;抗体还可从寿命生物科学公司(LifeSpanBiosciences,Inc.)(美国华盛顿州西雅图)购得。Kv1.3通道水平可指示可有效通过本文所公开的以毒素为主的治疗性肽来治疗的眼科病症。
为识别出将从本文所公开的方法获益的个体,将个体Kv1.3通道水平与从数据库得到的参考水平进行比较。来自数据库的参考水平可源自相同个体中先前测量或可衍生自群体。“群体”为具有类似指定特征的个体的任何分组。可根据(例如)临床参数、临床评估、治疗性疗法、疾病状态(健康或患有本文所公开的眼科病症)、眼科病症的严重度等等来分组。
“数据库”如本文中使用为从在希望的条件下评估样本(或样本群体)所得到的数值集。数据库数值可(例如)通过以实验方式从样本得到测量值和由这些测量值建构数据库来得到。如所属领域的技术人员所了解,参考水平可以是基于(例如)所属领域中有用并已知的用于从个别数据点集;例如,平均值、中位数、平均值中位数等等实现有意义汇总参考水平的任何数学或统计公式。或者,参考水平或可建立参考水平的数据库可从如实验室的服务提供场所或从数据库或已储存数据库的服务器得到。
在特定的实施例中,个体可基于Kv1.3通道水平在统计上与源自过去曾从所公开治疗获益的群体的参考水平无明显差异选择为将从本文所公开的治疗获益者。在其它实施例中,个体可基于Kv1.3通道水平与源自罹患本文所公开的眼科病症的群体的参考水平无统计显著差异选择为将从本文所公开的治疗获益者。在其它特定的实施例中,个体可基于Kv1.3通道水平统计上明显高于源自健康群体的参考水平选择为将从本文所公开的治疗获益者。
Kv1.3通道水平无明显差异,假如所述差异是在将预期仅基于偶然性发生的程度范围内。相对来说,统计显著差异或增加为大于将预期仅偶然发生者。统计显著性或无统计显著性可通过所属领域中熟知的任何多种方法来确定。统计显著性的常用量度的一个实例为p-值。p-值表示得到与特定数据点相当的特定结果的机率,其中所述数据点是以仅随机偶然性的结果为基础。一结果在小于或等于0.05的p-值下通常被视为显著(而非随机偶然)。
所述筛选方法可用于指导个体治疗。例如,假如个体Kv1.3通道水平将个体识别为将从本文所公开的方法获益者,则可对所述个体开立或提供治疗有效量的本文所公开的药用组合物。筛选方法的所述结果还可(例如)用于提供临床决策支持,如确定是否延长干预或治疗时间,用于推荐对处在风险状态的患者进行预防性体检,用于推荐提高就诊频率,用于推荐增加测试次数,和/或用于推荐干预。所述方法的结果还可用于治疗选择,确定对治疗、调整和治疗给药的反应,监测持续性治疗效率,且指示治疗疗法的变动。
制造方法
以毒素为主的治疗性肽可使用重组DNA技术来制造。以毒素为主的治疗性肽还可使用梅里菲尔德(Merrifield)固相合成法制得,然而,还可使用所属领域中已知的其它相当的化学合成。固相合成法是从以毒素为主的治疗性肽的C-端通过使受保护α-氨基酸与适当的树脂偶联开始。这种起始物质可通过使α-氨基受保护的氨基酸经酯键附接到氯甲基化树脂或羟甲基树脂、或经酰胺键附接到二苯甲基胺(BHA)树脂或对甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂制得。波丹斯基(Bodansky)等人,应用化学(Chem.Ind.)(伦敦)38,1597(1966)描述羟甲基树脂的制法。氯甲基化树脂可从伯乐实验室(BioRadLaboratories)(加州里奇蒙)和从实验室系统公司(Lab.Systems,Inc.)得到。斯特尔特(Stewart)和杨(Young),固相肽合成(Solidphasepeptidesynthesis.).W.H.弗里曼(W.H.Freeman)、肯特(Kent),英国(1969)描述这种树脂的制法。BHA和MBHA树脂载体可商业购得,且一般是在合成的所希望的以毒素为主的治疗性肽在C-端具有未经取代的酰胺时使用。因此,固体树脂载体可以是所属领域所熟知的任何固体树脂载体,如,具有式—O—CH2-树脂载体、—NHBHA树脂载体或—NH-MBHA树脂载体者。当需要未经取代的酰胺时,使用BHA或MBHA树脂可能有利,这是因为裂解可直接提供酰胺。在需要N-甲基酰胺的情况下,其可从N-甲基BHA树脂生成。当需要其它经取代的酰胺时,可使用第4,569,967号美国专利的教示,或当在C-端需要除游离酸外的再其它基团时,可优选地使用如霍本(Houben)及韦尔(Weyl),有机化学方法(MethodenderorganischenChemie),左尔格森姆(GeorgTheime),斯图加特(1974)中所述的传统方法来合成以毒素为主的治疗性肽。
在打算合成在C-端具有游离酸的以毒素为主的治疗性肽的情况下,经Boc或Fmoc且经侧链保护基保护的C-端氨基酸如果适当则可先依照述于哈瑞克(Horiki)等人,化学快报(Chem.Lett.),165-168(1978)中的程序在搅拌下使用含于二甲基甲酰胺(DMF)中的KF在约60℃下与氯甲基化树脂偶联24小时。在使受BOC保护的氨基酸偶联到树脂载体之后,可(例如)通过使用在二氯甲烷中的三氟乙酸(TFA)或仅使用TFA来将α-氨基保护基脱去。保护基的脱去可在0℃与室温之间的温度下进行。可依施罗德(Schroeder)和卢克(Lubke),肽(ThePeptides),学术出版社(AcademicPress):纽约(1965)中所述来使用其它标准裂解试剂(如,含于二噁烷中的HCl)及用于将特异性α-氨基保护基脱去的条件。
在将α-氨基保护基脱去之后,残留的α-氨基-和侧链-保护的氨基酸可依所期顺序逐步进行偶联以得到中间化合物,或作为在合成中分开地添加各氨基酸的替代,其中一些可在添加到固相反应器之前彼此相偶联。适当的偶联试剂的选择是属于本领域中的技术。示例性的偶联试剂包括N,N'-二环己基碳二亚胺(在HoBt或HoAt存在下的DCC、DIC、HBTU、HATU、TBTU)。
所属领域中熟知用于包括以毒素为主的治疗性肽的肽的固相合成中的活化试剂。适当的活化试剂的实例包括碳二亚胺,如N,N'-二异丙基碳二亚胺和N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺。施罗德和卢克,肽,科学出版社:纽约(1965)和卡普尔(Kapoor),药学科学杂志(J.Pharm.Sci.),59(1),1-27(1970)描述其它活化试剂和其于肽偶联中的用途。
各经保护的氨基酸或氨基酸序列可以过量两倍或两倍以上方式引入固相反应器中,且偶联可在DMF:CH2Cl2(1:1)或仅在DMF或CH2Cl2介质中进行。在发生中间偶联的情况下,可在下一个氨基酸偶联前将α-氨基保护基脱去之前重复偶联程序。在合成各阶段的偶联反应的成功在人工进行情况下可如凯撒(Kaiser)等人,分析生物化学(Anal.Biochem.)第34(2)卷,595-8(1970)所述通过茚三酮反应来监测。
偶联反应可如在贝克曼(Beckman)990自动合成仪上使用如里维尔(Rivier)等人,生物聚合物(Biopolymers),17(8),1927-1938(1978)中所报告的程序以自动化进行。
在已完成所希望的氨基酸序列之后,可经如液态氟化氢或TFA(假如使用Fmoc化学品)的试剂处理从树脂载体将中间肽移去,所述试剂不仅可从树脂裂解肽而且可裂解所有残留的侧链保护基和N-端处未在前面步骤脱去的α-氨基保护基以得到呈游离酸形式的肽。假如序列中存在Met,则可在从树脂使用HF裂解肽之前先使用TFA/乙二硫醇使Boc保护基脱去以消除可能的S-烷基化。在使用氟化氢或TFA来裂解的情况下,可于反应容器中包含一种或多种如苯甲醚、甲酚、二甲硫醚和甲基乙基硫醚的清除剂。
可实现直链以毒素为主的治疗性肽的环化,此与使以毒素为主的治疗性肽环化同时使肽-树脂的一部分的环化相反,可在Cys残基之间形成键。为实现这一二硫环化键,完全受保护的以毒素为主的治疗性肽可从羟甲基化树脂或氯甲基化树脂载体通过所属领域中熟知的氨解裂解以得到可接着适当地环化及脱去保护基的完全受保护的酰胺中间物。或者,脱去保护基以及以毒素为主的治疗性肽从上述树脂或二苯甲基胺(BHA)树脂或甲基二苯甲基胺(MBHA)的裂解可在0℃下使用氢氟酸(HF)或TFA进行,接着如上所述氧化。
以毒素为主的治疗性肽还可使用自动合成仪来合成。在这些实施例中,氨基酸可使用先进化学技术(AdvancedChemtech)357自动肽合成仪在C-端开始依序偶联到MBHA林克(MBHARink)树脂(通常是100mg树脂)。偶联是使用含于N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的1,3-二异丙基碳二亚胺或通过六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(HBTU)和二乙基异丙基乙胺(DIEA)来进行。Fmoc保护基可经含于二甲基甲酰胺(DMF)中的哌啶的20%溶液处理脱去。树脂随后用DMF洗涤(两次)接着用甲醇和NMP洗涤。
示例性的实施例
1.一种治疗有需要的个体的眼科病症的方法,所述方法包括投与所述个体治疗有效量的包含具有相对SEQIDNO:1到256中任一者至少80%序列一致性的以毒素为主的治疗性肽的药用组合物。
2.如实施例1的方法,其中所述以毒素为主的治疗性肽具有相对SEQIDNO:1到256中任一者至少85%的序列一致性。
3.如实施例1或2的方法,其中所述以毒素为主的治疗性肽具有相对SEQIDNO:1到256中任一者至少90%的序列一致性。
4.如实施例1到3中任一个实施例的方法,其中所述以毒素为主的治疗性肽具有相对SEQIDNO:1到256中任一者至少95%的序列一致性。
5.如实施例1到4中任一个实施例的方法,其中所述以毒素为主的治疗性肽具有相对SEQIDNO:1到256中任一者至少96%的序列一致性。
6.如实施例1到5中任一个实施例的方法,其中所述以毒素为主的治疗性肽具有相对SEQIDNO:1到256中任一者至少97%的序列一致性。
7.如实施例1到6中任一个实施例的方法,其中所述以毒素为主的治疗性肽具有相对SEQIDNO:1到256中任一者至少98%的序列一致性。
8.如实施例1到7中任一个实施例的方法,其中所述以毒素为主的治疗性肽具有相对SEQIDNO:1到256中任一者至少99%的序列一致性。
9.如实施例1的方法,其中所述以毒素为主的治疗性肽为具有相对SEQIDNO:225到256中任一者至少80%序列一致性的以毒素为主的肽。
10.如实施例9的方法,其中所述以毒素为主的肽具有相对SEQIDNO:225到256中任一者至少85%的序列一致性。
11.如实施例9或10的方法,其中所述以毒素为主的肽具有相对SEQIDNO:225到256中任一者至少90%的序列一致性。
12.如实施例9到11中任一个实施例的方法,其中所述以毒素为主的肽具有相对SEQIDNO:225到256中任一者至少95%的序列一致性。
13.如实施例9到12中任一个实施例的方法,其中所述以毒素为主的肽具有相对SEQIDNO:225到256中任一者至少96%的序列一致性。
14.如实施例9到13中任一个实施例的方法,其中所述以毒素为主的肽具有相对SEQIDNO:225到256中任一者至少97%的序列一致性。
15.如实施例9到14中任一个实施例的方法,其中所述以毒素为主的肽具有相对SEQIDNO:225到256中任一者至少98%的序列一致性。
16.如实施例9到15中任一个实施例的方法,其中所述以毒素为主的肽具有相对SEQIDNO:225到256中任一者至少99%的序列一致性。
17.如实施例1的方法,其中所述以毒素为主的治疗性肽为具有相对SEQIDNO:1到224中任一者至少80%序列一致性的以ShK为主的肽。
18.如实施例17的方法,其中所述以ShK为主的肽具有相对SEQIDNO:1到224中任一者至少85%的序列一致性。
19.如实施例17或18的方法,其中所述以ShK为主的肽具有相对SEQIDNO:1到224中任一者至少90%的序列一致性。
20.如实施例17到19中任一个实施例的方法,其中所述以ShK为主的肽具有相对SEQIDNO:1到224中任一者至少95%的序列一致性。
21.如实施例17到20中任一个实施例的方法,其中所述以ShK为主的肽具有相对SEQIDNO:1到224中任一者至少96%的序列一致性。
22.如实施例17到21中任一个实施例的方法,其中所述以ShK为主的肽具有相对SEQIDNO:1到224中任一者至少97%的序列一致性。
23.如实施例17到22中任一个实施例的方法,其中所述以ShK为主的肽具有相对SEQIDNO:1到224中任一者至少98%的序列一致性。
24.如实施例17到23中任一个实施例的方法,其中所述以ShK为主的肽具有相对SEQIDNO:1到224中任一者至少99%的序列一致性。
25.如实施例1及17到20中任一个实施例的方法,其中所述以ShK为主的肽具有相对SEQIDNO:1至少95%的序列一致性。
26.如实施例1及17到20中任一个实施例的方法,其中所述以ShK为主的肽具有相对SEQIDNO:2至少95%的序列一致性。
27.如实施例1及17到20中任一个实施例的方法,其中所述以ShK为主的肽具有相对SEQIDNO:208、SEQIDNO:209、SEQIDNO:210、SEQIDNO:217和/或SEQIDNO:218至少95%的序列一致性。
28.如实施例1、17到20和27中任一个实施例的方法,其中所述以ShK为主的肽具有相对SEQIDNO:208、SEQIDNO:209、SEQIDNO:210、SEQIDNO:217和/或SEQIDNO:218至少96%的序列一致性。
29.如实施例1、17到20、27和28中任一个实施例的方法,其中所述以ShK为主的肽具有相对SEQIDNO:208、SEQIDNO:209、SEQIDNO:210、SEQIDNO:217和/或SEQIDNO:218至少97%的序列一致性。
30.如实施例1、17到20和27到29中任一个实施例的方法,其中所述以ShK为主的肽具有相对SEQIDNO:208、SEQIDNO:209、SEQIDNO:210、SEQIDNO:217和/或SEQIDNO:218至少98%的序列一致性。
31.如实施例1、17到20和27到30中任一个实施例的方法,其中所述以ShK为主的肽具有相对SEQIDNO:208、SEQIDNO:209、SEQIDNO:210、SEQIDNO:217和/或SEQIDNO:218至少99%的序列一致性。
32.如实施例1到31中任一个实施例的方法,其中所述以毒素为主的治疗性肽是天然或合成的。
33.如实施例1到32中任一个实施例的方法,其中所述以毒素为主的治疗性肽是附接到具有阴离子电荷的有机或无机化学实体。
34.如实施例1到33中任一个实施例的方法,其中所述以毒素为主的治疗性肽的C-端为酸或酰胺。
35.如实施例1到34中任一个实施例的方法,其中所述药用组合物是经局部投与眼睛。
36.如实施例1到35中任一个实施例的方法,其中所述药用组合物是通过非经肠及/或肠内途径投与。
37.如实施例1到36中任一个实施例的方法,其中所述药用组合物是局部或通过非经肠和/或肠内途径投与。
38.如实施例1到37中任一个实施例的方法,其中所述药用组合物是经玻璃体内注射投与。
39.如实施例1到38中任一个实施例的方法,其中所述药用组合物是依每天六次、每天五次、每天四次、每天三次、每天两次、每天一次、每周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次投与。
40.如实施例1到39中任一个实施例的方法,其中所述眼科病症为干眼、葡萄膜炎、小儿葡萄膜炎、干燥性角膜结膜炎、表层巩膜炎、角膜炎、视网膜血管炎、巩膜炎、眼内炎、瘢痕性类天疱疮、莫伦氏溃疡和/或巨大细胞病毒介导的视网膜炎。
41.如实施例1到40中任一个实施例的方法,其中所述眼科病症是因全身性红斑狼疮、显微镜下多血管炎、结节性多动脉炎、韦格纳氏肉芽肿病(肉芽肿病合并多血管炎)、类肉瘤病、贝赛特氏综合症、伏格特-小柳-原田病、高安氏动脉炎、类风湿关节炎、休格连氏综合症、复发性多软骨炎、僵直性脊椎炎、银屑病和/或彻奇-斯全司综合症引起。
42.如实施例1到41中任一个实施例的方法,其中所述个体为成人、儿童或青少年。
43.如实施例1到42中任一个实施例的方法,其中所述药用组合物包含防腐剂。
44.如实施例43的方法,其中所述防腐剂为苯扎氯铵(≤0.025%)、抗坏血酸、苄索氯铵(≤0.01%)、氯丁醇(≤0.5%)、乙酸苯汞(≤0.004%)、硝酸苯汞(≤0.004%)、硫柳汞(≤0.01%)、对羟基苯甲酸甲酯(0.1到0.2%)和/或对羟基苯甲酸丙酯(≤0.04%)。
45.如实施例1到44中任一个实施例的方法,其中所述药用组合物包含粘度增强剂。
46.如实施例45的方法,其中所述粘度增强剂为羧甲基纤维素(≤1%)、羟乙基纤维素(≤0.8%)、羟丙基纤维素(≤1%)、甲基纤维素(≤2%)、聚乙烯醇(≤1.4%)、聚卡波菲、结兰胶、黄原胶、卡波姆、聚(苯乙烯-二乙烯苯)磺酸和/或聚乙烯吡咯烷酮(≤1.7%)。
47.如实施例1到46中任一个实施例的方法,其中所述药用组合物包含抗氧化剂。
48.如实施例47的方法,其中所述抗氧化剂为乙二胺四乙酸(≤0.1%)、亚硫酸氢钠(≤0.1%)、偏亚硫酸氢钠(≤0.1%)和/或硫脲(≤0.1%)。
49.如实施例1到48中任一个实施例的方法,其中所述药用组合物包含缓冲剂、张力调节剂和表面活性剂。
50.如实施例1到49中任一个实施例的方法,其中所述药用组合物包含10mM磷酸钠;0.8%w/vNaCl;和0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、或4w/v%的聚山梨醇酯20,其中所述组合物具有5.0、5.5、6.0、6.5、7、7.5或8的pH。
51.如实施例1到50中任一个实施例的方法,其中所述药用组合物包含0.05w/v%的聚山梨醇酯20,且其中所述组合物具有6.0的pH。
52.如实施例1到49中任一个实施例的方法,其中所述药用组合物包含10mM磷酸钠;0.8%w/vNaCl;和0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、或4w/v%的聚山梨醇酯80,其中所述组合物具有5.0、5.5、6.0、6.5、7、7.5、或8的pH。
53.如实施例1到49或52中任一个实施例的方法,其中所述药用组合物包含0.05w/v%的聚山梨醇酯80,且其中所述组合物具有6.0的pH。
54.如实施例1到53中任一个实施例的方法,其中所述治疗有效量可增进泪液形成;减轻眼睛刺痛或灼伤感觉;减少眼睛丝粘性排出物生成;减轻眼睛疼痛;减轻眼睛泛红;减少视力障碍发作的频率及/或持续时间;降低光敏感性;减少个体视野中暗、漂浮点发作的频率及/或持续时间;提高个体视力;减轻眼睛中沙粒感觉;减轻沉重眼睑感觉;减轻严重干眼期后过量流泪的发作;和/或缩小于眼睛内侧在虹膜前方的略带白色区域。
55.一种评估个体以预测通过实施例1到54中任一个实施例的方法治疗的结果的方法,所述方法包括:分析来自所述个体生物样本的T-细胞的Kv1.3通道表达水平;其中Kv1.3通道表达水平相对健康参考或参考群体增加指示患者可接受以具有相对SEQIDNO:1到224中任一者至少80%序列一致性的以ShK为主的肽治疗。
56.一种筛选可从如实施例1到54中任一个实施例的方法的治疗获益的个体的方法,所述方法包括:测量来自所述个体生物样本的T-细胞和/或巨噬细胞的Kv1.3通道表达水平;将所述个体的Kv1.3通道表达水平与健康对照或参考群体的Kv1.3通道表达水平进行比较;及假如所述个体中Kv1.3通道表达水平相较于健康对照或参考群体增加,则确定所述个体将从如实施例1到54中任一个实施例的方法的治疗获益。
57.一种选择用于临床试验的个体的方法,所述方法包括:测量来自所述个体生物样本的T-细胞和/或巨噬细胞的Kv1.3通道表达水平;将所述个体的Kv1.3通道表达水平与健康对照或参考群体的Kv1.3通道表达水平进行比较;及假如所述个体具有相较健康对照或参考群体提高的Kv1.3通道表达水平,则选择所述个体用于临床试验,或假如所述个体具有相较健康对照或参考群体减低或不变的Kv1.3通道表达水平,将所述个体从临床试验排除。
58.一种筛选针对于个体的眼科病症的可能治疗的方法,所述方法包括:测量来自所述个体生物样本的T-细胞和/或巨噬细胞的Kv1.3通道表达水平;将所述个体的Kv1.3通道表达水平与健康对照或参考群体的Kv1.3通道表达水平进行比较;及假如所述个体具有相较健康对照或参考群体增加的Kv1.3通道表达水平,则确定如实施例1到54中任一个方法为针对于个体的治疗。
59.如实施例56到58中任一个实施例的方法,其中所述Kv1.3通道表达水平是使用分析法来测量。
60.如实施例55的方法,其中所述Kv1.3通道表达水平是使用分析法来分析。
61.如实施例55到60中任一个实施例的方法,所述方法进一步包括通过促炎性免疫刺激因子或T-细胞活化剂在以毒素为主的治疗性肽的存在下激发T-细胞。
62.如实施例61的方法,其中所述以毒素为主的治疗性肽为以ShK为主的肽。
63.如实施例62的方法,其中所述以ShK为主的肽具有相对SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:208、SEQIDNO:209、SEQIDNO:210、SEQIDNO:217和/或SEQIDNO:218至少95%的序列一致性。
64.如实施例55到63中任一个实施例的方法,所述方法进一步包括测量促炎性细胞激素生成。
65.如实施例64的方法,其中所测得细胞激素为干扰素(IFN)-γ、介白素(IL)-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-17F、IL-17A/F、IL-21、IL-22、IL-23、粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、金属蛋白酶(MMP)3和/或MMP9。
66.如实施例55到65中任一个实施例的方法,所述方法进一步包括使用眼抗原在存在或不存在以毒素为主的治疗性肽下激发T-细胞。
67.如实施例66的方法,其中所述以毒素为主的治疗性肽为以ShK为主的肽。
68.如实施例67的方法,其中所述以ShK为主的肽具有相对SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:208、SEQIDNO:209、SEQIDNO:210、SEQIDNO:217和/或SEQIDNO:218至少95%的序列一致性。
69.如实施例68的方法,其中所述以ShK为主的肽具有式SEQIDNO:217。
70.一种如实施例1到69中任一个实施例的示例性的实施例,其中所述眼科病症为炎症性眼科病症。
下文实例描述本文中所公开的方法的优化。包含这些实例以证实本发明的特定实施例。所属领域的技术人员根据本发明当知晓可在不脱离本发明的精神和范围下对本文所公开的特定实施例做出许多种改变而仍旧实现类似或相似结果。
实例
实例1.通过以毒素为主的治疗性肽抑制炎症性细胞激素生成。本实例描述如本文所公开的以毒素为主的治疗性肽是否可调节造成组织损伤和与眼科病症相关的炎症结果的细胞激素水平的评估。
产生细胞激素IL-17-A、-F、-A/F、IL-21和IL22的Th17细胞和产生IL-17-A、-F、-A/F和IFN-γ的Th1/Th17细胞日益与各种自体免疫疾病包括使眼睛受到影响的自体免疫疾病(如葡萄膜炎的各种形式)和干眼疾病的病理相关联。类似IFN-γ,通过增加趋化细胞激素生成,IL-17致使单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞募集到炎症部位。IL-17的早期来源包括常驻在眼表面组织中的γδT细胞和积聚在眼表面组织如在干燥性压力诱发的干眼早期的结膜中的自然杀手(NK)T-细胞。NKT-细胞还为与减小的杯状细胞密度、改变的角膜上皮粘蛋白和角膜上皮屏障功能障碍相关联的IFN-γ的早期来源。
CD4+Th1、Th17和Th1/Th17T-细胞在干眼和其它眼科病症的抗原特异性慢性阶段期间的组织损伤中发挥主要作用。活化CD4+T-细胞位于干眼患者的眼表面上且是造成疾病进展的原因。总的来说,Th1和Th17衍生的细胞激素造成干眼和其它眼科病症中大部分组织损伤结果且为用于治疗人类这些疾病的症状和潜伏性病理过程的适当的标靶。此包括葡萄膜炎的各种形式,包括慢性葡萄膜炎,如在幼年特发性关节炎、休格伦氏综合症和贝赛特氏综合症中所观察到的慢性葡萄膜炎,其中IFN-γ和IL-17同时与增加的炎症和腺体功能障碍相关联。因此,干眼和葡萄膜炎的局部性和全身性病因的共同机制可靶向于使用本文中所公开的方法和药用组合物的疗法。
本实例研究含有本文所公开的以毒素为主的治疗性肽的药用组合物减低因毒胡萝卜素引起的促炎性细胞激素分泌的能力(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich),美国密苏里州圣路易斯)。毒胡萝卜素通过抑制微粒体的肌浆网和内质网中细胞内膜的Ca2+离子泵蛋白来刺激促炎性细胞激素释放。这种抑制作用会导致快速释放Ca2+存储且在随后活化血浆膜钙通道。
原代血液细胞的制造。使用全血和周边血液单核细胞(PBMC)以测试如本文所公开的以ShK为主的治疗性肽于治疗罹患包括干眼的眼科病症的个体的适合性。全血可不作任何额外处理直接分至细胞培养中以进行实验分析。
PBMC可如下通过密度梯度离心从供者血液单离。将血液收集于装纳作为抗凝血剂的肝素钠和包含聚酯凝胶和密度梯度液体的细胞分离介质的收集管(BD伐克特纳CPT(BDVacutainerCPT))中。所述样本在室温下以1500RCF离心20分钟。包含单核细胞和血小板的细胞层正好位于血浆层下方且使用巴斯德吸管(PasteurPipette)收集于单独的15mL圆锥管。用PBS洗涤所述细胞两次且通过离心粒化以移去上清液。将经纯化的PBMC再悬浮于全RPMI(cRPMI)细胞培养基中且经接种至用于所述分析的适当的密度。
可从其测定细胞激素分泌的其它细胞包括人巨噬细胞/单核细胞、大鼠血液细胞、淋巴结和脾细胞。
原代血液细胞的处理。将ShK-186在cRPMI中连续稀释为4X最终浓度工作储液。每种以ShK为主的肽浓度取50μL工作储液添加到96-孔细胞培养板中的6个孔。使用不含以ShK为主的肽的50μLcRPMI作为在阳性对照(不含以ShK为主的肽,含毒胡萝卜素刺激)和阴性对照(不含以ShK为主的肽,无毒胡萝卜素刺激)孔中的对照处理。将在全RPMI中的100μL全血或200,000PBMC添加到96-孔细胞培养板中的各个孔。在37℃和5%CO2下培养细胞与以ShK为主的肽或培养基对照一小时。一小时后,将50μL40uM毒胡萝卜素刺激物添加到除阴性对照孔以外的所有孔,所述阴性对照孔接收50μL0.4%DMSO到0.1%最终浓度。将细胞培养48小时。
经以ShK为主的肽处理且经毒胡萝卜素刺激的细胞的分析。在通过毒胡萝卜素刺激48小时后,将96孔板以2000RPM离心5分钟。小心地将上清液转移到灭菌96-孔板以供样本分析。使用与磁珠结合的特异性抗体和与链霉亲和素/藻红素反应产生荧光信号的二级抗体来检测细胞激素。检测到经结合的珠粒并使用Magpix仪器(路明克斯公司(LuminexCorp.),美国得克萨斯州奥斯汀)定量,但,如所属领域中已知的类似技术可用于测量蛋白质生成,如(例如)ELISA,使用包括荧光和比色法的检测方法。
使用上述方法,证实ShK-186(SEQIDNO:217)可抑制已证实造成干眼结果的炎症性细胞激素(包括IL-17和IFN-γ)。ShK-186抑制在通过毒胡萝卜素刺激之前经ShK-186处理的全血中炎症性细胞激素IL-2、IL-17、IL-4和IFN-γ的水平。IC50值在皮摩尔范围内,如图1中所显示。
ShK-186还抑制在通过毒胡萝卜素刺激之前经ShK-186处理的PBMC中炎症性细胞激素IL-2、IL-17、IL-4和IFN-γ的水平。IC50值在皮摩尔范围内,如图2中所显示。
这些结果证实包含本文所公开以ShK为主的治疗性肽的药用组合物可减少与如自体免疫眼睛疾病(包括葡萄膜炎)和干眼的眼科病症相关联的促炎性细胞激素的分泌。
实例2.在干眼和对照患者中通过TEM的Kv1.3通道表达。本实例描述通过存于干眼患者中的TEM相较来自健康患者对照的TEM的Kv1.3通道表达的评估,且表征干眼患者样本对经本发明的以毒素为主的治疗性肽(如ShK-186)治疗的反应性。
为了实施功能检测,从葡萄膜炎或干眼患者和健康对照单离PBMC。在本实例的第一阶段中,细胞是在无活体外刺激下活化后不久进行测试或是在活体外经抗-CD3及抗-CD28抗体或丝裂原活化且接着进行免疫染色和多色流式细胞计数以研究CD4及CD8+T-细胞子组中TEM表面上Kv1.3通道的表达水平。预期从患者单离的细胞的无活体外刺激下Kv1.3的表达为高的,但所述表达可能在活体外活化后增加。为验证Kv1.3是治疗标靶,取自干眼或葡萄膜炎患者的结膜活体组织检查标本接受通过以抗-CD3+、-CD4+和-Kv1.3抗体染色的免疫组织化学分析来识别Kv1.3的表达水平提高的CD3+/CD4+T-细胞群体。类似地,针对CD40、CD68、CD163、iNOS等等的抗体和抗-Kv1.3抗体组合可用于识别经活化的巨噬细胞。预期取自罹患干眼或如慢性葡萄膜炎的其它自体免疫眼睛疾病的患者的样本对活化标记和Kv1.3高T细胞和巨噬细胞为阳性。在第三阶段中,使用匹配细胞等分试样以研究以ShK为主的肽阻断来自干眼患者或葡萄膜炎患者相对对照的TEM的促炎性和增殖潜力的能力。包括IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IL-21和IL-22、穿孔蛋白和颗粒酶B的细胞激素是通过在休眠或活化细胞中在以毒素为主的治疗性肽存在或不存在下的细胞内染色和流式细胞计数来检测。另外,其等可通过如所收集上清液的多重ELISA的分析法定量。在这些实验中,如由一种或任一种所述方法在未受刺激或经活化的T细胞或巨噬细胞中均测得,ShK-186的活体外添加明显地减低前述细胞激素的表达。ShK-186的添加还明显地减低T细胞或巨噬细胞在活体外活化期间的活体外增殖。这种减低可特别通过定量[3H]胸苷并入或荧光染料CFSE的标准免疫学方法来测定。
实例3.通过局部投与来局部递送以毒素为主的治疗性肽。本实例描述投与本发明的以毒素为主的治疗性肽(如ShK-186或ShK-198)后局部性和全身性药物含量的评估。
三只雌性6到8周龄史泊格-多利(Sprague-Dawley)大鼠(美国印第安纳州印第安纳波里斯)每天三次以局部投与左眼(LE)10μLP6N(磷酸钠(10mM)、氯化钠(0.8%)和聚山梨醇酯20(0.05%),pH6.0)和局部投与右眼(RE)含在P6N中的10μL0.5%ShK-186的方式给药21天。在第3天、第7天、第12天、第14天、第17天和第21天采集血液并经处理为血浆。在第21天,除了血浆之外,从各只眼睛收集玻璃体液。使用标准直接ELISA方法来测量所收集样本中的ShK-186含量。
图3A和3B提供局部投与ShK-186到右眼(RE)相较于投与媒剂的左眼(LE)21天后所收获的局部房水(图3A和图3B)和血浆(图3A)样本中ShK-186的定量。在RE的房水中发现呈显著浓度的经局部投与的ShK-186,指明药物的眼内递送(图3A、3B)。在来自未经处理的LE或血浆的样本中未检出ShK-186,指明是最小全身暴露于药物(图3A和B)。
另外,雌性8到14周龄路易斯(LEWIS)大鼠(查尔斯河(CharlesRiver))每天三次以局部投与生理盐水或0.1%ShK-186(动物3-1到3-3)或1%ShK-186(动物4-1到4-4)方式给药(10μL)(图3C)。如图D所示,ShK-198以0.1%(动物5-1到5-4)或1%提供;动物2-1到2-4接受媒剂P6N(图3D)。图3C提供局部投与ShK-1867天后所收获的局部房水中ShK-186的定量。在前房房水中发现呈显著浓度的经局部投与的ShK-186,指明药物的眼内递送。在血浆样本中未检出ShK-186,指明是最小全身暴露于药物(未显示)。图3D提供局部投与ShK-1987天后所收获的前房房水或血浆中ShK-198的定量。在房水中发现呈显著浓度的经局部投与的ShK-198,指明药物的眼内递送。在血浆样本中未检出ShK-198,指明是最小全身暴露于药物(未显示)。
实例4.ShK-186和ShK-198在自体免疫眼睛疾病中治疗效应的评估。本实例描述局部递送本发明的以毒素为主的治疗性肽(如ShK-186)的治疗效应的评估。
一种用于评估ShK-186在自体免疫眼睛疾病(如葡萄膜炎)中治疗潜力的模型为黑色素相关抗原(MAA)诱发的实验自体免疫前部葡萄膜炎(EAAU)。在所述模型中,雄性路易斯大鼠5到10周龄(查尔斯河)经皮下使用乳化于弗氏完全佐剂(completeFreund’sadjuvant)(CFA)中的MAA免疫且还接受单次腹膜内注射百日咳毒素(0.2到1mcg/只动物)。到第10天开始出现疾病症状且到免疫接种18天后达到峰值。所述动物通常到第25天可康复。
制备MAA。MAA是遵循由辛普森(Simpsom)等人,眼(Eye)11,206-208(1997)所述的程序作一定修改来制备。从25只刚着色的牛眼睛切下虹膜和睫状体结构。取组织切成小试片且接着在冷PBS中均质化。均质物以4000g旋转10分钟,用PBS洗涤三次且接着接受以2%特顿X-100(TritonX-100)的洗涤剂萃取,在室温下旋转3小时。所得材料再次旋转并用PBS洗涤三次且此次使用2%SDS再次接受洗涤剂萃取,在37℃下旋转3小时。用PBS洗涤所述材料三次接着用H2O洗涤三次且最后用70%乙醇洗涤。将MAA粒置于真空下维持约15min,得到干燥抗原材料,-20℃下冷冻储藏。
制备MAA:CFA乳液。就用于结果显示于图4中的实验的乳液来说,将50毫克MAA再悬浮于3.8mLPBS中,且在使所述悬浮液短暂涡转之后,进行30秒声波处理三次,于各次之间在冰上培养30秒。使所述浆液通过100μm细胞过滤器,用针筒推进器加压使较稠材料通过。使用市售BCA套组(皮尔斯23225(Pierce23225))测得悬浮液的蛋白质含量为3.27mg/mL,且在使用前冷冻储藏在-20℃。在免疫接种的当天(第0天),让储备MAA在室温下融溶及短暂地涡转,再进行600μg/mL的作业稀释。接着使所述溶液逐滴与CFA1:1混合同时涡转,实现300μg/mL(或30μg/只动物)的最终抗原浓度。乳液在加载到针筒中并输入通过18G乳化桥(emulsifyingbridge)之前允许再涡转5分钟直到极稠。在同一天注射所述乳液,每个足垫经皮下注射50μL,依组别每只动物总计100μL。图4A到D显示与所述疾病模型相关联的病理和ShK-186的局部投与对疾病的发生和严重度上的效应。
图4A显示在诱发EAAU后第11天、第13天、第15天和第18天使用裂隙灯临床观测每只动物的数据。基于瞳孔功能(缩小)、虹膜结构、前房中细胞的存在和前房中蛋白质的存在(红肿)来指定眼睛个别得分。接着将得分转换为每天的综合临床得分。发现相较于经媒剂处理的那些动物,每天三次地从第0到第8天经0.1%ShK-186和从第9到第18天经1%ShK-186对眼睛局部处理的动物的综合得分明显更低。
由图4B可见,ShK-186的局部投与使得所述模型中总病理减少。(左图(3-2RE))动物每天三次以媒剂(P6N)给药。在免疫接种后第18天,观测到动物3-2具有13的综合临床得分:缩小的瞳孔完全布满蛋白质(得分=4),虹膜血管充盈部分损伤(得分=3),在前房中存在诸多浸润细胞(得分=4;未显示),和轻微红肿(得分=2;未显示)。在(右图,4-8RE)描绘的动物在免疫接种诱发EAAU后接受局部投与0.1%ShK-186持续9天及再局部投与1%ShK-186持续10天。在免疫接种后第18天,观测到动物4-8具有0的综合临床得分:正常瞳孔(得分=0),正常虹膜血管及结构(得分=0),前房中不存在人眼可见细胞或蛋白质(各者得分=0;未显示)。
由总病理观测预期,ShK-186的局部投与还减轻组织病理,如图4C所显示。就所述分析来说,依照金姆等人(如前述)(1997)所述疾病参数,对事先在10%福尔马林中固定的眼睛切片基于虹膜及睫状体结构和炎症性细胞浸润到虹膜和/或睫状体和前房的基质的程度评分;此可由独立兽医病理学家进行。在图4C(1.)中,显示对照健康眼睛(10X);(2.)与(4.)显示取自经媒剂处理的动物的眼睛(得分为2)(10X、40X);(3.)与(5.)显示取自每天三次经0.1%ShK-186处理8天接着经1%ShK-186处理10天的动物的眼睛(指定组织病理学得分为0)(10X、40X)。图4C(6.)显示基于对取自媒剂处理组(P6N)或如所指示的ShK-186处理组(1%ShK-186)的四只眼睛组织病理学分析的综合临床得分。
图4D显示证实ShK-198局部投与减轻EAAU大鼠模型的临床症状的数据。在经辅助的MAA乳液免疫接种诱发EAAU后第13天使用裂隙灯对每只动物进行临床观察。在经辅助的MAA乳液免疫接种诱发EAAU后第13天使用裂隙灯对每只动物进行临床观察。基于前房中细胞的存在(上图)或前房中蛋白质的存在或红肿(下图)指定眼睛个别得分。大鼠每天三次经P6N媒剂或1%ShK-198局部处理眼睛。N=10只大鼠/20只眼睛。
用于评估ShK-186、ShK-198或相关肽对葡萄膜炎疾病的预防性和治疗性潜力的其它模型包括通过视网膜抗原诱发的模型。所述实验自体免疫葡萄膜炎或视网膜炎模型(EAU)还为器官特异性T-细胞介导的疾病,其中认为效应子记忆CD4+及CD8+T-细胞(通常是指Th1(IFN-γ生成)、Th17(IL-17生成)或Th1/Th17(IFN-γ/IL-17)共生成细胞)扮演主要致病原角色。在所述模型中,不论是来自光感受器蛋白质的牛、啮齿动物或人视网膜可溶性抗原(S-Ag,也称为抑制蛋白)、或来自在涉及维生素A衍生物输送的光感受器间基质中发现的光感受器间类视色素结合蛋白质(包括衍生自所述蛋白质的R14和R16肽)的抗原均在CFA中乳化。在添加或不添加经纯化的百日咳毒素(同时提供)下使用所述乳液以使小鼠(B10.RIII;C57.BL/6)、大鼠(路易斯、F344、CAR、BN、PVG)或天竺鼠感受性菌株具免疫力。可使用的其它抗原来源包括视紫质(rhodopsin)、恢复蛋白(recoverin)和光导蛋白(phosducin)。(参见阿加瓦尔(Agarwal)等人,(2012);安德拉斯皮尔(AndrasPerl)(编辑),自体免疫:方法和协定(Autoimmunity:MethodsandProtocols),分子生物学中的方法(MethodsinMolecularBiology),第900卷.施普林格科学+商业媒体(SpringerScience+BusinessMedia),纽约)。
实例5.干眼疾病模型中ShK-186和ShK类似物的治疗效应的评估。本发明的ShK-186和其它肽的预防性和治疗性效应的评估可通过分析干燥性角膜结膜炎(KCS)来进行。可在动物中于切除眼窝和瞬泪腺后在双侧诱发KCS(穆尔(Moore)等人,眼科学调查与视力科学,42(3),653-659(2001))。包括大鼠、兔和狗的动物中切除泪腺会导致在手术后约2到3周诱发疾病,此点可通过希默氏泪液测试(STT)值的显著减小来确定。细胞内粘蛋白库还可经定量且在取自发病动物的结膜样本中减少。诱发KCS后,ShK-186、ShK-198或分别列于表1及2中的以毒素为主或以ShK为主的肽中任一者可以0.05到5%含于P6N或另一种媒剂中的浓度范围以一次、两次、三次或三次以上/天施用。可在腺体切除前(基线)和在诱发后第2、第4和第6周收集腹部膜穹窿结膜的活体组织检查标本切片。在每次取样时,拍摄眼睛照片且在随后基于结膜炎的程度和眼分泌物的特征进行色彩分级。
本发明的ShK-186和其它肽的预防性和治疗性效应的评估可在休格伦氏综合症的实验自体免疫干眼疾病模型中进行。此种模型述于蒋(Jiang)等人,眼科学调查与视力科学,50,2245-2254(2009)的教示中。在所述模型中,路易斯大鼠经皮下以包含500μg泪腺及唾腺提取物或200μg重组小鼠Klk1b22和500μg结核分枝杆菌H37Ra(狄福科(Difco),密歇根州底特律)于弗氏不完全佐剂(西格玛(Sigma),密苏里州圣路易斯)中的0.2mL乳液免疫,分布在尾基和翼上的4个点。在同一天经腹膜内注射200、500、750或1000毫微克的百日咳毒素的单剂量作为抗原乳液。
用于评估ShK-186功效的另一种模型为抗原特异性T-细胞过继转移模型。在所述模型中,从事先经过免疫的大鼠的引流淋巴结或脾脏制备经纯化的T-细胞。接着将所述细胞与泪腺提取物(或从提取物纯化得到的馏分VII;或Klk1b22)混合并共同培养。2、3、4、5或7天后,含在0.5mLPBS中的T-细胞经腹膜内注射到未免疫的路易斯接受者中(5百万个细胞/只大鼠)。
实验干眼疾病的其它模型包括防腐剂苯扎氯铵的局部投与(雄(Xiong)等人,眼科学调查与视力科学,49,1850-1856(2008))。
在上述模型中,可在免疫接种或T-细胞转移之前或之后的不同时间点开始以毒素为主的治疗性肽(如ShK-186)或媒剂治疗以评估所述肽的预防性或治疗性效应。
除非另作指明,否则本发明的操作是使用常规化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转殖基因生物学技术,其等均是属于本领域技术范围。参见:例如,马尼亚蒂斯(Maniatis)等人,分子克隆(MolecularCloning)(冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress),纽约冷泉港,1982);萨姆布鲁克(Sambrook)等人,分子克隆,第2版(冷泉港实验室出版社,纽约冷泉港,1989);萨姆布鲁克和拉塞尔(Russell),分子克隆,第3版(冷泉港实验室出版社,纽约冷泉港,2001);阿苏贝尔(Ausubel)等人,现代分子生物学试验指南(CurrentProtocolsinMolecularBiology)(约翰威利和圣子,更新到2005);格罗弗(Glover),DNA克隆(IRL出版社,牛津市,1985);安纳德(Anand),用于分析复杂基因组的技术(TechniquesfortheAnalysisofComplexGenomes)(学术出版社,纽约,1992);格思里(Guthrie)与芬克(Fink),酵母遗传学和分子生物学指南(GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology)(学术出版社,纽约,1991);哈洛(Harlow)和莱恩(Lane),抗体(Antibodies)(冷泉港实验室出版社,纽约冷泉港,1998);雅格比(Jakoby)和帕斯坦(Pastan),1979;核酸杂交(NucleicAcidHybridization)(B.D.哈梅斯(B.D.Hames)和S.J.希金斯(S.J.Higgins)编辑1984);转录与转译(TranscriptionAndTranslation)(B.D.哈梅斯和S.J.希金斯编辑1984);动物细胞的培养(CultureOfAnimalCells)(R.I.弗瑞西尼(R.I.Freshney),阿兰R.丽丝公司(AlanR.Liss,Inc.),1987);固定化的细胞和酶(ImmobilizedCellsAndEnzymes)(IRL出版社,1986);B.佩拉尔(B.Perbal),分子克隆的实践指南(APracticalGuideToMolecularCloning)(1984);论文(thetreatise),酶学中的方法(MethodsInEnzymology)(学术出版社公司(AcademicPress,Inc.),纽约);哺乳动物细胞的基因转运载体(GeneTransferVectorsForMammalianCells)(J.H.米勒(J.H.Miller)和M.P.卡洛斯(M.P.Calos)编辑,1987,冷泉港实验室出版社);细胞和分子生物学中的免疫化学方法(ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology)(迈尔(Mayer)和沃克(Walker)编辑,学术出版社,伦敦市,1987);实验免疫学手册(HandbookOfExperimentalImmunology),第I-IV卷(D.M.威尔(D.M.Weir)与C.C.布莱克威尔(C.C.Blackwell)编辑,1986);里沃特(Riott),基础免疫学(EssentialImmunology),第6版(布莱克威尔科学书刊(BlackwellScientificPublications),牛津市,1988);Hogan等人,小鼠胚胎操作(ManipulatingtheMouseEmbryo)(冷泉港实验室出版社,纽约冷泉港,1986);韦斯特菲尔德M.(Westerfield,M.),斑马鱼书籍(Thezebrafishbook)。斑马鱼实验室使用指南(Aguideforthelaboratoryuseofzebrafish)(Daniorerio),第4版(俄勒冈大学出版社(Univ.ofOregonPress),俄勒岗州尤金,2000)。
如所属领域的技术人员所了解,本文中所公开的各个实施例可包括(基本上由或由以下组成)其特定陈述的要素、步骤、组分或组件。因此,术语“包括(include)”或“包括(including)”应理解为(例如):“包括、由……组成、或基本上由……组成”。如本文中所使用,过渡术语“包括(comprise)”或“包括(comprises)”意味着包括(但不限于),且允许包含甚至大量的未明示的要素、步骤、组分或组件。过渡词语“由……组成”不包含任何未明示的要素、步骤、组分或组件。过渡词语“基本上由……组成”使得本实施例的范围受限于特定的要素、步骤、组分或组件及不显著影响本实施例的那些要素、步骤、组分或组件。如本文中所使用,材料效应将导致本文所公开的以毒素为主的治疗性肽治疗炎症性眼科病症的能力统计上显著减低。
除非另作指明,否则用于本说明书和权利要求书中的所有数值在所有实例中应理解为由术语“约”修饰。据此,除非指出相反情况,否则述于本说明书和附随权利要求书中的数字参数为可根据企图通过本发明得到的所想要的性质变化的近似值。至少且非尝试限制均等论应用于权利要求书的范围,各数字参数应至少根据所记录有效位数的位数和通过应用舍入法来理解。在要求进一步明确的情况下,术语“约”具有在与所述数值或范围结合使用时由所属领域的技术人员针对其所合理指定的含义,也就是说,表示比所述值或范围稍微较大或稍微较小,其范围在所述值±20%;所述值±19%;所述值±18%;所述值±17%;所述值±16%;所述值±15%;所述值±14%;所述值±13%;所述值±12%;所述值±11%;所述值±10%;所述值±9%;所述值±8%;所述值±7%;所述值±6%;所述值±5%;所述值±4%;所述值±3%;所述值±2%;或所述值±1%。
尽管记述本发明宽广范围的数字范围和参数为近似值,但述于特定实例中的数值是尽可能精确地报告。然而,任何数值固有地包含必然会因其各别测试测量中存在的标准偏差所致的特定误差。
除非另外在本文中指明或者内容明显矛盾,否则用于描述本发明的上下文中(特别用于所附权利要求书的上下文中)的术语“一”、“一个”、“所述”等指示应理解为包含单数形式和复数形式。本文中数值范围之述仅打算用作个别提及落在所述范围中的各别数值的速记方法。除非另外在本文中指明,否则各个别的数值是经并入本说明书中如同其在本文中个别地引用般。除非另外在本文中指明或者内容明显矛盾,否则述在本文中的所有方法可以任何适当的顺序进行。任何和所有实例或本文所提供示例性的语言(例如,“如”)的使用仅打算更优选地阐述本发明而不对另作声明的本发明范围造成限制。本说明书中的语言不应被理解为表示为实施本发明所必需的任何非主张要素。
本文所公开的本发明的替代要素或实施例的分组不应被理解为限制。可能会个别地提及各组成员或与所述组其它成员或在其中发现的其它要素任意组合地提及并主张。预期一个组别的一个或多个要素可根据方便性和/或专利性原因包含为一组别或从一组别移除。在任何这种包含或移除发生的情况下,认为本说明书包含经修饰因而实现随附权利要求书中使用的所有马库西群组(Markushgroup)的书面论述的群组。
在本文中描述本发明的某些实施例,包括为发明者已知可用于实施本发明的最佳模式。当然,所属领域的技术人员在阅读上述说明后当可了解关于这些所述实施例的改变。本发明者预期所属领域的技术人员可适当地使用所述改变,且本发明者意图将本发明以除本文明确所述之外的方式实施。据此,本发明包括如适用法律允许的本说明书附属的权利要求书中所列举主题的所有修改和等效物。除此之外,除非另外在本文中指明或者内容明显矛盾,否则本发明包含其所有可能变化中上述要素的任何组合。
另外,已在本说明书中多次引用公开案、专利和/或专利申请(统称为“参考文献”)。引述的各参考文献个别地以根据其特定引述教示引用方式并入本文中。
总的来说,咸应了解本文中所公开的本发明实施例为本发明原理的示例。可使用的其它修改是属于本发明范围。因此,举例然非限制性地,本发明的替代结构可依照本文教示进行使用。因此,本发明不受限于所精确显示并论述者。
在本文中显示的特定情况是举例来说且仅是以说明论述本发明优选的实施例的目的为基础且是为提供据认为是本发明各种实施例的原理和概念性态样的最有用且可容易了解的说明者而提出的。就此来说,尚未尝试较基本理解本发明所需更详细地显示本发明的结构细节,可实际上呈现结合附图和/或实例进行让所属领域的技术人员了解本发明若干种形式为何的描述。
除非在实例中进行清楚并明确修改或在应用所述含义使得任何构造无意义或基本上无意义的情况下,否则在本发明中使用的定义及解释打算并计划以任何未来构造进行控制。在术语的构造将使其无意义或基本上无意义的情况中,定义应采取韦氏辞典(Webster'sDictionary)(第3版)或所属领域的技术人员已知的字典(如牛津生物化学及分子生物学字典(OxfordDictionaryofBiochemistryandMolecularBiology)(编辑安东尼史密斯(AnthonySmith),牛津大学出版社(OxfordUniversityPress),牛津市,2004))。
Claims (27)
1.一种治疗有需要的个体的炎症性眼科病症的方法,所述方法包括投与所述个体治疗有效量的含有具有式SEQIDNO:217的以ShK为主的肽的药用组合物。
2.一种治疗有需要的个体的炎症性眼科病症的方法,所述方法包括投与所述个体治疗有效量的含有以ShK为主的肽的药用组合物,所述肽具有相对SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:208、SEQIDNO:209、SEQIDNO:210、SEQIDNO:217和/或SEQIDNO:218具有至少95%序列一致性的序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述以ShK为主的肽是天然或合成的。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法,其中所述以ShK为主的肽是附接到具有阴离子电荷的有机或无机化学实体。
5.根据权利要求1到3中任一项所述的方法,其中所述以ShK为主的肽的C-端为酸或酰胺。
6.根据权利要求1到3中任一项所述的方法,其中所述投与是局部投与眼睛。
7.根据权利要求1到3中任一项所述的方法,其中所述投与是非经肠和/或经肠。
8.根据权利要求1到3中任一项所述的方法,其中所述投与是局部投与眼睛且为非经肠和/或经肠途径。
9.根据权利要求1到3中任一项所述的方法,其中所述投与是通过玻璃体内注射进行。
10.根据权利要求1到3中任一项所述的方法,其中所述投与是每天六次、每天五次、每天四次、每天三次、每天两次、每天一次、每周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次地进行。
11.根据权利要求1到3中任一项所述的方法,其中所述炎症性眼科病症为干眼、葡萄膜炎、小儿葡萄膜炎和/或休格伦氏综合征。
12.根据权利要求1到3中任一项所述的方法,其中所述个体为人类儿童、青少年或成人。
13.根据权利要求1到3中任一项所述的方法,其中所述药用组合物进一步包含10mM磷酸钠;0.8%w/vNaCl;和0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3或4w/v%的聚山梨醇酯20,其中所述组合物具有5.0、5.5、6.0、6.5、7、7.5或8的pH。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述药用组合物包含0.05w/v%的聚山梨醇酯20,且其中所述组合物具有6.0的pH。
15.根据权利要求1到3中任一项所述的方法,其中所述药用组合物进一步包含10mM磷酸钠;0.8%w/vNaCl;和0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3或4w/v%的聚山梨醇酯80,其中所述组合物具有5.0、5.5、6.0、6.5、7、7.5或8的pH。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述药用组合物含有0.05w/v%的聚山梨醇酯80,且其中所述组合物具有6.0的pH。
17.一种筛选可从用根据权利要求1到16中任一项所述的方法治疗获益的个体的方法,所述方法包括:测量来自所述个体的生物样本的T-细胞的Kv1.3通道表达水平;将所述个体的Kv1.3通道表达水平与从来自无炎症性眼科病症的群体的数据集得到的参考水平进行比较;且假如所述个体的Kv1.3通道表达水平相较所述参考水平增加,则确定所述个体将从用根据权利要求1到16中任一项所述的方法治疗获益。
18.一种评估个体以预测用以毒素为主的治疗性肽治疗的结果的方法,所述方法包括:分析来自所述个体的生物样本的T-细胞的Kv1.3通道表达水平;其中相比从来自无炎症性眼科病症的群体的数据集得到的参考水平,Kv1.3通道表达水平增加指示个体将从递送治疗有效量的以毒素为主的治疗性肽获益。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述以毒素为主的治疗性肽为相对SEQIDNO:1到224中的任一个序列具有至少80%序列一致性的以ShK为主的肽。
20.根据权利要求18所述的方法,其进一步包括用促炎性免疫刺激因子或T-细胞活化剂在以ShK为主的肽的存在下激发T-细胞。
21.根据权利要求18所述的方法,其进一步包括测量T-细胞的促炎性细胞激素产生。
22.根据权利要求21所述的方法,其中测得的细胞激素是选自干扰素(IFN)-γ、介白素IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23、粒细胞巨噬细胞群落刺激因子GM-CSF、肿瘤坏死因子TNF-α、金属蛋白酶MMP3和MMP9中的一或多者。
23.根据权利要求18所述的方法,其进一步包括用眼抗原在存在或不存在以ShK为主的肽下激发T-细胞。
24.根据权利要求19所述的方法,其中所述以ShK为主的肽具有式SEQIDNO:217。
25.根据权利要求19所述的方法,其中所述以ShK为主的肽相对SEQIDNO:1具有至少95%的序列一致性。
26.根据权利要求19所述的方法,其中所述以ShK为主的肽相对SEQIDNO:2具有至少95%的序列一致性。
27.根据权利要求19所述的方法,其中所述以ShK为主的肽相对SEQIDNO:208、SEQIDNO:209、SEQIDNO:210、SEQIDNO:217和/或SEQIDNO:218具有至少95%的序列一致性。
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