JP5670961B2 - ShKトキシンを含む組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、2004年10月7日出願の米国仮特許出願第60/617,395号の優先権を主張するものであり、この仮出願の内容全体を参照により本明細書に明確に組み込む。
細胞膜は真核細胞の外側表面を形成する。細胞膜を通る受動拡散により、種々のイオン(たとえば、ナトリウム、カリウム、カルシウムなど)が細胞に出入りする。細胞に出入りするこのようなイオンの拡散は、細胞膜内に存在する「イオンチャネル」によって促進される。イオンチャネルは、細胞膜内に埋め込まれたタンパク質であり、細胞膜を横切るイオンの選択的な流れを制御しており、これによって細胞内部の内容物と細胞周囲の細胞外液との間に濃度勾配を形成させる。イオン濃度は、興奮性細胞(たとえば神経細胞)の電気的活動に直接関与するため、イオンチャネルの機能(または機能不全)は当該細胞の電気的特性および挙動を実質的に制御することができる。実際に、幅広く「チャネル病」と呼ばれる種々の疾患は、イオンチャネルの機能不全または機能異常に関連していると考えられている。
多発性硬化症(MS)、1型糖尿病(T1DM)、関節リウマチ(RA)および乾癬などの自己免疫疾患は、世界で数億人が罹患している。これらの障害では、特異的自己反応性T細胞−たとえば、MS患者ではミエリン特異的T細胞−が疾患の経過中に自己抗原刺激を繰り返し受け、慢性的に活性化された記憶細胞に分化し、これが炎症性組織に遊走してサイトカインを分泌することにより病因に寄与すると考えられている(ヴィグリエッタ(Viglietta)ら、2002年;ヴィサース(Vissers)ら、2002年;ウルフ(Wulff)ら、2003年b)。慢性的に活性化された記憶T細胞を優先的に標的とする治療法があれば、自己免疫疾患に対し重要な価値を有すると考えられる。
Kv1.3チャネルはエネルギーホメオスタシスとエネルギーバランスに関与していることが見出された(非特許文献1)。Kv1.3チャネルを遺伝学的にノックアウトしたマウスは、脂肪食を摂取しても体重は増加しなかったが、同一の食餌を与えた対照マウスは過体重となった。Kv1.3チャネルの薬理学的遮断は、Kv1.3チャネルの遺伝子ノックアウトの上記効果を再現した。したがって、Kv1.3ブロッカーは、肥満の管理に使用できる可能性が高い。
Kv1.3チャネルは、肝臓および筋肉などの末梢標的器官におけるインスリン感受性の調節に関与している(非特許文献2)。マウスでは、Kv1.3チャネルの遺伝子ノックアウトが肝臓および筋肉のインスリンに対する感受性を増強した。したがって、Kv1.3ブロッカーは、インスリンの末梢作用を増強し、これによって血糖値を低下させることにより、2型糖尿病の治療に使用できる可能性がある。
最も強力なKv1.3阻害薬はカリブイソギンチャクStichodactyla helianthus由来のペプチドShKである。ShKは、3つのジスルフィド架橋により連結された35残基のポリペプチドである。ShKは、pMレベルの濃度でKv1.3を遮断して(Kd=11pM)TEM細胞の増殖を抑制し、さらに、ミエリン特異的TEM細胞の養子移入により誘発したラットの実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を改善する。考えられるShKの欠点は、神経細胞のKv1.1チャネルに対し低pM濃度の親和性がある点である(Kd=28pM)。EAE試験ではShKに副作用はまったく観察されなかったが、MSにおいて血液脳関門に障害があると起こる可能性があるように、高濃度のShKが脳内に進入すれば好ましくない神経毒性を招くと考えられる。したがって、特異性の高いKv1.3阻害薬の開発が必要である。製薬産業および学術機関の広範囲に及ぶ努力により、中位のnM範囲でKv1.3を阻害する小分子がいくつか産出されたが、これらの物質は実行可能な薬剤候補となるような選択性および力価を有していない。
ShKトキシンは任意の適切な方法で合成することができる。そのような方法の1つでは、Arg(Pmc)、Asp(OtBu)、Cys(Trt)、Gln(Trt)、His(Trt)、Lys(Boc)、Ser(tBu)およびThr(tBu)を含む市販のFmoc−アミノ酸(バッケム社(Bachem Feinchemikalien))を入手し、組み立ててShKトキシンを形成する。アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)431Aペプチド合成装置を用い、0.25mmolスケールでFmoc−Cys(Trt)−Rから開始してアミノ酸の段階的組立てを行ってもよい。残基34〜22を単結合させる。その後、樹脂の等分量(たとえば半量)を分取してさらに適切に混合する。続いて、残った等分量の樹脂に残りのペプチド配列を二重結合させる。カップリングはすべて、2当量の1−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下でジシクロヘキシルカルボジイミドを介して行なう。最後の2残基もHBTU/DIEA法で結合させる。当該2残基はAeea(Fmoc−アミノエチルオキシエチルオキシ酢酸)と、N末端残基としてのFmoc−Tyr(PO4)モノベンジルエステルである。最終的にFmoc基を除去した後、ペプチド樹脂(2.42g)を樹脂から切断し、同時に試薬Kを用いて室温で2時間にわたって脱保護する。当技術分野では試薬Kは周知であり、文献に記載されている。キング、ディー.エス.(King,D.S.)、フィールズ、シー.ジー.(Fields,C.G.)およびフィールズ、ジー.ビー.(Fields,G.B.)(1990年)Int.J.Peptide Protein Res.第36巻、p.255−266を参照されたい。切断後、ペプチドを濾過して消耗した樹脂ビーズを取り除き、氷冷ジエチルエーテルで沈殿させる。続いて微細なフィルタ漏斗で該ペプチドを収集し、氷冷エーテルで洗浄し、最後に20%AcOH水溶液で抽出する。次に該ペプチド抽出物をH2Oで希釈して2リットルとし、NH4OHでpHを8.0に調整し、室温で36時間にわたって空気酸化させる。ジスルフィド結合を酸化して還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンの比が2:1になった後、該ペプチド溶液をpH2.5に酸性化し、レイニン社(Rainin)のDynamax(商標)C18カラム(5.0×30cm)にポンプで送り込む。0.1%TFAを含有するH2Oに混和したアセトニトリル5〜30%を用い、直線濃度勾配で上記試料を溶出する。2つのRP−HPLC分析装置TFAおよびTEAPを用いて、得られた画分を分析する。純粋画分を併せ、凍結乾燥する(ペニントン、エム.ダブリュ.(Pennington,M.W.)、バーンズ、エム.イー.(Byrnes,M.E.)、ザイデンバーグ、アイ.(Zaydenberg,I.)、カイティン、アイ.(Khaytin,I.)、デカストナイ、ジェイ.(de Chastonay,J.)、クラフテ、ディー.(Krafte,D.)、ヒル、アール.(Hill,R.)、マーニル、ブイ.(Mahnir,V.)、ボルバーグ、ダブリュ.エイ.(Volberg,W.A.)、ゴルチカ、ダブリュ.(Gorczyca,W.)およびケム、ダブリュ.アール.(Kem,W.R.)(1995年)Int.J.Peptide Protein Res.第46巻、p.354−358を参照)。
アニオン性アミノ酸残基は、アミノエチルオキシエチルオキシアセチル・リンカーなどのリンカーにより、もしくは他の何らかの適切な手段により、天然または合成ShKトキシンのN末端に付加してもよい。当該実施例では、図1に示した9つのShK類似体が作製される。まず、Fmoc−Aeea−OHを、上述のように組み立てた合成ShKトキシンのN末端に結合させる。続いて樹脂を9つに等分する。次に、DICおよびHOBTを用いて、Fmoc−Tyr(PO4Bzl)−OH、Fmoc−d−Tyr(PO4Bzl)−OH、Fmoc−Tyr(PO4Me2)−OH、Fmoc−Pmp−OH、Fmoc−d−Pmp−OH、Fmoc−Pmp(Et)−OH、Fmoc−Pmp(Et)2−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH、またはFmoc−Amp(Boc)−OHのいずれかを等分した樹脂の1つに結合させる。続いて非ブロック化したペプチド樹脂を切断し、5%トリイソプロピルシランを含有する試薬K(キング(King)ら、1990年)を用いて室温で2時間にわたって脱保護する。t−15分時点で切断混合物に固体のNH4Iを加えてMet(O)を還元する(ニコラス(Nicolas)ら、1995年)。Tyr(PO4Me2)−OHを含有するペプチドについては、スカベンジャーとしてチオアニソールを含有する1MのTMSBrのTFA溶液を含有する切断混合物を4℃で18時間にわたって使用した(ティアン(Tian)ら、1993年)。この方法を用いると、メチル保護基の不完全な除去がよくみられ、2つの種(Tyr(PO4)およびTyr(PO4Me))はRP−HPLCで容易に精製される。Tyr(PO4Me2)を含む類似体は標準の試薬Kによる切断を介して切断され、両Me基はそのまま維持される。いずれの場合も、切断混合物を濾過し、粗ペプチドを氷冷ジエチルエーテル中で沈殿させる。沈殿を収集し、樹脂200mgから約75mgのペプチドが産出される。この粗生成物を50%AcOH水溶液20mlに溶解し、0.75LのH2Oで希釈する。NH4OHで該溶液のpHを8.2に調整し、グルタチオン(2mM:1mM)(還元型:酸化型)を加えて一晩放置し、折り畳ませた。類似体はすべて、以前に記載されているようにRP−HPLCを用いて精製する(ペニントン(Pennington)ら、1995年;ペニントン(Pennington)ら、1996年a;ペニントン(Pennington)ら、1996年b)。純粋な画分を併せ、凍結乾燥する。各試料をRP−HPLC、AAAおよびMALDI−TOF MSで確認し、バイオアッセイの前に調整してペプチド含量を明らかにする。
p−ホスホ−Tyr−Aeea−ShK−Nle21−Cys35−アミド
p−ホスホノ−メチル−フェニルアラニン−Aeea−ShK−Nle21−Cys35−アミド(Pmp)
p−ホスファチジル−Phe−Aeea−ShK−Nle21−Cys35−アミド
p−ホスホ−Tyr−Aeea−ShK−Nle21−Cys35−アシド
p−ホスホノ−メチル−フェニルアラニン−Aeea−ShK−Nle21−Cys35−アシド(Pmp)
p−ホスファチジル−Phe−Aeea−ShK−Nle21−Cys35−アシド
非加水分解性PmpおよびPpaのほかに、p−ホスホノ(ジフルオロ−メチル)−フェニルアラニン(Pfp)およびp−ホスホノ−メチルケト−フェニルアラニン(Pkp)による置換もアニオン性置換であり、以下:
Pfp−Aeea−ShK−Nle21−Cys35アミド
Pkp−Aeea−ShK−Nle21−Cys35アミド
Pfp−Aeea−ShK−Nle21−Cys35アシド
Pkp−Aeea−ShK−Nle21−Cys35アシド
が得られる。
本発明は、本発明のShK類似体(上記表1に列記した類似体を含むがこれらに限定されない)のみで構成される、または当該類似体を含んでなる薬剤学的に許容可能な製剤の治療有効量(たとえば、症状または疾患進行を軽減または消失させる予防的もしくは効果的な量)を投与することにより、ヒトまたは動物対象者におけるT細胞媒介性障害(たとえば自己免疫疾患、移植片対宿主病、臓器移植の拒絶反応の予防など)、他の炎症性障害、肥満および2型糖尿病などの特定の障害または疾患を治療もしくは予防するための方法を提供する。任意の適切な投与経路(たとえば、経口、経直腸、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、鼻腔内、局所、経粘膜、経皮、薬剤供給インプラントによるなど)を使用できる。T細胞媒介性障害の予防または治療に使用する場合は、T細胞膜上のKv1.3チャネルを阻害するのに十分な投与量を使用する。これに関して本発明のShK類似体は、さまざまな種類のT細胞媒介性自己免疫疾患の予防または治療に使用できる可能性を有する。以下に、本発明の方法により予防または治療しうる一部のT細胞媒介性自己免疫疾患の一部の例を、各疾患により主に影響を受ける標的器官に着目して分類して示す。
多発性硬化症
重症筋無力症
ギラン・バレーなどの自己免疫性末梢神経障害
自己免疫性ブドウ膜炎
胃腸管:
クローン病
潰瘍性大腸炎
原発性胆汁性肝硬変
自己免疫性肝炎
歯周病に随伴する骨吸収
血液:
自己免疫性溶血性貧血
悪性貧血
自己免疫性血小板減少症
内分泌:
1型糖尿病
アジソン病
グレーブス病
橋本甲状腺炎
自己免疫性卵巣炎および精巣炎
血管:
側頭動脈炎
抗リン脂質抗体症候群
ウェゲナー肉芽腫症およびベーチェット病などの血管炎
多臓器および/または筋骨格系:
関節リウマチ(RA)
変形性関節症(OA)
全身性紅斑性狼瘡
強皮症
多発筋炎、皮膚筋炎
強直性脊椎炎などの脊椎関節症
シェーグレン症候群
皮膚:
乾癬
疱疹状皮膚炎
尋常性天疱瘡
白斑
影響を受ける特定の器官とは関係なく、Tリンパ球は自己免疫疾患の発現に寄与していると考えられている。これらの疾患に現在利用可能な治療法は大いに不満足なものであり、グルココルチコイド(メチルプレドニゾロン、プレドニゾンなど)、非ステロイド性抗炎症薬、金塩、メトトレキサート、抗マラリア薬のほか、シクロスポリンおよびFK−506などの他の免疫抑制薬を使用するのが通例である。さらに、本発明の方法により予防または治療しうる別のT細胞媒介性障害は、移植片対宿主病および/または移植臓器の拒絶反応である。実際に、組織型決定、外科技術、および有効な免疫抑制治療の改良技術の開発に伴い、臓器移植の転帰は徐々に改善されてきている。しかし、移植臓器の拒絶反応は未だに重大な問題である。Tリンパ球は免疫応答に中心的な役割を演じており、多くの移植臓器の拒絶反応に大きく関与している。Tリンパ球はいわゆる移植片対宿主病の原因でもあり、該疾患は、移植した骨髄細胞がMHC不適合の宿主組織を認識して破壊する。このため、シクロスポリンおよびFK506などのT細胞性免疫を抑制する薬剤を使用して、移植拒絶反応および移植片対宿主病が予防されている。しかし残念ながら、こうしたT細胞阻害薬は毒性を有し、肝毒性および腎毒性のため、その使用が制限される。このため本発明の方法は、移植片対宿主病もしくは移植拒絶反応の治療または予防に対し、毒性の低い代替選択肢を提供しうる。また、電位差ゲート型Kv1.3カリウムチャネルの阻害薬はエフェクター記憶T細胞の抑制に特に有効であることが示されており、このため本発明の方法は、骨吸収および歯周病、乾癬、関節リウマチ、糖尿病および多発性硬化症など、エフェクター記憶T細胞に関連する疾患の予防または治療に特に有効である可能性がある。T細胞媒介性疾患のほか、Kv1.3チャネルは、エネルギーホメオスタシス、体重および末梢インスリン感受性を調節することが解明されている。このため本発明の方法は、細胞膜上のKv1.3チャネルを阻害することにより、異常なホメオスタシス、体重および末梢インスリン感受性が関わる他の疾患および障害を治療するために使用できる。このような他の疾患および障害には、歯周病における骨吸収、2型糖尿病、メタボリック症候群および肥満が含まれるが、これらに限定されない。
さらに本発明によれば、蛍光団で標識したShK(L5)を単独で、もしくは自己反応性細胞を検出できるクラスII四量体と併用してフローサイトメトリーに使用することにより、in vitroでT細胞媒介性障害を診断するための方法、あるいは、種々の細胞型の選別または識別の方法を提供する。フローサイトメトリーは懸濁液中の細胞を特徴付けるための柔軟な方法であり、蛍光励起細胞分取法を用いて、フローサイトメトリーで測定した特徴に基づき生細胞を選別する。フローサイトメトリーで検出しうる細胞の特徴および機能の種類には、細胞内外のタンパク質の発現、DNAの含量と生存能力とアポトーシスのタイプ、多剤耐性ポンプ活性、酵素活性、T細胞活性化、T細胞受容体特異性、サイトカイン発現、食作用ならびに酸化バースト活性が含まれる。このため、本発明の当該方法では、ShKに付加されるアミノ酸残基には、単独で、もしくは自己反応性細胞を検出できる特異的な自己抗原を取り付けたクラスII四量体と併用してフローサイトメトリーに使用するために、蛍光団の標識が組み込まれてもよい。当該フローサイトメトリーを行ないうる方法の具体的な説明は、ビートン、シー.(Beeton,C)らの「慢性的に活性化されたTリンパ球におけるKv1.3チャネルのアップレギュレーションを検出および研究するための新規蛍光性トキシン(A Novel Fluorescent Toxin to Detect and Investigate Kv1.3 Channel Up−Regulation in Chronically Activated T Lymhocytes)」J.Biol.Chem.、第278巻、第11号、p.9928−9937(2003年3月)に記載されている。一般にフローサイトメーターは、集束レーザー光を使用して、細胞が流体の流れのなかでレーザー光線を通過するときに細胞を照射する。細胞から散乱した光と、目的の細胞に取り付けた蛍光色素から放たれた光をいくつかの検出器で分析し、コンピュータで処理する。細胞は、大きさおよび形のほか、細胞内および細胞表面上のさまざまな分子の存在によっても識別および選別しうる。
ShKは神経細胞のKv1.1チャネルとKv1.3チャネルをほぼ同等の力価で遮断する。このため、血液脳関門に障害があり、Kv1.1チャネルを遮断するのに十分な量のShKが進入できる状況下では、神経毒性が懸念される。Kv1.3に特異的な阻害薬を設計するための我々の戦略は、フルオレセイン−6−カルボキシレート(F6CA)が20Å長のAeeaリンカーを介してShKのN末端に付加されているShK−F6CAが、Kv1.1に比べKv1.3に対し80倍の選択性を示したという我々の所見によって導かれた(ビートン(Beeton)ら、2003年)。F6CAは制限されたカルボキシレートとしても、環化したラクトンとしても存在できるため、ShK−F6CAのKv1.3特異性がF6CAの陰電荷によるものか、フルオレセインの大きく嵩高い原子核により作り出される疎水性によるものか、可能性のある平面性p電子スタッキングによるものなのか、もしくは、これらの可能性のある寄与因子がすべて組み合わされたことによるものなのか、はっきりしなかった。これらの可能性を区別するために、かつ非蛍光性のKv1.3選択的阻害薬を開発する意図をもって、N末端を置換した一連の12個の新規ShK類似体を作製し、上記相互作用の一部について探査した。Aeeaリンカーを介してチロシン、フェニルアラニンまたはこれらの誘導体(電荷、大きさおよび疎水性は多岐にわたる)をShKのN末端に付加することにより、電荷および疎水性の影響を探り、F6CA置換でみられた選択性の増強について洞察を得ることができた。
図2A〜2Dに示した実施例では、陰電荷(実効電荷2)を有する翻訳後修飾された芳香族アミノ酸であるL−ホスホチロシン(L−pTyr)を、AEEAリンカーを介してShK−Arg1に付加し、新規類似体ShK(L5)を作製した。L929細胞に安定に発現しているKv1.3 およびKv1.1チャネルで、ShKトキシンとShK(L5)を試験した。図2Bは、保持電位80mV〜40mVの200msにわたる脱分極パルスにより誘発したKv1.3およびKv1.1電流に対するShKおよびShK(L5)の作用を示している。いずれのペプチドも、投与量依存的にKv1.3およびKv1.1を可逆性に遮断し、ヒル係数は1であった。Microcal Origin(登録商標)ソフトウェアを用いて示した用量反応曲線から、Kdを判定した。ShKはKv1.3(Kd=10±1pM)およびKv1.1(Kd=28±6pM)を遮断し、予測どおり力価はほぼ同等であった(図1C)。対照的にShK(L5)は、Kv1.1(Kd=7.4±0.8nM)に比べKv1.3(Kd=69±5pM)に対し100倍選択的であった(図1B、1C)。ShK(L5)およびそのウォッシュアウトによるKv1.3電流遮断の時間経過を図1Dに示す。ShK(L5)ウォッシュインの時定数(TON)は131±21秒(n=7)であり、ペプチドウォッシュアウトの時定数(TOFF)は150±28秒(n=4)であった。KON(15×106±0.5×106M−1秒−1)およびKOFF(0.0059±0.0013秒−1)値から算出したKd(57±7pM)は、Microcal Originソフトウェアで判定したKd(69±5pM)と一致している。
図3A〜3Dを参照すると、ShK(L5)のin vitroでの免疫抑制活性を評価するために、本出願人は、ヒトTEM細胞株と、ナイーブおよびTCM細胞の混合物を含むヒトPBMCとの間で、抗CD3抗体で刺激した増殖を抑制するShK(L5)の能力を比較した。フローサイトメトリーにより、検討した2つの母集団の細胞表面の表現型を確認した。図3Aにみられるように、TEM細胞株はCCR7−CD45RA−が90%を超え、一方、図3Bに示すように、PBMCは65%のCCR7+CD45RA+(ナイーブ)および18%のCCR7+CD45RA−(TCM)細胞を含有していた。図3Cは、ShK(L5)およびShKがPMBCの増殖抑制(IC50=5nM、p<0.05)に比べTEM細胞の増殖抑制(IC50=約80pM)において60倍効果が高かったことを示している。PBMCの低い感受性は、これまでに報告されているように(ガンシャニ(Ghanshani)ら、2000年;ウルフ(Wulff)ら、2003年)、ナイーブおよびTCM細胞における、刺激によるKCa3.1チャネルの迅速なアップレギュレーションにより説明されると考えられる。この解釈を踏まえ、図3Dの上の列に示すように、PBMCを48時間活性化してKCa3.1発現をアップレギュレートし、続いて12時間休ませ、さらに抗CD3抗体で再活性化したところ、PBMCはShK(L5)遮断に対して完全に抵抗性となった。第1ラウンドの刺激でShK(L5)により抑制されたPBMCは、洗浄して休ませ、抗CD3抗体で再度誘発すると、同じようにShK(L5)に抵抗性を示した。上記の結果は、ナイーブおよびTCM細胞がKCa3.1チャネルをアップレギュレートすることによりKv1.3阻害薬を免れることを示した早期の研究を確証するものである。以上のように、ShK(L5)は優先的かつ持続的にTEM細胞の増殖を抑制する。
ShK(L5)の治療的有効性を評価することを前提として、ラットにMS様疾患を引き起こす記憶T細胞株PASの増殖を抑制するShK(L5)の能力について検討した。対照として、本出願人はラット脾臓T細胞を使用した。2つの細胞母集団の分化状態を確認するため、ナイーブT細胞のマーカーであるCD45RCの発現を評価した(バンス(Bunce)およびベル(Bell)、1997年)。図4Aに示すように、ラット脾臓T細胞はCD45RC+が76%であったが(すなわち主にナイーブ細胞)、PAS細胞はCD45RC−であったことから記憶細胞であることが示唆される。PAS細胞がTEM状態にあるか、もしくはTCM状態にあるか判断するために、活性化の前および48時間後にKv1.3発現を調査した。TEM細胞は刺激によりKv1.3レベルを著明にアップレギュレートするが、TCM細胞ではアップレギュレートしないと予測される。図4Bを参照すると、パッチクランプ法実験から、PAS細胞のMBP刺激後にKv1.3電流の振幅が著しく増大することが明らかにされ、TEM細胞であることと一致している。PAS細胞上のKv1.3チャネル数を測定する独自の測定法として、Kv1.3と特異的に結合することが報告されている蛍光標識したShK類似体であるShK−F6CAを用いた。フローサイトメトリーで測定したShK−F6CAの染色強度は、細胞表面に発現したKv1.3四量体の数を反映している。図4Cにみられるように、ShK−F6CA(10nM)の染色強度はPAS細胞のMBP活性化とともに増大し、過剰な非標識ShK(L5)(100nM)がShK−F6CA染色を競合的に阻害した。最終試験として本出願人は、固定してKv1.3特異抗体で染色した静止期PAS細胞およびMBPで刺激したPAS細胞について共焦点顕微鏡検査を行なった。図4Bおよび4Cのデータと一致して、休止期PAS T細胞はKv1.3染色強度が4.4±0.6であり、この値は抗原による活性化後に10.6±2.3(p<0.005)に増大したことから(図4Dを参照)、活性化後にKv1.3タンパク質発現が増加したことを示している。このため、MBPで活性化したPAS細胞は、CD45RC−Kv1.3highTEM細胞であり、一方、実験に用いたラット脾臓T細胞は大部分がナイーブ状態である。
パッチクランプ法によるバイオアッセイを用いて、皮下注射後のShK(L5)の血中濃度がTEM細胞の阻害に十分であるかどうか確認した。これらの実験の結果を図5A〜5Fに示す。
本出願人は、in vitroおよびin vivo試験をいくつか実施してShK(L5)が毒性を示すかどうか判定した。当該試験の結果を付録Aに要約する。ヒトおよびラットのリンパ系細胞を、Kv1.3半遮断量またはTEM抑制のIC50(70〜80pM)の1200倍を超える濃度のShK(L5)(100nM)とともに48時間インキュベートしたところ、軽微な細胞毒性を示した。同じ高濃度のShK(L5)は、試験株TA97Aを用いたエイムス試験で陰性であったことから、変異原物質ではないことが示唆された。いずれのin vitro試験においても特筆すべき毒性は検出できなかった。
図6A〜6Cを参照すると、2つの動物モデルにおいてin vivoでの免疫抑制活性についてShK(L5)を評価した。本出願人は、MBPで活性化したPAS TEM細胞をLewisラットに移入して誘発した急性EAEを予防および治療する能力のほか、TEM細胞で媒介されるDTH反応を抑制する能力も試験した。PAS細胞をin vitroで48時間にわたってMBPで活性化し、続いてLewisラットに養子移入した(生細胞数:6〜8×106)。次に予防試験では、ラットに生理食塩水(対照)またはShK(L5)(10μg/kg/日)を5日間にわたって皮下注射した。第1の予防試験では、対照ラットは軽度EAEを発現し(平均最大臨床スコア2.0±1.2)、平均発症日は5.6±0.6日であった(データ省略)。ShK(L5)は疾患の重症度を軽減した(平均最大臨床スコア0.7±0.6、p<0.05)。第2の予防試験では、対照ラットはより重度のEAEを発現し(平均最大臨床スコア3.2±0.4)、平均発症日は4.8±0.4日であった(図6A)。ShK(L5)は疾患の重症度を有意に軽減した(平均最大臨床スコア0.6±0.4、p<0.007)が、疾患発症日は有意には遅延させなかった(5.5±0.7日;p=0.07)。これらの試験では毒性の徴候がまったくみられなかった。
図7A〜7Gを参照すると、高選択性Kv1.3阻害薬(21)であるShK(L5)は、GAD65特異的TEM細胞においてKv1.3電流を遮断し、Kdは72±3pMであった。ShK(L5)を薬理学的プローブとして使用して、Kv1.3機能を必要とするTEM細胞活性化のステップを明らかにした。生化学的研究から、Kv1.3およびKvb2は、SAP97(シナプス関連タンパク質97)、ZIP(PKCゼータ結合タンパク質、p56lck関連p62タンパク質、A170)、p56lckおよびCD4を含むシグナル伝達複合体に属することが示されている(図7B)。ヒトTEM細胞における当該複合体の存在は、Kv1.3、Kvb2、SAP97、ZIPおよびp56lckとCD4との共キャップ形成を示す本出願人の結果により裏付けられている。さらに、FRET(蛍光エネルギー変換)研究から、Kv1.3をトランスフェクトしたヒトT細胞ではKv1.3がCD3に非常に接近しており、さらに該チャネルは、Kv1.3をトランスフェクトしたヒト細胞傷害性T細胞とその標的との接点に優先的に局在していることが示されている。CD4は、T細胞と抗原提示細胞(APC)が接する領域であるISに移動するため、シグナル伝達複合体のKv1.3および他のタンパク質も抗原提示によりISに局在する可能性がある。この考えを検討するため、T1DM患者からのGAD65特異的Kv1.3highTEMクローンを、GAD65 557Iペプチドを取り付けてDAPIで染色して視覚化を助けたHLA適合APCとともにインキュベートした。20分後、シグナル伝達複合体中のタンパク質を検討するため、APC−TEM結合体を免疫染色した。ISには、Kv1.3、Kvb2、SAD97、ZIPおよびp56lckとともにCD4が局在していた。APCとTEMとの接触のない場合では、CD4およびKv1.3は細胞全体に分布していた。さらに、GAD65特異的TEM細胞がMBP(無関連抗原)を取り付けたAPCに曝された場合は、CD4およびKv1.3は接点に局在できなかったことから、ISの集積は抗原特異的であることが立証された。以上のように、GAD65特異的TEM細胞では、抗原提示により、Kv1.3含有シグナル伝達複合体がCD4とともにISに移動することから、Kv1.3はTEM細胞におけるシグナル変換機構に不可欠な構成要素であることが示唆される。以上の試験に基づけば、Kv1.3チャネルの約99%を遮断する濃度(100nM)のShK(L5)は、ISの集積を妨げず、ひとたび形成されたISを崩壊させなかったことから、Kv1.3チャネルを通るK+の流出はISの形成または安定性に不必要であることが示された。
図8A〜8Eを参照すると、ShK(L5)は、T細胞活性化に不可欠な初期段階であるTEM細胞のカルシウムシグナル伝達を阻害した。T1DM患者からのGAD65特異的TEMクローンに、カルシウム指示薬である色素Fluo3を取り付け、培養液のみで、または濃度を増大させたShK(L5)とともにプレインキュベートし、活性化用抗CD3抗体および架橋用第2抗体の添加前後にフローサイトメトリーにより画像化した。刺激後242±35秒で最高カルシウム上昇が起こり、これがShK(L5)で遮断され、IC50は約200pMであった(図8A)。ShK(L5)は、T1DM患者およびRA患者からのナイーブ/TCM細胞に比べ、同患者からの自己反応性TEM細胞による[3H」チミジン取込みを10倍効果的に抑制した(図8B、左)。第2セットの実験(図8B、右)では、RA−SFおよびRA−PBT細胞を抗CD3抗体で48時間活性化し、それぞれ「TEMエフェクター」および「ナイーブ/TCMエフェクター」を作製した。培地中で細胞を一晩休ませ、ShK(L5)の存在下または非存在下で抗CD3抗体でさらに48時間再刺激し、[3H」チミジン取込みを測定した。RA−SF−TEMエフェクターはShK(L5)阻害に対する感受性を保持していたが、RA−PB−ナイーブ/TCMエフェクターはKv1.3遮断に抵抗性であり(図8B,右)、これはおそらく、該エフェクターがカルシウム活性化KCa3.1/IKCa1チャネルをアップレギュレートしたことによるものである可能性が高く、このチャネルはカルシウム流入の際にKv1.3の代わりになる。ShK(L5)は、T1DMおよびRA患者からのTEM細胞によるインターロイキン2(IL2)およびインターフェロン−g(IFN−g)の産生を大いに抑制したが、これらの患者からのナイーブ/TCM細胞によるIL2およびIFN−gの産生はそれほど影響を受けなかった(図8C)。TEM細胞およびナイーブ/TCM細胞による腫瘍壊死因子−αおよびインターロイキン4の産生は、いずれもShK(L5)に感受性が低かった(図8C)。
図9に示すように、アジュバント中の卵アルブミン(OVA)でラットを免疫した。7日後に片耳にOVAを接種し、他方の耳に生理食塩水を接種した。遅延型過敏症(DTH)の徴候として、24時間後に耳の腫脹を測定した。図9に示したFACSヒストグラムは、OVAを接種した耳のT細胞はCD45RC陰性記憶細胞であり、一方、同一ラットの血液および脾臓のT細胞は大部分がナイーブT細胞であることを示している。
図10に示すように、ナイーブ細胞のエフェクター記憶TEM細胞への分化を妨げるため第0日から第7日まで(初回刺激段階)、もしくはTEM細胞の機能を妨げるため耳に卵アルブミンを接種した後のエフェクター段階で、皮下注射として10μg/kg/日のShK(L5)をラットに投与した。
図11に示すように、対照ラットは耳の腫脹、すなわち陽性DTH反応を発現した。ShK(L5)は、初回刺激段階で投与するとDTHの抑制に効果がなかったことから、ナイーブおよびセントラル記憶T細胞のエフェクター記憶細胞への分化を抑制しなかったことを示している。ShK(L5)は、エフェクター段階で投与するとDTHを抑制したことから、エフェクター記憶T細胞が耳に達する能力を妨げたか、またはエフェクター記憶T細胞の活性化を抑制したかのうち少なくともいずれかであることを示している。ShK(L5)投与ラットの耳のT細胞数は、賦形剤を投与したラットの耳と同じであったため、第一の可能性は除外された。エフェクター記憶T細胞はKv1.3陰性であったが、賦形剤を投与した動物の耳の記憶T細胞はKv1.3陽性であったため、ShK(L5)は耳におけるエフェクター記憶T細胞の活性化を抑制したのである。上記動物ではIgMおよびIgG B細胞の反応も影響を受けなかった。
図12Aは、新規発症1型糖尿病患者、健康な対照者および多発性硬化症患者に由来する抗原特異的T細胞からのKv1.3電流(上)およびチャネル数/細胞(下)を示している。各データ点は、3回目の抗原刺激から48時間後に測定した、単一ドナーからの2〜4のT細胞株に由来する細胞20〜50個についての平均値±SEMを示している。T1DM患者および対照者の血中にはインスリンおよびGAD65に特異的なT細胞の頻度が低いため、スプリットウェル法を用いて短期自己抗原特異的CD4+T細胞株を作製することにより、上記母集団を増幅した。対照として、MSには関係しているがT1DMには関係のない無関連自己抗原であるミエリン塩基性タンパク質(MBP)に特異的なT細胞株を作製した。3回目の抗原刺激後に、4pFを超える膜電気容量を有する活性化細胞を用い、ホールセルパッチクランプ法によりKv1.3電流を測定した(細胞直径11μm以上)。代表的なKv1.3電流およびKv1.3チャネル数/T細胞を図12Aに示す。電流は、Kv1.3に特徴的な生物物理学的および薬理学的特性を示した。新規発症T1DM患者由来のインスリン(9〜23)またはGAD65(555〜567)特異的T細胞は、Kv1.3電流が大きく、Kv1.3チャネル数が多かったが、当該患者由来の疾患とは無関連なMBP特異的T細胞はKv1.3lowであった(p=0.001)。比較のため、反対のパターンが観察されたMS患者について本出願人が発表したKv1.3データをプロットした。MS患者では、MBPまたはミエリン乏突起神経膠細胞の糖タンパク質(ペプチド35〜55)もしくはプロテオリピドタンパク質(ペプチド139〜151)に特異的なT細胞はKv1.3highであったが、インスリンおよびGAD65に特異的なT細胞はKv1.3lowであった(p=0.0001)。健康対照者から単離した自己反応性T細胞は、特異性に関係なくKv1.3lowであった。MSおよびT1DMの両方を有する患者1例では、3つの自己抗原に特異的なT細胞がKv1.3highであった。長期にわたるT1DMを有する患者からのGAD65特異的およびインスリン特異的T細胞がKv1.3highであったことは、自己反応性TEM細胞の持続性を反映しているが、非自己免疫性2型DM患者からのGAD65およびインスリン特異的T細胞にはKv1.3lowパターンがみられた。図12Bに、個々の細胞のKv1.3の染色強度(上)および蛍光強度(下)を示す。本出願人は、Kv1.3の免疫染色によりパッチクランプ法のデータを確認した。T1DM患者からのインスリン特異的およびGAD65特異的T細胞、ならびにMS患者からのMBP特異的T細胞は明るく染色されたが、無関連自己抗原に特異的な細胞の染色はかすかであった。図12CはCCR7発現を示している。フローサイトメトリーにより、Kv1.3highT細胞はCCR7−TEM細胞であるが、Kv1.3low細胞はCCR7+ナイーブまたはTCM細胞であることが示された。図12Dは、T1DMおよびMSの両方を有する患者からと、それぞれ5年以上および2年以上のT1DMまたは2型DMを有する患者からの自己反応性T細胞における1細胞あたりのKv1.3の数を示している。図12Eは、新規発症T1DM患者からのCD4+GAD65四量体+T細胞におけるKv1.3数を示している。さらなる対照として、GAD65 557Iペプチドを含有する蛍光性MHCクラスII四量体を使用して、新規発症T1DMを有するDR−0401陽性患者からGAD65特異的CD4+T細胞を単離した。四量体で選別したGAD65活性化T細胞は、T1DM患者からのGAD65特異的T細胞株に観察されたパターンと同じKv1.3highパターンを示した。以上を要約すると、T1DMおよびMSのいずれにおいても、疾患関連性の自己抗原活性化T細胞はKv1.3highCCR7−TEMエフェクターであり、一方、当該患者における疾患無関連性の自己反応性細胞はKv1.3lowCCR7+ナイーブ/TCM細胞である。
RAでは、罹患関節からの疾患関連T細胞の単離が可能である。本出願人は、抗CD3抗体で刺激後48時間の時点でRA患者7例の滑液(SF)から採取したT細胞についてパッチクランプ法を行なった。図13Aにみられるように、対照として本出願人は、非自己免疫性の退行性変形性関節症(OA)患者7例からのSF−T細胞(同一プロトコルで活性化した)を分析した。RA−SFのT細胞はKv1.3highであり、一方、OA−SFのT細胞はKv1.3lowであった(p<0.0001)。本出願人は、RA患者の末梢血(PB)からの抗CD3活性化T細胞にKv1.3lowパターンを見出した(p<0.0001)が、これは血液中には自己反応性Kv1.3highTEM細胞がまれであるためである。Kv1.3およびその付属のKvβ2サブユニットの免疫染色により、パッチクランプ法のデータの確証を得た。図13Bは、 Kv1.3(図では明灰色)および Kvβ2(図では暗灰色)染色の共焦点画像を示している。RA−SFのT細胞はKv1.3およびKvβ2の両方が明るく染色されたが、OA−SFおよびRA−PBのT細胞は弱い染色を示した。図13CはCCR7発現を示している。フローサイトメトリーにより、Kv1.3highRA−SF T細胞はCCR7−TEM細胞であるが、Kv1.3lowOA−SFおよびRA−PB T細胞はCCR7+ナイーブ/TCM細胞であることが検証された。図13D(上)は、抗CD3抗体または抗Kv1.3抗体で染色し、ヘマトキリン/エオシンで対比染色したRAおよびOA患者からの滑膜の顕微鏡写真を示している(40倍)。さらなる試験として、RA患者5例およびOA患者5例からのパラフィン包埋滑膜組織(ST)をCD3、Kv1.3およびCCR7について免疫染色した。以前に示したとおり、本出願人の染色法は、ナイーブ/TCM細胞ではKv1.3チャネル数が少ないためにKv1.3を検出しない。RA−STではCD3+Kv1.3+CCR7−TEM細胞の優勢がみられたが、OA滑膜ではCD3+細胞がまばらであり、これらの細胞は主にKv1.3−CCR7+ナイーブ/TCM細胞であった。分類法により評価したCD3+、Kv1.3+およびCCR7+細胞による浸潤度を図S2Aに示す。CD3+炎症指数:RA=3.2±0.1;OA=1.1±0.2(p<0.01);Kv1.3+炎症指数:RA=2.8±0.3;OA=0.6±0.3(p<0.01)。以上のように、異なる3つの自己免疫疾患において、我々の結果は、疾患関連性自己反応性T細胞がKv1.3highCCR7−TEMエフェクターであることで一致している。
Claims (31)
- アニオン電荷を有する有機化学物質を付加したShKトキシンを含んでなる組成物であって、前記化学物質が、AEEAc−L−アスパラギン酸塩、AEEAc−D−アスパラギン酸塩、AEEAc−L−グルタミン酸塩、AEEAc−D−グルタミン酸塩、AEEAc−p−Tyr−モノメチル、AEEAc−p−ホスホノ(ジフルオロ−メチル)−フェニルアラニン(Pfp)、AEEAc−p−ホスホノ−メチルケト−フェニルアラニン(Pkp)、またはAEEAc−p−ホスホノ−フェニルアラニン(Ppa)を含み、前記化学物質がShKトキシンのN末端残基に付加されている組成物。
- 前記ShKトキシンが天然源から入手される請求項1に記載の組成物。
- 前記ShKトキシンが合成物である請求項1に記載の組成物。
- 前記化学物質が蛍光団の標識を含んでいる請求項1に記載の組成物。
- 前記化学物質がAEEAc−L−アスパラギン酸塩である請求項1に記載の組成物。
- 前記化学物質がAEEAc−D−アスパラギン酸塩である請求項1に記載の組成物。
- 前記化学物質がAEEAc−L−グルタミン酸塩である請求項1に記載の組成物。
- 前記化学物質がAEEAc−D−グルタミン酸塩である請求項1に記載の組成物。
- 前記化学物質がAEEAc−p−ホスホノ(ジフルオロ−メチル)−フェニルアラニン(Pfp)を含む請求項1に記載の組成物。
- 前記化学物質がAEEAc−p−ホスホノ−メチルケト−フェニルアラニン(Pkp)を含む請求項1に記載の組成物。
- 前記化学物質がAEEAc−p−ホスホノ−フェニルアラニン(Ppa)を含む請求項1に記載の組成物。
- ヒトまたは動物においてKv1.3カリウムチャネルを阻害する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組成物。
- 自己免疫疾患の予防または治療用の請求項12に記載の組成物。
- 前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、重症筋無力症、ギラン・バレーなどの自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性ブドウ膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、自己免疫性血小板減少症、1型糖尿病、アジソン病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、ベーチェット病、関節リウマチ、歯周病に随伴する骨吸収、全身性紅斑性狼瘡、強皮症、多発筋炎、皮膚筋炎、尋常性天疱瘡、強直性脊椎炎などの脊椎関節症、およびシェーグレン症候群からなる群から選択される請求項13に記載の組成物。
- 移植片対宿主病の予防または治療用の請求項12に記載の組成物。
- 移植した組織または臓器の拒絶反応の予防または治療用の請求項12に記載の組成物。
- メタボリック症候群の予防または治療用の請求項12に記載の組成物。
- 2型糖尿病の治療または予防用の請求項12に記載の組成物。
- 肥満の治療または予防用の請求項12に記載の組成物。
- 歯周病に随伴する骨吸収の治療または予防用の請求項12に記載の組成物。
- 前記ShKトキシンが21位におけるMet残基の置換により修飾されている請求項1に記載の組成物。
- 前記21位におけるMet残基の置換が酸化を阻止するようになされた請求項21に記載の組成物。
- 前記21位におけるMet残基がNle残基で置換されている請求項21に記載の組成物。
- 前記ShKトキシンがC末端酸官能基をアミドで置換することにより修飾されている請求項1に記載の組成物。
- 前記C末端酸官能基のアミドへの置換が、C末端カルボキシペプチダーゼ酵素に対する安定性を与えるようになされた請求項24に記載の組成物。
- 前記ShKトキシンが、アミノ酸配列Arg−Ser−Cys−Ile−Asp−Thr−Ile−Pro−Lys−Ser−Arg−Cys−Thr−Ala−Phe−Gln−Cys−Lys−His−Ser−Met−Lys−Tyr−Arg−Leu−Ser−Phe−Cys−Arg−Lys−Thr−Cys−Gly−Thr−Cysを有する請求項1に記載の組成物。
- p−Tyr−モノメチルAEEAc−Arg−Ser−Cys−Ile−Asp−Thr−Ile−Pro−Lys−Ser−Arg−Cys−Thr−Ala−Phe−Gln−Cys−Lys−His−Ser−Nle−Lys−Tyr−Arg−Leu−Ser−Phe−Cys−Arg−Lys−Thr−Cys−Gly−Thr−Cys−アミドからなる構造のポリペプチド類似体を含む組成物。
- p−ホスホノ−フェニルアラニンAEEAc−Arg−Ser−Cys−Ile−Asp−Thr−Ile−Pro−Lys−Ser−Arg−Cys−Thr−Ala−Phe−Gln−Cys−Lys−His−Ser−Nle−Lys−Tyr−Arg−Leu−Ser−Phe−Cys−Arg−Lys−Thr−Cys−Gly−Thr−Cys−アミドからなる構造のポリペプチド類似体を含む組成物。
- p−ホスホノ−フェニルアラニンAEEAc−Arg−Ser−Cys−Ile−Asp−Thr−Ile−Pro−Lys−Ser−Arg−Cys−Thr−Ala−Phe−Gln−Cys−Lys−His−Ser−Met−Lys−Tyr−Arg−Leu−Ser−Phe−Cys−Arg−Lys−Thr−Cys−Gly−Thr−Cys−アミドからなる構造のポリペプチド類似体を含む組成物。
- フローサイトメトリーを実施するための方法であって、
(A)請求項4に記載の組成物を提供する工程と、
(B)工程Aで提供された組成物を細胞と混合する工程と、
(C)工程Aで提供された組成物に対し親和性を有する細胞を、フローサイトメーターを用いて、計数、単離、または識別する工程と
を含むことを特徴とする方法。 - 前記工程Cがフローサイトメーターを用いてTリンパ球を計数、単離または識別することからなる請求項30に記載の方法。
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