MX2007004074A - Analogos de toxina shk y sus usos en inhibicion selectiva de canales de potasio kv1.3. - Google Patents

Analogos de toxina shk y sus usos en inhibicion selectiva de canales de potasio kv1.3.

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Christine Beeton
Michael William Pennington
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Abstract

Analogos de toxina shK y metodos para utilizar dicho analogos ShK. Los analogos ShK en general comprenden toxina ShK conectada a una entidad quimica (e.g. un atomo, molecula, grupo, residuo, compuesto, porcion, etc.) que tiene una carga anionica. En algunas modalidades la entidad quimica conectada a la toxina ShK puede comprender un residuo aminoacido. Los analogos ShK pueden ser administrados a sujetos humanos o animales no-humanos para provocar inhibicion de canales de potasio o para tratar de otra forma enfermedades o desordenes. En algunas modalidades, la entidad quimica a la cual se conecta la toxina ShK, puede seleccionarse para proporcionar inhibicion selectiva de ciertos canales de potasio (e.g. canales Kv1.3) sobre otros canales de potasio (e.g., canales Kv1.1). En algunas modalidades, la entidad quimica a la cual se conecta la toxina ShK, puede incluir un fluoroforo, proporcionado de esta manera un analogo ShK etiquetado con fluoroforo. Estos analogos ShK etiquetados con fluoroforo pueden emplearse solo en citometria de flujo, o en conjunto con tetrameros clase II que pueden detectar celulas auto-reactivas.

Description

ANÁLOGOS DE TOXINA SHK Y SUS USOS EN INHIBICIÓN SELECTIVA DE CANALES DE POTASIO Kv1.3 SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud de patente reclama prioridad de la solicitud de patente provisional de los E.U.A. No. de Serie 60/617,395 presentada en octubre 7, 2004, la totalidad de la cual aquí se incorpora expresamente por referencia. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona a) composiciones novedosas de materia, b) métodos y equipos para inhibición in vivo y/o in vitro del canal Kv1.3 en linfocitos T y B y otros tipos de células y c) métodos para tratar desórdenes autoinmunes y otros, en sujetos humanos o animales. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Membranas de plasma celular forman las superficies exteriores de células eucarióticas. Diversos iones (por ejemplo, sodio, potasio, calcio, etc.) entran y salen de células por difusión pasiva a través de las membranas de plasma de las células. Esta difusión de iones dentro y fuera de las células se facilita por la presencia de "canales de iones" dentro de las membranas celulares. Los canales de iones son proteínas incrustadas dentro de la membrana celular, que controlan el flujo selectivo de iones a través de la membrana, de esta manera permitiendo la formación de gradientes de concentración entre contenidos intracelulares de las células y fluido extracelular circundante. Debido a que las concentraciones de iones están involucradas directamente en la actividad eléctrica de células excitables (por ejemplo, neuronas), el funcionamiento (o mal funcionamiento) de los canales de iones puede controlar substancialmente las propiedades eléctricas y comportamiento de estas células. Sin duda, una variedad de desórdenes, ampliamente denominados "canalopatías", se consideran vinculados con las insuficiencias o disfunciones de canal de iones. Los canales de iones se refieren como "con compuerta", si están abiertos o cerrados. Los tipos básicos de canales de iones con compuertas incluyen a) canales con compuertas de ligando, b) canales con compuerta mecánica y c) canales con compuerta de voltaje. En particular, canales con compuerta de voltaje se encuentran en neuronas, células musculares y células no excitables tales como linfocitos. Abren o cierran en respuesta a cambios en la carga a través de la membrana de plasma. Canales Kv1.3 v Enfermedades Autoinmunes Las enfermedades autoinmunes tales como esclerosis múltiple (MS = i múltiple sclerosis), diabetes mellitus tipo-1 (T1DM = type-1 diabetes mellitus), arthritis reumatoide (RA = rheumatoid arthritis) y soriasis, afectan a varios cientos de millones de personas en todo el mundo. En estos desórdenes, células T autoreactivas específicas - por ejemplo células T específicas de mielina en pacientes de MS - se considera que se someten a estímulo autoantígeno repetido durante el curso de la enfermedad y diferencian en células de memoria activadas crónicamente que contribuyen a patogénesis por migración a los tejidos inflamados y secreción de citoquinas (Viglietta et al., 2002; Vissers et al., 1002; Wulff et al., 2003b). Las terapias que de preferencia hacen blanco o diana en células T de memoria crónicamente activadas tendrán valor significante para enfermedades autoinmunes. Las células T de memoria se dividen en dos sub-conjuntos - de memoria central (TCM) y memoria efectora (TEM) - con base en la expresión del receptor de quimiocina CCR7 y la fosfatasa CD45RA (Geginat et al., 2001 ; Sallusto et al., 1999). Células sin tratamiento previo y TCM asientan en el nodo linfático antes de migrar a sitios de inflamación, mientras que células TEM asientan directamente en sitios de inflamación en donde se secretan cantidades copiosas de IFN- J y TNF-y exhiben función efectora inmediata. Recientemente se ha mostrado que las células T autoreactivas específicas de mielina en pacientes de MS, son células TE predominantemente activas ( ulff et al., 2003b), y la transferencia adoptiva de células TE de rata activadas específicas de mielina en recipientes sin tratamiento previo inducen severa EAE (Beeton et al., 2001a; Beeton et al., 2001b). Una diana terapéutica nueva excitante para inmunomodulación de células TEM es el canal Kv1.3 K+ con compuerta de voltaje. Las células TE regulan en forma ascendente los canales Kv1.3 ante activación y su proliferación desplazada por antígeno es exquisitamente sensible a bloqueadores Kv1.3 (Wulff et al., 2003b). Células sin tratamiento previo y TCM en contraste son significativamente menos sensibles a bloqueadores Kv1.3 para empezar y rápidamente se vuelven resistentes a bloqueo KV1.3 al regular en forma ascendente el canal K+ activado por calcio y IKCal (Ghanshani et al., 2000; Wulff et al., 2003b). La dominancia de Kv1.3 en células TEM proporciona una forma poderosa para manipular la actividad de este sub-conjunto con inhibidores Kv1.3 específicos. La distribución de tejido funcionalmente restringido del canal y el hecho de que el bloqueo Kv1.3 in vivo mejora EAE mediado por TEM> resorción de huesos en enfermedad periodontal y reacciones de hipersensibilidad de tipo retrasado en modelos de animales sin provocar efectos secundarios obvios, ha mejorado lo atractivo de Kv1.3 como un blanco terapéutico (Beeton et al., 2001b; Koo et al., 1997; Valverde et al., 2004). Aunque los bloqueadores Kv1.3 suprimirán todas las células TE activadas (por ejemplo células TE específicas para antígenos de vacuna), una terapia basada en Kv1.3 sería una mejora significante frente a terapias actuales que modulan en forma amplia e indiscriminada todo el sistema inmune.
Una ventaja adicional de bloqueadores Kv1.3 es que son reversibles. De esta manera, se puede titular el efecto terapéutico de bloqueadores Kv1.3 cuando se requiere y detener la terapia frente a la infección, a diferencia de agentes quimioterapéuticos que tardan meses en disminuir. Canal Kv1.3 v Obesidad El canal Kv1.3 se encontró que juega un papel en homeostasis de energía y balance de energía (Hum Mol Genet. 2003 12:551-9). Ratones con el canal Kv1.3 con gen inoperativo knock out, fueron capaces de ingerir dietas grasas sin ganar peso, mientras que ratones de control a los que se les dió la misma dieta tuvieron sobre-peso. El bloque farmacológico de los canales Kv1.3 recapitula el efecto de los genes inoperativos knock-out de canales Kv1.3. Consecuentemente, es probable que bloqueadores Kv1.3 tengan uso en el manejo de obesidad. Canales Kv1.3 v Diabetes Mellitus Tipo-2. Los canales Kv1.3 juegan un papel para regular sensibilidad a insulina en órganos diana periféricos tales como el hígado y músculo (Proc Nati Acad Sci U S A, 2004 101:3112-7). Los genes inoperativos knock-out del canal Kv1.3 en ratones mejoran la sensibilidad del hígado y músculo a insulina.
Consecuentemente, bloqueadores Kv1.3 pueden tener uso en el tratamiento de diabetes mellitus tipo-2, al mejorar las acciones periféricas de insulina y de esta manera disminuir los niveles de glucosa en la sangre. Polipéptidos de Origen Natural que se conoce Inhiben Canales Kv1.3 El inhibidor Kv1.3 más potente es el péptido ShK de la anemona del Mar Caribe Stichodactyla helianthus. ShK es un polipéptido de 35-residuos reticulado por 3 puentes disulfuro. ShK bloquea Kv1.3 (Kd = 11 pM) y suprime la proliferación de células TEM a concentraciones picomolares, y mejora la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratas, inducida por la transferencia adoptiva de células TE específicas de mielina. Una desventaja potencial de ShK es su baja afinidad picomolar para el canal Kv1.1 neuronal (Kd 28 pM). Aunque no se observaron efectos secundarios con ShK en pruebas EAE, el ingreso de altas concentraciones de ShK en el cerebro, como puede suceder cuando está comprometida la barrera sangre-cerebro en MS, puede llevar a neurotoxicidad indeseada. El desarrollo de inhibidores Kv1.3 altamente específicos por lo tanto es necesario. Un esfuerzo extenso por la industria farmacéutica y grupos académicos ha dado por resultado varias moléculas pequeñas que inhiben Kv1.3 en el rango medio-nanomolar, pero estos compuestos no tienen la selectividad o potencia para hacerlos candidatos de drogas viables. Varios análogos peptídicos truncados de ShK se han reportado previamente. En uno de estos análogos ShK, la secuencia nativa se truncó y después se estabilizó por la introducción de enlaces covalentes adicionales (un disulfuro no nativo y dos puentes lactama). En otros, andamios estructurales no nativos estabilizados por puentes disulfuro y/o lactama se modificaron para incluir residuos amino ácido clave de la toxina nativa. Estos análogos ShK exhiben grados variantes de actividad inhibitoria Kv1.3 y especificidad. Lanigan, M. D. et al.; Designed Peptide Analogues of the Potassium Channel Blocker ShK Toxin; Biochemistry, 25; 40(51): 15528-37 (December 2001).
Queda necesidad en la técnica por el desarrollo de nuevos análogos de ShK que inhiban selectivamente los canales Kv1.3 en linfocitos, con efectos inhibitorios mínimos o nulos en los canales Kv1.1 u otros canales de potasio. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones novedosas (aquí referidas como "análogos ShK") que comprenden toxina ShK conectada (por ejemplo, ligada, unida por un enlazador o de otra forma asociada con) una entidad química orgánica o inorgánica (por ejemplo, un átomo, molécula, grupo, residuo, compuesto, porción, etc.), que tenga una carga aniónica. Además de acuerdo con la presente invención, se proporcionan métodos para inhibir canales de potasio y/o tratar enfermedades o desórdenes en sujetos humanos o animales, al administrar al sujeto una cantidad efectiva de un análogo ShK de la presente invención. En algunas modalidades, la entidad química a la cual se conecta la toxina de ShK puede seleccionarse para proporcionar inhibición selectiva de ciertos canales de potasio (por ejemplo canales Kv1.3) sobre otros canales de potasio (por ejemplo, canales Kv1.1). Aún más, de acuerdo con la presente invención, análogos ShK del character anterior pueden incluir una etiqueta de fluoróforo y estos análogos ShK etiquetados con fluoróforo de la presente invención pueden utilizarse en citometría de flujo solo, o en conjunto con tetrámeros clase li que pueden detectar células autoreactivas. Adicionales aspectos, elementos y detalles de la presente invención serán aparentes para aquellos con destreza en la técnica ante lectura de la descripción detallada y los ejemplos establecidos a continuación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra las estructuras químicas de una cantidad de análogos ShK de la presente invención. La Figura 2A muestra un modelo molecular de ShK con base en la estructura RMN publicada en donde el Lys22, crítico para el bloqueo de canal, se resalta en un tono de gris. L- Tyr se conecta al grupo a-amino de Arg1 de ShK (resaltado en un segundo tono de gris) a través de un enlazador Aeea (derecha).
Las estructuras del enlazador y L-p Tyr se modelaron con AM1 en Hyperchem. La Figura 2B muestra el efecto de ShK (superior) y ShK (L5) (fondo) en corrientes Kv1.3 y Kv1.1 en células transfectadas en forma estable. La Figura 2C muestra inhibición dependiente de dosis de Kv1.3 (símbolos abiertos) y Kv1.1 (símbolos cerrados) por ShK (oscuro) y ShK(L5) (ligero). Kds en Kv1.3 =10 ± 1 pM (ShK) y 69 ± 5 pM (ShK(L5)); K S en Kv1.1 = 28 ± 6 pM (ShK) y 7.4 ± 0.8 nM (ShK(L5)). La Figura 2D muestra el curso de tiempo de arrastre de ingreso y de salida de ShK(L5) en Kv1.3 en donde las células se mantuvieron a un potencial de retención de 80 mV y despolarizaron por 200 mseg a 40 mV cada 30 seg. La Figura 2E muestra valores Kd para inhibición de Kv1.3 y Kv1.1 por análogos ShK. Kds para ShK-F6CA y ShK-Dap22con base en fuentes publicadas. La Figura 3A es una gráfica que muestra intensidades de tinción de CD45RA y CCR7 como se determina por citometría de flujo en la población con compuerta CD3+ de PBMCs humano teñido con anticuerpos contra CD3, CD45RA y CCR7. La Figura 3B es una gráfica que muestra intensidades de tinción de CD45RA y CCR7, como se determina por citometría de flujo en la población de compuertas CD3+ en células en una línea de TEM humano teñida con anticuerpos contra CD3, CD45RA y CCR7. La Figura 3C es una gráfica que muestra los efectos inhibitorios de ShK (gris oscuro) y ShK(L5) (gris claro) de [3H] timidina e incorporada por PBMCs (símbolos abiertos, una mezcla de células sin tratamiento previo/TCM) y células TEM (símbolos cerrados) estimuladas por 48 horas con anticuefo anti-CD3. La Figura 3D es una gráfica que muestra PBMCs humanos pre-activados (células sin tratamiento previo/TcM) que regulan en forma ascendente la expresión KCa3.1, se vuelven resistentes a inhibición ShK(L5) cuando se reactivan con anticuefo anti-CD3. Estas células previamente se han reportado que se vuelven sensibles al inhibidor específico de Kca3.1 TRAM-34. La Figura 4A es una gráfica que muestra tinción CD45RC de células T de bazo de rata (izquierdo) y células PAS T (derecha) detectadas por citometría de flujo. La Figura 4B es una gráfica que muestra las corrientes Kv1.3 exhibidas por células PAS T inactivas (superior) y activadas por antígeno de mielina (inferior). La Figura 4C proporciona una representación gráfica de perfiles de citometría de flujo tinción de ShK-F6CA en células PAS T inactivas (superior) y activadas por antígeno de mielina (inferior). Células no teñidas (líneas negras) y células teñidas con ShK-F6CA (área llena con gris claro). Competencia de tinción ShK-F6CA por ShK(L5) sin etiquetado se representa por un área llena con gris oscuro.
La Figura 4D muestra imágenes confocales de inmunotinción Kv1.3 en células PAS T inactivas (superior) y activadas por antígeno de mielina (inferior). Análisis estadístico se llevó a cabo utilizando la prueba-U Mann-Whitney. La Figura 4E muestra inhibición dependiente de dosis por ShK (líneas obscuras) y ShK(L5) (líneas claras) de incorporación de [3H] timidina por células de rata (izquierda) sin tratamiento previo (TCM) (símbolos abiertos) y (TEM) (símbolos cerrados) activadas con Con A (1 µ g/ml). La Figura 4F muestra inhibición dependiente de dosis por ShK (líneas obscuras) y ShK(L5) (líneas claras) de secreción IL2 por células PAS T, 7 horas después de estímulo con MBP. G, inhibición inducida por ShK(L5) de [3H] timidina disparada por antígeno de mielina incorporado por células PAS T (símbolos abiertos) se invierte por la adición de 20 µ /ml de IL2 (símbolos cerrados). La Figura 5A es una gráfica que muestra actividad de bloqueo Kv1.3 de ShK(L5), como se determina en canales Kv1.3 expresados en forma estable en células L929. La Figura 5B es una gráfica que muestra niveles de sangre de ShK(L5) en diversos tiempos después de una sola inyección subcutánea de 200 mg/kg de ShK(L5) en cuatro ratas. Se tomó sangre a los tiempos indicados y se probó en suero por registro electrofisiológico de fijación de voltaje para determinar la cantidad de ShK(L5). La Figura 5C es una gráfica de los datos de La Figura 5B adaptados a un solo deterioro exponencial indicando una vida media de aproximadamente 50 minutos. La Figura 5D es una gráfica que muestra niveles de sangre de ShK(L5) en cinco ratas Lewis que reciben inyecciones subcutáneas de un solo día de 10 g/kg/día ShK(L5) por 5 días. Se tomó sangre cada mañana (24 horas después de la inyección previa) y probó por actividad de bloqueo en canales Kv1.3 por registro electrofisiológico de fijación de voltaje. La Figura 5E es una gráfica que muestra niveles en suero de ShK(L5) en ratas, en diversos tiempos después de una sola dosis de 10 mg/kg de ShK(L5) ya sea en forma subcutánea (barras abiertas; n = 4) o intravenosamente (barras cerradas; n = 4). Se tomó sangre a los tiempos indicados y se probó suero por registro electrofisiológico de fijación de voltaje para determinar la cantidad de ShK(L5) en sangre. ShK(L5) mantiene un nivel de estado estable de 300 pM en la sangre casi 24 horas después de una sola inyección subcutánea. Esta concentración es suficiente para inhibir selectivamente la función de células TEM. La Figura 5F es una gráfica que muestra el % de recuperación de ShK(L5) después que una dosis de semi bloqueo de ShK(L5) se agrega a un plasma de rata o PBS que contiene 2% de plasma de rata e incuba a 37 grados C para una duración variante. Se tomaron alícuotas a los tiempos indicados y la actividad de bloqueo se determina en canales Kv1.3. ShK(L5) es extremadamente estable en plasma. La Figura 6A es una gráfica que muestra la prevención con puntaje de EAE. Células PAS T se activaron in vitro, lavaron, e inyectaron intraperitonealmente el día 0. Calificaciones entonces, calificación clínica de EAE: 0= sin signos clínicos, 0.5 = cola floja distal, 1 = cola floja, 2 = ligera paraparesis o ataxia, 3 = paraparesis moderada, 4 = parálisis de extremidad trasera completa, 5 = 4 + incontinencia, 6 = muerte. Ratas (n = 6/grupo) se inyectaron subcutáneamente con vehículo solo (n = 6) o ShK(L5) (n = 6; 10 mg/kg/día) del día 0 al día 5.
La Figura 6B es una gráfica que muestra el tratamiento calificado de EAE. Células PAS T se activaron in vitro, lavaron, e inyectaron intraperitonealmente el día 0. Tratamiento con ShK(L5) a 10mg/kg/día se inició cuando las ratas desarrollaron signos clínicos de EAE y se continuó por 3 días. La Figura 6C es una gráfica que muestra espesor de oreja como un indicador de reacción DTH producida contra albúmina en ratas. Animales (n = 6/grupo) se trataron con ShK(L5) 10 mg/kg/día por 2 días, después de lo cual se midió el hinchado de la oreja. Análisis estadístico se llevó a cabo utilizando ia prueba U Mann-Whitney. La Figura 7A muestra la estructura ShK(L5) y una gráfica que muestra inhibición de canales Kv1.3 en células TEM como una función de concentración de ShK(L5). Cada punto de datos representa promedio de tres determinaciones. La Figura 7B es un diagrama de complejo de señalización que contiene Kv1.3. La Figura 7C muestra co-localización de CD4, Kv1.3, Kv/i2, SAP97, ZIP y p56lck en lS. La Figura 7D muestra CD4 y tinción Kv1.3 en ausencia de contacto TEM-APC visible. La Figura 7E muestra CD4 y tinción Kv1.3 en células TEM específicas GAD65, expuestas a APCs cargados con MBP. La Figura 7F muestra que ShK(L5) 100 nM no evita la formación de IS. La Figura 7G muestra que ShK(L5) 100 nM no interrumpe el IS.
La Figura 8A es una gráfica que muestra la señalización de calcio en células TEM específicas de GAD de tres pacientes T1 DM activado por anticuerpos secundarios reticulados + anti-CD3 (flecha) en la ausencia (negro) o presencia de ShK(L5) 0.1 nM (gris oscuro), 1 nM (gris medio) o 100 nM (gris claro). La Figura 8B es una gráfica que muestra incorporación de [3H]-timidina por células sin tratamiento previo/TCM y TEM (izquierdo) y efectores sin tratamiento previo/TcM y efectores TE de pacientes con T1 DM y RA (derecha).
Células TEM: ciónos TEM activados por GAD65 de tres pacientes T1 DM y células SF- TEM activadas por anticuerpo anti-CD3 de tres pacientes RA. Células sin tratamiento previo/TcM: células sin tratamiento previo-PB/TCM activadas por anticuerpo anti-CD3 de los mismos tres pacientes de RA. La Figura 8C es una series de gráficas de barra que muestran producción de citoquina por las células TEM y sin tratamiento previo/TCM utilizadas en la Figura 8B. La Figura 8D muestra el fenotipo de células T auto reactivas relevantes de enfermedad e irrelevantes de enfermedad en MS, T1 DM y RA. La Figura 8E es un diagrama que muestra la forma en la cual ShK(L5) inhibe la señalización de calcio, proliferación de linfocitos y producción de citoquina pero no la formación de IS. La Figura 9 es un diagrama que representa un modelo de rata de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH = delayed type hypersensitivity) provocada por células T de memoria efectora. La Figura 10 es un diagrama que muestra un protocolo de tratamiento para ShK(L5) en un modelo de rata de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) provocado por células T de memoria efectora.
La Figura 11 es un diagrama que representa supresión específica de respuesta de memoria efectora in vivo en ratas por ShK(L5) sin deteriorar la función de células sin tratamiento previo y T en memoria central o células B. La Figura 12A muestra corrientes Kv1.3 (superior) y número de canal/célula (fondo) en célula T específicas de mielina e insulina, GAD65 de pacientes con diabetes mellitus tipo 1 de inicio nuevo (T1DM), controles de salud y pacientes con esclerosis múltiple. La Figura 12B muestra tinción de Kv1.3 (superior) e intensidad de fluorescencia de células T individuales (fondo) de estos pacientes. La Figura 12C muestra gráficas de número de células relativo contra intensidad de tinción CCR7. Células que expresan altos niveles de Kv1.3 son CCR7-negativas, es decir son efectoras TEM- Células que expresan bajos niveles de Kv1.3 son CCR7 positivas, es decir ya son células sin tratamiento previo o TCM- La Figura 12D muestra número Kv1.3/célula en células T auto reactivas de un paciente que tiene T1DM y MS (izquierdo), pacientes que tiene T1 DM por una duración mayor a 5 años (medio) y pacientes que no tienen DM de tipo 2 auto inmune. La Figura 12E muestra números Kvl .S en células T CD4+tetrámero+GAD65+ de un paciente con nuevo T1 DM de nuevo inicio. La Figura 13A muestra números de canales Kv1.3 por célula T periféricas de celina, células T de sangre y fluido sinovial de pacientes RA y células T de fluido sinovial de pacientes OA. La Figura 13B muestra imágenes confocales de Kv1.3 (de gris claro) y Kv ?2 (gris más oscuro) como tinción en células mostradas en la Figura 13A.
La Figura 13C muestra gráficas de número de células relativo contra intensidad de tinción CCR7. La Figura 13D muestra microfotografías (superior) y gráficas de barras de índice de inflamación (fondo) del sinovio de pacientes RA y OA teñido con anticuerpos anti-CD3 o anti-Kv1.3 y de contra tinción con hematoxilina/eosina (40X). DESCRIPCIÓN DETALLADA La siguiente descripción detallada y los dibujos acompañantes se pretende que describen algunos pero no necesariamente todos, los ejemplos o modalidades de la invención solamente. Esta descripción detallada y los dibujos acompañantes, no limitan el alcance de la invención en forma alguna. La presente invención proporciona análogos novedosos de ShK, métodos para hacer estas composiciones y métodos para utilizar dichas composiciones para inhibir canales Kv1.3 (u otros canales de ¡ones) en células de humanos o animales y para tratamiento o prevención de enfermedades o desordenes, tales como desordenes auto inmunes mediados por células T. Las composiciones de la presente invención comprenden toxina ShK conectada (por ejemplo, ligada, unida por enlazador o de otra forma asociada con) una entidad química de carga aniónica orgánico o inorgánico, (por ejemplos un átomo, molécula, grupo, residuo, compuesto, porción, etcétera). En cuando menos algunas modalidades de la invención, la entidad química de carga aniónica, orgánica o inorgánica, puede seleccionarse para aumentar u optimizar la afinidad de la composición para inhibición de canales Kv1.3 sobre canales Kv1.1. Ejemplos de moléculas o grupos de carga aniónica orgánicos o inorgánicos, que pueden enlazarse o ligarse a ShK de acuerdo con la presente invención, incluyen pero no necesariamente están limitados a: amino ácidos; polipéptidos; residuos amino ácido; residuos amino ácido no naturales; treonina; derivados de treonina; fosfo-treonina; serina; derivados serina; fosfo-serina; ácido glutámico; derivados de ácido glutámico; ácido gamma-carboxi-glutámico; ácido aspártico; derivados de ácido aspártico; compuestos o grupos inorgánicos; compuestos o grupos orgánicos; anhídrido succínico; y anhídrido ftálico. De acuerdo con la presente invención, algunos ejemplos no limitantes de composiciones de la presente invención, en donde la identidad química de carga aniónica comprende un residuo amino ácido, se ilustra en las figuras 1 y 2C y refieren aquí por designaciones alfanuméricas, como se ilustra en la Tabla 1 siguiente: Tabla 1 Con referencia específica a la Figura 1 , tirosina o fenilalanina o sus derivados no naturales cargados se conjugaron a ShK (izquierda superior) a través de un enlazador conectado en su extremo N (residuo Arg1 mostrado en gris sombreado). El Lys22, que se requiere para bloqueo de canal, se ilustra en un tono más oscuro de gris. El modelo molecular de ShK se basa en la estructura de RMN publicada y las estructuras del enlazador y los nuevos residuos se modelaron. Estas modalidades de composiciones de la presente invención generalmente comprende la toxina ShK, que es un polipéptido, ligado a (por ejemplo, ligado químicamente, enlazado o de otra forma asociado con) al menos un residuo amino ácido de carga aniónica. En modalidades en donde el residuo amino ácido tiene un centro quiral, el enantiómero D y/o L de este residuo amino ácido puede emplearse. El residuo amino ácido de carga aniónica puede ser un residuo no natural y puede conectarse o enlazarse a un extremo N del polipéptido ShK. En algunas modalidades, el residuo amino ácido de carga aniónica puede enlazarse a un extremo N de ShK a través de un enlazador, tal como un enlazador aminoetiloxietiloxi-acetilo. Estos análogos de ShK inhiben el canal Kv1.3 más específicamente que ShK debido a que tienen afinidad reducida para otros canales de potasio (por ejemplo, Kv1.1). El ShK puede aislarse de fuentes naturales como se conoce en la técnica, o puede ser sintetizado. Síntesis de Toxina ShK La Toxina ShK puede sintetizarse por cualquier método conveniente. En dicho método, Fmoc-amino ácidos (Bachem Feinchemikalien) incluyendo Arg(Pmc), Asp(OtBu), Cys(Trt), G?n(Trt), His(Trt), Lys(Boc), Ser(tBu) y Thr(tBu) se obtienen comercialmente y ensamblan para formar la Toxina ShK. Un ensamblado por pasos de los amino ácidos, puede llevarse a cabo en un sintetizador de péptidos Applied Biosystems 431 A, a la escala a 0.25 mmol partiendo con Fmoc-Cys(Trt)-R. Los residuos 34 a 22 son de acoplado sencillo. Posteriormente, una alíquota (por ejemplo la mitad) de la resina se retira para lograr un mejor mezclado. El resto de secuencia péptido es doblemente acoplado a la alíquota de resina restante. Todos los acoplamientos son mediados por diciclohexilcarbodiimida en la presencia de 2 eq de 1 -hidroxibenzotriazol. Los dos residuos finales también se acoplan mediante química HBTU/DIEA. Estos residuos son (Fmoc-ácido aminoetiloxietiloxiacético) y como el residuo N-terminal Fmoc-Tyr (PO4) monobenzil éter. Después de la eliminación final del grupo Fmoc, la resina péptído (2.42 g) se escinde de la resina y desprotege simultáneamente utilizando reactivo K por dos horas a temperatura ambiente. El reactivo K se conoce en la técnica y ha sido descrito en la literatura. Ver, King, D.S., Fields, CG. and Fields, G.B. (1990) Int. J. Peptide Protein Res. 36, 255-266. Después de escisión, el péptido se filtra para retirar las perlas de resina agotadas y precipita con dietil éter enfriado por hielo. El péptido después se recolecta en un embudo de filtro fino, lava con éter enfriado por hielo y finalmente extrae con AcOH al 20 por ciento en H2O. El extracto de péptido subsecuentemente se diluye en dos litros de H2O, el pH se ajusta a 8.0 con NH OH y deja que oxide al aire a temperatura ambiente por 36 horas. Después de oxidación de los enlaces disulfuro con una proporción 2:1 de glutationa reducida a oxidada, la solución de péptido se acidifica a pH 2.5 y bombea sobre una columna Rainin Dynamax Cis (5.0 x 30 cm). La muestra se eluye con un gradiente lineal de 5-30 por ciento de acetonitrilo en H2O que contiene TFA 0.1 por ciento. Las fracciones resultantes se analizan utilizando dos sistemas RP-HPLC analíticos: TFA y TEAP. Fracciones puras se recolectan y liofilizan. (Ver, Pennington, M.W., Byrnes, M. E., Zaydenberg, I., Khaytin, I., de Chastonay, J., Krafte, D., Hill, R., Mahnir, V., Volberg, W.A., Gorczyca, W. and Kern, W.R. (1995) Int. J. Peptide Protein Res. 46, 354-358.) En forma alterna, síntesis de péptidos de fase sólida que emplea una estrategia de grupo protector Boc-Bzl puede utilizarse para ensamblar la estructura primaria, así como análogos del péptido. El péptido puede ser entonces escindido de la fase sólida por HF anhidro, dando por resultado el péptido lineal listo para pegar como se describió anteriormente para el péptido sintetizado Fmoc. (Ver, Stewart, J. M. and Young J. D. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis. 2nd Edition.
Pierce Chemical Company. Rockford, II.) En forma alterna, otros métodos de síntesis para ensamblar la estructura primaria de ShK o análogos pueden incluir técnica de ligación química en donde el péptido se prepara como una serie de fragmentos designados con péptidos tioéster C-terminales. El péptido tioéster puede reaccionar con otro péptido que contiene un residuo Cys N-terminal, para formar un péptido que contiene un enlace péptido nativo. Al utilizar esa tecnología, se puede ensamblar efectivamente la estructura primaria de ShK. (Ver, (4) Wiiken, J. and Kent S.B.H. (1998) Chemical protein synthesis. Current Opin. Biotech. 9, 412-426.) En forma alterna, otro método sintético que puede emplearse para ensamblar la estructura primaria de ShK será utilizar un enfoque convergente de fragmento péptido protegido, como se describe en Albericio, F., Lloyd-Williams, P., and Giralt, E. (1997) Convergent peptide synthesis; ¡n Methods in Enzymol. Ed G. Fields, Academic Press, New York, NY. pp 313-335. En este método, fragmentos protegidos lineales se ensamblan como fragmentos de protección de cadena lateral completa. Estos fragmentos pueden entonces acoplarse en conjunto en una forma convergente para ensamblar la secuencia primaria de ShK o uno de sus análogos. El ensamblado de los fragmentos puede también utilizar una resina de fase sólida para facilitar las etapas de acoplamiento y lavado. En forma alterna, métodos recombinantes pueden emplearse en donde la secuencia de codificación cDNA para ShK pueden generarse para expresión ya sea en un sistema de expresión procariótico o eucariótico. Análogos ShK recombinantes que contienen amino ácidos no naturales son también posibles al utilizar moléculas tRNA precargadas que utilizan codones no estándar. La construcción cCNA puede ser de ingeniería para utilizar uno de estos codones no usados. Para agregar el residuo fosfotirosina así como el residuo Aeea. El plegado de análogos ShK producido en forma recombinante puede entonces lograrse en un método similar al utilizado para los péptidos sintéticos. (Ver, Pennington, M.W., Byrnes, M. E., Zaydenberg, I., Khaytin, L1 de Chastonay, J., Krafts, D., Hill, R., Mahnir, V., Volberg, W.A., Gorczyca, W. and Kern, W.R. (1995) Int. J. Peptide Protein Res. 46, 354- 358.) Conexión de Residuos Amino Ácido Aniónicos con ShK y modificaciones opcionales a ShK Residuos amino ácidos aniónicos pueden conectarse al extremo N de Toxina ShK natural o sintética mediante un enlazador, tal como un enlazador amino etil oxietiloxiacetilo o por cualquier otro medio conveniente. En este ejemplo, se preparan los nueve (9) análogos ShK mostrados en la Figura 1. Inicialmente, Fmoc-Aeea-OH se acopla al extremo N de Toxina ShK sintética ensamblada como se describió anteriormente. La resina entonces se divide en 9 alícuotas. Ya sea Fmoc- Tyr(PO4Bzl)- OH, Fmoc-d-Tyr(PO4Bzl)-OH, Fmoc-Tyr(PO4Me2)-OH, Fmoc-Pmp-OH, Fmoc- d-Pmp-OH, Fmoc-Pmp(Et)-OH, Fmoc-Pmp(Et)2-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, o Fmoc-Amp(Boc)-OH se acoplan utilizando DIC y HOBT con una de las aliquotas de resina. La resina péptido desbloqueada entonces se escinde y desprotege con reactivo (King et al., 1990) que contiene triisopropílsilano al 5 por ciento por 2 horas a RT. Met(O) se reduce por adición de NH4I sólido al cóctel de escisión a t-15 min. (Nicolás et al., 1995). Para el péptido que contiene Tyr(PO Me2)-OH, un cóctel de escisión que contiene TMSBr 1 m en TFA que contiene tioanisol con un depurador por 18 hras a 4 grados C se utiliza (Tian et al., 1993). Remoción incompleta de los grupos protectores metilo es común cuando se utiliza este método y dos de las especies (Tyr(PO ) y Tyr(PO4Me)) se purifican fácilmente por RP-HPLC. El análogo que contiene Tyr(PO4Me2) se escinde mediante escisión de reactivo K estándar manteniendo ambos grupos Me intactos. En cada caso, la mezcla de escisión se filtra y el péptido crudo se precipita en dietil éter enfriado por hielo. El precipitado se recolecta, dando aproximadamente 75 mg de péptido de 200 mg de resina. El producto crudo se disuelve en 20 ml de AcOH al 50 por ciento y diluye en 0J5 I de H2O. El pH de la solución se ajusta con NH OH a 8.2, y se dejó que plegara durante la noche con la adición de glutationa (2mM:1mM) (reducido:oxidado). Todos los análogos se purifican utilizando RP-HPLC como se describió previamente (Pennington et al., 1995; Pennington et al., 1996a; Pennington et al., 1996b).
Fracciones puras se recolectan y liofilizan. Cada muestra se confirma por RP-HPLC, AAA y MALDI-TOF MS y ajusta para tomar en cuenta el contenido de péptido antes de bioensayo. En algunas modalidades de la invención, para mejorar las propiedades PK PD de la estructura en ShK, residuos que son sensibles a propiedades de degradación pueden reemplazarse o substituirse. De esta manera, la substitución del residuo Met en la posición 21 puede llevarse a cabo para impartir un efecto estabilizante a oxidación. Adicionalmente, substitución de la función ácido C-terminal con una amida, impartirá estabilidad a las enzimas carboxipeptidasa C-terminal. Estas dos sustituciones a le estructura primaria de ShK combinadas con la porción aniónica en el extremo N se han sintetizado para generar bloqueador cable 1.3 más estable y selectivo. Sustituciones fosfato no hidrolizables también impartirán un efecto estabilizante contra hidrólisis acida y básica del fosfato así como estabilidad contra enzimas fosfatasa. Las sustituciones se resumen a continuación. Los acrónimos empleados se definen como sigue: Pmp=p-fosfonometil- Fenilalanina; Ppa=p-Fosfatidil- Fenilalanina y Nle=Norleucina. Substituciones: p-fosfo-Tyr-Aeea-ShK-Nle21 -Cys35-amida p-Fosfono-metil-Fenilalanina-Aeea-ShK-Nle21- Cys35amida (Pmp) p-Fosfatitil-Fe-Aeea-ShK-Nle21 -Cys35-amida (Ppa) p-fosfo-Tyr-Aeea-ShK-Nle21 -Cys35-p- Fosfono-metil- Fenilalanina-Aeea-ShK-Nle21- Cys35-ácido (Pmp) p-Fosfatitil-Fe-Aeea-ShK-Nle21 -Cys35-ácido (Ppa) Además de Pmp y Ppa no hidrolizables, la subtitución de p- Fosfono(difluoro-metil)-Fenilalanina (Pfp) y p-Fosfono-metílketo-Fenilalanina (Pkp) también son substituciones aniónicas con la siguiente condición: Pfp-Aeea-Shk-NIe21 Cys35 amida Pkp-Aeea-ShK-amida Nle21-Cys35 ácido Pfp-Aeea-Shk-Nle21 Cys35 ácido. Estructuras de las substituciones N-terminales se establecen en el Apéndice B. Otras estructuras que están dentro del alcance de la presente invención se publican en Beeton, C. et al., Targeting Effector Memory T Cells with a Selective Peptide Inhibitor ofKv1.3 Channels for Therapy of Autoimmune Diseases, Molecular Farmacology, Vol. 67, No.4, 1369- (2005), la totalidad de lo cual aquí se incorpora expresamente por referencia y una copia completa de lo cual se agrega aquí como Apéndice O Usos Terapéuticos de Análogos ShK de la Presente Invención La presente invención proporciona métodos para tratar o evitar ciertos desórdenes o enfermedades tales como desórdenes mediados por células T (por ejemplo desórdenes autoinmunes, enfermedad de injerto contra anfitrión, prevención de rechazo de trasplantes de órganos etc.), otros desórdenes inflamatorios, obesidad y diabetes tipo II en sujetos humanos o animales al administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva (por ejemplo preventiva o efectiva para reducir o eliminar síntomas o avance de enfermedad) de una preparación farmacéuticamente aceptable que consiste o comprende de un análogo ShK de la presente invención (por ejemplo incluyendo pero no limitado a aquellos citados en la tabla 1 previamente). Cualquier ruta conveniente de administración (por ejemplo oral, rectal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intranasal, tópica, transmucosal, transdérmica, por implante de suministro de droga, etc.) podrá ser empleada. Cuando se utiliza para evitar o tratar un desorden mediado por células T, la o las dosis serán suficientes para inhibir canales Kv1.3 en membranas de células T. En este aspecto, los análogos ShK de la presente invención tienen el potencial para utilizarse para evitar o tratar una amplia variedad de desórdenes autoinmunes mediados por célula T. Los siguientes son algunos ejemplos de algunas enfermedades autoinmunes mediadas por células T que pueden evitarse o tratarse por los métodos de la presente invenció, categorizados con respecto al órgano objetivo que se afecta principalmente por cada una de esas enfermedades: Sistema Nervioso: Tracto Gastrointestinal: Esclerosis Múltiple Enfermedad de Crohn Myasthenia gravis Colitis ulcerativa Neuropatías autoinmunes Cirrosis biliar primaria tales como Guillain-Barré Hepatitis autoimmune Uveitis autoinmune Resorción de huesos asociada con enfermedad periodontal Sangre: Endocrino: anemia hemolítica autoimmune Diabetes mellitus Tipo 1 Enfermedad de Anemia perniciosa Addison Trombocitopenia autoimmune Enfermedad de Grave tiroiditis de Hashimoto ooforitis autoimmune y orquitis Vascular: Arteritis temporal Síndrome Anti-fosfolípidos Vasculítis tal como Granulomatosis de Wegener Enfermedad de Behcet Múltiples Órganos y/o Sistema Músculo- Esquelético: Artritis reumatoide (RA) Osteoartritis (OA) Lupus sistémico eritematoso Piel: escleroderma, Soriasis Polimiositis, dermatomiositis Dermatitis herpetiformis espondiloartropatías tales como Pemfigus vulgaris espondilitis anquilosante Vitíligo Síndrome de Sjogren Independientemente del o los órganos particulares afectados, linfocitos T se considera que contribuyen al desarrollo de enfermedades autoinmunes. Las terapias actualmente disponibles para estas enfermedades son substancialmente insatisfactorias y típicamente involucran el uso de glucocorticoides (por ejemplo metilprednisolona, prednisona), agentes anti-inflamatorios no esteroideales, sales de oro, metotrexato, antimalarios, y otros inmunosupresores tales como ciclosporina y FK- 506. También, otro desorden mediado por células T que puede evitarse o tratarse por los métodos de la presente invención, esa enfermedad de injerto contra anfitrión y/o rechazo de órganos trasplantados. Sin duda, los resultados de los procedimientos de trasplante de órganos han mejorado progresivamente con el desarrollo de refinamiento en tipado de tejido, técnicas quirúrgicas y tratamientos inmunosupresores más efectivos. Sin embargo, el rechazo de órganos trasplantados permanece como un problema principal. Los linfocitos T juegan un papel central en la inmunorespuesta y son responsables en una gran medida por el rechazo de muchos órganos trasplantados. También son responsables por la enfermedad así denominada injerto-contra-anfitrión en donde células de médula ósea trasplantadas, reconocen y destruyen tejidos anfitrión no igualados no apareados MHC. De acuerdo con esto, drogas tales como ciclosporína y FK506 que suprimen la inmunidad de células T se utilizan para evitar rechazo de trasplante y enfermedad de injerto-contra-anfitrión. Desafortunadamente, estas drogas inhibitorias de células T son tóxicas, con toxicidades de hígado y renales que limitan su uso. De esta manera, los métodos de la presente invención pueden proporcionar alternativas menos tóxicas para el tratamiento o prevención de enfermedad de injerto contra anfitrión o rechazo de trasplante. También, inhibidores de canal de potasio Kv1.3 de compuerta de voltaje se han mostrado que son especialmente efectivos para suprimir células T de memoria efectuada, y de esa manera, los métodos de la presente invención pueden ser particularmente efectivos para evitar o tratar enfermedades que se asocian con células T de memoria efectora tales como: resorción de hueso y enfermedad periodontal, psoriasis, artritis reumatoide, diabetes mellitus y esclerosis múltiples. Además de enfermedades mediadas por células T, el canal Kv1.3 se ha determinado que regula la homeostásis de energía, peso corporal y sensibilidad a insulina periférica. De esta manera, los métodos de la presente invención pueden utilizarse para tratar otras enfermedades y desórdenes que involucran homeostasis anormal, peso corporal y sensibilidad de insulina periférica al inhibir canales Kv1.3 en membranas celulares, estas otras enfermedades y desórdenes incluyen pero no están limitados necesariamente a resorción de huesos en enfermedad periodontal, diabetes tipo 2, síndrome metabólico y obesidad. Uso de Análogos ShK de la Presente Invención en Citometría de Flujo Además, de acuerdo con la presente invención, se proporcionan métodos para diagnosticar desórdenes derivados por célula T o de otra forma clasificado a distinguir entre diversos tipos de células in vitro utilizando versiones etiquetadas con fluoróforo de ShK(L5) para utilizar solo en citometría de flujo, o en conjunto con tetrámeros clase II que pueden ser células autoreactivas detectadas. Citometría de flujo es un método flexible para caracterizar células en suspensión en donde se utiliza clasificación de células activada por fluorescencia para seleccionar células vivas en base a las características medidas por citometría de flujo. Los tipos de características y funciones celulares que puedan detectarse por citometría de flujo incluyen la expresión de proteínas fuera y dentro de las células, tipo y contenido de DNA, viabilidad y apoptosis, actividad de bomba de resistencia a múltiples drogas, actividad enzimática, activación de célula extrema T, especificidad de receptor de células T, expresión de citoquina, fagocitosis y actividad de ráfaga oxidativa. De esta manera, en este método de la presente invención, el residuo amino ácido conectado al ShK puede incorporar una etiqueta de fluoróforo para utilizar en citometría de flujo solo o en conjunto con tetrámero clase II cargados con auto antígenos específicos que pueden detectar células autoreactivas. Descripciones específicas de los métodos por los cuales esta citometría de flujo puede llevarse a cabo, se describen en Beeton, C1 et al., A Novel Fluorescent Toxin to Detect y Investígate Kvl.3 Channel Up-Regulation in Chronically Activated T Lymhocytes; J. Biol. Chem., Vol. 278, No. 11 , 9928-9937 (marzo 2003). En general, un citómetro de flujo utiliza luz láser enfocada para iluminar células conforme pasan el haz láser en una corriente fluida. La luz dispersa por las células y la luz emitida por colorantes fluorescentes conectados a las células de interés, se analiza por varios detectores y procesan por una computadora. Las células pueden ser distinguidas y seleccionadas con base a tamaño y forma, así como por la presencia de muchas moléculas diferentes dentro y en la superficie de las células. Ejemplos de Efectos Inhibitorios de Canal de Potasio y Utilidad Terapéutica de Análogos ShK de la Presente Invención ShK bloquea el Kv1.1 y el canal Kv1.3 con potencia aproximadamente equivalente. La neurotoxicidad por lo tanto es una consideración bajo circunstancias que compromete la barrera-sangre-cerebro y permiten la entrada de cantidades suficientes de ShK para bloquear los canales Kv1.1. Nuestra estrategia para diseñar un inhibidor específico de Kv1.3 fue guiada por nuestro hallazgo de que fluoresceína-6-carboxilato (F6CA) que contiene ShK-F6CA se conecta a través de un enlazador Aeea de 20 A de largo al extremo N de ShK exhibió 80 veces de selectividad para Kv1.3 sobre Kv1.1 (Beeton et al., 2003). Ya que F6CA puede existir como un carboxilato restringido o también como una lactona ciclizada, no fue claro si la especificidad a Kv1.3 de ShK-F6CA se debió a la carga negativa de F6CA, ia hidrofobicidad creada por este núcleo de fluoresceína voluminoso grande, el apilamiento electrónico p-planar potencial o una combinación de todas estas contribuciones potenciales. Para distinguir entre estas posibilidades y con la intención de desarrollar un inhibidro selectivo Kv1.3 no fluorescente, generamos una serie de 12 análogos ShK N-terminalmente substituidos para sondear algunas de estas interacciones. Al conectar tirosina, fenilalanina o sus derivados (variar en carga, tamaño e hidrofobicidad) a través de un enlazador Aeea al extremo N de ShK, pudimos sondear los efectos de carga e hidrofobicidad para lograr perfección dentro de nuestra mejora selectiva vista con substitución F6CA. Inhibición Kv/v1.3 Selectiva Sobre Inhibición Kv1.1: En el ejemplo mostrado en las Figuras 2A-2D, L-fosfotirosina (L-pTyr), un aminoácido aromático modificado post-traducción, de carga negativa (carga neta 2), se conecta mediante el enlazador AEEA a ShK-Arg1 para generar el análogo novedoso ShK(LS). La toxina ShK y Shk (L5) se probaron en los canales Kv1.3 y Kv1.1 en forma estable expresada en células L929. La Figura 2B muestra los efectos de ShK y ShK(L5) en corrientes Kv1.3 y Kv1.1 producidas por pulsos despolarizantes de 200 ms de un potencial de retención de 80 mV a 40 mV. Ambos péptidos bloquean de forma reversible Kv1.3 y Kv1.1 en una forma dependiente de dosis con coeficientes Hill de 1. KaS se determino de las curvas de dosis-respuestas mostradas utilizando el soporte lógico Microcal Origin. ShK bloqueó Kv1.3 (Kd = 10 ± 1 pM) y Kv1.1 (Kd = 28 ± 6 pM) con potencia aproximadamente equivalente como se esperaba (Figura 1C). En contraste ShK(L5) fue 100 veces selectivo para Kv1.3 (Kd = 69 ± 5 pM) sobre KvH (Kd = 7.4 ± 0.8 nM) (Figuras 1B, 1C). En el curso de tiempo de bloqueo de corriente Kv 1.3 por ShK(L5) y su limpieza se ilustra en la Figura 1D. La constante de tiempo (TON) de ShK(L5) arrastre de ingreso fue 131 ± 21 seg (n = 7) mientras que la constante de tiempo (TOFF) para el arrastre de salida de péptido fue 150 ± 28 seg (n = 4). La Kd (57 ± 7 pM) calculada a partir de los valores K0N (15 x 106 ± 0.5 x 106 M"1seg"1) y KOFF (0.0059 ± 0.0013 sec 1) es consistente con la Kd (69 ± 5 pM) determinada con el soporte lógico Microcal Origin. Otros análogos ShK también se probaron en canales Kv1.3 y KvH. ShK(DS) que contiene D-fosfotirosina (D-pTyr) fue 35 veces selectivo para Kv1.3 sobre KvH pero fue un orden de magnitud menos potente que ShK(L5). ShK(L6) que contiene L-pTyr-monometil mostró especificidad Kv1.3 modesta (11 veces) mientras que los análogos ShK que contienen L-pTyr-dimetil o L-Tyr no fueron selectivos para Kv1.3 sobre Kv1.1. Análogos que contienen fenilalanina o sus derivados (que varían en volumen, densidad de electrones p y carga) fueron modestamente no específicos para Kv1.3 sobre Kv1.1. La especificidad de 100 veces de ShK(L5) para Kv1.3 sobre Kv1.1 es mayor que ShK-F6CA (80 veces), ShK(D5) (35 veces), ShK-Dap22 (33 veces) o cualquier otro análogo ShK probado. Los solicitantes también estimaron especificidad de ShK(L5) en un panel de 20 canales de iones y estos datos se resumen en la siguiente Tabla 2: Canales Kd de ShK(L5) [pM] Kvl.l 7,000 ± 1 ,000 Kvl.2 48,000 ± 7,000 Kvl.3 (clonado) 69 ± 5 Kvl.3 (sin tratamiento previo) 76 ± 8 Kvl.4 137,000* 3,000 Kvl.5 100,000 sin efecto Kvl.6 18,000 ± 3,000 Kvl.7 100,000 sin efecto Kv2.1 100,000 sin efecto Kv3.1 100,000 sin efecto Kv3.2 20,000 ± 2,000 Kir2.1 100,000 sin efecto Kvll.l (HERG) 100,000 sin efecto Kca-1 -1 100,000 sin efecto KCa2.1 100,000 sin efecto KCa2.3 100,000 sin efecto KCa3.i 115,000 ± 5,000 Navl.2 100,000 sin efecto Navl.4 100,000 sin efecto canal CT de Célula T activadoOOOOOO por hinchado 100,000 sin efecto Cavl.2 100,000 sin efecto Como puede apreciarse de los datos de la Tabla 2 anterior ShK(L5) bloqueó el canal Kv1.3 en células T con una Kd (76 pM) equivalente a su Kd en el canal clonado (69 pM). Fue 100 veces selectiva para Kv1.3 sobre Kv1.1, 260 veces selectiva sobre Kv1.6, 280 veces selectiva sobre Kv3.2, 680 veces selectivas sobre Kv1.2 y >1000 veces selectiva sobre todos los otros canales probados. De manera importante, fue 1600 veces selectiva para Kv1.3 sobre KCa3.1, el canal K+ activado con calcio, que regula la activación de las células sin tratamiento previo y TCM humanas (Wulff et al., 2003). ShK nativo fue menos selectivo que ShK(L5). ShK fue 2.8 veces selectivo para Kv1.3 (Kd = 10 ± 1 pM) sobre Kv11 (Kd 28 ± 6 pM), 20 veces selectivo sobre Kv1.6 (200 ± 20 pM), 500 veces selectivo sobre Kv3.2 (Kd = 5,000 ± 1,000 pM), y >1000 veces selectivo sobre Kv1.2 (10 ± 1 nM) y KCa3.1 (Kd = 28 ± 3 nM). Margatoxin, un péptido de veneno de escorpión que se ha reportado como un inhibidor Kv1.3 específico (Koo et al., 1997; Lin et al., 1993; Middieton et al., 2003) tampoco fue específica. Fue 5 veces selectiva para Kv1.3 (110 ± 12 pM) sobre Kv1.2 {Kd =520 ± 1 pM), 9 veces selectiva sobre Kv1.1 (10 ± 1 nM) y > 1000 veces selectiva sobre Kv1.6 y Kv3.2 (Ka > 100 nM). Luteolina, un nutracéutico vendido para enfermedades autoinmunes (www.lutimax.com) en base a que es un inhibidor Kv1.3 (Lahey and Rajadhyaksha, 2004), bloqueó Kv1.3 débilmente (Kd = 65 ± 5 mM) y no exhibió selectividad sobre Kv1.1 (Kd=77± 5mM), Kv1.2 (Kd = 63 ± 4 mM) o Kv1.5 (Kd= 41 ± 3 mM). La especificidad exquisita de ShK(L5) para Kv1.3 junto con su afinidad picomolar para el canal, lo hace un ¡nmunosupresor potencialmente atractivo. Supresión Preferencial de Proliferación de células TPM Humanas Con referencia a las Figuras 3A-3D, a fin de estimar actividad inmunosupresiva in vitro de ShK(L5), los solicitantes compararon su capacidad para suprimir proliferación estimulada por anticuerpo anti-CD3 de líneas de células TCM humanas contra PBMCs humanas que contienen una mezcla de células sin tratamiento previo y TCM. La citometría de flujo confirmó los fenotipos de superficie celular de las dos poblaciones estudiadas. Como se ve en la Figura 3A, las líneas TEM fueron >90% CCR7OD45RA, mientras que como se ilustra en la Figura 3B los PBMCs que contienen 65% de CCR7+CD45RA+ (sin tratamiento previo) y 18% CCR7+CD45RA" (células TCM)- La Figura 3C muestra que ShK(L5) y ShK fueron 60 veces más efectivos para suprimir la proliferación de células TEM (IC50 = ~80 pM) en comparación con PBMCs (IC50 = 5 nM, p < 0.05). La menor sensibilidad de PBMCs puede explicarse por una regulación ascendente rápida de los canales KCa3.1 en células sin tratamiento previo y TCM ante estímulo como se ha reportado previamente (Ghanshani et al., 2000; Wulff et al., 2003). Siguiendo con esta interpretación, PBMCs activado por 48 horas para regular en forma ascendente la expresión KCa3.1, luego reposó por 12 horas, y reactivo con anticuerpo anti-CD3 fueron completamente resistentes a bloqueo ShK(L5), como se muestra en la hilera superior de la Figura 3D. PBMCs que han sido suprimido por ShK(L5) durante la primer ronda de estímulo exhiben resistencia idéntica a ShK(L5) cuando las células se lavaron, reposaron y volvieron a probar con anticuerpo anti-CD3. Estos resultados corroboraron estudios previos que indican que las células sin tratamiento previo y TCM escaparon inhibidores Kv1.3 por al regular en forma ascendente los canales KCa3.1. De esta manera ShK(L5) en forma preferencial y persistente suprime la proliferación de células TEM. Supresión Preferencial de Proliferación de Células TPMde Rata Como un preámbulo para evaluar la efectividad terapéutica de ShK(L5) examinamos su capacidad para suprimir proliferación de línea celular T de memoria PAS, que provoca una enfermedad tipo MS en ratas. Como un control, los solicitantes utilizaron células T de bazo de rata. Para confirmar el estado de diferenciación de las dos proliferaciones celulares, estimamos la expresión de CD45RC, un marcador de células T sin tratamiento previo (Bunce and Bell, 1997). Células T de bazo de rata fueron 76% CD45RC+ (es decir primordialmente células sin tratamiento previo) mientras que células PAS fueron CD45RC" que sugieren que son células de memoria, como se muestra en la Figura 4. Para determinar si células PAS están en el estado TEM O el estado TCM examinamos la expresión de Kv1.3 antes y 48 horas después de activación. Células TEM pero no TCM se espera que regulen en forma ascendente significativa niveles de Kv1.3 ante estímulo. Con referencia a la Figura 4B, experimento de registro electrofisiológico de fijación de voltaje, revelaron un incremento marcado en amplitud de corriente Kv1.3 después de estímulo MBP de células PAS consistente con ser células TEM- Como una medida independiente del número de canales Kv1.3 en células PAS utilizamos ShK-F6CA, un análogo ShK etiquetado en forma fluorescente que previamente se ha reportado que liga específicamente a Kv1.3. La intensidad de tinción ShK-F6CA determinada por citometría de flujo refleja el número de tetrámeros Kv1.3 expresados en la superficie celular. Como se ve en la Figura 4C, la intensidad de tinción de ShK-F6CA (10 nM) aumentó con activación en MBP de células PAS y un exceso de ShK(L5) no etiquetado (100 nM), inhibió en forma competitiva la tinción ShK-F6CA. Como una prueba final, los solicitantes realizaron microscopía confocal en células inactivas PAS y estimuladas con MBP, que se han fijado y teñido con anticuerpo específico Kv1.3. Siguiendo con los datos en las Figuras 4B y 4C, las células PAS T en reposo, tuvieron una intensidad de tinción de Kv1.3 de 4.4 ± 0.6 y este valor aumentó a 10.6 ± 2.3 (p < 0.005) después de activación inducida por antígeno (ver Figura 4D) mostrando aumento en expresión de proteína Kv1.3 después de activación. De esta manera, células PAS activadas con MBP son células TEM Kv1.3alt0 (CD45RC"), mientras que células T de bazo de rata empleadas en nuestros experimentos están predominantemente en el estado nativo. La proliferación activada por MBP de células PAS se suprimió aproximadamente 1000 veces más efectivamente por ShK(L5) y ShK (IC50 = -80 pM) que la proliferación inducida por mitógeno de células T de bazo de rata (ver Figura 4E, IC5O "100 nM; p < 0.05). Estos resultados corroboran los hallazgos con células T humanas descritas anteriormente. Como se ve en la Figura 4 GShK(L5) inhibe la producción de IL2 inducida por MBP por células PAS (Figura 4F), e IL2 exógeno parcialmente superó la expresión ShK(L5) de proliferación de células PAS estudios previos (Figura 4G). Estudios previos reportaron hallazgos similares con inhibidores Kv1.3 menos específicos en células T humanas de rata y de mini-cerdo. En resumen, ShK(L5) es un inhibidor poderoso y selectivo de células TEM de humanos y ratas y pueden por lo tanto tener uso terapéutico en enfermedades autoinmunes al hacer blanco preferencialmente en células TEM que contribuyen a la patogénesis de estos desórdenes. Vida Media y Estabilidad en Circulación Un bioensayo de registro electrofisiológico de fijación de voltaje se utiliza para evaluar si los niveles de circulación de ShK(L5) siguiendo la inyección subcutánea, fueron suficientes para inhibir células TEM- Los resultados de estos experimentos se ilustran en las Figuras 5A-5F. Muestras de suero de ratas de control y tratadas con ShK(L5) se probaron para actividad de bloqueo en canales Kv1.3. Suero de control no exhibe actividad de bloqueo detectable indicando una ausencia de bloqueador de canal endógeno. Para estandarizar el ensayo, cantidades conocidas de ShK(L5) se agregaron a suero de rata y estas muestras se probaron en canales Kv1.3. Las muestras de suero espigadas bloquearon corrientes Kv1.3 en una forma dependiente de dosis (Kd 77 ± 9 pM) fue indistinguible del efecto ShK(L5) en la ausencia del suero (Fig. 4A). Niveles de ShK(L5) en animales tratados, se determinaron por comparación con la curva estándar. ShK(L5) fue detectable en su suero 5 minutos después de una sola inyección subcutánea de 200 mg/kg. Niveles pico (12 nM) se alcanzaron en 30 minutos y el nivel luego bajó a una línea base de aproximadamente 300 pM durante 420 minutos. La desaparición de ShK(L5) de la sangre pudo adaptarse por un solo exponencial. La vida media en circulación se estimó como de aproximadamente 50 minutos. Ya que el nivel pico en suero después de 200 mg/kg (12 nM) excede significativamente el requerimiento para bloqueo selectivo de canales Kv1.3 y función de células TEM. probamos dosis menores. Después de una sola inyección de 10 mg/kg la concentración pico en suero de ShK(L5) alcanzó "500 pM dentro de 30 minutos (datos no mostrados), una concentración suficiente para bloquear >90% Kv1.3 pero no afectó KV1.1. Una administración diaria repetida de esta dosis (10mg/kg/día) resultó en niveles de estado estable de ~300 pM (medido 24 horas después de inyección, Figura 5D), que es suficiente para provocar 60-70% supresión de células TEM con poco efecto en células sin tratamiento previo/TcM- El nivel de "estado estable" es inesperado dado la vida media en circulacón estimada de ~50 min e indica que ShK(L5) se "acumula" en administración repetida. Para determinar si el "depósito" estaba en la piel o en otra parte en el cuerpo medimos niveles en la sangre de ShK(L5) 10 horas después de que ratas recibieran inyecciones intravenosas o subcutáneas sencillas de 10 mg/kg de ShK(L5). El péptido desapareció con el mismo curso de tiempo después de administración por cualquier ruta (Figura 5E) indicando que la piel no es responsable por el nivel de estado estable de 300 pM ShK(L5) alcanzado después de una sola inyección diaria de 10 mg/kg (Figura 5D), y el o los depósitos residen en otra parte. El logro exitoso de un nivel de estado estable de 300 pM ShK(L5) después de inyecciones sencillas diarias de 10mg/kg/día sugiere que el péptido puede estar estable in vivo. Para examinar directamente su estabilidad incubamos ShK(L5) en plasma de ratas o en PBS que contiene plasma de rata al 2% a 37 grados C para duraciones variantes y después midió actividad de bloqueo Kv1.3. En ambos juegos de muestras con pico (plasma y PBS) observamos una reducción del 50% en actividad de bloqueo de Kv1.3 en aproximadamente 5 horas supuestamente debido a ligado de péptido a la superficie plástica del tubo y el nivel entonces permaneció uniforme por los siguientes 2 días (Figura 5F). Como una prueba de estabilidad agregada comparamos las actividades de bloqueo de Kv1.3- contra Kv1.1 de sueros de ratas tratadas con ShK(L5). Si ShK(L5) se modifica in vivo, ya sea por defosforilación de pTyr o escisión de la cadena lateral Aeea-pTyr producida de ShK(L4) y ShK respectivamente, ninguno de los cuales es selectivo para Kv1.3 sobre Kv1.1. Muestras de suero de animales tratado con ShK(L5) exhibieron la misma selectividad para Kv1.3 sobre Kv1.1 como ShK(L5), indicando que el péptido no se somete a las modificaciones anteriormente establecidas. Tomados en conjunto, estos resultados indican que ShK(L5) es notablemente estable en plasma y alcanza concentraciones en suero farmacológicamente relevantes después de inyecciones subcutáneas diarias sencillas de 10 mg/kg. Sin toxicidad Los solicitantes realizaron varias pruebas in vitro e in vivo para determinar si ShK(L5) exhibe toxicidad alguna. Los resultados de estos estudios se resumen en el Apéndice A. Células linfoides de rata y humano, incubadas por 48 horas con una concentración de (100 nM) de ShK(L5) >1200 veces mayor que la dosis de bloqueo media de Kv1.3 o la supresión de IC50 para TEM (70-80 pM), exhibieron mínima citotoxicidad. La misma alta concentración de ShK(L5) fue negativa en la prueba Ames en el probador de tensión TA97A sugiriendo que no es un mutágeno. Ambas pruebas in vitro fallaron en detectar toxicidad significante. Bloqueo inducido por droga de los canales Kv11.1 (HERG) ha contribuido a mayor toxicidad cardíaca y a retirar varios medicamentos del mercado. ShK(L5) no tiene efecto en los canales Kv11.1 a 100 nM (>1430-veces la Ká para Kv1.3), y el régimen terapéutico selecto por el solicitante (10 mg/kg/día, 300 pM como nivel de circulación de estado estable), por lo tanto no habrá de provocar cardiotoxicidad. Como una prueba adicional, los solicitantes realizaron análisis de variabilidad del ritmo cardíaco en vehículo administrado en ratas conscientes (PBS + suero de rata 2%) el día-1 , seguido por 10 mg/kg/día ShK(L5) el día -2. ShK(L5) no tuvo efecto en el ritmo cardíaco o los parámetros de variabilidad del ritmo cardíaco (HRV = heart rate variability) en ambos dominios de tiempo y frecuencia Fuerza de tarea (Task Forcé) de la European Society of Cardiology and the North American Society of Pacing Electrophysiology, 1996). Estimulados por los experimentos de toxicidad aguda, los solicitantes realizaron un estudio de toxicidad sub-crónica en donde se administraron inyecciones subcutáneas diarias a ratas de 10 mg/kg ShK(L5) o vehículo por 2 semenas (n = 6 en cada grupo). Animales tratados con ShK(L5) ganaron pero en el mismo grado que ratas que reciben vehículo (Apéndice A). Análisis de química de sangre y hematológico no mostró diferencia entre ratas tratadas con ShK(L5) y con vehículo, y análisis citométrico de flujo no reveló diferencias en las proporciones de subconjuntos de timocitos o linfocitos (Apéndice A). En forma colectiva, estos estudios sugieren que ShK(L5) es seguro. Parar determinar el índice de seguridad terapéutica, administramos una dosis 60-veces superior (600 mg/kg/día) de ShK(L5), a ratas sanas por 5 días y no observamos signos clínicos de toxicidad, y no se percibió toxicidad cuando ratas sanas recibieron una sola inyección de 1000 mg/kg de ShK(L5). La situación es menos sanguínea cuando la barrera sangre-cerebro está comprometida como sucede en EAE y MS. Ratas con EAE que recibieron ShK(L5) 10 mg/kg/día por 10 días, no mostraron signos de toxicidad. En contraste, cuarenta por ciento de ratas (5/12) a las que se administraron 600 mg/kg/día por cinco días, murieron en el quinto día cuando desarrollaron signos clínicos de EAE (LD 0 extrapolada = 750 mg/kg/día). Ya que la concentración pico de ShK(L5) en el suero (12 nM) después de administración de una sola inyección de 200 mg/kg, es suficiente para bloquear >50% de los canales Kv1.1 , la toxicidad observada en ratas EAE administradas con 600 mg/kg/día de ShK(L5) es probablemente debido al ingreso en el cerebro de cantidades suficientes de ShK(LS) para bloquear Kv1.1. De esta manera, el índice de seguridad terapéutica efectiva de ShK(L5) está bien en exceso de 100 en situaciones en donde la barrera de sangre-cerebro no están comprometida (como se ve en enfermedades autoinmunes que no afectan al sistema nervioso central (CNS = central nervous system)), mientras que el índice de seguridad terapéutico es 75 cuando se rompe la barrera sangre-cerebro. Prevención de DTH y EAE Adoptivo Agudo Con referencia a las Figuras 6A-6C, ShK(L5) se evalúa para actividad inmunosupresora in vivo en dos modelos de animales. Los solicitantes probaron su habilidad para evitar y tratar EAE agudo inducido por la transferencia de células PAS TEM activadas por MBP en ratas de Lewis, así como suprimir la reacción de DTH mediada por células TEM- Células PAS se activaron con MBP por 48 horas in vitro y después transfirieron adoptivamente (6-8 x 106 células viables) en ratas Lewis. Para la prueba de prevención, ratas recibieron entonces inyecciones subcutáneas de salino (controles) o ShK(L5) (10 //g/kg/día) por 5 días. En la primer prueba de prevención, ratas de control desarrollaron EAE ligero (calificación clínica máxima promedio 2.0 ± 1.2) con un inicio promedio de 5.6 ± 0.6 días (no mostrado). ShK(L5) redujo la severidad de la enfermedad (calificación clínica máxima promedio OJ ± 0.6, p < 0.05). En la segunda prueba de prevención, ratas de control desarrollaron EAE más severo (calificación clínica máxima promedio 3.2 ± 0.4) con un inicio promedio de 4.8 ± 0.4 días (Figura 6A). ShK(L5) reduce significativamente la severidad de la enfermedad (calificación clínica máxima promedio 0.6 ± 0.4, p < 0.007) pero no retarda significativamente el inicio de la enfermedad (5.5 ± 0.7 días; p = 0.07). No se notaron signos de toxicidad en estos estudios. En la prueba de tratamiento (Figura 6B) se inyectaron ratas con células PAS activadas con MBP, se les administró salino o 10 //g/kg/día de ShK(L5) cuando inicialmente desarrollaron signos de EAE (cola caída, postura jorobada y pérdida de 6% o más de su peso durante 24 horas) y la terapia continuó por tres días. Signos clínicos de EAE alcanzaron un pico el día 6 en el grupo de control (calificación = 3.9 ± 0J) y el día 7 en el grupo tratado (calificación = 1.9 ± 0.9; p < 0.05). Como una evaluación independiente de la actividad inmunosupresiva de ShK(L5)'s in vivo, los solicitantes también examinaron su efectividad para inhibir la reacción DTH que es mediada predominantemente por células TE que se asientan en la piel. Ratas Lewis inmunizadas con ovalbúmina y adyuvante, se probaron 7 días después con ovalbúmina en una oreja y salino en la otra oreja. Ratas recibieron inyecciones de salino (controles) o ShK(LS) (10 / g/kg/día) y se midió el espesor de la oreja como una indicación de DTH. Todas las ratas de control desarrollaron hinchado de oreja, 24 y 48 horas después de la prueba con ovalbúmina mientras que la reacción de DTH fue substancialmente más ligera en los animales tratados con ShK(L5) (Figura 6C). De esta manera, ShK(L5) inhibe la respuesta de DTH mediada por TEM, y evita y mejora severo EAE adoptivo inducido por células TEM activadas por mielina. Enjambres Kv1.3 en IS durante Presentación de Antígeno pero Flujo K* a Través de Kv1.3 no se Reguiere para Formación ¡S o Estabilidad Con referencia a las Figuras 7A-7G, ShK(L5), un inhibidor Kv1.3 altamente selectivo (21), bloqueó las corrientes Kv1.3 en células TEM específicas de GAD65 con una Kd de 72 ± 3 pM. Utilizamos ShK(L5) como una sonda farmacológica para definir aquellas etapas en la activación de células TEM que requieren función Kv1.3. Estudios bioquímicos han mostrado que Kv1.3 y Kvb2 pertenecen a un complejo de señalización que incluye proteína asociada con Sinapsis (SAP97 = Synapse-Associated-Protein-97), proteína que interactúa con PKC-zeta (ZIP = PKC-zeta-interacting-protein), proteína-p62-asociada-p56lck A170), p56lck y CD4 (Figura 7B). La existencia de este complejo en células TEM humanas está soportada por los resultados del solicitante que muestran co-terminación extremo de Kv1.3, Kvb2, SAP97, ZIP y p56lck con CD4. Además, estudios de transferencia de energía fluorescente (FRET = fluorescence energy transfer) muestran Kv1.3 en proximidad inmediata con CD3 en células T humanas transfectadas con Kv1.3, y el canal localiza preferencialmente en el punto de contacto entre células T citotóxicas humanas transfectadas con Kv1.3 y sus objetivos o dianas. Ya que CD4 circula al IS, la zona de contacto entre células T y células que presentan antígeno (APC = antigen presenting cells), es posible que Kv1.3 y otras proteínas en el complejo de señalización también se localicen en IS durante la presentación de antígeno. Para probar esta ¡dea, ciónos TE Kv1.3hi9h específicos de GAD65 de un paciente T1 DM se incubaron con APCs apareados con HLA que se han cargado con péptido GAD65 5571 y tiñeron con DAPI para ayudar a la visualización. Después de 20 minutos, conjugados APC-TEM se inmunotiñeron por proteínas en el complejo de señalización. CD4 co-localizado en el IS con Kv1.3, Kvb2, SAP97, ZIP y p56lck. En la ausencia de contacto APC-TEM, CD4 y Kv1.3 se distribuyeron a través de la célula. Además, CD4 y Kv .3 fallaron en localizar en puntos de contacto cuando células TE especificas de GAD65 se expusieron a APCs cargado con MBP (un antígeno irrelevante), verificando que la formación de enjambre IS es específica de antígeno. De esta manera, en células TE específicas de GAD65, un complejo de señalización que contiene Kv1.3 circula junto con CD4 a IS durante presentación de antígeno, sugiriendo que Kv1.3 es un componente integral de la maquinaria que transduce señales en las células TEM. Con base en estos estudios, ShK(L5) a una concentración que bloquea aproximadamente 99% de canales Kv1.3 (100 nM) no evita formación de enjambre IS y no rompe IS una vez formado, indicando que el flujo K+ a través de los canales Kv1.3 es innecesario para formación IS o estabilidad. Supresión de Células TEM Humanas Con referencia a las Figuras 8A-8E, ShK(L5) inhibió señalización de calcio en células TE . una etapa temprana y esencial en activación de célula T. Ciónos TEM específicos de GAD65 de pacientes T1 DM, se cargaron con el colorante indicador de calcio Fluo3, pre-incubado en medio solo o con concentraciones crecientes de ShK(L5) y formar en ¡magen por citometría de flujo antes y después de la adición de un anticuerpo anti-CD3 de activación y un anticuerpo secundario de reticulado. Aumento de calcio máximo ocurrió en 242±35 segundos después de estímulo y se bloqueó por ShK(L5) con una IC50 de -200 pM (Figura 8A). ShK(L5) fue 10-veces más efectivo para suprimir la incorporación de [3H]-timidina por células TE autoreactivas de pacientes T1DM y RA en comparación con células sin tratamiento previo/TcM de estos pacientes (Figura 8B, izquierda). En un segundo juego de experimentos (Figura 8B, derecha), células T RA-SF y RA-PB se activaron con anticuerpo anti-CD3 por 48 horas para generar "efectores TEM", y "efectores sin tratamiento previo/TCM" respectivamente. Las células reposaron durante la noche en medio, re-estimularon con anticuefo anti-CD3 en la presencia o ausencia de ShK(L5) por 48 horas más e incoforación de [3H]-timidina se midió. Efectores RA-SF-TEM retuvieron su sensibilidad a inhibición de ShK(L5), mientras que efectores RA-PB-sin tratamiento previo/TcM fueron resistentes a bloqueo Kv1.3 (Figura 8B, derecha), muy probablemente debido a que regulan en forma ascendente el canal KCa3.1/IKCa1 , activado con calcio, que substituye Kv1.3 para promover entrada de calcio. ShK(L5) suprimió profundamente la producción de interleucina 2 (IL2) e interferona-g (IFN-g) por células TEM de pacientes T1 DM y RA, mientras que la producción de IL2 y IFN-g por células sin tratamiento previo/TCM de estos pacientes fue menos afectada (Figura 8C). La producción de factor de necrosis de tumor-a e interleucina 4 tanto por células TE como células sin tratamiento previo/TcM fue menos sensible a ShK(L5) (Figura 8C). Verificación de Modelo de Rata de Hipersensibilidad de tipo Retardado (DHT= Delayed Type Hypersensitivity) Provocada por Células T de Memoria Efectora Como se ilustra en la Figura 9, se inmunizaron ratas con ovalbúmina (OVA) en adyuvante. Se sometieron a prueba en una orej.a 7 días después con OVA y en la otra con salino. Se midió el hinchado de oreja 24 horas después como un signo de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH). Los histogramas FACS mostrados en la Figura 9 indican que las células T en las orejas sometidas a pruebas con OVA son células con memoria negativa CD45RC mientras que las células T en la sangre y el bazo de las mismas ratas primordialmente son células T sin tratamiento previo. Protocolo de Tratamiento para Shk(L5) en un Modelo de Rata de Hipersensibilidad de tipo Retrasado (DHT) Provocado por Células T de Memoria Efectora Como se ilustra en la Figura 10, ratas recibieron ShK(L5) 10 //g/kg/día como una inyección subcutánea ya sea desde el día 0 al día 7 (durante la fase de cebado), para evitar la diferenciación de células sin tratamiento previo a células TE de memoria efectora, o durante la fase efectora después de tratamiento en la oreja con ovalbúmina para evitar la función de células TEM. Shk(L5) Suprime Específicamente Respuestas de Memoria Efectora In Vivo en Ratas sin Deteriorar la Función de Células T sin Tratamiento Previo y de Memoria Central o Células B Como se ilustra en la Figura 11, ratas de control desarrollaron hinchado de oreja, es decir una respuesta DTH positiva, ShK(L5) no fue efectivo para suprimir DTH cuando se administra en fase de cebado indicando que no suprime la diferenciación de células T sin tratamiento previo y de memoria central en células de memoria efectora. ShK(L5) suprime DTH cuando se administra durante la fase efectora indicando que ya que evita la habilidad de las células T de memoria efectora para alcanzar la oreja y/o suprimir la activación de células T de memoria efectora. La primer posibilidad se excluyó debido a que el número de células T en las orejas de ratas tratadas con ShK(L5)fue el mismo que las orejas de ratas que se les administró el vehículo. ShK(L5) suprimió la activación de células T de memoria efectora en la oreja debido a que estas células T fueron Kv1.3-negativas, mientras que las células T de memoria en las orejas de animales tratados con vehículos fueron Kv1.3-positivas. Respuestas de células B, IgM e IgG en estos animales tampoco fueron afectadas. Expresión de Kv1.3 en Células T Específicas para Copiar, Antígenos de insulina/9- 23- y Mielina de Pacientes con T1 DNI O MS y Controles Sanos La Figura 12A muestra corrientes Kv1.3 (superior) y número de canal/células (inferior) de células T específicas de antígeno de pacientes con diabetes mellitus de tipo uno de nuevo inicio, controles sanos y pacientes con esclerosis múltiple. Cada punto de datos representa el promedio de ± SEM de 20-50 células de 2-4 líneas celulares T de un solo donador medidas 48 horas después del tercer estímulo de antígeno. Debido a la baja frecuencia de células T específicas para insulina y GAD65 en la sangre de pacientes T1DM y controles, amplificamos estas poblaciones al generar líneas celular T CD4+ específicas de auto antígeno de corto plazo utilizando el método de pozo dividido. Como controles, generamos línea de células T específicas para la proteína básica de mielina auto antígeno (MBP = myelin basic protein) y relevante que está implicada en MS pero no T1 DM.
Siguiendo el tercer estímulo antigénico, corrientes Kv1.3 se midieron por registro electrofisiológico de fijación de voltaje de células enteras en células activadas con una capacitancia de membrana mayor a 4 pF (diámetro de células > 11 µm). Corrientes Kv1.3 representativas y números de canal Kv1.3/células T se ilustran en la Figura 12A. Las corrientes exhiben propiedades biofísicas y farmacológicas características de Kv1.3. Células T específicas para insulina (9-23) o GAD65 (555-567) de pacientes con T1 DM de nuevo inicio exhibieron grandes corrientes Kv1.3 y expresaron altos números de canales Kv1.3, mientras que en células específicas de MBP IRrelevantes de enfermedad de estos pacientes fueron Kv1.3low (p = 0.001). Para comparación hemos trazado nuestros datos Kv1.3 publicados en pacientes de MS en quienes el patrón opuesto se observó. En pacientes MS, células T específicas para MBP o glicoproteína de oligodendrocitos-mielina (peptide 35-55) o proteína de proteolípido (péptido 139-151) fueron Kv1. 3h'9h, mientras que en células T específicas de insulina y GAD65 fueron Kv1.3lo (p = 0.0001). Células T auto reactivas aisladas de controles sanos fueron Kv1.3low independientemente de la especificidad. En un individuo tanto con MS como T1 DM, células T específicas para todos los tres auto antígenos fueron Kv1.3h,9h. Células T específicas de insulina y específicas de GAD65 de pacientes con T1DM antiguo, fueron Kv1.3high que refleja la persistencia de células TEM auto reactivas mientras que un patrón Kv1.3low se encontró en células T específicas de GAD65 e insulina de pacientes con DM tipo 2 no auto inmune. Como se ve en la Figura 2B, tinción Kv1.3 (superior) e intensidades de fluorescencia de células individuales (inferior). Los solicitantes confirmaron que los datos de registro electrofisiológico de fijación de voltaje por inmunotínción para células T específicas de insulina Kv1.3. y GAD65 de pacientes T1 DM y células T específicas de MBP de pacientes MS se tiñeron brillantes mientras que células específicas para auto antígenos irrelevantes se tiñeron en forma tenue. La Figura 12C muestra expresión CCR7. Citometría de flujo reveló que células Kv1.3h¡9h fueron células TEM CCR7 mientras que células Kv1.3low fueron células TC O sin tratamiento previo CCR7+. La Figura 12D muestra números Kv1.3/célula en células T auto reactivas de un paciente tanto con T1 como MS, y de pacientes que tienen T1DM o DM tipo 2 por más de 5 años y 2 años, respectivamente. La Figura 12D muestra números Kv1.3 en células T CD4+GAD65-tetrámero+ de pacientes con TIDM de nuevo inicio. Como control adicional empleamos tetrámeros clase II MHC fluorescentes que contienen el péptido GAD65 5571 para aislar células T CD4+ específicas de GAD65 de un pacientes positivo de DR-0401 con T1DM de Nuevo inicio. Células T activadas con GAD65 clasificadas por tetrámero exhibieron el mismo patrón Kv1.3h'9h observado en líneas celulares T específicas de GAD65 de pacientes T1DM. En resumen, células T activadas por auto antígeno relevantes para la enfermedad tanto en T1 DM como en MS son efectoras TEM CCR7- Kv1.3high mientras que células auto reactivas y relevantes para enfermedad para estos pacientes son células sin tratamiento previo/TcM CCR7+ Kv1.3|0 w. Expresión Kv1.3 en Artritis Reumatoide y Osteoartritis En RA, células T relevantes a la enfermedad pueden aislarse de las articulaciones afectadas. Células T de registro electrofisiológico de fijación de voltaje de los solicitantes del fluido sinovial (SF = synovial fluid) de 7 pacientes de RA, 48 horas después de estímulo con anticuerpo anti-CD3. Como se ve en la Figura 13A, como controles, los solicitantes analizaron células T-SF de 7 pacientes con ósteoartritis (OA) no autoinmune degenerativa (que se ha activado con el mismo protocolo). Células T RA-SF fueron Kv1.3hl9h mientras que células T OA-SF fueron Kv1.3low (p < 0.0001). Los solicitantes encontraron que el patrón Kv1.3lo en células T activadas con anti-CD3 de sangre periférica (PB= peripheral blood) de pacientes RA (p < 0.0001 ) debido a que células Kv1.3h,gh auto reactivas son infrecuentes en la sangre. La inmunotinción para Kv1.3h,gh y su sub unidad Kv ?2 asociada corroboró los datos de registro electrofisiológico de fijación de voltaje. La Figura 13B muestra imagines confocales de tinción Kv1.3 (gris claro como se ve en la Figura) y Kv ?2 (gris obscuro como se ve en la figura). Células T RA-SF se tiñeron brillantes tanto para Kv1.3 como Kvß2, mientras que células T OA-SF y RA-PB exhibieron tinción débil. La Figura 13C ilustra expresión CCR7. La citometría de flujo verificó que células T RA-SF Kv1.3hi9h fueron células TEM CCR7' mientras que células T OA-SF y RA-PB Kv1.3low fueron células sin tratamiento previo/TCM CCR7+. La Figura 13D (superior) muestra microfotografías de sinobio de pacientes RA y OA teñido con anticuerpos anti-CD3 o anti-Kv1.3 y contrateñido con hematoxilina/eosina (40X). Como prueba adicional, nosotros sometimos a inmunotinción tejidos sinobiales (ST = synovial tissues) incrustados con parafina de 5 pacientes de RA y 5 de OA para CD3, Kv1.3 y CCR7. Previamente hemos mostrado que nuestro método de tinción no detecta Kv1.3 en células sin tratamiento previo/TcM debido a sus bajos números de canales Kv1.3. En RA-TS, se notó una preponderancia de células TEM Kv1.3+CD3+CCR7" mientras que células CD3+ fueron escasas en sinobio de OA y estas primordialmente fueron células sin tratamiento previo/TcM Kv1.3" CCR7 +. Grado de infiltración por células CD3+, Kv1.3* y CCR7+ estimadas por un sistema de degradación en la Figura S2A, índice inflamatorio. CD3+: RA = 3.2±0.1 ; OA = 1.1 ±0.2 (p <0.01 ); índice inflamatorio Kv1.3+: RA = 2.8±0.3; OA = 0.6±0.3 (p <0.01). De esta manera en tres desórdenes auto inmunes diferentes, nuestros resultados son consistentes con células T auto reactivas asociadas con enfermedad que son efectores TEM CCR7 Kv1.3h,gh. Habrá de apreciarse que la invención se ha descrito aquí con referencia a ciertos ejemplos o modalidades de la invención pero que puedan realizarse diversas adiciones, eliminaciones, alteraciones y modificaciones a esos ejemplos y modalidades, sin apartarse del espíritu y alcance pretendido de la invención. Por ejemplo, cualquier elemento o atributo de una modalidad o ejemplo puede incorporarse en o emplearse con otra modalidad o ejemplo al menos que para hacerlo hiciera a la modalidad o ejemplo inadecuados para su uso pretendido. También, cuando las etapas de un método o procedimiento se citan o establecen e un orden particular, el orden de esas etapas puede cambiarse a menos que de otra forma se especifique que o a menos que ese cambio en el orden de las etapas haga a la invención inpatentable o inadecuada para su uso pretendido. Todas las adiciones, eliminaciones, modificaciones y alteraciones razonables habrán de considerarse equivalente de los ejemplos y modalidades descritos y habrán de incluirse dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
Apéndice A: Estudio de toxicidad de ShK(L5) Pruebas In vitro ShK(L5) 100nM Citotoxicidad (% de células muertas) PBMCs Humanas 7.5 ±4.3 Células T PAS 8.1 ±0.8 Células Jurkat 5.5 ±3.3 Linfoma de Burkit 3.1 ±0.9 Myeloma RPMI 8226 6.5 ±2.1 Prueba Ames Negativa ShK(L5)10 Pruebas In vivo Agudas Salino //g/kg Electrocardiograma* Ritmo cardíaco 302 ± 13 311 ± 20 SDNN 13.3 ±3.0 17.8 ± 4.4 CV% 6.7 ±1.4 9.2 ± 2.2 SDANN smin 5.0 ±2.0 6.9 ± 2.3 rMSSD 6.8 ±2.2 9.8 ± 3.5 HF(n.u.) 71 ±21 79 ± 37 HF (%) 50 ±8 53 ±10 LF(n.u.) 68±4 64 ±10 LF (%) 50 ±8 47 ± 10 LF/HF 1.1 ±0.4 1.3 ± 0.7 Pruebas In vivo Sub-crónicas Salino ShK(L5)10 CD3+CD8+ 26.9 ± 0.1 25.0 ± 0.2 lgM+ 38.8 ± 1.5 33.3 ± 0.3 Datos expresados como promedio ± SD. *Probados con pruebas t, p<0.05 en todos los parámetros; SDNN: desviación estándar de todos los intervalos RR normal-a-normal; CV%:100 x intervalo SDNN/RR promedio; SDANN5m¡n: desviación estándar del promedio de los intervalos RR normales para cada periodo de 5 min.; rMSSD: media cuadrática de diferencia sucesiva; HF (n.u.) energía de alta frecuencia (0J5-2.5 Hz) en unidad normalizada; LF (n.u.); potencia de baja frecuencia (0.2-0J5Hz) en unidad normalizada.
APÉNDICE B L-p-Fosfonofenilalanina (PPA) -p-fosforometanonafenilalamina (PM(=o)PA) L-p-cetofosfofenilalanina (KPP) 10 -p-fosfonodiflorometilfenilalanina (PM(f2)PA) -p-diflorometilfosforofenilalanina

Claims (54)

REIVINDICACIONES
1. Una composición de materia que comprende ShK conectado a una actividad química orgánica o inorgánica que tiene una carga aniónica.
2. Composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la entidad química se elige del grupo que consiste de: aminoácidos; polipéptidos; residuos aminoácidos; residuos aminoácidos no naturales; treonina; derivados de treonina; fosfo-treonina; serina; derivados de serina; fosfo-serina; ácido glutámico; derivados de ácido glutámico; ácido gamacarboxiglutámico; ácido aspártico; derivados de ácido aspártico; compuestos o grupos inorgánicos; compuestos o grupos orgánicos; anhídrido succinico; y anhídrido oftálico
3. Una composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la toxina ShK se obtiene de una fuente natural.
4. Una composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la toxina ShK es sintética.
5. Una composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la entidad química se conecta al extremo N del polipéptido ShK.
6. Una composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la entidad química se conecta a un extremo N de ShK a través de una molécula de enlace o grupo de enlace.
7. Una composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la entidad química se conecta a un extremo N de ShK por un enlazador aminoetiloxietiloxi-acetilo.
8. Una composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la entidad química incluye una etiqueta de fluoróforo.
9. Una composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la entidad química es AEEAc-L-Pmp(OH2).
10. Una composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la entidad química es AEEAc-D-Pmp(OH2).
11. Composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la entidad química es AEEAc-D-Pmp(OH, Et).
12. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la entidad química es AEEAc-L-Pmp(Et2).
13. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la entidad química es AEEAc-D-Pmp(Et2).
14. Una composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la entidad química es AEEAc-L-Tyr.
15. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la entidad química es AEEAc-L-Tyr(PO H2).
16. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la entidad química es AEEAc-L-Phe(p-NH2).
17. Una composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la entidad química es AEEAc-L-Phe(p-CO2H).
18. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la entidad química es AEEAc-L-Aspartato.
19. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la entidad química es AEEAc-D-Aspartato.
20. Una composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la entidad química es AEEAc-L-Glutamato.
21. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la entidad química es AEEAc-D-Glutamato.
22. Un método para provocar inhibición de canales de potasio Kv1.3 en un sujeto humano o animal, el método se caracteriza porque comprende la etapa de: (A) administrar al sujeto una composición que comprende toxina ShK conectada a una entidad química orgánica o inorgánica que tiene una carga aniónica, en una forma y cantidad que son efectivas para inhibir los canales de potasio Kv1.3. **dix31a
23. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el método se lleva a cabo para evitar o tratar un desorden auto inmune.
24. Un método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el desorden auto inmune se elige del grupo que consiste de: Esclerosis Múltiple, Myasthenia gravis, Neuropatías autoinmunes tales como Guillain-Barré, uveitis autoinmune, enfermedad de crohn, colitis ulcerativa, cirrosis biliar primaria, hepatitis autoimmune, trombocitopenia autoimmune, Diabetes mellitus Tipo 1 , Enfermedad de Addison, Enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, ooforitis autoimmune y orquitis, Enfermedad de Behcet, artritis reumatoide, resorción de huesos asociada con enfermedad periodontal, lupus sistémico eritematoso, escleroderma, polimiositis, dermatomiositis, Pemfigus vulgaris, espondiloartropatías tales como espondilitis anquilosante, Síndrome de Sjogren.
25. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el método se lleva a cabo para evitar o tratar una enfermedad de injerto contra anfitrión.
26. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el método se lleva a cabo para evitar o tratar rechazo de un tejido u órgano trasplantado.
27. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el método se lleva a cabo para evitar o tratar síndrome metabólico.
28. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el método se lleva a cabo para evitar o tratar diabetes tipo 2.
29. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el método se lleva a cabo para evitar o tratar obesidad.
30. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el método se lleva a cabo para evitar o tratar resorción de huesos asociada con enfermedad periodontal.
31. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la composición comprende toxina ShK enlazada con una entidad química seleccionada del grupo que consiste de: amino ácidos; polipéptidos; residuos amino ácido; residuos amino ácido no naturales; treonina; derivados de treonina; fosfo-treonina; serina; derivados serina; fosfo-serina; ácido glutámico; derivados de ácido glutámico; ácido gamma-carboxi-glutámico; ácido aspártico; derivados de ácido aspártico; compuestos o grupos inorgánicos; compuestos o grupos orgánicos; anhídrido succínico; y anhídrido ftálico.
32. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la entidad química es AEEAc-L-Pmp(OH2).
33. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la entidad química es AEEAc-D-Pmp(OH2).
34. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la entidad química es AEEAc-D-Pmp(OH, Et).
35. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la entidad química es AEEAc-L-Pmp(Et2).
36. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la entidad química es AEEAc-D-Pmp(Et2).
37. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la entidad química es AEEAc-L-Tyr.
38. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la entidad química es AEEAc-L-Tyr(PO3H2).
39. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la entidad química es AEEAc-L-Phe(p-NH2).
40. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la entidad química es AEEAc-L-Phe(p-CO2H).
41. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la entidad química es AEEAc-L-Aspartato.
42. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la entidad química es AEEAc-D-Aspartato.
43. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la entidad química es AEEAc-L-Glutamato.
44. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la entidad química es AEEAc-D-Glutamato.
45. Un método para realizar citometría de flujo, el método se caracteriza porqu comprende las etapas de: (A) proporciona una composición que comprende ShK conectado a una entidad química orgánica o inorgánica que tiene una carga aníonica y una etiqueta de flúoroforo; (B) combinar la composición que se proporciona en la etapa A con células; y (C) usar un citómetro de flujo para contar, aislar o distinguir células que tienen afinidad para la composición que se proporciona en la etapa A.
46. Un método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la etapa C comprende utilizar el citómetro de flujo para contar, aislar o distinguir linfocitos T.
47. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ShK se modifica por sustitución del residuo Met en la posición 21.
48. Una composición de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque la sustitución en el residuo 21 Met impide la oxidación.
49. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ShK se modifica por sustitución de la función ácido C-terminal con una amida.
50. Una composición de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque la sustitución de la función ácido C-terminal con una amida imparte estabilidad a enzimas carboxipeptidasa C-terminales.
51. Un método de conformidad con la reivindicación 22 o 45, caracterizado porque el ShK se modifica por sustitución del residuo Met en la posición 21.
52. Una composición de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado porque la sustitución en el residuo 21 Met impide la oxidación.
53. Un método de conformidad con la reivindicación 22 o 45, caracterizado porque el ShK se modifica por sustitución de la función ácido C-terminal con una amida.
54. Un método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque la sustitución de la función ácido C-terminal con una amida imparte estabilidad a enzimas carboxipeptidasa C-terminales.
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