ES2580233T3 - Análogos de toxina ShK y sus usos en inhibición selectiva de canales de potasio Kv1.3 - Google Patents

Análogos de toxina ShK y sus usos en inhibición selectiva de canales de potasio Kv1.3 Download PDF

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Christine Beeton
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Abstract

Una composición de materia que comprende ShK, un enlazador aminoetiloxietiloxi-acetilo unido a un extremo N de ShK y una entidad química aniónica unida a dicho enlazador, en la que la entidad química aniónica es un residuo aminoacídico, y la composición de materia es selectiva para los canales Kv1.3 sobre los canales Kv1.1.

Description

DESCRIPCION
Analogos de toxina ShK y sus usos en inhibicion selectiva de canales de potasio Kv1.3.
5 CAMPO DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona a) composiciones novedosas de materia, b) metodos y kits para la inhibicion in vivo y/o in vitro del canal Kv1.3 en linfocitos T y B y otros tipos de celulas y c) metodos para tratar trastornos autoinmunes y otros, en sujetos humanos o animales.
10
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Las membranas de plasma celular forman las superficies exteriores de las celulas eucarioticas. Diversos iones (por ejemplo, sodio, potasio, calcio, etc.) entran y salen de las celulas por difusion pasiva a traves de las membranas 15 plasmaticas de las celulas. Dicha difusion de iones dentro y fuera de las celulas se facilita por la presencia de "canales de iones" dentro de las membranas celulares. Los canales de iones son protemas incrustadas dentro de la membrana celular, que controlan el flujo selectivo de iones a traves de la membrana, permitiendo de esta manera la formacion de gradientes de concentracion entre los contenidos intracelulares de las celulas y el fluido extracelular circundante. Debido a que las concentraciones de iones estan involucradas directamente en la actividad electrica de 20 las celulas excitables (por ejemplo, las neuronas), el funcionamiento (o mal funcionamiento) de los canales de iones puede controlar sustancialmente las propiedades electricas y el comportamiento de dichas celulas. De hecho, una diversidad de trastornos, ampliamente denominados "canalopatfas", se cree que estan vinculados con las insuficiencias o disfunciones de canal de iones.
25 Los canales de iones se denominan como "regulados", si estan abiertos o cerrados. Los tipos basicos de canales de iones regulados incluyen a) canales regulados por ligando, b) canales regulados mecanicamente, y c) canales regulados por voltaje. En particular, los canales regulados por voltaje se encuentran en las neuronas, celulas musculares y celulas no excitables, tales como linfocitos. Se abren o cierran en respuesta a cambios en la carga por la membrana plasmatica.
30
Canales Kv1.3 y enfermedades autoinmunes.
Las enfermedades autoinmunes, tales como esclerosis multiple (EM), diabetes mellitus tipo 1 (DMT1), artritis reumatoide (AR) y psoriasis, afectan a varios cientos de millones de personas en todo el mundo. En estos trastornos, 35 se cree que los linfocitos T autorreactivos espedficos - por ejemplo, linfocitos T espedficos de mielina en pacientes de EM - experimentan una estimulacion autoantfgeno repetida durante el transcurso de la enfermedad y se diferencian de la celulas de memoria cronicamente activadas que contribuyen a la patogenesis por migracion a los tejidos inflamados y secrecion de citocinas (Viglietta y col., 2002; Vissers y col., 1002; Wulff y col., 2003b). Las terapias que se dirigen preferiblemente a los linfocitos T de memoria cronicamente activados tendran un valor 40 significativo para las enfermedades autoinmunes.
Los linfocitos T de memoria se dividen en dos sub-conjuntos - de memoria central (Tcm) y de memoria efectora (Tem) - - en base a la expresion del receptor de quimiocina CCR7 y la fosfatasa CD45RA (Geginat y col., 2001; Sallusto y col., 1999). Los linfocitos indiferenciados y Tcm se asientan en el nodo linfatico antes de migrar a sitios de
45 inflamacion, mientras que los linfocitos Tem se asientan directamente en sitios de inflamacion donde secretan
cantidades copiosas de IFN-p y TNF-a y muestran una funcion efectora inmediata. Recientemente se ha mostrado que los linfocitos T autorreactivos espedficos de mielina en pacientes de EM son linfocitos Tem predominantemente activos (Wulff y col., 2003b), y la transferencia adoptiva de linfocitos Tem de rata activados espedficos de mielina en receptores sin tratamiento previo inducen EAE grave (Beeton y col., 2001 a; Beeton y col., 2001 b). Una nueva diana
50 terapeutica excitante para inmunomodulacion de linfocitos Tem es el canal de K+ Kv1.3 regulado por voltaje. Los
linfocitos Tem regulan por aumento los canales Kv1.3 tras la activacion y su proliferacion inducida por antfgeno es exquisitamente sensible a bloqueadores de Kv1.3 (Wulff y col., 2003b). Por el contrario, los linfocitos indiferenciados y Tcm son significativamente menos sensibles a los bloqueadores de Kv1.3 para empezar y rapidamente se vuelven resistentes al bloqueo de Kv1.3 regulando por aumento el canal de K+ activado por calcio IKCa1 (Ghanshani y col., 55 2000; Wulff y col., 2003b).
La dominancia de Kv1.3 en los linfocitos Tem proporciona una potente forma de manipular la actividad de este sub- conjunto con inhibidores de Kv1.3 espedficos. La distribucion tisular funcionalmente restringida del canal y el hecho de que el bloqueo de Kv1.3 in vivo mejora la EAE mediada por Tem, la resorcion osea en una enfermedad
periodontal y reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado en modelos animales sin provocar efectos secundarios obvios, ha mejorado lo atractivo de Kv1.3 como una diana terapeutica (Beeton y col., 2001b; Koo y col., 1997; Valverde y col., 2004). Aunque los bloqueadores de Kv1.3 suprimiran todos los linfocitos Tem activados (por ejemplo, linfocitos Tem espedficos para antigenos de vacuna), una terapia basada en Kv1.3 sera una mejora 5 significativa frente a terapias actuales que modulan amplia e indiscriminadamente todo el sistema inmune. Una ventaja adicional de los bloqueadores de Kv1.3 es que son reversibles. Por lo tanto, se puede valorar el efecto terapeutico de los bloqueadores de Kv1.3 cuando sea necesario y detener la terapia frente a la infeccion, a diferencia de los agentes quimioterapeuticos, que tardan meses en disminuir.
10 Canales Kv1.3 y obesidad
Se descubrio que el canal Kv1.3 tiene una funcion en la homeostasis energetica y el balance energetico (Hum Mol Genet 2003 12: 551-9). Los ratones con el canal Kv1.3 geneticamente inactivados fueron capaces de ingerir dietas grasas sin ganar peso, mientras que los ratones de control a los que se les dio la misma dieta tuvieron sobre-peso. 15 El bloqueo farmacologico de los canales Kv1.3 recapitulo el efecto de los genes inactivados de los canales Kv1.3. En consecuencia, es probable que bloqueadores de Kv1.3 tengan uso en el manejo de la obesidad.
Canales Kv1.3 y Diabetes Mellitus tipo 2.
20 Los canales Kv1.3 tienen una funcion en el aumento regulado de la sensibilidad a la insulina en organos diana perifericos, tales como el idgado y los musculos (Proc Natl Acad Sci USA. 2004 101: 3112-7). La genetica inactivada del canal Kv1.3 en los ratones mejoro la sensibilidad del idgado y el musculo a la insulina. En consecuencia, los bloqueadores Kv1.3 pueden tener utilidad en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2 mejorando las acciones perifericas de la insulina, disminuyendo de esta manera los niveles de glucosa en sangre.
25
Polipeptidos de origen natural conocidos por inhibir los canales Kv1.3
El inhibidor Kv1.3 mas potente es el peptido ShK de la anemona de mar del Caribe Stichodactyla helianthus. ShK es 30 un polipeptido de 35 residuos entrecruzado por 3 puentes disulfuro. ShK bloquea Kv1.3 (Kd = 11 pM) y suprime la proliferacion de linfocitos Tem a concentraciones picomolares, y mejora la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratas inducida por la transferencia adoptiva de linfocitos Tem espedficos de mielina. Una desventaja potencial de ShK es su baja afinidad picomolar para el canal Kv1.1 neuronal (Kd 28 pM). Aunque no se observaron efectos secundarios con ShK en ensayos de EAE, la entrada de altas concentraciones de ShK en el cerebro, como 35 puede suceder cuando esta comprometida la barrera hematoencefalica en EM, puede conducir a una neurotoxicidad no deseada. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de inhibidores de Kv1.3 altamente espedficos. Un esfuerzo extenso por la industria farmaceutica y los grupos academicos ha producido varias moleculas pequenas que inhiben Kv1.3 en el rango medio-nanomolar, pero estos compuestos no tienen la selectividad o potencia para hacerlos candidatos a farmaco viables.
40
Se han indicado previamente varios analogos peptfdicos truncados de ShK. En uno de estos analogos de ShK, la secuencia nativa se trunco y despues se estabilizo por la introduccion de enlaces covalentes adicionales (un disulfuro no nativo y dos puentes lactama). En otros, los armazones estructurales no nativos estabilizados por disulfuro y/o puentes lactama se modificaron para incluir residuos aminoaddicos clave de la toxina nativa Estos 45 analogos de ShK muestran grados variables de actividad inhibidora de Kv1.3 y especificidad. Lanigan, M.D. y col.; Designed Peptide Analogues of the Potassium Channel Blocker ShK Toxin; Biochemistry, 25; 40(51): 15528-37 (Diciembre 2001).
Sigue habiendo necesidad en la tecnica del desarrollo de nuevos analogos de ShK que inhiban selectivamente los 50 canales Kv1.3 en linfocitos, con efectos inhibitorios mmimos o nulos en los canales Kv1.1 u otros canales de potasio.
SUMARIO DE LA INVENCION
La invencion se define en las reivindicaciones.
55
La presente invencion proporciona composiciones novedosas (denominadas en el presente documento como "analogos de ShK") que comprenden la toxina ShK unida (por ejemplo, ligada, unida por un enlazador o asociada de otro modo con) una entidad qmmica organica o inorganica (por ejemplo, un atomo, molecula, grupo, residuo, compuesto, resto, etc.), que tenga una carga anionica, como se define en las reivindicaciones.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ademas de acuerdo con la presente divulgacion, se proporcionan metodos para inhibir canales de potasio y/o tratar enfermedades o trastornos en sujetos humanos o animales, administrando al sujeto una cantidad eficaz de un analogo de ShK de la presente invencion. En algunas realizaciones, la entidad qmmica a la que se une la toxina de ShK puede seleccionarse para proporcionar la inhibicion selectiva de ciertos canales de potasio (por ejemplo canales Kv1.3) sobre otros canales de potasio (por ejemplo, canales Kv1.1).
Aun adicionalmente, de acuerdo con la presente invencion, los analogos de ShK del caracter anterior pueden incluir una etiqueta de fluoroforo y dichos analogos ShK etiquetados con fluoroforo de la presente invencion pueden usarse en citometna de flujo en solitario, o junto con tetrameros de clase ll que pueden detectar celulas autorreactivas.
Aspectos, elementos y detalles adicionales de la presente invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica tras la lectura de la descripcion detallada y los ejemplos expuestos a continuacion.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra las estructuras qmmicas de varios analogos de ShK de la presente invencion.
La figura 2A muestra un modelo molecular de ShK en base a la estructura de RMN publicada en la que Lys22, cntico para el bloqueo del canal, se resalta en un tono de gris. L-pTyr se unio al grupo a-amino de Arg1 de ShK (resaltado en un segundo tono de gris) a traves de un enlazador Aeea (derecha). Las estructuras del enlazador y L-pTyr se modelaron con AM1 en Hyperchem.
La figura 2B muestra el efecto de ShK (superior) y ShK(L5) (inferior) en corrientes de Kv1.3 y Kv1.1 en celulas transfectadas de forma estable.
La figura 2C muestra una inhibicion dependiente de la dosis de Kv1.3 (sfmbolos abiertos) y Kv1.1 (sfmbolos cerrados) por ShK (oscuro) y ShK(L5) (claro). Kd en Kv1.3 =10 + 1 pM (ShK) y 69 + 5 pM (ShK(L5)); Kd en Kv1.1 = 28 + 6 pM (ShK) y 7,4 + 0,8 nM (ShK(L5)).
La figura 2D muestra el transcurso de tiempo de absorcion y de lavado de ShK(L5) en Kv1.3 donde las celulas se mantuvieron a un potencial de retencion de 80 mV y se despolarizaron durante 200 ms a 40 mV cada 30 s.
La figura 2E muestra valores de Kd para la inhibicion de Kv1.3 y Kv1.1 por lo analogos de ShK. Kd para ShK-F6CA y ShK-Dap22 en base a las fuentes publicadas.
La figura 3A es un grafico que muestra las intensidades de tincion de CD45RA y CCR7 segun se determina por citometna de flujo en la poblacion regulada por CD3+ de PBMC humanas tenidas con anticuerpos contra CD3, CD45RA y CCR7.
La figura 3B es un grafico que muestra las intensidades de tincion de CD45RA y CCR7 segun se determina por citometna de flujo en la poblacion regulada por CD3+ en celulas de lmea Tem humana tenida con anticuerpos contra cD3, CD45RA y CCR7.
La figura 3C es un grafico que muestra los efectos inhibitorios de ShK (gris oscuro) y ShK(L5) (gris claro) de la incorporacion de [3H] timidina por las PBMC (sfmbolos abiertos, una mezcla de celulas indiferenciadas/linfocitos Tcm) y linfocitos Tem (sfmbolos cerrados) con estimulacion durante 48 horas con anticuerpo anti-CD3.
La figura 3D es una grafica que muestra las PBMC humanas activadas previamente (celulas indiferenciadas/linfocitos Tcm) que regulan por aumento la expresion de KCa3.1 que se vuelven resistentes a la inhibicion de ShK(L5) cuando se reactivan con el anticuerpo anti-CD3. Se ha indicado previamente que estas celulas se vuelven sensibles al inhibidor espedfico de Kca3.1 TRAM-34.
La figura 4A es un grafico que muestra la tincion con CD45RC de linfocitos T esplenicos de rata (izquierda) y linfocitos T PAS (derecha) detectados por citometna de flujo.
La figura 4B es un grafico que muestra las corrientes de Kv1.3 mostradas por linfocitos T PAS inactivos (superior) y activados por el antfgeno de mielina (inferior).
La figura 4c proporciona una representacion grafica de perfiles de citometna de flujo de tincion con ShK- F6CA en linfocitos T PAS inactivos (superior) y activados por antfgeno de mielina (inferior). Celulas no tenidas (lmeas de color negro) y celulas tenidas con ShK-F6CA (area rellena de color gris claro). La competicion de la tincion con ShK-F6CA por ShK(L5) no marcado se representa por el area rellena de color gris oscuro.
La figura 4D muestra imagenes confocales de la inmunotincion de Kv1.3 en linfocitos T PAS inactivos (superior) y activados con antfgeno de mielina (inferior). El analisis estadfstico se realizo usando la prueba U de Mann-Whitney.
La figura 4E muestra una inhibicion dependiente de la dosis por ShK (lmeas oscuras) y ShK(L5) (lmeas claras) de la incorporacion de [3H] timidina por celulas de rata (izquierda) indiferenciadas/linfocitos Tcm
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
(s^bolos abiertos) y linfocitos Tem (s^bolos cerrados) activados con Con A (1 |jg/ml).
La figura 4F muestra la inhibicion dependiente de la dosis por ShK (lmeas oscuras) y ShK(L5) (lmeas claras) de la secrecion de IL2 por los linfocitos T PAS 7 horas despues de la estimulacion con MBP. G, la inhibicion inducida por ShK(L5) de la incorporacion de [3H] timidina activada por el antigeno de mielina por los linfocitos T PAS (sfmbolos abiertos) se invierte por la adicion de 20 u/ml de IL2 (sfmbolos cerrados).
La figura 5A es un grafico que muestra la actividad de bloqueo de Kv1.3 de ShK(L5) segun se determina en los canales Kv1.3 expresada de forma estable en celulas L929.
La figura 5B es un grafico que muestra los niveles en sangre de ShK(L5) en diversos momentos despues de una unica inyeccion subcutanea de 200 mg/kg de ShK(L5) en cuatro ratas. Se extrajo sangre en los momentos indicados y el suero se ensayo por fijacion de membranas para determinar la cantidad de ShK(L5).
La figura 5C es un grafico de los datos de la figura 5B ajustados a un unico decaimiento exponencial que indica una semivida de aproximadamente 50 minutos.
La figura 5D es un grafico que muestra los niveles en sangre de ShK(L5) en cinco ratas Lewis que recibieron inyecciones subcutaneas diarias individuales de 10 jg/kg/dfa de ShK(L5) durante 5 dfas. Se extrajo sangre cada manana (24 horas despues de la inyeccion previa) y se ensayo para el bloqueo de la actividad en los canales Kv1.3 por fijacion de membranas.
La figura 5E es un grafico que muestra niveles en suero de ShK(L5) en ratas en diversos momentos tras una unica dosis de 10 mg/kg de ShK(L5) por via subcutanea (barras de color blanco; n = 4) o intravenosa (barras de color negro; n = 4). Se extrajo sangre en los momentos indicados y el suero se ensayo por fijacion de membranas para determinar la cantidad de ShK(L5) en sangre. ShK(L5) mantuvo un nivel en estado estable de 300 pM en la sangre casi 24 horas despues de una unica inyeccion subcutanea. Esta concentracion es suficiente para inhibir selectivamente la funcion de los linfocitos Tem.
La figura 5F es un grafico que muestra el % de recuperacion de ShK(L5) despues de anadir una dosis de hemi-bloqueo de ShK(L5) al plasma de rata o PBS que contema plasma de rata al 2 % y se incubo a 37 °C durante una duracion variable. Las almuotas se recogieron en los momentos indicados y la actividad de bloqueo se determino en los canales Kv1.3. ShK(L5) es extremadamente estable en plasma.
La figura 6A es un grafico que muestra la prevencion puntuada de EAE. Los linfocitos T PAS se activaron in vitro, se lavaron y se inyectaron por via intraperitoneal el dfa 0. Puntuacion clmica de EAE: 0 = sin signos clmicos, 0,5 = cola cafda distal, 1 = cola cafda, 2 = paraparesia o ataxia leve, 3 = paraparesia moderada, 4 = paralisis completa de las extremidades posteriores, 5 = 4 + incontinencia, 6 = muerte. A las ratas (n = 6/grupo) se les inyecto por via subcutanea vehmulo en solitario (n = 6) o ShK(L5) (n = 6; 10 mg/kg/dfa) del dfa 0 al dfa 5.
La figura 6B es un grafico que muestra el tratamiento puntuado de EAE. Los linfocitos T PAS se activaron in vitro, se lavaron y se inyectaron por via intraperitoneal el dfa 0. El tratamiento con ShK(L5) a 10 mg/kg/dfa se inicio cuando las ratas desarrollaron signos clmicos de EAE y se continuo durante 3 dfas.
La figura 6C es un grafico que muestra el espesor de la oreja como un indicador de la reaccion de DTH provocada frente a ovalbumina en ratas. Los animales (n = 6/grupo) se trataron con ShK(L5) 10 mg/kg/dfa durante 2 dfas, despues de lo cual se midio la hinchazon de la oreja. El analisis estadfstico se realizo usando la prueba U de Mann-Whitney.
La figura 7a muestra la estructura de ShK(L5) y un grafico que muestra la inhibicion de los canales Kv1.3 en linfocitos Tem en funcion de la concentracion de ShK(L5). Cada punto de datos representa la media de tres determinaciones.
La figura 7B es un diagrama de complejo de senalizacion que contiene Kv1.3.
La figura 7C muestra una co-localizacion de CD4, Kv1.3, Kvp2, SAP97, ZIP y p56lck en IS.
La figura 7D muestra la tincion de CD4 y Kv1.3 en ausencia de un contacto visible Tem-APC.
La figura 7E muestra la tincion de CD4 y Kv1.3 en linfocitos Tem espedficos de GAD65 expuestos a APC cargadas con MBP.
La figura 7F muestra que ShK(L5) 100 nM no impide la formacion de IS.
La figura 7G muestra que ShK(L5) 100 nM no interrumpe el IS.
La figura 8A es un grafico que muestra la senalizacion de calcio en linfocitos Tem espedficos de GAD de tres pacientes de DMT1 activados por anticuerpos secundarios de entrecruzamiento anti-CD3 + (flecha) en ausencia (negro) o presencia de ShK(L5) 0,1 nM (gris oscuro), 1 nM (gris medio) o 100 nM (gris claro).
La figura 8B es un grafico que muestra la incorporacion de [3H]-timidina por las celulas indiferenciadas/linfocitos Tcm y los linfocitos Tem (izquierda) y los efectores indiferenciados/TcM y efectores Tem de pacientes con DMT1 y AR (derecha). Linfocitos Tem: Clones de Tem activados por GAD65 de tres pacientes de DM T1 y linfocitos SF-Tem activados por el anticuerpo anti-CD3 de tres pacientes de AR. Celulas indiferenciadas/linfocitos Tcm: celulas diferenciadas de PB/linfocitos Tcm activadas por el anticuerpo anti-CD3 de los mismos tres pacientes de AR.
La figura 8C es una serie de graficos de barras que muestran la produccion de citocina por los linfocitos Tem y las celulas indiferenciadas/linfocitos Tcm usados en la figura 8B.
La figura 8D muestra el fenotipo de los linfocitos T autorreactivos relevantes a la enfermedad e irrelevantes a la enfermedad en EM, DM T1 y AR.
5 La figura 8E es un diagrama que muestra la manera en la que ShK(L5) inhibe la senalizacion de calcio, la
proliferacion de linfocitos y la produccion de citocina, pero no la formacion de IS.
La figura 9 es un diagrama que representa un modelo de rata de hipersensibilidad de tipo tardfo (DTH) provocada por linfocitos T de memoria efectora.
La figura 10 es un diagrama que muestra un protocolo de tratamiento para ShK(L5) en un modelo de rata 10 de hipersensibilidad de tipo tardfo (DTH) provocada por linfocitos T de memoria efectora
La figura 11 es un diagrama que representa la supresion espedfica de respuestas de memoria efectora in vivo en ratas mediante ShK(L5) sin interrumpir la funcion de los linfocitos T o los linfocitos B indiferenciados y de memoria central.
La figura 12A muestra corrientes de Kv1.3 (superior) y el numero de canal/celula (inferior) en linfocitos T 15 espedficos de GAD65, insulina y mielina de pacientes con diabetes mellitus tipo 1 (DMT1) de nueva
aparicion, controles sanos y pacientes con esclerosis multiple.
La figura 12B muestra la intensidad de tincion de Kv1.3 (superior) y de fluorescencia de linfocitos T individuales (inferior) de estos pacientes.
La figura 12C muestra graficos del numero de celulas relativo frente la intensidad de tincion de CCR7. Las 20 celulas que expresan altos niveles de Kv1.3 son negativas a CCR7, es decir, son TEM-efectores. Las celulas
que expresan bajos niveles de Kv1.3 son positivas a CCR7, es decir no celulas indiferenciadas o linfocitos
Tcm
La figura 12D muestra el numero de Kv1.3/celula en linfocitos T autorreactivos de un paciente que tiene DMT1 y EM (izquierda), pacientes que han tenido DMT1 durante mas de 5 anos (centro) y pacientes que 25 tienen DM tipo 2 no autoinmune.
La figura 12E muestra los numeros de Kv1.3 en linfocitos T CD4+GAD65-tetramero+ de un paciente con DM T1 de nueva aparicion.
La figura 13A muestra los numeros de canal Kv1.3 por celula en linfocitos T de sangre periferica y linfocitos T de lfquido sinovial de pacientes de AR y linfocitos T de lfquido sinovial de pacientes de OA.
30 La figura 13B muestra imagenes confocales de tincion de Kv1.3 (gris claro) y Kvp2 (gris oscuro) en las
celulas mostradas en la figura 13A.
La figura 13C muestra graficos del numero de celulas relativo frente la intensidad de tincion de CCR7.
La figura 13D muestra micrograffas (superior) y graficos de barras del mdice inflamatorio (inferior) del sinovio de pacientes de AR y OA con tincion de anticuerpos anti-CD3 o anti-Kv1.3 y contra-tincion con 35 hematoxilina/eosina (40X)
DESCRIPCION DETALLADA
La siguiente descripcion detallada y los dibujos adjuntos pretenden describir algunos, pero no necesariamente todos, 40 los ejemplos o realizaciones de la invencion unicamente. Esta descripcion detallada y los dibujos adjuntos, no limitan el alcance de la invencion de ningun modo.
La presente invencion proporciona analogos novedosos de ShK como se define en las reivindicaciones. La divulgacion proporciona metodos para preparar dichas composiciones y metodos para utilizar dichas composiciones 45 para inhibir los canales Kv1.3 (u otros canales de iones) en celulas humanas o animales y para el tratamiento o prevencion de enfermedades y trastornos, tales como trastornos autoinmunes mediados por linfocitos T. Las composiciones de la presente invencion comprenden la toxina ShK unida (por ejemplo, conectada, unida por enlazador o asociada de otra forma) a un residuo aminoaddico con carga anionica organico o inorganico. En la invencion, la entidad qmmica de carga anionica, organica o inorganica, se selecciona para aumentar u optimizar la 50 afinidad de la composicion para la inhibicion de canales Kv1.3 sobre canales Kv1.1.
De acuerdo con la presente invencion, algunos ejemplos no limitantes de composiciones de la presente invencion, en las que la entidad qmmica con carga anionica comprende un residuo aminoaddico, se muestran en las figuras 1 y 2E y se hacen referencia en el presente documento por designaciones alfanumericas, como se muestra en la 55 Tabla 1 que se indica a continuacion:
Tabla 1
DESIGNACION
RESIDUO AMINOACIDICO UNIDO A ShK EN LA POSICION 2
ShK-L1
AEEAc-L-Pmp(OH2)
ShK-D1
AEEAc-D-Pmp(O2)
ShK-D2
AEEAc-D-Pmp(OH, Et)
ShK-L3
AEEAc-L-Pmp(Et2)
ShK-D3
AEEAc-D-Pmp(Et2)
ShK-L4
AEEAc-L-Tyr
ShK-L5
AEEAc-L-Tyr(POa H2)
ShK-L7
AEEAc-L-Phe(p-CO2H)
Con referencia espedfica a la figura 1, tirosina o fenilalanina o sus derivados no naturales cargados se conjugaron a ShK (izquierda superior) a traves de un enlazador unido en su extremo N (residuo Arg1 mostrado en gris 5 sombreado). El Lys22, que se requiere para bloqueo de canal, se ilustra en un tono mas oscuro de gris. El modelo molecular de ShK se basa en la estructura de RMN publicada, y las estructuras del enlazador y los nuevos residuos se modelaron. Estas realizaciones de composiciones de la presente invencion comprende generalmente la toxina ShK, que es un polipeptido, unido a (por ejemplo, unido qmmicamente, enlazado o asociado de otra forma) al menos un residuo aminoaddico de carga anionica. En realizaciones en las que el residuo aminoaddico tiene un centro 10 quiral, puede usarse el enantiomero D y/o L de dicho residuo aminoaddico. El residuo aminoaddico de carga anionica puede ser un residuo no natural y puede unirse o enlazarse a un extremo N del polipeptido ShK. En algunas realizaciones, el residuo aminoaddico de carga anionica puede unirse a un extremo N de ShK a traves de un enlazador, tal como un enlazador aminoetiloxietiloxi-acetilo. Estos analogos de ShK inhiben el canal Kv1.3 mas espedficamente que ShK debido a que tienen una afinidad reducida para otros canales de potasio (por ejemplo, 15 Kv1.1). El ShK puede aislarse a partir de fuentes naturales como se conoce en la tecnica, o puede sintetizarse.
Sintesis de la toxina ShK
La toxina ShK puede sintetizarse mediante cualquier metodo adecuado. En uno de dichos metodos, los aminoacidos 20 Fmoc (Bachem Feinchemikalien), incluyendo Arg(Pmc), Asp(OtBu), Cys(Trt), Gln(Trt), His(Trt), Lys(Boc), Ser(tBu) y Thr(tBu) se obtienen en el mercado y se ensamblan para formar la toxina ShK. El ensamblaje por etapas de los aminoacidos puede realizarse en un sintetizador peptfdico Applied Biosystems 431A a la escala 0,25 mmol partiendo de Fmoc-Gys(Trt)-R. Los residuos 34 a 22 se acoplan individuales. Posteriormente, una alfcuota (por ejemplo, la mitad) de la resina se elimina para realizar un mejor mezclado. El resto de secuencia peptfdica se acopla 25 doblemente a la alfquota de resina restante. Todos los acoplamientos estan mediados por diciclohexilcarbodiimida en presencia de 2 equiv. de 1-hidroxibenzotriazol. Los dos residuos finales tambien se acoplan a traves de la qmmica HBTU/DIEA. Estos residuos son Aeea (Fmoc-acido aminoetiloxietiloxiacetico) y como el residuo N-terminal Fmoc-Tyr (PO4) monobencil ester. Tras la eliminacion final del grupo Fmoc, la resina peptfdica (2,42 g) se escinde en la resina y se desprotege simultaneamente usando reactivo K durante 2 h a temperatura ambiente. El reactivo K 30 se conoce en la tecnica y se ha descrito en la bibliograffa. Vease, King, D.S., Fields, C.G. y Fields, G.B. (1990) Int. J. Peptide Protein Res. 36, 255-266. Tras la escision, el peptido se filtra para eliminar las perlas de resina gastadas y se precipita con eter dietflico enfriado con hielo. Despues, el peptido se recoge en un embudo de filtro fino, se lava con eter enfriado con hielo y finalmente se extrae con AcOH al 20 % en H2O. El extracto peptfdico se diluye posteriormente en 2 litros de H2O, el pH se ajusta a 8,0 con NH4OH y se deja oxidar al aire a temperatura ambiente 35 durante 36 horas. Tras la oxidacion de los enlaces disulfuro con una relacion 2:1 de glutation reducido con respecto a oxidado, la solucion peptfdica se acidifica a pH 2,5 y se bombea sobre una columna Rainin Dynamax C18 (5,0 x 30 cm). La muestra se eluye con un gradiente lineal de acetonitrilo al 5-30 % en H2O que contiene TFA al 0,1 %. Las fracciones resultantes se analizan usando dos sistemas RP-HPLC analfticos: TFA y TEAP. Las fracciones puras se combinan y se liofilizan. (Vease, Pennington, M.W., Byrnes, M.E., Zaydenberg, I., Khaytin, I., de Chastonay, J., 40 Krafte, D., Hill, R., Mahnir, V., Volberg, W.A., Gorczyca, W. y Kem, W.R. (1995) Int. J. Peptide Protein Res. 46, 354358).
Como alternativa, puede utilizarse una sintesis peptfdica de fase solida empleando una estrategia de grupo protector Boc-Bzl para ensamblar la estructura primaria, asf como analogos del peptido. Despues, el peptido puede escindirse 45 en la fase solida por HF anhidro, produciendo el peptido lineal listo para el plegado como se ha descrito anteriormente para el peptido sintetizado Fmoc. (Vease, Stewart, J.M. y Young J.D. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis. 2a Edicion. Pierce Chemical Company. Rockford, II.)
Como alternativa, otros metodos sinteticos para ensamblar la estructura primaria de ShK o analogos puede incluir tecnolog^a de ligado qmmico donde el peptido se prepara como una serie de fragmentos disenados con peptidos tioester C-terminal. El peptido tioester puede reaccionar con otro peptido que contiene un residuo Cys N-terminal para formar un peptido que contiene un enlace peptfdico nativo. Usando esta tecnologfa, se puede ensamblar de 5 forma eficaz la estructura primaria de ShK (vease, (4) Wilken, J. y Kent S.B.H. (1998) Chemical protein synthesis. Current Opin. Biotech. 9, 412-426.)
Como alternativa, otro metodo sintetico que puede emplearse para ensamblar la estructura primaria de ShK utilizara un enfoque convergente de fragmento peptfdico protegido como se describe en Albericio, F., Lloyd-Wlliams, P., y 10 Giralt, E. (1997) Convergent peptide synthesis; en Methods Enzymol. Ed G. Fields, Academic Press, Nueva York, NY. pags. 313-335. En este metodo, los fragmentos protegidos lineales se ensamblan como fragmentos protegidos de cadena lateral completa. Estos fragmentos pueden entonces acoplarse en conjunto de una forma convergente para ensamblar la secuencia primaria de ShK o uno de sus analogos. El ensamblaje de los fragmentos puede tambien utilizar una resina de fase solida para facilitar las etapas de acoplamiento y lavado.
15
Como alternativa, pueden usarse metodos recombinantes en los que la secuencia de codificacion ADNc para ShK puede generarse para la expresion en un sistema de expresion procariota o eucariota. Tambien son posibles analogos de ShK recombinantes que contienen amino acidos no naturales utilizando moleculas de ARNt precargadas que utilizan codones no estandar. La construccion ADNc puede disenarse para utilizar uno de estos 20 codones sin utilizar para anadir el residuo fosfotirosina, asf como el residuo Aeea. El plegado del analogo de ShK producido de forma recombinante puede realizarse entonces en un metodo similar al usado para los peptidos sinteticos. (Vease, Pennington, M.W., Byrnes, M.E., Zaydenberg, I., Khaytin, I., de Chastonay, J., Krafte, D., Hill, R., Mahnir, V., Volberg, W.A., Gorczyca, W. y Kem, W.R. (1995) Int. J. Peptide Protein Res. 46, 354-358).
25 Union de residuos aminoacidicos anionicos a ShK y modificaciones opcionales en ShK
Los residuos aminoacidicos anionicos pueden unirse al extremo N de la toxina ShK natural o sintetica por medio de un enlazador, tal como un enlazador aminoetiloxietiloxi-acetilo, o mediante cualquier otro medio adecuado. En este ejemplo, se preparan los nueve (9) analogos de ShK mostrados en la figura 1. Inicialmente, Fmoc-Aeea-OH se 30 acopla al extremo N de la toxina ShK sintetica ensamblada como se ha descrito anteriormente. Despues, la resina se divide en 9 alfcuotas. Fmoc-Tyr(PO4Bzl)-OH, Fmoc-d-Tyr(PO4Bzl)-OH. Fmoc-Tyr(PO4Me2)-OH, Fmoc-Pmp-OH, Fmoc-d-Pmp-OH, Fmoc-Pmp(Et)-OH, Fmoc-Pmp(Et)2-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, o Fmoc-Amp(Boc)-OH se acopla entonces usando DIC y HOBT a una de las alfcuotas de resina. Despues, la resina peptfdica desbloqueada se escinde y se desprotege con reactivo K (King y col., 1990) que contiene triisopropilsilano al 5 % durante 2 h a TA. 35 Met(O) se reduce por la adicion de NH4l solido al coctel de escision en t-15min. (Nicolas y col., 1995). Para el peptido que contiene Tyr(PO4Me2)-OH, se uso un coctel de escision que contema TMSBr 1 M en TFA que contema tioanisol como eliminador durante 18 h a 4 °C (Tian y col., 1993). La eliminacion incompleta de los grupos protectores metilo es comun al usar este metodo y dos de las especies (Tyr(PO4) y Tyr(PO4Me)) se purifican facilmente por RP-HPLC. El analogo que contiene Tyr(PO4Me2) se escinde a traves de escision con reactivo K 40 convencional manteniendo ambos grupos Me intactos en cada caso, la mezcla de escision se filtra y el peptido en bruto se precipita en eter dietflico enfriado con hielo. El precipitado se recoge, produciendo aproximadamente 75 mg de peptido de 200 mg de resina. El producto en bruto se disuelve en 20 ml de AcOH acuoso al 50 % y se diluye en 0,75 I de H2O. El pH de la solucion se ajusta con NH4OH a 8,2, y se dejo plegarse durante una noche con la adicion de glutation (2 mM:1 mM) (reducido:oxidado). Todos los analogos se purifican usando RP-HPLC como se ha 45 descrito previamente (Pennington y col., 1995; Pennington y col., 1996a; Pennington y col., 1996b). Las fracciones puras se combinan y se liofilizan. Cada muestra se confirma por RP-HPLC, AAA y MALDI-TOF SM y se ajusta para justificar el contenido peptfdico antes del bioensayo.
En algunas realizaciones de la invencion, para mejorar las propiedades PK/PD de la estructura de ShK, los residuos 50 que son sensibles a propiedades de degradacion pueden reemplazarse o sustituirse. Por lo tanto, la sustitucion del residuo Met en la posicion 21 puede realizarse para impartir un efecto estabilizante a la oxidacion. Adicionalmente, la sustitucion de la funcion acido C-terminal con una amida, impartira estabilidad a las enzimas carboxipeptidasa C- terminal. Estas dos sustituciones a la estructura primaria de ShK combinadas con el resto anionico en el extremo N se han sintetizado para generar el bloqueador de Kv1.3 mas estable y selectivo. Las sustituciones fosfato no 55 hidrolizables tambien impartiran un efecto estabilizante contra la hidrolisis de acido y basica del fosfato, asf como estabilidad contra enzimas fosfatasa. Las sustituciones se resumen a continuacion. Los acronimos usados son como se definen a continuacion: Pmp = p-fosfonometil-Fenilalanina; y Nle = Norleucina.
Sustituciones:
p-fosfo-Tyr-Aeea-ShK-Nle21-Cys35-amida p-Fosfono-metil-Fenilalanina-Aeea-ShK-Nle21-Cys35amida (Pimp)
5 p-Fosfatitil-Phe-Aeea-ShK-NIe21-Cys35-amida (Ppa)
p-fosfo-Tyr-Aeea-ShK-Nle21 -Cys35-acido p-Fosfono-metil-Fenilalanina-Aeea-ShK-Nle21-Cys35acido (Pmp) p-Fosfatitil-Phe-Aeea-ShK-Nle21-Cys35-acido (Ppa)
10 Ademas de la Pmp y Ppa no hidrolizables, la sustitucion de p-Fosfono(difluoro-metil)-Fenilalanina (Pfp) y p-Fosfono- metilceto-Fenilalanina (Pkp) son tambien sustituciones anionicas, con la siguiente condicion:
Pfp-Aeea-Shk-Nle21 Cys35 amida Pkp-Aeea-ShK-Nle21-Cys35 amida 15 Pfp-Aeea-Shk-Nle21 Cys35 acido
Pkp-Aeea-ShK-Nle21-Cys35 acido
Las estructuras de las sustituciones N-terminales se exponen en el Apendice B. Otras estructuras que estan dentro del alcance de la presente invencion se publican en Beeton, C. y col., Targeting Effector Memory T Cells with a 20 Selective Peptide Inhibitor of Kv1.3 Channels for Therapy of Autoimmune Diseases, Molecular Pharmacology, Vol. 67, No.4, 1369- (2005), una copia completa del cual se ajunta a la presente como Apendice C.
Usos terapeuticos de analogos de ShK de la presente invencion
25
30
35
40
La presente divulgacion proporciona metodos para tratar o prevenir ciertos trastornos o enfermedades, tales como trastornos mediados por linfocitos T (por ejemplo, trastornos autoinmunes, enfermedad de injerto contra huesped, prevencion de rechazo de trasplantes de organos, etc.), otros trastornos inflamatorios, obesidad y diabetes tipo 2, en sujetos humanos o animales administrando al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz (por ejemplo, preventiva o eficaz para reducir o eliminar smtomas o el avance de la enfermedad) de una preparacion farmaceuticamente aceptable que consiste o comprende un analogo de ShK de la presente invencion (por ejemplo, incluyendo, pero sin limitacion, los enumerados en la Tabla 1 anterior). Puede usarse cualquier ruta adecuada de administracion (por ejemplo, oral, rectal, intravenosa, intramuscular, subcutanea, intradermica, intranasal, topica, transmucosa, transdermica, por implante de administracion de farmaco, etc.). Cuando se utiliza para prevenir o tratar un trastorno mediado por linfocitos T, la dosificacion o dosificaciones seran suficientes para inhibir los canales Kv1.3 en las membranas de linfocitos T. A este respecto, los analogos de ShK de la presente invencion tienen el potencial de usarse para prevenir o tratar una amplia diversidad de trastornos autoinmunes mediados por linfocitos T. Los siguientes son algunos ejemplos de algunas enfermedades autoinmunes mediadas por linfocitos T que pueden prevenirse o tratarse por los metodos de la presente invencion, categorizados con respecto al organo diana que se afecta principalmente por cada una de dichas enfermedades:
Sistema nervioso:___________________________
Esclerosis multiple Miastenia gravis
Neuropatfas autoinmunes, tales como Guillain-Barre
Uveitis autoinmune Sangre:
Anemia hemolftica autoinmune Anemia perniciosa Trombocitopenia autoinmune
Vascular:
Arteritis temporal Smdrome antifosfolfpido
Vasculitis, tales como granulomatosis de Wegener y de Behcet
Tracto gastrointestinal:_____________________
Enfermedad de Crohn Colitis ulcerosa Cirrosis biliar primaria Hepatitis autoinmune
Resorcion osea asociada a enfermedad
periodontal
Endocrino:
Diabetes mellitus tipo 1 Enfermedad de Addison Enfermedad de Grave Tiroiditis de Hashimoto
Ooforitis y orquitis autoinmune
Multiples_____organos_____y/o sistema
musculoesqueletico:
Artritis reumatoide (AR)
Osteoartritis (OA)
Piel: Lupus eritematoso sistemico
Psoriasis Escleroderma
Dermatitis herpetiforme Polimiositis, dermatomiositis
Penfigo vulgar Espondiloartropatias, tal como espondilitis
Vitiligo anquilosante
Smdrome de Sjogren
Independientemente del organo u organos particulares afectados, se cree que los linfocitos T contribuyen al desarrollo de enfermedades autoinmunes. Las terapias actualmente disponibles para estas enfermedades son sustancialmente insatisfactorias y tipicamente implican el uso de glucocorticoides (por ejemplo metilprednisolona, 5 prednisona), agentes antiinflamatorios no esteroideos, sales de oro, metotrexato, antimalaricos, y otros inmunosupresores, tales como ciclosporina y FK- 506. Ademas, otro trastorno mediado por linfocitos T que puede prevenirse o tratarse por los metodos de la presente invencion es la enfermedad de injerto contra huesped y/o
rechazo de organos trasplantados. De hecho, los resultados de los procedimientos de trasplante de organos han
mejorado progresivamente con el desarrollo de refinamiento en el tipado tisular, tecnicas quirurgicas y tratamientos 10 inmunosupresores mas eficaces. Sin embargo, el rechazo de organos trasplantados permanece como un problema principal. Los linfocitos T tienen una funcion principal en la respuesta inmune y son responsables, en gran medida, del rechazo de muchos organos trasplantados. Tambien son responsables de la enfermedad denominada injerto contra huesped, en la que las celulas de medula osea trasplantadas reconocen y destruyen tejidos del huesped no apareados a MHC. Por consiguiente, se usan farmacos tales como ciclosporina y FK506 que suprimen la inmunidad 15 de los linfocitos T para prevenir el rechazo de trasplante y la enfermedad de injerto contra huesped.
Desafortunadamente, estos farmacos que inhiben los linfocitos T son toxicos, limitando su uso las toxicidades
hepaticas y renales. Por lo tanto, los metodos de la presente invencion pueden proporcionar alternativas menos toxicas para el tratamiento o prevencion de enfermedad de injerto contra huesped o rechazo de trasplante. Ademas, se ha mostrado que los inhibidores del canal de potasio Kv1.3 regulado por voltaje son especialmente eficaces en la 20 supresion de linfocitos T de memoria efectora y, por lo tanto, los metodos de la presente invencion pueden ser particularmente eficaces para prevenir o tratar enfermedades que se asocian a los linfocitos T de memoria efectora tales como: resorcion osea y enfermedad periodontal, psoriasis, artritis reumatoide, diabetes mellitus y esclerosis multiple. Ademas de enfermedades mediadas por linfocitos T, se ha determinado que el canal Kv1.3 regula la homeostasis energetica, el peso corporal y la sensibilidad a la insulina periferica. Por lo tanto, los metodos de la 25 presente divulgacion pueden usarse para tratar otras enfermedades y trastornos que implican una homeostasis, peso corporal y sensibilidad de insulina periferica anormales inhibiendo los canales Kv1.3 en membranas celulares, tales estas otras enfermedades y trastornos incluyen, pero no se limitan necesariamente a, resorcion osea en enfermedad periodontal, diabetes tipo 2, smdrome metabolico y obesidad.
30 Uso de analogos de ShK de la presente invencion en citometria de flujo
Ademas, de acuerdo con la presente divulgacion, se proporcionan metodos para diagnosticar trastornos mediados por linfocitos T o clasificados de otra forma o que se distinguen entre diversos tipos de celulas in vitro usando versiones etiquetadas con fluoroforo de ShK(L5) para su uso en citometna de flujo en solitario, o junto con 35 tetrameros de clase II que pueden detectar celulas autorreactivas. La citometna de flujo es un metodo flexible para caracterizar celulas en suspension en el que se usa clasificacion de celulas activadas por fluorescencia para seleccionar celulas vivas en base a las caractensticas medidas por citometna de flujo. Los tipos de caractensticas y funciones celulares que pueden detectarse por citometna de flujo incluyen la expresion de protemas fuera y dentro de las celulas, el tipo de contenido de ADN, la viabilidad y la apoptosis, la actividad de bomba de resistencia a 40 multiples farmacos, la actividad enzimatica, la activacion de linfocitos T, la especificidad de receptor de linfocitos T, la expresion de citocina, la fagocitosis y la actividad de rafaga oxidativa. Por lo tanto, en este metodo de la presente divulgacion, el residuo aminoaddico unido al ShK puede incorporar una etiqueta de fluoroforo para su uso en citometna de flujo en solitario, o junto con tetrameros de clase II cargados con autoantigenos espedficos que pueden detectar celulas autorreactivas. Las descripciones espedficas de los metodos por los que dicha citometna 45 de flujo puede realizarse se describen en Beeton, C., y col., A Novel Fluorescent Toxin to Detect and Investigate Kv1.3 Channel Up-Regulation in Chronically Activated T Lymhocytes; J. Biol. Chem., Vol. 278, N° 11, 9928-9937 (Marzo de 2003). En general, un citometro de flujo usa luz laser enfocada para iluminar celulas segun pasan el haz laser en una corriente fluida. La luz dispersada por las celulas y la luz emitida por los colorantes fluorescentes unidos a las celulas de interes, se analizan por varios detectores y se procesan por un ordenador. Las celulas pueden
distinguirse y seleccionarse en base al tamano y forma, asf como por la presencia de muchas moleculas diferentes dentro y en la superficie de las celulas.
Ejemplos de efectos de inhibicion del canal de potasio y utilidad terapeutica de analogos de ShK de la 5 presente invencion
ShK bloquea el canal Kv1.1 neuronal y el canal Kv1.3 con una potencia aproximadamente equivalente. Por lo tanto, la neurotoxicidad es una preocupacion bajo las circunstancias que compromete la barrera hematoencefalica y permite la entrada de cantidades suficientes de ShK para bloquear los canales Kv1.1. La estrategia para disenar un 10 inhibidor espedfico de Kv1.3 se guio por el hallazgo de que fluorescema-6-carboxilato (F6CA) que contiene ShK- F6CA unido a traves de un enlazador Aeea de 20 A de largo al extremo N de ShK mostro 80 veces de selectividad para Kv1.3 sobre Kv1.1 (Beeton y col., 2003). Dado que F6CA puede existir como un carboxilato restringido o tambien como una lactona ciclada, no estaba claro si la especificidad a Kv1.3 de ShK-F6CA se debio a la carga negativa de F6CA, la hidrofobicidad creada por este nucleo de fluorescema voluminoso grande, el apilamiento 15 electronico p planar potencial, o una combinacion de todas estas contribuciones potenciales. Para distinguir entre estas posibilidades y con la intencion de desarrollar un inhibidor selectivo a Kv1.3 no fluorescente, se genero una serie de 12 analogos de ShK N-terminalmente sustituidos para probar algunas de estas interacciones. Uniendo tirosina, fenilalanina o sus derivados (variables en carga, tamano e hidrofobicidad) a traves de un enlazador Aeea al extremo N de ShK, se pudo probar los efectos de carga e hidrofobicidad para comprender mejor la mejora de 20 selectividad observada con la sustitucion de F6CA.
Inhibicion selectiva de KV\v1.3 sobre la inhibicion de Kv1.1:
En el ejemplo mostrado en las figuras 2A-2D, L-fosfotirosina (L-pTyr), un aminoacido aromatico modificado post- 25 traduccionalmente negativamente cargado (carga neta 2), se unio a traves del enlazador AEEA a ShK-Arg1 para generar el analogo ShK(L5) novedoso. La toxina ShK y ShK(L5) se ensayaron en los canales Kv1.3 y Kv1.1 expresados de forma estable en celulas L929. La figura 2B muestra los efectos de ShK u ShK(L5) sobre las corrientes de Kv1.3 y Kv1.1 provocadas por pulsos de despolarizacion de 200 ms de un potencial de retencion de 80 mV a 40 mV. Ambos peptidos bloquearon de forma reversible Kv1.3 y Kv1.1 de una manera dependiente de la 30 dosis con coeficientes de Hill de 1. Kd se determinaron a partir de las curvas dosis-respuesta mostradas usando el software Microcal Origin. ShK bloqueo Kv1.3 (Kd =10 + 1 pM) y Kv1.1 (Kd = 28 + 6 pM) con una potencia aproximadamente equivalente segun se espero (figura 1C). Por el contrario, ShK(L5) fue selectivo 100 veces para Kv1.3 (Kd = 69 + 5 pM) sobre Kv1.1 (Kd = 7,4 + 0,8 nM) (figuras 1B, 1C). El transcurso de tiempo del bloqueo de corriente de Kv1.3 por ShK(L5) y su lavado se muestra en la figura 1D. La constante temporal (Ton) de la absorcion 35 de ShK(L5) fue 131 + 21 s (n = 7), mientras que la constante temporal (Toff) para el lavado peptfdico fue 150 + 28 s (n = 4). La Kd (57 + 7 pM) calculada a partir de los valores de Kon (15 x 106 + 0,5 x 106 M'1s'1) y Koff (0,0059 + 0,0013 s-1) es coherente con la Kd (69 + 5 pM) determinada con el software Microcal Origin.
Tambien se ensayaron otros analogos de ShK en los canales Kv1.3 y Kv1.1. ShK(D5) que contema D-fosfotirosina 40 (D-pTyr) fue selectivo 35 veces para K1.3 sobre Kv1.1, pero fue de un orden de magnitud menos potente que ShK(L5). ShK(L6) que contema L-pTyr-monometilo mostro una especificidad de Kv1.3 mas modesta (11 veces), mientras que los analogos de ShK que conteman L-pTyr-dimetilo o L-Tyr no fueron selectivos para Kv1.3 sobre Kv1.1. Los analogos que conteman fenilalanina o sus derivados (variables en masa entera, densidad de p electrones y carga) fueron moderadamente espedficos o no espedficos para Kv1.3 sobre Kv1.1. La especificidad de 100 veces 45 de ShK(L5) para Kv1.3 sobre Kv1.1 es mayor que la de ShK-F6CA (80 veces), ShK(D5) (35 veces), ShK-Dap22 (33 veces) o cualquier otro analogo de ShK ensayado.
Los Solicitantes tambien evaluaron la especificidad de ShK(L5) en un panel de 20 canales ionicos y estos datos se resumen en la siguiente Tabla 2:_________________________________________________
Canales
Kd de ShK(L5) TpMl
Kv1.1
7.000 + 1.000
Kv1.2
48.000 + 7.000
Kv1.3 (clonado)
69 + 5
Kv1.3 (nativo)
76 + 8
Kv1.4
137.000 + 3.000
Kv1.5
100.000 sin efecto
Kv1.6
18.000 + 3.000
Kv1.7
100.000 sin efecto
Kv2.1
100,000 sin efecto
Kv3.1
100.000 sin efecto
Kv3.2
20.000 + 2.000
Kir2.1
100.000 sin efecto
Kv11.1 (HERG)
100.000 sin efecto
Kca.1.1
100.000 sin efecto
Kca2.1
100.000 sin efecto
Kca2.3
100.000 sin efecto
Kca3.1
115.000 + 5.000
Nav1.2
100.000 sin efecto
Nav1.4
100.000 sin efecto
Canal CT de linfocitos T activado por hinchazon
100.000 sin efecto
Cav1.2
100.000 sin efecto
Como puede apreciarse a partir de los datos de la Tabla 2 anterior, ShK(L5) bloqueo el canal Kv1.3 en los linfocitos T con una Kd (76 pM) equivalente a su Kd en el canal clonado (69 pM). Fue selectivo 100 veces para Kv1.3 sobre Kv1.1, selectivo 260 veces sobre Kv1.6, selectivo 280 veces sobre Kv3.2, selectivo 680 veces sobre Kv1.2 y 5 selectivo >1000 veces sobre todos los demas canales ensayados. Mayormente, fue selectivo para Kv1.3 1600 veces sobre KCa3.1, el canal de K+ activado por calcio que regula la activacion de las celulas indiferenciadas y los linfocitos Tcm humanos (Wulff y col., 2003). El ShK nativo fue menos selectivo que ShK(L5). ShK fue selectivo 2,8 veces para Kv1.3 (Kd = 10 + 1 pM) sobre Kv1.1 (Kd 28 + 6 pM), selectivo 20 veces sobre Kv1.6 (200 + 20 pM), 500 veces selectivo sobre Kv3.2 (Kd = 5,000 + 1,000 pM), y >1000 veces selectivo sobre Kv1.2 (10 + 1 nM) y KCa3.1 (Kd 10 = 28 + 3 nM). Margatoxina, un peptido procedente del veneno de escorpion que se ha promocionado como un inhibidor de Kv1.3 espedfico (Koo y col., 1997; Lin y col., 1993; Middleton y col., 2003) tambien fue no espedfica. Fue 5 veces selectivo para Kv1.3 (110 + 12 pM) sobre Kv1.2 (Kd =520 + 1 pM), 9 veces selectivo sobre Kv1.1 (10 + 1 nM) y >1000 veces selectivo sobre Kv1.6 y Kv3.2 (Kd >100 nM). Luteolina, un nutraceutico vendido para enfermedades autoinmunes (
www.lutimax.com) sobre la base de que es un inhibidor de Kv1.3 (Lahey y 15 Rajadhyaksha, 2004), bloqueo Kv1.3 debilmente (Kd = 65 + 5 mM) y no mostro ninguna selectividad sobre Kv1.1 (Kd=77 + 5 mM), Kv1.2 (Kd = 63 + 4 mM) o Kv1.5 (Kd = 41 + 3 mM). La exquisita especificidad de ShK(L5) para Kv1.3 junto con su afinidad picomolar para el canal le hace un inmunosupresor potencialmente atractivo.
Supresion preferencial de proliferacion de linfocitos Tem humanos
20
Con referencia a las figuras 3A-3D, para evaluar la actividad inmunosupresora in vitro de ShK(L5), los Solicitantes compararon su capacidad de suprimir la proliferacion estimulada por el anticuerpo anti-CD3 de lmeas de linfocitos TEm humanos frente a PBMC humanas que contienen una mezcla de celulas indiferenciadas y linfocitos Tcm. La citometna de flujo confirmo los fenotipos de la superficie celular de las dos poblaciones estudiadas. Como se 25 observa en la figura 3A, las lmeas Tem fueron >90 % de CCR7"CD45RA, mientras que como se muestra en la figura 3B, las PBMC conteman un 65 % de celulas CCR7+CD45RA+ (indiferenciadas) y un 18 % de CCR7+CD45RA" (Tcm). La figura 3C muestra que ShK(L5) y ShK eran 60 veces mas eficaces en la supresion de la proliferacion de linfocitos Tem (CI50 = ~80 pM) en comparacion con los PBMC (CI50 = 5 nM, p < 0,05). La sensibilidad inferior de las PBMC puede explicarse por una rapida regulacion por aumento de los canales KCa3.1 en las celulas indiferenciadas y los 30 linfocitos Tcm tras la estimulacion como se ha indicado previamente (Ghanshani y col., 2000; Wulff y col., 2003). De acuerdo con esta interpretacion, las PBMC activadas durante 48 horas para regular por aumento la expresion de KCa3.1, despues en reposo durante 12 horas, y activadas de nuevo con anticuerpo anti-CD3 fueron completamente resistentes al bloqueo de ShK(L5), como se muestra en la fila superior de la figura 3D. Las PBMC que se habfan suprimido por ShK(L5) durante la primera ronda de estimulacion mostraron una resistencia identica a ShK(L5) 35 cuando las celulas se lavaron, reposaron y se estimularon de nuevo con el anticuerpo anti-CD3. Estos resultados corroboran los estudios anteriores indicando que las celulas indiferenciadas y los linfocitos Tcm escapan de los inhibidores de Kv1.3 por la regulacion por aumento de los canales KCa3.1. Por lo tanto, ShK(L5) suprime preferiblemente y de forma persistente la proliferacion de linfocitos Tem.
40 Supresion preferencial de proliferacion de linfocitos Tem de rata
Como un preambulo para evaluar la efectividad terapeutica de ShK(L5), se examino su capacidad para suprimir la proliferacion de la lmea de linfocitos T de memoria, PAS, que provoca una enfermedad tipo EM en ratas. Como un control, los Solicitantes usaron linfocitos T de bazo de rata. Para confirmar el estado de diferenciacion de las dos 45 poblaciones celulares, se evaluo la expresion de CD45RC, un marcador de linfocitos T indiferenciados (Bunce y Bell,
1997). Los linfocitos T esplenicos de rata fueron un 76% de CD45RC+ (es dedr, principalmente celulas indiferenciadas), mientras que las celulas PAS fueron CD45RC, lo que sugiere que son celulas de memoria, como se muestra en la figura 4A. Para determinar si las celulas PAS estan en el estado Tem o el estado Tcm, se examino la expresion de Kv1.3 antes y 48 horas despues de la activacion. Se espera que los linfocitos Tem pero no Tcm regulen 5 por aumento significativamente los niveles de Kv1.3 tras la estimulacion. Con referencia a la figura 4B, los experimented de fijacion de membranas revelaron un llamativo aumento en la amplitud de corriente de Kv1.3 despues de la estimulacion con MBP de las celulas PAS coherente con la de sus linfocitos Tem. Como una medida independiente del numero de canales Kv1.3 en celulas PAS, se uso ShK-F6CA, un analogo de ShK marcado de forma fluorescente que previamente se ha indicado que se une espedficamente a Kv1.3. La intensidad de tincion 10 ShK-F6CA determinada por citometna de flujo refleja el numero de tetrameros de Kv1.3 expresados en la superficie celular. Como se observa en la figura 4C, la intensidad de tincion de ShK-F6CA (10 nM) aumento con activacion por MBP de las celulas PAS y un exceso de ShK(L5) no etiquetado (100 nM), inhibio de forma competitiva la tincion de ShK-F6CA. Como una prueba final, los Solicitantes realizaron microscopfa confocal en celulas PAS inactivas y estimuladas por MBP que se han fijado y tenido con un anticuerpo espedfico de Kv1.3. De acuerdo con los datos en 15 las figuras 4B y 4C, los linfocitos T PAS en reposo teman una intensidad de tincion de Kv1.3 de 4,4 + 0,6 y este valor aumento a 10,6 + 2,3 (p < 0,005) despues de la activacion inducida por antfgeno (vease la figura 4D) que mostraba un aumento en la expresion de protema de Kv1.3 tras la activacion. Por lo tanto, las celulas PAS activadas por MBP son linfocitos CD45RC" Kv1.3high Tem, mientras que en los linfocitos T esplenicos de rata usados en estos experimentos estan predominantemente en el estado indiferenciado.
20
La proliferacion activada por MBP de las celulas PAS se suprimio ~1000 veces mas eficazmente por ShK(L5) y ShK (CI50 = ~80 pM) que la proliferacion inducida por mitogeno de linfocitos T esplenicos de rata (vease la figura 4E, CI50 "100 nM; p < 0,05). Estos resultados corroboran los hallazgos con linfocitos T humanos que se han descrito anteriormente. Como se observa en la figura 4G, ShK(L5) inhibio la produccion de IL2 inducida por MBP por celulas 25 PAS (figura 4F), y la IL2 exogena parcialmente anulo la supresion de ShK(L5) de la proliferacion de celulas PAS (figura 4G). Estudios anteriores indicaron hallazgos similares con inhibidores de Kv1.3 menos espedficos en linfocitos T humanos, de rata y de cerdo enano. En resumen, ShK(L5) es un inhibidor potente y selectivo de linfocitos Tem humanos y de rata y, por lo tanto, puede tener uso terapeutico en enfermedades autoinmunes dirigiendose preferiblemente a los linfocitos Tem que contribuyen a la patogenesis de estos trastornos.
30
Semivida circulante y estabilidad
Se uso un bioensayo de fijacion de membranas para averiguar si los niveles circulantes de ShK(L5) tras la inyeccion subcutanea fueron suficientes para inhibir los linfocitos Tem. Los resultados de estos experimentos se muestran en 35 las figuras 5A-5F.
Se ensayaron muestras de suero de ratas tratadas con ShK(L5) y de control para bloquear la actividad en los canales Kv1.3. El suero de control no mostro ninguna actividad de bloqueo detectable, indicando una ausencia de bloqueadores de canal endogeno. Para estandarizar el ensayo, se anadieron cantidades conocidas de ShK(L5) al 40 suero de rata y estas muestras se ensayaron en canales Kv1.3. Las muestras de suero con adiciones bloquearon las corrientes de Kv1.3 de una forma dependiente de la dosis (Kd 77 + 9 pM) que fue indistinguible del efecto de ShK(L5) en ausencia de suero (figura 4A). Los niveles de ShK(L5) en animales tratados se determinaron por comparacion con la curva estandar. ShK(L5) fue detectable en suero 5 minutos despues de una unica inyeccion subcutanea de 200 mg/kg. Los niveles pico (12 nM) se alcanzaron en 30 minutos y despues el nivel cayo hasta un valor inicial de 45 aproximadamente 300 pM durante 420 minutos. La desaparicion de ShK(L5) de la sangre pudo ajustarse por un unico exponencial. La semivida circulante se estimo en ~50 min.
Dado que el nivel serico maximo despues de 200 mg/kg (12 nM) excede significativamente el requisito para el bloqueo selectivo de los canales Kv1.3 y la funcion de los linfocitos Tem, se ensayaron dosis inferiores. Despues de 50 una unica inyeccion de 10 mg/kg, la concentracion serica maxima de ShK(L5) alcanzo 500 pM en 30 min (datos no mostrados), una concentracion suficiente para bloquear >90 % de Kv1.3 pero sin afectar a Kv1.1. La administracion a diario repetida de esta dosis (10 mg/kg/dfa) dio como resultado niveles en estado estable de ~300 pM (medidos 24 horas despues de la inyeccion, figura 5D), que es suficiente para causar una supresion del 60-70 % de linfocitos Tem con poco efecto sobre las celulas indiferenciadas/linfocitos Tcm. El nivel en "estado estable" es inesperado dada 55 la semivida circulante estimada de ~50 min e indica que ShK(L5) se "acumula" en una administracion repetida. Para determinar si el "deposito" estaba en la piel o en otra parte en el cuerpo, se midieron los niveles en sangre de ShK(L5) 10 horas despues de que las ratas recibieran inyecciones intravenosas o subcutaneas individuales de 10 mg/kg de ShK(L5). El peptido desaparecio con el mismo transcurso de tiempo despues de administracion por cualquier ruta (figura 5E) indicando que la piel no es responsable del nivel en estado estable de 300 pM de ShK(L5)
alcanzado despues de una unica inyeccion diaria de 10 mg/kg (figura 5D), y el deposito o los depositos residen en otra parte.
El logro con exito de un nivel en estado estable de 300 pM de ShK(L5) tras inyecciones individuals diarias de 5 10 mg/kgMa sugiere que el peptido puede ser estable in vivo. Para examinar directamente su estabilidad, se incubo ShK(L5) en plasma de rata o en PBS que contema plasma de rata al 2 % a 37 °C durante duraciones variables y despues se midio la actividad de bloqueo de Kv1.3. En ambos conjuntos de muestras con adiciones (plasma y PBS) se observo una reduccion del 50% en la actividad de bloqueo de Kv1.3 en aproximadamente 5 horas, presumiblemente debido a la union del peptido a la superficie plastica del tubo, y despues el nivel permanecio 10 estable durante los siguientes 2 dfas (figura 5F). Como un ensayo de estabilidad anadido, se comparo la actividad de bloqueo de Kv1.3 frente a la actividad de bloqueo de Kv1.1 de sueros de ratas tratadas con ShK(L5). Si ShK(L5) se modifica in vivo, por desfosforilacion de pTyr o escision de la cadena lateral Aeea-pTyr, producira ShK(L4) y ShK respectivamente, ninguno de los cuales es selectivo para Kv1.3 sobre Kv1.1. Las muestras en suero de animales tratados con ShK(L5) mostraron la misma selectividad para Kv1.3 sobre Kv1.1 que ShK(L5), indicando que el 15 peptido no experimenta las modificaciones que se han indicado anteriormente. Tomados en conjunto, estos resultados indican que ShK(L5) es notablemente estable en plasma y alcanza concentraciones en suero farmacologicamente relevantes despues de inyecciones subcutaneas diarias individuales de 10 mg/kg.
Sin toxicidad
20
Los Solicitantes realizaron varios ensayos in vitro e in vivo para determinar si ShK(L5) muestra alguna toxicidad. Los resultados de estos estudios se resumen en el Apendice A. Las celulas linfoides humanas y de rata incubadas durante 48 horas con una concentracion (100 nM) de ShK(L5) >1200 veces mayor que la dosis de hemi-bloqueo de Kv1.3 o la CI50 para la supresion de Tem (70-80 pM), mostraron una citotoxicidad minima. La misma alta 25 concentracion de ShK(L5) fue negativa en el ensayo de Ames en la cepa de ensayo TA97A, sugiriendo que no es un mutagen. Ningun ensayo in vitro pudo detectar una toxicidad significativa.
El bloqueo inducido por farmaco de los canales Kv11.1 (HERG) ha contribuido a una mayor toxicidad cardiaca y la retirada de varios medicamentos del mercado. ShK(L5) no tiene ningun efecto sobre los canales Kv11.1 a 100 nM 30 (>1430 veces la Kd para Kv1.3) y, por lo tanto, el regimen terapeutico escogido por los Solicitantes (10 mg/kgMa, 300 pM, nivel circulante en estado estable) no debena causar cardiotoxicidad. Como un ensayo adicional, los Solicitantes realizaron analisis de variabilidad de la frecuencia cardiaca en ratas conscientes a las que se administro vehnculo (PBS + suero de rata al 2 %) el dfa 1, seguido de 10 mg/kgMa de ShK(L5) el dfa 2. ShK(L5) no tuvo ningun efecto sobre la frecuencia cardiaca ni los parametros HRV estandar (variabilidad de la frecuencia cardiaca) tanto en 35 los dominios de tiempo como de frecuencia (Task force of the European Society of Cardiology and the North American Society of Pacing Electrophysiology, 1996).
Estimulados por los experimentos de toxicidad aguda, los Solicitantes realizaron un estudio de toxicidad sub-cronica en el que se administraron inyecciones subcutaneas diarias a ratas de 10 mg/kg de ShK(L5) o vetnculo durante 2 40 semanas (n = 6 en cada grupo). Los animales tratados con ShK(L5) ganaron peso en el mismo grado que ratas que recibieron vehnculo (Apendice A). El analisis hematologico y de qmmica de sangre no mostro ninguna diferencia entre las ratas tratadas con ShK(L5) y con vehnculo, y el analisis citometrico de flujo no revelo diferencias en las proporciones de subconjuntos de timocitos o linfocitos (Apendice A). En conjunto, estos estudios sugieren que ShK(L5) es seguro.
45
Parar determinar el mdice de seguridad terapeutica, se administro una dosis 60 veces superior (600 mg/kgMa) de ShK(L5) a ratas sanas durante 5 dfas y no se observo ningun signo clmico de toxicidad, y no se percibio toxicidad cuando ratas sanas recibieron una unica inyeccion de 1000 mg/kg de ShK(L5). La situacion es menos optimista cuando la barrera hematoencefalica esta comprometida, como sucede en EAE y EM. Las ratas con eAe que 50 recibieron ShK(L5) 10 mg/kgMa durante 10 dfas, no mostraron signos de toxicidad. Por el contrario, el cuarenta por ciento de ratas (5/12) a las que se administraron 600 mg/kgMa durante cinco dfas, murieron en el quinto dfa cuando desarrollaron signos clmicos de EAE (DL50 extrapolada = 760 mg/kgMa). Ya que la concentracion pico de ShK(L5) en el suero (12 nM) despues de administracion de una unica inyeccion de 200 mg/kg es suficiente para bloquear >50 % de los canales Kv1.1, la toxicidad observada en ratas con EAE a las que se administraron 600 mg/kgMa de 55 ShK(L5) se debe probablemente a la entrada en el cerebro de cantidades suficientes de ShK(LS) para bloquear Kv1.1. Por lo tanto, el mdice de seguridad terapeutica eficaz de ShK(L5) excede ampliamente de 100 en situaciones en las que la barrera hematoencefalica no esta comprometida (como se observa en enfermedades autoinmunes que NO afectan al sistema nervioso central (SNC)), mientras que el mdice de seguridad terapeutico es de 75 cuando se rompe la barrera hematoencefalica.
Prevencion de DTH y EAE adoptiva aguda
Con referencia a las figuras 6A-6C, ShK(L5) se evaluo para comprobar la actividad inmunosupresora in vivo en dos 5 modelos animales. Los Solicitantes ensayaron su capacidad para prevenir y tratar EAE aguda inducida por la transferencia de linfocitos Tem PAS activados por MBP en ratas Lewis, asf como para suprimir la reaccion de DTH mediada por linfocitos Tem. Las celulas PAS se activaron con MBP durante 48 horas in vitro y despues se transfirieron de forma adoptiva (6-8 x 106 celulas viables) a ratas Lewis. Para el ensayo de prevencion, despues, las ratas recibieron inyecciones subcutaneas de solucion salina (controles) o ShK(L5) (10 pg/kgMa) durante 5 dfas. En 10 el primer ensayo de prevencion, las ratas de control desarrollaron EAE leve (puntuacion clmica maxima promedio 2,0 + 1,2) con una aparicion media de 5,6 + 0,6 dfas (no se muestra). ShK(L5) redujo la gravedad de la enfermedad (puntuacion clmica maxima promedio 0,7 + 0,6, p < 0,05). En el segundo ensayo de prevencion, las ratas de control desarrollaron EAE mas grave (puntuacion clmica maxima promedio 3,2 + 0,4) con una aparicion media de 4,8 ++ 0,4 dfas (figura 6A). ShK(L5) redujo significativamente la gravedad de la enfermedad (puntuacion clmica maxima 15 promedio 0,6 + 0,4, p < 0,007) pero no retraso significativamente la aparicion de la enfermedad (5,5 + 0,7 dfas; p = 0,07). No se apreciaron signos de toxicidad en estos estudios.
En el ensayo de tratamiento (figura 6B), a las ratas se les inyectaron celulas PAS activadas con MBP, se les administro solucion salina o 10 pg/kg/dfa de ShK(L5) cuando desarrollaron inicialmente signos de EAE (cola cafda, 20 postura jorobada y perdida del 6 % o mas de su peso durante 24 horas) y la terapia continuo durante tres dfas. Los signos clmicos de EAE alcanzaron su punto maximo el dfa 6 en el grupo de control (puntuacion = 3,9 + 0,7) y el dfa 7 en el grupo tratado (puntuacion = 1,9 + 0,9; p < 0,05).
Como una evaluacion independiente de la actividad inmunosupresora de ShK(L5) in vivo, los Solicitantes tambien 25 examinaron su eficacia en la inhibicion de la reaccion de DTH que esta mediada predominantemente por los linfocitos Tem de tropismo cutaneo. Las ratas Lewis inmunizadas con ovalbumina y adyuvante se estimularon 7 dfas mas tarde con ovalbumina en una oreja y solucion salina en la otra oreja. Despues, las ratas recibieron inyecciones de solucion salina (controles) o ShK(L5) (10 pg/kg/dfa) y se midio el grosor de la oreja como una indicacion de DTH. Todas las ratas de control desarrollaron hinchazon de oreja 24 y 48 horas despues de la estimulacion con 30 ovalbumina, mientras que la reaccion de DTH fue sustancialmente mas moderada en los animales tratados con ShK(L5) (figura 6C). Por lo tanto, ShK(L5) inhibe la respuesta de DTH mediada por Tem, y previene y mejora la EAE adoptiva grave inducida por linfocitos Tem activados por mielina.
Grupos Kv1.3 en IS durante la presentacion del antigeno pero el aflujo de K+ a traves de Kv1.3 no se requiere 35 para la formacion o la estabilidad de IS
Haciendo referencia a las figuras 7A-7G, ShK(L5), un inhibidor de Kv1.3 altamente selectivo (21), bloqueo las corrientes de Kv1.3 en los linfocitos Tem espedficos de GAD65 con una Kd de 72 + 3 pM. Se uso ShK(L5) como una sonda farmacologica para definir estas etapas en la activacion de linfocitos Tem que requieren la funcion de Kv1.3. 40 Los estudios bioqmmicos han mostrado que Kv1.3 y Kvb2 pertenecen a un complejo de senalizacion que incluye SAP97 (protema asociada a sinapsis 97), ZIP (protema que interactua con PKC-zeta, protema p62 asociada a p56, A170), p56lck y CD4 (figura 7B). La existencia de este complejo en linfocitos Tem humanos se sostiene por los resultados de los Solicitantes que muestran sellado conjunto de Kv1.3, Kvb2, SAP97, ZIP y p56lck con CD4. Ademas, los estudios FRET (transferencia de energfa fluorescente) muestran Kv1.3 en proximidad inmediata a CD3 en 45 linfocitos T humanos transfectados con Kv1.3, y el canal se localiza preferiblemente en el punto de contacto entre los linfocitos T citotoxicos humanos transfectados con Kv1.3 y sus dianas. Ya que CD4 circula a IS, la zona de contacto entre los linfocitos T y las celulas que presentan antigeno (APC), es posible que Kv1.3 y otras protemas en el complejo de senalizacion tambien se localicen en IS durante la presentacion de antigeno. Para probar esta idea, clones de Kv1.3high Tem espedficos de GAD65 de un paciente de DMT1 se incubaron con APC apareadas a HLA que 50 se habfan cargado con peptido GAD65 557I y se habfan tenido con DAPI para facilitar la visualizacion. Despues de 20 min, los conjugados de APC-Tem se inmunotineron para protemas en el complejo de senalizacion. CD4 se co- localizo en IS con Kv1.3, Kvb2, SAP97, ZIP y p56lck. En ausencia de contacto APC-Tem, CD4 y Kv1.3 se distribuyeron por toda la celula. Ademas, CD4 y Kv1.3 no pudieron localizarse en los puntos de contacto cuando los linfocitos Tem espedficos de GAD65 se expusieron a APC cargadas con MBP (un antigeno irrelevante), verificando 55 que el agrupamiento de IS es espedfico de antigeno. Por lo tanto, en los linfocitos Tem espedficos de GAD65, un complejo de senalizacion que contiene Kv1.3 circula junto con CD4 a IS durante la presentacion de antigeno, sugiriendo que Kv1.3 es un componente integral de la maquinaria que transduce senales en los linfocitos Tem. En base a estos estudios, ShK(L5) a una concentracion que bloquea aproximadamente el 99 % de los canales Kv1.3 (100 nM) no impidio el agrupamiento de IS y no interrumpio Is una vez formado, indicando que el eflujo de K+ a
traves de los canales Kv1.3 es innecesario para la formacion o la estabilidad de IS. Supresion de linfocitos Tem humanos
5 Con referencia a las figuras 8A-8E, ShK(L5) inhibio la senalizacion del calcio en linfocitos Tem, una etapa temprana y esencial en la activacion de linfocitos T. Se cargaron clones de Tem espedficos de GAD65 de pacientes de DMT1 con el tinte indicador de calcio Fluo3, se incubaron previamente en medio en solitario y con concentraciones en aumento de ShK(L5) y se sometieron a diagnostico por imagen por citometna de flujo antes y despues de la adicion de un anticuerpo anti-CD3 de activacion y un anticuerpo secundario de entrecruzamiento. El ascenso del calcio 10 maximo se produjo 242 + 35 segundos despues de la estimulacion y se bloqueo por ShK(L5) con una CI50 de ~200 pM (figura 8A). ShK(L5) fue 10 veces mas eficaz en la supresion de la incorporacion de [3H]-timidina por los linfocitos Tem autorreactivos de pacientes de DMT1 y AR en comparacion con las celulas indiferenciadas/linfocitos Tcm de estos pacientes (figura 8B, izquierda). En un segundo conjunto de experimentos (figura 8B, derecha), los linfocitos T de RA-SF y RA-PB se activaron con el anticuerpo anti-CD3 durante 48 horas para generar "Tem- 15 efectores" y "indiferenciadas/TcM-efectores" respectivamente. Las celulas se dejaron en reposo durante una noche en medio, se estimularon de nuevo con el anticuerpo anti-CD3 en presencia o ausencia de ShK(L5) durante 48 horas mas y se midio la incorporacion de [3H]-timidina. Los RA-SF-TEM-efectores conservaron su sensibilidad a la inhibicion de ShK(L5), mientras que los RA-PB-indiferenciados/TcM-efectores fueron resistentes al bloqueo de Kv1.3 (figura 8B, derecha), muy probablemente debido a que regulan por aumento el canal KCa3.1/IKCa1 activado por 20 calcio, que se sustituye por Kv1.3 en el fomento de la entrada de calcio. ShK(L5) suprimio significativamente la produccion de interleucina 2 (IL2) e interferon-g (IFN-g) por los linfocitos Tem de pacientes de DMT1 y AR, mientras que la produccion de IL2 e IFN-g por las celulas indiferenciadas/linfocitos Tcm de estos pacientes se vio menos afectada (figura 8C). La produccion del factor a de necrosis tumoral e interleucina 4 tanto por linfocitos Tem como celulas indiferenciadas/linfocitos Tcm fue menos sensible a ShK(L5) (figura 8C).
25
Verificacion del modelo de rata de hipersensibilidad de tipo tardio (DTH) causada por linfocitos T de memoria efectora.
Como se muestra en la figura 9, las ratas se inmunizaron con ovalbumina (OVA) en adyuvante. Se estimularon en 30 una oreja 7 dfas despues con OVA y en la otra con solucion salina. Se midio la hinchazon de la oreja 24 horas despues como un signo de hipersensibilidad de tipo tardfo (DTH). Los histogramas FACS mostrados en la figura 9 indican que los linfocitos T en las orejas estimuladas con OVA son celulas de memoria negativa CD45RC mientras que los linfocitos T en la sangre y el bazo de las mismas ratas primordialmente son linfocitos T indiferenciados.
35 Protocolo de tratamiento para Shk(L5) en un modelo de rata de hipersensibilidad de tipo tardio (DTH) causada por linfocitos T de memoria efectora
Como se muestra en la figura 10, las ratas recibieron ShK(L5) 10 pg/kg/dfa como inyeccion subcutanea desde el dfa 0 al dfa 7 (durante la fase de cebado) para impedir la diferenciacion de celulas indiferenciadas a linfocitos TEM de 40 memoria efectora, o durante la fase efectora despues de la exposicion de la oreja a ovalbumina para impedir la funcion de los linfocitos TEM.
Shk(L5) suprime especificamente las respuestas de memoria efectora in vivo en ratas sin alterar la funcion de los linfocitos T o linfocitos B indiferenciados y de memoria central
45
Como se ilustra en la Figura 11, las ratas de control desarrollaron hinchazon en la oreja, es decir una respuesta DTH positiva. ShK(L5) NO fue eficaz en la supresion de DTH al administrarse durante la fase de cebado, indicando que no suprimio la diferenciacion de celulas indiferenciadas y linfocitos T de memoria central en celulas de memoria efectora. ShK(L5) suprime la DTH cuando se administra durante la fase efectora, indicando que evita la habilidad de 50 los linfocitos T de memoria efectora para alcanzar la oreja y/o suprime la activacion de linfocitos T de memoria efectora. La primera posibilidad se excluyo debido a que el numero de linfocitos T en las orejas de ratas tratadas con ShK(L5) fue el mismo que en las orejas de ratas a las que se les administro el vehfculo. ShK(L5) suprimio la activacion de linfocitos T de memoria efectora en la oreja debido a que estos linfocitos T fueron negativos a Kv1.3, mientras que los linfocitos T de memoria en las orejas de animales tratados con vehfculos fueron positivos a Kv1.3. 55 Las respuestas de los linfocitos B de IgM e IgG en estos animales tampoco se vieron afectadas.
Expresion de Kv1.3 en linfocitos T especificos para GAD651555-567. Antigenos de insulina/9-23 y mielina de pacientes con DMT1 O MS y controles sanos
La figura 12A muestra corrientes de Kv1.3 (superior) y numero de canal/celula (inferior) de linfocitos T espedficos de antigeno de pacientes con diabetes mellitus de tipo 1 de nueva aparicion, controles sanos y pacientes con esclerosis multiple. Cada punto de datos representa la media + SEM de 20-50 celulas de 2-4 lmeas de linfocitos T de un unico donante medida 48 horas despues de la tercera estimulacion con antigeno. Debido a la baja frecuencia de linfocitos 5 T espedficos para insulina y GAD65 en la sangre de pacientes de DMT1 y controles, se amplificaron estas poblaciones generando lmeas de linfocitos T CD4+ espedficos de autoantfgeno a corto plazo usando el metodo de pocillos divididos. Como controles, se generaron lmeas de linfocitos T espedficas para la protema basica de mielina (MBP) de autoantigeno irrelevante que esta implicada en MS pero no en DM T1. Tras la tercera estimulacion antigenica, las corrientes de Kv1.3 se midieron por fijacion de membranas de celulas enteras en celulas activadas 10 con una capacidad de membrana mayor de 4 pF (diametro celular > 11 pm). Las corrientes de Kv1.3 representativas y los numeros de canal Kv1.3/linfocito T se muestran en la figura 12A. Las corrientes mostraron propiedades bioffsicas y farmacologicas caractensticas de Kv1.3. Los linfocitos T espedficos para insulina (9-23) o GAD65 (555567) de pacientes con DMT1 de nueva aparicion mostraron mayores corrientes de Kv1.3 y expresaron altos numeros de canales Kv1.3, mientras que los linfocitos T espedficos de MBP irrelevantes a la enfermedad de estos pacientes 15 fueron Kv1.3low (p = 0,001). Para comparacion, se trazan los datos de Kv1.3 publicados en pacientes de MS en los que se observo el patron opuesto. En pacientes de MS, los linfocitos T espedficos para MBP o glicoprotema de oligodendrocito de mielina (peptido 35-55) o protema proteolfpfdica (peptido 139-151) fueron Kv1.3high, mientras que los linfocitos T espedficos de insulina y GAD65 fueron Kv1.3low (p = 0,0001). Los linfocitos T autorreactivos aislados de controles sanos fueron Kv1.3low independientemente de la especificidad. En un individuo tanto con MS como DM 20 T1, los linfocitos T espedficos para los tres autoantfgenos fueron Kv1.3high. Los linfocitos T espedficos de GAD65 y espedficos de insulina de pacientes con DM T1 duradera fueron Kv1.3high, lo que reflejaba la persistencia de los linfocitos Tem autorreactivos, mientras que se observo un patron de Kv1.3low en linfocitos T espedficos de GAD65 y de insulina de pacientes con DM tipo 2 no autoinmune. Como se observa en la figura 12B, intensidad de tincion de Kv1.3 (superior) y de fluorescencia de celulas individuales (inferior). Los Solicitantes confirmaron los datos de fijacion 25 de membranas por inmunotincion para Kv1.3. Los linfocitos T espedficos de insulina y GAD65 de pacientes de DMT1 y los linfocitos T espedficos de MBP de pacientes de MS se tineron intensamente, mientras que las celulas espedficas para autoantfgenos irrelevantes se tineron escasamente. La figura 12C muestra la expresion de CCR7. La citometna de flujo revelo que los linfocitos T Kv1.3hight eran linfocitos 'Tem CCR7, mientras que las celulas Kv1.3low eran celulas CCR7+ indiferenciadas o linfocitos Tcm. La figura 12D muestra el numero de Kv1.3/celula en linfocitos T 30 autorreactivos de un paciente tanto con DM T1 como MS, y de pacientes que han tenido DM T1 o DM tipo 2 durante mas de 5 anos y 2 anos, respectivamente. La figura 12E muestra los numeros de Kv1.3 en linfocitos T CD4+GAD65- tetramero+ de un paciente con DM T1 de nueva aparicion. Como un control adicional, se usaron tetrameros fluorescentes MHC de clase II que conteman el peptido GAD65 557I, para aislar linfocitos T CD4+ espedficos de GAD65 de un paciente positivo a DR-0401 con dMT1 de nueva aparicion. Los linfocitos T activados por GAD65 35 clasificados por tetrameros mostraron el mismo patron Kv1.3high observado en las lmeas de linfocitos T espedficos para GAD65 de pacientes de DMT1. En resumen, los linfocitos T activados por autoantfgeno relevantes a la enfermedad tanto en DMT1 como en MS son Kv1.3highCCR7' TEM-efectores, mientras que las celulas autorreactivas irrrelevantes a la enfermedad en estos pacientes son celulas Kv1.3lowCCR7+ indiferenciadas/linfocitos Tcm.
40 Expresion de Kv1.3 en artritis reumatoide y osteoartritis
En AR, los linfocitos T relevantes a la enfermedad pueden aislarse de las articulaciones afectadas. Los linfocitos T de de fijacion de membranas de los Solicitantes procedentes del fluido sinovial (SF) de 7 pacientes de AR, 48 horas despues de estimulacion con anticuerpo anti-CD3. Como se observa en la figura 13A, como controles, los 45 Solicitantes analizaron celulas T-SF de 7 pacientes con osteoartritis (OA) no autoinmune degenerativa (que se ha activado con el mismo protocolo. Los linfocitos T RA-SF fueron Kv1.3high, mientras que los linfocitos T OA-Sf fueron Kv1.3low (p < 0,0001). Los Solicitantes observaron el patron de Kv1.3low en linfocitos T activados por anti-CD3 de la sangre periferica (PB) de pacientes de AR (p < 0,0001) porque los linfocitos Tem Kv1.3hgh autorreactivos son infrecuentes en las sangre. La inmunotincion para Kv1.3 y su subunidad Kvp2 asociada corroboraron los datos de 50 fijacion de membranas. La figura 13B muestra imagenes confocales de la tincion de Kv1.3 (gris claro como se observa en la figura) y Kvp2 (gris mas oscuro como se observa en la figura). Los linfocitos T RA-SF se tineron intensamente tanto para Kv1.3 como Kvp2, mientras que los linfocitos T OA-SF y RA-PB mostraron una tincion debil. La figura 13C ilustra la expresion de cCR7. La citometna de flujo verifico que los linfocitos T Kv1.3high RA-SF eran linfocitos Tem CCR7', mientras que los linfocitos T Kv1.3low OA-SF y RA-PB eran celulas CCR7+ 55 indiferenciadas/linfocitos Tcm. La figura 13D (superior) muestra micrograffas del sinovio de pacientes de AR y OA con tincion de anticuerpos anti-CD3 o anti-Kv1.3 y contra-tincion con hematoxilina/eosina (40X) Como un ensayo adicional, se inmunotineron tejido sinoviales (ST) embebidos en parafina de 5 pacientes de AR y 5 pacientes de Oa para CD3, Kv1.3 y CCR7. Se ha mostrado previamente que este metodo de tincion no detecta Kv1.3 en celulas indiferenciadas/linfocitos Tcm debido a su bajo numero de canales Kv1.3. En RA-ST, se observo una preponderancia
de linfocitos Tem CD3+Kv1.3+CCR7-, mientras que las celulas CD3+ fueron escasas en sinovio de OA y estas fueron principalmente celulas Kv1.3-CCR7+ indiferenciadas/linfocitos Tcm. El grado de infiltracion por las celulas CD3+, Kv1.3+ y CCR7+ se evaluo por el sistema de clasificacion de la figura S2A. fndice inflamatorio de CD3+: AR = 3,2 + 0,1; OA = 1,1 + 0,2 (p<0,01); fodice inflamatorio de Kv1.3+: AR = 2,8 + 0,3; OA = 0,6 + 0,3 (p<0,01). Por lo tanto, en 5 tres trastornos autoinmunes diferentes, estos resultados son consistentes con linfocitos T autorreactivos asociados a la enfermedad son Kv1.3nighCCR7-TEM-efectores.
Se apreciara que la invencion se ha descrito en el presente documento con referencia a ciertos ejemplos o realizaciones de la invencion pero que pueden hacerse diversas adiciones, eliminaciones, alteraciones y 10 modificaciones a estos ejemplos y realizaciones, sin apartarse del alcance de la invencion reivindicada. Por ejemplo, cualquier elemento o atributo de una realizacion o ejemplo puede incorporarse en o emplearse con otra realizacion o ejemplo, a menos que para hacerlo la realizacion o el ejemplo se vuelva inadecuado para su uso pretendido. Ademas, cuando las etapas de un metodo o procedimiento se citan o indican en un orden particular, el orden de estas etapas puede cambiarse a menos que se especifique otra cosa o a menos que dicho cambio en el orden de 15 las etapas haga a la invencion carente de patentabilidad o inadecuada para su uso pretendido. Todas las adiciones, eliminaciones, modificaciones y alteraciones razonables han de considerarse equivalentes de los ejemplos descritos.
Apendice A: Estudio de toxicidad de ShK(L5)
Pruebas In vitro
ShK(L5) 100 nM
Citotoxicidad (% de celulas muertas)
PBMC humanas
7,5 + 4,3
Linfocitos T PAS
8,1 + 0,8
Celulas Jurkat
5,5 + 3,3
Linfoma de Burkitt
3,1 + 0,9
Mieloma RPMI 8226
6,5 + 2,1
Ensayo de Ames
Negativo
Ensayos in vivo agudos
Solucion salina SHK(L5) 10 Mg/kg
Electrocardiograma*
Frecuencia cardiaca
302 + 13 311 + 20
SDNN
13,3 + 3,0 17,8 + 4,4
% CV
6,7 + 1,4 92 + 2,2
SDANNsmin
5,0 + 2,0 6,9 + 2,3
rMSSD
6,8 + 2,2 9,8 + 3,5
HF (n.u.)
71 + 21 79 + 37
HF (%)
50 + 8 53 + 10
LF (n.u.)
68 + 4 64 + 10
LF (%)
50 + 8 47 + 10
LF/HF
1,1 + 0,4 1,3 + 0,7
Ensayos sub-cronicos in vivo
Solucion salina ShK(L5) 10 Mg/kg/dia durante 2 semanas
Aumento de peso (%)
72 + 1,8 62 + 1,7
Recuento sanguineo completo
Hematocrito (%)
403 + 1,4 39,0 + 4,9
Hemoglobina (g/dl)
15,3 + 0,5 15,0 + 1,5
MCV (fl)
48,5 + 0,2 48,3 + 0,3
MCH (pg)
18,5 + 0,8 18,5 + 0,6
MCHC (g/dl)
38,0 + 1,8 38,4 + 1,3
Globulos blancos totales (x 103mm-3)
7,1 + 2,1 7,1 + 2,5
Globulos rojos totales (x 106mm-3)
8,3 + 0,3 8,1 + 1,0
Plaquetas totales (x 103mm-3)
656 + 214 606 + 106
Quimica sanguinea
Fosfatasa alcalina (U/I)
170 + 26 150 + 18
Glucosa (mg/dl)
139 + 21 150 + 18
Nitrogeno ureico en sangre (mg/dl)
17,1 + 2,6 15,0 + 1,7
Creatinina (mg/dl)
0,6 +0 0,6 + 0,1
Albumina (g/dl)
5,0 + 0,3 4,5 + 0,4
Poblaciones celulares timicas (%).
CD4-CD8-
3,6 ± 1,1 43 ± 0,7
CD4+CD8+
77,8 ± 6,1 76,8 ± 4,1
CD4+CD8-
8,5 ± 1,7 11,2 ± 2,0
CD4-CD8+
10,0 ± 3,3 7,6 ± 1,3
CD3+
89,5 ± 1,6 93,2 ± 3,5
Poblaciones esplenicas (%)
CD3+
72,4 ± 4,4 65,4 ± 0,1
CD3+CD45RC+
35,6 ± 2,6 39,8 ± 1,1
CD3+CD45RC-
23,6 ± 2,3 26,5 ± 1,3
CD3+CD4+
62,7 ± 0,1 66,6 ± 1,2
CD3+CD8+
26,9 ± 0,1 25,0 ± 0,2
IgM+
38,8 ± 1,5 33,3 ± 0,3
Datos expresados como media ± DE. *Ensayado con pruebas t, p<0,05 en todos los parametros; SDNN: Desviacion estandar de todos los intervalos RR normal-normal; % CV: 100 x SDNN/intervalo RR medio; SDANN5min: Desviacion estandar de la media de los intervalos RR normales para cada periodo de 5 min; rMSSD: Media cuadratica de diferencia sucesiva; HF (n.u.): Ene^a de alta frecuencia (0,75 - 2,5 Hz) en unidad normalizada; LF (n.u.): Energia de baja frecuencia (02 - 0,75 Hz) en unidad normalizada.________________________________________________
APENDICE B
L-p-Fosfonofenilalanina (PPA)
imagen1
/.-p-Fosfonometanonafenilalanina (PM(=0)PA) (/.-p-Cetofosfonofenilalanina (KPP)
imagen2
L-p-Fosfonodiflurometil-fenilalanina (PM(f2)PA) (L-p-Difluorometilfosfonofenilalanina)
5
10 Direccionamiento de los linfocitos T de memoria efectora con un inhibidor peptldico selectivo de canales Kv1.3 para la terapia de enfermedades autoinmunes
Christine Beeton, Michael W. Pennington, Heike Wulff, Satendra Singh, Daniel Nugent, George Crossley, Ilya Khaytin, Peter A. Calabresi, Chao-Yin Chen, George A. Gutman y K. George Chandy.
Department of Physiology and Biophysics, University of California Irvine, Irvine, California (C.B., G.A.G., K.G.C.); Bachem Bioscience Inc., King of Prussia, Pennsylvania (M.W.P., S.S., D.N., G.C., I.K.); Department of Medical Pharmacology and Toxicology, University of California, Davis, California (H.W., C.Y.C.); y Department of Pathology,
Johns Hopkins Hospital, Baltimore, Maryland (P.A.C.)
Recibido el 13 de octubre de 2004; aceptado el 21 de enero de 2005 5 Resumen
El canal de K(+) Kv1.3 regulado por voltaje es una diana novedosa para la inmunomodulacion de linfocitos T de memoria efectora autorreactivos (T(EM)) que tienen una funcion principal en la patogenesis de las enfermedades autoinmunes. Se describe la caracterizacion del peptido novedoso ShK(L5) que contiene 1-fosfotirosina unida a 10 traves de un enlazador hidrofilo de nueve atomos al extremo N del peptido ShK de la anemona de mar Stichodactyla helianthus. ShK(L5) es un bloqueador de Kv1.3 altamente espedfico que muestra una selectividad de 100 veces para Kv1.3 (K(d) = 69 pM) sobre Kv1.1 y una selectividad de mas de 250 veces sobre todos los demas canales ensayados. ShK(L5) suprime la proliferacion de linfocitos T(EM) humanos y de rata e inhibe la produccion de interleucina-2 a concentraciones picomolares. Los linfocitos T humanos indiferenciados y de memoria central son 15 inicialmente 60 veces menos sensibles que los linfocitos T(EM) con respecto a ShK(L5) y despues se vuelven resistentes al peptido durante la activacion regulando por aumento el canal K(Ca)3.1 activado con calcio. ShK(L5) no muestra citotoxicidad in vitro sobre lmeas celulares de mamffero y es negativo en la prueba de Ames. Es estable en plasma y cuando se administra una vez al dfa por inyeccion subcutanea (10 pg/kg), alcanza niveles en sangre en "estado estable" de aproximadamente 300 pM. Este regimen no causa toxicidad cardiaca evaluada por 20 monitorizacion EKG continua y no altera los parametros de la qrnmica clmica y hematologicos despues de una terapia de 2 semanas. ShK(L5) previene y trata la encefalomielitis autoinmune experimental y suprime la hipersensibilidad de tipo tardm en ratas. ShK(L5) puede ser util para la terapia de trastornos autoinmunes.
ABREVIATURAS: MS, esclerosis multiple; Tem, subconjunto de linfocitos T de memoria efectora; Tcm, subconjunto 25 de linfocitos T de memoria central; EAE, encefalomielitis autoinmune experimental; DTH, hipersensiblidad de tipo tardm; Kca3.1, canal de K+ activado por Ca2+ de conductancia intermedia; Kv, canal de K+ regulado por voltaje; ShK, toxina de Stichodactyla helianthus; Fmoc, 9-fluorenilmetoxicarbonilo; Pmp, p-fosfonometil-fenilalanina; Aeea, acido amino-etil-oxi-etiloxi-acetico; HEK, rinon embrionario humano; HERG, gen humano relacionado con eter-a-go-go; PBMC, celula mononuclear de sangre periferica; IL2, interleucina 2; PBS, solucion salina tamponada con fosfato; 30 MBP, protema basica de mielina; F6CA, fluorescema-6-carboxilo; L-pTyr, L-fosfotirosina; CP-339818, 1 -bencil-4- pentilimino-1,4-dihidroquinolina; UK-78282, 4-[difenilmetoxi)metil]-1-[3-(4-metoxifenil)propil]-piperidina; WIN-17317, clorhidrato de 1-bencil-7-cloro-4-n-propilimino-1,4-dihidroquinolina.
Este trabajo conto con el apoyo de subvenciones de la National Multiple Sclerosis Society (para H.W., K.G.C., 35 P.A.C., M.W.P.), el National Institute of Health (subvencion NS048252 para K.G.C.), la Arthritis National Research Foundation (para C.B.), y una beca posdoctoral de la National Multiple Sclerosis Society (para C.B.).
C.B. y M.P. contribuyeron por igual a este trabajo.
El artmulo, la fecha de publicacion y la informacion de referencia pueden encontrarse en 40
http://molpharm.aspetjournals.org/ doi: 10.1124/mol.104.008193.
Las enfermedades autoinmunes afectan a millones de personas en todo el mundo y pueden tener un mecanismo patogenico comun. La patogenesis puede implicar el "despertar" de los linfocitos T autorreactivos espedficos a la 45 enfermedad latentes - por ejemplo, linfocitos T espedficos de mielina en pacientes con esclerosis multiple (MS) - por mimetismo molecular u otros mecanismos indeterminados. Una vez despiertos, los linfocitos T autorreactivos pueden diferenciarse de un estado indiferenciado a linfocitos T de memoria continuamente activados como consecuencia de una estimulacion autoantigenica repetida y contribuir al dano inflamatorio migrando rapidamente a los tejidos, secretando citocinas inflamatorias, y mostrando una funcion efectora inmediata (Sallusto y col., 1999). Varias lmeas 50 de prueba apoyan este esquema. En primer lugar, una mayona de los linfocitos T espedficos de mielina de pacientes con MS son linfocitos T de memoria efectora (Tem) activados independientes de la co-estimulacion (Lovett- Racke y col., 1998; Scholz y col., 1998; Markovic-Plese y col., 2001; Wulff y col., 2003). En segundo lugar, la transferencia de linfocitos Tem espedficos de mielina a receptores de rata sin tratar induce encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), un modelo para EM (Beeton y col., 2001b). En tercer lugar, los linfocitos T de 55 pacientes con diabetes mellitus tipo 1 que son espedficos para la descarboxilasa 65 de acido glutamico de autoantfgeno asociado a la enfermedad son celulas de memoria continuamente activadas (Viglietta y col., 2002). Por ultimo, la mayona de los linfocitos T en el sinovio de pacientes con artritis reumatoide y en lesiones cutaneas de pacientes con psoriasis son linfocitos Tem, ya que son linfocitos T que provocan una hipersensiblidad de tipo tardm (DTH) (Ezawa y col., 1997; Friedrich y col., 2000; Soler y col., 2003). Los linfocitos B de memoria, especialmente
aquellos que pertenecen al subconjunto CD27+IgD" de conmutacion de clase, tambien contribuyen probablemente a la patogenesis de muchas enfermedades autoinmunes (Iglesias y col., 2001; O'Connor y col., 2001; Corcione y col., 2004). Las terapias que se dirigen a linfocitos Tem y linfocitos B de memoria de conmutacion de clase sin alterar la actividad de otros subconjuntos de linfocitos se dirigiran, por lo tanto, a las celulas patogenas en pacientes con 5 enfermedades autoinmunes pero sin comprometer las respuestas inmunes agudas.
Una nueva diana terapeutica excitante para inmunomodulacion de linfocitos Tem y linfocitos B de memoria de conmutacion de clase es el canal de K+ Kv1.3 regulado por voltaje. Los linfocitos Tem regulan por aumento Kv1.3 tras la activacion y su proliferacion inducida por antfgeno es exquisitamente sensible a bloqueadores de Kv1.3 (Wulff y 10 col., 2003). Por el contrario, los linfocitos indiferenciados y Tcm son significativamente menos sensibles a los bloqueadores de Kv1.3 para empezar y rapidamente se vuelven resistentes al bloqueo de Kv1.3 regulando por aumento el canal de K+ activado por calcio Kca3.1 (Wulff y col., 2003; Chandy y col., 2004). Los linfocitos B, como los linfocitos T, cambian su dependencia del canal de potasio de Kca3.1 a Kv1.3 segun se diferencian de indiferenciados a linfocitos B de memoria CD27+IgD" de conmutacion de clase (Wulff y col., 2004). Los bloqueadores de Kv1.3 15 inhiben la proliferacion de estas celulas sin afectar a los linfocitos B indiferenciados y de memoria CD27+IgD+. Mediante el direccionamiento de los linfocitos TEMy los linfocitos B de memoria de conmutacion de clase con bloqueadores de Kv1.3, puede ser posible mejorar las enfermedades autoinmunes sin comprometer la mayor parte de la respuesta inmune. La distribucion tisular funcionalmente restringida de Kv1.3 y el hecho de que, in vivo, el bloqueo de Kv1.3 mejore la EAE, la resorcion osea en una enfermedad periodontal, y DTH en modelos animales sin 20 provocar efectos secundarios obvios ha mejorado lo atractivo de Kv1.3 como una diana terapeutica (Koo y col., 1997; Beeton y col., 2001b; Valverde y col., 2004). Aunque los bloqueadores de Kv1.3 suprimiran todos los linfocitos Tem activados (por ejemplo, linfocitos Tem espedficos para antfgenos de vacuna) y linfocitos B de memoria de conmutacion de clase, una terapia basada en Kv1.3 sera una mejora significativa frente a terapias actuales que suprimen amplia e indiscriminadamente todo el sistema inmune. Una ventaja adicional de los bloqueadores de Kv1.3 25 es que son reversibles. Por lo tanto, se puede valorar el efecto terapeutico de los bloqueadores de Kv1.3 cuando sea necesario y detener la terapia frente a la infeccion, a diferencia de los agentes quimioterapeuticos o terapias de anticuerpos monoclonales dirigidos, que tardan meses en disminuir.
A pesar de grandes esfuerzos, no se han desarrollado inhibidores selectivos y potentes del canal Kv1.3 (Chandy y 30 col., 2004). El inhibidor Kv1.3 mas potente es el peptido ShK de la anemona de mar del Caribe Stichodactyla helianthus (Pennington y col., 1995). ShK bloquea Kv1.3 (Kd, ~10pM), suprime la proliferacion de linfocitos Tem a concentraciones picomolares (Wulff y col., 2003), y mejora la EAE (Beeton y col., 2001b). Un inconveniente potencial de ShK es su afinidad (Kd, 28 pM) para el canal Kv1.1 neuronal (Kalman y col., 1998). Aunque no se observaron efectos secundarios con ShK en ensayos de EAE (Beeton y col., 2001b), la entrada de altas concentraciones de 35 ShK en el cerebro puede conducir a una neurotoxicidad no deseada. Otros inhibidores, incluyendo correolida, trans- PAC, CP-339818, UK-78282, Psora-4, margatoxina y luteolina son menos selectivos para Kv1.3 (Chandy y col., 2004). Por lo tanto, es necesario el desarrollo de un derivado de ShK mas selectivo.
Se ha desarrollado ShK(L5), un analogo sintetico de ShK que bloqueo Kv1.3 con afinidad picomolar y mostro una 40 selectividad de mas de 100 veces para Kv1.3 sobre Kv1.1 y otros canales. La selectividad se consiguio uniendo una L-fosfotirosina (L-pTyr) cargada negativamente a traves de un enlazador hidrofilo a ShK-Arg1. ShK(L5) suprimio la proliferacion de linfocitos Tem in vitro a concentraciones picomolares sin comprometer la funcion de los linfocitos indiferenciados y Tcm. En estudios in vivo de prueba de concepto, ShK(L5) mejoro la EAE provocada por la transferencia de linfocitos Tem espedficos de mielina a receptores de rata sin tratar y suprimio la repuesta de DTH 45 tambien provocada por los linfocitos Tem. ShK(L5) puede aprovecharse como una terapia para la esclerosis multiple u otras enfermedades autoinmunes mediadas por linfocitos T y B.
Materiales y metodos
50 Smtesis de analogos de ShK. Para los analogos Fmoc-Pmp, los grupos protectores etilo se eliminaron tratando el Fmoc-Pmp-(Etil)2-OH con HCl acuoso 6 N a reflujo. Despues de 16 h, un solido de color blanco se elimino por precipitacion, que despues se aislo por filtracion y se lavo con agua hasta que los lavados fueron neutros (Hammerschmidt y Hanbauer, 2000). La eliminacion parcial de los grupos protectores etilo de Pmp-fosfonato dio como resultado Pmp, Pmp-Et o Pmp(Etilo)2. Todos los derivados de aminoacidos de Fmoc se obtuvieron en Bachem 55 AG (Bubendorf, Suiza), excepto para Fmoc-D-TyrPO3(bencil)-OH, que se obtuvo en Nova Biochem (San Diego, CA), y Fmoc-Pmp(etil)-OH y Fmoc-D-Pmp(etil)2-OH, que se obtuvieron en Chem Impex (Wood Dale, IL). El ensamblaje en fase solida se inicio con resina Fmoc-Cys(Trt)-2-clorotritilo para minimizar la racemizacion potencial del residuo Cys C-terminal (Fujiwara y col., 1994). Se realizo un ensamblaje automatizado en un sintetizador peptfdico ABI-431A (Applied Biosystems, Foster City, CA). Fmoc-Aeea-OH se acoplo al extremo N despues del ensamblaje de ShK. La
resina se dividio en nueve aKcuotas. Fmoc-Tyr(PO3Bzl)-OH, Fmoc-D-Tyr(PO3Bzl)-OH, Fmoc-Tyr(PO3Me2)-OH, Fmoc-Pmp-OH, Fmoc-D-Pmp-OH, Fmoc-Pmp(etil)-OH, Fmoc-Pmp(Et)2-OH, Fmoc-Tyr(ferc-butil)-OH, o Fmoc-p- amino-L-fenilalanina(ferc-butiloxi-carbonil)-OH se acoplo, usando diisopropilcarbodiimida y 1-hidroxibenzotriazol, a una de las alfcuotas de resina. La resina peptfdica desbloqueada se escindio y se desprotegio con reactivo K (King y 5 col., 1990) que contema triisopropilsilano al 5 % durante 2 h a TA. Met(O) se redujo mediante la adicion de NH4l solido al coctel de escision en t-l5 min (Nicolas y col., 1995). Para los peptidos que conteman Tyr(PO3Me2)-OH, se uso un coctel de escision que contema bromuro de trimetilsililo 1 M en TFA (acido trifluoroacetico) que contema tioanisol como eliminador durante 18 h a 4 °C (Tian y col., 1993). La eliminacion incompleta de los grupos protectores metilo es comun al usar este metodo, y dos de las especies [p-fosfotirosina) y Tyr(PO3HMe)] se purifican 10 facilmente por RP-HPLC. El analogo que contema Tyr(PO4Me2) se escindio a traves de escision de reactivo K estandar manteniendo intactos ambos grupos metilo. En cada caso, la mezcla de escision se filtro y el peptido en bruto se precipito en eter dietflico enfriado con hielo. El precipitado se recogio, produciendo aproximadamente 75 mg de peptido de 200 mg de resina. El producto en bruto se disolvio en 20 ml de AcOH acuoso al 50 % y se diluyo en 0,75 I de H2O. El pH de la solucion se ajusto con NH4OH a 8,2, y despues se dejo plegarse durante una noche con 15 la adicion de glutation (2 mM:1 mM) (reducido:oxidado). Todos los analogos se purificaron usando RP-HPLC, usando un gradiente lineal de agua frente a acetonitrilo tamponado con acido trifluoroacetico como se ha descrito previamente (Pennington y col., 1995, 1996a,b). Las fracciones puras se combinaron y se liofilizaron, dando como resultado una sal trifluoroacetato de cada peptido. La pureza de los peptidos fue mayor del 95 %. Cada muestra se confirmo por cromatograffa lfquida de alto rendimiento de fase inversa, analisis aminoaddico, y ionizacion-desorcion 20 laser asistida por matriz/espectrometna de masas de tiempo de vuelo y se ajusto para justificar el contenido peptfdico antes del bioensayo. ShK y margatoxina se obtuvieron en Bachem Biosciences (King of Prussia, PA). La luteolina se adquirio en Sigma-Aldrich (St Louis, MO).
Canales ionicos. Se uso la nomenclatura IUPHAR para los canales ionicos descritos en este artfculo (Gutman y 25 col., 2003). Las celulas que expresan de forma estable mKv1.1, rKv1.2, mKv1.3, hKv1.5 y mKv3.1 se han descrito previamente (Grissmer y col., 1994). Las lmeas celulares que expresan de forma estable otros canales ionicos de mairnferos fueron obsequios de varias fuentes: mKv1.7 en celulas CHL y hKCa2.3 en celulas COS-7 de Aurora Biosciences Corp. (San Diego, CA); hKv1.4 en celulas LTK de Michael Tamkun (University of Colorado, Boulder, CO); hKv2.1 en celulas HEK293 de Jim Trimmer (University of California, Davis, CA); Kv11.1 (HERG) en celulas 30 HEK293 de Craig January (University of Wisconsin, Madison, WI); celulas HEK293 que expresan hKCal.1 orKCa2.1 o hKCa3.1 de Khaled Houamed (University of Chicago, Chicago, IL); hNav1.4 en celulas HEK-293 de Frank Lehmann-Horn (University of Ulm, Germany), y Cav1.2 en celulas HEK-293 de Franz Hofmann (Munich, Alemania). Las celulas RBL-2H3 (que expresan Kir2.1) y las celulas de neuroblastoma N1E-115 (que expresan Nav1.2) se obtuvieron de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA). hKv1.6 y 35 rKv3.2 (ambas en pcDNA3) se obtuvieron en Protinac GmbH (Hamburg, Alemania) y transfectaron transitoriamente en celulas COS-7 con Fugene-6 (Roche, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el protocolo de los fabricantes.
Celulas linfoides y lmeas celulares. Se usaron gradientes de Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich) para aislar esplenocitos de ratas Lewis y celulas mononucleares de sangre periferica humana (PBMC) de la sangre de 40 voluntarios sanos. Los linfocitos Tem humanos espedficos de glicoprotema de oligodendrocito de mielina o del toxoide tetanico se generaron como se ha descrito previamente (Wulff y col., 2003). La lmea de linfocitos T de ratas Lewis CD4+ encefalitogena PAS (Beraud y col., 1993) fue una donacion de Evelyne Beraud (University of Marseille, Marsella, Francia), y las celulas de plasmacitoma RPMI 8226 fueron una donacion de Shastri Gollapudi (University of California, Irvine, CA). Las celulas Jurkat y Burkitt se adquirieron en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo.
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Analisis electrofisiologico. Los experimentos se realizaron en la configuracion de celula entera de la tecnica de fijacion de membranas. Las corrientes de Kv se provocaron por pulsos de despolarizacion de 200 ms a partir de un potencial de retencion de -80 a 40 mV como se ha descrito previamente (Zhou y col., 1998; Wulff y col., 2000; Bardien-Kruger y col., 2002; Kolski-Andreaco y col., 2004; Vennekamp y col., 2004). Cada bloqueador de 50 canal se ensayo en multiples concentraciones. La reduccion medida en la corriente pico a 40 mV para cada concentracion se uso para generar una curva dosis-respuesta, y la Kd y el coeficiente de Hill se determinaron con el software Origin (OriginLab Corp., Northampton, MA) como se ha descrito previamente (Zhou y col., 1998; Wulff y col., 2000; Bardien-Kruger y col., 2002; Kolski-Andreaco y col., 2004; Vennekamp y col., 2004). La Kdtambien se determino a partir de las tasas on (Ton) y off (Toff) para el bloqueo del canal. Despues de la estabilizacion de la 55 amplitud de corriente de Kv1.3 maxima, se perfundio ShK(L5) 70 pM sobre la celula, y los valores de corriente maximos trazados en funcion del tiempo se ajustaron a una unica funcion exponencial para determinar Ton. Despues de alcanzar el bloqueo de equilibrio, la perfusion se conmuto de nuevo a una solucion de bano sin bloqueador. Las corrientes maximas se trazaron como se ha descrito anteriormente para determinar Toff. Kon, Koff y Kd se calcularon asumiendo una unica reaccion bimolecular entre ShK(L5) y Kv1.3: Kon = 1 - Tonx Koff /[Ton x
concentracion de ShK(L5)]; Koff = 1/Toff; Kd =Koff / Kon (Peter y col., 2001). Para los canales Kv11.1, el bloqueo de corriente se midio tanto en 20 como en -50 mV (corriente de cola). Para los canales Koa, Kir2.1, y las corrientes de cloruro activadas por hinchazon, se midio el cambio en la conductancia de la pendiente por los analogos de ShK y, para las corrientes de Na+ y Ca2+, la reduccion de la corriente minima.
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Tincion para citometna de flujo y microscopia de fluorescencia. Los fenotipos de linfocitos T de PBMC humanas, esplenocitos de rata y linfocitos T PAS se determinaron por citometna de flujo. Las PBMC se tineron triplemente con anticuerpo anti-CD3 conjugado con Cy-cromo (BD Pharmingen, San Diego, CA), anticuerpo anti- CD45RA conjugado con ficoeritrina (BD Pharmingen), y anticuerpo anti-CCR7 conjugado con isotiocianato de 10 fluorescema (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los esplenocitos de rata y los linfocitos T tenidos con PAS se tineron doblemente con anticuerpo anti-CD3 conjugado con Cy-cromo y anticuerpo anti-CD45RC conjugado con
isotiocianato de fluorescema (BD Pharmingen). Las celulas tenidas se analizaron con un FACScan (BD Biosciences, San Jose, CA).
15 Se usaron dos enfoques para evaluar la expresion de protema Kv1.3 en los linfocitos T PAS. En primer lugar, las celulas PAS se tineron con ShK-F6CA (10 nM; Bachem Bioscience Inc.), un analogo de ShK etiquetado con
fluoroforo, y se analizaron por citometna de flujo como se ha descrito previamente (Beeton y col., 2003). Para los
experimentos de competicion, las celulas PAS se incubaron previamente con exceso de ShK(L5) no marcado (100 nM) antes de la adicion de ShK-F6CA 10 nM. En segundo lugar, las celulas PAS se permeabilizaron y se 20 tineron con anticuerpo anti-Kv1.3 (Koch y col., 1997) (donado por Hans-Gunther Knaus, Innsbruck, Austria) seguido de un anticuerpo secundario conjugado con Alexa-488 (Molecular Probes, Eugene, OR). Las celulas tenidas se visualizaron con un microscopio confocal Zeiss LSM-510 META (Carl Zeiss GmbH, Jena, Alemania), las
intensidades de fluorescencia se midieron para las celulas individuales (n = 10-15), y el analisis estadfstico se realizo usando la prueba U de Mann-Whitney.
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Estudios funcionales. La proliferacion de linfocitos T humanos y de rata se determino con ensayos de incorporacion de [3H]timidina como se ha descrito previamente (Beeton y col., 2001a,b; Wulff y col., 2003). Para las mediciones de produccion de IL2, los linfocitos T PAS se activaron con MBP en presencia o ausencia de ShK o ShK(L5) durante 8 h, y los sobrenadantes de cultivo se recogieron como se ha descrito previamente (Beeton y col., 30 2001a). IL2 se detecto en los sobrenadantes usando el kit de IL2 de rata Quantikine (R&D Systems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El efecto de la IL2 exogena (20 unidades/ml; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) en la proliferacion de linfocitos T PAS se determino como se ha descrito previamente (Beeton y col., 2001a).
Determinacion de la semivida circulante y estabilidad plasmatica. Se anadieron cantidades conocidas de 35 ShK(L5) a suero de rata Lewis, y la actividad de bloqueo en los canales Kv1.3 se ensayo por fijacion de membranas para establecer una curva dosis-respuesta estandar. Las muestras de suero de ratas Lewis obtenidas en diversos momentos despues de inyecciones subcutaneas o intravenosas individuales de ShK(L5) se ensayaron para comprobar la actividad de bloqueo de Kv1.3 por fijacion de membranas y los niveles de ShK(L5) se determinaron a partir de la curva estandar como se ha descrito previamente (Beeton y col., 2001b). En otros experimentos, las ratas 40 Lewis recibieron inyecciones diarias individuales de 10 pg/kg de ShK(L5) y los niveles sericos de ShK(L5) se determinaron 24 h despues de cada inyeccion los dfas 1 a 5. Para determinar la estabilidad en plasma de ShK(L5), el plasma de rata con adiciones con una cantidad conocida de ShK(L5) se incubo a 37 °C durante duraciones variables y despues se ensayo para comprobar la actividad de bloqueo de Kv1.3; la cantidad de ShK(L5) residual en estas muestras se determino a partir de la curva estandar.
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Ensayos citotoxicidad y prueba de Ames. PBMC humanas, celulas PAS, Jurkat, RPMI 8226 y Burkitt se desarrollaron durante 48 h en presencia o ausencia de ShK(L5) 100 nM. Despues, las celulas se tineron con el kit de viabilidad/citotoxicidad LIVE/DEAD (Molecular Probes) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y el porcentaje de celulas vivas y muertas se determino usando un lector de microplacas de fluorescencia (CytoFluor; 50 Applied Biosystems, Foster City, CA). Se uso Triton X-100 (0,1 %) como control positivo para la muerte celular. Para la prueba de Ames, la actividad mutagenica de ShK(L5) se determino en la cepa de ensayo de Salmonella typhimurium TA97a por Nelson Laboratories (Salt Lake City, UT).
Estudios EKG para evaluar la toxicidad cardiaca. Se usaron estudios electrocardiograficos con transmisores EKG 55 implantados (Data Sciences International, Arden Hills, MN) para el analisis de la variabilidad de la frecuencia cardiaca en animales que recibieron ShK(L5) o vehmulo. Los protocolos experimentales se revisaron y se aprobaron por el Institutional Animal Care and Use Committee de UC Davis. Seis ratas Lewis (9-11 semanas de edad; peso = 219 + 9 g) se anestesiaron con una mezcla de ketamina (80 mg/kg) y xilazina (7,5 mg/kg) administrada por inyeccion intramuscular. Los transmisores EKG se colocaron en la cavidad peritoneal de cada rata y se tunelaron dos
electrodos EKG por via subcutanea al hombro derecho y al caudal del espacio xifoides hasta la caja toracica. Se administro un analgesico, carprofeno (5 mg/kg, subcutaneo), al final de la cio^a. Dos semanas despues de la cirug^a, se realizo un registro EKG inicial en las ratas durante 2 h (dfa 1). Despues, se inyecto el vehnculo por v^a subcutanea (PBS + suero de rata al 2 %) y se continuo el registro durante 8 h mas. Despues, los animales se 5 devolvieron a sus jaulas. El dfa 2, se realizo un registro EKG inicial durante 2 h despues de lo cual, se inyecto por via subcutanea ShK(L5) (10|jg/kg disuelto en vehnculo) y el registro EKG continuo durante 8h mas. Los datos registrados de 1,5 a 3,5 h despues de las inyecciones se usaron para el analisis de los parametros de variabilidad de la frecuencia cardiaca estandar tanto en los dominios de tiempo como de frecuencia usando el software Nevokard (Bio-Impedance Technology, Inc., Chapel Hill, NC).
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Estudios de toxicidad subcronica. Ratas Lewis (9-11 semanas de edad; peso, 199 + 7 g) recibieron inyecciones subcutaneas de ShK(L5) 10 jg/kgMa (n = 6) o solucion salina (n = 6) durante 2 semanas. Las ratas se pesaron a diario. El Comparative Biology Laboratory en la University of California, Davis realizo el analisis qmmico (COBAS MIRA Plus; Roche Diagnostic Systems, Branchburg, NJ) y hematologico (analizador de hematologfa multiespecie 15 HEMAVET® 850; CDC Technologies, Oxford, CT) en muestras sangumeas extrafdas al final de 2 semanas. Suspensiones celulares individuales preparadas a partir de timos y bazos extrafdos de seis animales a los que se les dio ShK(L5) y seis a los que se les dio solucion salina se tineron con anticuerpos espedficos para diversos marcadores de linfocitos T y B (BD Pharmingen) y se analizaron por citometna de flujo.
20 Prevencion y tratamiento de EAE adoptiva aguda y prevencion de DTH en ratas Lewis. Se adquirieron ratas Lewis endogamas hembra de 9 a 11 semanas de edad en Harlan-Sprague-Dawley (Indianapolis, IN) y se alojaron en condiciones de barrera con comida para roedores irradiada y agua acidificada ad libitum. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices del National Institutes of Health y se aprobaron por el Institutional Animal Care and Use Committee en la University of California, Irvine. ShK(L5) se disolvio en PBS + suero de rata Lewis al 25 2 % (solucion salina) para inyeccion subcutanea. Se indujo EAE adoptiva aguda como se ha descrito previamente (Beeton y col., 2001a,b) con 6 a 8 x 106 celulas PAS activadas por (MBP) de protema basica de mielina. Se extrajo MBP de medula espinal de cobayas congeladas (Harlan Bioproducts, Indianapolis, IN) como se ha descrito previamente (Deibler y col., 1972). Las ratas se pesaron a diario y se observaron dos veces al dfa para evaluar los signos clmicos de la EAE. Para los ensayos de prevencion, las ratas recibieron 10 jg/kg/dfa de ShK(L5) desde el dfa 30 0 a 5, mientras que las ratas de control recibieron solucion salina. Para los ensayos de tratamiento, la administracion de ShK(L5) (10 jg/kg/dfa) o solucion salina se comenzo despues de la aparicion de la enfermedad (las ratas teman la cola cafda, estaban encorvadas, y habfan perdido >6 % de su peso durante 24 h) y se continuo durante 3 dfas.
Para los ensayos de DTH, las ratas Lewis se inmunizaron con una emulsion de ovalbumina en adyuvante completo 35 de Freund (Difco, Detroit, MI). Siete dfas despues, recibieron una inyeccion de ovalbumina disuelta en solucion salina en el pabellon auricular de una oreja y solucion salina en la otra oreja. Despues, las ratas recibieron inyecciones subcutaneas de ShK(L5) (10 jg/kg/dfa) o vehfculo (PBS + suero de rata Lewis al 2 %). La hinchazon de la oreja se midio 24 y 48 h mas tarde usando un micrometro cargado con resorte (Mitutoyo, Spokane, WA).
40 Resultados
ShK(L5), un analogo de ShK novedoso que muestra una selectividad de 100 veces para Kv1.3 sobre Kv1.1. ShK bloquea el canal Kv1.1 neuronal y el canal Kv1.3 con una potencia aproximadamente equivalente. Por lo tanto, la neurotoxicidad es una preocupacion bajo las circunstancias que compromete la barrera hematoencefalica y 45 permite la entrada de cantidades suficientes de ShK para bloquear los canales Kv1.1. La estrategia para disenar un inhibidor espedfico de Kv1.3 se guio por el hallazgo de que fluorescema-6-carboxilato (F6CA) que contiene ShK- F6CA unido a traves de un enlazador Aeea de 20 A de largo al extremo N de ShK mostro 80 veces de selectividad para Kv1.3 sobre Kv1.1 (Beeton y col., 2003). Dado que F6CA puede existir como un carboxilato restringido o tambien como una lactona ciclada, no estaba claro si la especificidad a Kv1.3 de ShK-F6CA fue un resultado de la 50 carga negativa de F6CA, la hidrofobicidad creada por este nucleo de fluorescema voluminoso grande, el apilamiento electronico n-n planar potencial, o una combinacion de todas estas contribuciones potenciales. Para distinguir entre estas posibilidades y con la intencion de desarrollar un inhibidor selectivo a Kv1.3 no fluorescente, se genero una serie de 12 analogos de ShK N-terminalmente sustituidos para probar algunas de estas interacciones. Uniendo tirosina, fenilalanina o sus derivados (variables en carga, tamano e hidrofobicidad) a traves de un enlazador Aeea al 55 extremo N de ShK, se pudo probar los efectos de carga e hidrofobicidad para comprender mejor la mejora de selectividad observada con la sustitucion de F6CA.
En el ejemplo mostrado en la figura 1A, L-fosfotirosina (L-pTyr), un aminoacido aromatico modificado post- traduccionalmente negativamente cargado (carga neta -2), se unio a traves del enlazador AEEA a ShK-Arg1 para
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generar un analogo novedoso denominado ShK(L5). ShK y ShK(L5) se ensayaron en los canales Kv1.3 y Kv1.1 expresados de forma estable en celulas L929. La figura 1B muestra los efectos de ShK y ShK(L5) en corrientes de Kv1.3 y Kv1.1 provocadas por pulsos de despolarizacion de 200 ms de un potencial de retencion de -80 a 40 mV. Ambos peptidos bloquearon de forma reversible Kv1.3 y Kv1.1 de una manera dependiente de la dosis con coeficientes de Hill de 1 (figura 1, B-D). Los valores de Kd se determinaron a partir de las curvas dosis-respuesta mostradas en la figura 1C usando el software Origin. ShK bloqueo Kv1.3 (Kd = 10 + 1 pM) y Kv1.1 (Kd = 28 + 6 pM) con una potencia aproximadamente equivalente segun se espero (figura 1C). Por el contrario, ShK(L5) fue selectivo 100 veces para Kv1.3 (Kd = 69 + 5 pM) sobre Kv1.1 (Kd = 7,4 + 0,8 nM) (figura 1, B y C). El transcurso de tiempo del bloqueo de corriente de Kv1.3 por ShK(L5) y su lavado se muestra en la figura 1D. La constante temporal (Ton) de
absorcion de ShK(L5) fue 131 + 21 s (n = 7), mientras que la constante temporal (Toff) para el lavado peptfdico fue de 150 + 28 s (n = 4). La Kd (57 + 7 pM) calculada a partir de los valores de Kon (15 x 106 + 0,5 x 106 M-1s-1) y Koff (0.0059 + 0.0013 s-1) es consistente con la Kd (69 + 5 pM) determinada con el uso del software Origin.
imagen3
Compuesto
Residuo conectado en la posicion-2 Carga neta en la posici6n-2 Kd en Kv1.3 [pM] Kd en Kv1.1 [pM] proporcion de KdS
ShK
10±1 28 ±6 2,8
ShK(L5)
L-p-Tyr ' -2 69±5 7.400 ±900 104,2
ShK(D5)
D-p-Tyr -2 1.100 ±150 39.000 ±650 35,4
SftK(L6)
L-p-Tyr monometilo -1 10 ±1 112 ±9 11,2
ShK(L7)
L-p-Tyrdimetilo 0 24 ±2 175 ±30 7,3
ShK(L4)
L-Tyr 0 47 ±6 159 ±5 3,4
ShK(Ll)
L-Pmp -2 293 ±45 LOOO ±100 3,4
ShK(Dl)
D-Pmp -2 96 ±12 1.400 ±80 14,6
ShK(D2)
D-Pmp monoetilo -1 311± 16 1.100 ±100 3,5
■ ShK(L3)
L-Pmp dietilo 0 71 ±6 1.100 ± 200 15,5
ShK(D3)
D-Prap dietilo 0 70±9 166± 13 2,4
ShK{L9)
L-p-COOH-Phe -1 94±7 319±36 3,4
SKK-L8
L-p-amino-Phe +1 65±4 142± 13 2,2
SMC-F6CA
F6CA -1 48 ±4 4.000 ±300 83
ShK-Dap^
Ninquno Ninauno 52±3 1.800 ±577 35
Figura 1.
Generacion de un bloqueador de Kv1.3 selectivo. A, modelo molecular de ShK basado en la estructura de RMN publicada. El Lys22, crftico para el bloqueo de canal, se resalta en color naranja. L-pTyr se unio al grupo a-amino de Arg1 de ShK (resaltado en color cian) a traves de un enlazador Aeea (derecha). Las estructuras del enlazador y L- pTyr se modelaron con AM1 en Hyperchem. B, efecto de ShK (superior) y ShK(L5) (inferior) en corrientes de Kv1.3 y Kv1.1 en celulas transfectadas de forma estable. C, inhibicion dependiente de la dosis de Kv1.3 (sfmbolos abiertos) y Kv1.1 (sfmbolos cerrados) por ShK (azul) y ShK(L5) (rojo). Los valores de Kd en Kv1.3 = 10 + 1 pM (ShK) y 69 + 5 pM (ShK(L5)); valores de Kd en Kv1.1 = 28 + 6 pM (ShK) y 7,4 + 0,8 nM (ShK(L5)). D, transcurso de tiempo de absorcion y lavado de ShK(L5) en Kv1.3. Las celulas se mantuvieron a un potencial de retencion de -80 mV y se despolarizaron durante 200 ms a 40 mV cada 30 s. E, valores de Kd mostrados para la inhibicion de Kv1.3 y Kv1.1 por analogos de ShK. Los valores de Kd para ShK-F6CA y ShK-Dap22 proceden de fuentes publicadas (Kalman y col., 1998; Beeton y col., 2003; Chandy y col., 2004).
Se ensayaron otros analogos de ShK en los canales Kv1.3 y Kv1.1 (figura 1E). ShK(D5) que contenfa D-fosfotirosina fue selectivo 35 veces para Kv1.3 sobre Kv1.1, pero fue de un orden de magnitud menos potente que ShK(L5). ShK(L6) que contenfa L-pTyr-monometilo mostro una especificidad moderada (11 veces) para Kv1.3, mientras que los analogos de ShK que contenfan L-pTyr-dimetilo o L-Tyr no fueron selectivos para Kv1.3 sobre Kv1.1 (figura 1E). Los analogos que contenfan fenilalanina o sus derivados (variables en masa entera, densidad de n electrones y
carga) fueron moderadamente espedficos o no espedficos para Kv1.3 sobre Kv1.1 (figura 1E). La especificidad de 100 veces de ShK(L5) para Kv1.3 sobre Kv1.1 es mayor que la de ShK-F6CA (80 veces), ShK(D5) (35 veces), ShK- Dap22 (33 veces), o cualquier otro analogo de ShK ensayado (figura 1C).
5 ShK(L5) es un inhibidor de Kv1.3 altamente especifico. Se evaluo la especificidad de ShK(L5) en un panel de 20 canales ionicos (Tabla 1). ShK(L5) bloqueo el canal Kv1.3 en linfocitos T con una Kd (76 pM) equivalente a su Kd en el canal clonado (69 pM). Fue selectivo 100 veces para Kv1.3 sobre Kv1.1, selectivo 260 veces sobre Kv1.6, selectivo 280 veces sobre Kv3.2, selectivo 680 veces sobre Kv1.2 y selectivo >1000 veces sobre todos los demas canales ensayados. Cabe destacar que fue selectivo para Kv1.3 1600 veces sobre KCa3.1, el canal de K+ activado 10 por calcio que regula la activacion de las celulas indiferenciadas y linfocitos Tcm humanos (Wulff y col., 2003). El ShK nativo fue menos selectivo que ShK(L5). ShK fue selectivo 2,8 veces para Kv1.3 (Kd = 10 + 1 pM) sobre Kv1.1 (Kd 28 + 6 pM), selectivo 20 veces sobre Kv1.6 (200 + 20 pM), selectivo 500 veces sobre Kv3.2 (Kd = 5000 + 1000 pM), y selectivo >1000 veces sobre Kv1.2 (10 + 1 nM) y KCa3.1 (Kd = 28 + 3 nM). Margatoxina, un peptido procedente del veneno de escorpion que se ha promocionado como un inhibidor de Kv1.3 espedfico (Lin y col., 1993; Koo y col., 15 1997; Middleton y col., 2003) tambien fue no espedfica. Fue selectivo 5 veces para Kv1.3 (110 + 12 pM) sobre Kv1.2 (Kd = 520 + 1 pM), selectivo 9 veces sobre Kv1.1 (10 + 1 nM), y selectivo >1000 veces sobre Kv1.6 y Kv3.2 (Kd > 100 nM). La luteolina, un nutraceutico vendido para enfermedades autoinmunes (
http://www.lutimax.com) sobre la base de que es un inhibidor de Kv1.3 (Lahey y Rajadhyaksha, 2004), bloqueo debilmente Kv1.3 (Kd = 65 + 5 pM) y no mostro ninguna selectividad sobre Kv1.1 (Kd = 77 + 5 pM), Kv1.2 (Kd = 63 + 4 pM), o Kv1.5 (Kd = 41 + 3 pM). La 20 exquisita especificidad de ShK(L5) para Kv1.3, junto con su afinidad picomolar para el canal, le hace un inmunosupresor potencialmente atractivo.
TABLA 1
Selectividad de ShK(L5)
Canales
Kd de ShK(L5)
Kv1.1
pM 7000+1000
Kv1.2
48.000 + 7000
Kv1.3 (clonado)
69 + 5
Kv1.3 (nativo)
76 + 8
Kv1.4
137.000 + 3000
Kv1.5
100.000 (N.E.)
Kv1.6
18.000 + 3000
Kv1.7
100.000 (N.E.)
Kv2.1
100.000 (N.E.)
Kv3.1
100.000 (N.E.)
Kv3.2
20.000 + 2000
Kir2.1
100.000 (N.E.)
Kv11.1 (HERG)
100.000 (N.E.)
Kca 1.1
100.000 (N.E.)
Kca2.1
100.000 (N.E.)
Kca2.3
100.000 (N.E.)
Kca3.1
115.000 + 5000
Nav1.2
100.000 (N.E.)
Nav1.4
100.000 (N.E.)
Canal Cl- de linfocitos T activados por hinchazon
100.000 (N.E.)
Cav1.2
100.000 (N.E.)
- N.E., ningun efecto
25
ShK(L5) suprime preferiblemente y de forma persistente la proliferacion de linfocitos Tem humanos. Para evaluar la actividad inmunosupresora in vitro de ShK(L5), se comparo su capacidad para suprimir la proliferacion estimulada por el anticuerpo anti-CD3 de las lmeas de linfocitos Tem humanos frente a las PBMC humanas que contienen una mezcla de linfocitos indiferenciados y Tcm. La citometna de flujo confirmo los fenotipos de la superficie 30 celular de las dos poblaciones estudiadas. Las lmeas Tem fueron >90 % de CCR7"CD45RA" (figura 2A), mientras que las PBMC conteman un 65 % de linfocitos CCR7+CD45RA+ (indiferenciados) y un 18 % de linfocitos CCR7+CD45RA" (Tcm) (figura 2B). La figura 2C muestra que ShK(L5) y ShK eran 60 veces mas eficaces en la supresion de la proliferacion de linfocitos Tem (CI50 = ~80 pM) en comparacion con las PBMC (CI50 = 5 nM, p < 0,05). La sensibilidad inferior de las PBMC puede explicarse por una rapida regulacion por aumento de los canales KCa3.1 en las celulas
indiferenciadas y los linfocitos TcMtras la estimulacion como se ha indicado previamente (Ghanshani y col., 2000; Wulff y col., 2003). De acuerdo con esta interpretation, las PBMC activadas durante 48 h para regular por aumento la expresion de KCa3.1, despues en reposo durante 12 h y activadas de nuevo con el anticuerpo anti-CD3, fueron completamente resistentes al bloqueo de ShK(L5) (figura 2D, flecha superior). Las PBMC que se hadan 5 suprimido por ShK(L5) durante la primera ronda de estimulacion mostraron una resistencia identica a ShK(L5) cuando las celulas se lavaron, reposaron y se estimularon de nuevo con el anticuerpo anti-CD3. Estos resultados corroboran un informe anterior que mostraba que las celulas indiferenciadas y los linfocitos Tcm escapan de los inhibidores de Kv1.3 por la regulation por aumento de los canales KCa3.1 (Wulff y col., 2003). Por lo tanto, ShK(L5) suprime preferiblemente y de forma persistente la proliferation de linfocitos Tem.
10
imagen4
Figura 2.
ShK(L5) suprime preferiblemente la proliferacion de linfocitos Tem humanos. Las PBMC humanas (A) y una lmea 15 Tem humana (B) se tineron con anticuerpos contra CD3, CD45RA y CCR7. Las intensidades de tincion de CD45RA y CCR7 se determinaron por citometna de flujo en la poblacion regulada por CD3+. C, inhibition dependiente de la dosis por ShK (azul) y ShK(L5) (rojo) de la incorporation de [3H] timidina por las PBMC (sfmbolos abiertos, una mezcla de celulas indiferenciadas/linfocitos Tcm) y linfocitos Tem (sfmbolos cerrados) estimulados durante 48 h con anticuerpo anti-CD3. D, PBMC humanas previamente activadas (celulas indiferenciadas/linfocitos Tcm) que regulan 20 por aumento la expresion de KCa3.1 (Ghanshani y col., 2000) que se vuelven resistentes a la inhibicion de ShK(L5) cuando se reactivan con el anticuerpo anti-CD3. Se ha demostrado previamente que estas celulas se vuelven sensibles al inhibidor espedfico de Kca3.1 TRAM-34 (Ghanshani y col., 2000).
ShK(L5) inhibe la proliferacion de y la production de IL2 por los linfocitos TEM de rata; la IL2 exogena anula 25 parcialmente la supresion. Como un preambulo para evaluar la eficacia terapeutica de ShK(L5), se examino su capacidad para suprimir la proliferacion de la lmea de linfocitos T de memoria, PAS, que provoca una enfermedad tipo EM en ratas (Beraud y col., 1993). Como un control, se usaron linfocitos T de bazo de rata. Para confirmar el estado de diferenciacion de las dos poblaciones celulares, se evaluo la expresion de CD45RC, un marcador de linfocitos T indiferenciados (Bunce y Bell, 1997). Los linfocitos T esplenicos de rata fueron un 76 % de CD45RC+ (es 30 decir, principalmente celulas indiferenciadas), mientras que las celulas PAS fueron CD45RC, lo que sugiere que son celulas de memoria (figura 3A). Para determinar si las celulas PAS estan en el estado Tem o Tcm, se examino la expresion de Kv1.3 antes y 48 h despues de la activation. Se espera que los linfocitos Tem, pero no los linfocitos Tcm, regulen por aumento significativamente los niveles de Kv1.3 tras la estimulacion (Beeton y col., 2001b, 2003). Los experimentos de fijacion de membranas revelaron un llamativo aumento en la amplitud de corriente de Kv1.3 35 despues de la estimulacion con MBP de las celulas PAS coherente con la de sus linfocitos Tem (figura 3B). Como una medida independiente del numero de canales Kv1.3 en celulas PAS, se uso ShK-F6CA, un analogo de ShK marcado de forma fluorescente que se une espedficamente a Kv1.3 (Beeton y col., 2003). La intensidad de tincion ShK-F6CA determinada por citometna de flujo refleja el numero de tetrameros de Kv1.3 expresados en la superficie celular (Beeton y col., 2003). La intensidad de tincion de ShK-F6CA (10 nM) aumento con la activacion por MBP de 40 las celulas PAS, y un exceso de ShK(L5) no etiquetado (100 nM) inhibio de forma competitiva la tincion de ShK- F6CA (figura 3C). Como una prueba final, se realizo microscopfa confocal en celulas PAS inactivas y estimuladas por MBP que se han fijado y tenido con un anticuerpo espedfico de Kv1.3. De acuerdo con los datos en la figura 3, B y C, los linfocitos T PAS en reposo ternan una intensidad de tincion de Kv1.3 de 4,4 ± 0,6, y este valor aumento a
10,6 ± 2,3 (p < 0,005) despues de la activacion inducida por antigeno (figura 3D), que mostraba un aumento en la expresion de protema de Kv1.3 despues de la activacion. Por lo tanto, las celulas PAS activadas por MBP son linfocitos CD45RC- Kv1.3high Tem, mientras que en los linfocitos T esplenicos de rata usados en estos experimentos estan predominantemente en el estado indiferenciado.
5
imagen5
Linfocitos T PAS
CD45RC
Linfocitos Tem de rata en reposo
S&K-F6CA
Linfocitos Tem de rata activados
Kvl.3
ShK-F6CA
Linfocitos Tem
Linfocitos Tem
io«io*io*io3io'*ios
10° 10110* IQ310410s ShK(L5) [pM]
Linfocitos T esplenicos
CD45RC
e I d.5>
el
lonowiano'io5
Compuesto [pM]
Compuesto [pM]
Figura 3.
ShK(L5) suprime preferiblemente la proliferation de linfocitos Tem de rata. A, tincion con CD45RC de linfocitos T 10 esplenicos de rata (izquierda) y linfocitos T PAS (derecha) detectados por citometna de flujo. B, corrientes de Kv1.3 mostradas por linfocitos T PAS inactivos (superior) y activados por el antigeno de mielina (inferior). C, perfiles de citometna de flujo de tincion con ShK-F6CA en linfocitos T PAS inactivos (superior) y activados por antigeno de mielina (inferior). Celulas no tenidas (lmeas de color negro) y celulas tenidas con ShK-F6CA (relleno de color verde). La competition de la tincion con ShK-F6CA por ShK(L5) no marcado se rellena de color rojo. D, imagenes 15 confocales de la inmunotincion de Kv1.3 en linfocitos T PAS inactivos (superior) y activados con antigeno de mielina (inferior). El analisis estadfstico se realizo usando la prueba U de Mann-Whitney. E, inhibition dependiente de la dosis por ShK (azul) y ShK(L5) (rojo) de la incorporation de [3H]timidina por celulas de rata indiferenciadas/linfocitos Tcm (sfmbolos abiertos) y linfocitos Tem (sfmbolos cerrados) activados con Con A (1 |jg/ml). F, inhibicion dependiente de la dosis por ShK (azul) y ShK(L5) (rojo) de la secretion de IL2 por los linfocitos T PAS 7 h despues de la 20 estimulacion con MBP. G, la inhibicion inducida por ShK(L5) de la incorporacion de [3H]timidina activada por el antigeno de mielina por los linfocitos T PAS (sfmbolos abiertos) se invierte por la adicion de 20 unidades/ml de IL2 (sfmbolos cerrados).
La proliferacion activada por MBP de las celulas PAS se suprimio ~1000 veces mas eficazmente por ShK(L5) y ShK 25 (CI50 = ~80 pM) que la proliferacion inducida por mitogeno de linfocitos T esplenicos de rata (figura 3E, CI50 - 100 nM; p < 0,05). Estos resultados corroboran los hallazgos con linfocitos T humanos (figura 2). GShK(L5) inhibio la production de IL2 inducida por MBP por celulas PAS (figura 3F), y la IL2 exogena parcialmente anulo la supresion de ShK(L5) de la proliferacion de celulas PAS (figura 3G). Estudios anteriores indicaron hallazgos similares con inhibidores de Kv1.3 menos espetificos en linfocitos T humanos, de rata o de cerdo enano (Chandy y col., 30 1984; Koo y col., 1997; Beeton y col., 2001a). En resumen, ShK(L5) es un inhibidor potente y selectivo de linfocitos Tem humanos y de rata y, por lo tanto, puede tener uso terapeutico en enfermedades autoinmunes dirigiendose preferiblemente a los linfocitos Tem que contribuyen a la patogenesis de estos trastornos (Chandy y col., 2004).
Valores plasmaticos de ShK(L5) despues de una administracion subcutanea. Antes de embarcarse en estudios 35 in vivo en un modelo de EAE de rata, se uso un bioensayo de fijacion de membranas para averiguar si los niveles
circulantes de ShK(L5) despues de la inyeccion subcutanea fueron suficientes para inhibir los linfocitos Tem. Se ensayaron muestras de suero de ratas tratadas con ShK(L5) y de control para bloquear la actividad en los canales Kv1.3. El suero de control no mostro ninguna actividad de bloqueo detectable, indicando una ausencia de bloqueadores de canal endogeno. Para estandarizar el ensayo, se anadieron cantidades conocidas de ShK(L5) al 5 suero de rata, y estas muestras se ensayaron en canales Kv1.3. Las muestras de suero con adiciones bloquearon las corrientes de Kv1.3 de una forma dependiente de la dosis (Kd, 77 ± 9 pM) que fue indistinguible del efecto de ShK(L5) en ausencia de suero (figura 4A). Los niveles de ShK(L5) en animales tratados se determinaron por comparacion con la curva estandar. ShK(L5) fue detectable en suero 5 min despues de una unica inyeccion subcutanea de 200 pg/kg (figura 4B). Los niveles pico (12 nM) se alcanzaron en 30 min y despues el nivel cayo 10 hasta un valor inicial de aproximadamente 300 pM durante 420 min (figura 4B). La desaparicion de ShK(L5) de la sangre pudo ajustarse por un unico exponencial (figura 4C). La semivida circulante se estimo en ~50 min.
imagen6
B
ShK(L5) fpM]
imagen7
5 10 20 30 60 120180420
imagen8
Tiempo despuGs de inyeccion de ShK(L5) [min]
imagen9
inyeccion de ShK(L5) [min]
Tiempo despues de la inyeccion de ShK(L5) [horas]
imagen10
Figura 4.
15
Semivida circulante y estabilidad de ShK(L5). A, se anadieron cantidades conocidas de ShK(L5) a suero de rata (■) o a PBS (A) y la actividad de bloqueo se determino en canales Kv1.3 expresados de forma estable en celulas L929. B, una unica dosis de 200 pg/kg de ShK(L5) se inyecto por via subcutanea a cuatro ratas. Se extrajo sangre en los momentos indicados y el suero se ensayo por fijacion de membranas para determinar la cantidad de ShK(L5). C, 20 datos ajustados a un unico decaimiento exponencial. Semivida » 50 min. D, cinco ratas Lewis recibieron inyecciones subcutaneas a diario individuales de 10 pg/kg/dia de ShK(L5) durante 5 dias. Se extrajo sangre cada manana (24 h despues de la inyeccion previa) y se ensayo para el bloqueo de la actividad en los canales Kv1.3 por fijacion de membranas. E, las ratas recibieron una unica dosis de 10 pg/kg de ShK(L5) por via subcutanea (barras blancas; n = 4) o intravenosa (barras negras; n = 4). Se extrajo sangre en los momentos indicados. El suero se ensayo por 25 fijacion de membranas para determinar la cantidad de ShK(L5) en sangre. F, una dosis de hemi-bloqueo de ShK(L5) al plasma de rata (□) o a PBS que contema plasma de rata al 2 % (■) y se incubo a 37 °C durante una duracion variable. Las alicuotas se recogieron en los momentos indicados y la actividad de bloqueo se determino en los canales Kv1.3.
30 Dado que el nivel serico maximo despues de 200 pg/kg (12 nM) excede significativamente el requisito para el
bloqueo selectivo de los canales Kv1.3 y la funcion de los linfocitos Tem, se ensayaron dosis inferiores. Despues de una unica inyeccion de 10 jg/kg, la concentracion serica maxima de ShK(L5) alcanzo «500 pM en 30 min (datos no mostrados), una concentracion suficiente para bloquear >90% de Kv1.3 pero sin afectar a Kv1.1. La administracion a diario repetida de esta dosis (10 jg/kgMa) dio como resultado niveles en estado estable de ~300 pM (medidos 5 24 h despues de la inyeccion; figura 4D), que es suficiente para causar una supresion del 60 al 70 % de linfocitos Tem con poco efecto sobre las celulas indiferenciadas/linfocitos Tcm. El nivel en "estado estable" es inesperado dada la semivida circulante estimada de ~50 min e indica que ShK(L5) se "acumula" en una administracion repetida. Para determinar si el "deposito" estaba en la piel o en otra parte en el cuerpo, se midieron los niveles en sangre de ShK(L5) 10 h despues de que las ratas recibieran inyecciones intravenosas o subcutaneas individuales de 10 jg/kg 10 de ShK(L5). El peptido desaparecio con el mismo transcurso de tiempo despues de la administracion por cualquier ruta (figura 4E) indicando que la piel no es responsable del nivel en estado estable de 300 pM de ShK(L5) alcanzado despues de una unica inyeccion diaria de 10 jg/kg (figura 4D), y el deposito o los depositos residen en otra parte.
El exito al conseguir un nivel en estado estable de 300 pM de ShK(L5) despues de inyecciones individuales a diario 15 de 10 jg/kgMa sugiere que el peptido puede ser estable in vivo. Para examinar su estabilidad, se incubo ShK(L5) en plasma de rata o en PBS que contema plasma de rata al 2% a 37 °C durante duraciones variables y despues se midio la actividad de bloqueo de Kv1.3. En ambos conjuntos de muestras con adiciones (plasma y PBS) se observo una reduccion del 50 % en la actividad de bloqueo de Kv1.3 en aproximadamente 5 h, presumiblemente debido a la union del peptido a la superficie plastica del tubo, y despues el nivel permanecio estable durante los siguientes 20 2 dfas (figura 4F). Como un ensayo de estabilidad anadido, se comparo la actividad de bloqueo de Kv1.3 frente a la actividad de bloqueo de Kv1.1 de sueros de ratas tratadas con ShK(L5). Si ShK(L5) se modifica in vivo, por desfosforilacion de pTyr o escision de la cadena lateral Aeea-pTyr, producira ShK(L4) y ShK, respectivamente, ninguno de los cuales es selectivo para Kv1.3 sobre Kv1.1 (figura 1E). Las muestras en suero de animales tratados con ShK(L5) mostraron la misma selectividad para Kv1.3 sobre Kv1.1 que ShK(L5), indicando que el peptido no 25 experimenta las modificaciones que se han indicado anteriormente. Tomados en conjunto, estos resultados indican que ShK(L5) es notablemente estable en plasma y alcanza concentraciones en suero farmacologicamente relevantes despues de inyecciones subcutaneas diarias individuales de 10 jg/kg.
Estudios de toxicidad. Se realizaron varios ensayos in vitro e in vivo para determinar si ShK(L5) muestra alguna 30 toxicidad (Tabla 2). Las celulas linfoides humanas y de rata incubadas durante 48 horas con una concentracion (100 nM) de ShK(L5) >1200 veces mayor que la dosis de hemi-bloqueo de Kv1.3 o la CI50 para la supresion de Tem (70-80 pM), mostraron una citotoxicidad minima. La misma alta concentracion de ShK(L5) fue negativa en el ensayo de Ames en la cepa de ensayo TA97A, sugiriendo que no es un mutagen. Ningun ensayo in vitro pudo detectar una toxicidad significativa.
35
TABLA 2
Estudio de toxicidad de ShK(L5). Los datos se expresan como media + D.E.
Pruebas in vitro
ShK(L5) 100 nM
Citotoxicidad (% de celulas muertas)
PBMC humanas
7,5 + 4,3
Linfocitos T PAS
8,1 + 0,8
Celulas Jurkat
5,5 + 3,3
Linfoma de Burkitt
3,1 + 0,9
Mieloma RPMI 8226
6,5 + 2,1
Ensayo de Ames
Negativo
Ensayos in vivo agudos
Solucion salina SHK(L5) 10 pg/kg
Electrocardiograma*
Frecuencia cardiaca
302 + 13 311 + 20
SDNN
13,3 + 3,0 17,8 + 4,4
% CV
6,7 + 1,4 92 + 2,2
SDANNsmin
5,0 + 2,0 6,9 + 2,3
rMSSD
6,8 + 2,2 9,8 + 3,5
HF (n.u.)
71 + 21 79 + 37
HF (%)
50 + 8 53 + 10
LF (n.u.)
68 + 4 64 + 10
LF (%)
50 + 8 47 + 10
LF/HF
1,1 + 0,4 1,3 + 0,7
Ensayos sub-cronicos in vivo
Solucion salina ShK(L5) 10 gg/kg/dia durante 2 semanas
Aumento de peso (%)
72 + 1,8 62 + 1,7
Recuento sanguineo completo
Hematocrito (%)
403 + 1,4 39,0 + 4,9
Hemoglobina (g/dl)
15,3 + 0,5 15,0 + 1,5
MCV (fl)
48,5 + 0,2 48,3 + 0,3
MCH (pg)
18,5 + 0,8 18,5 + 0,6
MCHC (g/dl)
38,0 + 1,8 38,4 + 1,3
Globulos blancos totales (x 103mm"3)
7,1 + 2,1 7,1 + 2,5
Globulos rojos totales (x 106mm"3)
8,3 + 0,3 8,1 + 1,0
Plaquetas totales (x 103mm"3)
656 + 214 606 + 106
Qmmica sanguinea
Fosfatasa alcalina (U/I)
170 + 26 150 + 18
Glucosa (mg/dl)
139 + 21 150 + 18
Nitrogeno ureico en sangre (mg/dl)
17,1 + 2,6 15,0 + 1,7
Creatinina (mg/dl)
0,6 +0 0,6 + 0,1
Albumina (g/dl)
5,0 + 0,3 4,5 + 0,4
Poblaciones celulares timicas (%).
CD4"CD8"
3,6 + 1,1 43 + 0,7
CD4+CD8+
77,8 + 6,1 76,8 + 4,1
CD4+CD8-
8,5 + 1,7 11,2 + 2,0
CD4"CD8+
10,0 + 3,3 7,6 + 1,3
CD3+
89,5 + 1,6 93,2 + 3,5
Poblaciones esplenicas (%)
CD3+
72,4 + 4,4 65,4 + 0,1
CD3+CD45RC+
35,6 + 2,6 39,8 + 1,1
CD3+CD45RC"
23,6 + 2,3 26,5 + 1,3
CD3+CD4+
62,7 + 0,1 66,6 + 1,2
CD3+CD8+
26,9 + 0,1 25,0 + 0,2
IgM+
38,8 + 1,5 33,3 + 0,3
a Ensayado con pruebas t, P < 0,05 en todos los parametros. - SDNN, Desviacion estandar de todos los intervalos RR normal-normal; % CV, 100 x SDNN/intervalo RR medio;
SDANN5 min, desviacion estandar de la media de los intervalos RR normales para cada periodo de 5 min; rMSSD,
media cuadratica de diferencia sucesiva
HF (n.u.), energfa de alta frecuencia (0,75-2,5 Hz) en unidad
normalizada; LF (n.u.), energfa de baja
frecuencia (0,2-0,75 Hz) en unidad normalizada; MCV, volumen
corpuscular medio; MCH, hemoglobina corpuscular media; MCHC, concentracion de hemogloblina corpuscular
media.
El bloqueo inducido por farmacos de los canales Kv11.1 (HERG) ha contribuido a una mayor toxicidad cardiaca y la retirada de varios medicamentos del mercado. ShK(L5) no tiene ningun efecto sobre los canales Kv11.1 a 100 nM (>1430 veces la Kd para Kv1.3), y, por lo tanto, el regimen terapeutico escogido (10 jg/kg^a, 300 pM de nivel 5 circulante en estado estable) no debena causar cardiotoxicidad. Como un ensayo adicional, se realizo un analisis de variabilidad de la frecuencia cardiaca en ratas conscientes a las que se administro vehuculo (PBS + suero de rata al 2 %) el dfa 1, seguido de 10 jg/kgMa de ShK(L5) el dfa 2. shK(L5) no tuvo ningun efecto sobre la frecuencia cardiaca ni los parametros HRV estandar (variabilidad de la frecuencia cardiaca) tanto en el dominio de tiempo como de frecuencia (Task Force of the European Society of Cardiology and the North American Society of Pacing 10 Electrophysiology, 1996).
Estimulados por los experimentos de toxicidad aguda, se realizo un estudio de toxicidad subcronica en el que se administraron inyecciones subcutaneas diarias a ratas de 10 jg/kg de ShK(L5) o vehnculo durante 2 semanas (n = 6 en cada grupo). Los animales tratados con ShK(L5) ganaron peso en el mismo grado que las ratas que recibieron 15 vetnculo (Tabla 2). El analisis hematologico y de qmmica de sangre no mostro ninguna diferencia entre las ratas tratadas con ShK(L5) y con vehnculo, y el analisis citometrico de flujo no revelo diferencias en las proporciones de subconjuntos de timocitos o linfocitos (Tabla 2). En conjunto, estos estudios sugieren que ShK(L5) es seguro.
Parar determinar el mdice de seguridad terapeutica, se administro una dosis 60 veces superior (600 jg/kgMa) de 20 ShK(L5) a ratas sanas durante 5 dfas y no se observo ningun signo clmico de toxicidad, y no se percibio toxicidad
cuando ratas sanas recibieron una unica inyeccion de 1000 pg/kg de ShK(L5). La situacion es menos optimista cuando la barrera hematoencefalica esta comprometida, como sucede en EAE y EM. Las ratas con eAe que recibieron ShK(L5) 10 pg/kgMa durante 10 dfas, no mostraron signos de toxicidad. Por el contrario, el 40 % de las ratas (5 de 12) a las que se administraron 600 pg/kg/dfa durante 5 dfas, murieron el quinto dfa cuando desarrollaron 5 signos clmicos de EAE (DL50 extrapolada = 750 pg/kgMa). Ya que la concentracion pico de ShK(L5) en el suero (12 nM) despues de administracion de una unica inyeccion de 200 pg/kg es suficiente para bloquear >50% de los canales Kv1.1, la toxicidad observada en ratas con EAE a las que se administraron 600 pg/kgMa de ShK(L5) esta causada probablemente a la entrada en el cerebro de cantidades suficientes de ShK(LS) para bloquear Kv1.1. Por lo tanto, el mdice de seguridad terapeutica eficaz de ShK(L5) excede ampliamente de 100 en situaciones en las que la 10 barrera hematoencefalica no esta comprometida (como se observa en enfermedades autoinmunes que NO afectan al sistema nervioso central), mientras que el mdice de seguridad terapeutico es de 75 cuando se rompe la barrera hematoencefalica.
ShK(L5) previene y trata EAE adoptiva aguda y previene DTH en ratas Lewis. Se evaluo ShK(L5) para 15 comprobar la actividad inmunosupresora in vivo en dos modelos animales. Se ensayo su capacidad para prevenir y tratar EAE aguda inducida por la transferencia de linfocitos Tem PAS activados por MBP en ratas Lewis (Beeton y col., 2001a,2001b; Beraud y col., 1993), asf como para suprimir la reaccion de DTH mediada por los linfocitos Tem (Soler y col., 2003). Las celulas PAS se activaron con MBP durante 48 h in vitro y despues se transfirieron de forma adoptiva (6-8 x 106 celulas viables) a ratas Lewis. Para el ensayo de prevencion, despues, las ratas recibieron 20 inyecciones subcutaneas de solucion salina (ratas de control) o ShK(L5) (10 pg/kgMa) durante 5 dfas. En el primer ensayo de prevencion, las ratas de control desarrollaron EAE leve (puntuacion clmica maxima promedio 2,0 + 1,2) con una aparicion media de 5,6 + 0,6 dfas (no mostrado). ShK(L5) redujo la gravedad de la enfermedad (puntuacion clmica maxima promedio, 0,7 + 0,6, p < 0,05). En el segundo ensayo de prevencion, las ratas de control desarrollaron EAE mas grave (puntuacion clmica maxima promedio 3,2 + 0,4) con una aparicion media de 4,8 + 25 0,4 dfas (figura 5A). ShK(L5) redujo significativamente la gravedad de la enfermedad (puntuacion clmica maxima promedio 0,6 + 0,4, p < 0,007), pero no retraso significativamente la aparicion de la enfermedad (5,5 + 0,7 dfas; p = 0,07). No se apreciaron signos de toxicidad en estos estudios.
imagen11
Figura 5.
ShK-L5 previene DTH y EAE adoptiva aguda en ratas Lewis. A, prevention de EAE. Los linfocitos T PAS se 5 activaron in vitro, se lavaron y se inyectaron por via intraperitoneal el dia 0. Puntuacion clmica de EAE: 0 = sin signos clmicos, 0,5 = cola caida distal, 1 = cola caida, 2 = paraparesia o ataxia leve, 3 = paraparesia moderada, 4 = paralisis completa de las extremidades posteriores, 5 = 4 + incontinencia, 6 = muerte. A las ratas (n = 6/grupo) se les inyecto por via subcutanea vehmulo (□; n = 6) o ShK(L5) (■; n = 6; 10 ^g/kgMa) del dia 0 al dia 5. B, tratamiento de EAE. Los linfocitos T PAS se activaron in vitro, se lavaron y se inyectaron por via intraperitoneal el dia 0. El 10 tratamiento con ShK(L5) a 10 ^g/kg/dia se inicio cuando las ratas desarrollaron signos clmicos de EAE y se continuo durante 3 dias. C, la reaction de DTH se provoco contra ovalbumina y las ratas (n = 6/grupo) se trataron con ShK(L5) 10 ^g/kg/dia durante 2 dias, despues de lo cual se midio la hinchazon de la oreja. El analisis estadistico se realizo usando la prueba U de Mann-Whitney. 15 * * * * 20 * * * * 25
15 En el ensayo de tratamiento (figura 5B), a las ratas se les inyectaron celulas PAS activadas con MBP, se les
administro una solution salina o 10^g/kg/dia de ShK(L5) cuando desarrollaron inicialmente signos de EAE (cola
caida, postura jorobada y perdida del 6 % o mas de su peso durante 24 horas), y la terapia continuo durante tres
dias. Los signos clmicos de EAE alcanzaron su punto maximo el dia 6 en el grupo de control (puntuacion = 3,9 ± 0,7)
y el dia 7 en el grupo tratado (puntuacion = 1,9 ± 0,9; p < 0,05).
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Como una evaluation independiente de la actividad inmunosupresora de ShK(L5) in vivo, tambien se examino su
eficacia en la inhibition de la reaccion de DTH que esta mediada predominantemente por los linfocitos TEMde
tropismo cutaneo (Soler y col., 2003). Las ratas Lewis inmunizadas con ovalbumina y adyuvante se estimularon
7 dias mas tarde con ovalbumina en una oreja y solucion salina en la otra oreja. Despues, las ratas recibieron
25 inyecciones de solucion salina (ratas de control) o ShK(L5) (10 ^g/kg/dia) y se midio el grosor de la oreja como una
indicacion de DTH. Todas las ratas de control desarrollaron hinchazon de oreja 24 y 48 h despues de la estimulacion con ovalbumina, mientras que la reaccion de DTH fue sustancialmente mas moderada en los animales tratados con ShK(L5) (figura 5C). Por lo tanto, ShK(L5) inhibe la respuesta de DTH mediada por Tem, y previene y mejora la EAE adoptiva grave inducida por linfocitos Tem activados con mielina.
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Analisis
Se ha desarrollado un inhibidor de Kv1.3 altamente espedfico uniendo el aminoacido cargado negativamente L-pTyr al extremo N de ShK a traves de un enlazador hidrofilo de 20 A. ShK(L5) bloquea Kv1.3 con una Kd de 69 pM y 10 muestra una selectividad para Kv1.3 de 100 veces sobre Kv1.1, 260 veces sobre Kv1.6, 280 veces sobre Kv3.2, 680 veces sobre Kv1.2, y >1000 veces sobre todos los demas canales ensayados. Otros bloqueadores conocidos de Kv1.3 son significativamente menos selectivos que ShK(L5). Margatoxina, un peptido del veneno de escorpion Centruroides margaritatus, suprime la DTH en cerdos enanos (Koo y col., 1997), pero muestra unicamente una selectividad de 5 veces para Kv1.3 (Kd, 110 pM) sobre Kv1.2 (Kd, 520 pM) y una selectividad de 9 veces sobre 15 Kv1.1 (Kd, 10 nM). La kaliotoxina del escorpion Androctonus mauritanicus suprime la DTH en ratas y mejora la EAE (Beeton y col., 2001a) y la resorcion osea inflamatoria en enfermedad periodontal experimental (Valverde y col., 2004), pero es menos potente (Kv1.3 Kd, 650 pM) y menos selectiva (Grissmer y col., 1994) que ShK(L5). Los primeros bloqueadores de Kv1.3 de molecula pequena con afinidad nanomolar que se descubrieron - iminodihidroquinolinas WIN-17317 y CP-339818 y la bencidril piperidina UK-78282 - tambien bloquean los canales 20 de sodio (Wanner y col., 1999) y el canal Kv1.4 neuronal (Hanson y col., 1999). Los inhibidores de Kv1.3 de molecula pequena desarrollados por Merck - correolida (Felix y col., 1999; Hanner y col., 1999; Koo y col., 1999; Bao y col., 2005), benzamidas sustituidas con ciclohexilo (Schmalhofer y col., 2002) y candelalidas A-C (Singh y col., 2001) - son escasamente selectivos para Kv1.3. Psora-4, el bloqueador de Kv1.3 de molecula pequena mas potente (Kd, 3 nM) es unicamente selectivo de 16 a 20 veces para Kv1.3 sobre Kv1.1 y Kv1.2, y selectivo 2,5 veces sobre el 25 canal Kv1.5 cardiaco (Vennekamp y col., 2004). La luteolina, un flavonoide que mejora la EAE en ratas (Hendriks y col., 2004), se vende como un nutraceutico (
http://www.lutimax.com;
http://www.synorx.com), aparentemente debido a su capacidad para bloquear los canales Kv1.3 (Lahey y Rajadhyaksha, 2004). Sin embargo, la luteolina es un inhibidor de Kv1.3 debil (Kd, 65 pM) y no es selectivo para Kv1.3 sobre Kv1.1, Kv1.2, o Kv1.5. Ningun otro bloqueador de molecula pequena de Kv1.3 conocido - sulfamidebenzamidoindanos (Castle y col., 2000), 30 diclorofenilpirazolopirimidinas (Atwal y col., 2001), furoquinolina Ibu-8 (Butenschon y col., 2001), tetrafenilporfirinas (Gradl y col., 2003), 3-alquil- y 3-aril-7H-furo[3,2-g]cromen-7-onas (Wernekenschnieder y col., 2004), y derivados de kelinona y calcona (Baell y col., 2004), caribdotoxina, noxiustoxina, (Grissmer y col., 1994), agitoxina-2 (Garcia y col., 1994), BgK (Cotton y col., 1997), Pandinius imperatortoxina 1 (Peter y col., 2001), HsTx1 - es tan potente ni tan selectivo como ShK(L5). Debido a su falta de selectividad para Kv1.3, estos bloqueadores pueden ser 35 potencialmente neurotoxicos si entran en el sistema nervioso central a concentraciones suficientes para bloquear los canales neuronales. El unico inhibidor de Kv1.3 con una potencia y especificidad para Kv1.3 comparable con ShK(L5) es el analogo sintetico recientemente descrito (OSK1-Lys16Asp20) de la toxina OSK1 del escorpionOrthochirus scrobiculosus (Mouhat y col., 2005), pero su actividad como inmunomodulador sigue siendo indeterminada.
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La exquisita especificidad para Kv1.3 de ShK(L5) le convierte en una atractiva expectativa de farmaco. ShK(L5) es notablemente estable en plasma y alcanzo niveles en sangre en estado estable de ~300 pM despues de inyecciones subcutaneas repetidas a diario individuales de 10 pg/kg. Esta concentracion en sangre de ShK(L5) es suficiente para bloquear >90 % de los canales Kv1.3 sin afectar a otros canales ionicos y causar una supresion del 60 al 70 % de 45 linfocitos Tem mientras que se conservan los linfocitos indiferenciados/linfocitos Tcm. Una concentracion de ShK(L5) mayor de 1200 veces su dosis farmacologica no fue citotoxica o mutagenica in vitro. ShK(L5) no bloqueo el canal Kv11.1 (HERG) K+ cardiaco responsable del smdrome QT largo inducido por farmaco (Recanatini y col., 2005), y la administracion in vivo de ShK(L5) a concentraciones farmacologicas (10 pg/kgMa) no altero la funcion cardiaca en ratas sanas en base a una monitorizacion EKG continua. La administracion in vivo repetida de 10pg/kgMa de 50 ShK(L5) durante 2 semanas no cambio los perfiles de la qmmica clmica o hematologicos. Los animales sanos a los que se les administro una inyeccion individual de 1000 pg/kg/dfa de ShK(L5) (100 veces la dosis farmacologica) o inyecciones repetidas de 600 pg/kg/dfa durante 5 dfas (60 veces la dosis farmacologica), no mostraron ningun signo visible de toxicidad. Estos resultados indican que pueden conseguirse niveles en sangre farmacologicamente relevantes despues de inyecciones subcutaneas a diario individuales de ShK(L5), y el mdice de seguridad 55 terapeutica eficaz en ratas sanas excede de 100.
ShK(L5) puede tener uso como un producto terapeutico en enfermedades autoinmunes dirigiendose preferiblemente a los linfocitos Tem autorreactivos continuamente activados que se han implicado en EM, diabetes mellitus tipo 1, artritis reumatoide y psoriasis (Ezawa y col., 1997; Lovett-Racke y col., 1998; Scholz y col., 1998; Friedrich y col.,
2000;Markovic-Plese y col., 2001; Viglietta y col., 2002; Soler y col., 2003; Wulff y col., 2003). ShK(L5) suprimio la proliferacion de linfocitos Tem humanos y de rata (CI50 = ~80 pM en ambos casos) e inhibio la produccion de IL2 a concentraciones picomolares (figuras 2 y 3). La IL2 exogena anulo parcialmente este bloqueo. Los linfocitos indiferenciados/TcM humanos fueron inicialmente 60 veces menos sensibles a ShK(L5) que los linfocitos 5 Tem humanos, y se volvieron completamente resistentes al bloqueador durante la activacion (figura 2), presumiblemente por la regulacion por aumento de Kca3.1 (Ghanshani y col., 2000; Wulff y col., 2003). Los linfocitos indiferenciados/TcM de rata fueron 1000 veces menos sensibles a ShK(L5) que los linfocitos Tem. Esta variacion de especies en la sensibilidad a ShK(L5) de los linfocitos indiferenciados/TcM en comparacion con los linfocitos Tem - 60 veces inferior en seres humanos y 1000 veces inferior en ratas - puede explicarse por diferencias en la expresion del 10 canal de K+ entre linfocitos indiferenciados/TcM humanos y de rata. Los linfocitos indiferenciados/TcM humanos inactivos expresan mas canales Kv1.3 por celula (250-400) que los canales Kca3.1 (10-20) y, por lo tanto, se inhiben de forma mas potente por los bloqueadores de Kv1.3 que los bloqueadores de Kca3.1 (Ghanshani y col., 2000; Wulff y col., 2003). Los linfocitos indiferenciados/TcM de rata inactivos, por el contrario, expresan mas canales Kca3.1 por celula (10-20) que los canales Kv1.3 (1-10), y son mas sensibles a Kca3.1 que los bloqueadores de Kv1.3 (Beeton y 15 col., 2001b). La diferencia rata/humano en la expresion de canal puede cimentar la sensibilidad diferencial de los linfocitos indiferenciados/TcM de rata (ci50 = 100 nM) y los linfocitos indiferenciados/TcM humanos (ci50 = 5 nM) a ShK(L5). En resumen, ShK(L5) suprime preferiblemente los linfocitos Tem, mientras que los linfocitos indiferenciados/TcM son menos sensibles al bloqueador para comenzar y despues rapidamente escapan a la supresion regulando por ascenso los canales Kca3.1 (Ghanshani y col., 2000; Beeton y col., 2001b; Wulff y col., 20 2003).
Los linfocitos B de memoria de conmutacion de clase humanos (por ejemplo, cD27+IgG+IgD') estan implicados en la patogenicidad de las enfermedades autoinmunes (Iglesias y col., 2001; O'connor y col., 2001; corcione y col., 2004). Los bloqueadores de Kv1.3 suprimen preferiblemente la proliferacion de linfocitos B de memoria tardfa, 25 mientras que los linfocitos B de memoria indiferenciados y tempranos (cD27+IgD+) son significativamente menos sensibles (Wulff y col., 2004). Por lo tanto, ShK(L5) puede suprimir la funcion de los linfocitos Tem y los linfocitos B de memoria de conmutacion de clase que contribuyen al desarrollo de trastornos autoinmunes. Es motivo de preocupacion la importante funcion de los linfocitos B de memoria de conmutacion de clase en la inmunidad humoral (produccion de anticuerpos IgG) y la disminucion de la capacidad de montar respuestas inmunes viables a desaffos 30 bacterianos que pueden surgir como resultado de la supresion basada en canal de estas celulas. Es una suerte que los linfocitos B de memoria de conmutacion de clase humanos sean menos sensibles al bloqueo por ShK (ci50 = 14 nM) que los linfocitos Tem humanos (ci50 = 80-400 pM), ya que expresan mayores numeros de canales Kv1.3 en el resto (~2000/celula) que los linfocitos Tem (250-400/celula) (Wulff y col., 2004). Por lo tanto, puede ser posible valorar la dosis de bloqueadores de Kv1.3 para suprimir preferiblemente uno o ambos grupos de celulas de memoria 35 durante la terapia de una enfermedad autoinmune.
Se evaluo ShK(L5) en dos modelos de rata de una enfermedad inducida por linfocitos Tem, EAE inducida por transferencia adoptiva de linfocitos Tem espedficos de mielina (Beeton y col., 2001b) y DTH causada por linfocitos T de tropismo cutaneo (Soler y col., 2003). ShK(L5) evito la EAE si se administro en forma de una inyeccion diaria 40 individual (10 pg/kgMa) desde el momento de la transferencia celular adoptiva, y redujo significativamente la gravedad de la enfermedad cuando se inicio la terapia en la aparicion de los smtomas. No se observo toxicidad en las ratas de EAE tratadas, lo que sugeria que las concentraciones en sangre y tisulares de ShK(L5) conseguidas con este regimen de tratamiento no son suficientes para bloquear los canales neuronales, incluyendo los canales Kv heteromultimericos que contienen subunidades de Kv1.3 (Koch y col., 1997). ShK(L5) tambien fue eficaz en la 45 supresion de DTH. Estos estudios de prueba de concepto demuestran la eficacia terapeutica de ShK(L5) en la mejora de enfermedades mediadas por linfocitos Tem en modelo de rata. Se determino el mdice de seguridad terapeutica de ShK(L5) en ratas con EAE (cuando la barrera hematoencefalica esta probablemente comprometida) administrando inyecciones diarias de una dosis (600 pg/kg/dfa) 60 veces mayor que la dosis terapeuticamente eficaz. El cuarenta por ciento de las ratas con EAE que recibieron esta dosis murieron el quinto dfa 50 (DL50 extrapolada = 750 pg/kg/dfa durante 5 dias), lo que corresponde a un mdice de seguridad terapeutica de aproximadamente 75.
En conclusion, ShK(L5) es un bloqueador de Kv1.3 mas selectivo que cualquier otro inhibidor conocidos, y puede ser beneficioso en enfermedades autoinmunes mediante el direccionamiento de tanto linfocitos Tem como linfocitos B de memoria de conmutacion de clase. Su afinidad picomolar para Kv1.3 y la notable estabilidad en plasma junto con su 55 mdice de seguridad terapeutica en ratas sanas (>100), asf como en ratas con EAE (~75) son buena senal para su uso potencial como un inmunomodulador terapeutico. Las inyecciones subcutaneas diarias individuales de ShK(L5) son eficaces en la mejora de EAE y en la prevencion de DTH, indicando que esta ruta de administracion peptfdica sera compatible con la terapia.
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Agradecimientos
Agradecemos a Paul Munch, Suresh Raman y Daniel Homerick su excelente asistencia tecnica.
Referencias
Atwal KS, Vaccaro W, Lloyd J, Finlay H, Yan L, and Bhandaru RS (2001) inventors, Bristol-Myers Squibb, assignee. Heterocyclic dihydropyrimidines as potassium channel inhibitors. World patent WO0140231. 2001 Jun 7.
Baell JB, Gable RW, Harvey AJ, Toovey N, Herzog T, Hansel W, and Wulff H (2004) Khellinone derivatives as blockers of the voltage-gated potassium channel Kv1.3: synthesis and immunosuppressive activity. J Med Chem 47: 2326-2336.
Bagdany M, Batista CVF, Valdez-Cruz NA, Somodi S, Rodriguez de la Vega RC, Licea AF, Gaspar R, Possani LD, and Panyi G (2005) Anuroctoxin, a new scorpion toxin of the a-KTx 6 subfamily, is highly selective for Kv1.3 over IKCal ion channels of human T lymphocytes. Mol Pharmacol 67: 1-11.
Bao J, Miao S, Kayser F, Kotliar AJ, Baker RK, Doss gA, Felix JP, Bugianesi RM, Slaughter RS, and Kaczorowski GJ (2005) Potent Kv1.3 inhibitors from correolide-modification of the C18 position. Bioorg Med Chem Lett 15: 447-451.
Bardien-Kruger S, Wulff H, Arieff Z, Brink P, Chandy KG, and Corfield V (2002) Characterisation of the human voltage-gated potassium channel gene, KCNA7, a candidate gene for inherited cardiac disorders and its exclusion as cause of progressive familial heart block I (PFHBI). Eur J Hum Genet 10: 36-43.
Beeton C, Barbaria J, Giraud P, Devaux J, Benoliel A, Gola M, Sabatier J, Bernard D, Crest M, and Beraud E (2001a) Selective blocking of voltage-gated K+channels improves experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T cell activation. J Immunol 166: 936-944.
Beeton C, Wulff H, Barbaria J, Clot-Faybesse O, Pennington M, Bernard D, Cahalan M, Chandy K, and Beraud E (2001b) Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci USA 98: 13942-13947.
Beeton C, Wulff H, Singh S, Botsko S, Crossley G, Gutman GA, Cahalan MD, Pennington MW, and Chandy KG (2003) A novel fluorescent toxin to detect and investigate Kv1.3 channel up-regulation in chronically activated T lymphocytes. J Biol Chem 278: 9928-9937.
Beraud E, Balzano C, Zamora AJ, Varriale S, Bernard D, and Ben-Nun A (1993) Pathogenic and nonpathogenic T lymphocytes specific for the encephalitogenic epitope of myelin basic protein: functional characteristics and vaccination properties. J Neuroimmunol 47: 41-53.
Bunce C and Bell EB (1997) CD45RC isoforms define two types of CD4 memory T cells, one of which depends on persisting antigen. J Exp Med 185: 767-776.
Butenschon I, Moller K, and Hansel W (2001) Angular methoxy-substituted furo- and pyranoquinolinones as blockers of the voltage-gated potassium channel Kv1.3. J Med Chem 44: 1249-1256.
Castle NA, Hollinshead SP, Hughes PF, Mendoza GS, Searafin J, Wilson JW, Amato GS, Beaudoin S, Gross M, and McNaughton-Smith G (2000) inventors, ICAgen and Eli Lilly & Company, assignee. Potassium channel inhibitors. U.S. patent 6,083,986. 2000 Jul 4.
Chandy KG, DeCoursey TE, Cahalan MD, McLaughlin C, and Gupta S (1984) Voltage-gated potassium channels are required for human T lymphocyte activation. J Exp Med 160: 369-385.
Chandy KG, Wulff H, Beeton C, Pennington M, Gutman GA, and Cahalan MD (2004) K+ channels as targets for specific immunomodulation. Trends Pharmacol Sci 25: 280-289.
Corcione A, Casazza S, Ferretti E, Giunti D, Zappia E, Pistorio A, Gambini C, Mancardi GL, Uccelli A, and Pistoria V (2004) Recapitulation of B cell differentiation in the central nervous system of patients with multiple sclerosis.Proc Natl Acad Sci USA 101: 11064-11069.
Cotton J, Crest M, Bouet F, Alessandri N, Gola M, Forest E, Karlsson E, Castaneda O, Harvey AL, Vita C, et al. (1997) A potassium-channel toxin from the sea anemone Bunodosoma granulifera, an inhibitor for Kv1 channels. Revision of the amino acid sequence, disulfide-bridge assignment, chemical synthesis, and biological activity. Eur J Biochem 244: 192-202.
Deibler GE, Martenson RE, and Kies MW (1972) Large scale preparation of myelin basic protein from central nervous tissue of several mammalian species.Prep Biochem 2: 139-165.
Ezawa K, Yamamura M, Matsui H, Ota Z, and Makino H (1997) Comparative analysis of CD45RA- and CD45RO-positive CD4+ T cells in peripheral blood, synovial fluid and synovial tissue in patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Acta Med Okayama 51: 25-31.
Felix JP, Bugianesi RM, Schmalhofer WA, Borris R, Goetz MA, Hensens OD, Bao JM, Kayser F, Parsons WH, Rupprecht K, et al. (1999) Identification and biochemical characterization of a novel nortriterpene inhibitor of the human lymphocyte voltage-gated potassium channel, Kv1.3. Biochemistry 38: 4922-4930.
5
10
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35
40
45
50
55
Friedrich M, Krammig S, Henze M, Docke WD, Sterry W, and Asadullah K (2000) Flow cytometric characterization of lesional T cells in psoriasis: intracellular cytokine and surface antigen expression indicates an activated, memory/effector type 1 immunophenotype. Arch Dermatol Res 292: 519-521.
Fujiwara Y, Akaji K, and Kiso Y (1994) Racemization-free synthesis of C-terminal cysteine-peptide using 2- chlorotrityl resin. Chem Pharm Bull (Tokyo) 42:724-726.
Garcia ML, Garcia-Calvo M, Hidalgo P, Lee A, and MacKinnon R (1994) Purification and characterization of the three inhibitors of voltage-dependent K+channels from Leiurus
quinquestriatus var. hebraeus venom. Biochemistry 33:6834-6839.
Ghanshani S, Wulff H, Miller MJ, Rohm H, Neben A, Gutman GA, Cahalan MD, and Chandy KG (2000) Up- regulation of the IKCa1 potassium channel during T-cell activation: molecular mechanism and functional consequences. J Biol Chem275: 37137-37149.
Gradl SN, Felix JP, Isacoff EY, Garcia ML, and Trauner D (2003) Protein surface recognition by rational design: nanomolar ligands for potassium channels. J Am Chem Soc 125: 12668-12669.
Grissmer S, Nguyen AN, Aiyar J, Hanson DC, Mather RJ, Gutman GA, Karmilowicz MJ, Auperin DD, and Chandy KG (1994) Pharmacological characterization of five cloned voltage-gated K+ channels, types Kv1.1, 1.2, 1.3, 1.5, and 3.1, stably expressed in mammalian cell lines. Mol Pharmacol 45: 1227-1234.
Gutman GA, Chandy KG, Adelman JP, Aiyar J, Bayliss DA, Clapham DE, Covarriubias M, Desir GV, Furuichi K, Ganetzky B, et al. (2003) International Union of Pharmacology. XLI. compendium of voltagegated ion channels: potassium channels. Pharmacol Rev 55: 583-586.
Hammerschmidt F and Hanbauer M (2000) Transformation of arylmethylamines into alpha-aminophosphonic acids via metalated phosphoramidates: rearrangements of partly configurationally stable N-phosphorylated alpha-aminocarbanions. J Org Chem 65: 6121-6131.
Hanner M, Schmalhofer WA, Green B, Bordallo C, Liu J, Slaughter RS, Kaczorowski GJ, and Garcia ML (1999) Binding of correolide to Kv1 family potassium channels. J Biol Chem 274: 25237-25244.
Hanson DC, Nguyen A, Mather RJ, Rauer H, Koch K, Burgess LE, Rizzi JP, Donovan CB, Bruns MJ, Canniff PC, et al. (1999) UK-78,282, a novel piperidine compound that potently blocks the Kv1.3 voltage-gated potassium channel and inhibits human T cell activation. Br J Pharmacol 126: 1707-1716.
Hendriks JJA, Alblas J, van der Pol SMA, van Tol EAF, Dijkstra CD, and de Vries HE (2004) Flavonoids influence monocytic GTPase activity and are protective in experimental allergic encephalitis. J Exp Med 200: 1667-1672.
Iglesias A, Bauer J, Litzenburger T, Schubart A, and Linington C (2001) T- and B-cell responses to myelin oligodendrocyte glycoprotein in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Glia 36: 220-234.
Kalman K, Pennington MW, Lanigan MD, Nguyen A, Rauer H, Mahnir V, Paschetto K, Kem WR, Grissmer S, Gutman GA, et al. (1998) ShK-Dap2 , a potent Kv1.3-specific immunosuppressive polypeptide. J Biol Chem 273: 32697-32707.
King DS, Fields CG, and Fields GB (1990) A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis. Int J Pept Protein Res36: 255-266.
Koch RO, Wanner sG, Koschak A, Hanner M, Schwarzer C, Kaczorowski GJ, Slaughter RS, Garcia ML, and Knaus HG (1997) Complex subunit assembly of neuronal voltage-gated K+ channels. Basis for high-affinity toxin interactions and pharmacology. J Biol Chem 272: 27577-27581.
Kolski-Andreaco A, Tomita H, Shakkottai VG, Gutman GA, Cahalan MD, Gargus JJ, and Chandy KG (2004) SK3-1C, a dominant-negative suppressor of SKoa and IKoa channels. J Biol Chem 279: 6893-6904.
Koo GC, Blake JT, Shah K, Staruch MJ, Dumont F, Wunderler D, Sanchez M, McManus OB, Sirotina- Meisher A, Fischer P, et al. (1999) Correolide and derivatives are novel immunosuppressants blocking the lymphocyte Kv1.3 potassium channels. Cell Immunol 197: 99-107.
Koo GC, Blake JT, Talento A, Nguyen M, Lin S, Sirotina A, Shah K, Mulvany K, Hora D Jr, Cunningham P, et al. (1997) Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol 158: 5120-5128.
Koschak A, Bugianesi RM, Mitterdorfer J, Kaczorowski GJ, Garcia ML, and Knaus HG (1998). Subunit composition of brain voltage-gated potassium channels determined by hongotoxin-1, a novel peptide derived from Centruroides limbatusvenom. J Biol Chem. 273: 2639-2644.
Lahey T and Rajadhyaksha VJ (2004) 3-Deoxyflavonoid inhibition of T-lymphocyte activation and therapeutic use, pp 19, Us patent 2004102386.
Lin CS, Boltz RC, Blake JT, Nguyen M, Talento A, Fischer PA, Springer MS, Sigal NH, Slaughter RS, Garcia ML, et al. (1993) Voltage-gated potassium channels regulate calcium-dependent pathways involved in human T lymphocyte activation. J Exp Med 177: 637-645.
Lovett-Racke AE, Trotter JL, Lauber J, Perrin PJ, June CH, and Racke MK (1998) Decreased dependence of myelin basic protein-reactive T cells on CD28-mediated costimulation in multiple sclerosis patients: a
5
10
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20
25
30
35
40
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50
55
marker of activated/memory T cells. J Clin Investig 101: 725-730.
Markovic-Plese S, Cortese I, Wandinger KP, McFarland HF, and Martin R (2001) CD4+CD28- costimulation- independent T cells in multiple sclerosis. J Clin Investig 108: 1185-1194.
Middleton RE, Sanchez M, Linde AR, Bugianesi RM, Dai G, Felix JP, Koprak SL, Staruch MJ, Bruguera M, Cox R, et al. (2003) Substitution of a single residue in Stichodactyla helianthus peptide, ShK-Dap, reveals a novel pharmacological profile. Biochemistry 42: 13698-13707.
Mouhat S, Visan V, Ananthakrishnan S, Wulff H, Andreotti N, Grissmer S, Darbon H, De Waard M, and Sabatier JM (2005) K+channel types targeted by synthetic OSK1, a toxin from Orthochirus scrobiculosus scorpion venom. Biochem J 385: 95-104.
Nicolas E, Vilaseca M, and Giralt E (1995) A study of the use of NH4I for the reduction of methionine sulphoxide in peptides containing cysteine and cystine. Tetrahedron 51: 5701-5710.
O'Connor K, Bar-Or A, and Hafler Da (2001) The neuroimmunology of multiple sclerosis: possible roles of T and B lymphocytes in immunopathogenesis. J Clin Immunol 21: 81-92.
Pennington M, Byrnes M, Zaydenberg I, Khaytin I, de Chastonay J, Krafte D, Hill R, Mahnir V, Volberg W, Gorczyca W, et al. (1995) Chemical synthesis and characterization of ShK toxin: a potent potassium channel inhibitor from a sea anemone. Int J Pept Protein Res 346: 354-358.
Pennington M, Mahnir V, Khaytin I, Zaydenberg I, Byrnes M, and Kem W (1996a) An essential binding surface for ShK toxin interaction with rat brain potassium channels. Biochemistry 35: 16407-16411. Pennington M, Mahnir V, Krafte D, Zaydenberg I, Byrnes M, Khaytin I, Crowley K, and Kem W (1996b) Identification of three separate binding sites on ShK toxin, a potent inhibitor of voltage-dependent potassium channels in human T-lymphocytes and rat brain. Biochem Biophys Res Commun 219: 696-701.
Peter MJ, Varga Z, Hajdu P, Gaspar RJ, Damjanovich S, Horjales E, Possani LD, and Panyi G (2001) Effects of toxins Pi2 and Pi3 on human T lymphocyte Kv1.3 channels: the role of Glu7 and Lys24. J Membr Biol 179: 13-25.
Recanatini M, Poluzzi E, Masetti M, Cavalli A, and De Ponti F (2005) QT prolongation through hERG K+ channel blockade: current knowledge and strategies for the early prediction during drug development. Med Res Rev 25:133-166.
Regaya I, Beeton C, Ferrat G, Andreotti N, Darbon H, De Waard M, and Sabatier JM (2004) Evidence for domain-specific recognition of SK and Kv channels by MTX and HsTX1 scorpion toxins. J Biol Chem 279: 55690-55696.
subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions.Nature (Lond) 401: 708-712.
Schmalhofer WA, Bao J, McManus OB, Green B, Matyskiela M, Wunderler D, Bugianesi RM, Felix JP, Hanner M, Linde-Arias AR, et al. (2002) Identification of a new class of inhibitors of the voltage-gated potassium channel, Kv1.3, with immunosuppressant properties. Biochemistry 41: 7781-7794.
Scholz C, Patton KT, Anderson DE, Freeman GJ, and Hafler DA (1998) Expansion of autoreactive T cells in multiple sclerosis is independent of exogenous B7 costimulation. J Immunol 160: 1532-1538.
Singh S, Zink DL, Dombrowski AW, Dezeny G, Bills GF, Felix J, Slaughter RS, and Goetz MA (2001) Candelalides A-C: novel diterpenoid pyrones from fermentations of Sesquicillium candelabrum as blockers of the voltage-gated potassium channel Kv1.3. Org Lett 3: 247-250.
Soler D, Humphreys TL, Spinola SM, and Campbell JJ (2003) CCR4 versus CCR10 in human cutaneous TH lymphocyte trafficking. Blood 101: 1677-1682.
Task Force of the European Society of Cardiology the North American Society of Pacing Electrophysiology (1996) Heart Rate variability: standards of measurement, physiological interpretation and clinical use. Circulation 93: 1043-1065.
Tian Z, Gu C, Roeske RW, Zhou M, and Van Etten RL (1993) Synthesis of phosphotyrosine-containing peptides by solid-phase method. Int J Peptide Protein Res 42: 155-158.
Valverde P, Kawai T, and Taubman M (2004) Selective blockade of voltage-gated potassium channels reduces inflammatory bone resorption in experimental periodontal disease. J Bone Miner Res 19: 155-164. Vennekamp J, Wulff H, Beeton C, Calabresi PA, Grissmer S, Hansel W, and Chandy KG (2004) Kv1.3 blocking 5-phenylalkoxypsoralens: a new class of immunomodulators. Mol Pharmacol 65: 1364-1374. Viglietta V, Kent SC, Orban T, and Hafler DA (2002) GAD65-reactive T cells are activated in patients with autoimmune type 1a diabetes. J Clin Investig 109: 895-903.
Wanner SG, Glossmann H, Knaus HG, Baker R, Parsons W, Rupprecht KM, Brochu R, Cohen CJ, Schmalhofer W, Smith M, et al. (1999) WIN 17317-3, a new high-affinity probe for voltage-gated sodium channels. Biochemistry 38: 11137-11146.
Wernekenschnieder A, Korner P, and Hansel W (2004) 3-Alkyl- and 3-aryl-7H-furo[3,2-g]chromen-7-ones as blockers of the voltage-gated potassium channel Kv1.3. Pharmazie 59: 319-320.
Wulff H, Calabresi P, Allie R, Yun S, Pennington MW, Beeton C, and Chandy KG (2003) The voltage-gated
Kv1.3 K+ channel in effector memory T cells as new target for MS. J Clin Investig 111: 1703-1713.
Wulff H, Knaus H, Pennington M, and Chandy KG (2004) K+ channel expression during B cell differentiation: implications for immunomodulation and autoimmunity. J Immunol 173: 776-786.
Wulff H, Miller MJ, Haensel W, Grissmer S, Cahalan MD, and Chandy KG (2000) Design of a potent and 5 selective inhibitor of the intermediate-comductance Ca2+-activated K+channel, IKCa1: a potential
immunosuppressant. Proc Natl Acad Sci USA 97: 8151-8156.
Zhou W, Cayabyab FS, Pennefather PS, Schlichter LC, and DeCoursey TE (1998) HERG-like K+ channels in microglia. J Gen Physiol 111: 781-794
10 Direccion de correspondencia: Solicitudes de reimpresion: K. George Chandy, M.D., Ph.D., Department of Physiology and Biophysics, Medical School, 291 Irvine Hall, University of California, Irvine, Irvine, CA 92697-4561. Tel: 949-824-7435, Fax: 949-824-3143, correo electronico:
ydnahcg@icu.ude
Las siguientes son clausulas numeradas.
15
1. Una composicion de materia que comprende ShK unida a una entidad qmmica organica o inorganica que tiene una carga anionica.
2. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que la entidad qmmica se selecciona entre el grupo que consiste en:
20
aminoacidos;
polipeptidos;
residuos aminoaddicos;
residuos aminoaddicos sinteticos;
25 treonina;
derivados de treonina;
fosfo-treonina;
serina;
derivados de serina;
30 fosfo-serina;
acido glutamico; derivados de acido glutamico; gammacarboxi-acido glutamico; acido aspartico;
35 derivados de acido aspartico;
compuestos o grupos inorganicos; compuestos o grupos organicos; anddrido sucdnico; y anddrido ftalico.
40 3. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que la toxina ShK se obtiene a partir de una fuente
natural.
4. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que la toxina ShK es sintetica.
5. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que la entidad qmmica se une a un extremo N del polipeptido de ShK.
45 6. Una composicion de acuerdo con la clausula 5, en la que la entidad qmmica se une a un extremo N de
ShK a traves de una molecula de union o un grupo de union.
7. Una composicion de acuerdo con la clausula 5, en la que la entidad qmmica se une a un extremo N de ShK por un enlazador aminoetiloxietiloxi-acetilo.
8. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que la entidad qmmica incluye una etiqueta de
50 fluoroforo.
9. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que la entidad qmmica es AEEAc-L-Pmp(OH2).
10. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que la entidad qmmica es AEEAc-D-Pmp(OH2).
11. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que la entidad qmmica es AEEAc-D-Pmp(OH, Et).
12. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que la entidad qmmica es AEEAc-L-Pmp(Et2).
55 13. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que la entidad qmmica es AEEAc-D-Pmp(Et2).
14. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que la entidad qmmica es AEEAc-L-Tyr.
15. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que la entidad qmmica es AEEAc-L-Tyr(PO3H2).
16. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que la entidad qmmica es AEEAc-L-Phe(p-NH2).
17. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que la entidad qmmica es AEEAc-L-Phe(p-CO2H).
5
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18. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que la entidad qmmica es AEEAc-L-Aspartato.
19. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que la entidad qmmica es AEEAc-D-Aspartato.
20. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que la entidad qmmica es AEEAc-L-Glutamato.
21. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que la entidad qmmica es AEEAc-D-Glutamato.
22. Un metodo para provocar la inhibicion de los canales de potasio Kv1.3 en un sujeto humano o animal, comprendiendo dicho metodo la etapa de:
(A) administrar al sujeto una composicion que comprende la toxina ShK unida a una entidad qmmica organica o inorganica que tiene una carga anionica, en una forma y cantidad que sea eficaz para inhibir los canales de potasio Kv1.3.
23. Un metodo de acuerdo con la clausula 22, en el que el metodo se realiza para prevenir o tratar un trastorno autoinmune.
24. Un metodo de acuerdo con la clausula 23, en el que el trastorno autoinmune se selecciona entre el grupo que consiste en:
Esclerosis multiple Miastenia gravis
Neuropatfas autoinmunes, tal como Guillain-Barre
Uveitis autoinmune
Enfermedad de Crohn
Colitis ulcerosa
Cirrosis biliar primaria
Hepatitis autoinmune
Trombocitopenia autoinmune
Diabetes mellitus tipo 1
Enfermedad de Addison
Enfermedad de Grave
Tiroiditis de Hashimoto
Ooforitis y orquitis autoinmune
Enfermedad de Behcet
Artritis reumatoide
Resorcion osea asociada a
enfermedad periodontal
Lupus eritematoso sistemico
Escleroderma
Polimiositis, dermatomiositis Penfigo vulgar
Espondiloartropatfas, tal como espondilitis anquilosante Smdrome de Sjogren
25. Un metodo de acuerdo con la clausul enfermedad injerto contra huesped.
26. Un metodo de acuerdo con la clausul rechazo de un tejido u organo trasplantado.
27. Un metodo de acuerdo con la clausul smdrome metabolico.
28. Un metodo de acuerdo con la clausul diabetes tipo 2.
29. Un metodo de acuerdo con la clausul obesidad.
30. Un metodo de acuerdo con la clausul resorcion osea asociada a enfermedad periodontal.
31. Un metodo de acuerdo con la clausula 22, en el una entidad qmmica seleccionada entre el grupo que
22,
en el que el metodo se realiza
22,
en el que el metodo se realiza
22,
en el que el metodo se realiza
22,
en el que el metodo se realiza
22,
en el que el metodo se realiza
22,
en el que el metodo se realiza
que la composicion comprende la consiste en:
prevenir o tratar la tratar o prevenir el prevenir o tratar el tratar o prevenir la tratar o prevenir la tratar o prevenir la toxina ShK unida a
aminoacidos; polipeptidos; residuos aminoaddicos;
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33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
residuos aminoaddicos sinteticos; treonina;
derivados de treonina;
fosfo-treonina;
serina;
derivados de serina;
fosfo-serina;
acido glutamico;
derivados de acido glutamico;
gammacarboxi-acido glutamico;
acido aspartico;
derivados de acido aspartico;
compuestos o grupos inorganicos;
compuestos o grupos organicos;
anhndrido sucdnico; y
anhndrido ftalico.
Un metodo de acuerdo con la clausula 22, en el que la entidad qmmica es AEEAc-L-Pmp(OH2).
Un metodo de acuerdo con la clausula 22, en el que la entidad qmmica es AEEAc-D-Pmp(OH2).
Un metodo de acuerdo con la clausula 22, en el que la entidad qmmica es AEEAc-D-Pmp(OH, Et).
Un metodo de acuerdo con la clausula 22, en el que la entidad qmmica es AEEAc-L-Pmp(Et2).
Un metodo de acuerdo con la clausula 22, en el que la entidad qmmica es AEEAc-D-Pmp(Et2).
Un metodo de acuerdo con la clausula 22, en el que la entidad qmmica es AEEAc-L-Tyr.
Un metodo de acuerdo con la clausula 22, en el que la entidad qmmica es AEEAc-L-Tyr(PO3H2).
Un metodo de acuerdo con la clausula 22, en el que la entidad qmmica es AEEAc-L-Phe(p-NH2).
Un metodo de acuerdo con la clausula 22, en el que la entidad qmmica es AEEAc-L-Phe(p-CO2H).
Un metodo de acuerdo con la clausula 22, en el que la entidad qmmica es AEEAc-L-Aspartato.
Un metodo de acuerdo con la clausula 22, en el que la entidad qmmica es AEEAc-D-Aspartato.
Un metodo de acuerdo con la clausula 22, en el que la entidad qmmica es AEEAc-L-Glutamato.
Un metodo de acuerdo con la clausula 22, en el que la entidad qmmica es AEEAc-D-Glutamato.
Un metodo para realizar citometna de flujo, comprendiendo dicho metodo las etapas de:
(A) proporcionar una composicion que comprende ShK unida a una entidad qmmica organica o inorganica que tiene una carga anionica y una etiqueta de fluoroforo;
(B) combinar la composicion proporcionada en la Etapa A con las celulas; y
(C) usar un citometro de flujo para contar, aislar o distinguir las celulas que tienen afinidad para la composicion proporcionada en la Etapa A.
46. Un metodo de acuerdo con la clausula 45, en el que la Etapa C comprende usar el citometro de flujo para contar, aislar o distinguir linfocitos T.
47. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que el ShK se modifica por sustitucion del residuo Met en la posicion 21.
48. Una composicion de acuerdo con la clausula 47, en la que la sustitucion en el residuo Met 21 disuade la oxidacion.
49. Una composicion de acuerdo con la clausula 1, en la que el ShK se modifica por la sustitucion de la funcion de acido C-terminal con una amida.
50. Una composicion de acuerdo con la clausula 49, en la que la sustitucion de la funcion de acido C- terminal con una amida imparte estabilidad a las enzimas de corboxipeptidasa C-terminal.
51. Un metodo de acuerdo con la clausula 22 o 45, en el que el ShK se modifica por la sustitucion del residuo Met en la posicion 21.
52. Un metodo de acuerdo con la clausula 51, en el que la sustitucion en el residuo Met 21 disuade la oxidacion.
53. Un metodo de acuerdo con la clausula 22 o 45, en el que el ShK se modifica por la sustitucion de la funcion de acido C-terminal con una amida.
54. Un metodo de acuerdo con la clausula 53, en el que la sustitucion de la funcion de acido C-terminal con una amida imparte estabilidad a las enzimas de corboxipeptidasa C-terminal.

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composicion de materia que comprende ShK, un enlazador aminoetiloxietiloxi-acetilo unido a un extremo N de ShK y una entidad qmmica anionica unida a dicho enlazador, en la que la entidad qmmica anionica es
    5 un residuo aminoaddico, y la composicion de materia es selectiva para los canales Kv1.3 sobre los canales Kv1.1.
  2. 2. Una composicion de materia de acuerdo con cualquiera de la reivindicacion anterior, en la que la entidad qmmica incluye una etiqueta de fluoroforo.
    10 3. Una composicion de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en la que la entidad qmmica
    comprende L-Pmp(OH2), D-Pmp(OH2), D-Pmp(OH, Et), L-Pmp(Et2), D-Pmp(Et2), L-Tyr, L-Tyr(POaH2), L-Phe(p-NH2), L-Phe(p-CO2H), L-Aspartato, D-Aspartato, L-Glutamato, D-Glutamato, D-Tyr(Po3H2), L-p-Tyr monometilo, L-p-Tyr dimetilo, L-Ppa, L-Pfp o L-Pkp.
    15 4. Una composicion de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en la que dicha ShK tiene la
    secuencia aminoaddica: Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met- Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys (SeQ ID NO: 1).
  3. 5. Una composicion de materia de acuerdo con la reivindicacion 1 que tiene la secuencia: L-Tyr(PO3H2)- 20 AEEAc-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-
    Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys (SEQ ID NO: 2).
  4. 6. Una composicion de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en la que el ShK se modifica por la sustitucion del residuo Met en la posicion 21.
    25
  5. 7. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que Met se reemplaza con Norleucina (Nle).
  6. 8. Una composicion de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en la que el ShK se modifica por la sustitucion de la funcion de acido C-terminal con una amida.
    30
  7. 9. Una composicion de materia de acuerdo con la reivindicacion 1 que tiene la secuencia: L-Tyr(PO3H2)- AEEAc-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu- Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-amida (SeQ ID NO:3).
    35 10. Una composicion de materia de acuerdo con la reivindicacion 1 que tiene la secuencia: L-Tyr-AEEAc-
    Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe- Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-amida (SEQ ID NO:4).
  8. 11. Una composicion de materia de la reivindicacion 1 que tiene la secuencia p-fosfono(difluoro-metil)- 40 fenilalanina-AEEAc-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Nle-Lys-Tyr-
    Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-amida.
  9. 12. Una composicion de materia de la reivindicacion 1 que tiene la secuencia Tyr(PO3H2)-AEEAc-Arg-Ser- Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Nle-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-
    45 Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-amida.
  10. 13. Una composicion de materia de la reivindicacion 1 que tiene la secuencia p-fosfonometil-fenilalanina- AEEAc-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu- Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-amida.
    50
  11. 14. Una composicion de materia de la reivindicacion 1 que tiene la secuencia p-fosfono-fenilalanina- AEEAc-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu- Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-amida.
    55 15. Una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para su uso en la
    atenuacion de una respuesta inmune no deseada o para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno autoinmune.
  12. 16. Un uso de acuerdo con la reivindicacion 15, en el que la enfermedad o trastorno se selecciona entre el
    10
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    20
    25
    30
    grupo de: trastornos autoinmunes, enfermedad injerto contra huesped, rechazo de un organo o tejido trasplantado, smdrome metabolico, diabetes tipo 2, obesidad, y resorcion osea asociada a enfermedad periodontal.
  13. 17. Un uso de acuerdo con la reivindicacion 15, en el que la enfermedad o trastorno comprende un
    trastorno autoinmune seleccionado entre:
    Esclerosis multiple,
    Miastenia gravis,
    Neuropatfas autoinmunes,
    Guillain-Barre,
    Uveitis autoinmune,
    Enfermedad de Crohn,
    Colitis ulcerosa,
    Cirrosis biliar primaria,
    Hepatitis autoinmune,
    Trombocitopenia autoinmune,
    Diabetes mellitus tipo 1,
    Enfermedad de Addison,
    Enfermedad de Grave,
    Tiroiditis de Hashimoto,
    Ooforitis autoinmune,
    Orquitis autoinmune,
    Enfermedad de Behcet,
    Artritis reumatoide,
    Lupus eritematoso sistemico,
    Escleroderma,
    Polimiositis,
    Dermatomiositis,
    Penfigo vulgar,
    Espondiloartropatias,
    Espondilitis anquilosante, y Smdrome de Sjogren.
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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1796709A4 (en) * 2004-10-07 2009-10-28 Univ California ANALOGUE OF SHK-TOXIN AND ITS USE AS SELECTIVE INHIBITORS OF KV1.3-KALIUM CHANNELS
US7833979B2 (en) * 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
WO2008088422A2 (en) * 2006-10-25 2008-07-24 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
JP5591691B2 (ja) 2007-05-22 2014-09-17 アムジエン・インコーポレーテツド 生物活性を有する融合タンパク質を作製するための組成物及び方法
WO2009021289A1 (en) * 2007-08-14 2009-02-19 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Potassium channel inhibitors
SG10201701670SA (en) 2007-09-20 2017-04-27 Tel Hashomer Medical Res Infrastructure & Services Ltd Compositions of aquatic origin for prevention of cell adhesion and methods of using same
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
GB0819634D0 (en) * 2008-10-25 2008-12-03 Isis Innovation Autoimmune disorders
US20120121591A1 (en) * 2009-03-20 2012-05-17 Amgen Inc. SELECTIVE AND POTENT PEPTIDE INHIBITORS OF Kv1.3
CN103339145A (zh) 2010-09-22 2013-10-02 安姆根有限公司 运载体免疫球蛋白及其用途
JP2014509859A (ja) 2011-03-16 2014-04-24 アムジエン・インコーポレーテツド １７ｎａｖ１．３およびｎａｖ１．７の強力かつ選択的阻害剤
SG10201604468QA (en) * 2011-06-06 2016-07-28 Kineta One Llc Shk-based pharmaceutical compositions and methods of manufacturing and using the same
MX2014002260A (es) 2011-08-31 2014-08-18 Amgen Inc Factor de crecimiento de fibroblasto 21 para usar en el tratamiento de diabetes tipo 1.
RU2014117558A (ru) * 2011-10-03 2015-11-10 Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния Лечение ожирения и нарушений, связанных с ожирением, путем нацеливания фармакологических агентов на калиевые каналы
KR102268830B1 (ko) 2013-01-25 2021-06-24 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Kv1.3 길항제 및 사용 방법
CA2903205A1 (en) * 2013-03-05 2014-09-12 Kineta One, Llc Methods of treating ipex syndrome using toxin-based pharmaceutical compositions
US10344060B2 (en) 2013-03-12 2019-07-09 Amgen Inc. Potent and selective inhibitors of Nav1.7
AU2014293270A1 (en) * 2013-07-22 2016-02-11 Kineta One, Llc Ophthalmic uses of toxin-based therapeutic peptides and pharmaceutical compositions thereof
US20160338967A1 (en) * 2013-12-23 2016-11-24 Kineta One, Llc Sustained release depot formulations of therapeutic proteins, and uses thereof
GB201408135D0 (en) * 2014-05-08 2014-06-25 Conogenetix Biosciences Gmbh Kv1.3 potassium channel antagonists
WO2015191781A2 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Amgen Inc. Apelin polypeptides
EP3180365B1 (en) 2014-08-15 2021-08-18 Monash University Novel potassium channel blockers and use thereof in the treatment of autoimmune diseases
WO2016112208A2 (en) * 2015-01-09 2016-07-14 Kineta One, Llp Topical applications of kv1.3 channel blocking peptides to treat skin inflammation
CN106518995B (zh) * 2016-11-08 2020-07-17 南方医科大学 印鼠客蚤多肽及其基因和应用
KR20220066095A (ko) 2019-09-20 2022-05-23 질랜드 파마 에이/에스 Kv1.3 차단제
BR112023019022A2 (pt) 2021-03-23 2023-10-17 Zealand Pharma As Bloqueadores de kv1.3
KR102533290B1 (ko) * 2022-04-14 2023-05-16 한국해양과학기술원 전압개폐 칼륨이온채널 억제 활성능을 갖는 펩타이드
KR102553070B1 (ko) * 2022-06-16 2023-07-07 한국해양과학기술원 전압개폐 칼륨이온채널 억제 활성능을 갖는 작은상자해파리 기원 펩타이드
WO2024083919A1 (en) 2022-10-18 2024-04-25 Zealand Pharma A/S Inhibitors

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998023639A2 (en) * 1996-11-27 1998-06-04 University Of Florida ShK TOXIN COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
AU8052798A (en) * 1997-09-17 1999-04-05 Bachem Bioscience, Inc. Polypeptide compositions that inhibit potassium channel activity and uses herefor
US6616944B2 (en) * 2000-03-08 2003-09-09 Medinnova Gesellschaft Fur Medizinsche Innovationen Aus Adkademischer Forschung Mbh Self-assembling colloidal carriers for protein delivery
US6861405B2 (en) * 2001-06-12 2005-03-01 Yale University Compositions and methods relating to glucose metabolism, weight control, and food intake
EP1796709A4 (en) * 2004-10-07 2009-10-28 Univ California ANALOGUE OF SHK-TOXIN AND ITS USE AS SELECTIVE INHIBITORS OF KV1.3-KALIUM CHANNELS
RU2014117558A (ru) * 2011-10-03 2015-11-10 Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния Лечение ожирения и нарушений, связанных с ожирением, путем нацеливания фармакологических агентов на калиевые каналы

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