ES2273718T3 - Composiciones de abridor de los canales de agua y composiciones medicinales para uso oftalmico. - Google Patents
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Abstract
Uso de un ligando de lipocalina para la fabricación de una composición para el tratamiento de lesión epitelial queratoconjuntival, en la que dicho ligando de lipocalina es un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en: glucolípidos, porfirinas, benzoato de denatonio, 2-isobutil-3- metoxipirazina, 2-amino-4-butil-5-propilselenazol, acetato de citronelilo, carvona, 2-isopentilpirazina, 4-butil-5- propiltiazol, timol, 3, 7-dimetiloctanol, 2-nonenal, linalol, benzoato de bencilo, compuestos similares al almizcle de anillo de 3 miembros, 2-metil-3-metoxipirazina, benzaldehído, quinolina, 2-feniletanol, cineol, isovalerato de isobutilo, ácido isovalérico, a-ionona, 2-trans-6-cis-nonadienal, geosmina, tricloroanisol, 5-a-androst-16-en-3-ona, pentadecalactona, sulfuro de dimetilo, 4-hidroxioctanolactona, acetato de etilo, (+)-pregona y trans-4-metilciclohexanol.
Description
Composiciones de abridor de los canales de agua
y composiciones medicinales para uso oftálmico.
La presente invención se refiere a un abridor de
los canales de agua novedoso que comprende una sustancia que se une
a lipocalinas, en particular proteínas de unión a odorantes (a
continuación en el presente documento, OBP). El abridor de los
canales de agua novedoso según la presente invención tiene una
actividad abridora de los canales de agua de
acuaporina-5 y tiene su aplicación en composiciones
farmacéuticas, en particular, como un fármaco terapéutico para la
lesión epitelial queratoconjuntival, por ejemplo un fármaco
terapéutico para la xeroftalmia (sequedad de ojos).
La permeación del agua a través de la membrana
celular se produce lentamente por difusión a través de la bicapa
lipídica que es el elemento estructural principal de la membrana
celular. En los últimos años, sin embargo, se ha descubierto un
movimiento rápido de agua a través de la membrana celular en ciertos
tipos de células, y las investigaciones conducen a postular que, en
este fenómeno están implicadas algunas proteínas de membrana que
son permeables de forma selectiva al agua. Por lo tanto, en realidad
se aislaron varias proteínas de membrana de este tipo, y estas
proteínas de membranas se han denominado canales de agua.
Se han aislado como tales proteínas canales de
agua, un grupo de proteínas de membrana denominadas acuaporinas
(AQP), y hasta la fecha se han descubierto en mamíferos, anfibios y
plantas acuaporinas tales como AQP1 a 5, FA-CHIP, y
AQP-\gammaTIP (por ejemplo Advances in Medicine,
173, 9, 745-748 (1995)). Entre estas, se sabe que
la AQP5 existe en la glándula salival, en el ojo (glándula lagrimal,
tejido epitelial corneal), y en los bronquios de mamíferos
(Advances in Medicine, 173, 9, 745-748(1995);
Am. J. Physiol., 270, C12-C30 (1996)).
Recientemente, se ha encontrado que la AQP5
existe en la membrana apical de las células del tejido de la
glándula lagrimal del ojo (Ishida et al., Biochem. Biophys.
Res. Comn., 224, 1-4 (1996)) y se ha confirmado que
está asociada profundamente con el transporte intercelular del agua
en la lagrimación y la modulación de la liberación del líquido
lagrimal (Ishida et. al., Biochem. Biophys. Res. Comn., 238,
891-895 (1997)).
Según las recientes investigaciones de los
presentes inventores, un experimento usando ovocitos de Xenopus
laevis en los que se expresa AQP5, sugiere que la puerta del
canal de agua de la acuaporina se abre y se cierra mediante una
determinada proteína con origen en las células de la glándula
lagrimal. Entonces, se identificó por primera vez un péptido
parcial específico en las inmediaciones de la región
C-terminal de la AQP5 como un abridor de los
canales de agua.
Mientras tanto, se han emprendido estudios sobre
las OBP en asociación con la elucidación del olfato. La OBP es una
proteína soluble de bajo peso molecular que se produce en grandes
niveles en la mucosa nasal de los vertebrados y en la linfa
sensiliar de los insectos. La OBP tiene afinidad por las sustancias
olorosas y las feromonas, por lo tanto se considera que está
relacionada con la percepción olfativa, y se sabe que pertenece a
la superfamilia de las lipocalinas. La lipocalina es una proteína
secretora soluble y se conocen varios miembros que pueden unirse a
una variedad de ligandos hidrófobos incluidos en las sustancias
olorosas.
Según algunas fuentes, aunque se han aislado
varios tipos de OBP, muchos son dímeros cuya subunidad es de
aproximadamente 20 kDa, y también hay monómeros. Al igual que la OBP
de los vertebrados, se sintetiza, según nuestros conocimientos, en
el tejido de las fosas nasales, se secreta de forma extracelular, y
se acumula en su mayor nivel en el epitelio respiratorio nasal.
Se sabe también que los ligandos de las
lipocalinas, en particular las sustancias olorosas que tienen una
actividad de unión a las OBP (a las que nos referiremos a
continuación en el presente documento a veces como "sustancias
olorosas"), tienen ciertas actividades bioquímicas o
fisiológicas. Por ejemplo, se ha publicado que los derivados de
2-cetoalcano y carvona influyen en la ATPasa
sodio-potasio en el tejido olfativo (Life Sciences,
20, 1051-1062 (1977)) y que los monoterpenos tales
como la carvona inhiben la aldosa reductasa del cristalino (Arch.
Pharm. Res., 11, 312-314 (1988)), mientras que la
publicación Kokai de solicitud de patente japonesa
Hei-2-193932 describe la absorción
transdérmica y transmucosa que promueve la actividad de la carvona
y otros.
Con respecto a la OBP, la patente de los EE.UU.
5.030.722 describe una proteína OBP derivada de la glándula nasal
lateral de la rata.
Se sabe que la OBP también existe en grandes
niveles en el líquido lagrimal de la rata (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 83, 4942-4946(1986)).
También se ha notificado que la prealbúmina
lagrimal secretada desde la glándula lagrimal humana tiene homología
con la OBP en su secuencia de aminoácidos (Chem. Senses, 20,
69-76 (1995)). Además, se ha descubierto una
proteína de 19 kDa que se asemeja enormemente a la lipocalina
lagrimal, en el moco nasal humano (Comp. Biochem. Physiol., 118B,
819-824 (1997)).
Se ha detectado en la orina y saliva animal una
proteína que puede unirse a una sustancia olorosa que se considera
también que pertenece a la superfamilia de las lipocalinas
(Finlayson et al., Science, 149, 981-982
(1965), Cell, 32, 755-761 (1983)).
Los documentos
EP-A-1 016 406 (SENJU PHARMA CO), 5
de julio del 2000 (2000-07-05) y
WO99/09968, 4 de marzo de 1999 (04.03.1999) describen una
composición oftálmica que comprende ligandos de lipocalina que
tienen actividad de unión a proteínas olorosas (es decir, mentol,
borneol etc.). Los colirios que contienen mentol reducen la
sensación de sequedad del ojo.
El documento
EP-A-0 473 159 (SENJU PHARMA CO), 4
de marzo de 1992 (1992-03-04)
describe una composición oftálmica que comprende retinol (siendo un
ligando de la lipocalina que tiene actividad de unión a proteínas
olorosas) y su uso en el tratamiento de la sequedad de los
ojos.
El documento
US-A-5 698 533 (KANG
MENG-CHE), 16 de diciembre de 1997
(1997-12-16) describe una
composición oftálmica que comprende mentol (siendo un ligando de la
lipocalina que tiene actividad de unión a proteínas olorosas) para
el tratamiento de la sequedad de los ojos.
A pesar de toda la información reunida hasta el
momento sobre las lipocalinas, incluyendo las OBP y las sustancias
olorosas, no se conoce todavía su relación con la lagrimación.
Sin embargo, en el transcurso de la
investigación sobre la acción de los ligandos de las lipocalinas
incluyendo las OBP en la glándula lagrimal, los inventores de la
presente invención han encontrado de forma sorprendente que varias
sustancias ligando incluyendo las sustancias olorosas muestran una
actividad estimulante de la lagrima-
ción.
ción.
A la vista del estado de la técnica anterior, la
presente invención tiene por objeto proporcionar un abridor de los
canales de agua novedoso que tiene la actividad de abrir un canal de
agua AQP. Es un objeto adicional proporcionar una composición
farmacéutica, en particular un estimulante de la lagrimación, que
comprende el abridor como un principio activo. El estimulante
anterior puede usarse en el tratamiento de la lesión epitelial
queratoconjuntival, tal como xeroftalmia (sequedad de ojos).
El primer aspecto de la presente invención es
una composición de acuaporina abridora de los canales de agua que
comprende un ligando de lipocalina.
En este primer aspecto de la invención, el
ligando de la lipocalina es preferiblemente un compuesto que tiene
actividad de unión a proteínas que se unen a odorantes.
El segundo aspecto de la presente invención es
una composición farmacéutica para uso oftálmico que comprende un
ligando de la lipocalina como principio activo.
La composición farmacéutica para uso oftálmico
según el segundo aspecto de la presente invención es preferiblemente
una composición estimulante de la lagrimación o un fármaco
terapéutico para la lesión epitelial queratoconjuntival.
En el segundo aspecto de la invención, el
fármaco terapéutico para la lesión epitelial queratoconjuntival es
preferiblemente un fármaco terapéutico para la xeroftalmia.
En el segundo aspecto de la invención, el
ligando de la lipocalina es preferiblemente un compuesto que tiene
actividad de unión a proteínas que se unen a odorantes.
Preferiblemente, el segundo aspecto de la
invención comprende además un fármaco parasimpaticomimético.
La figura 1 es un gráfico que muestra los
resultados de un experimento de permeabilidad de agua realizado con
carvona en el ejemplo 1.
La figura 2 es un gráfico que muestra los
resultados de experimentos de permeabilidad de agua realizados con
sustancias odorantes en el ejemplo 2.
La figura 3 es un gráfico que muestra los
resultados del efecto del uso combinado del clorhidrato de
pilocarpina sobre la lagrimación de ratones en el ejemplo 4.
\newpage
La presente invención se describirá ahora en
detalle.
La composición según el primer aspecto de la
presente invención es una composición de acuaporina abridora de los
canales de agua que tiene actividad abridora del canal de agua AQP5.
Según se usa en esta memoria descriptiva, el término de actividad
abridora del canal de agua AQP5 significa la potencia de aumentar la
permeabilidad al agua de la membrana celular a través del canal de
agua AQP5 y el término acuaporina abridora de los canales de agua
significa una sustancia que tiene actividad abridora del canal de
agua acuaporina. El canal de agua mencionado anteriormente incluye
canales que permiten de forma selectiva que pase sólo agua y canales
que permiten que pase no sólo agua sino también moléculas de bajo
peso molecular, tales como glicerol o urea.
Ahora se describe la actividad abridora del
canal de agua AQP5 de la composición según el primer aspecto de la
invención.
Se conoce que, en las células de tejidos vivos,
la actividad de permeación de agua por la AQP5 se modula de
diversas formas. Por ejemplo, incluso en las células del tejido de
la glándula lagrimal con una expresión verificada de AQP5, la
lagrimación se controla normalmente por inervación
simpática-parasimpática. Por lo tanto, la expresión
de AQP5 en una célula de tejido vivo y la expresión de su actividad
de permeación de agua no son el mismo acontecimiento. Por lo tanto,
la actividad de permeación de agua por la AQP5 se confirma mediante
un experimento de permeabilidad de agua usando ovocitos de rana
africana (Xenopus laevis), que se sabe que no tiene ningún
gen de la familia de la AQP expresado en ellos, y se les inyecta el
gen AQP5 para la expresión de la proteína codificada, según se
indica a continuación.
La inyección del ARNm de AQP5 en los ovocitos de
Xenopus laevis desencadena una elevación en la permeabilidad
al agua. Puesto que esta elevación en la permeabilidad al agua puede
observarse con facilidad, se ha usado esta técnica muy a menudo
para la confirmación de la actividad del canal de agua. Por ejemplo,
Ishibashi et al. insertaron el ADNc de AQP3 en el vector
BlueScript derivado de pSP64T, sintetizaron ARNc usando
T7-ARN polimerasa, inyectaron este ARNc en los
ovocitos de Xenopus laevis, y confirmaron la potenciación de
la permeabilidad al agua según se evidencia por un incremento en el
volumen de 48 a 62 horas de incubación después de la inyección,
probando de ese modo, la existencia del canal de agua (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 91, 6269-6273 (1994)). Se encuentra
un informe similar en Science, 256, 385-387
(1992).
Por lo tanto, de la misma manera que
anteriormente, se microinyectó a ovocitos de Xenopus laevis
el ARNc de longitud completa que codifica para AQP5 y se cultivó
para ver la expresión de AQP5. Después se transfirieron los
ovocitos a un fluido de cultivo hipotónico y se calculó la
permeabilidad al agua a partir del cambio en el volumen. Mientras
que el grupo de control al que no se le inyectó el ARNc de longitud
completa que codifica para AQP5 muestra sólo una baja permeabilidad
al agua, la permeabilidad al agua se eleva en el grupo al que se le
inyectó el ARNc de longitud completa que codifica para AQP5,
evidenciando de este modo la actividad del canal de agua.
Por otra parte, en el sistema en el que a los
ovocitos de Xenopus laevis se les microinyectó tanto el ARNc
de longitud completa que codifica para AQP5 como el ARN
poli(A)^{+} derivado de la glándula lagrimal y
cultivado para producir la expresión de la proteína AQP5 y la
proteína total con origen en la glándula lagrimal, la actividad de
permeación de agua de la AQP5 disminuye drásticamente, comparado con
el sistema antes mencionado en el que se expresa AQP5 sola según se
describe un poco después en el presente documento en más detalle en
los ejemplos. Por lo tanto, está claro que la actividad de
permeación de agua de AQP5 se inhibe por la presencia de la
proteína con origen en la glándula lagrimal. Este fenómeno de la
actividad de permeación de agua de la AQP5 que se inhibe por la
presencia de la proteína con origen en la glándula lagrimal se
considera que surge de los cambios en la apertura y cierre de la
puerta del canal de agua.
Cuando la composición según el primer aspecto de
la invención se hace que coexista en este sistema, la actividad de
permeación de agua de AQP5 se recupera hasta un nivel comparable con
el observado en ausencia de la inhibición. El hecho de que el
ligando de la lipocalina se identifica como una sustancia que tiene
una actividad abridora del canal de agua AQP5 es un poco
sorprendente a la luz de los conocimientos que se han recopilado
hasta la fecha sobre las lipocalinas, en particular las OBP.
Las lipocalinas son proteínas relativamente
pequeñas solubles, que se producen en varios órganos y líquidos
corporales de los vertebrados y los invertebrados, y muestran
diversidad al nivel de la secuencia de aminoácidos. Sin embargo,
las lipocalinas, en el grupo denominado lipocalina centrales
("kernel") tiene 3 motivos de secuencia conservados en común
en los alrededores del extremo N-terminal, y
aquellas del grupo denominadas lipocalinas externas
("outlier"), de las cuales es miembro la OBP, tienen uno de
dichos motivos de secuencia en común. Además, las lipocalinas
tienen una característica muy distintiva común en la estructura de
gran dimensión y la estructura de lipocalina típica comprende una
estructura en barril \beta que consiste en 8 hebras \beta
antiparalelas consecutivas, con una hélice de tipo 3_{10} y
estando unida una hélice \alpha a los extremos respectivos de
esta estructura hidrófoba similar a un bolsillo. Los ligandos se
unen al barril \beta hidrófobo. Por lo tanto, las lipocalinas
tienen una gran afinidad por las moléculas hidrófobas y se sospecha
que funcionan in vivo como vehículos de ligandos hidrófobos
en líquidos
corporales.
corporales.
Como ejemplos de las sustancias conocidas como
lipocalinas, pueden mencionarse, por ejemplo, OBP,
\alpha-1-microglobulina,
\alpha1-glucoproteína ácida, apolipoproteína,
crustacianina, proteína embrionaria CH21,
\beta-lactoglobulina, proteína urinaria mayor,
probasinas, proteína que de unión a retinol, albúmina lagrimal,
proteína de la glándula de von Ebner, purpurina, etcétera.
Se ha confirmado con la OBP bovina que la OBP
tiene el motivo en barril \beta en común con las lipocalinas. La
OBP de ratón es un heterodímero que comprende dos subunidades Ia y
Ib. Las secuencias de nucleótidos de los genes OBP Ia y Ib de ratón
(657 pb y 669 pb, respectivamente) y las secuencias de aminoácidos
de las proteínas OBP Ia y Ib (residuos de aminoácido 147 y residuos
de aminoácido 146, respectivamente) se describen en Gene, 212,
49-55 (1998).
OBP incluye las siguientes proteíanas. Por lo
tanto, la OBP bovina, la OBP I de rata, la OBP II de rata, la
OBP I de conejo, la OBP II de conejo, la OBP I porcina, la OBP
II porcina, la OBP I de ratón, la OBP II de ratón, la OBP III
de ratón, la hys-OBP-I
(puercoespín), hys-OBP-II
(puercoespín), OBP I de ciervo, OBP II de ciervo, BG de rana, OBP
felina, etc. son ejemplos de OBP que se han aislado de los tejidos
olfativos de los vertebrados.
Pueden mencionarse como las moléculas hidrófobas
que se unen como ligandos a las lipocalinas, por ejemplo, retinol
(un ligado de la albúmina lagrimal, proteína de unión a retinol,
purpurina, etc.), glucolípidos (ligandos de la proteína VEG),
porfirinas (ligandos de la proteína HC), benzoato de denatonio (un
ligando de la proteína de la glándula de von Ebner), etcétera. Los
ligandos se describen a continuación en más detalle, tomando como
ejemplo la OBP.
La OBP toma una amplia gama de sustancias como
ligandos si se compara con otras lipocalinas, y se une de forma
reversible a varias sustancias olorosas (sustancias odorantes) y
feromonas. La existencia de la actividad de unión a
2-isobutil-3-metoxipirazina
es una de las características de las proteínas OBP (sin embargo, la
OBP felina es la única excepción conocida). Mientras que una
sustancia olorosa es una sustancia que estimula la sensación
olfativa, el tener una actividad de unión a OBP, no es
necesariamente el equivalente de provocar una sensación olfativa.
Por lo tanto, en la presente invención no importa si una sustancia
que tiene actividad de unión a OBP provoca una sensación olfativa.
Los ligandos de OBP que tienen actividad de unión a OBP en general
tienen grupos polares tales como hidroxilo, carbonilo, etc. o un
heterociclo y son moléculas de tamaño medio que tienen una región
hidrófoba plana. Pueden mencionarse, pero no se limitan a
2-isobutil-3-metoxipirazina,
2-amino-4-butil-5-propilselenazol,
acetato de citronelilo, carvona,
2-isopentilpirazina,
4-butil-5-propiltiazol,
timol, mentol, 3,7-dimetiloctanol,
2-nonenal, linalol, retinol, benzoato de bencilo,
compuestos similares al almizcle de anillo de 3 miembros,
2-metil-3-metoxipirazina,
benzaldehído, quinolina, 2-feniletanol, cineol,
isovalerato de isobutilo, ácido isovalérico,
\beta-ionona,
2-trans-6-cis-nonadienal,
geosmina, tricloroanisol,
5-\alpha-androst-16-en-3-ona,
pentadecalactona, sulfuro de dimetilo,
4-hidroxioctanolactona, acetato de etilo, borneol,
por ejemplo.
Estas sustancias tienen generalmente constantes
de disociación de aproximadamente 0,1 a 100 \muM. Por ejemplo
2-isobutil-3-metoxipirazina,
2-isopentilpirazina,
4-butil-5-propiltiazol,
timol, mentol, 3,7-dimetiloctanol,
2-nonenal, linalol, retinol, benzoato de bencilo,
compuestos similares al almizcle de anillo de 3 miembros, etc.
tienen constantes de disociación de aproximadamente 0,1 a 1 \muM
según se determina con la OBP bovina.
La composición farmacéutica para uso oftálmico
según el segundo aspecto de la presente invención comprende al
menos una especie de dichos ligandos de lipocalina, en particular
ligandos de OBP como un principio activo. Según se usa en esta
memoria descriptiva, el término "uso oftálmico" significa el
uso en seres humanos o animales para el tratamiento de una
enfermedad en el ojo o con el fin de mejorar o promover la función
del ojo. Puesto que la composición farmacéutica del segundo aspecto
de la invención tiene actividad abridora del canal AQP5 en las
células del tejido de la glándula lagrimal, muestra una actividad
estimulante de la lagrimación y puede usarse como una composición
estimulante de la lagrimación. Además, la duración del efecto puede
prolongarse usando, en combinación, un fármaco
parasimpaticomimético que tiene una actividad secretomora glandular,
tal como el clorhidrato de pilocarpina.
Pueden mencionarse como tales composiciones
farmacéuticas para uso oftálmico, por ejemplo, una composición
estimulante de la lagrimación, un fármaco terapéutico para la lesión
epitelial queratoconjuntival, un acelerador de la cicatrización de
heridas queratoconjuntivales y un estimulante del alargamiento de
las células epiteliales queratoconjuntivales, etc. Entre estos, el
fármaco terapéutico para la xeroftalmia (sequedad de ojos) es
importante como fármaco terapéutico para enfermedades que surgen
del abuso de los ojos asociado con el desarrollo del equipo OA.
La composición farmacéutica para uso oftálmico
según el segundo aspecto de la presente invención puede estimular
directamente la secreción de líquido lagrimal desde la glándula
lagrimal. Por lo tanto, es muy diferente en el mecanismo de acción
de los fármacos oftálmicos convencionales que comprenden lágrimas
artificiales que se dirigen a compensar las deficiencias en el
líquido lagrimal, y no sólo es de acción rápida sino que también
mejora la lagrimación. El fármaco terapéutico para la lesión
epitelial queratoconjuntival según el segundo aspecto de la
invención, tiene, aprovechándose de las características anteriores,
propiedades muy ventajosas, tales como la acción de larga duración,
en particular para el tratamiento de la xeroftalmia (sequedad de
ojos).
La enfermedad a la cual se dirige el fármaco
terapéutico para la lesión epitelial queratoconjuntival según el
segundo aspecto de la invención, no se limita a la sequedad de ojos,
sino que incluye, por ejemplo el síndrome de Sjögren, el síndrome
de Stevens-Johnson, enfermedades posoperatorias,
enfermedades inducidas por fármacos, lesiones traumáticas, y
enfermedades exógenas causadas al llevar puestas lentes de
contacto.
Sin embargo, la composición farmacéutica según
el segundo aspecto de la invención no se limita a las aplicaciones
anteriores, sino que puede administrarse a seres humanos o animales
como una composición farmacéutica para el tratamiento de
enfermedades de los tejidos y órganos en los que se expresa la
AQP5.
La composición farmacéutica según el segundo
aspecto de la invención puede administrarse no sólo de forma
tópica, sino que también puede aplicarse de forma sistémica, que es
lo mismo que decir por vía oral o parenteral. La forma farmacéutica
incluye fármacos oftálmicos tales como colirios, y pomadas,
inyecciones, comprimidos, cápsulas y gránulos oftálmicos por
ejemplo. Estas formas farmacéuticas pueden prepararse mediante las
tecnologías establecidas. Los colirios, por ejemplo, pueden
prepararse en una forma farmacéutica mediante la formulación de un
agente isotonizante tal como el cloruro de sodio, glicerina
concentrada o similares; un tampón tal como el fosfato de sodio, el
acetato de sodio o similares; un tensioactivo tal como monooleato de
polioxietileno y sorbitano, estearato de polioxilo 40, aceite de
ricino hidrogenado y polioxietilenado o similares; un estabilizante
tal como citrato de sodio, edetato de sodio o similares; y un
conservante tal como cloruro de benzalconio, parabenos o similares
según se necesite. El pH puede estar en el intervalo aceptable para
las preparaciones de fármacos oftálmicos pero se prefiere un
intervalo de pH de 4 a 8. Pueden prepararse preparaciones orales
tales como comprimidos, cápsulas, gránulos etc. en una forma
farmacéutica usando un excipiente tal como lactosa, almidón,
celulosa cristalina, aceite vegetal, o similares; un lubricante tal
como estearato de magnesio, talco o similares; un aglutinante tal
como hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona o similares; un
disgregante tal como carboximetilcelulosa cálcica o similares; un
agente de recubrimiento tal como hidroxipropilmetilcelulosa,
macrogoles, resina de silicona o similares; y un agente formador de
película de gelatina, según se necesite.
La dosificación de la composición farmacéutica
según el segundo aspecto de la invención puede seleccionarse de
forma apropiada según el síntoma, edad, forma farmacéutica y
similares. Cuando la composición farmacéutica para uso oftálmico
según el segundo aspecto de la invención se usa como colirios, por
ejemplo, es suficiente instilar una preparación que contiene del
0,001 al 3% (p/v) del principio activo del segundo aspecto de la
invención una o varias veces al día. Las preparaciones orales pueden
administrarse generalmente de 1 mg a 1000 mg al día, bien de una
vez o en varias dosis divididas.
Se ha verificado mediante administración
intravenosa a ratones que la composición farmacéutica según el
segundo aspecto de la invención produce una actividad estimulante
de la lagrimación in vivo.
Los siguientes ejemplos experimentales,
ejemplos, y ejemplos de preparación de fármacos ilustran la presente
invención en más detalle sin limitar el alcance de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo experimental
1
Se aisló la glándula lagrimal a partir de ratas
SD macho y ratones BALB/c macho y usando un kit de purificación de
ARN de Pharmacia (producto de Pharmacia), se aisló el ARN total. Se
purificó el ARN poli(A)^{+} mediante cromatografía
de afinidad usando una columna de
oligo(dt)-celulosa de la forma rutinaria.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo experimental
2
Se sometió el ARN poli(A)^{+} de
glándula lagrimal de rata obtenido en el ejemplo experimental 1 a
una transcripción inversa usando un cebador
oligo(dT)_{18} y el ADNc monocatenario obtenido se
usó como plantilla para la PCR. Se usó como cebador de PCR una
secuencia que contenía sitios de digestión de enzimas de restricción
y permitía la amplificación por PCR del marco de lectura abierto
del ADNc de AQP5 de rata. El ADNc monocatenario anterior para su
uso como plantilla se amplificó por PCR (94ºC, 1 min., 60ºC, 1 min.,
72ºC, 2 min. durante 30 ciclos). El producto de PCR se subclonó en
el plásmido BlueScript II KS(+). En este experimento, para obtener
el ADNc exacto, esta subclonación se realizó 10 veces. La secuencia
de nucleótidos del ADN se confirmó mediante el método de terminador
de cadena. A partir de ahora en el presente documento, este plásmido
recombinante se denominará pBlueScriptII KS
(+)-AQP5.
Después, el diseño de los cebadores se realizó
para amplificar la región que codifica para la AQP5 completa y para
incluir la región no traducida en el lado 5' del gen de
\beta-globina de Xenopus laevis, cuya
existencia se ha publicado en J. Biol. Chem., 258,
7924-7927 (1983). Usando dicho pBlueScriptII KS
(+)-ADN de AQP5 como plantilla y 50 pmol de
cebador, se llevó a cabo la amplificación por PCR (94ºC, 1 min.,
50ºC, 1 min., 72ºC, 2 min. durante 30 ciclos). El producto de la
PCR se subclonó en el vector pSP64poly(A) (producto de
Pro-Mega). Este plásmido recombinante se denominará
a continuación en el presente documento
pSP64poly(A)-AQP5.
\newpage
Ejemplo experimental
3
Usando 5 \mug del digesto por EcoR1 de dicho
pSP64poly(A)-ADN de AQP5 y SP6ARN polimerasa,
se llevó a cabo una transcripción in vitro en 100 \muL en
presencia de un análogo de caperuza
m^{7}G(5')ppp(5')G a 30ºC durante 1 hora para
sintetizar el ARN complementario (ARNc). Después el plásmido de ADN
se digirió con ADNasa I libre de ARNasa (Pharmacia Biotech), se
extrajo con fenol/cloroformo, y se extrajo dos veces con etanol. El
ARNc así obtenido se suspendió en agua destilada para inyección en
los ovocitos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo experimental
4
Se prepararon los ovocitos según el método
descrito en Taylor et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82,
6585-6589 (1985)) según se indica a continuación.
Se anestesiaron individuos hembra maduros de Xenopus laevis y
se extrajeron los ovocitos (fase V a VI) y se situaron en una
disolución tampón de Barth (Tris-HCl 5 mM, NaCl 88
mM, KCl 1 mM, NaHCO_{3} 2,4 mM, Ca(NO_{3})_{2}
0,33 mM, CaCl_{2} 0,41 mM, MgSO_{4} 0,82 mM, penicilina +
estreptomicina 10 \mug/mL, pH 7,2; el tampón de esta formulación
se denomina a continuación en el presente documento como
"MBS"). Después, se dispersaron las células respectivas en una
disolución tampón de Barth que contenía 2 mg/ml de colagenasa de
tipo 2 pero sin ión calcio con agitación suave durante 1 hora. Se
lavaron estos ovocitos muy bien con disolución tampón de Barth. Se
cultivaron entonces los ovocitos en disolución tampón de Barth a
20ºC durante toda la noche y al día siguiente se llevó a cabo una
microinyección mediante el siguiente procedimiento.
En 50 nl de agua destilada se disolvieron 5 ng
de ARNc de AQP5 obtenido en el ejemplo experimental 3, bien solo o
junto con 25 ng del ARN poli(A)^{+} de glándula
lagrimal obtenido en el ejemplo experimental 1, y la disolución se
microinyectó en los ovocitos con una micropipeta de vidrio
esterilizada usando un sistema de microinyección Drummond (producto
de Drummond). En el grupo control, se microinyectaron 50 nl de agua
destilada. Se cultivaron los ovocitos en MBS a 20ºC durante 3 días
cambiando a diario el fluido del cultivo para dejar que se expresen
la AQP5 y la proteína con origen en la glándula lagrimal.
Se confirmó la expresión de la proteína AQP5
sometiendo la fracción de la membrana de los ovocitos a una
electroforesis en gradiente de gel de
SDS-poliacrilamida y se llevó a cabo un análisis de
inmunotransferencia de tipo Western usando el antisuero de conejo
obtenido usando el extremo C-terminal de AQP5.
Además, usando una muestra de ovocito inmovilizado, se confirmó la
expresión de la proteína AQP5 en la membrana celular mediante una
técnica de inmunofluorescencia usando un microscopio de
fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ovocitos obtenidos en el ejemplo
experimental 4 se incubaron en MBS isotónico que contenía
dibutiril-AMPc 5 mM (concentración salina de
aproximadamente 200 mOsm) durante 30 minutos. Entonces, los ovocitos
se transfirieron a MBS isotónico, se microinyectó carvona 10^{-8}
M, 10^{-7}_{ }M o 10^{-6}_{ }M en los ovocitos, y las
células se cultivaron en MBS isotónico durante 4 horas. En el grupo
control se microinyectó agua destilada. El experimento de la
permeabilidad al agua se realizó según el siguiente protocolo.
El experimento de permeabilidad de agua se
realizó según el método descrito en la bibliografía (Science, 256,
385-387 (1992), y Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91,
6269-6273 (1994)), según se explica a
continuación.
Los ovocitos anteriores cultivados en MBS
isotónico (200 mOsm) durante 4 horas se transfirieron a MBS
hipotónico (40 mOsm)y se cultivaron en el mismo a 20ºC, y
durante el transcurso, se realizó un fotografiado en serie usando
un microscopio de contraste de fases (producto de Olympus) a
intervalos de 10 segundos. El volumen y el cambio en el volumen se
computaron a partir de la imagen producida por un sistema de
análisis de imágenes (producto de Fuji Film). El valor de
permeabilidad al agua (Pf) se calculó a partir del gradiente inicial
de V/V_{0} frente al tiempo (d(V/V_{0})/dt), el volumen
inicial del ovocito (V_{0} = 9 x 10^{-4} cm^{3}), el área
inicial del ovocito (S = 0,045 cm^{2}), y el volumen molar del
agua (V_{a} = 18 cm^{3}/mol) por medio de la siguiente
ecuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Pf \ (cm/seg)
= [V_{0} \ x \ (d(V/V_{0})/dt)]/[S \ x \ V_{a} \ x \
(mOSm_{in} -
mOsm_{out})]
En la ecuación, V representa el volumen
(cm^{3}) del ovocito después del tiempo t; mOSm_{in} representa
la concentración salina inicial de MBS, que era de 200 mOsm en este
caso; mOSm_{out} representa la concentración salina de MBS
hipotónico, que era de 40 mOsm en este caso.
Los resultados se muestran en la figura 1. Los
experimentos 1 a 8 del dibujo se realizaron según las siguientes
condiciones 1 a 8.
| Ovocitos | Inyección | |
| Experimento 1 | Inyectado ARNc | Agua destilada |
| Experimento 2 | Inyectado ARNc + ARN poli(A) | Agua destilada |
| Experimento 3 | Inyectado ARNc + ARN poli(A) | Carvona 10^{-8} M |
| Experimento 4 | Inyectado ARNc + ARN poli(A) | Carvona 10^{-7} M |
| Experimento 5 | Inyectado ARNc + ARN poli(A) | Carvona 10^{-6} M |
| Experimento 6 | Inyectada agua destilada | Agua destilada |
| Experimento 7 | Inyectada agua destilada | Carvona 10^{-7} M |
| Experimento 8 | Inyectada agua destilada | Carvona 10^{-6} M |
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un experimento de la
permeabilidad al agua de la misma manera que en el ejemplo 1 usando
2-isobutil-3-metoxipirazina,
10^{-7} M o 10^{-6} M, o acetato de citronelilo, 10^{-7} M o
10^{-6} M, cada uno como otra sustancia odorante, en lugar de
carvona.
Los resultados se muestran en la figura 2. Los
experimentos 1 a 9 del dibujo se realizaron según las siguientes
condiciones experimentales 1 a 9.
| Ovocitos | Inyección | |
| Experimento 1 | Inyectado ARNc | Agua destilada |
| Experimento 2 | Inyectado ARNc + ARN poli(A) | Agua destilada |
| Experimento 3 | Inyectado ARNc + ARN poli(A) | 2-isobutil-3-metoxipirazina 10^{-7} M |
| Experimento 4 | Inyectado ARNc + ARN poli(A) | 2-isobutil-3-metoxipirazina 10^{-6} M |
| Experimento 5 | Inyectado ARNc + ARN poli(A) | acetato de citronelilo 10^{-7} M |
| Experimento 6 | Inyectado ARNc + ARN poli(A) | acetato de citronelilo 10^{-6} M |
| Experimento 7 | Inyectada agua destilada | Agua destilada |
| Experimento 8 | Inyectada agua destilada | 2-isobutil-3-metoxipirazina 10^{-6} M |
| Experimento 9 | Inyectada agua destilada | acetato de citronelilo 10^{-6} M |
Con referencia al ejemplo 1, el experimento 1
mostró la permeabilidad al agua de los ovocitos a los que no se les
había inyectado ARN poli(A)^{+} con origen en la
glándula lagrimal, pero que expresan proteína AQP5; el resultado
indica claramente la existencia de la actividad de un canal de agua
cuando se compara con los experimentos 6 a 8 en los que no se
expresaba AQP5. Los experimentos 2 a 5 mostraban la permeabilidad al
agua de los ovocitos en presencia tanto de la proteína AQP5 como de
la proteína expresada mediante la inyección de ARN
poli(A)^{+} con origen en la glándula lagrimal. Era
evidente a partir del experimento 2 que la permeabilidad al agua
disminuía considerablemente en presencia de la proteína expresada
mediante la inyección del ARN poli(A) con origen en la
glándula lagrimal. La comparación de este resultado con el resultado
del experimento 1 indicó que la proteína expresada mediante la
inyección de ARN poli(A)^{+} con origen en la
glándula lagrimal inhibía la permeabilidad al agua de la proteína
AQP5. Se ha confirmado a partir de los experimentos 3 a 5 que la
inyección de carvona en los ovocitos en las condiciones anteriores
dieron como resultado la recuperación de la permeabilidad al agua
hasta el nivel observado en el
experimento 1.
experimento 1.
Con referencia al ejemplo 2, los experimentos 3
a 6 indicaron que, aunque no tan alto como la carvona, la
2-isobutil-3-metoxipirazina
o el acetato de citronelilo también elevan la permeabilidad al agua.
A partir de estos resultados, se ha encontrado que muchas
sustancias diferentes que varían mucho en la estructura química,
tal como la carvona que es un derivado hidrocarbonado cíclico
(monoterpeno-cetona), la
2-isobutil-3-metoxipirazina
que es un derivado de un compuesto heterocíclico, y el acetato de
citronelilo que es un derivado de hidrocarburo de cadena, elevan la
permeabilidad al agua de AQP5 en medidas remarcables.
Por lo tanto, la composición de la presente
invención reestablece y mantiene el nivel de actividad de permeación
de agua de las células disminuido por la expresión de la proteína
mediante la inyección de ARN poli(A)^{+} con origen
en la glándula lagrimal en presencia de AQP en un estado más
activo.
Después, usando (R)-(-)-carvona,
(+)-pregona, borneol,
trans-4-metilciclohexanol, y mentol,
todos los cuales son sustancias odorantes, cada una disuelta en
aceite de ricino hidrogenado al 0,1%-solución salina, se evaluó
in vivo la actividad estimulante de la lagrimación de estas
sustancias. El método usado era tal y como sigue.
Se recogió el líquido lagrimal del ojo izquierdo
de ratones a intervalos de 15 minutos usando un tubo microcapilar
de vidrio (capacidad de aspiración de 0,5 \mul/32 mm). La cantidad
de líquido lagrimal aspirado se midió en longitud (mm) usando
calibres y se convirtió en \mul para su uso como un marcador de la
producción de lágrimas. Se anestesiaron los ratones mediante
administración intraperitoneal de disolución anestésica de nembutal
(0,2 mL/10 g de peso corporal, dosis de 60 mg/kg). Tras confirmar la
pérdida del reflejo doloroso en el ratón, se inició la medición de
la producción de lágrimas. Se realizaron las mediciones
invariablemente a intervalos de 15 minutos desde el principio al
fin. Después de dos mediciones iniciales realizadas separadas por
15 minutos, cada sustancia de prueba (dosis de 30 mg/kg) se
administró inmediatamente en la vena caudal de los ratones a una
tasa de 0,1 ml/10 g de peso corporal. Por lo tanto, la recogida de
líquido lagrimal se lleva a cabo a intervalos de 15 minutos.
Como resultado, se observaron incrementos
marcados en la lagrimación a los 15 minutos después de la
administración intravenosa de cada una de las sustancias odorantes.
En la tabla 1 se muestran los resultados. Se expresó el cambio en
la producción de lágrimas como el porcentaje de producción de
lagrimación en cada medición en relación al promedio de la
producción de lagrimación en dos mediciones iniciales antes de la
administración de cada sustancia de prueba.
| Sustancia de prueba | Cambio en la producción de lagrimación |
| después de 15 minutos (%) | |
| (R)-(-)-Carvona | 61,5 |
| (+)-pregona | 70,2 |
| Borneol | 97,5 |
| Trans-4-metilciclohexanol | 85,4 |
| Mentol | 88,1 |
| Vehículo | 2,8 |
Se evaluó el efecto del uso combinado de
(R)-(-)carvona, es decir, la sustancia odorante usada en el ejemplo
1, y el clorhidrato de pilocarpina. El método usado es como se
indica a continuación.
Se recogió el líquido lagrimal del ojo izquierdo
de ratones a intervalos de 15 minutos usando un tubo microcapilar
de vidrio (capacidad de aspiración de 0,5 \mul/32 mm). La cantidad
de líquido lagrimal aspirado se midió en longitud (mm) usando
calibres y se convirtió en \mul para su uso como un marcador de la
producción de lágrimas. Se anestesiaron los ratones mediante
administración intraperitoneal de disolución anestésica de nembutal
(0,2 ml/10 g peso corporal, dosis de 60 mg/kg). Tras confirmar la
pérdida del reflejo doloroso en el ratón, se inició la medida de la
producción de lágrimas. Se realizaron las mediciones invariablemente
a intervalos de 15 minutos desde el principio al fin. Después de
dos mediciones iniciales realizadas separadas por 15 minutos, se
administró la sustancia de prueba inmediatamente en la vena caudal
de los ratones a una tasa de 0,1 ml/10 g de peso corporal. Después,
se repitió la medición a intervalos de 15 minutos. Inmediatamente
después de la medición de la producción de lagrimación a los 15
minutos después de la administración de la sustancia de prueba, se
administró clorhidrato de pilocarpina al 0,005% por vía subcutánea a
0,1 ml/10 g de peso corporal (dosis de 5 mg/kg). Se llevó a cabo de
forma adicional la recogida de líquido lagrimal 4 veces a
intervalos de 15 minutos.
Como resultado, se observaron aumentos marcados
en lagrimación a los diez minutos y pico hasta decenas de minutos
tras la administración intravenosa y el efecto se sostuvo durante un
largo tiempo. En la figura 3 se muestran los resultados con la
(R)-(-)-carvona (dosis de 30 mg/kg) en el gráfico.
El cambio en la producción de lagrimación se expresó como el
porcentaje de la producción de lagrimación en cada medición en
relación con el promedio de producción de lagrimación en las dos
mediciones antes de la administración de la sustancia de prueba. La
dimensión del tiempo representa el tiempo después de la
administración de carvona.
Pudo observarse a partir del ejemplo 3 que la
administración de carvona produce un aumento no inferior al 60% en
la producción de lagrimación en un periodo corto de tiempo tal como
de 15 a 30 minutos. Además, el efecto disminuyó gradualmente con el
tiempo. Sin embargo, el ejemplo 4 mostró que el uso combinado de
pilocarpina dio como resultado una prolongación adicional del
efecto.
\vskip1.000000\baselineskip
Algunos ejemplos de formulación generales para
los colirios se dan a continuación pero pretenden ayudar en el
entendimiento de la presente invención y de ninguna forma definen el
alcance de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
| Colirio 1 (en 100 ml) | |
| Carvona | 100 mg |
| Aceite de ricino hidrogenado al 1% | 1 ml |
| Solución salina fisiológica | c.s.p |
\vskip1.000000\baselineskip
| Colirio 2 (en 100 ml) | |
| Benzoato de denatonio | 100 mg |
| Aceite de ricino hidrogenado al 1% | 1 ml |
| Solución salina fisiológica | c.s.p |
\vskip1.000000\baselineskip
| Colirio 3 (en 100 ml) | |
| Carvona | 10 mg |
| Glicerina concentrada | 2500 mg |
| Polisorbato 80 | 2000 mg |
| Dihidrogenofosfato de sodio\cdot2H_{2}O | 200 mg |
| Hidróxido de sodio 1 N | c.s.p |
| Ácido clorhídrico 1 N | c.s.p |
| Agua estéril purificada | c.s.p |
\vskip1.000000\baselineskip
Los colirios que contienen carvona en
concentraciones del 0,001%, 0,005%, 0,05%, 0,1% y 3,0% (p/v) pueden
preparase también de forma similar ajustando los niveles de
formulación de carvona y los aditivos de forma apropiada.
\vskip1.000000\baselineskip
| Colirio 4 (en 100 ml) | |
| 2-Isobutil-3-metoxipirazina | 10 mg |
| Glicerina concentrada | 2500 mg |
| Polisorbato 80 | 2000 mg |
| Dihidrogenofosfato de sodio\cdot2H_{2}O | 200 mg |
| Hidróxido de sodio 1 N | c.s.p |
| Ácido clorhídrico 1 N | c.s.p |
| Agua estéril purificada | c.s.p |
| Colirio 5 (en 100 ml) | |
| Acetato de citronelilo | 10 mg |
| Glicerina concentrada | 2500 mg |
| Polisorbato 80 | 2000 mg |
| Dihidrogenofosfato de sodio\cdot2H_{2}O | 200 mg |
| Hidróxido de sodio 1 N | c.s.p |
| Acido clorhídrico 1 N | c.s.p. |
| Agua estéril purificada | c.s.p |
La composición abridora de los canales de agua
novedosa según el primer aspecto de la invención, constituida según
lo anterior, tienen una actividad abridora del canal de agua AQP5.
La composición farmacéutica según el segundo aspecto de la
invención puede estimular y mantener la actividad del canal de agua
de AQP5 en la glándula lagrimal, y usándola puede proporcionar una
composición farmacéutica para uso oftálmico, en particular una
composición estimulante de la lagrimación que tienen tanto unas
propiedades de acción rápida como de larga duración y un fármaco
terapéutico para la lesión epitelial queratoconjuntival.
Claims (5)
1. Uso de un ligando de lipocalina para la
fabricación de una composición para el tratamiento de lesión
epitelial queratoconjuntival, en la que dicho ligando de
lipocalina es un compuesto que se selecciona del grupo que consiste
en: glucolípidos, porfirinas, benzoato de denatonio,
2-isobutil-3-metoxipirazina,
2-amino-4-butil-5-propilselenazol,
acetato de citronelilo, carvona,
2-isopentilpirazina,
4-butil-5-propiltiazol,
timol, 3,7-dimetiloctanol,
2-nonenal, linalol, benzoato de bencilo, compuestos
similares al almizcle de anillo de 3 miembros,
2-metil-3-metoxipirazina,
benzaldehído, quinolina, 2-feniletanol, cineol,
isovalerato de isobutilo, ácido isovalérico,
\beta-ionona,
2-trans-6-cis-nonadienal,
geosmina, tricloroanisol,
5-\alpha-androst-16-en-3-ona,
pentadecalactona, sulfuro de dimetilo,
4-hidroxioctanolactona, acetato de etilo,
(+)-pregona y
trans-4-metilciclohexanol.
2. Uso de un ligando de lipocalina para la
fabricación de una composición para la aceleración de la
cicatrización de heridas queratoconjuntivales, en la que dicho
ligando de lipocalina es un compuesto que se selecciona del grupo
que consiste en: glucolípidos, porfirinas, benzoato de denatonio,
2-isobutil-3-metoxipirazina,
2-amino-4-butil-5-propilselenazol,
acetato de citronelilo, carvona,
2-isopentilpirazina,
4-butil-5-propiltiazol,
timol, 3,7-dimetiloctanol,
2-nonenal, linalol, benzoato de bencilo, compuestos
similares al almizcle de anillo de 3 miembros,
2-metil-3-metoxipirazina,
benzaldehído, quinolina, 2-feniletanol, cineol,
isovalerato de isobutilo, ácido isovalérico,
\beta-ionona,
2-trans-6-cis-nonadienal,
geosmina, tricloroanisol,
5-\alpha-androst-16-en-3-ona,
pentadecalactona, sulfuro de dimetilo,
4-hidroxioctanolactona, acetato de etilo,
(+)-pregona y
trans-4-metilciclohexanol.
3. Uso de un ligando de lipocalina para la
fabricación de una composición para el tratamiento del alargamiento
de las células epiteliales queratoconjuntival, en la que dicho
ligando de lipocalina es un compuesto que se selecciona del grupo
que consiste en: glucolípidos, porfirinas, benzoato de denatonio,
2-isobutil-3-metoxipirazina,
2-amino-4-butil-5-propilselenazol,
acetato de citronelilo, carvona,
2-isopentilpirazina,
4-butil-5-propiltiazol,
timol, 3,7-dimetiloctanol,
2-nonenal, linalol, benzoato de bencilo, compuestos
similares al almizcle de anillo de 3 miembros,
2-metil-3-metoxipirazina,
benzaldehído, quinolina, 2-feniletanol, cineol,
isovalerato de isobutilo, ácido isovalérico,
\beta-ionona,
2-trans-6-cis-nonadienal,
geosmina, tricloroanisol,
5-\alpha-androst-16-en-3-ona,
pentadecalactona, sulfuro de dimetilo,
4-hidroxioctanolactona, acetato de etilo,
(+)-pregona y
trans-4-metilciclohexanol.
4. Uso de un ligando de lipocalina para la
fabricación de una composición para el tratamiento de la
xeroftalmia, en la que dicho ligando de lipocalina es un compuesto
que se selecciona del grupo que consiste en: glucolípidos,
porfirinas, benzoato de denatonio,
2-isobutil-3-metoxipirazina,
2-amino-4-butil-5-propilselenazol,
acetato de citronelilo, carvona,
2-isopentilpirazina,
4-butil-5-propiltiazol,
timol, 3,7-dimetiloctanol,
2-nonenal, linalol, benzoato de bencilo, compuestos
similares al almizcle de anillo de 3 miembros,
2-metil-3-metoxipirazina,
benzaldehído, quinolina, 2-feniletanol, cineol,
isovalerato de isobutilo, ácido isovalérico,
\beta-ionona,
2-trans-6-cis-nonadienal,
geosmina, tricloroanisol,
5-\alpha-androst-16-en-3-ona,
pentadecalactona, sulfuro de dimetilo,
4-hidroxioctanolactona, acetato de etilo,
(+)-pregona y
trans-4-metilciclohexanol.
5. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho ligando de lipocalina se
usa en combinación con un fármaco parasimpaticomimético.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22676199 | 1999-08-10 | ||
| JP11-226761 | 1999-08-10 |
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|---|---|
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ID=16850211
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