JP3817122B2

JP3817122B2 - 水チャンネルオープナー組成物及び眼科用医薬組成物

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Publication number: JP3817122B2
Application number: JP2000240803A
Authority: JP
Inventors: 四郎三田; 成弘石田; 慎一郎平井
Original assignee: Santen Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Santen Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-08-10
Filing date: 2000-08-09
Publication date: 2006-08-30
Anticipated expiration: 2020-08-09
Also published as: JP2001114698A

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、リポカリン類、特にオドラントバインディングプロテイン（以下、ＯＢＰ）、への結合物質からなる新規水チャンネルオープナーに関する。本発明の新規水チャンネルオープナーは、アクアポリン５水チャンネル開口作用を有し、医薬組成物、特に眼球乾燥症候群（ドライアイ）治療用剤等の角結膜上皮障害治療用剤に利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
細胞膜を介する水の透過は、細胞膜の主要構造である脂質２重層を拡散してゆっくりと行われる。しかしながら、近年、ある種の細胞において、細胞膜を通過する速い水の移動が発見され、研究の結果、この現象には水を選択的に通す膜タンパク質が関与していることが想定された。その後、実際に各種のこのような膜タンパク質が単離されるに至り、この膜タンパク質は、水チャンネルと称されるようになった。
【０００３】
このような水チャンネルタンパク質として、アクアポリン（ＡＱＰ）とよばれる一群の膜タンパク質が単離されており、現在、ＡＱＰ１〜５、ＦＡ−ＣＨＩＰ、ＡＱＰ−γＴＩＰ等のアクアポリンが哺乳類、両生類、植物等から発見されている（例えば、「医学のあゆみ」、１７３巻、９号、７４５〜７４８頁（１９９５年））。このうち、ＡＱＰ５は、哺乳類の唾液腺、眼（涙腺、角膜上皮組織）、気管支等に存在していることが知られている（「医学のあゆみ」、１７３巻、９号、７４５〜７４８頁（１９９５年）；Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７０，Ｃ１２−Ｃ３０（１９９６））。
【０００４】
ＡＱＰ５は、近年、眼の涙腺組織細胞の頂端細胞膜に存在していることが示され（Ｉｓｈｉｄａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｎ．，２２４，１−４（１９９６））、涙液分泌に際しての細胞横断的な水の輸送に深く関与しており、涙液放出の調節を行っていることが認められた（Ｉｓｈｉｄａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｎ．，２３８，８９１−８９５（１９９７））。
【０００５】
本発明者らの最近の研究によれば、ＡＱＰ５を発現させたアフリカツメガエル卵母細胞を用いた実験により、アクアポリンの水チャンネルは涙腺細胞由来の何らかのタンパク質によってゲートの開閉がなされると考えられる。そして、ＡＱＰ５のＣ末端近傍の特定の部分ペプチドが水チャンネルオープナーとして始めて特定された。
【０００６】
一方、ＯＢＰに関する研究が臭覚の解明に関連してなされてきた。ＯＢＰは、脊椎動物の鼻粘液中や昆虫の感覚子リンパ中に高い濃度で含まれる可溶性低分子量タンパクである。ＯＢＰは匂い物質やフェロモンに親和性があり、臭覚に関連すると考えられ、リポカリンスーパーファミリーに属することが知られている。リポカリンは、可溶性の分泌タンパクで、匂い物質を含む様々な疎水性リガンドとの結合能を示す各種のメンバーが知られている。
【０００７】
ＯＢＰは由来によって幾つかの種類が単離されているが、サブユニットが２０ｋＤａ前後の２量体であるものが多く、単量体もある。脊椎動物のＯＢＰは知られている限りでは鼻腔組織で合成され細胞外に分泌され、鼻の吸腔上皮に最も高濃度で蓄積されている。
【０００８】
また、リポカリンのリガンド、特に、ＯＢＰへの結合活性を有する匂い物質（以下、「オドラント物質」ともいう）が、ある種の生化学的又は生理的作用を有することが知られている。例えば、２−ケトアルカン誘導体やカルボンが臭覚組織におけるナトリウム−カリウムＡＴＰａｓｅに影響を与えることや（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０，１０５１−１０６２（１９７７））、カルボン等のモノテルペン類がレンズアルドースレダクターゼを阻害する（Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１１，３１２−３１４（１９８８））ことが報告され、特開平２−１９３９３２号公報にはカルボン等についての経皮、経粘膜吸収促進作用が開示されている。
【０００９】
ＯＢＰに関して、Ｕ．Ｓ．特許５，０３０，７２２号にはラット側鼻腺由来のＯＢＰタンパクが開示されている。
【００１０】
ＯＢＰはまた、ラットの涙液中に高濃度で存在することも知られている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，４９４２−４９４６（１９８６））。
【００１１】
ヒトの涙腺から分泌される涙液プレアルブミンが、ＯＢＰとアミノ酸配列に相同性を有することも報告されている（ＣｈｅｍＳｅｎｓｅｓ，２０，６９−７６（１９９５））。また、ヒトの鼻粘液には涙液リポカリンと良く似た１９ｋＤａのタンパクが発見されている（ＣｏｍｐＢｉｏｃｈｅｍＰｈｙｓｉｏｌ，１１８Ｂ，８１９−８２４（１９９７））。
【００１２】
同じくリポカリンスーパーファミリーに属すると考えられている匂い物質との結合能を有するタンパクが、動物の尿中や唾液中に見つかっている（Ｆｉｎｌａｙｓｏｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４９，９８１−９８２（１９６５）、Ｃｅｌｌ，３２，７５５−７６１（１９８３））。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
このようにＯＢＰを含むリポカリン類や匂い物質に関する知見が蓄積されつつあるが、涙液分泌との関わりは知られていなかった。
【００１４】
しかしながら、本発明者らは、ＯＢＰを含むリポカリン類のリガンドの涙腺における作用を探究する過程で、意外にも匂い物質を含む各種のリガンド物質が涙液分泌促進作用を発揮する事を発見した。
【００１５】
上記現状に鑑み、本発明は、ＡＱＰの水チャンネルを開口する作用を有する新規水チャンネルオープナーを提供することを目的とするものである。また、これを有効成分として含む医薬組成物、特に涙液分泌促進剤を提供することを目的とするものである。上記促進剤は、眼球乾燥症候群（ドライアイ）等の角結膜上皮障害治療用に使用することができる。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、リポカリンのリガンドからなるアクアポリン水チャンネルオープナー組成物である。
本発明の有利な態様においては、上記リポカリンのリガンドは、オドラントバインディングプロテイン結合活性を有する化合物である。
本発明はまた、リポカリンのリガンドを有効成分として含有する眼科用医薬組成物、特に、涙液分泌促進組成物、及び、眼球乾燥症候群治療剤等の角結膜上皮障害治療剤である。
以下に本発明を詳述する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の組成物は、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有するアクアポリン水チャンネルオープナー組成物である。本明細書中、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用とは、ＡＱＰ５水チャンネルを通した細胞膜の水透過性を向上させる作用をいい、アクアポリン水チャンネルオープナーとはアクアポリンの水チャンネル開口作用を有する物質をいう。上記水チャンネルには、水のみを選択的に通過させるものや、水のみならず、例えば、グリセロールや尿素等の低分子量の分子を通過させるものも存在する。
【００１８】
本発明の組成物のＡＱＰ５水チャンネル開口作用を、以下に説明する。
生体組織細胞において、ＡＱＰ５による水透過作用は、各種の調節を受けていることが知られている。例えば、ＡＱＰ５の発現が確認されている涙腺組織細胞であっても、通常は、交感神経−副交感神経支配により涙液分泌が制御されている。従って、生体組織細胞におけるＡＱＰ５の発現とその水透過作用の発現は同一の事象ではない。そこで、ＡＱＰ５による水透過作用の確認は、ＡＱＰファミリーの遺伝子が発現していないことが知られているアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞にＡＱＰ５遺伝子を注入して発現させたものを用いて、水透過性実験を行うことによって、以下のように確認される。
【００１９】
アフリカツメガエル卵母細胞に、ＡＱＰ５のｍＲＮＡを注入することによって水透過性の上昇が引き起こされる。この水透過性の上昇は、容易に観察することができるので、水チャンネルの作用の確認に広く使用されている。例えば、石橋らは、ＡＱＰ３のｃＤＮＡをｐＳＰ６４Ｔ由来のＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクターに挿入し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してｃＲＮＡを合成し、このｃＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入した場合、注入後４８〜６２時間のインキュベーションにより水の透過性が増加し、また、体積増加が生じたことを確認して、水チャンネルを確認している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，６２６９−６２７３（１９９４））。類似の報告がＳｃｉｅｎｃｅ，２５６，３８５−３８７（１９９２）にもある。
【００２０】
そこで、これらと同様にして、ＡＱＰ５をコードする全長ｃＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞にマイクロインジェクションして培養し、ＡＱＰ５を発現させる。その後、低張な培養液中に卵母細胞を移動して、その体積変化から水透過性を算出する。ＡＱＰ５をコードする全長ｃＲＮＡを注入しなかったコントロール群は、低い水透過性を示すが、ＡＱＰ５をコードする全長ｃＲＮＡを注入した群の水透過性が上昇することによって、水チャンネルの作用を確認することができる。
【００２１】
一方、アフリカツメガエル卵母細胞に、ＡＱＰ５をコードする全長ｃＲＮＡ、及び、涙腺由来のポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡをマイクロインジェクションして培養し、ＡＱＰ５、及び、涙腺由来の全タンパク質を発現させた系においては、ＡＱＰ５による水透過作用は、後に実施例において詳細に説明するように、上述のＡＱＰ５のみを発現させた系に比べて大幅に低下する。従って、涙腺由来のタンパク質の存在によってＡＱＰ５による水透過作用が抑制されることが判る。この涙腺由来のタンパク質の存在によってＡＱＰ５による水透過作用が抑制される現象は、水チャンネルゲートの開閉の変化によるものであると考えられる。
【００２２】
この系に、本発明の組成物を共存させると、ＡＱＰ５による水透過作用が、抑制のない場合と同程度に回復する。このように、リポカリンのリガンドがＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有する物質として特定されたことは、従来のリポカリン類、特にＯＢＰに関して蓄積された知見からみて全く予想外の事実である。
【００２３】
リポカリン類は脊椎動物、無脊椎動物の各種器官や体液に存在する比較的小さな可溶性タンパクであり、アミノ酸配列レベルでは多様性を示すが、カーネルリポカリンと呼ばれる一群はＮ末端付近に３つの保存的配列モチーフを共通にし、ＯＢＰがその一つであるアウトライアーリポカリンとよばれる一群はそのうちの１つの配列モチーフを共通にする。また、リポカリンは高次構造において極めて特徴的な共通点を持ち、典型的なリポカリンの構造は、８本の逆平行に連続するβストランドからなるβバレル構造を有し、このポケット状の疎水性構造の両端に、３₁₀様ヘリックスとαヘリックスがそれぞれ付いている。リガンドは疎水性のβバレルに結合する。このため、リポカリンは疎水性の分子に対する親和性が高く、生体内では体液中で疎水性リガンドのキャリアーとして機能していると考えられている。
【００２４】
リポカリンとして知られているものを例示すれば、例えば、ＯＢＰ、α−１−ミクログロブリン、α１−アシドグリコプロテイン、アポリポプロテイン、クラスタシアニン、エンブリオＣＨ２１タンパク、βラクトグロブリン、メジャーウリナリープロテイン、プロバシン、レチノールバインディングタンパク、涙液アルブミン、ｖｏｎＥｂｎｅｒ腺タンパク、パープリン等を挙げることができる。
【００２５】
ＯＢＰはリポカリンに共通な典型的βバレルモチーフを持つことがウシＯＢＰで確かめられている。マウスのＯＢＰは二つのサブユニットＩａとＩｂとからなるヘテロダイマーである。マウスのＯＢＰ−ＩａとＩｂ遺伝子の塩基配列（それぞれ、６５７ｂｐと６６９ｂｐ）及びＯＢＰ−ＩａとＩｂタンパク質のアミノ酸配列（それぞれ、１４７アミノ酸残基と１４６アミノ酸残基）はＧｅｎｅ，２１２，４９−５５（１９９８）に開示されている。
【００２６】
ＯＢＰに属するものには以下のタンパクが含まれる。すなわち、ウシＯＢＰ、ラットＯＢＰ−Ｉ、ラットＯＢＰ−ＩＩ、ウサギＯＢＰ−Ｉ、ウサギＯＢＰ−ＩＩ、ブタＯＢＰ−Ｉ、ブタＯＢＰ−ＩＩ、マウスＯＢＰ−Ｉ、マウスＯＢＰ−ＩＩ、マウスＯＢＰ−ＩＩＩ、ｈｙｓ−ＯＢＰ−Ｉ（ヤマアラシ）、ｈｙｓ−ＯＢＰ−ＩＩ（ヤマアラシ）、シカＯＢＰ−Ｉ、シカＯＢＰ−ＩＩ、カエルＢＧ、ネコＯＢＰ等は脊椎動物の臭覚組織から単離されたＯＢＰの例示である。
【００２７】
リポカリンにリガンド結合する疎水性分子としては、例えば、レチノール（涙液アルブミン、レチノール結合タンパク、パープリン等のリガンド）、グリコリピッド等（ＶＥＧタンパクのリガンド）、ポルフィリン（プロテインＨＣのリガンド）、デナトニウムベンゾエート（ｖｏｎＥｂｎｅｒ腺タンパクのリガンド）等を挙げることができるが、以下、ＯＢＰを例にとりリガンドを詳述する。
【００２８】
ＯＢＰは、他のリポカリンに比べて広い範囲の物質をリガンドとし、各種の匂い物質（オドラント物質）やフェロモンと可逆的に結合するが、２−イソブチル−３−メトキシピラジンとの結合活性の存在がＯＢＰタンパクの特徴の一つである（ネコＯＢＰは知られている唯一の例外である）。匂い物質は臭覚を刺激する物質であるが、ＯＢＰとの結合活性を有することと臭覚を引き起こすこととは必ずしも同じ事象ではない。従って、本発明においては、ＯＢＰとの結合活性を有する物質が臭覚を生じるか否かは問わない。ＯＢＰとの結合活性を有するＯＢＰのリガンドは、一般的には、ヒドロキシル基、カルボニル基等の極性基を持つか、又は、複素環を有し、かつ、平面状の疎水性領域を有する中程度の大きさの分子であり、例えば、２−イソブチル−３−メトキシピラジン、２−アミノ−４−ブチル−５−プロピルセレノアゾール、シトロネリルアセテート、カルボン、２−イソペンチルピラジン、４−ブチル−５−プロピルチアゾール、チモール、メントール、３，７−ジメチルオクタノール、２−ノネナール、リナロール、レチノール、ベンジルベンゾエート、３員環ムスク様化合物、２−メチル−３−メトキシピラジン、ベンズアルデヒド、キノリン、２−フェニルエタノール、シネオール、イソブチルイソバレレート、イソバレリック酸、β−イオノン、２−トランス−６−シス−ノナジエナール、ゲオスミン、トリクロロアニソール、５α−アンドロスト−１６−エン−３−オン、ペンタデカラクトン、ジメチルスルフィド、４−ヒドロキシオクタノイック酸ラクトン、エチルアセテート、ボルネオール等を挙げることができるが、これらに限るものではない。
【００２９】
これらの物質は、一般には、０．１〜１００μＭ程度の解離定数を持つ。例えば、２−イソブチル−３−メトキシピラジン、２−イソペンチルピラジン、４−ブチル−５−プロピルチアゾール、チモール、メントール、３，７−ジメチルオクタノール、２−ノネナール、リナロール、レチノール、ベンジルベンゾエート、３員環ムスク様化合物等はウシＯＢＰで０．１〜１μＭ程度の解離定数をもつ。
【００３０】
本発明の眼科用医薬組成物は、上述したリポカリンのリガンド、特にＯＢＰのリガンドの少なくとも１種を有効成分として含有してなる。本明細書中、「眼科用」とは、眼の疾病治療又は機能向上若しくは促進の目的のために、ヒト又は動物に適用されることを意味する。本発明の医薬組成物は、涙腺組織細胞のＡＱＰ５の水チャンネル開口作用を有するので、涙液分泌促進作用を発揮し、涙液分泌促進組成物として用いることができる。また、塩酸ピロカルピン等の腺分泌促進作用を有する副交感神経作動薬を併用して効果の持続性を高めることができる。
【００３１】
このような眼科用医薬組成物としては、例えば、涙液分泌促進組成物、角結膜上皮障害治療剤、角結膜創傷治癒促進剤、角結膜上皮伸展促進剤等を挙げることができる。なかでも、眼球乾燥症候群（ドライアイ）治療剤は、ＯＡ機器の発達に伴う眼の酷使等を原因とする疾病の治療剤として重要である。
【００３２】
本発明の眼科用医薬組成物は、涙腺からの涙液の分泌を直接促進することが可能である。従って、涙液の補填を目的とした従来の人工涙液の点眼剤とは、その作用機序を全く異にし、即効性があると同時に、涙液分泌を改善する。本発明の角結膜上皮障害治療剤は、上述の特性を生かして、特に、眼球乾燥症候群（ドライアイ）治療に対して持続性をも有するという極めて有利な性質を有している。
【００３３】
本発明の角結膜上皮障害治療剤の対象疾病はドライアイに限定されず、例えば、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、術後疾患、薬剤性疾患、外傷性疾患、コンタクトレンズ装用外因性疾患等を挙げることができる。
【００３４】
しかしながら、本発明の医薬組成物は、これらの用途のみに限定されず、ＡＱＰ５の発現する組織や器官の疾病治療を目的とする医薬組成物として、ヒト又は動物に投与することもできる。
【００３５】
本発明の医薬組成物は、局所投与のみならず全身投与することができ、経口でも非経口でも投与することが可能である。投与剤型としては、例えば、点眼液や眼軟膏等の点眼剤、注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等を挙げることができる。これらの剤型は通常使用される技術を使用して調製することができる。例えば、点眼剤であれば、塩化ナトリウム、濃グリセリン等の等張化剤、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等の緩衝化剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ステアリン酸ポリオキシ４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤、クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム等の安定化剤、塩化ベンザルコニウム、パラベン等の防腐剤を必要に応じて用いて製剤化することができる。ｐＨは眼科製剤に許容される範囲内であればよいが、ｐＨ４〜８の範囲が好ましい。また、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等の経口剤は、必要に応じて、乳糖、デンプン、結晶セルロース、植物油等の増量剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マクロゴール、シリコン樹脂等のコーティング剤、ゼラチン被膜剤を用いて製剤化することができる。
【００３６】
本発明の医薬組成物の投与量は、症状、年齢、剤型等により適宜選択されるが、本発明の眼科用医薬組成物を点眼剤として用いる場合であれば、例えば、本発明の有効成分を０．００１〜３％（ｗ／ｖ）含有するものを１日１回〜数回点眼すればよく、経口剤であれば、通常、１日あたり１ｍｇ〜１０００ｍｇを１回または数回に分けて投与すればよい。
【００３７】
なお、本発明の医薬組成物は、マウスの静脈内に投与することにより、ｉｎｖｉｖｏにおいて涙液分泌促進作用があることが確認されている。
【００３８】
【実施例】
以下に実験例、実施例及び製剤例等を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００３９】
実験例１涙腺ポリ（Ａ） ⁺ ＲＮＡの調製
雄性ＳＤラット及び雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスから涙腺を摘出し、ファルマシアＲＮＡピュリフィケーションキット（ファルマシア社製）によって、その全ＲＮＡを単離した。ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡは、常法に従って、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。
【００４０】
実験例２ＡＱＰ５をコードするｃＤＮＡの構築
実験例１で得たラット涙腺ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）₁₈プライマーを用いて逆転写し、その一本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲ法の鋳型として使用した。ＰＣＲ法のプライマーとしては、制限酵素切断部位を含み、かつ、ラットＡＱＰ５のｃＤＮＡ中の読み取り枠（オープンリーディングフレーム）をＰＣＲ法によって増幅できるものを使用した。鋳型として用いる上記一本鎖ｃＤＮＡを、ＰＣＲにより増幅させた（９４℃１分、６０℃１分、７２℃２分を３０サイクル）。ＰＣＲにより増幅させたものは、プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）にサブクローニングした。本実験では、正確なｃＤＮＡを得るために、サブクローニングを１０回行った。チェーンターミネーター法によってＤＮＡの塩基配列を確認した。以下、この組み換えプラスミドを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）−ＡＱＰ５という。
【００４１】
次に、ＡＱＰ５全コード領域を増幅し、かつ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８，７９２４−７９２７（１９８３）にその存在が報告されているアフリカツメガエルβ−グロビン遺伝子の５′側の非翻訳領域を含むように、プライマーを設計した。鋳型として上記のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）−ＡＱＰ５のＤＮＡを用い、プライマー５０ｐｍｏｌを使って、ＰＣＲ法により増幅させた（９４℃１分、５０℃１分、７２℃２分を３０サイクル）。ＰＣＲ法により増幅させたものは、ｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）ベクター（プロメガ社製）にサブクローニングした。以下、この組み換えプラスミドを、ｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）−ＡＱＰ５という。
【００４２】
実験例３ＲＮＡ合成
上記ｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）−ＡＱＰ５のＤＮＡのＥｃｏＲ１加水分解物５μｇ及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて、１００μＬ中、キャップアナログのｍ⁷ Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇの存在下、３０℃にて１時間、ｉｎｖｉｔｒｏで転写させ、相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を合成した。その後、プラスミドＤＮＡをＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅ１（ファルマシアバイオテック社製）で加水分解した後、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで２回抽出した。このようにして得たｃＲＮＡは、卵母細胞に注入するために、蒸留水に懸濁した。
【００４３】
実験例４卵母細胞の調製及びタンパク質の発現
卵母細胞は、以下のようにテイラー（Ｔａｙｌｏｒ）らに記載の方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２，６５８５−６５８９（１９８５））に準じて調製した。成熟した雌性アフリカツメガエルを麻酔し、卵母細胞（ステージＶ〜ＶＩ）を取り出し、バース（Ｂａｒｔｈ）緩衝液（５ｍＭトリス−ＨＣｌ、８８ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＫＣｌ、２．４ｍＭＮａＨＣＯ₃ 、０．３３ｍＭＣａ（ＮＯ₃ ）₂ 、０．４１ｍＭＣａＣｌ₂ 、０．８２ｍＭＭｇＳＯ₄ 、ペニシリン＋ストレプトマイシン１０μｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２、以下この配合の緩衝液を「ＭＢＳ」という）中に入れた。次いで、タイプＩＩコラゲナーゼ２ｍｇ／ｍＬを含み、カルシウムイオンを含まないバース緩衝液中で、ゆっくりと１時間攪拌しながら、各細胞を分散させた。この卵母細胞をバース緩衝液で充分に洗浄した。卵母細胞は、バース緩衝液中、２０℃で終夜培養し、翌日に、以下の方法によって、マイクロインジェクションを行った。
【００４４】
実験例３で得たＡＱＰ５のｃＲＮＡを５ｎｇ、又は、これと実験例１で得た涙腺ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡ２５ｎｇとを、蒸留水５０ｎＬに溶解させ、滅菌したガラス製マイクロピペットで、ドラモンドマイクロインジェクションシステム（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ社製）を使って、卵母細胞にマイクロインジェクションした。コントロール群としては、蒸留水５０ｎＬをマイクロインジェクションした。卵母細胞は、毎日、培養液を交換しながら、ＭＢＳ中、２０℃にて３日間培養し、ＡＱＰ５及び涙腺由来のタンパク質を発現させた。
【００４５】
ＡＱＰ５タンパク質の発現は、卵母細胞の膜成分をＳＤＳポリアクリルアミドグラジエントゲル電気泳動し、ＡＱＰ５のＣ末端を用いて得たウサギ抗血清を用いたウエスタンブロッティングによって確認した。また、卵母細胞を固定化したものを用いて、蛍光免疫細胞染色法により、細胞膜におけるＡＱＰ５タンパク質の発現を蛍光顕微鏡下に確認した。
【００４６】
実施例１水透過性に対するカルボンの影響試験
実験例４の卵母細胞を、５ｍＭジブチリルｃＡＭＰを含む等張なＭＢＳ（塩濃度約２００ｍＯｓｍ）中、３０分間インキュベートした。その後、等張なＭＢＳに卵母細胞を移し、カルボン１０^-8Ｍ、１０^-7Ｍ又は１０^-6Ｍを卵母細胞にマイクロインジェクションし、等張なＭＢＳ中で４時間培養した。コントロール群としては、蒸留水をマイクロインジェクションしたものを用いた。下記実験方法に従って、水透過性実験を行った。
【００４７】
水透過性実験は、以下のように、文献（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６，３８５−３８７（１９９２）、及び、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９１，６２６９−６２７３（１９９４））に記載されている方法に準じて行った。
【００４８】
等張なＭＢＳ（２００ｍＯｓｍ）中で４時間培養した上記卵母細胞を４０ｍＯｓｍの低張なＭＢＳに移し、２０℃で培養しながら、１０秒間隔で、位相差顕微鏡（オリンパス社製）による写真撮影を行った。体積及び体積変化は、画像解析システム（富士フィルム社製）の画像から計算した。水透過性（Ｐｆ）は、経過時間に対するＶ／Ｖ₀ の初期の傾き（ｄ（Ｖ／Ｖ₀ ）／ｄｔ）、卵母細胞の初期体積（Ｖ₀ ＝９×１０^-4ｃｍ³ ）、卵母細胞の初期面積（Ｓ＝０．０４５ｃｍ² ）及び水のモル体積（Ｖ_W ＝１８ｃｍ³ ／ｍｏｌ）から下記式により算出した。
【００４９】
Ｐｆ（ｃｍ／ｓｅｃ）＝〔Ｖ₀ ×（ｄ（Ｖ／Ｖ₀ ）／ｄｔ）〕／〔Ｓ×Ｖ_W ×（ｍＯｓｍ_in−ｍＯｓｍ_out ）〕
式中、Ｖはｔ時間経過後の卵母細胞の体積（ｃｍ³ ）を表す。ｍＯｓｍ_inは、初期のＭＢＳの塩濃度であり、この場合は２００ｍＯｓｍであった。ｍＯｓｍ_out は、低張なＭＢＳの塩濃度であり、この場合は４０ｍＯｓｍであった。
【００５０】
結果を図１に示した。図中、１〜８の実験は、下記の実験条件１〜８に従って行った。
卵母細胞インジェクション
実験１ｃＲＮＡ注入蒸留水
実験２ｃＲＮＡ＋ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ注入蒸留水
実験３ｃＲＮＡ＋ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ注入１０^-8Ｍカルボン
実験４ｃＲＮＡ＋ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ注入１０^-7Ｍカルボン
実験５ｃＲＮＡ＋ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ注入１０^-6Ｍカルボン
実験６蒸留水注入蒸留水
実験７蒸留水注入１０^-7Ｍカルボン
実験８蒸留水注入１０^-6Ｍカルボン
【００５１】
実施例２水透過性に対するオドラント物質の影響試験
実施例１と同様にしてカルボンの代わりに、やはりオドラント物質である２−イソブチル−３−メトキシ−ピラジン１０^-7Ｍ又は１０^-6Ｍ、シトロネリルアセテート１０^-7Ｍ又は１０^-6Ｍを用いて水透過性実験を行った。
結果を図２に示した。図中、１〜９の実験は、下記の実験条件１〜９に従って行った。
卵母細胞インジェクション
実験１ｃＲＮＡ注入蒸留水
実験２ｃＲＮＡ＋ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ注入蒸留水
実験３ｃＲＮＡ＋ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ注入１０^-7Ｍ２−イソブチル−３−メトキシ−ピラジン
実験４ｃＲＮＡ＋ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ注入１０^-6Ｍ２−イソブチル−３−メトキシ−ピラジン
実験５ｃＲＮＡ＋ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ注入１０^-7Ｍシトロネリルアセテート
実験６ｃＲＮＡ＋ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ注入１０^-6Ｍシトロネリルアセテート
実験７蒸留水注入蒸留水
実験８蒸留水注入１０^-6Ｍ２−イソブチル−３−メトキシ−ピラジン
実験９蒸留水注入１０^-6Ｍシトロネリルアセテート
【００５２】
実施例１において、１の実験は、涙腺由来のポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを注入しない卵母細胞であって、ＡＱＰ５タンパク質が発現した場合の水透過性を示し、ＡＱＰ５タンパク質が発現していない６〜８の実験と比較して、水チャンネルの作用の存在を明瞭に示している。２〜５の実験は、ＡＱＰ５タンパク質とともに、涙腺由来のポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡの注入により発現したタンパク質が存在する場合の卵母細胞の水透過性を示す。２の実験が示すように、涙腺由来のポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡの注入により発現したタンパク質が存在する場合には、水透過性が大きく低下していることが判る。１の実験の結果と比較して、涙腺由来のポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡの注入により発現したタンパク質が、ＡＱＰ５タンパク質の水透過性を抑制していると理解できる。この条件の卵母細胞に、カルボンを注入することにより、水透過性が、１の実験が示すレベルに回復することが、３〜５の実験から確証された。
【００５３】
また、実施例２において、３〜６の実験から、２−イソブチル−３−メトキシ−ピラジンやシトロネリルアセテートもまた、カルボンよりは少ないが、水透過性の上昇を示すことが判る。これらの結果、環状炭化水素誘導体（モノテルペンケトン）のカルボン、複素環誘導体の２−イソブチル−３−メトキシ−ピラジン、鎖状炭化水素誘導体のシトロネリルアセテートと、極めて多様な化学構造の物質がＡＱＰ５の水透過性を顕著に上昇させることが判明した。
【００５４】
すなわち、本発明の組成物は、ＡＱＰ存在下、涙腺由来のポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡの注入により発現したタンパク質存在下に抑制された細胞の水透過性活性レベルを、一層活性な状態に回復、維持する作用を有するものである。
【００５５】
実施例３オドラント物質のマウスにおける涙液分泌促進作用
次に、オドラント物質である（Ｒ）−（−）−カルボン、（＋）−プレゴン、ボルネオール、ｔｒａｎｓ−４−メチルシクロヘキサノール及びメントールを０．１％硬化ひまし油生理食塩水に溶解したものを使用してｉｎｖｉｖｏにおける涙液分泌促進作用を調べた。方法は以下のとおりである。
【００５６】
〔涙液分泌量測定〕
涙液は、マイクログラスキャピラリ（吸引容量０．５μＬ／３２ｍｍ）を用いて１５分間隔でマウス左目から採取した。吸引した涙液量は長さ（ｍｍ）をノギスで測定した上でμＬに換算し、分泌量の指標とした。マウスはネンブタール麻酔溶液を腹腔内投与（体重１０ｇあたり０．２ｍＬ、投与量は６０ｍｇ／ｋｇ）して麻酔した。マウスの痛覚反射が消失したことを確認後、涙液分泌量測定を開始した。測定は、開始後終了まで全て１５分間隔で行った。まず、１５分間隔で２回の涙液分泌測定終了後、直ちにマウス体重１０ｇに対して０．１ｍＬの割合で各被検物質（投与量３０ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈内投与した。その後引き続き涙液を１５分間隔で採取した。
【００５７】
その結果、これらのオドラント物質を静脈に投与した後１５分で顕著に涙液分泌が増加することが認められた。これらの結果を表１に示した。なお、涙液分泌量の変化は、被検物質投与前の２回の測定分泌量の平均に対する各測定時点での分泌量の百分率化で表した。
【００５８】
【表１】

【００５９】
実施例４マウス涙液分泌量に対するオドラント物質と塩酸ピロカルピンの併用効果
実施例１で使用したオドラント物質（Ｒ）−（−）−カルボンと塩酸ピロカルピンとを併用した場合の効果を調べた。方法は以下のとおりである。
【００６０】
〔涙液分泌量測定〕
涙液は、マイクログラスキャピラリ（吸引容量０．５μＬ／３２ｍｍ）を用いて１５分間隔でマウス左目から採取した。吸引した涙液量は長さ（ｍｍ）をノギスで測定した上でμＬに換算し、分泌量の指標とした。マウスはネンブタール麻酔溶液を腹腔内投与（体重１０ｇあたり０．２ｍＬ、投与量は６０ｍｇ／ｋｇ）して麻酔した。マウスの痛覚反射が消失したことを確認後、涙液分泌量測定を開始した。測定は、開始後終了まで全て１５分間隔で行った。まず、１５分間隔で２回の涙液分泌測定終了後、直ちにマウス体重１０ｇに対して０．１ｍＬの割合で被検物質を尾静脈内投与した。引き続き、１５分間隔で測定を継続しつつ、被検物質投与から１５分後に涙液分泌量を測定し、その後直ちに、０．００５％塩酸ピロカルピンを体重１０ｇあたり０．１ｍＬ（投与量は５ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与した。更に引き続き涙液を１５分間隔で４回採取した。
【００６１】
その結果、静脈投与後十数分〜数十分の短時間で顕著に涙液分泌が増加することが認められた。また、その効果は長く持続した。（Ｒ）−（−）−カルボン（投与量３０ｍｇ／ｋｇ）の結果を図３のグラフで示した。なお、涙液分泌量の変化は、被検物質投与前の２回の測定分泌量の平均に対する各測定時点での分泌量の百分率変化で表した。時間経過は、カルボン投与後の経過を表す。
【００６２】
実施例３から、カルボンを投与した後、１５〜３０分の短時間で６０％以上の涙液分泌量増加を見ることができる。また、その効果は時間の経過とともに徐徐に減少する。しかしながら、ピロカルピンと併用するとその効果が一層持続することが実施例４から判る。
【００６３】
製剤例
以下に、点眼剤の一般的な製剤処方例を示すが、これらは本発明をよりよく理解するに資するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
点眼剤１（１００ｍＬ中）
カルボン１００ｍｇ
１％硬化ヒマシ油１ｍＬ
生理食塩水適量
点眼剤２（１００ｍＬ中）
デナトニウムベンゾエート１００ｍｇ
１％硬化ヒマシ油１ｍＬ
生理食塩水適量
【００６４】
点眼剤３（１００ｍＬ中）
カルボン１０ｍｇ
濃グリセリン２５００ｍｇ
ポリソルベート８０２０００ｍｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物２００ｍｇ
１Ｎ水酸化ナトリウム適量
１Ｎ塩酸適量
滅菌精製水適量
【００６５】
カルボンと添加物の量を適宜変更することにより、カルボンの濃度が０．００１％、０．００５％、０．０５％、０．１％、３．０％（ｗ／ｖ）である点眼剤も同様に調製することができる。
【００６６】
点眼剤４（１００ｍＬ中）
２−イソブチル−３−メトキシ−ピラジン１０ｍｇ
濃グリセリン２５００ｍｇ
ポリソルベート８０２０００ｍｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物２００ｍｇ
１Ｎ水酸化ナトリウム適量
１Ｎ塩酸適量
滅菌精製水適量
【００６７】
点眼剤５（１００ｍＬ中）
シトロネリルアセテート１０ｍｇ
濃グリセリン２５００ｍｇ
ポリソルベート８０２０００ｍｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物２００ｍｇ
１Ｎ水酸化ナトリウム適量
１Ｎ塩酸適量
滅菌精製水適量
【００６８】
【発明の効果】
本発明の新規水チャンネルオープナー組成物は、上述の構成よりなるので、ＡＱＰ５の水チャンネル開口作用を有する。本発明の医薬組成物は、ＡＱＰ５の涙腺における水チャンネル作用を促進、維持することが可能であり、このものを使用して、眼科用医薬組成物、特に即効性及び持続性を同時に併せ有する涙液分泌促進組成物、角結膜上皮障害治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で行ったカルボンを用いた水透過性実験の結果を表すグラフである。
【図２】実施例２で行ったオドラント物質を用いた水透過性実験の結果を表すグラフである。
【図３】実施例４で行ったマウス涙液分泌量に対する塩酸ピロカルピンの併用効果を表すグラフである。

Claims

リポカリンのリガンドを有効成分として含有する涙液分泌促進組成物であって、
前記リポカリンのリガンドが、メントール、ボルネオール、グリコリピッド、ポルフィリン、デナトニウムベンゾエート、２−イソブチル−３−メトキシピラジン、２−アミノ−４−ブチル−５−プロピルセレノアゾール、シトロネリルアセテート、カルボン、２−イソペンチルピラジン、４−ブチル−５−プロピルチアゾール、チモール、３，７−ジメチルオクタノール、２−ノネナール、リナロール、ベンジルベンゾエート、３員環ムスク様化合物、２−メチル−３−メトキシピラジン、ベンズアルデヒド、キノリン、２−フェニルエタノール、シネオール、イソブチルイソバレレート、イソバレリック酸、β−イオノン、２−トランス−６−シス−ノナジエナール、ゲオスミン、トリクロロアニソール、５α−アンドロスト−１６−エン−３−オン、ペンタデカラクトン、ジメチルスルフィド、４−ヒドロキシオクタノイック酸ラクトン、エチルアセテート、（＋）−プレゴン、及び、ｔｒａｎｓ−４−メチルシクロヘキサノール、からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする涙液分泌促進組成物。
副交感神経作動薬を更に含有する請求項１記載の涙液分泌促進組成物。