CN105378159A - 调节血清低密度脂蛋白（LDL）水平的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9 型（PCSK9）变构结合配体 - Google Patents

调节血清低密度脂蛋白（LDL）水平的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9 型（PCSK9）变构结合配体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及高胆固醇血症的领域。具体地，本发明提供组合物和方法以通过使用范围在350-2,000Da之间的3-8个氨基酸的合成配体和/或合成配体衍生物序列来改变蛋白PCSK9的构象，以调节低密度脂蛋白的循环水平。PCSK9的构象的改变影响PCSK9和内源低密度脂蛋白受体之间的相互作用，并可导致减少或增加水平的循环LDL-胆固醇。高LDL-胆固醇水平与增加的心脏疾病风险相关。低LDL-胆固醇水平可在其它病状例如肝功能障碍中是有问题的；因此，对于可升高LDL水平的配体也存在效用。

Description

调节血清低密度脂蛋白（LDL）水平的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9 型（PCSK9）变构结合配体
发明领域
本发明涉及高胆固醇血症的领域。具体地，本发明提供组合物和方法以通过使用合成配体和/或合成配体衍生物改变蛋白PCSK9的构象来调节低密度脂蛋白的循环水平，所述合成配体和/或合成配体衍生物具有在350-2,000Da之间的3-8个氨基酸的序列。PCSK9的构象的改变影响PCSK9和内源低密度脂蛋白受体之间的相互作用，并可导致减少或增加水平的循环LDL-胆固醇。高LDL-胆固醇水平与增加的心脏疾病风险相关。低LDL-胆固醇水平可在其它病状例如肝功能障碍中是有问题的；因此，对于可升高LDL水平的配体也存在效用。
背景
低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的血浆水平升高代表冠状动脉心脏疾病发生的最大风险因素。LDL-C从血浆的清除主要由肝脏通过LDL受体(LDLR)的作用发生，所述LDL受体是以高亲和力结合至LDL颗粒上的载脂蛋白B100(apoB100)并介导其胞吞吸收的细胞表面糖蛋白。Goldstein等人,Annu.Rev.CellBiol.1:1-39(1985)。常染色体显性高胆固醇血症(ADH)与发现于编码LDLR(家族性高胆固醇血症(FH))或apoB100(家族性缺陷型apoB100)的基因中的突变有关，所述突变降低血浆LDL清除率。分别地Hobbs等人,Annu.Rev.Genet.24,133-170(1990)；和Innerarity等人,J.LipidRes.31:1337-1349(1990)。
低密度脂蛋白(LDL)受体(LDLR)介导VLDL、VLDL残粒和LDL的有效胞吞作用。作为胞吞过程的一部分，LDLR释放脂蛋白到肝内体中。
调节LDL-胆固醇水平的一种方法会是鉴定结合至PCSK9的肽并根据需要改变PCSK9和LDLR之间的相互作用动力学以使得通过LDLR胞吞作用的脂蛋白清除速率增加或减少。
发明概述
本发明涉及高胆固醇血症的领域。具体地，本发明提供组合物和方法以通过使用合成配体和/或合成配体衍生物改变蛋白PCSK9的构象来调节低密度脂蛋白的循环水平，所述合成配体和/或合成配体衍生物具有在350-2,000Da之间的3-8个氨基酸的序列。PCSK9的构象的改变影响PCSK9和内源低密度脂蛋白受体之间的相互作用，并可导致减少或增加水平的循环LDL-胆固醇。高LDL-胆固醇水平与增加的心脏疾病风险相关。低LDL-胆固醇水平可在其它病状例如肝功能障碍中是有问题的；因此，对于可升高LDL水平的配体也存在效用。
在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其包括：a)提供；i)PCSK9蛋白，其中所述蛋白包含诱导变构调节的结合位点和低密度脂蛋白受体结合位点；ii)能够结合所述结合位点的合成配体；iii)包含低密度脂蛋白受体和低密度脂蛋白的多个肝细胞；b)使所述合成配体结合至所述结合位点，其中所述合成配体诱导所述蛋白的构象转变；和c)通过所述构象转变调节所述低密度脂蛋白受体结合位点对于所述低密度脂蛋白受体的亲和力。在一个实施方案中，结合位点包括PCSK9蛋白的His417,Lys421,Pro446,Trp453,Gln454,Glu628,Gly629,Asn652和Thr653。在一个实施方案中，合成配体是变构抑制剂配体，其中所述调节减小所述低密度脂蛋白受体结合位点对于所述低密度脂蛋白受体的亲和力，使得所述多个肝细胞对所述低密度脂蛋白的内化增加。在一个实施方案中，合成配体是变构增强剂配体，所述调节增加所述低密度脂蛋白受体结合位点对于所述低密度脂蛋白受体的亲和力，使得所述多个肝细胞对所述低密度脂蛋白的内化减少。在一个实施方案中，所述蛋白的构象转变选自诱导契合转变和生物力学转变。在一个实施方案中，合成配体是选自VYVRFW、VLELYW和ISDLSY的合成肽。在一个实施方案中，变构抑制剂是选自SRX55，SRX56，SRX60，SRX61，SRX62，SRX63，SRX64，SRX65和SRX66的肽。在一个实施方案中，变构增强剂是选自SRX64，SRX67，SRX68，SRX69，SRX72和SRX73的肽。在一个实施方案中，合成肽包含约3-8个之间的氨基酸。在一个实施方案中，合成肽是六个氨基酸。在一个实施方案中，合成肽小于1300Da。在一个实施方案中，合成肽在约466-1067Da之间。在一个实施方案中，合成肽在约175-1,000Da之间。
在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其包括：a)提供；i)PCSK9蛋白，其中所述蛋白包含诱导变构调节的结合位点和低密度脂蛋白受体结合位点；ii)能够结合所述结合位点的合成配体；iii)包含低密度脂蛋白受体群的多个肝细胞；b)使所述合成配体结合至所述结合位点，其中所述合成配体诱导所述蛋白的构象转变；c)通过所述构象转变调节所述低密度脂蛋白受体的所述群。在一个实施方案中，结合位点包括PCSK9蛋白的His417,Lys421,Pro446,Trp453,Gln454,Glu628,Gly629,Asn652和Thr653。在一个实施方案中，合成配体是变构抑制剂配体，其中所述调节增加在所述多个肝细胞的细胞表面上可测量的所述低密度脂蛋白受体的所述群。在一个实施方案中，合成配体是变构增强剂配体，其中所述调节减少在所述多个肝细胞的细胞表面上可测量的所述低密度脂蛋白受体的所述群。在一个实施方案中，所述蛋白的所述构象转变选自诱导契合转变和生物力学转变。在一个实施方案中，配体是选自VYVRFW、VLELYW和ISDLSY的合成肽。在一个实施方案中，变构抑制剂肽选自SRX55，SRX56，SRX60，SRX61，SRX62，SRX63，SRX64，SRX65和SRX66。在一个实施方案中，变构增强剂肽选自SRX64，SRX67，SRX68，SRX69，SRX72和SRX73。在一个实施方案中，合成肽包含约3-8个之间的氨基酸。在一个实施方案中，合成肽是六个氨基酸。在一个实施方案中，合成肽小于1,300Da。在一个实施方案中，合成肽在约466-1067Da之间。在一个实施方案中，合成肽在约50-1,000Da之间。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：
其中：i)n是氨基酸残基的数量，其是在范围3-8中的整数；ii)组成氨基酸是独立选择的天然或非天然氨基酸的单一对映体；iii)R2和R3独立地选自氢、低级烷基、支链烷基、羟烷基、环烷基、杂环、芳基、杂芳基、酰基、取代或未取代的苯甲酰基、烷基或芳基磺酰基(例如甲磺酰基或甲苯磺酰基)和氨基甲酰基(例如BOC)；iv)R1选自-OH和-NR4-R5；v)R4和R5独立地选自氢、低级烷基、芳基、环烷基、芳族杂环、吡啶、四唑、烷氧基、环烷氧基；可选择地，R4和R5被连接作为杂环例如哌啶；吡咯烷；吗啉；哌嗪；经取代的杂环例如4-甲基哌嗪；或稠杂环例如二氢喹啉或二氢吲哚以及S1、S2和S3是侧链。在一个实施方案中，该化合物还包含带负电的极性基团。在一个实施方案中，带负电的极性基团选自掺入所述侧链S1、S2或Sn中的O-磷酸盐、O-硫酸盐、5-O-和5-N-四唑的至少一种。在一个实施方案中，选自S1、S2和Sn的侧链包含磷酸丝氨酸。在一个实施方案中，侧链S1包括-CH2-NH-四唑。在一个实施方案中，化合物选自Val-Tyr-Val-Arg-Phe-Trp,β-Ala-Phe(3-CH2NH2)-Val-D-Ser(p)-Phe-Trp,Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Hph-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp(3-Me)-Ser-Ser-Ser(p),Val-Leu-Glu-Leu-Tyr-Trp,Leu-Asp-Leu-Phe-Phe-Ser,Ile-Leu-Asp-Leu-Ser-Tyr,Ac-Trp-Ser-Ser(p),Ac-Trp-Ala-Ser(p),Ac-Trp(5-F)-Ala-Ser(p)-吗啉,Thr-Leu-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Tyr-Trp-Gly,Phe(4-Ph)-Ala-Ser(p)-吗啉。在一个实施方案中，所述化合物包含约3-8个之间的氨基酸。在一个实施方案中，所述化合物是六个氨基酸。在一个实施方案中，所述化合物小于1,300Da。在一个实施方案中，所述化合物在约466-1067Da之间。在一个实施方案中，所述化合物在约175-1,000Da之间。在一个实施方案中，所述化合物包含合成肽。在一个实施方案中，所述化合物被配制为药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物还包含制药药物。在一个实施方案中，制药药物选自他汀类药物(statins)、心血管药、代谢药和抗高血压药。在一个实施方案中，制药药物选自依折麦布、苯磺酸氨氯地平、西他列汀、二甲双胍、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。在一个实施方案中，药物组合物被配制为选自下列的形式：片剂，液体，凝胶，胶囊，囊剂，微粒，脂质体，纳米颗粒，盐，透皮贴剂，软膏，洗剂，乳膏，凝胶，滴剂，条剂，栓剂，喷雾剂和粉剂。
在一个实施方案中，本发明涉及包含范围在约350-1,500Da之间的PCSK9变构配体的组合物。在一个实施方案中，PCSK9变构配体小于1,300Da。在一个实施方案中，PCSK9变构配体包含约3-6个之间的氨基酸。在一个实施方案中，PCSK9变构配体在约550-1,000Da之间。在一个实施方案中，所述组合物是药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物是制药组合物。在一个实施方案中，所述施用还包括选自包括但不限于脂质体、微粒和纳米颗粒的组的递送系统。在一个实施方案中，药物组合物包含有效剂量的所述配体。在一个实施方案中，药物组合物包含盐。在一个实施方案中，药物组合物被配制用于口服施用。
在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其包括：a)施用PCSK9变构抑制剂肽至受试者，其中所述受试者具有心血管疾病的至少一种症状；和b)通过所述PCSK9变构抑制剂肽施用减少心血管疾病的所述至少一种症状。在一个实施方案中，所述至少一种症状的减少介于10％-85％之间。在一个实施方案中，所述至少一种症状的减少介于20％-65％之间。在一个实施方案中，所述至少一种症状的减少介于30％-55％之间。在一个实施方案中，所述心血管疾病包括冠心病。在一个实施方案中，所述心血管疾病包括高血压。在一个实施方案中，所述心血管疾病包括高胆固醇血症。在一个实施方案中，所述心血管疾病包括动脉粥样硬化。在一个实施方案中，所述至少一种症状包括减少的循环高密度脂蛋白。在一个实施方案中，所述至少一种症状包括增多的循环胆固醇。在一个实施方案中，所述至少一种症状包括增多的循环低密度脂蛋白。在一个实施方案中，所述至少一种症状包括高血压。在一个实施方案中，所述施用包括有效剂量的所述PCSK9变构抑制剂肽。在一个实施方案中，所述施用还包括选自包括但不限于脂质体、微粒和纳米颗粒的组的递送系统。在一个实施方案中，所述有效剂量包含药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含盐。在一个实施方案中，药物组合物被配制用于口服施用。在一个实施方案中，变构抑制剂肽包含约3-8个之间的氨基酸。在一个实施方案中，变构抑制剂肽是六个氨基酸。在一个实施方案中，变构抑制剂肽小于1,300Da。在一个实施方案中，变构抑制剂肽在约466-1067Da之间。在一个实施方案中，变构抑制剂肽在约175-1,000Da之间。
在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其包括：a)施用PCSK9变构增强剂肽至受试者，其中所述受试者具有心血管疾病的至少一种症状；和b)通过所述PCSK9变构抑制剂肽施用减少心血管疾病的所述至少一种症状。在一个实施方案中，所述心血管疾病包括高胆固醇血症。在一个实施方案中，所述至少一种症状包括减少的循环胆固醇。在一个实施方案中，所述至少一种症状包括增多的高密度脂蛋白。在一个实施方案中，所述至少一种症状包括减少的低密度脂蛋白。在一个实施方案中，所述至少一种症状包括低血压。在一个实施方案中，所述至少一种症状的减少介于10％-85％之间。在一个实施方案中，所述至少一种症状的减少介于20％-65％之间。在一个实施方案中，所述至少一种症状的减少介于30％-55％之间。在一个实施方案中，所述施用包括有效剂量的所述PCSK9变构抑制剂肽。在一个实施方案中，所述施用还包括选自包括但不限于脂质体、微粒和纳米颗粒的组的递送系统。在一个实施方案中，所述有效剂量包含药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含盐。在一个实施方案中，药物组合物被配制用于口服施用。在一个实施方案中，变构增强剂肽包含约3-8个之间的氨基酸。在一个实施方案中，变构增强剂肽是六个氨基酸。在一个实施方案中，变构增强剂肽小于1,300Da。在一个实施方案中，变构增强剂肽在约466-1067Da之间。在一个实施方案中，变构增强剂肽在约175-1,000Da之间。
在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其包括：a)施用PCSK9变构合成肽至受试者，其中所述受试者具有肝脏疾病的至少一种症状；和b)通过所述PCSK9变构肽施用减少肝脏疾病的所述至少一种症状。在一个实施方案中，所述至少一种症状包括升高的低密度脂蛋白受体密度。在一个实施方案中，所述至少一种症状包括降低的低密度脂蛋白受体密度。在一个实施方案中，所述至少一种症状的减少介于10％-85％之间。在一个实施方案中，所述至少一种症状的减少介于20％-65％之间。在一个实施方案中，所述至少一种症状的减少介于30％-55％之间。在一个实施方案中，所述PCSK9变构合成肽包括PCSK9变构增强剂肽。在一个实施方案中，所述PCSK9变构合成肽包括PCSK9变构抑制剂肽。在一个实施方案中，所述施用包括有效剂量的所述PCSK9变构肽。在一个实施方案中，所述施用还包括选自包括但不限于脂质体、微粒和纳米颗粒的组的递送系统。在一个实施方案中，所述有效剂量包含药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含盐。在一个实施方案中，药物组合物被配制用于口服施用。在一个实施方案中，变构合成肽包含约3-8个之间的氨基酸。在一个实施方案中，变构合成肽是六个氨基酸。在一个实施方案中，变构合成肽小于1,300Da。在一个实施方案中，变构合成肽在约466-1067Da之间。在一个实施方案中，变构合成肽在约175-1,000Da之间。
在一个实施方案中，在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其包括：a)提供；i)PCSK9蛋白，其中所述蛋白包含变构调节位点和正构低密度脂蛋白受体(LDLR)结合位点；和ii)能够结合所述变构调节位点的变构合成肽；b)使所述变构合成肽结合至所述变构调节位点，其中所述变构合成肽诱导所述正构LDLR结合位点的构象转变。在一个实施方案中，所述变构合成肽对所述变构调节位点的所述结合，抑制所述正构LDLR结合位点的诱导契合构象转变。在一个实施方案中，所述结合诱导所述PCSK9蛋白的构象转变。在一个实施方案中，所产生的PCSK9构象转变减小所述正构LDLR结合位点相互作用对LDLR的结合亲和力，其中低密度脂蛋白清除率增加。在一个实施方案中，构象转变增强所述正构低密度脂蛋白受体结合位点从低密度脂蛋白受体的解离。在一个实施方案中，构象转变减少对于结合配体的正构Cis-His富集结构域(CHRD)结合位点(例如，以促进在低pH下的囊泡运输；DeVay等人,"Characterizationofproproteinconvertasesubtilisin/kexintype9(PCSK9)traffickingrevealsanovellysosomaltargetingmechanismviaamyloidprecursor-likeprotein2(APLP2)"JBiolChem.288(15):10805-10818(2013)。在一个实施方案中，正构低密度脂蛋白受体结合位点的构象转变包括诱导契合抑制。在一个实施方案中，所述变构合成肽的结合减少PCSK9的正构LDLR结合位点的诱导契合所需的构象转变，从而抑制所述正构LDLR相互作用的结合亲和力，其中低密度脂蛋白清除率增加。在一个实施方案中，所述正构低密度脂蛋白受体结合位点构象转变的诱导是生物力学的。在一个实施方案中，构象转变导致PCSK9催化结构域和PCSK9C-末端结构域之间的连接环的生物力学硬化。在一个实施方案中，生物力学构象转变包括氨基酸丙氨酸443侧链和/或主链的易位和/或旋转运动。在一个实施方案中，生物力学构象转变包括氨基酸缬氨酸441侧链和/或主链的易位和/或旋转运动。在一个实施方案中，生物力学构象转变包括氨基酸天冬氨酸422侧链和/或主链的易位和/或旋转运动。在一个实施方案中，生物力学构象转变包括氨基酸苏氨酸162侧链和/或主链的易位和/或旋转运动。在一个实施方案中，生物力学构象转变包括氨基酸脯氨酸445侧链和/或主链的易位和/或旋转运动。在一个实施方案中，生物力学构象转变包括氨基酸脯氨酸446侧链和/或主链的易位和/或旋转运动。在一个实施方案中，生物力学构象转变包括组氨酸449的重新定向和易位。在一个实施方案中，生物力学机制包括氨基酸丙氨酸443侧链和/或主链的易位和/或旋转运动的抑制。在一个实施方案中，生物力学机制包括氨基酸缬氨酸441侧链和/或主链的易位和/或旋转运动的抑制。在一个实施方案中，生物力学机制包括氨基酸天冬氨酸422侧链和/或主链的易位和/或旋转运动的抑制。在一个实施方案中，生物力学机制包括氨基酸苏氨酸162侧链和/或主链的易位和/或旋转运动的抑制。在一个实施方案中，生物力学机制包括氨基酸脯氨酸445侧链和/或主链的易位和/或旋转运动的抑制。在一个实施方案中，生物力学机制包括氨基酸脯氨酸446侧链和/或主链的易位和/或旋转运动的抑制。在一个实施方案中，生物力学移位包括组氨酸449侧链和/或主链的易位和/或旋转运动的抑制。在一个实施方案中，变构合成肽是VYVRFW。在一个实施方案中，变构合成肽是VLELYW。在一个实施方案中，变构合成肽是ISDLSY。在一个实施方案中，变构合成肽包含约3-8个之间的氨基酸。在一个实施方案中，变构合成肽是六个氨基酸。在一个实施方案中，变构合成肽小于1,300Da。在一个实施方案中，变构合成肽在约466-1067Da之间。在一个实施方案中，变构合成肽在约175-1,000Da之间。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：
其中：i)n是氨基酸残基的数量，其是在范围3-8中的整数；ii)组成氨基酸是独立选择的天然或非天然氨基酸的单一对映体；iii)R2和R3独立地选自氢、低级烷基、支链烷基、羟烷基、环烷基、杂环、芳基、杂芳基、酰基、取代或未取代的苯甲酰基、烷基或芳基磺酰基(例如甲磺酰基或甲苯磺酰基)和氨基甲酰基(例如BOC)；iv)R1选自-OH和-NR4-R5；v)R4和R5独立地选自氢、低级烷基、芳基、环烷基、芳族杂环、吡啶、四唑；可选择地，R4和R5被连接作为杂环例如哌啶；吡咯烷；吗啉；哌嗪；经取代的杂环例如4-甲基哌嗪；或稠杂环例如二氢喹啉或二氢吲哚。在一个实施方案中，该化合物还包含带负电的极性基团。在一个实施方案中，带负电的极性基团包括但不限于掺入侧链S1、S2或S3中的O-磷酸盐、O-硫酸盐、或5-O-或5-N-四唑。在一个实施方案中，侧链S1、S2或S3包含磷酸丝氨酸。在一个实施方案中，侧链S1包括-CH2-NH-四唑。在一个实施方案中，C-末端包含甘氨酸。在一个实施方案中，所述化合物包含约3-8个之间的氨基酸。在一个实施方案中，所述化合物是六个氨基酸。在一个实施方案中，所述化合物小于1,300Da。在一个实施方案中，所述化合物在约466-1067Da之间。在一个实施方案中，所述化合物在约175-1,000Da之间。在一个实施方案中，所述化合物包含合成肽。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Val-Tyr-Val-Arg-Phe-Trp。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：β-Ala-Phe(3-CH2NH2)-Val-D-Ser(p)-Phe-Trp。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Ser-Ser-Ser(p)。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Thr-Leu-Hph-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp(3-Me)-Ser-Ser-Ser(p)。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Val-Leu-Glu-Leu-Tyr-Trp。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Leu-Asp-Leu-Phe-Phe-Ser。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Ile-Leu-Asp-Leu-Ser-Tyr。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Ac-Trp-Ser-Ser(p)。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Ac-Trp-Ala-Ser(p)。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Ac-Trp(5-F)-Ala-Ser(p)-吗啉。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Thr-Leu-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Ac-Tyr-Trp-Gly。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Phe(4-Ph)-Ala-Ser(p)-吗啉。
在一个实施方案中，本发明涉及的化合物包括但不限于，Val-Tyr-Val-Arg-Phe-Trp-NH2,Ala-Phe(3-CH2H2)-Val-D-Ser(p)-Phe-Trp-NH2,Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2,Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2,Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2,Thr-Leu-Hph-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2,Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp(3-Me)-Ser-Ser-Ser(p)-NH2,Val-Leu-Glu-Leu-Tyr-Trp-NH2,Leu-Asp-Leu-Phe-Phe-Ser-NH2,Ile-Leu-Asp-Leu-Ser-Tyr-NH2,Ac-Trp-Ser-Ser(p)-NH2,Ac-Trp-Ala-Ser(p)-H2,Ac-Trp(5-F)-Ala-Ser(p)-NH2和Thr-Leu-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2。
在一个实施方案中，本发明涉及的化合物包括但不限于，Ac-Trp-Ser-Ser(p)-NHCH3,Ac-Trp-Ala-Ser(p)-NHCH3,Ac-Trp-Ala-Ser(p)-吗啉,Ac-Trp-Ala-Ser(p)-4-甲基哌嗪,Ac-Trp-Ala-Ser(p)-吡啶；Ac-Τrp-Ala-Ser(p)-吡咯烷。
在一个实施方案中，本发明涉及的化合物包括但不限于，Ac-Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Thr-Leu-Hph-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp(3-Me)-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Val-Leu-Glu-Leu-Tyr-Trp,Ac-Leu-Asp-Leu-Phe-Phe-Ser,Ac-Ile-Leu-Asp-Leu-Ser-Tyr和Ac-Thr-Leu-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)。
在一个实施方案中，本发明涉及的化合物包括但不限于，Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p),Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p),Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p),Thr-Leu-Hph-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p),Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp(3-Me)-Ser-Ala-Ser(p)和Thr-Leu-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p)。
在一个实施方案中，本发明涉及的化合物包括但不限于，Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p)-NH2,Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p)-NH2,Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p)-NH2,Thr-Leu-Hph-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p)-NH2,Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp(3-Me)-Ser-Ala-Ser(p)-NH2和Thr-Leu-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p)-NH2。
在一个实施方案中，本发明涉及的化合物包括但不限于，Ac-Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p),Ac-Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p),Ac-Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p),Ac-Thr-Leu-Hph-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p),Ac-Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp(3-Me)-Ser-Ala-Ser(p)和Ac-Thr-Leu-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p)。
在一个实施方案中，本发明涉及的化合物包括但不限于，Ac-Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p)-NH2,Ac-Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p)-NH2,Ac-Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p)-NH2,Ac-Thr-Leu-Hph-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p)-NH2,Ac-Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp(3-Me)-Ser-Ala-Ser(p)-NH2,Ac-Thr-Leu-Thr-Trp-Ser-Ala-Ser(p)-NH2。
在一个实施方案中，本发明涉及的化合物包括但不限于，Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Hph-Thr-Trp-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp(3-Me)-Ser-Ser(p)和Thr-Leu-Thr-Trp-Ser-Ser(p)。
在一个实施方案中，本发明涉及的化合物包括但不限于，Ac-Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser(p)-NH2,Ac-Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser(p)-NH2,Ac-Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ser-Ser(p)-NH2,Ac-Thr-Leu-Hph-Thr-Trp-Ser-Ser(p)-NH2,Ac-Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp(3-Me)-Ser-Ser(p)-NH2和Ac-Thr-Leu-Thr-Trp-Ser-Ser(p)-NH2。
在一个实施方案中，本发明涉及的化合物包括但不限于，Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp-Ala-Ser(p),Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ala-Ser(p),Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ala-Ser(p),Thr-Leu-Hph-Thr-Trp-Ala-Ser(p),Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp(3-Me)-Ala-Ser(p)和Thr-Leu-Thr-Trp-Ala-Ser(p)。
在一个实施方案中，本发明涉及的化合物包括但不限于，Ac-Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp-Ala-Ser(p)-NH2,Ac-Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ala-Ser(p)-NH2,Ac-Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ala-Ser(p)-NH2,Ac-Thr-Leu-Hph-Thr-Trp-Ala-Ser(p)-NH2,Ac-Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp(3-Me)-Ala-Ser(p)-NH2和Ac-Thr-Leu-Thr-Trp-Ala-Ser(p)-NH2。
在一个实施方案中，本发明涉及的化合物包括但不限于，Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Ala-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Ala-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Ala-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Hph-Ala-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Ala-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Ala-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Ala-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Thr-Leu-Hph-Ala-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Ala-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2,Ac-Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Ala-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2,Ac-Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Ala-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2和Ac-Thr-Leu-Hph-Ala-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2。
在一个实施方案中，本发明涉及的化合物包括但不限于，Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Ser-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Ser-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Ser-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Hph-Ser-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Ser-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Ser-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Ser-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Thr-Leu-Hph-Ser-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Ser-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2,Ac-Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Ser-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2,Ac-Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Ser-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2和Ac-Thr-Leu-Hph-Ser-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2。
在一个实施方案中，本发明涉及的化合物包括但不限于，Ac-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Hph-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2,Ac-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2,Ac-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2和Ac-Hph-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2。
在一个实施方案中，本发明涉及的化合物包括但不限于，BOC-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),BOC-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),BOC-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),BOC-Hph-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),ΒΟC-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-ΝΗ2,BOC-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2,BOC-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2和BOC-Hph-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2。
在一个实施方案中，本发明涉及的化合物包括但不限于，Thr-Leu-Cys(CH3)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Cys(CH(CH3)2)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Cys(CH2-3,4-二氟苯基)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Cys(CH2-3-羟苯基)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Cys(CH2-3-甲苯基)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)和Ac-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)-NH2。
在一个实施方案中，本发明涉及具有式Phe(4-Ph)-Gly(Et)-Ser(p)-吗啉的化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及选自Ac-Tyr-Trp(6-OMe)-Gly,Ac-Tyr(3-F)-Trp-Gly,新戊酰-Tyr-Trp-Gly,甲黄酰-Tyr-Trp-Gly,BOC-Tyr-Trp-Gly,
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Ac-D-Trp-D-Phe(3CF3)-D-Arg-NH2。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Ac-D-Trp-D-Phe(3Cl)-D-Arg-NH2。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Ac-D-Trp-D-Phe-D-Arg-NH2。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Ac-D-Trp-D-Phe-D-Arg。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：NAc-NMe-D-Arg-D-Phe(3OH)-D-Trp-NH2。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Ac-Arg-Phe(3CF3)-Gly。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Ac-Ala-Val-Arg-N(Me)(Ph3CF3)。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Ac-D-Arg-D-Phe(3OH)-D-Trp。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Ac-D-Arg-D-Phe(3OH)-D-Trp-NH2。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：丙酰基-D-Arg-D-Phe(3OH)-D-Trp。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Ac-Val-Arg-Phe-Trp。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Ac-Tyr-Val-Arg-Phe-Trp。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Val-Tyr-Asp-Arg-Phe-Trp。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Val-Tyr-Glu-Arg-Phe-Trp。
在一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物：Val-Tyr-Val-Cit-Phe-W(Cit＝瓜氨酸)。
在一个实施方案中，本发明涉及包含下式的化合物的药物组合物和载体：
其中：i)n是氨基酸残基的数量，其是在范围3-8中的整数；ii)组成氨基酸是独立选择的天然或非天然氨基酸的单一对映体；iii)R2和R3独立地选自氢、低级烷基、支链烷基、羟烷基、环烷基、杂环、芳基、杂芳基、酰基、取代或未取代的苯甲酰基、烷基或芳基磺酰基(例如甲磺酰基或甲苯磺酰基)和氨基甲酰基(例如BOC)；iv)R1选自-OH和-NR4-R5；v)R4和R5独立地选自氢、低级烷基、芳基、环烷基、芳族杂环、吡啶、四唑；可选择地，R4和R5被连接作为杂环例如哌啶；吡咯烷；吗啉；哌嗪；经取代的杂环例如4-甲基哌嗪；或稠杂环例如二氢喹啉或二氢吲哚。在一个实施方案中，药物组合物还包含带负电的极性基团。在一个实施方案中，所述带负电的极性基团选自掺入侧链S1、S2或S3中的O-磷酸盐、O-硫酸盐、5-O-和5-N-四唑的至少一种。在一个实施方案中，侧链S1、S2或S3包含磷酸丝氨酸。在一个实施方案中，侧链S1包括-CH2-NH-四唑。在一个实施方案中，C-末端包含甘氨酸。在一个实施方案中，药物组合物还包含他汀类药物。在一个实施方案中，他汀类药物包括但不限于阿托伐他汀、罗苏伐他汀和/或辛伐他汀。在一个实施方案中，药物组合物包含抗糖尿病药物。在一个实施方案中，药物组合物包含心血管药物。在一个实施方案中，药物组合物包含依折麦布在一个实施方案中，药物组合物包含抗高血压药，其包括但不限于苯磺酸氨氯地平在一个实施方案中，抗糖尿病药物包括但不限于西他列汀和/或二甲双胍。在一个实施方案中，所述化合物包含约3-8个之间的氨基酸。在一个实施方案中，所述化合物是六个氨基酸。在一个实施方案中，所述化合物小于1,300Da。在一个实施方案中，所述化合物在约466-1067Da之间。在一个实施方案中，所述化合物在约175-1,000Da之间。在一个实施方案中，所述化合物包含合成肽。
定义
如本文所用的术语“化合物”或“配体”是指包含能够相互作用(即，例如附着、结合等)于结合配偶体从而改变该结合配偶体的生物学功能的天然氨基酸的任何外源分子。化合物/配体可包括但不限于，包含至少两个肽键的氨基酸链、抗体、蛋白、肽和/或三肽。这样的化合物/配体可通过取代基来衍生化，所述取代基包括但不限于羟基、硫、胺、酰胺、醚、酯、脂肪链、芳环、脂族环、经取代的芳环和/或经取代的脂族环。这样的化合物/配体可以是抑制剂化合物/配体，或增强剂化合物/配体。化合物/配体还可包括“药物”，从而指的是能够被施用的实现期望效应的任何药理活性物质。药物或化合物/配体可以是合成的或天然存在的。
如本文所用的术语“合成配体”，是指包含氨基酸的分子，所述分子是配体，并且被离体设计和随后使用体外、体内或体外和体内组合的手段来合成，以产生具有预先指定的特征(例如电荷、形状、分子量)的分子，并且其与另一天然存在的生物分子结合以形成复合物。优选地，这些合成配体比靶天然生物分子更小，更优选这些合成配体小于1,300Da，并且更优选是介于350和1,250Da之间。
如本文所用的术语“合成肽”是指约3-8个氨基酸并且范围在约350-1,500Da之间的非天然氨基酸序列。优选是约4-5个氨基酸并且范围在约550-1,000Da之间的非天然氨基酸序列。例如，合成肽是六个氨基酸并且小于1,300Da，例如，在约466-1067Da之间。优选地，合成肽按照实施例V制备。
如本文所用的术语“变构位点”是指不是天然化学活性/受体结合位点的配体结合位点，其在结合于外源性配体时，改变蛋白(作为酶)的形状和活性。例如，“变构增强剂肽”是指结合至变构位点从而可增加蛋白的天然活性和/或各自亲和力的配体(例如PCSK9变构增强剂肽)。可选择地，“变构抑制剂肽”是指结合至变构位点从而可降低蛋白的天然活性和/或各自亲和力的配体(例如PCSK9变构抑制剂肽)。例如，结合位点包括PCSK9蛋白的His417,Lys421,Pro446,Trp453,Gln454,Glu628,Gly629,Asn652和Thr653。
如本文所用的术语“正构位点”是指配体(例如肽)对于受体、结合和/或催化位点的原始的未经调节的结合位点。
如本文所用的术语“构象”是指氨基酸序列的三维立体化学构型。例如，任何特定的构象由氨基酸序列中个体氨基酸之间的空间相互作用、疏水相互作用、氢键合、电化学键合和/或盐桥相互作用之间的热力学平衡导致。
如本文所用的术语“构象转变”是指可将第一热力学平衡(构象1)改变成第二热力学平衡(构象2)或增强单独蛋白和/或蛋白-配体复合物和/或蛋白-蛋白复合物内的亚稳折叠状态的动态范围和/或类型和/或数量的外源力或分子(例如，抑制剂肽)的引入。此外，构象转变可主要在某些特定的外部条件(pH、温度等)下和/或在单独蛋白或多部分复合物的寿命内的特定期间(包括但不限于优先用于分子识别、初始结合相互作用、诱导契合相互作用，功能活性和/或解离的条件)表现出来。
如本文所用的术语“EGFA”是指低密度脂蛋白受体的最氨基EGF样结构域。例如，EGF样结构域可包括LDLR受体的胞外部分。
如本文所用的术语“LDL-R”和“LDLR”是指低密度脂蛋白受体的缩写。该缩写可以是关于整个LDL-R受体蛋白或其任何部分。LDL-R驻留在细胞表面上并且可结合低密度脂蛋白，使得LDL-R/LDL复合物内化在细胞(即，例如肝细胞)内，在其中LDL被释放并且LDL-R再循环回到细胞表面。
如本文所用的术语“结合界面”是指至少两种不同的分子的官能团(即，例如羟基、酰胺、胺、羧基、脒、胍、烃、磺酰基等)之间的吸引相互作用(即，例如氢键合、静电相互作用、疏水相互作用等)的任何集合。吸引力的集合形成稳定的分子平面从而在至少两个分子之间形成“结合界面”。
如本文所用的术语“诱导契合”是指需要受体构象改变的肽的任何接受。这样的构象可通过氨基酸侧链和柔性环的平移/旋转运动促进，从而重新排列静电和/或疏水结构域。
如本文所用的术语“复合物”或“组成物”是指通常由弱静电键而不是通过共价键连接的两个或更多个离子或分子的任何化学缔合。例如，复合物或组成物可在如本文所述的肽和PCSK9氨基酸序列之间形成，从而产生肽/PCSK9氨基酸序列复合物或组合物。任选地，这样的复合物或组成物还可包括但不限于LDLR氨基酸序列或其任何部分，包括但不限于EGFA区。
如本文所使用的术语“氢键”，一个极性分子中(如水的)的氢原子与同一或不同极性物质的通常另一分子中的小电负性原子(如氧、氮或氟的)之间的静电吸引。
如本文所用的术语“盐桥”是指相互作用例如氢键合和/或静电相互作用的任何交互或组合，其以使带电荷部分重叠的方式排列阳离子和阴离子化学结构。
如本文所用的术语“相互作用”是指一个分子和/或官能团可对另一分子和/或官能团具有的任何效应。这样的效应可包括但不限于，空间(即，例如物理的)、静电(即，例如电吸引或排斥)、电磁、亲水或疏水效应。
如本文所用的术语“重叠”是指分子以一个分子的电子结构在另一分子的顶部并延伸通过该分子的边缘的方式的任何定位，或被以这种方式定位。
如本文所用的术语“高胆固醇血症”是指其中血液胆固醇水平升高在临床推荐的水平之上的任何医学病状。例如，如果胆固醇用低密度脂蛋白(LDL)进行测量，高胆固醇血症可在所测量的LDL水平高于例如约70mg/dl时存在。或者，如果胆固醇用游离血浆胆固醇进行测量，高胆固醇血症可在所测量的游离胆固醇水平高于例如约200-220mg/dl时存在。
如本文所用的术语“处于…的风险”是指由患者表现出的可使患者易患特定疾病或痛苦的医学病状或一组医学病状。例如，这些病状可由包括但不限于行为、情绪、化学、生化或环境影响的影响导致。
如本文所用的术语“有效量”是指包含实现临床有益结果(即，例如症状的减少)的治疗剂的药物组合物的特定量。这样的组合物的毒性和治疗功效可通过在细胞培养物或实验动物中的标准制药程序(例如，用于测定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量))测定。毒性和治疗效应之间的剂量比是治疗指数，其可表示为比率LD50/ED50。表现出高治疗指数的化合物是优选的。从这些细胞培养测定和附加动物研究获得的数据可用于配制一系列剂量的供人类使用。这类化合物的剂量优选处于包括具有很少或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。所述剂量在此范围内取决于所用的剂型、患者的敏感性和施用途径而变化。
如本文所用的术语“症状”是指由患者观察到的疾病或身体障碍的任何主观或客观证据。例如，主观证据通常基于患者自我报告，并且可包括但不限于疼痛、头痛、视力障碍、恶心和/或呕吐。可选择地，客观证据通常是医疗测试的结果，包括但不限于体温、全血计数、脂质面板、甲状腺面板、血压、心率、心电图、组织和/或身体成像扫描。
如本文所用的术语“疾病”和/或“病症”是指活的动物或植物体或其部分之一的正常状态的任何损害，其打断或改变重要功能的执行。通常通过辨别体征和症状来显示，其通常是对下列的应答：i)环境因素(如营养不良、工业危害或气候)；ii)特定传染源(如虫、细菌或病毒)；iii)生物体的先天缺陷(如遗传异常)；和/或iv)这些因素的组合。
术语“减少”、“抑制”、“减小”、“抑制”、“降低”、“防止”及语法等同体(包括“更低”、“更小”等)在关于未治疗的受试者相对于经治疗的受试者中任何症状的表述时，意指经治疗的受试者中症状的数量和/或大小比在未治疗的受试者中在由任何医学专业人员认可为临床相关的任何量上更低。在一个实施方案中，经治疗受试者中症状的数量和/或大小至少10％低于、至少25％低于、至少50％低于、至少75％低于和/或至少90％低于未治疗受试者中症状的数量和/或大小。
术语“增加”、“增强”、“升高”及语法等同体(包括“更高”、“更大”等)在关于未治疗的受试者相对于经治疗的受试者中任何症状的表述时，意指经治疗的受试者中症状的数量和/或大小比在未治疗的受试者中在由任何医学专业人员认可为临床相关的任何量上更高。经治疗受试者中症状的数量和/或大小至少10％高于、至少25％高于、至少50％高于、至少75％高于和/或至少90％高于未治疗受试者中症状的数量和/或大小。
如本文所用的术语“附着”是指介质(或载体)和药物之间的任何相互作用。附着可以是可逆或不可逆的。这样的附着包括但不限于共价键合、离子键合、范德华力或摩擦等。如果药物被浸渍、掺入、涂覆、在悬浮液中、在乳剂中、在溶液中、混合于等，则药物是附着至介质(或载体)的。
如本文所用的术语“被施用”或“施用”是指提供组合物给患者以使得该组合物具有对患者的预期效应的任何方法。施用的示例性方法是通过直接的机制例如局部组织施用(即，例如血管外放置)、口服、透皮贴剂、局部、吸入、栓剂等。
如本文所用的术语“患者”或“受试者”是人或动物并且不需要是住院的。例如，门诊病人、休养所中的人是“患者”。患者可包含任何年龄的人或非人动物，并因此包括成人和青少年(即，儿童)。并非意欲的是，术语“患者”意味着需要医学治疗，因此，患者可自愿或不自愿成为试验的一部分，无论是临床还是支持基础科学研究。
如本文所用的术语“亲和力”是指两个或多个分子组装以形成多部分复合物和保持组装在该复合物中的热力学趋势的测量。例如，SRX55配体对PCSK9有高亲和力并且在热力学上有利于形成复合物。所理解的是，条件(例如，在受体内化过程中的pH)的变化，例如，LDL对LDLR的亲和力的降低和两个分子可彼此解离或分离。
如本文所用的术语“来源于”是指化合物或氨基酸序列的来源。在一个方面，化合物或氨基酸序列可来源于生物体或特定的物种。在另一个方面，化合物或氨基酸序列可来源于更大的复合物或序列。在另一个方面，化合物或序列可来源于在自然界中发现的氨基酸序列的部分或全部的化学修饰。
如本文所用的术语“蛋白”是指任何的众多天然存在的极其复杂的物质(如酶或抗体)，其由通过肽键连接的氨基酸残基组成，包含元素碳、氢、氮、氧、通常地硫。一般而言，蛋白包含具有数百范围内量级的氨基酸。
如本文所用的术语“肽”是指由一个酸的氨基与另一个的羧基的组合而来源于三个或更多个氨基酸并且通常由蛋白的部分水解获得的任何的各种酰胺。一般而言，肽包含具有数十或更小的范围内量级的氨基酸。
如本文所用的术语“药学上”或“药理学上可接受的”是指当施用于动物或人时不产生不利的、过敏的或其它的不良反应的分子实体和组合物。
如本文所用的术语“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂或分散介质，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇，、和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物以及二甲基亚砜、植物油、包衣、等渗剂和吸收延迟剂、脂质体、商购可得的清洁剂等。补充的生物活性成分也可被掺入至这些载体中。
如本文所用的术语“纯化的”或“分离的”可指已经历处理(即，例如分馏)以除去各种其它组分的肽组合物，并且该组合物基本上保留其表达的生物学活性。
当使用术语“基本上纯化的”时，该指称将指其中蛋白或肽形成组合物的主要成分的组合物，例如构成组合物的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多(即，例如重量/重量和/或重量/体积)。术语“纯化至均质”用于包括已被纯化至“表观均质性”以使得存在单一蛋白种类(即，例如基于SDS-PAGE或HPLC分析)的组合物。纯化的组合物不意欲指可残留一些微量杂质。
如本文所用，术语“基本上纯化的”是指从它们的天然环境中移出、隔离或分离，并且至少60％、优选75％、更优选90％不含与它们天然伴随的其它组分的分子例如氨基酸序列。因此“分离的多肽”是基本上纯化的多肽。
如本文所用的术语“生物相容的”是指任何材料不引起宿主中的实质有害应答。当异物被引入到活体中时，总会担心该物质会诱导免疫应答例如炎性反应，其将对宿主有负面效应。在本发明的上下文中，生物相容性根据针对其设计的应用进行评估：例如；绷带被认为是与皮肤生物相容的，而植入的医疗设备被认为是与身体的内部组织生物相容的。优选地，生物相容性材料包括但不限于可生物降解的和生物稳定的材料。
如本文所用的术语“氨基酸序列”和“多肽序列”可互换使用并指氨基酸的序列。
蛋白的“变体”被定义为在一个或多个氨基酸上不同于多肽序列或多肽序列的任何同源物的氨基酸序列。变体可具有“保守”改变，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质，例如，异亮氨酸对亮氨酸的置换。较少见地，变体可具有“非保守”改变，例如，用色氨酸置换甘氨酸。类似的微小变化还可包括氨基酸缺失或插入(即添加)或两者。
“缺失”被定义为其中一个或多个氨基酸残基分别不存在的氨基酸序列的改变。
“插入”或“添加”是已导致一个或多个氨基酸残基的添加的氨基酸序列的变化。
如本文所用的术语“衍生物”是指氨基酸的任何化学修饰。这样的修饰的示例会包括但不限于烷基、芳基、羟基、巯基、亚砜基(sulfoxyl)、磺酰基、酰基、磷酰基、烷氧基、氨基或氨基杂环基团对氢的置换。例如，酪氨酸是苯丙氨酸的4-羟基氨基酸衍生物，并且磷酸丝氨酸是丝氨酸的O-磷酸衍生物。其他可能的化学修饰可包括但不限于C-末端酰胺和酰基或磺酰基N末端修饰。
如本文所用的术语“结合”包括任何物理附着或紧密缔合，其可以是永久的或暂时的。通常，氢键合、疏水力、范德华力、共价和离子键合等的相互作用促进所测量/影响的目标分子和分析物/靶之间的物理附着。“结合”相互作用可以是简述为其中结合引起化学反应发生的情形。这在结合成分是酶并且分析物/靶是酶的底物时是典型的。结合剂和分析物/靶之间的接触引起的反应也在用于本发明目的的结合的定义范围内。
附图简述
图1示出如通过FACS在HuH7细胞中测量的WTPCSK9抑制的示例性数据。HuH7细胞在单独的或与100μΜ的各种SRX肽混合的0.75μg/mlPCSK9-WT蛋白(WT)的不存在(Cnt)或存在下温育18小时。细胞表面上LDLR的水平通过使用抗人LDLRAb和用Alexa647标记的合适的第二Ab的FACS来测量。相对于Cnt报告细胞表面LDLR。活性的％抑制计算为[SRX-WT]/[Cnt-WT]×100。
图2示出众多PCSK9变构调节肽对WTPCSK9活性的示例性数据。HuH7细胞在单独的或与100uΜ的各种SRX肽混合的1μg/mlPCSK9-WT蛋白(WT)的不存在(Cnt)或存在下接种于96孔板中进行总共20小时。16小时后，将dil-LDL(5ug/ml)加入到温育混合物中。4小时后，测量荧光(Ex:520nm/Em:575nm；截断:550nm)。dil-LDL吸收被计算为针对细胞数量校正过的RFU。
图3示出众多PCSK9变构调节肽对突变PCSK9蛋白(“功能获得”(GOF)-D374Y)调节的示例性数据。HuH7细胞在单独的或与100uΜ的各种SRX肽混合的0.5μg/mlPCSK9-D374Y蛋白(DY)的不存在(Cnt)或存在下接种于96孔板中进行总共20小时。16小时后，将dil-LDL(5ug/ml)加入到温育混合物中。4小时后，测量荧光(Ex:520nm/Em:575nm；截断:550nm)。dil-LDL吸收被计算为针对细胞数量校正过的RFU。
图4示出显示受SRX55的剂量依赖性抑制的突变PCSK9蛋白(“功能获得”GOF-D374Y)调节的示例性数据，如由HuH7细胞中的dil-LDL吸收所测量的。HuH7细胞在单独的或与递增浓度的各种SRX肽混合的0.5μg/mlPCSK9GOF-D374Y蛋白(DY)的不存在(Cnt)或存在下接种于96孔板中进行总共20小时。16小时后，将dil-LDL(5ug/ml)加入到温育混合物中。4小时后，测量荧光(Ex:520nm/Em:575nm；截断:550nm)。dil-LDL吸收被计算为针对细胞数量校正过的RFU。
图5示出显示受SRX55的剂量依赖性抑制的突变PCSK9蛋白(“功能获得”GOF-D374Y)调节的示例性数据，如由HepG2细胞中的dil-LDL吸收所测量的。HepG2细胞在单独的或与递增浓度的各种SRX55肽混合的2μg/mlPCSK9GOF-D374Y蛋白(DY)的不存在(Cnt)或存在下接种于96孔板中进行总共20小时。16小时后，将dil-LDL(5ug/ml)加入到温育混合物中。4小时后，测量荧光(Ex:520nm/Em:575nm；截断:550nm)。dil-LDL吸收被计算为针对细胞数量校正过的RFU。
图6示出HepG2细胞在单独的或与递增浓度的各种SRX55肽混合的PCSK9蛋白(D374Y：0.6ug/ml；WT：1.2ug/ml)的不存在(Cnt)或存在下接种于96孔板中进行总共20小时的示例性数据。16小时后，将dil-LDL(5ug/ml)加入到温育混合物中。4小时后，测量荧光(Ex:520nm/Em:575nm；截断:550nm)。dil-LDL吸收被计算为针对细胞数量校正过的RFU。PCSK9和-/+SRX55混合物在37℃下预温育3小时，然后加入到细胞中。
图7示出FL-83B细胞在单独的或与递增浓度的各种SRX55肽混合的PCSK9蛋白(D374Y：0.6ug/ml；WT：1.2ug/ml)的不存在(Cnt)或存在下接种于96孔板中进行总共20小时的示例性数据。16小时后，将dil-LDL(5ug/ml)加入到温育混合物中。4小时后，测量荧光(Ex:520nm/Em:575nm；截断:550nm)。dil-LDL吸收被计算为针对细胞数量校正过的RFU。PCSK9和-/+SRX55混合物在37℃下预温育3小时，然后加入到细胞中。
图8提供了显示变构调节合成肽(例如SRX55)与PCSK9蛋白的结合的示例性实施方案。前结构域以淡蓝色显示。PCSK9“催化”结构域的两个半部由黄色和深蓝色分别显示。EGF-A结合位点显示为蓝色和黄色空间立体球(Spacefill)。SRX55(绿色)显示与变构配体结合位点结合。N-末端螺旋显示为白色。
发明详述
本发明涉及高胆固醇血症的领域。具体地，本发明提供组合物和方法以通过使用合成肽和/或合成肽衍生物改变蛋白PCSK9的构象来调节低密度脂蛋白的循环水平，所述合成肽和/或合成肽衍生物具有在350-2,000Da之间的3-8个氨基酸的序列。PCSK9的构象的改变影响PCSK9和内源低密度脂蛋白受体之间的相互作用，并可导致减少或增加水平的循环LDL-胆固醇。高LDL-胆固醇水平与增加的心脏疾病风险相关。低LDL-胆固醇水平可在其它病状例如肝功能障碍中是有问题的；因此，对于可升高LDL水平的肽也存在效用。
I.天然PCSK9的生理作用
前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型(PCSK9)，也被称为PCSK9，是在人中由PCSK9基因编码的酶。Seidah等人,"Thesecretoryproproteinconvertaseneuralapoptosis-regulatedconvertase1(NARC-1):liverregenerationandneuronaldifferentiation"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(3):928-933(2003)。类似的基因(直系同源物)发现于许多物种中。许多酶，包括PSCK9，在刚合成时处于非活动状态，因为它们具有阻断其活性的肽链部分；前蛋白转化酶去除该部分以激活酶。
示例性实施方案示出了变构调节合成肽(例如SRX55)与PCSK9蛋白的结合。参见图8。前结构域以淡蓝色显示。PCSK9“催化”域的两个半部由黄色和深蓝色分别显示。EGF-A结合位点显示为蓝色和黄色空间立体球。SRX55(绿色)显示与变构配体结合位点结合。N-末端螺旋显示为白色。
PSCK9基因编码属于分泌性枯草杆菌酶(subtilase)家族的蛋白酶K亚家族的前蛋白转化酶。所编码的蛋白被合成为可溶性酶原，其在内质网中经历自催化分子内加工。该蛋白可用作前蛋白转化酶。例如，人PCSK9氨基酸序列是：
PSCK9被认为在胆固醇内稳态中发挥调节作用。例如，PCSK9能结合至低密度脂蛋白受体(LDL-R)的表皮生长因子样重复A(EGF-A)结构域，从而导致LDL-R内化和降解。显然，可预期减少的LDL-R水平导致降低的LDL-C代谢，这可导致高胆固醇血症。
据估计，大约900万美国人具有高或非常高风险的心脏相关问题，其可受益于PCSK9抑制剂(特别是在与他汀类药物组合时)。PCSK9抑制剂可导致如此广泛的使用从而具有在某些病状中替代他汀类药物的潜力。PCSK9具有医学意义，因为它在胆固醇内稳态中起作用。阻断PCSK9生物学作用的药物被认为降低循环低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平(即，例如通过增加LDL-R的可用性和从而LDL-C清除率)。这样的药物正开始III期临床试验，以评估其在人类中的安全性和有效性，和以确定其是否能改善心脏疾病结果。
抑制LDL-R/PCSK9复合物形成的药物已显示比常规可用的降胆固醇药物(即，例如他汀类药物)远更多地降低胆固醇。在生物学上合理的是，这也会降低由高胆固醇引起的心脏病发作等疾病。对人类的研究，包括正在进行中的III期临床试验，集中于PCSK9抑制是否确实减弱心血管疾病且具有可接受的副作用。LopezD.,"InhibitionofPCSK9asanovelstrategyforthetreatmentofhypercholesterolemia"DrugNewsPerspect.21(6):323-e30(2008)；Steinberg等人,"InhibitionofPCSK9:apowerfulweaponforachievingidealLDLcholesterollevels"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106(24):9546-9547(2009)；Mayer,"AnnexinA2isaC-terminalPCSK9-bindingproteinthatregulatesendogenouslowdensitylipoproteinreceptorlevels"J.Biol.Chem.283(46):31791-31801((2008)；以及Anonomyous,"Bristol-MyersSquibbselectsIsisdrugtargetingPCSK9asdevelopmentcandidateforpreventionandtreatmentofcardiovasculardisease"PressRelease.FierceBiotech.2008-04-08。
目前，已报道，PCSK9抗体药物处于临床试验中(例如，Sanofi/Regeneron,Amgen,Pfizer,Novartis,Roche)。然而，抗体疗法的一个缺点是，施用通过皮下或静脉内注射进行。在与LDL-R相互作用的催化结构域附近结合至PCSK9并因此抑制LDL-R/PCSK9复合物形成的多种单克隆抗体目前处于临床试验阶段。这些抗体包括AMG145(Amgen)、lD05-IgG2(Merck&Co.)和SAR236553/REGN727(Aventis/Regeneron)。Lambert等人,"ThePCSK9decade"J.LipidRes.53(12):2515-2524(2012)。Shan等人,"PCSK9bindstomultiplereceptorsandcanbefunctionallyinhibitedbyanEGF-Apeptide".Biochem.Biophys.Res.Commun.375(1):69-73(2008)。EGF-A结合位点的肽PCSK9抑制剂通过筛选线性和二硫化束缚的噬菌体展示肽文库来鉴定。该方法鉴定了13-氨基酸肽(Pep2-8)，其包含LDL受体的天然结合结构域的结构拟态。肽抑制剂结合位点被测定为与EGF(A)结构域的结合位点在很大程度上重叠；因此，Pep2-8用作LDL受体结合的竞争性抑制剂。这类似于也破坏LDL受体-EGF(A)结构域与PCSK9的相互作用的抗PCSK9单克隆抗体的抑制机制。Zhang等人,"IdentificationofaSmallPeptideThatInhibitsPCSK9ProteinBindingtotheLowDensityLipoproteinReceptor'JBiolChem289:942-955(2014)。
已显示PCSK9反义寡核苷酸(IsisPharmaceuticals)增加LDL-R的表达并降低小鼠中的总循环胆固醇水平。Graham等人,"Antisenseinhibitionofproproteinconvertasesubtilisin/kexintype9reducesserumLDLinhyperlipidemicmice"J.LipidRes.48(4):763-767(2007)。还已报道，锁核酸(SantarisPharma)降低小鼠中的PCSK9mRNA水平。Gupta等人,"Alockednucleicacidantisenseoligonucleotide(LNA)silencesPCSK9andenhancesLDLRexpressioninvitroandinvivo"PLoSONE5(5):el0682(2010)；和Lindholm等人,"PCSK9LNAantisenseoligonucleotidesinducesustainedreductionofLDLcholesterolinnonhumanprimates".Mol.Ther.20(2):376-381(2012)。RNAi(ALN-PCS,AlnylamPharmaceuticals)的初步临床试验已取得积极的结果作为抑制LDL-R/PCSK9复合物形成的有效手段。Frank-Kamenetsky等人,"TherapeuticRNAitargetingPCSK9acutelylowersplasmacholesterolinrodentsandLDLcholesterolinnonhumanprimates"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105(33):11915-11920(2008)。
II.PCSK9变构位点调节肽
PCSK9的变体可减少或增加循环胆固醇。Abifadel等人,"MutationsinPCSK9causeautosomaldominanthypercholesterolemia"Nat.Genet.34(2):154-156(2003)。LDL-C通常在其结合至肝细胞的表面上的LDL-R时从血液去除，并且作为受体-配体复合物被内化至肝细胞内。然而，当PCSK9结合至LDL-R时，LDL-R与复合的LDL颗粒一起伴随降解。但是，如果PCSK9未结合至LDL-R，则LDL-R在内化后回收从而返回到细胞的表面用于去除更多的胆固醇。
在一些实施方案中，本发明涉及长度为3-8个氨基酸且小于约1,300Da的合成肽序列，其具有对PCSK9形成LDL-R/PCSK9复合物的能力的调节效应。在一些实施方案中，合成肽包含亲脂性N-末端氨基酸(例如苯丙氨酸)。在一些实施方案中，本发明涉及结合至PCSK9变构位点的肽的用途。在一些实施方案中，所述肽减少LDL-R/PCSK9复合物形成并由此用于治疗包括脂质失调的各种疾病。在一些实施方案中，所述肽增加LDL-R/PCSK9复合物形成并由此用于与LDL失调相关的疗法的研究和开发。
虽然没有必要了解发明的机制，但据信“功能获得”(GOF)PCSK9突变体可导致病状，包括但不限于高胆固醇血症。例如，结合至PCSK9变构位点并增加PCSK9的低密度脂蛋白受体对细胞(例如肝细胞)表面上的低密度脂蛋白受体的亲和力的肽(例如合成肽和/或合成肽衍生物)预期会通过增加低密度脂蛋白受体内化和降解来增加高胆固醇血症的症状。
虽然没有必要了解发明的机制，但据信“功能缺失”(LOF)PCSK9突变体可导致包括减少的低密度脂蛋白的病状并预期会导致低胆固醇血症从而降低心血管疾病包括但不限于冠状动脉心脏疾病的风险。例如，结合于PCSK9变构位点降低PCSK9的低密度脂蛋白受体结合位点对细胞(例如肝细胞)表面上的低密度脂蛋白受体的亲和力的肽预期会因低密度脂蛋白受体的伴随回收而促进低密度脂蛋白内化和清除从而减少高胆固醇血症的症状。
本发明公开的PCSK9变构肽的实施方案相对于上文讨论的控制LDL的现有治疗策略而言具有若干优势。例如，如本文所涉及的小的PCSK9变构肽具有这样的优势：这些肽可口服施用而不会出现在抗体施用中所见的免疫反应或者在核酸施用(即，反义或锁核酸)中所见的系统性降解问题。尽管如此，由于这些小肽具有长半衰期，包封药物递送系统，例如脂质体或其它可生物降解的保护性组合物，将延长这些半衰期至比抗体或核酸更大的程度。
本文中所呈现的数据示例了十六种(16)合成肽，其对PCSK9的结合至LDL-R的能力具有通过结合至PCSK9变构位点介导的各种效应。例如，三种合成肽能够通过阻止WTPCSK9/LDL-R复合物形成使LDL-R的细胞表面表达增加60-95％，如通过FACS在HuH7细胞中所测量的。具体地，一种合成肽(SRX55)能够通过改变WTPCSK9/LDL-R复合物亲和力使LDL-R的细胞表面表达增加100％。参见图1。同样的这三种合成肽被测定为使LDL内化增加30-50％，如通过HuH7细胞中的dil-LDL吸收所测量的。在另一项研究中，一种肽能够100％抑制GOFPCSK9-D374Y的活性，如通过HepG2细胞中的dil-LDL吸收所测量的，并且四种肽显示出20-30％，如通过HuH7细胞中的dil-LDL吸收所测量的。一些肽还显示在小鼠肝细胞dil-LDL吸收中的抑制活性。
具体地，本数据显示PSCK9变构合成肽通过使肽结合至PCSK9来调节LDLR细胞表面水平的能力。参见图1。在该实验中，肝细胞培养模型(HuH7细胞)的LDLR水平通过按照实施例III的荧光激活细胞分选(FACS)来测量。细胞表面LDLR被报告为LDLR的基础水平的百分比，由顶部图中的Cnt_Amm.Bic、Cnt_Ac.Acid和Cnt条表示。参见图1(上图)。在外源PCSK9存在情况下的LDLR水平被表示为WT_Amm.Bic、WT-Ac.Acid和WT，与测试肽组合的外源PCSK9被表示为SRX##。所测量的LDLR水平被报告为相对于各组的基础对照(Cnt)的％。正调节(增加)LDLR细胞表面水平的肽(例如变构合成抑制剂肽)的实例包括SRX55、SRX56、SRX60和SRX62，负调节(降低)LDLR细胞表面水平的示例性肽(例如变构合成增强剂肽)包括SRX69、SRX72和SRX73。这进一步示出了百分比抑制(％抑制被计算为[SRX-WT]/[Cnt-WT]×100％)，其中LDLR水平的正调节(增加)被报告为正％抑制，并且LDLR水平的负调节(降低)被报告为负％抑制。参见图1(下图)。
通过配体与PCSK9:LDLR复合物的结合来调节肝细胞LDL内化的能力显示于图2至7中。LDL内化通过在不存在外源性PCSK9(Cnt)、在存在外源性PCSK9(正常PCSK9＝WT，D374Y突变PCSK9＝DY)、或者在存在PCSK9和测试肽(表示为SRX##，或如果图中显示单个肽的结果时表示为SRX)的情况下，由荧光标记的LDL分子(diI-LDL)的吸收来测量。
如通过相对于Cnt的diI-LDL％吸收报告的LDL内化可在模型肝细胞系(HuH7)中在测试SRX肽的存在下进行调节。参见图2(上图)。已显示LDL内化通过变构合成抑制剂肽例如SRX55、SRX56、SRX60和SRX67正调节(增加)。LDL内化可通过变构合成增强剂肽例如SRX36、SRX61、SRX64、SRX65、SRX66和SRX73负调节(降低)。显示了百分比抑制，其中LDL内化的正调节(增加)被报告为>0％抑制，LDL内化的负调节(降低)被报告为<0％抑制。参见图2(下图)。
如通过相对于Cnt的diI-LDL％吸收报告的LDL内化可在模型肝细胞系(HuH7)中在与临床相关的病理学功能获得性D374Y外源PCSK9(DY)组合的测试SRX肽的存在下进行调节。参见图3(上图)。已显示LDL内化通过变构合成抑制剂肽例如SRX55、SRX56、SRX60、SRX63、SRX64和SRX66正调节(增加)。LDL内化可通过变构合成增强剂肽例如SRX36、SRX71、SRX72和SRX73负调节(降低)。显示了百分比抑制，其中LDL内化的正调节(增加)被报告为>0％抑制，LDL内化的负调节(降低)被报告为<0％抑制。参见图3(下图)。
如通过相对于Cnt的diI-LDL％吸收报告的LDL内化可通过与临床相关的病理学功能获得性D374YPCSK9(DY)组合的变构合成抑制剂肽(SRX55，SRX60，SRX66和SRX56)的存在来正调节(增加)。已显示SRX55具有剂量依赖性方式的正调节性。参见图4(上图)。显示了百分比抑制，其中LDL内化的正调节(增加)被报告为>0％抑制，注意11.1uM的SRX55在0％的采样噪声之内。参见图4(下图)。
如通过相对于Cnt的diI-LDL％吸收报告的LDL内化可在第二模型肝细胞系(HepG2细胞)中结合临床相关的病理学功能获得性D374YPCSK9(DY)由SRX55以剂量依赖性方式正调节(增加)。参见图5(上图)。该正调节被进一步显示为百分比抑制，其中LDL内化的正调节(增加)被报告为>0％抑制。参见图5(下图)。
如通过相对于Cnt的diI-LDL％吸收报告的LDL内化可在第二模型肝细胞系(HepG2细胞)中在与临床相关的病理学功能获得性D374YPCSK9(DY)或正常PCSK9(WT)组合预温育时，由SRX55以剂量依赖性方式正调节(增加)。参见图6(上图)。该正调节被进一步显示为百分比抑制，其中LDL内化的正调节(增加)被报告为>0％抑制。参见图6(下图)。
如通过相对于Cnt的diI-LDL％吸收报告的LDL内化可在第三肝细胞系(FL83B)中在与临床相关的病理学功能获得性D374YPCSK9(DY)或正常PCSK9(WT)组合预温育时，由SRX55以剂量依赖性方式正调节(增加)。参见图7(上图)。该正调节被进一步显示为百分比抑制，其中LDL内化的正调节(增加)被报告为>0％抑制。参见图7(下图)。
最有效的肽(例如，SRX55；化合物1)在所有的测定和PCSK9表型中以一致的次序执行。随后设计了改进的肽，其预期具有更好的药物样性质，因为它们是基于初步结果的分析设计的。通常，这些改进肽的设计具有来自掺入了带负电的极性基团(例如磷酸盐、硫酸盐、四唑或羧酸)的C末端的前三个氨基酸的至少一个。例如，在化合物3中，极性基团包括磷酸基团：
化合物3：Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p)
可选择地，在化合物14中，C末端甘氨酸包含极性基团：
化合物14：Ac-Tyr-Trp-Gly
组成氨基酸可具有确定的立体化学，通常是天然“L”对映体，并且可具有天然存在的或合成的侧链。肽“N”末端可以是游离的、烷基化的、磺化的或酰化的。“C”末端可以是羧酸或酰胺。
可涉及各种天然和非天然氨基酸。色氨酸吲哚侧链可被烷基、烷氧基、卤素、羧基等取代以形成其它的类似物。苯丙氨酸、酪氨酸和高苯丙氨酸苯基部分可具有另外的苯基取代，例如烷基、烷氧基、卤素、羧基等。丝氨酸可在一些实例中被丙氨酸取代。苏氨酸可由丝氨酸或丙氨酸取代。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸可在一些类似物中互换。具有羧酸侧链的氨基酸例如天冬氨酸，可具有衍生为酰胺的侧链。
III.临床治疗
在一些实施方案中，本发明涉及施用PCSK9变构抑制剂肽至具有心血管疾病的症状的受试者。在一个实施方案中，所述心血管疾病包括高胆固醇血症。在一个实施方案中，所述心血管疾病包括高血压。在一个实施方案中，高胆固醇血症包括升高的低密度脂蛋白水平。
在一些实施方案中，本发明涉及施用PCSK9变构抑制剂肽至具有代谢性疾病的症状的受试者。在一个实施方案中，所述代谢性疾病包括糖尿病。
虽然没有必要了解发明的机制，但据信PCSK9变构抑制剂合成肽(即，例如SRX55)的施用诱导PCSK9蛋白的构象转变，使得低密度脂蛋白结合位点对于低密度脂蛋白受体的亲和力降低，其中PCSK9/LDL-R复合物形成减少。PCSK9/LDL-R复合物形成的减少导致用于结合循环LDL的LDL-R受体的生物利用度增加，从而增加LDL通过LDL-R的内化和清除。还相信，PCSK9变构抑制剂肽导致肝细胞LDL-R的生物利用度增加。
A.高胆固醇血症
高胆固醇血症(也称为血胆脂醇过多)是高水平胆固醇在血液中的存在。它是“高脂血症”(血液中的脂质水平升高)和“高脂蛋白血症”(血液中的脂蛋白水平升高)的一种形式。Durrington,P"Dyslipidaemia"TheLancet362(9385):717-731。高胆固醇血症通常是由于遗传和环境因素的组合引起的。环境因素包括肥胖和饮食选择。遗传贡献通常是由于多基因的累加效应引起的，虽然偶尔可以是由于单一基因缺陷(例如在家族性高胆固醇血症的情况下)引起的。存在一些次要原因，包括：2型糖尿病，肥胖，酒精，单克隆丙种球蛋白病，透析，肾病综合征，梗阻性黄疸，甲状腺功能减退，库欣氏综合征，神经性厌食症，药物(噻嗪类利尿剂，环孢素，糖皮质激素，β-阻滞剂，视黄酸)。Bhatnagar等人,(2008)"Hypercholesterolaemiaanditsmanagement"BMJ337:a993。在一些情况下遗传异常完全负责高胆固醇血症，例如在家族性高胆固醇血症中，其中在常染色体显性APOB基因、常染色体隐性LDLRAP1基因、PCSK9基因的常染色体显性家族性高胆固醇血症(HCHOLA3)变体或LDL受体基因中存在一个或多个基因突变。"Hypercholesterolemia"GeneticsHomeReferenceU.S.NationalInstitutesofHealth,ghr.nlm.nih.gov/condition＝hypercholesterolemia。即使不存在负责高胆固醇血症的单一突变，但遗传素质仍然与久坐的生活方式、肥胖或动脉粥样化饮食组合地起着主要作用。Citkowitz等人,(2010)"PolygenicHypercholesterolemia".eMedicineMedscape,emedicine.medscape.com/article/121424-overview。
胆固醇是一种固醇。其是所有动物细胞利用来构造它们的膜的脂质的三个主要类别之一，并因此由所有的动物细胞制造。植物细胞不制造胆固醇。其还是类固醇激素、胆汁酸和维生素D的前体。由于胆固醇不溶于水，故其在血浆中于蛋白颗粒(脂蛋白)内进行运输。脂蛋白通过其密度进行分类：极低密度脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。Biggerstaff等人,(2004)."Understandinglipoproteinsastransportersofcholesterolandotherlipids"AdvPhysiolEduc28(1-4):105-6。所有脂蛋白携带胆固醇，但HDL以外的脂蛋白(称为非-HDL胆固醇)，特别是LDL-胆固醇的水平升高与动脉粥样硬化和冠状动脉心脏疾病的风险增加有关。Carmena等人,(2004)"Atherogeniclipoproteinparticlesinatherosclerosis"Circulation109(23Suppl1):III2-7。相反，较高水平的HDL胆固醇是保护性的。Kontush等人,(2006)"Antiatherogenicsmall,denseHDL—guardianangelofthearterialwall？"NatClinPractCardiovascMed3(3):144—153。非-HDL胆固醇和LDL在血液中的水平升高可以是饮食、肥胖、继承性(遗传性)疾病(例如家族性高胆固醇血症中的LDL受体突变)、或其它疾病例如糖尿病和甲状腺功能低下的存在的结果。总胆固醇是在血液中所有脂肪的量。这些脂肪被称为脂质。构成总胆固醇的有不同类型的脂质。最重要的两个类型是：低密度脂蛋白(LDL)-“坏”胆固醇和高密度脂蛋白(HDL)-“好”胆固醇。高胆固醇，尤其是“坏”胆固醇(LDL)，会堵塞动脉。这可减少血液流向心脏。其可导致心脏疾病、中风或心脏病发作。胆固醇以毫克/分升(mg/dL)测量。在诸如心脏疾病或糖尿病的病状中，LDL胆固醇应保持低于100mg/dL。如果存在心脏疾病的风险，LDL胆固醇应低于130mg/dL。一般而言，LDL胆固醇应低于160-190mg/dL。可选择地，HDL“好”胆固醇应是高的。例如，男性中的HDL水平应当高于40mg/dL，而女性的HDL水平应当高于50mg/dL。
高胆固醇血症的一个症状包括血清胆固醇的长期升高，这可导致动脉粥样硬化。Bhatnagar等人,(2008)"Hypercholesterolaemiaanditsmanagement"BMJ337:a993。在数十年的时期内，慢性升高的血清胆固醇促成动脉中动脉粥样硬化斑的形成。这可导致所涉及动脉的进行性狭窄(变窄)或甚至完全阻塞(堵塞)。或者较小的斑可破裂并导致凝块形成，阻碍血液流动。FinnAV,NakanoM,NarulaJ,KolodgieFD,VirmaniR(July2010)."Conceptofvulnerable/unstableplaque"Arterioscler.Thromb.Vase.Biol30(7):1282-1292。冠状动脉的突然阻塞导致心肌梗塞或心脏病发作。供应脑的动脉的阻塞可导致中风。如果狭窄或阻塞的发展是渐进的，对组织和器官的血液供应慢慢减少，直到器官功能变得受损。在此时，组织缺血(限制血液供应)可表现为特定的症状，包括但不限于，脑的短暂性缺血(通常被称为短暂性脑缺血发作)可表现为暂时失明、眩晕和平衡受损、失语(说话困难)、轻瘫(乏力)和感觉异常(麻木或刺痛)，通常表现在身体的一侧。对心脏的供血不足可表现为胸痛，以及眼的缺血可表现为一只眼的短暂性视力丧失。对腿的供血不足可表现为行走时小腿疼痛，而在肠内，其可呈现为吃饭后的腹痛。Grundy等人,(1998)"Primarypreventionofcoronaryheartdisease:guidancefromFramingham:astatementforhealthcareprofessionalsfromtheAHATaskForceonRiskReduction.AmericanHeartAssociation"Circulation97(18):1876-1887。
B.低胆固醇血症
低胆固醇血症(hypocholesterolemia)是在血液(-emia)中异常低(hypo-)水平的胆固醇的存在。尽管高的总胆固醇(高胆固醇血症)的存在与心血管疾病有关，但胆固醇的体内产生的缺陷也可导致不利的后果。胆固醇是哺乳动物细胞膜的主要成分，并且被需要用来建立适当的膜渗透性和流动性。目前尚不清楚低于平均的胆固醇水平是否是直接有害的；但其常常在特定疾病中遇到。
低胆固醇的可能原因包括但不限于，他汀类药物、甲状腺功能亢进或甲状腺过度活跃、肾上腺功能不全、肝病、吸收不良(从肠道营养素吸收不足)例如在乳糜泻中、营养不良、无β脂蛋白血症(导致胆固醇读数低于50mg/dl的遗传性疾病)、低β脂蛋白血症(导致胆固醇读数低于50mg/dl的遗传性疾病)、锰缺乏症、Smith-Lemli-Opitz综合征、马凡氏综合征、白血病以及其它血液系统疾病。
人口统计研究表明，低胆固醇与死亡率增加有关，主要是由于抑郁症、癌症、出血性中风、主动脉夹层和呼吸道疾病。Jacobs等人,(1992)."ReportoftheConferenceonLowBloodCholesterol:MortalityAssociations"Circulation86(3):1046-1060；和SuarezE.C.,(1999)"Relationsoftraitdepressionandanxietytolowlipidandlipoproteinconcentrationsinhealthyyoungadultwomen".PsychosomMed61(3):273-279。还可能的是，无论是什么原因导致了低胆固醇水平，其也导致死亡，并且低胆固醇只是健康状况不佳的标志。
C.糖尿病
糖尿病影响超过2000万美国人。超过4000万美国人患有前驱糖尿病(其常常在2型糖尿病之前发生)。糖尿病通常是终身(慢性)疾病，其中在血液中存在高水平的糖。胰岛素是由胰腺产生来控制血糖的激素。糖尿病可由胰岛素太少、胰岛素抗性或两者导致。为了理解糖尿病，重要的是首先理解其中食物被分解并由身体为能量而使用的正常过程。
当食物被消化时发生若干事件。一种称为葡萄糖的糖进入血流。葡萄糖是身体燃料的来源。一种称为胰腺的器官制造胰岛素。胰岛素的作用是将葡萄糖从血流移动进入肌肉、脂肪和肝细胞中，在那里它可被用作燃料。
患有糖尿病的人具有高血糖，因为其身体不能将糖移动进入脂肪、肝脏和肌肉细胞中以被储存用于能量。这是因为，他们的胰腺不制造足够的胰岛素或者他们的细胞不正常地响应胰岛素。
糖尿病有两种主要类型。对于每种类型的病因和风险因素是不同的。1型糖尿病可发生于任何年龄，但其最常见诊断于儿童、青少年或年轻成人中。在这种疾病中，身体制造很少或不制造胰岛素。需要每天注射胰岛素。确切的病因不明。2型糖尿病构成大多数糖尿病病例。它最常发生于成年期。但由于高肥胖率，青少年和年轻成人现在被诊断患有其。许多2型糖尿病患者不知道他们患有该病。
妊娠期糖尿病是在没有糖尿病的女性妊娠期间的任何时间发生的高血糖。
糖尿病症状可以是由于高血糖水平引起的，并且包括但不限于，视力模糊、过度口渴、疲乏、饥饿、常常排尿和体重减少。
IV.药物组合物
本发明还提供了药物组合物(例如包含上文描述的肽)。取决于期望局部还是全身治疗以及取决于待治疗的区域，本发明的药物组合物可以以多种方式施用。施用可以是局部的(包括眼和粘膜，包括阴道和直肠递送)、肺部的(例如，通过吸入或吹入粉剂或气雾剂，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和透皮)、口服的或肠胃外的。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内(例如，鞘内或心室内)施用。
用于局部施用的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规的药物载体、水性、粉剂或油性基质、增稠剂等可以是必要的或期望的。
用于口服、舌下或经颊施用的组合物和制剂包括粉剂或颗粒剂、水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊剂、凝胶、滴剂、条剂、树胶、囊剂或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可以是期望的。
用于肠胃外、鞘内或脑室内施用的组合物和制剂可包括无菌水溶液，所述溶液还可含有缓冲剂、稀释剂和其它适合的添加剂，例如但不限于，渗透增强剂、载体化合物和其它药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物包括但不限于，溶液、乳剂和含脂质体的制剂。这些组合物可产生自各种组分，包括但不限于，预形成的液体、自乳化固体和自乳化半固体。
在一些实施方案中，药物组合物还可包含其它药物、激素和/或肽。例如，该药物组合物还可包含他汀类药物。他汀类药物(或HMG-CoA还原酶抑制剂)是一类用于通过抑制酶HMG-CoA还原酶来降低胆固醇水平的药物，其在胆固醇在肝脏中的产生中起作用。升高的胆固醇水平与心血管疾病有关，因此他汀类药物用于预防这些疾病。Lewington等人,"Bloodcholesterolandvascularmortalitybyage,sex,andbloodpressure:ameta-analysisofindividualdatafrom61prospectivestudieswith55,000vasculardeaths"Lancet370(9602):1829-1839(2007)。研究已发现，他汀类药物作为二级预防策略用于治疗心血管疾病(CVD)是最有效的，其在具有升高的胆固醇水平但没有先前的CVD的那些中的益处成疑。Taylor等人"Statinsfortheprimarypreventionofcardiovasculardisease".In:Taylor,Fiona.CochraneDatabaseSystRev(1)(2011)。他汀类药物有罕见但严重的副作用，特别是肌肉损伤。
他汀类药物的具体实例包括但不限于阿托伐他汀(和)，氟伐他汀洛伐他汀 匹伐他汀普伐他汀 瑞舒伐他汀和辛伐他汀 他汀类药物与另一种药例如依折麦布/辛伐他汀剂的几种组合制剂也是可获得的。
心血管药物的具体实例包括但不限于普萘洛尔，洋地黄，苯磺酸氨氯地平和硝苯地平。
其它药物组合物的具体例实例还可包括但不限于依折麦布苯磺酸氨氯地平烟酸，西格列汀二甲双胍或奥利司他
本发明的药物制剂可方便地以单位剂量形式呈现，其可根据在制药工业中熟知的常规技术来制备。这样的技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂联合在一起的步骤。一般而言，制剂通过使活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀地和紧密地联合在一起和随后如果有必要的话使产品成形来制备。
本发明的组合物可被配制为任何的多种可能剂型，例如但不限于片剂、胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物还可被配制为在水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可还包含增加悬浮液的粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液还可包含稳定剂。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物可被配制为和用作泡沫。药物泡沫包括制剂，例如但不限于乳剂、微乳剂、乳膏、凝胶剂和脂质体。虽然在性质上基本上类似，但这些制剂在最终产品的成分和一致性上可不同。
本发明的组合物可另外包含在药物组合物中常规发现的其它辅助组分。因此，例如，组合物可含有额外的、相容的、药物活性的材料，例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可含有另外的可用于物理配制本发明的组合物的各种剂型的材料，例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，这样的材料，当加入时，不应不适当地干扰本发明的组合物的成分的生物活性。制剂可被灭菌并且如果需要的话，与辅助剂混合，所述辅助剂为例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等，它们不与制剂中的活性药物成分有害地相互作用。
剂量的给予取决于待治疗的疾病状态的严重性和响应性，治疗过程持续数天至数月或直至实现治愈或实现疾病状态的减少。最佳剂量给予方案可由患者体内药物累积的测量计算。施用医师可容易地确定最佳剂量、剂量给予方法和重复率。最佳剂量可根据个体寡核苷酸的相对效力而变化，并且通常可基于在体外和体内动物模型中发现有效的EC50或基于本文描述的肽来估计。一般而言，剂量为0.01μg至100g/kg体重，并且可以每天、每周、每月或每年给予一次或多次。治疗医师可基于体液或组织中药物的经测量的滞留时间和浓度来估计剂量给予的重复率。成功治疗后，可期望使受试者经受维持疗法以防止疾病状态的复发，其中肽以维持剂量施用，范围为0.01μg至100g/kg体重，每日一次或多次至每20年一次。
实验
实施例I
细胞培养和转染
将缺失内源PCSK9的HepG2/shPCSK9或HuH7/shPCSK9细胞(1)以1×105细胞/孔接种在12孔微量培养板(GreinerBio-One)中。随后将这些细胞用0.7μg/ml的V5标记的PCSK9或其功能获得PCSK9D374Y温育4小时或过夜，所述V5标记的PCSK9或其功能获得PCSK9D374Y用各种肽在50μΜ(或更少，如果需要的话对大多数活性肽如此)下预温育4小时或不进行预温育。然后将细胞在含有1％NonidetP-40、0.5％脱氧胆酸钠、补充有1X完全蛋白酶抑制剂混合物(RocheAppliedScience)的0.1％SDS的1XRIPA缓冲液(150NIM的NaCl，50mM的三-盐酸，pH8.0)中裂解，并通过Western印迹分析。
实施例II
Western印迹分析
细胞裂解物中的蛋白通过10％Tris-甘氨酸SDS-PAGE解析。将凝胶印迹到聚偏二氟乙烯(PVDF，PerkinElmerLifeSciences)膜(GEHealthcare)上，在含有5％脱脂奶的TBS-T(50mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl,0.1％Tween20)中封闭1小时，并用自制多克隆人PCSK9抗体(1:000)(13)、人LDLR抗体(1:1000，R&DSystems)、β-肌动蛋白(1:5000；Sigma)和单克隆抗体(mAb)V5-HRP(1:5000；Sigma)免疫印迹。适当的辣根过氧化物酶缀合的二抗(1:10000，Sigma)用于使用ECLPlus试剂盒(GEHealthcare)在增强的化学发光下进行检测。使用ImageJ软件获得蛋白条带的定量。
实施例III
FACS分析
将HuH7/shPCSK9细胞如上所述地用PCSK9在37℃下温育4小时，所述PCSK9用在50μΜ(或更少，如果需要的话对大多数活性肽如此)下使用的各示例性肽预温育或不进行预温育。Benjannet等人,"EffectsoftheprosegmentandpHontheactivityofPCSK9:evidenceforadditionalprocessingevents"JBiolChem.285(52):40965-40978(2010)。
然后将细胞用溶液A(含有0.5％牛血清白蛋白(Sigma)和lg/升葡萄糖的不含钙/镁的Dulbecco'sPBS(Invitrogen))洗涤3x。然后将细胞在室温下用lxVersene溶液(Invitrogen)温育10分钟，然后加入5ml溶液A。随后将细胞在含有人LDLRmAb-C7(1:100；SantaCruzBiotechnology)的溶液A中温育40分钟。洗涤后，将细胞在含有第二抗体(AlexaFluor647驴抗小鼠抗体；1:250；MolecularProbes)的溶液中温育20分钟。
在悬浮于含有0.2％的碘化丙啶的PBS中之后，对细胞使用FACSBDLSR(BDBiosciences)利用AlexaFluor647针对碘化丙啶(死细胞)和活细胞中的LDLR通过FACS进行分析。
示例的肽的细胞活性
化合物1 +
化合物2 +
化合物3 +
化合物4 +
化合物5 +
化合物6 -
化合物7 -
化合物8 +
化合物9 +
化合物10 -
化合物11 -
化合物12 (+)
化合物13 -
化合物14 (+)
化合物15 -
化合物16 (+)
+意指在100uM上>30％抑制高于对照-意指误差范围内的抑制
(+)意指在100uM上抑制>30％低于对照
实施例IV
细胞diI-LDL吸收测定
将用短发夹PCSK9敲低序列例如HepG2/shPCSK9、HuH7/shPCSK9、FL83B/shPCSK9转染的细胞例如HepG2、HuH7、FL83B或细胞系以2×104细胞/孔接种在96孔板中，并在37摄氏度下在RPMI+10％FBS中培养。大约24小时后，将细胞培养基吸出并用RPMI+3-5mg/mLLPDS(LipoproteinDeficientSerum,Millipore)培养基替换用于进一步的实验。Benjannet等人,"EffectsoftheprosegmentandpHontheactivityofPCSK9:evidenceforadditionalprocessingevents"JBiolChem.285(52):40965-40978(2010)。
肽活性通过用：i)无SRX肽/PCSK9蛋白复合物(对照，Cnt)；ii)PCSK9蛋白；和iii)SRX肽/PCSK9复合物培养细胞来评估。还使用了这些实验条件的各种排列，包括：i)加入野生型PCSK9(WT)；ii)突变PCSK9(例如，D374Y突变PCSK9，DY)；iii)相同浓度和/或组合的各种SRX肽和/或PCSK9；iv)不同浓度和/或组合的各种SRX肽和/或PCSK9；v)使用如上所述的不同细胞，具有或不具有转染的短发夹序列；vi)PCSK9和SRX肽的预温育(例如1小时，2小时，3小时，4小时等)；vii)各种温度，包括但不限于体温(例如，7℃)、超生理温度(例如39℃)；和viii)有/无搅拌(例如振动器或温和的周期性涡旋)。
使用前面段落中描述的条件的组合之一培养细胞16小时。16小时后，将使培养基浓度为5ug/mLdiI-LDL(与1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚碳花青高氯酸酯偶联的低密度脂蛋白)所需的diI-LDL量加入到培养孔中并将细胞在这些新的条件下持续培养另外的4个小时。在4小时的温育期的结束时(总共20小时的细胞培养)，细胞吸收通过溶剂例如去离子高压灭菌水或PBS中的10μMHoechst33342中的4％甲醛的添加停止，并将样本在20℃下温育20分钟。
细胞样本用PBS漂洗两次，然后用360nm处的激发和在460nm处检测的发射来测量荧光以测量DNA含量。随后将细胞样本用0.1NNaOH溶液中的0.1％SDS振荡温育10分钟。样本中diI-LDL的荧光通过使用530nm处的激发和580nm处的所得发射来定量。
将diI-LDLR的荧光测量结果标准化至估计的细胞数量，其由Hoechst荧光测定。将数据对于不同的实验条件进行分析，并报告为Cnt样本的百分比相对荧光单位(RFU)。百分比抑制计算为肽暴露样本的RFU对PCSK-no肽的RFU的差，除以PCSK9-no肽对Cnt样本的RFU的RFU差，也表达为[(SRX：RFU)-(PCSK9-no肽：RFU)]/[(PCSK9-no肽：RFU)-(Cnt：RFU)]×100。
实施例V
制备PCSK9变构抑制剂肽的方法
本实施例提供了鉴定和合成本发明的肽的几种方法。R.B.Merrifield(1963)."SolidPhasePeptideSynthesis.I.TheSynthesisofaTetrapeptide".J.Am.Chem.Soc.85(14):2149-2154；Albericio,F.(2000).Solid-PhaseSynthesis:APracticalGuide(1ed.).BocaRaton:CRCPress,p.848.ISBN0-8247-0359-6；andAlbericioF,CarpinoLA.,"Couplingreagentsandactivation"MethodsEnzymol.1997；289:104-126。
所有肽用Fmoc(9-芴甲氧羰基)化学(21stCenturyBiochemicals,260CedarHillSt.,Marlboro,MA01752)制造。简言之，将肽用聚苯乙烯树脂制备，用合适的接头官能化，并随后使用IntavisRS肽合成仪(Germany)制造或使用由粗玻璃熔块定制用于通过真空去除反应物的玻璃肽合成容器(Chemglass)手工制造。
在任一情况下，如下连续加入氨基酸：将氨基酸溶解于NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)或DMF(二甲基甲酰胺)；这些溶剂还用于在各步骤后洗涤树脂。待添加的Fmoc保护的氨基酸通过使用HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐)或HCTU(2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸铵)活化；对于待添加的4倍化学计量(相对于树脂)，使用3.95倍过量的HATU或HCTU来产生活性酯。连同8倍过量的DIPEA(Ν,Ν-二异丙基乙胺)作为碱，这些试剂催化下一个氨基酸的添加。在偶联氨基酸后(每个循环包括双重偶联循环以确保有效偶联)，将树脂暴露于20％乙酸酐以终止(“脱帽(cap-off))未添加下一个氨基酸的任何肽链。然后将树脂用DMF(3×)、甲醇(MeOH，2×)和再次DMF洗涤，2X。使用哌啶来在每个偶联循环结束时去除Fmoc基团，这暴露N-末端胺并允许添加下一个氨基酸。
在各步骤的合成完成后，将肽(在树脂上)使用MeOH(3×)和DCM(3×)干燥，用92％TFA、2％水、2％三异丙基硅烷、2％茴香硫醚和2％乙二硫醇切割和脱保护，在室温下进行3-4小时。将肽沉淀在冷乙醚中，离心(2,000RPM)并用冷醚洗涤沉淀2X。在干燥后，将肽溶解在含有0.1％TFA(缓冲液A)的水中并经历使用C18柱的RP-HPLC(缓冲液B＝95％乙腈/0.1％TFA)。
一些PCSK9变构合成肽，及它们的物理特性，列举如下：
化合物1(SRX-55)：Val-Tyr-Val-Arg-Phe-Trp,Calc'dm/z：868.46；Obs.：869.00
化合物2：(SRX-56)β-Ala-Phe(3-CH2NH2)-Val-D-Ser(p)-Phe-Trp,Calc'dm/z：864.36；Obs.：864.80
化合物3(SRX-60)：Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Calc'dm/z:1053.39；Obs.：1053.80
化合物4(SRX-61)：Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Calc'dm/z：1064.42；Obs.：1064.90
化合物5：(SRX-62)Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Calc'dm/z：1027.46；Obs.:
化合物6：(SRX-63)Thr-Leu-Hph-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Calc'dm/z：1021.42；Obs.：1022.30
化合物7：(SRX-64)Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp(3-Me)-Ser-Ser-Ser(p),Calc'dm/z：1067.40；Obs.：1067.80
化合物8：(SRX-65)Val-Leu-Glu-Leu-Tyr-Trp,Calc'dm/z：821.43；Obs.：821.90
化合物9：(SRX-66)Leu-Asp-Leu-Phe-Phe-Ser,Calc'dm/z：740.37；Obs.：740.80
化合物10：(SRX-67)Ile-Leu-Asp-Leu-Ser-Tyr,Calc'dm/z：722.39；Obs.：722.80
化合物11：(SRX-68)Ac-Trp-Ser-Ser(p),Calc'dm/z：500.13；Obs.：500.15
化合物12：(SRX-69)Ac-Trp-Ala-Ser(p),Calc'dm/z：484.14；Obs.：484.40
化合物13：(SRX-70)Ac-Trp(5-F)-Ala-Ser(p)-吗啉,Calc'dm/z：571.18；Obs.：571.00
化合物14：(SRX-72)Ac-Tyr-Trp-Gly,Calc'dm/z：466.19；Obs.：466.47
化合物15：(SRX-36)Thr-Leu-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Calc'dm/z：860.33；Obs.：860.00
化合物16：(SRX-73)Phe(4-Ph)-Ala-Ser(p)-吗啉,Calc'dm/z：548.20；Obs.：548.00
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种方法，包括：
a)提供；
i)PCSK9蛋白，其中所述蛋白包含诱导变构调节的结合位点和低密度脂蛋白受体结合位点；
ii)由介于3至8个氨基酸之间的序列组成的合成配体，其能够结合所述结合位点；
iii)包含低密度脂蛋白受体和低密度脂蛋白的多个肝细胞；
b)使所述合成配体结合至所述结合位点，其中所述合成配体诱导所述蛋白的构象转变；和
c)通过所述构象转变调节所述低密度脂蛋白受体结合位点对于所述低密度脂蛋白受体的亲和力。
2.权利要求1的方法，其中所述合成配体是变构抑制剂配体，其中所述调节减小所述低密度脂蛋白受体结合位点对于所述低密度脂蛋白受体的亲和力，使得所述多个肝细胞对所述低密度脂蛋白的内化增加。
3.权利要求1的方法，其中合成配体是变构增强剂配体，所述调节增加所述低密度脂蛋白受体结合位点对于所述低密度脂蛋白受体的亲和力，使得所述多个肝细胞对所述低密度脂蛋白的内化减少。
4.权利要求1的方法，其中所述蛋白的所述构象转变选自诱导契合转变和生物力学转变。
5.权利要求1的方法，其中所述合成配体是选自VYVRFW、VLELYW和ISDLSY的合成肽。
6.权利要求2的方法，其中所述变构抑制剂是选自SRX55，SRX56，SRX60，SRX61，SRX62，SRX63，SRX64，SRX65和SRX66的肽。
7.权利要求3的方法，其中所述变构增强剂肽选自SRX64，SRX67，SRX68，SRX69，SRX72和SRX73。
8.一种方法，包括：
a)提供；
i)PCSK9蛋白，其中所述蛋白包含诱导变构调节的结合位点和低密度脂蛋白受体结合位点；
ii)由介于3至8个氨基酸之间的序列组成的合成配体，其能够结合所述结合位点；
iii)包含低密度脂蛋白受体群的多个肝细胞；
b)使所述合成配体结合至所述结合位点，其中所述合成配体诱导所述蛋白的构象转变；和
c)通过所述构象转变调节所述低密度脂蛋白受体的所述群。
9.权利要求8的方法，其中所述合成配体是变构抑制剂配体，其中所述调节增加在肝细胞的细胞表面上可测量的所述低密度脂蛋白受体的所述群。
10.权利要求8的方法，其中所述合成配体是变构增强剂配体，其中所述调节减少在肝细胞的细胞表面上可测量的所述低密度脂蛋白受体的所述群。
11.权利要求8的方法，其中所述蛋白的所述构象转变选自诱导契合转变和生物力学转变。
12.权利要求8的方法，其中所述配体是选自VYVRFW、VLELYW和ISDLSY的合成肽。
13.权利要求9的方法，其中所述变构抑制剂是选自SRX55，SRX56，SRX60，SRX61，SRX62，SRX63，SRX64，SRX65和SRX66的肽。
14.权利要求10的方法，其中所述变构增强剂是选自SRX64，SRX67，SRX68，SRX69，SRX72和SRX73的肽。
15.下式的化合物：
其中：i)n是氨基酸残基的数量，其是在范围3-8中的整数；ii)组成氨基酸是独立选择的天然或非天然氨基酸的单一对映体；iii)R2和R3独立地选自氢、低级烷基、支链烷基、羟烷基、环烷基、杂环、芳基、杂芳基、酰基、取代或未取代的苯甲酰基、烷基或芳基、甲磺酰-磺酰基、甲苯磺酰-磺酰基和氨基甲酰基；iv)R1选自-OH和-NR4-R5；v)R4和R5独立地选自氢、低级烷基、芳基、环烷基、芳族杂环、吡啶、四唑、烷氧基、环烷氧基；可选择地，R4和R5被连接作为杂环例如哌啶；吡咯烷；吗啉；哌嗪；经取代的杂环例如4-甲基哌嗪；或稠杂环例如二氢喹啉或二氢吲哚；以及vi)S1、S2和Sn是侧链，其中至少一种侧链选自极性基团、带负电的基团和带正电的基团。
16.权利要求15的化合物，其还包含带负电的极性基团。
17.权利要求16的化合物，其中所述带负电的极性基团选自掺入所述侧链S1、S2或Sn中的O-磷酸盐、O-硫酸盐、5-O-和5-N-四唑的至少一种。
18.权利要求15的化合物，其中所述侧链的至少一种包含磷酸丝氨酸。
19.权利要求15的化合物，其中所述侧链S1包括-CH2-NH-四唑。
20.权利要求15的化合物，其还包含极性C-末端。
21.权利要求15的化合物，其中所述化合物选自Val-Tyr-Val-Arg-Phe-Trp,β-Ala-Phe(3-CH2NH2)-Val-D-Ser(p)-Phe-Trp,Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Hph-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp(3-Me)-Ser-Ser-Ser(p),Val-Leu-Glu-Leu-Tyr-Trp,Leu-Asp-Leu-Phe-Phe-Ser,Ile-Leu-Asp-Leu-Ser-Tyr,Ac-Trp-Ser-Ser(p),Ac-Trp-Ala-Ser(p),Ac-Trp(5-F)-Ala-Ser(p)-吗啉,Thr-Leu-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Tyr-Trp-Gly,Phe(4-Ph)-Ala-Ser(p)-吗啉。
22.权利要求15的化合物，其中所述化合物被配制为药物组合物。
23.权利要求22的化合物，其中所述药物组合物还包含制药药物。
24.权利要求23的化合物，其中所述制药药物选自他汀类药物、心血管药、代谢药和抗高血压药。
25.权利要求23的化合物，其中所述制药药物选自依折麦布、苯磺酸氨氯地平、西他列汀、二甲双胍、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。
26.权利要求23的化合物，其中所述药物组合物被配制为选自下列的形式：片剂，液体，凝胶，胶囊，囊剂，微粒，脂质体，纳米颗粒，盐，透皮贴剂，软膏，洗剂，乳膏，凝胶，滴剂，条剂，栓剂，喷雾剂和粉剂。
27.权利要求15的化合物，其中所述极性基团是瓜氨酸。
28.权利要求20的化合物，其中所述极性C-末端是甘氨酸。
29.权利要求15的化合物，其中所述带正电的基团是酰胺。

Claims (26)

1.一种方法，包括：
a)提供；
i)PCSK9蛋白，其中所述蛋白包含诱导变构调节的结合位点和低密度脂蛋白受体结合位点；
ii)能够结合所述结合位点的合成配体；
iii)包含低密度脂蛋白受体和低密度脂蛋白的多个肝细胞；
b)使所述合成配体结合至所述结合位点，其中所述合成配体诱导所述蛋白的构象转变；和
c)通过所述构象转变调节所述低密度脂蛋白受体结合位点对于所述低密度脂蛋白受体的亲和力。
2.权利要求1的方法，其中所述合成配体是变构抑制剂配体，其中所述调节减小所述低密度脂蛋白受体结合位点对于所述低密度脂蛋白受体的亲和力，使得所述多个肝细胞对所述低密度脂蛋白的内化增加。
3.权利要求1的方法，其中合成肽是变构增强剂配体，所述调节增加所述低密度脂蛋白受体结合位点对于所述低密度脂蛋白受体的亲和力，使得所述多个肝细胞对所述低密度脂蛋白的内化减少。
4.权利要求1的方法，其中所述蛋白的所述构象转变选自诱导契合转变和生物力学转变。
5.权利要求1的方法，其中所述合成配体是选自VYVRFW、VLELYW和ISDLSY的合成肽。
6.权利要求2的方法，其中所述变构抑制剂是选自SRX55，SRX56，SRX60，SRX61，SRX62，SRX63，SRX64，SRX65和SRX66的肽。
7.权利要求3的方法，其中所述变构增强剂肽选自SRX64，SRX67，SRX68，SRX69，SRX72和SRX73。
8.一种方法，包括：
a)提供；
i)PCSK9蛋白，其中所述蛋白包含诱导变构调节的结合位点和低密度脂蛋白受体结合位点；
ii)能够结合所述结合位点的合成配体；
iii)包含低密度脂蛋白受体群的多个肝细胞；
b)使所述合成配体结合至所述结合位点，其中所述合成配体诱导所述蛋白的构象转变；和
c)通过所述构象转变调节所述低密度脂蛋白受体的所述群。
9.权利要求8的方法，其中所述合成配体是变构抑制剂配体，其中所述调节增加在肝细胞的细胞表面上可测量的所述低密度脂蛋白受体的所述群。
10.权利要求8的方法，其中所述合成配体是变构增强剂配体，其中所述调节减少在肝细胞的细胞表面上可测量的所述低密度脂蛋白受体的所述群。
11.权利要求8的方法，其中所述蛋白的所述构象转变选自诱导契合转变和生物力学转变。
12.权利要求8的方法，其中所述配体是选自VYVRFW、VLELYW和ISDLSY的合成肽。
13.权利要求9的方法，其中所述变构抑制剂是选自SRX55，SRX56，SRX60，SRX61，SRX62，SRX63，SRX64，SRX65和SRX66的肽。
14.权利要求10的方法，其中所述变构增强剂是选自SRX64，SRX67，SRX68，SRX69，SRX72和SRX73的肽。
15.下式的化合物：
其中：i)n是氨基酸残基的数量，其是在范围3-8中的整数；ii)组成氨基酸是独立选择的天然或非天然氨基酸的单一对映体；iii)R2和R3独立地选自氢、低级烷基、支链烷基、羟烷基、环烷基、杂环、芳基、杂芳基、酰基、取代或未取代的苯甲酰基、烷基或芳基磺酰基(例如甲磺酰基或甲苯磺酰基)和氨基甲酰基(例如BOC)；iv)R1选自-OH和-NR4-R5；v)R4和R5独立地选自氢、低级烷基、芳基、环烷基、芳族杂环、吡啶、四唑、烷氧基、环烷氧基；可选择地，R4和R5被连接作为杂环例如哌啶；吡咯烷；吗啉；哌嗪；经取代的杂环例如4-甲基哌嗪；或稠杂环例如二氢喹啉或二氢吲哚以及S1、S2和Sn是侧链。
16.权利要求15的化合物，其还包含带负电的极性基团。
17.权利要求16的化合物，其中所述带负电的极性基团选自掺入所述侧链S1、S2或Sn中的O-磷酸盐、O-硫酸盐、5-O-和5-N-四唑的至少一种。
18.权利要求15的化合物，其中选自S1、S2和Sn的所述侧链包含磷酸丝氨酸。
19.权利要求15的化合物，其中所述侧链S1包括-CH2-NH-四唑。
20.权利要求12的化合物，其还包含甘氨酸C-末端。
21.权利要求15的化合物，其中所述化合物选自Val-Tyr-Val-Arg-Phe-Trp,β-Ala-Phe(3-CH2NH2)-Val-D-Ser(p)-Phe-Trp,Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Asp(NHCH2Ph)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Gly(CH2CH2环己基)-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Hph-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Trp(3-Me)-Ser-Ser-Ser(p),Val-Leu-Glu-Leu-Tyr-Trp,Leu-Asp-Leu-Phe-Phe-Ser,Ile-Leu-Asp-Leu-Ser-Tyr,Ac-Trp-Ser-Ser(p),Ac-Trp-Ala-Ser(p),Ac-Trp(5-F)-Ala-Ser(p)-吗啉,Thr-Leu-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(p),Ac-Tyr-Trp-Gly,Phe(4-Ph)-Ala-Ser(p)-吗啉。
22.权利要求15的化合物，其中所述化合物被配制为药物组合物。
23.权利要求22的化合物，其中所述药物组合物还包含制药药物。
24.权利要求23的化合物，其中所述制药药物选自他汀类药物、心血管药、代谢药和抗高血压药。
25.权利要求23的化合物，其中所述制药药物选自依折麦布、苯磺酸氨氯地平、西他列汀、二甲双胍、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。
26.权利要求23的化合物，其中所述药物组合物被配制为选自下列的形式：片剂，液体，凝胶，胶囊，囊剂，微粒，脂质体，纳米颗粒，盐，透皮贴剂，软膏，洗剂，乳膏，凝胶，滴剂，条剂，栓剂，喷雾剂和粉剂。
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