JP6031121B2

JP6031121B2 - 非アシル化グレリンを使用したグレリンレベル及びグレリン／非アシル化グレリン比の調節

Info

Publication number: JP6031121B2
Application number: JP2014546665A
Authority: JP
Inventors: デルレリー，アートヤンファン; アブリバト，ティエリー
Original assignee: アリゼファーマエスアーエス
Priority date: 2011-12-15
Filing date: 2012-12-14
Publication date: 2016-11-24
Anticipated expiration: 2032-12-14
Also published as: US20140336109A1; US20130157936A1; PT2790721T; CY1121296T1; PL2790721T3; EP2790721B1; RS58237B1; EP2790721B8; SI2790721T1; US9550821B2; ES2705499T3; EP2790721A1; DK2790721T3; HRP20190062T1; LT2790721T; WO2013088241A1; JP2015501832A; HUE042102T2; CA2857276A1; TR201900438T4

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2011年12月15日出願の米国仮特許出願第61/576,217号の利益及び優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本発明は、対象においてグレリンレベル及び/又はグレリン/非アシル化グレリン比を調節するための非アシル化グレリン、その断片及び/又は類似体の使用であって、そのような調節が前記対象に有益である使用に関する。本発明は、対象においてグレリンレベル及び/又はグレリン/非アシル化グレリン比を調節する非アシル化グレリン、その断片及び/又は類似体を含む組成物であって、そのような調節が前記対象に有益である組成物にも関する。本発明はさらに、対象が非アシル化グレリンの投与に応答する及び/又はそれから利益を得る可能性を決定するためのバイオマーカーとしてのグレリンレベル及び/又はグレリン/非アシル化グレリン比の使用にも関する。

グレリン(「アシル化グレリン」とも呼ばれる又は「AG」と略記される)は28アミノ酸ペプチドであり、ラット胃から精製及び同定され、Ser3残基上のオクタノイル修飾の存在により特徴付けられる(参考文献1)。グレリンのアシル化は酵素グレリンO-アシルトランスフェラーゼ(GOAT)により触媒される。GOATの大部分が胃及び腸において発現される。グレリンは、成長ホルモン(GH)分泌促進物質受容体(GHSR-1a)の内在性リガンドである(参考文献2、3)。グレリンは現在ではほとんどが、食物摂取を刺激しエネルギー消費を調節する強力な食欲促進因子と認識されている(参考文献4、5及び6)。周辺レベルでは、グレリンはグルコース及び脂質代謝を制御するその主要な生理作用をおそらく発揮する(参考文献7)。実際、グレリンは糖尿病誘発作用を有し(参考文献8)、グルコース刺激インスリン分泌を抑制し、耐糖能を悪化させる(参考文献9)。

したがって、上昇した血漿グレリンは、糖尿病及び肥満などの代謝及び成長のある種の障害に関連がある。上昇した血漿グレリンレベルは、プラダー・ウィリー症候群(PWS)のある成人及び児童の間でも実証されてきた(参考文献10及び11)。PWSは、GH欠乏の大半の患者に関連する遺伝的肥満症候群である。PWSの児童は急激な体重増加を猛烈な食欲とともに示す。PWSへのグレリンの関与に関する研究により、PWSにおいて観察される過食は上昇したグレリンレベルと正の相関が認められる顕著な論理的根拠が与えられており、グレリンの公知の食欲促進効果と一致している(参考文献12)。

非アシル化グレリン(「デスアシルグレリン」とも呼ばれる又は「UAG」と略記される)はグレリンの非アシル化形態である。血漿及び組織中のその濃度はグレリンと比べると高い。UAGは、唯一知られているグレリン受容体GHSR-1aに生理的濃度では結合することができずGH分泌に対して生理的効果を及ぼさないために、長い間生理的役割のない産物と考えられてきた(参考文献15)。しかし、UAGは、特に代謝レベルでは生物学的に活性なペプチドであり、その投与は食物摂取を減少させ胃内容排出を遅らせることにより負のエネルギー収支を誘導することが明らかにされている(参考文献16)。マウスにおいてUAGが過剰発現されると、脂肪蓄積が減少し、インスリン感受性及び耐糖能が増加する(参考文献16及び17)。

UAGは、健康な志願者に同時に投与されると、グレリンの高血糖効果を防ぐことが明らかにされており、特に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第7,825,090号を参照されたい。この最初の所見に続いてUAGの抗糖尿病誘発潜在性に関する報告がいくつか見られた(参考文献18、19、30、31及び32)。

インビトロ、インビボ及び臨床証拠は、UAGが健康な志願者及びGH欠損患者においてグレリンの糖尿病誘発効果を妨げることを示している(参考文献18及び19)。UAGはヒト肝細胞による基礎グルコース分泌とグレリン誘導グルコース分泌の両方を阻害する(参考文献31)。ラットでは、UAGはグルコースに対する門脈インスリン応答を増強し(参考文献32)、UAGを過剰発現しているトランスジェニックマウスにおいて観察されるように、脂肪沈着及びトリグリセリドレベルを減少させる(参考文献16)。インビトロでは、UAGはインスリノーマ細胞からのインスリン分泌を刺激し(参考文献32)、ベータ細胞の増殖を促しベータ細胞のアポトーシスを阻害する(参考文献33)。

UAG、その断片及び類似体の抗糖尿病誘発効果及びグレリン拮抗効果は、米国特許第7,485,620号、米国特許第8,222,217号、米国特許第8,318,664号及びWO 2008/145749に報告されており、それらはすべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

循環血管形成細胞(CAC)に関する最近の実験により、UAGは2型糖尿病患者において損なわれることが分かっている血管リモデリングプロセスに有益な影響を与えることが示されている。CACに対するUAGの効果は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2010/0016226号及びWO 2009/150214において報告されている。

肥満マウス及びヒトは、正常体重対象よりも低いUAGレベルを示すことが報告されており、肥満は相対的UAG欠乏と相関している可能性があることを示している(参考文献34、35及び21)。インスリン抵抗性肥満対象は、インスリン感受性肥満対象と比べた場合、AG/UAG比が上昇していることが観察されてきた(参考文献20及び22)。

グレリンを標的にする処置及びGHS-R(すなわち、グレリンアンタゴニスト)は、肥満並びにグレリンと関連する他の状態、障害及び疾患と戦うのに魅力的な薬理学的手段として提唱されてきた。いくつかのGHS-Rリガンド及び抗肥満ワクチンが提案されている(参考文献24)。グレリン、グレリン鏡像異性体に対する抗体及びグレリンアシルトランスフェラーゼ(GOAT)の阻害を誘導する他の薬理学的アプローチ(参考文献25)が調査されたが、有効性の欠如、非選択性及び持続する体重減少の欠如により、これらの薬理学的アプローチはまだ市場に届いていない(参考文献26)。

したがって、対象において循環グレリンレベル及び/又は循環グレリン/非アシル化グレリン比を調節する効率的でより直接的な方法の必要性が当技術分野には存在しており、そのような調節は、対象にとって、並びにグレリンレベル及びグレリン/非アシル化グレリン比の調節から利益を得ることができる対象を同定するより効率的な方法に有益である。

一態様によれば、本発明は、対象においてグレリンレベルを減少させるための方法であって、対象に有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。

別の態様によれば、本発明は、対象においてグレリンレベル及びグレリン/非アシル化グレリン比を減少させるための方法であって、対象に有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。

別の態様によれば、本発明は、対象においてグレリンレベルに関連する症状を寛解させるための方法であって、対象に有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。

別の態様によれば、本発明は、対象においてグレリンレベル及びグレリン/非アシル化グレリン比に関連する症状を寛解させるための方法であって、対象に有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。

別の態様によれば、本発明は、対象において上昇したグレリンレベルにより引き起こされる状態を寛解させる及び/又は処置(治療)するための方法であって、前記状態を有する対象に有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。

別の態様によれば、本発明は、対象において上昇したグレリンレベル及び上昇したグレリン/非アシル化グレリン比により引き起こされる状態を寛解させる及び/又は処置するための方法であって、前記状態を有する対象に有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。

別の態様によれば、本発明は、食餌誘発性体重減少に続いて対象において体重増加を防ぐための方法であって、対象に有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。

別の態様によれば、本発明は、対象においてグレリンレベルを減少させるための有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩並びに薬学的に許容される希釈剤を含む医薬組成物を提供する。

別の態様によれば、本発明は、対象においてグレリンレベルに関連する症状を寛解するための有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩並びに薬学的に許容される希釈剤を含む医薬組成物を提供する。

別の態様によれば、本発明は、食餌誘発性体重減少に続いて対象において体重増加を防ぐための有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩並びに薬学的に許容される希釈剤を含む医薬組成物を提供する。

別の態様によれば、本発明は、対象においてグレリンレベルを減少させるための有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩並びに薬学的に許容される希釈剤の使用を提供する。

別の態様によれば、本発明は、対象においてグレリンレベルに関連する症状を寛解するための有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩並びに薬学的に許容される希釈剤の使用を提供する。

別の態様によれば、本発明は、食餌誘発性体重減少に続いて対象において体重増加を防ぐための有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩並びに薬学的に許容される希釈剤の使用を提供する。

別の態様によれば、本発明は、糖尿病、プラダー・ウィリー症候群、肥満、インスリン抵抗性又は過食を患っている対象の集団内で、前記集団内のどの対象が非アシル化グレリン、その断片又はその類似体の投与から利益を得やすいかをスクリーニングするための方法であって、前記集団の対象から循環グレリンのレベルを決定することと、循環グレリンの基準レベルに少なくとも一部基づいて循環グレリンのレベルを処理して循環グレリンのレベルが上昇しているかどうかを伝える情報を引き出すことと、対象が非アシル化グレリンの投与から利益を得やすいかを決定するために前記情報をレシピエントに伝達することとを含む方法を提供する。

別の態様によれば、本発明は、糖尿病、プラダー・ウィリー症候群、肥満、インスリン抵抗性又は過食を患っている対象の集団内で、どの対象が非アシル化グレリン、その断片又はその類似体の投与から利益を得やすいかをスクリーニングするための方法であって、前記集団の対象から循環グレリンのレベル及び循環グレリン/非アシル化グレリンの比を決定することと、循環グレリンの基準レベル及び循環グレリン/非アシル化グレリンの基準比に少なくとも一部基づいて循環グレリンのレベル及び循環グレリン/非アシル化グレリンの比を処理して循環グレリンのレベル及び循環グレリン/非アシル化グレリンの比が上昇しているかどうかを伝える情報を引き出すことと、対象が非アシル化グレリンの投与から利益を得やすいかを決定するために前記情報をレシピエントに伝達することとを含む方法を提供する。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）対象においてグレリンレベルを減少させるための方法であって、有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む、前記方法。
（２）グレリンレベルが循環グレリンレベルである、（１）に記載の方法。
（３）グレリンレベルが上昇したグレリンレベルである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）グレリンレベルが、対象における高血糖、インスリン抵抗性、減少した脂肪利用率、脂肪症、体重増加又はインスリン分泌の抑制のうちの少なくとも1つと関連している、（１）〜（３）のいずれか１に記載の方法。
（５）対象が2型糖尿病、高グレリン血症、インスリン抵抗性及びプラダー・ウィリー症候群に関連する肥満並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される状態を患っている、（１）〜（４）のいずれか１に記載の方法。
（６）対象において循環グレリン/非アシル化グレリン比を減少させるための、（１）〜（５）のいずれか１に記載の方法。
（７）循環グレリン/非アシル化グレリン比が上昇した循環グレリン/非アシル化グレリン比である、（６）に記載の方法。
（８）対象においてグレリンレベル及びグレリン/非アシル化グレリン比を減少させるための方法であって、有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む、前記方法。
（９）グレリン/非アシル化グレリン比が上昇したグレリン/非アシル化グレリン比である、（８）に記載の方法。
（１０）グレリン/非アシル化グレリン比が循環グレリン/非アシル化グレリン比である、（８）又は（９）に記載の方法。
（１１）グレリン/非アシル化グレリン比が、高血糖、インスリン抵抗性、減少した脂肪利用率、脂肪症、体重増加及びインスリン分泌の抑制のうちの少なくとも1つと関連している、（８）〜（１０）のいずれか１に記載の方法。
（１２）対象が2型糖尿病、高グレリン血症、インスリン抵抗性及びプラダー・ウィリー症候群に関連する肥満並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される状態を患っている、（８）〜（１１）のいずれか１に記載の方法。
（１３）対象においてグレリンレベルに関連する症状を寛解するための方法であって、有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む、前記方法。
（１４）グレリンレベルが上昇したグレリンレベルである、（１３）に記載の方法。
（１５）グレリンレベルが循環グレリンレベルである、（１３）又は（１４）に記載の方法。
（１６）グレリンレベルに関連する症状が、高血糖、インスリン抵抗性、減少した脂肪利用率、脂肪症、体重増加及びインスリン分泌の抑制のうちの少なくとも1つである、（１３）〜（１５）のいずれか１に記載の方法。
（１７）対象においてグレリンレベル及びグレリン/非アシル化グレリン比に関連する症状を寛解するための方法であって、有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む、前記方法。
（１８）グレリンレベルが上昇した循環グレリンレベルであり、グレリン/非アシル化グレリン比が上昇した循環グレリン/非アシル化グレリン比である、（１７）に記載の方法。
（１９）グレリンレベル及びグレリン/非アシル化グレリン比に関連している症状が、高血糖、インスリン抵抗性、減少した脂肪利用率、脂肪症、体重増加及びインスリン分泌の抑制のうちの少なくとも1つである、（１７）又は（１８）に記載の方法。
（２０）対象において上昇したグレリンレベルにより引き起こされる状態を寛解及び/又は処置するための方法であって、前記状態を有する対象に有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む、前記方法。
（２１）上昇したグレリンレベルが上昇した循環グレリンレベルである、（２０）に記載の方法。
（２２）状態が、2型糖尿病、高グレリン血症、インスリン抵抗性及びプラダー・ウィリー症候群に関連する肥満並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、（２０）又は（２１）に記載の方法。
（２３）対象において上昇したグレリンレベル及び上昇したグレリン/非アシル化グレリン比により引き起こされる状態を寛解及び/又は処置するための方法であって、前記状態を有する対象に有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む、前記方法。
（２４）上昇したグレリンレベル及び上昇したグレリン/非アシル化グレリン比が上昇した循環グレリンレベル及び上昇した循環グレリン/非アシル化グレリン比である、（２３）に記載の方法。
（２５）状態が、2型糖尿病、高グレリン血症、インスリン抵抗性及びプラダー・ウィリー症候群に関連する肥満並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、（２３）又は（２４）に記載の方法。
（２６）食餌誘発性体重減少に続いて対象において体重増加を防ぐための方法であって、有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む、前記方法。
（２７）非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩の投与がグレリンレベルを減少させる、（２６）に記載の方法。
（２８）非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩の投与がグレリン/非アシル化グレリン比を減少させる、（２６）又は（２７）に記載の方法。
（２９）非アシル化グレリンが配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有する、（１）〜（２８）のいずれか１に記載の方法。
（３０）非アシル化グレリン断片が配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含む、（１）〜（２８）のいずれか１に記載の方法。
（３１）非アシル化グレリン断片が配列番号６に記載される通りである、（１）〜（２８）のいずれか１に記載の方法。
（３２）非アシル化グレリン断片が配列番号６に記載される通りであり、リンカー部分を含む、（１）〜（２８）のいずれか１に記載の方法。
（３３）非アシル化グレリン断片が配列番号２５に記載される通りである、（１）〜（２８）のいずれか１に記載の方法。
（３４）前記有効量が約0.001μg/kgから約10μg/kgまでである、（１）〜（３３）のいずれか１に記載の方法。
（３５）前記有効量が約1μg/kgから約1mg/kgまでである、（１）〜（３３）のいずれか１に記載の方法。
（３６）前記非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩が静脈内、皮下、経皮、経口、頬側、舌下、経鼻及び吸入からなる群から選択される経路を通じて投与される、（１）〜（３５）のいずれか１に記載の方法。
（３７）対象がヒトである、（１）〜（３６）のいずれか１に記載の方法。
（３８）対象においてグレリンレベルを減少させるための有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩並びに薬学的に許容される希釈剤を含む医薬組成物。
（３９）対象においてグレリン/非アシル化グレリン比を減少させるための、（３８）に記載の医薬組成物。
（４０）対象においてグレリンレベルに関連する症状を寛解するための有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩並びに薬学的に許容される希釈剤を含む医薬組成物。
（４１）対象においてグレリン/非アシル化グレリン比に関連する症状を寛解するための、（４０）に記載の医薬組成物。
（４２）グレリンレベルが上昇したグレリンレベルである、（４０）に記載の医薬組成物。
（４３）グレリン/非アシル化グレリン比が上昇したグレリン/非アシル化グレリン比である、（４１）に記載の医薬組成物。
（４４）食餌誘発性体重減少に続いて対象において体重増加を防ぐための有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩並びに薬学的に許容される希釈剤を含む医薬組成物。
（４５）非アシル化グレリンが配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有する、（３８）〜（４４）のいずれか１に記載の医薬組成物。
（４６）非アシル化グレリン断片が配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含む、（３８）〜（４４）のいずれか１に記載の医薬組成物。
（４７）非アシル化グレリン断片が配列番号６に記載される通りである、（３８）〜（４４）のいずれか１に記載の医薬組成物。
（４８）非アシル化グレリン断片が配列番号６に記載される通りであり、リンカー部分を含む、（３８）〜（４４）のいずれか１に記載の医薬組成物。
（４９）非アシル化グレリン断片が配列番号２５に記載される通りである、（３８）〜（４４）のいずれか１に記載の医薬組成物。
（５０）前記有効量が約0.001μg/kgから約10μg/kgまでである、（３８）〜（４９）のいずれか１に記載の医薬組成物。
（５１）前記有効量が約1μg/kgから約1mg/kgまでである、（３８）〜（４９）のいずれか１に記載の医薬組成物。
（５２）前記非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩が静脈内、皮下、経皮、経口、頬側、舌下、経鼻及び吸入からなる群から選択される経路を通じて投与される、（３８）〜（５１）のいずれか１に記載の医薬組成物。
（５３）対象においてグレリンレベルを減少させるための有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩並びに薬学的に許容される希釈剤の使用。
（５４）グレリンレベルが上昇した循環グレリンレベルである、（５３）に記載の使用。
（５５）対象においてグレリン/非アシル化グレリン比を減少させるための、（５３）又は（５４）に記載の使用。
（５６）対象においてグレリンレベルに関連する症状を寛解するための有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩並びに薬学的に許容される希釈剤の使用。
（５７）対象においてグレリン/非アシル化グレリン比に関連する症状を寛解するための、（５６）に記載の使用。
（５８）食餌誘発性体重減少に続いて対象において体重増加を防ぐための有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩並びに薬学的に許容される希釈剤の使用。
（５９）糖尿病、プラダー・ウィリー症候群、肥満、インスリン抵抗性又は過食を患っている対象の集団内で、前記集団内のどの対象が非アシル化グレリン、その断片又はその類似体の投与から利益を得やすいかをスクリーニングするための方法であって、
前記集団の対象から循環グレリンのレベルを決定することと、
循環グレリンの基準レベルに少なくとも一部基づいて循環グレリンのレベルを処理して循環グレリンのレベルが上昇しているかどうかを伝える情報を引き出すことと、
対象が非アシル化グレリンの投与から利益を得やすいかを決定するために前記情報をレシピエントに伝達することと
を含む、前記方法。
（６０）糖尿病、プラダー・ウィリー症候群、肥満、インスリン抵抗性又は過食を患っている対象の集団内で、どの対象が非アシル化グレリン、その断片又はその類似体の投与から利益を得やすいかをスクリーニングするための方法であって、
前記集団の対象から循環グレリンのレベル及び循環グレリン/非アシル化グレリンの比を決定することと、
循環グレリンの基準レベル及び循環グレリン/非アシル化グレリンの基準比に少なくとも一部基づいて循環グレリンのレベル及び循環グレリン/非アシル化グレリンの比を処理して循環グレリンのレベル及び循環グレリン/非アシル化グレリンの比が上昇しているかどうかを伝える情報を引き出すことと、
対象が非アシル化グレリンの投与から利益を得やすいかを決定するために前記情報をレシピエントに伝達することと
を含む、前記方法。
（６１）治療的有効量の非アシル化グレリン、その断片、その類似体及び/又はその薬学的に許容される塩を非アシル化グレリンの投与から利益を得やすい対象に投与することをさらに含む、（５９）又は（６０）に記載の方法。
（６２）循環グレリンのレベルが循環グレリンの正常レベルを超えている場合には、循環グレリンのレベルは上昇している、（５９）〜（６１）のいずれか１に記載の方法。
（６３）循環グレリン/非アシル化グレリンの比が循環グレリン/非アシル化グレリンの正常比を超えている場合には、循環グレリン/非アシル化グレリンの比は上昇している、（６０）〜（６２）のいずれか１に記載の方法。
（６４）集団の対象が2型糖尿病を患っている、（５９）〜（６３）のいずれか１に記載の方法。

図1は本発明の一実施形態による2型糖尿病(T2DM)対象を含む研究プロトコールの略図である。SBMとは標準朝食食事のことである。図2A及び2Bは、T2DM対象におけるAG血清レベルに対するUAG注入の効果を示すグラフである。図2Aでは、pg/mlでのAG血清レベルは、SBM前及び1時間後のプラセボ又はUAG投与に続いて測定された。図2Bでは、pg/mlでのUAG血清レベルは、SBM前及び1時間後のプラセボ又はUAG投与に続いて測定された。図3A及び3Bは、連続グルコースモニター装置(CGMS(登録商標)iPro(商標)Continuous Glucose Recorder、Medtronic trading、The Netherlands)を用いて測定された、T2DM対象における平均食後グルコースレベルを示すグラフである。図3AはSBM後並びにプラセボ、UAG 3mcg/kg/h及びUAG 10mcg/kg/h注入に続く平均絶対グルコースレベルを示している。反復測定ANOVA p<0.0001;ボンフェローニ多重比較プラセボ対3mcg NS;プラセボ対10 mcg p<0.001; 3mcg対10 mcg p<0.001。図3Bは、前記3つの処置群についての平均t0〜t180グルコースレベルを示している。図4A及び4Bは、T2DM対象における平均食後グルコースレベルを示すグラフである。図4Aはプラセボ、UAG 3mcg/kg/h及びUAG 10mcg/kg/h注入に続く食事前ベースラインからのグルコースレベルの変化を示している。反復測定ANOVA p<0.0001;ボンフェローニ多重比較プラセボ対3mcg p<0.001;プラセボ対10 mcg p<0.001; 3mcg対10 mcg p<0.05。図4Bは、前記3つの処置群についての平均t0〜t180グルコースレベルを示している。図5A及び5Bは、プラセボ、UAG 3mcg/kg/h及びUAG 10mcg/kg/h注入に続く8件の研究対象におけるSBM後のピーク血漿グルコースレベルを示すグラフである。ウィルコクソンマッチドペア符号付順位検定;*:10mcg対プラセボ、p<0.05。図6A、6B及び6Cは、空腹時基底AG及び/又はUAG濃度とUAG投与に対する血糖応答の間の相関の存在を示すグラフである。図6Aのグラフは、空腹時基底AGレベルとSBM後のピークグルコースレベルの(UAG対プラセボ投与に続く)変化の間の相関を示している。図6Bのグラフは、iPro連続グルコース測定を使用した、空腹時基底AGレベルとSBM後のAUCグルコースレベルの(UAG対プラセボ投与に続く)変化の間の相関を示している。図6Cのグラフは、iPro連続グルコース測定を使用した、UAGレベルに対する空腹時基底AGの比とSBM後のAUCグルコースレベルの(UAG対プラセボ投与に続く)変化の間の相関を示している。図６Ａの続きである。図６Ｂの続きである。図7Aは、本発明のさらなる実施形態によるT2DM対象における高インスリン性正常血糖クランプ研究プロトコールの略図である。図7Bは、図7Aにおいて図式化されたプロトコール中の、インスリン感受性を反映するM指標に対するUAGの効果を示すグラフである。ベースラインからのM指標の変化は、プラセボ及びUAG注入に続いて測定された。*:p<0.05、片側マンホイットニー検定。図7C及び7Dは、T2DM対象における基底AGレベルに対する短いUAG注入期間の効果を示すグラフである。図7Cは、UAG注入前及び2.5時間のUAG注入に続く循環AGレベルを示している。図7Dは、2.5時間のUAG注入後のベースラインからのAG変化を示している(12:00の[AG]レベル-9:30の[AG]レベル)。両側ウィルコクソンマッチドペア符号付順位検定;*:p<0.05;**:p<0.01。図７Ａの続きである。図７Ｂの続きである。図8は、示された研究期間にわたるAG誘発性食物摂取に対する環状UAG断片(6-13)の効果を示すグラフである。*p<0.001:クラスカルワリス一元配置ANOVA。群間の差はダン検定により評価された。

本発明は、T2DMの対象においてUAGを投与すると循環AGのレベルが減少するという本発明者らの知見から生じるが、これに限定されない。本発明は、基底AGのレベルが高くなるほど、AGレベルを減少させること、並びに、例えば、肥満、高血糖、インスリン抵抗性、脂肪沈着、過食及びインスリン抵抗性に関連する肥満などのAGレベルに関連する有害作用を減少させることに対するUAGの効果は、それだけ重要になるという知見からさらに生じる。

本発明者らは、循環AG/UAG比が高くなるほど、そのような比を減少させるのに、及びAG/UAG比に関連する有害作用を抑制するのにUAGはそれだけ効率的であることも見出した。

この点から見て、循環AGレベル及び循環AG/UAG比はそれぞれを、対象がUAGの投与に応答する及び/又はそれから利益を得る可能性を同定するためのバイオマーカーとして使用しうる。したがって、これらのバイオマーカーを、肥満、糖尿病、インスリン抵抗性、プラダー・ウィリー、過食及び高グレリン血症(hyperghrelinemia)などの、しかしこれらに限定されない状態を患っている対象の集団内で、前記対象のうちのどれがUAGの投与に応答する及び/又はそれから利益を得る可能性があるかを同定するために使用しうる。対象において、循環AGのレベルが高くなるほど及び/又は循環AG/UAG比が高くなるほど、この対象はUAGの投与に応答する及び/又はそれから利益を得る可能性がそれだけ高くなる。

今日まで、研究によりUAGは、例えば、グルコース及びインスリン代謝へのグレリンの末梢作用を相殺することが報告されている。本研究は、UAGの投与が循環グレリンレベルも抑制するという最初の証拠を提供し、AGレベルにより及び/又はAG/UAG比により影響を受ける代謝パラメータを改善するのに循環AGのレベルとUAGの有効性の間に相関が存在するという最初の証拠を提供する。

そこに提示されている驚くべき実証により、AGレベル及び/又はAG/UAG比から生じる状態の促進、寛解及び/又は処置を含むように非アシル化グレリンを使用することができる適用及び適応を拡大することが可能になっている。

これらの実証により、上昇したAGレベル及び/又は上昇したAG/UAG比から生じる状態の促進、寛解及び/又は処置を含むように非アシル化グレリンを使用することができる適用及び適応を拡大することも可能になっている。

本明細書で使用されるように、語句「上昇したAGレベル(複数可)」とは、正常な及び/又は健康な対象において観察されるAGレベルよりも高い循環AGのレベルのことである。いくつかの実装において、語句「上昇したAGレベル(複数可)」とは、AGに関連する1つ以上の有害な生理的症状が対象において現れる、持続する又は悪化する循環AGのレベルのことである。

本明細書で使用されるように、語句「上昇したAG/UAG比」とは、正常な及び/又は健康な対象において観察されるAG/UAG比よりも高い循環AG/UAGの比のことである。いくつかの実装において、語句「上昇したAG/UAG比」とは、AG/UAG比に関連する1つ以上の有害な生理的症状が対象において現れる又は持続する又は悪化する循環AG/UAGの比のことである。

いくつかの要因が正常対象における循環グレリン及び非アシル化グレリンのレベルに影響を与えることがあることは理解されるべきである。そのような要因の例には、性別、年齢、健康状態(fitness)、肥満度指数(BMI)、食習慣などが含まれるがこれらに限定されない。

本明細書で使用されるように、語句「グレリンの阻害」とは、グレリンレベルの減少及び/又はその生物活性の障害により起こるグレリンの生物活性の障害のことである。

当業者であれば対象におけるAG及びUAGレベルを測定するための技法及びアッセイを熟知している。そのような技法には、4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオライド塩酸塩(AEBSF)などのプロテアーゼ阻害剤又はプロテアーゼ阻害剤の他のカクテルの使用を伴う技法が含まれうる。

この実施形態の一実装では、肥満対象は、前記対象についての正常な体重よりもおよそ20%、およそ25%、およそ30%又はそれよりも大きい割合で多い体重を有することを特徴とする。正常な体重は、AGレベルが正常であった時及び/若しくはAG/UAG比が正常であった時などの過去の時点での前記対象の体重と比べることにより、又は類似する年齢及び/若しくは状態の他の対象の平均値と比べた場合のAGレベル並びに/又はAG/UAG比を比べることにより決定しうる。

この実施形態の別の実装では、体重過多の対象は、前記対象についての正常な体重よりもおよそ5%からおよそ20%多い体重を有することを特徴とする。正常な体重は、AGレベルが正常であった時及び/若しくはAG/UAG比が正常であった時などの過去の時点での前記対象の体重と比べることにより、又は類似する年齢及び/若しくは状態の他の対象の平均値と比べた場合のAGレベル並びに/又はAG/UAG比を比べることにより決定しうる。

この実施形態の別の実装では、正常な対象は、前記対象についての正常な体重よりもおよそ5%からおよそ5%少ない体重を有することを特徴とする。正常な体重は、AGレベルが正常であった時及び/若しくはAG/UAG比が正常であった時などの過去の時点での前記対象の体重と比べることにより、又は類似する年齢及び/若しくは状態の他の対象の平均値と比べた場合のAGレベル並びに/又はAG/UAG比を比べることにより決定しうる。正常な体重の対象は、19〜22のおおよその範囲のBMIを有しうる。

他の方法で定義されていなければ、本明細書に使用されるすべての専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。

i)非アシル化グレリン、その断片及びその類似体
用語「非アシル化グレリン」、「デスアシルグレリン」及び略字「UAG」は、配列番号1に明示されているアミノ酸配列を有するペプチドを意味することが意図されており、そのアミノ酸配列は
Gly-Ser-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln-Arg-Lys-Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-Pro-Ala-Lys-Leu-Gln-Pro-Arg(配列番号1)
である。

非アシル化グレリンはUAG(1〜28)と呼ばれることもある。

天然に存在するUAGの変種には、コードグレリン遺伝子若しくはその対立遺伝子のヌクレオチド配列中の別々の変化又は転写RNAの選択的スプライシングにより生じる1つ以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失を含有するペプチドが含まれる。前記変化は非アシル化グレリン変種の特性、薬理学的及び生物学的特徴に実質的な影響を与えないことは理解されている。それらのペプチドは塩の形態である場合もある。特に前記分子の酸性の機能は、トリフルオロ酢酸塩又は酢酸塩などの、しかしこれらに限定されないその塩誘導体により置き換えられうる。

「ペプチド」「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、長さ又は翻訳後修飾(例えば、グリコシル化又はリン酸化)、又は化学的修飾、又はD-Tyr、オルニチン、アミノアジピン酸などの非天然の若しくは珍しいアミノ酸を含有するペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質とは無関係に、任意のアミノ酸鎖を意味する。前記用語は本出願においては互換的に使用されている。

語句「断片」及び「その断片」とは、UAGなどのペプチドのアミノ酸断片のことである。

UAGの断片は配列番号1に描かれているアミノ酸配列よりも短く、したがって28アミノ酸残基よりも短い。したがって、UAGの断片は27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5又は4アミノ酸残基長である場合もある。例えば、UAGの断片は下の表1に描かれているアミノ酸配列を有する場合がある。

UAGの生物活性を保つ他のいかなるUAG断片も本発明により包含される。いくつかのUAG断片は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第8,222,217号、米国特許第8,318,664号及びWO/2008/145749に報告されており、UAGの生物活性を保持する最も小さなUAG断片は配列番号11として本明細書に描かれているUAG(9〜12)であることが実証されている。

一実施形態では、UAG、その断片又はその類似体などのポリペプチドは、「精製された」、「単離された」又は「実質的に純粋な」形態で使用される。ポリペプチドは、それに天然に付随する成分から分離されている場合は、「精製されている」、「単離されている」又は「実質的に純粋である」。典型的には、化合物は、それが試料中の全材料の少なくとも60重量%、65重量%、70重量%、75重量%、80重量%、85重量%、90重量%、95重量%、96重量%、97重量%、98重量%、又は99重量%である場合には、実質的に純粋である。

語句「非アシル化グレリンの類似体」、「非アシル化グレリンの断片の類似体」及び「その類似体」とは、AGを調節する、AGを阻害する、循環AGレベルを減少させる、循環している上昇したAGレベルを減少させる、循環AG/UAG比を減少させる、循環している上昇したAG/UAG比を減少させる、AGレベル及び/又はAG/UAGレベルにより誘導される症状を寛解する、循環AG及び/又は循環AG/UAG比に関連する状態を促進する、予防する及び/又は処置する、並びに上昇した循環AG及び/又は上昇した循環AG/UAG比に関連する状態を促進する、予防する及び/又は処置するなどの、しかしこれらに限定されない、本出願に記載されるUAGの生物学的機能において特にUAGに置き換えることができるUAG又はその断片の構造的及び機能的類似体の両方のことである。UAGのいくつかの類似体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第8,222,217号、米国特許第8,318,664号及びWO/2008/145749に報告されている。

単純な構造的類似体は、配列番号1に記載されるUAGとの相同性又はその任意の断片との相同性を示すペプチドを含む。AGの類似体の例は、胃に存在することが明らかにされているグレリン-28のアイソフォーム、すなわちデスGln-14グレリン(n-オクタン酸によるセリン3修飾を有する27アミノ酸ペプチド)である。前記類似体は、類似する結合親和性でGHSR-1aに結合し、クローン細胞においてCa²⁺流動を誘発し、グレリン-28と類似する効力でGH分泌を誘導する点でAGと機能的に同一である。UAGも、UAGと機能的に同一であるデスGln-14 UAGを有すると予測される。

UAGの好ましい類似体及びUAGの断片の好ましい類似体は、天然のUAG配列とは、又は天然のUAG断片配列とは保存的アミノ酸置換で異なる類似体、すなわち残基を類似する特徴の別の残基で置換する類似体である。典型的置換には、Ala、Val、LeuとIle間の、SerとThr間の、酸性残基AspとGlu間の、AsnとGln間の、塩基性残基LysとArg間の、及び芳香族残基PheとTyr間の置換が含まれる。特に好ましいのは、いくつかの、例えば、5〜10、1〜5、又は1〜2しかしこれらの数に限定されないアミノ酸がいかなる組合せでも置換されている、欠失している、又は付加されている類似体である。例えば、UAGの類似体は、UAGとは1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10アミノ酸置換(好ましくは保存的置換)、欠失若しくは付加、又はその組合せで配列が異なっていてもよい。

その全長にわたり本明細書に記載されるアミノ酸配列と少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列相同性又は配列同一性を有し、UAGの代謝的効果又は生物活性のうちの少なくとも1つを共有する本発明のペプチドの類似体が本明細書で提供される。当業者であれば非アシル化グレリンの類似体配列又は非アシル化グレリンの断片の類似体配列を容易に同定すると考えられる。

UAGの類似体の例は下の表2に提供されている。

UAGの類似体又はその断片の類似体は、例えば、アラニンスキャンにより、D-アミノ酸での若しくは合成アミノ酸での置換により又はペプチドの環状化により得られる類似体である。UAGの又はその断片の類似体は、天然にコードされていないアミノ酸を含む場合があり、天然にコードされていないアミノ酸とは、一般的なアミノ酸若しくはピロールリジン若しくはセレノシステインのうちの1つではないアミノ酸、又は天然にコードされるアミノ酸(20の一般的なアミノ酸又はピロールリジン及びセレノシステインを含むが、これらに限定されない)の修飾(例えば、翻訳後修飾)により生じるが、それ自体は翻訳複合体により伸長するポリペプチド鎖に組み込まれないアミノ酸のことである。そのような天然には存在しないアミノ酸の例には、N-アセチルグルコサミニル-L-セリン、N-アセチルグルコサミニル-L-スレオニン及びO-ホスホチロシンが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用されるように、用語「修飾された」とは、ポリペプチドの長さ、ポリペプチドのアミノ酸配列、化学構造、同時翻訳修飾、又は翻訳後修飾への変化などの所与のポリペプチドに加えられる任意の変化のことである。

用語「翻訳後修飾」とは、ポリペプチド鎖に組み込まれた後にアミノ酸に起こる天然又は非天然アミノ酸の任意の修飾のことである。前記用語は、例としてのみ、同時翻訳インビボ修飾、同時翻訳インビトロ修飾(例えば、無細胞翻訳系において)、翻訳後インビボ修飾、及び翻訳後インビトロ修飾を包含する。翻訳後修飾の例には、グリコシル化、アセチル化、アシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、ペグ化、塩、アミド又はエステル、特にC-末端エステルの付加、及び本発明のペプチドのN-アシル誘導体であるが、これらに限定されない。翻訳後修飾の種類は周知である。

本発明によるある種のペプチドは、N-又はC-末端が直接、又はリンカー部分の挿入を通じてヘッドトゥーテール(head-to-tail)で連結されるように、環状形態であってもよく、そのような部分はそれ自体一般的には、非環状形態に関してペプチドの三次元構造を変更するのを回避するような様式で骨格を結合するために必要に応じて1つ以上のアミノ酸残基を含む。そのようなペプチド誘導体は非環状化ペプチドと比べて改良された安定性及び生物学的利用能を有しうる。

本発明の環状ペプチドの例には、環状UAG(1-14)、環状UAG(1-18)、環状UAG(17-28)、環状UAG(6-13)、環状UAG(8-13)、環状UAG(8-12)、環状UAG(8-11)、環状UAG(9-12)及び環状UAG(9-11)並びに表2に同定されているペプチドが含まれる。

ペプチドを環状化するための方法は当技術分野では周知であり、例えば、2つの側鎖官能基の間でのジスルフィド結合形成、1つの側鎖官能基と骨格α-アミノ若しくはカルボキシル官能基の間でのアミド若しくはエステル結合形成、2つの側鎖官能基の間でのアミド若しくはエステル結合形成、又は骨格α-アミノ及びカルボキシル官能基の間でのアミド結合形成により実現しうる。これらの環状化反応は従来溶液中高希釈度で実施されてきた。環状化は一般にペプチドが樹脂に結合している間に実現される。固体支持体上で環状ペプチドを合成する最も一般的方法の1つは、アミノ酸の側鎖を樹脂に結合させることによる。適した保護戦略を使用して、C-及びN-末端は選択的に脱保護され、鎖集合後樹脂上で環状化することができる。この戦略は広く使用されており、tert-ブチルオキシカルボニル(Boc)又は9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)プロトコールと適合性がある。しかし、前記戦略は、固体支持体に結合する適切な側鎖官能性を含有するペプチドに制限される。いくつかのアプローチを使用して、環状ペプチドの効率的合成を達成しうる。環状ペプチドを合成するための1つの手順は、樹脂からの同時切断を用いた環状化に基づいている。適切なペプチド配列が固相合成により樹脂上に集合される又は線形配列が樹脂に付加された後に、脱保護されたアミノ基はそのアンカリング活性連鎖(its anchoring active linkage)と反応して保護された環状ペプチドを生成することができる。一般に、最終脱保護ステップが標的環状ペプチドを産出するのに必要とされる。

環状化の一形態であるラクタム化を実施して、Fmoc合成を使用してラクタム架橋を形成することができ、ベータエステル(又はグルタミン酸ではガンマエステル)においてアリルエステルで保護されたアスパラギン酸(又はグルタミン酸)及びN-εにおいてアリルオキシカルバミン酸で保護されたリジンなどの、しかしこれらに限定されない、側鎖に異なる保護基を有するアミノ酸を導入しうる。ペプチドのN-末端がFmoc、Boc又はAllocとは異なる他の保護基で保護されている合成の終了時、アスパラギン酸及びリジンのアリル及びアロック保護基は、例えば、パラジウム(0)で脱保護され、続いてPyAOP(7-アザベンゾトリアゾル-1-イルオキシトリス(ピロリジノ)ホスホニウム-ヘキサフルオロホスフェート)を使用して環状化され、ラクタム架橋を生成することができる。

別段の指示がない限り、本明細書で名前が挙げられるアミノ酸はL-型を指す。当技術分野でよく認識されている略字を使用して、左旋性アミノ酸(L-アミノ酸又はL又はL-型)及び右旋性アミノ酸(D-アミノ酸又はD又はD-型)、アラニン(Ala又はA)、アルギニン(Arg又はR)、アスパラギン(Asn又はN)、アスパラギン酸(Asp又はD)、システイン(Cys又はC)、グルタミン酸(Glu又はE)、グルタミン(Gln又はQ)、グリシン(Gly又はG)、ヒスチジン(His又はH)、イソロイシン(Ile又はI)、ロイシン(Leu又はL)、リジン(Lys又はK)、メチオニン(Met又はM)、フェニルアラニン(Phe又はF)、プロリン(Pro又はP)、セリン(Ser又はS)、スレオニン(Thr又はT)、トリプトファン(Trp又はW)、チロシン(Tyr又はY)並びにバリン(Val又はV)を含むアミノ酸を記載することになる。天然のペプチド配列内のL-アミノ酸残基を、タンパク質中に一般的に見られる20のL-アミノ酸のいずれか1つに或いは対応するD-アミノ酸、4-ヒドロキシプロリン若しくはヒドロキシリジンなどの、しかしこれらに限定されない希アミノ酸、又はP-アラニン若しくはホモセリンなどの非タンパク質アミノ酸のいずれか1つに変更してもよい。

UAGペプチド又はその断片若しくは類似体は融合タンパク質の一部であってもよい。例えば、分泌若しくはリーダー配列を含有するシグナル配列などの追加のアミノ酸配列、プロ配列、複数のヒスチジン残基(HA-タグ)などの特に精製に役立つリンカー配列、又は組換え産生中の安定性のための追加の配列を含むことが有利である場合が多い。追加のアミノ酸又は配列はポリペプチドのN末端で若しくはC末端で連結されてもよいし、又はN-末端とC-末端の間に位置する配列の任意のアミノ酸に連結されて、リンカー部分を有するUAGペプチド又はその断片若しくは類似体を生じてもよい。

UAG若しくはその断片の他の任意の類似体又は完全長UAGの生物活性を保っている他の任意の修飾されたUAG若しくはその断片は本発明により包含されている。

UAG又はその断片の機能的及び構造的類似体を与えるのに使用される一般的方法及び合成戦略は一般的に使用されており、当技術分野では周知であり、「Peptide synthesis protocols」、M.W. Pennigton & B. M. Dunn.編Methods in Molecular Biology. Vol 35. Humana Press、NJ.、1994;「Solid phase peptide synthesis」by Stewart and Young、W. h Freeman & Co.、San Francisco、1969及びErickson and Merrifield;並びに「The Proteins」Vol. 2、255頁以下(Neurath and Hill編)、Academic Press、New York、1976などの出版物に記載されている。

本明細書で使用されるように、用語「相同性」とは、等価な生物活性を保持したままの2つのペプチド間の配列類似性のことである。相同性は、整列された配列中のそれぞれの位置を比べることにより決定することができる。アミノ酸配列間の相同性の程度は、配列により共有される位置での同一の又は適合するアミノ酸の数の関数であり、したがって、「相同配列」とは、相同性及び等価な機能又は生物活性を共有している配列のことである。パーセント相同性の評価は当業者には公知である。

ペプチドの相同性、同一性及び類似性を決定する方法は、公表されているコンピュータプログラムに成文化されている。2つの配列間の同一性及び類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法には、GCGプログラムパッケージ、BLASTP、BLASTN、及びFASTAが含まれるがこれらに限定されない。BLAST XプログラムはNCBI及び他の供給源から公表されている。周知のSmith Watermanアルゴリズムを使用して同一性を決定してもよい。

ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータには、以下のものが含まれる。

アルゴリズム:Needleman and Wunsch、J.Mol Biol.48:443〜453頁(1970)
比較マトリックス: BLOSSUM62 from Hentikoff and Hentikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915〜10919頁(1992)
ギャップペナルティー:12;ギャップ長ペナルティー:4。

これらのパラメータを用いた有用なプログラムは、Genetics Computer Group、Madison、Wisから「ギャップ」プログラムとして公開されている。上述のパラメータはアミノ酸配列比較のためのデフォルトパラメータである(エンドギャップについてペナルティーなしとともに)。

本発明のポリペプチドは、当技術分野で公知の任意の適切な様式で調製しうる。そのようなポリペプチドには、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え産生されたポリペプチド、合成的に産生されたポリペプチド、又はこれらの方法の組合せにより産生されるポリペプチドが含まれる。そのようなポリペプチドを調製するための手段及び方法は当技術分野では周知である。

本発明のある種の態様はUAGポリヌクレオチドを使用する。これらのポリヌクレオチドには、本出願において定義されるUAGポリペプチド、断片及び類似体をコードする単離されたポリヌクレオチドが含まれる。

本明細書で使用されるように、用語「ポリヌクレオチド」とは、複数のデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオシドサブユニットからなる分子のことである。ヌクレオシドサブユニット間の連鎖は、リン酸、ホスホン酸、ホスホロアミド酸、ホスホロチオエート、若しくは同類の物により、又はペプチド核酸(PNA)において利用されるペプチド型の連鎖などの、当技術分野において公知である非リン酸基により与えることができる。連結基は鏡像異性でも光学不活性でも可能である。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは2ヌクレオシドサブユニットから数百又は数千のヌクレオシドサブユニットまでの長さに及ぶことが可能である。オリゴヌクレオチドは好ましくは5から100サブユニット長であり、さらに好ましくは5から60サブユニット長であるが、ポリヌクレオチドの長さははるかに大きく(例えば、最大100)なることが可能である。ポリヌクレオチドはDNAとRNAのいずれでもよい。DNAは、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、細胞又は組織由来のcDNA、及び合成DNAのいずれの形態でもよい。さらに、本発明は、ある種の態様では、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、又はファージミドを含むベクターを使用する場合がある。

本発明のポリペプチドに関する語句「生物活性」若しくは「生物学的特性」、又は用語「活性」は、本明細書では互換的に使用され、本発明のポリペプチドの薬理学的、生物学的又は細胞性の能力のことであり、AGを調節する、AGを阻害する、循環AGレベルを減少させる、循環している上昇したAGレベルを減少させる、循環AG/UAG比を減少させる、循環している上昇したAG/UAG比を減少させる、AGレベル及び/又はAG/UAGレベルにより誘導される症状を寛解する、循環AG及び/又は循環AG/UAG比に関連する状態を促進する、予防する及び/又は処置する並びに上昇した循環AG及び/又は上昇した循環AG/UAG比に関連する状態を促進する、予防する及び/又は処置するなどの、しかしこれらに限定されない本出願に記載されるUAGの生物学的機能においてUAGを置き換える能力を含むがこれに限定されない。

ii)治療方法、使用及び組成物
一実施形態によれば、対象におけるグレリンレベルの調節及び/又はAG/UAG比の調節は、そのような調節が対象にとって有益な場合に望ましい。

別の実施形態によれば、本発明は対象においてAGレベルを減少させる及び/又はAG/UAG比を減少させるための方法を提供する。この実施形態のいくつかの実装では、対象は上昇したAGレベル及び/又は上昇したAG/UAG比を示し、AGレベルに関連する及び/又はAG/UAG比に関連する症状はこの対象において悪化している又は憎悪している。

これらの実施形態のいくつかの実装では、AGレベルとは循環AGレベルのことであり、AG/UAG比とは循環AG/UAG比のことである。この実施形態のいくつかのさらなる実装では、対象はAGレベルに関連する及び/又はAG/UAG比に関連する以下の症状、高血糖、インスリン抵抗性、低下した脂肪利用率(fat utilization)、脂肪症、増加した食物摂取、体重増加及びインスリン分泌の抑制のうちの1つ以上を示す。この実施形態のさらなる実装では、対象は上で定義される症状に関連する以下の状態、糖尿病(例えば、2型糖尿病)、プラダー・ウィリー症候群(PWS)、肥満、インスリン抵抗性に関連する肥満、過食及び高グレリン血症のうちの1つ以上を患っている。前記方法は、有効量のUAG、その断片、類似体、薬学的塩(pharmaceutical salt)及び/又はそれらの任意の組合せを対象に投与することを含む。

別の実施形態によれば、本発明は、対象においてAGレベルに関連する及び/又はAG/UAG比に関連する症状を寛解する及び/又は弱めるための方法を提供する。この実施形態のいくつかの実装では、対象は上昇したAGレベル及び/又は上昇したAG/UAG比を示し、AGレベルに関連する及び/又はAG/UAG比に関連する症状はこの対象において悪化している又は憎悪している。したがって、本発明は、そのような対象において上昇したAGレベルに関連する及び/又は上昇したAG/UAG比に関連する症状を寛解する及び/又は弱めるための方法も提供する。

上昇したAGレベルに関連する症状には、高血糖、インスリン抵抗性、低下した脂肪利用率、脂肪症、増加した食物摂取、体重増加及びインスリン分泌の抑制が含まれるがこれらに限定されない。上昇したAG/UAG比に関連する症状には、インスリン抵抗性が含まれるがこれに限定されない。これらの実施形態のいくつかの実装では、対象は上に定義される症状に関連する以下の状態、糖尿病(例えば、2型糖尿病)、プラダー・ウィリー症候群(PWS)、肥満、インスリン抵抗性に関連する肥満、過食及び高グレリン血症のうちの1つ以上を患っている。前記方法は、有効量のUAG、その断片、類似体、薬学的塩及び/又はそれらの任意の組合せを対象に投与することを含む。この実施形態のいくつかのさらなる実装では、AGレベルとは循環AGレベルのことであり、AG/UAG比とは循環AG/UAG比のことである。前記方法は、有効量のUAG、その断片、類似体、薬学的塩及び/又はそれらの任意の組合せを対象に投与することを含む。

さらに別の実施形態によれば、本発明はAGレベルに関連する及び/又はAG/UAG比に関連する状態、障害又は疾患を寛解及び/又は処置する方法を提供する。この実施形態のいくつかのさらなる実装では、AGレベルとは循環AGレベルのことであり、AG/UAG比とは循環AG/UAG比のことである。AGレベルに関連する状態、障害又は疾患には、糖尿病(例えば、2型糖尿病)、プラダー・ウィリー症候群(PWS)、肥満、インスリン抵抗性に関連する肥満、過食及び高グレリン血症が含まれるがこれらに限定されない。前記方法は、有効量のUAG、その断片、類似体、薬学的塩及び/又はそれらの任意の組合せを対象に投与することを含む。

本明細書で使用されるように、用語「高グレリン血症」とは、上昇した循環AGレベルにより及び/又は上昇した循環AG/UAG比により引き起こされる病態のことである。高グレリン血症を患っている対象は、高血糖、インスリン抵抗性、減少したインスリン分泌、低下した脂肪利用率、脂肪症、体重増加及び/又はそれらの組合せなどの、しかしこれらの限定されない症状を示す。

本発明のいくつかの実装では、これらの対象においてAGレベルが上昇するほど、上昇したAGレベルにより誘導される症状は、それだけ明白になり、これらの症状を寛解する及び/又は弱めるのに、UAG、その断片、類似体及び/又は薬学的塩は、それだけ効率的になる。

本発明のいくつかの他の実装では、これらの対象においてAG/UAG比が上昇するほど、上昇したAG/UAG比により誘導される症状は、それだけ明白になり、これらの症状を寛解する及び/又は弱めるのに、UAG、その断片、類似体及び/又は薬学的塩は、それだけ効率的になる。

さらに別の実施形態によれば、本発明は、AGの末梢作用を相殺するための、並びにAGレベルを減少させる、及びAGレベルにより誘導される症状を寛解する方法を提供する。

新しく、しかしまだ明らかにされていない状態、疾患及び障害をAGの減少及び/又はAG/UAG比の減少とともに寛解する、予防する及び/又は処置することができる限り、本発明の方法は、それらの状態、障害及び疾患に関して利用することができる。

これらの実施形態の一実装では、前記方法は、有効量のUAG又はUAGそれ自体と同じ潜在的治療効能を共有する本明細書で定義されるポリペプチドをそのような投与を必要とする対象に投与するステップを含む。そのようなポリペプチドは配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含む、又は、例えば、上の表に記載される配列などのその任意の断片若しくは任意の類似体を含む。

UAGの作用は、断片UAG(6-13)(配列番号6)、UAG(8-13)(配列番号7)、UAG(8-12)(配列番号8)、UAG(8-11)(配列番号12)、UAG(9-12)(配列番号11)及びUAG(9-11)(配列番号29)により保存されていることが以前明らかにされている。その全体が本明細書に組み込まれている米国特許第8,222,217号及び米国特許第8,318,664号は、これらの断片が、グルコース、インスリン及び脂質代謝に対するUAG完全長の活性を保持していることを明らかにしている。UAG(1-14)(配列番号3)の逆配列を有しUAG(14-1)(配列番号30)と名付けられているペプチドは、UAG断片を試験する実験において負の対照として使用された。UAG(8-11)(配列番号10)は、UAG活性を保持する最小のUAG断片であることが明らかにされた。本明細書に提供される結果は、例えば、UAG(6-13)(配列番号6)及び環状UAG(6-13)(配列番号25)などのUAG断片は、AGレベルを減少させAG/UAG比を減少させるUAGの能力を保持していることをさらに示している。

さらなる実施形態では、UAG、その断片及び/又は類似体を使用してプラダー・ウィリー症候群(PWS)に関連する上昇したAGレベルを減少させる。PWSを患っている人は、遅い発育、重症の肥満及び飽くことのない食欲を患っている。彼らの空腹感は強烈であり、過食の結果としての早期死亡を避けるためには食物需給の管理施行を必要とする場合が多い。これらの対象におけるAG濃度は正常よりも高い。過食と増加したAGレベルの間のこの相関は、AGの公知の食欲促進効果と一致している。本明細書にあるデータは、UAGの投与によりPWS対象における上昇したAGレベルを減少させることができることを実証している。本発明の方法を使用すれば、プラダー・ウィリー症候群を抱えた患者がそのグレリンレベルをもっと正常で/もっと健康なレベルにまで低下させ、その食欲を抑え、及び/又はこの障害の他の徴候を寛解するのに寄与することができる。AGのこのような減少は、食欲の減少及びPWSに関連する体脂肪量のそれに続く減少になると予測される。

本明細書で使用されるように、用語「過食」は過剰な空腹感及び口による固形食の異常な大量摂取のことである。過食状態は、例えば、第3脳室の神経節細胞腫を含む中枢神経系(CNS)障害、視床下部星状細胞腫(hypothalmic astrocytoma)、クライネ・レヴィン症候群、フレーリッヒ症候群、パーキンソン病、プラダー・ウィリー症候群を含む遺伝性障害、不安、大鬱病性障害、両極性障害の鬱期、季節性感情障害、及び総合失調症を含む主要な精神障害、デルタ-9テトラヒドロカンナビノール、抗鬱薬及び神経遮断薬を含む向精神薬、並びに睡眠時無呼吸を含む睡眠障害に関連して起こることがある。過食は、鬱、不安及び総合失調症などの精神障害と関連して起こることがある。いくつかの実施形態では、UAG、その断片及び/又は類似体を投与すれば、これらの状態に関連する過食を減少させうる。

本明細書で使用されるように、用語「処置(治療)」とは、治療処置並びに予防対策の両方のことである。処置が必要な人々には、既に障害、疾患又は状態を抱えている人々、並びに疾患、障害又は状態を防ぐべきである人々が含まれる。処置が必要な人々は、障害、疾患又は状態が起こって後遺症又は傷跡を残している人々でもある。処置とは、疾患、障害若しくは状態に関連する症状を改善し、若しくは寛解し、弱めて前記疾患、障害若しくは状態の重症度を軽減する若しくは前記疾患、障害若しくは状態を治癒させる、又は前記疾患、障害若しくは状態が起こる若しくは再発するのを防ぐのに効果的である治療物質を投与することでもある。

研究によれば、肥満対象における食餌誘発性体重減少に続く1年までの血漿AGレベルの持続的増加が実証された(参考文献28及び29)。したがって、これらの対象において上昇したAGレベルを減少すれば、対象が食事制限をしている間の肥満再発を防ぐことができるであろう。したがって、さらなる実施形態では、本発明は、有効量のUAG、その断片、類似体及び/又は薬学的塩を対象に投与することにより、体重減少が必要な又は体重減少を維持する必要のある対象において食餌誘発性体重減少の効果を改善するための及び/又は食餌誘発性体重減少に続く体重増加を防ぐための方法を提供する。

この実施形態のさらなる実装では、UAG、その断片及び/又は類似体は食事制限プログラムの開始時に投与され、好ましくはUAG、その断片及び/又は類似体は食事制限プログラム中もずっと投与される。

本明細書で定義されるポリペプチドの少なくとも1つを組み込んでいる任意の医薬組成物を提供するのは本発明の別の態様である。

治療及び/又は製薬使用では、本明細書で定義されるポリペプチドは、従来法に従って、静脈内、皮下、経皮、局所、経口、頬側、舌下、経鼻、吸入、肺、又は非経口投与、しかしこれらに限定されない投与のために処方することができる。静脈内注射は従来の期間にわたりボーラス又は注入によるものでもよい。本明細書で定義されるポリペプチドは、例えば、内部若しくは外部標的部位へ微粒子銃送達により又は動脈中の部位へのカテーテルにより対象内の標的部位に直接投与してもよい。

一実施形態では、本明細書で定義されるポリペプチドはボーラスとして投与される。したがって、この実施形態の一実装では、薬物は食事前にボーラスとして投与され、前記ボーラスは有効量のUAG、その断片及び/若しくは類似体又はその塩を含む。ボーラスは一日1回、2回、3回若しくはそれよりも多い回数投与してもよく、又は他の投与計画に従って投与してもよい。

適切な投与計画は服用させる対象のタイプ、年齢、体重、性別及び対象の医学的状態、投与経路、所望の影響などの、しかしこれらに限定されない当技術分野で周知の要因を考慮に入れて決定される。

本明細書で定義されるポリペプチドなどの活性成分は懸濁液として経口投与してもよいし、医薬製剤技術において周知の技法に従って調製することができるし、嵩を与えるための結晶セルロース、懸濁剤としてのアルギン酸又はアルギン酸ナトリウム、粘度増強剤としてのメチルセルロース及び甘味料/香味料を含有してもよいが、これらに限定されない。即時放出錠剤として、これらの組成物は、結晶セルロース、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウム及びラクトース並びに/又は他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤及び潤滑剤を含有してもよいが、これらに限定されない。活性成分は徐放送達システムにより投与されてもよい。

鼻エアロゾル又は吸入により投与される製剤は、例えば、ベンジルアルコール若しくは他の適切な保存剤、生物学的利用能を増強する吸収促進剤を用いて、フルオロカーボンを用いて、及び/又は他の可溶化剤若しくは分散剤を用いて生理食塩水中の溶液として調製しうる。

本発明のポリペプチドは、静脈内(ボーラスでも注入でも)、腹腔内、皮下、閉塞あり若しくはなしでの局所的、又は筋肉内の形態で投与しうる。注射により投与される場合、注射液若しくは懸濁液は、当技術分野で周知の適切な非毒性、非経口で許容される希釈剤又は溶剤を使用して処方しうる。

本発明のポリペプチドは、局所投与のために処方してもよい。本明細書で使用される用語「局所的」には、化合物が皮膚又は粘膜組織を満たすことを可能にするいかなる投与経路でも含まれる。

局所適用に適している製剤は、例えば、クリーム、ローション、溶液、ゲル、軟膏、ペースト、硬膏剤、ペンキ、生体粘着剤等の形態であってよく、並びに/又はリポソーム、ミセル、微小粒子、及び/若しくはマイクロスフェアを含有するように調製されてもよい。製剤は水性、すなわち、水を含有していてもよく、又は非水溶性でもよく、場合によっては、体表に適用すると及びその後体表から蒸発する湿気が製剤内に維持されるように閉塞性被覆層(occlusive overlayer)と組み合わせて使用されてもよい。

軟膏は、医薬製剤の分野では周知であるが、典型的にワセリン又は他のワセリン誘導体に基づいた半固体製剤である。

製剤は、リポソーム、ミセル、微小粒子及び/又はマイクロスフェアを用いて調製してもよい。リポソームは脂質二重層を含む脂質壁を有する微細ベシクルであり、薬物送達システムとして使用することができる。ミセルは、その極性頭部が外部球殻を形成し、疎水性炭化水素鎖は球の中心に向かって配向されて、核を形成するように配置された界面活性剤分子で構成されていることが当技術分野では知られている。微小粒子は、通常はポリマーで調製されたミクロンサイズ範囲の微粒子キャリアシステムであり、通常前記微粒子内に捕捉される薬物又はワクチンの送達システムとして使用することができる。マイクロスフェアは、同様に、本製剤及び薬物送達システムに組み込まれてもよい。リポソーム及びミセル同様に、マイクロスフェアは基本的に薬物又は薬物含有製剤をカプセルに包む。マイクロスフェアは、必ずしもそうではないが、一般に合成又は天然に存在する生体適合性ポリマーから形成される。しかし、リン脂質などの荷電脂質で構成されていてもよい。

局所投与に適した製剤の調製は当技術分野では周知であり、関連文書及び文献に記載されている。

一般に、医薬組成物は、本発明のポリペプチドのうちの少なくとも1つを当業者には周知である薬学的に許容される担体とともに含むことになる。組成物は、利用される剤形に応じて、例えば、1つ以上の適切な賦形剤、希釈剤、充填剤、可溶化剤、保存剤、担体、塩、緩衝剤及び当技術分野で周知の他の材料をさらに含みうる。組成の方法は、当技術分野では周知である。

本文脈では、用語「薬学的に許容される担体」は、それ自体は実質的に治療及び/又は予防効果がないという意味で不活性であり非毒性であるいかなる材料をも表すことが意図されている。薬学的に許容される担体は、許容できる技術的特性を有する医薬組成物を得ることを可能にすることを目的に本発明のポリペプチドに添加してもよい。

そのような担体の例には、イオン交換体、アルミニウム、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、又は硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、及びPEGなどの電解質が含まれる。

局所又はゲル系形態のポリペプチドのための担体には、カルボキシメチルセルロースナトリウム又はメチルセルロースなどの多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸塩、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン-ブロックポリマー、PEG、及びウッドワックスアルコールが含まれる。

インビボ投与のために使用されるポリペプチドは無菌でなければならない。これは、凍結乾燥及び再構成に先立って、又は続いて、除菌膜を通す濾過により実現しうる。ポリペプチドは通常、凍結乾燥形態で又は溶液で保存されることになる。治療ポリペプチド組成物は一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈注射液バッグ又は皮下注射針で突き刺し可能な栓を有するバイアルに入れられる。

本明細書に定義される方法において使用するため、本発明は、容器、容器上のラベル、及び表示されたレベルで使用された場合容器内に活性薬剤としての本発明のポリペプチドを含む組成物であって、特に、AGを調節する、AGを阻害する、循環AGレベルを減少する、循環している上昇したAGレベルを減少させる、循環AG/UAG比を減少させる、循環している上昇したAG/UAG比を減少させる、AGレベル及び/若しくはAG/UAGレベルにより誘導される症状を寛解する、循環AG及び/若しくは循環AG/UAG比に関連する状態を促進する、予防する及び/若しくは処置する並びに/又は上昇した循環AG及び/若しくは上昇した循環AG/UAG比に関連する状態を促進する、予防する及び/若しくは処置するのに効果的である前記組成物を含む製品又は商用パッケージ又はキットも提供する。

「有効量」又は「治療的有効量」とは、所望の治療結果を達成するのに必要な投与量及び期間で、効果的な量のことである。本明細書に記述されるペプチドの治療的有効量は、個人の疾患状態、年齢、性別、及び体重などの要因、並びに個人において所望の応答を誘発する化合物の能力に応じて異なりうる。投与計画は最適な治療応答を与えるように調整しうる。治療的有効量は化合物のいかなる毒性又は有害効果よりも治療的に有益な効果のほうが勝る量でもある。「予防的有効量」とは、AGを調節する、AGを阻害する、循環AGレベルを減少させる、循環している上昇したAGレベルを減少させる、循環AG/UAG比を減少させる、循環している上昇したAG/UAG比を減少させる、AGレベル及び/若しくはAG/UAGレベルにより誘導される症状を寛解する、循環AG及び/若しくは循環AG/UAG比に関連する状態を促進する、予防する及び/若しくは処置する並びに/又は上昇した循環AG及び/若しくは上昇した循環AG/UAG比に関連する状態を促進する、予防する及び/若しくは処置するなどの所望の予防結果を達成するのに必要な投与量で及び期間で、効果的な量のことである。予防的有効量は、治療的有効量についての上記の通りに決定することができる。任意の特定の対象では、特定の投与計画は、個人の必要及び組成物を投与する又は組成物の投与を管理する人物の専門的判断に従って、時間をかけて調整してもよい。

例えば、本発明のペプチド(本明細書では「活性化合物」とも呼ばれる)の治療的有効量又は有効用量とは、AGを調節する、AGを阻害する、循環AGレベルを減少させる、循環している上昇したAGレベルを減少させる、循環AG/UAG比を減少させる、循環している上昇したAG/UAG比を減少させる、AGレベル及び/若しくはAG/UAGレベルにより誘導される症状を寛解する、循環AG及び/若しくは循環AG/UAG比に関連する状態を促進する、予防する及び/若しくは処置する並びに/又は上昇した循環AG及び/若しくは上昇した循環AG/UAG比に関連する状態を促進する、予防する及び/若しくは処置するのに十分な量のことである。そのようなパラメータを測定するための方法及び/又はアッセイは当業者には公知である。

本発明の治療的有効量は一般に、約0.001μg/kgから約10mg/kg、特に約0.01μg/kgから約10mg/kg、さらには約1μg/kgから約1mg/kgまでさまざまである。この範囲外であるが所望の治療効果を有する治療的有効量又は有効用量も本発明により包含されている。

一実施形態では、上記の対象は哺乳動物であり、さらなる態様では、ヒトである。

さらなる実施形態では、本ポリペプチドは、追加の薬理活性物質と組み合わせて投与してもよく、別の治療方法と組み合わせて投与してもよい。組合せはキットインパートシステム(kit-in-part system)の形態でもよく、組み合わされた活性物質は、同時投与、連続投与又は個別投与に使用してもよい。

iii)バイオマーカーとしてのAGレベル及びAG/UAG比
別の実施形態によれば、本発明は、治療的有効量のUAG、その断片及び/又はその類似体の投与を含む処置に応答する及び/又はそれから利益を得る可能性がある対象の確認のためのバイオマーカーとしての循環AGレベルの使用及び循環AG/UAG比の使用に関する。

この実施形態の一実装では、循環AGレベル及び/又は循環AG/UAG比は、当技術分野で公知の方法に従って、対象から得られる血液試料において測定される。次に、循環AGのレベル及び/又は循環AG/UAGの比は、対象が異常なレベルの循環AG(すなわち、正常又は健康レベルよりも下又は上)及び/又は異常な比の循環AG/UAG(すなわち、正常又は健康な比よりも下又は上)を有するかどうかを伝える情報を引き出せるように、AGの基準循環レベル及び基準循環AG/UAG比(例えば、対象自身から又は対照対象集団に由来する)に一部基づいて処理される。対象が上昇した循環AGレベル及び/又は上昇した循環AG/UAG比を有することを伝える情報は、対象がUAG、その断片又はその類似体の投与に応答する可能性があることを示している。したがって、そのような対象におけるUAG、その断片又はその類似体の投与は循環AGレベル及び/又は循環AG/UAG比を減少させる並びに上昇した循環AGレベル及び上昇した循環AG/UAG比に関連する効果を和らげる可能性がある。

この実施形態の別の実装では、対象は糖尿病(1型又は2型)、肥満、プラダー・ウィリー、インスリン抵抗性、過食及び高グレリン血症などの、しかしこれらに限定されない状態を患っている。本明細書に定義されるバイオマーカーを使用して、そのような対象がUAG、その断片又はその類似体の投与に応答する可能性がある及び/又はそれから利益を得る可能性があるかどうかを決定しうる。そのような状態を患い、上昇した循環AGレベル及び上昇した循環AG/UAG比を有する対象は、UAG、その断片及び/又はその類似体の投与に応答する及び/又はそれから利益を得る可能性がある。

この実施形態の別の実装では、前記バイオマーカーは、対象の集団内で、治療的有効量のUAG、その断片又はその類似体の投与に応答する及び/又はそれから利益を得る可能性がある対象を確認するために使用しうる。この実装では、集団の対象は糖尿病(1型又は2型)、プラダー・ウィリー症候群(PWS)、肥満、インスリン抵抗性、過食及び高グレリン血症などの、しかしこれらに限定されない状態を患っている。

この実施形態の別の実装に従って、本発明は対象がUAG、その断片及び/又はその類似体の投与に応答する及び/又はそれから利益を得る可能性を伝える情報を表示する方法を提供する。そのような実装は、例えば、コンピュータユニットによる実行に適したプログラムの要素を保存するコンピュータ読み取り可能な記憶媒体などの、しかしこれに限定されない装置により実施されうる。そのような実装では、プログラムの要素は、対象がUAG、その断片及び/又はその類似体の投与に応答する及び/又はそれから利益を得る可能性を伝える情報を表示するグラフィカルユーザーインターフェイスモジュール(graphical user interface module)を実装する。

当技術分野で公知の方法に従って測定される対象の循環AGのレベル、循環UAGのレベル及び/又は循環AG/UAG比に関連する1セットの情報データ要素をユーザーが入力するのを可能にする1セットのユーザー修正可能情報フィールドを表示するようにグラフィカルユーザーインターフェイスモジュールは適合される。グラフィカルユーザーインターフェイスモジュールは、ユーザーが情報データ要素のセットを処理装置に送信させることを可能にするコントロールを表示するように適合される。処理装置は、情報データ要素のセットに少なくとも一部基づいて対象がUAG、その断片及び/又はその類似体の投与に応答する及び/又はそれから利益を得る可能性を引き出すように適合される。グラフィカルユーザーインターフェイスモジュールは対象の循環AGのレベル、循環UAGのレベル及び/又は循環AG/UAG比を受け、正常な若しくは健康な循環AGレベル及び/又は正常な若しくは健康な循環AG/UAG比(例えば、対象から又は対照対象の集団に由来する)を基準にして対象がUAG、その断片及び/又はその類似体の投与に応答する及び/又はそれから利益を得る可能性を表示するように適合される。場合により、糖尿病(1型又は2型)、プラダー・ウィリー症候群(PWS)、肥満、インスリン抵抗性、過食及び高グレリン血症などの、しかしこれらに限定されない状態を患っている対象において観察される循環AGレベル及び/又は循環AG/UAG比を基準にして対象がUAG、その断片及び/又はその類似体の投与に応答する及び/又はそれから利益を得る可能性を表示するようにグラフィカルユーザーインターフェイスモジュールは適合される。

特定の実装に従って、情報データ要素のセットは、性別コンポーネント、体重コンポーネント、肥満度指数(BMI)コンポーネント、健康状態コンポーネントを含んでいてもよい。情報データ要素のセットは、対象に関連する他のどんな適切な情報をさらに含んでいてもよい。

特定の実装に従って、対象がUAG、その断片及び/又はその類似体の投与に応答する及び/又はそれから利益を得る可能性は、UAG、その断片及び/又はその類似体の投与に応答する及び/又はそれから利益を得る可能性を伝える表示データ要素を含む。表示データ要素は、スコアー、尤度、パーセンタイル値の形態で又は他のどんな適切なフォーマットで表されてもよい。

特定の実装に従って、対象がAUG、その断片及び/又はその類似体の投与に応答する及び/又はそれから利益を得る可能性を伝えるグラフ、循環AGの基準正常/健康レベル及び/又は基準正常/健康循環AG/UAG比を示す第一の情報(場合によって、グラフィカルユーザーインターフェイスモジュールは、糖尿病(1型又は2型)、プラダー・ウィリー症候群(PWS)、肥満、インスリン抵抗性、過食及び高グレリン血症などの、しかしこれらに限定されない状態を患っている対象における基準循環AGレベル及び循環AG/UAG比を示す情報を表示するように適合される)、対象のAGの循環レベル、UAGの循環レベル及び/又は循環AG/UAG比を示す第二の情報、並びに対象がUAG投与に応答する及び/又はそれから利益を得る可能性を伝える第三の情報を伝えるグラフを表示するようにグラフィカルユーザーインターフェイスモジュールは適合される。

実験及びデータ解析
本明細書にあるデータは、T2DM対象における血清AGレベルに対する及び血清AG/UAG比に対するUAGの強い抑制効果を報告している。

AG濃度に関する交差モデルにおける2用量のUAG(3μg UAG/kg/hr及び10μg UAG/kg/hr)対プラセボの連続一晩(15時間)注入は、2型糖尿病を抱える8人の体重過多対象において実施された。図1は研究プロトコールの略図を描いている。対象における標準朝食食事(SBM)へのグルコース及びインスリン応答並びに妥当な代謝制御が評価された。UAGの注入中、対象はプラセボを超える副作用を報告しなかった。実験室評価では、化学及びパラメータに顕著な変化は示されず、副作用は用量依存性ではなかった。

UAGの注入は血漿AGレベルを減少させる
図2A及び2Bにあるデータは、SBM前及び後の血清AGレベル(図2A)及びUAGレベル(図2B)を示している。SBMの開始前、AGレベルは、プラセボ注入中の21.01±8.9pg/ml(平均±SD)から、3mcg/kg.hr UAG注入液存在下での3.0±6.7pg/mlまで及び10mcg/kg.hr UAG注入液存在下での1.4±3.2pg/mlまで著しく減少する。AGレベルは、プラセボの14.03±9.4pg/mlから3mcg/kg.hr UAG注入液存在下での0.8±1.8pg/mlまで及び10mcg/kg.hr UAG注入液存在下での0.8±1.8pg/mlまでSMBに続いても減少する(図2A)。同時に、UAGの一晩注入により、UAGレベルは増加した(図2B)。UAGレベルはプラセボ注入の及びSBMの開始前の105.9±31.4(平均±SD)pg/mlから3mcg/kg.hr UAG注入液存在下での10998±2623pg/mlまで及び10mcg/kg.hr UAG注入液存在下での12085±1616pg/mlまで増加した。これらの結果は、T2DM対象においてUAGを投与すれば血清AGレベルが減少することを示す。

UAG断片の注入はAG誘導食物摂取を相殺する
UAGの環状化断片、すなわち配列番号25に描かれている環状UAG(6-13)は、ラットにおいてAGにより誘導される食欲増進効果を相殺することができた(図8)。これらの結果により、UAG関連作用/活性の原因であるコア配列を保持している本明細書で定義されるUAG断片はAGレベルに対するその効果も保持することが実証されている。上で考察されたように、ある種の対象ではAGの効果又はそのレベルを阻害する利益(例えば、摂食量を減少させる)がある。これらの結果により、上昇しているAGレベルが過食と関連しているプラダー・ウィリー症候群を抱えた患者の処置におけるUAGの有益な役割を実証している。したがって、AGのレベル及び/又は生物学的効果を阻害すれば、食欲及び/又は摂食量が減少するはずである。

UAGの注入は食後の血漿グルコースレベルを減少させる
UAGの一晩注入は、iPro連続グルコースモニタリングにより評価された場合、食後のグルコースレベルを著しく抑制した(図3A及び3B)。曲線下の面積はプラセボ注入の1618mmol/3hrsから3及び10 mcg UAG注入でのそれぞれ1601mmmol/3hrs及び1540mmol/3hrsまで減少した。図4A及び4Bは、グルコースプレSBMベースラインからの変化として得られた結果を描いている。曲線下の面積は、プラセボと比べた場合、3及び10mcg UAG注入用量では減少した。図5A及び5Bは、UAGを投与した場合のSBM後の血漿グルコースピークの減少を示している。食後血漿グルコースピークの全体の減少が対象において観察できる(図5B)。全体としては、これらのデータは、UAGの投与によりT2DM対象において食後血漿グルコースレベルが減少することを示している。

血漿AGレベル及びAG/UAG比のUAG誘導減少はグルコースレベルの減少と相関している
本発明者らは、標準グルコキナーゼアッセイを使用して、空腹時AGレベル及び/又はUAGレベルとUAG投与に続く血糖応答の間の相関の存在を明らかにすることができた。そのような相関をさらに実証するため、図6Aは空腹時AGレベルが上昇しているほど、UAG投与の血糖低下作用は最もよいことを示している。図6Bも、iPro連続グルコース測定を使用して、同じ相関及び効果を示している。空腹時AG/UAG比も、UAG投与に続く血糖応答と相関している(図6C)。iPro連続グルコース測定を使用すると、AG/UAG比が高いほどUAG注入の血糖低下作用と最もよく相関している。

UAGの注入はインスリン感受性を改善する
T2DM対象におけるインスリン感受性は、図7Aに描かれる高インスリン性正常血糖クランプ研究プロトコール(hyperinsulinemic-euglycemic clamp protocol)を使用して評価された。2.5hrプラセボ/UAG注入の開始時に効果的な正常血糖インスリンクランプを受けた患者では、ベースラインからのM-指標変化はUAG対プラセボ群では36%増加した(p=0.02)(図7B)。これらの結果により、UAG注入はT2DM対象においてインスリン抵抗性を改善することが実証されている。

さらに短いUAG注入で血漿AGレベルを減少させるのに十分である
AGレベルは、UAG注入に先立って及び2.5時間長UAG注入に続いて、T2DM対象において測定された。図7Cに提示されるデータは、短縮されたUAG注入期間は血漿AGレベルを減少させるのに十分であったことを示している。図7DはベースラインからのAGレベルの変化を示しており、短いUAG注入期間で血漿AGレベルを減少させるのに十分であることを実証している。

これらのデータは、それ自体で、UAGの投与がAGの減少を通じてSBM中のグルコースレベルを改善することを実証している。食後のピークグルコースレベルの顕著な減少も観察された。低及び高用量のUAG注入液の注入中の血清インスリンレベルの顕著な変化は観測されず(データは示されていない)、これは改善された血糖管理が改善されたインスリン感受性と相関していることを示している。データは、UAGの投与が高血糖をグレリン濃度依存性の様式で改善し、したがって、より高いAGレベルでは又はより高いAG/UAG比ではUAG血糖低下作用がさらに強くなることも示している。

これらの結果は、UAGがグレリンレベルの強力な阻害剤であり、UAGは代謝障害の処置においてグレリン阻害剤の開発の強力な候補となることを初めて示すものである。

材料及び技術的プロトコール
研究デザイン-単一施設、研究者主導型、二重盲検及びプラセボ対照ランダム化研究。最初の来診病歴中、対象の薬物使用及び生命徴候が検査された。血液試料は化学及び血液学分析のためにも採取された。研究は、それぞれ2日間の入院(来診2、3及び4)で3期間から構成された。

第一日目はおよそ15:00に開始され、次の日の14:00まで続いた。8人の対象は研究のために3群に分けられた。これらの期間に使用された投与量は病院薬局で調製された3mcg/kg.hr UAG、10mcg/kg.hr UAG又はプラセボ/生理食塩水のいずれかであり対象ごとに3バッグ届けられた。対象も研究者もこれらの期間に与えられた薬物は知らなかった。1週間の休薬期間が処置期間の間で実施された。

研究前、期間中、及び後で、血液試料はAG、UAG、化学、血液学及びCAC細胞について採取された。グルコースについての血液試料も静脈カテーテルを介して採取された。連続グルコースモニタリングでは、Continuous Glucoseモニター(iPro2、Medtronic trading、The Netherlands)が対象の腹部に設置された。体重と血圧はそれぞれの来診中に測定された。少なくとも1週間の休薬期間が処置期間の間で実施された。

対象-8人の対象が登録され(女性2人及び男性6人、平均年齢53歳(31〜65歳までの範囲)、平均肥満度指数(BMI)31.5kg/m²、26〜36kg/m²の範囲であった。8人の対象のうち7人が毎日メトホルミンを使用した。対象全員が登録に先立つ少なくとも3か月間は2型糖尿病と診断されていた。スクリーニングに先立つ少なくとも3か月間メトホルミン単剤療法が許可されたが、メトホルミン処置はそれぞれの処置期間の開始に1日先立って停止された。前記集団では、平均グリコヘモグロビンレベル(HbA1c)は52mmol/molで、48mmol/molから57mmol/molの範囲(6.9%、6.5〜7.4%の範囲)であり、肥満度指数は25kg/m²を超えていた。排除基準は、長期2型糖尿病合併症の病歴又は存在、スクリーニング時の研究室評価における臨床的に顕著な異常、及びスクリーニングに先立つ60日以内の全身性副腎皮質ステロイドの使用にあった。注入に先立って、対象は2つの留置カテーテルを受け、第一のカテーテルは処置に先立って挿入され、第二のカテーテルは血液試料採取のためにSBMに先立って挿入された。第二のカテーテルは等張食塩水の緩徐注入により開いたままにされた。

治験薬-この研究で使用されたUAGはBachem AG、Hauptstrasse 144、Bubendorf CH-4416、Switzerlandにより製造された。UAGは凍結乾燥粉末として届けられ(5mgの薬物を含有するバイアル)、製造業者の仕様書に従って地元の薬局で保管された。

研究手順-注入は地元の臨床研究部署で9pmから12amまでの15時間実施された。UAG溶液のそれぞれの容量は濾過され、0.9%の生理食塩水に希釈されて投与に適した用量が得られた。プラセボは0.9%の生理食塩水で構成された。用量は対象の体重に基づいて計算された。それぞれのバイアルは注入のために5mlの水で再構成され、0.22μmフィルターで濾過された。次に前記用量は500mlバッグの0.9% NaClに注入された。3つのバッグが調製されて、100ml/時で連続15時間注入を確保した。

標準朝食食事(SBM)は、
3スライスのコムギパン
3ポーションのマーガリン
2スライスのチーズ(48%脂肪)
1ポーションのジャム
1カップの全乳、及び
ゆで卵1個
合計で714キロカロリー(17%タンパク質、46%脂肪、及び37%炭水化物)で構成された。SBMは8:00amから8:15amまでの15分以内に消費しなければならなかった。3回の来診ごとに、次の安全パラメータ、すなわち、ヘモグロビン、ヘマトクリット、血小板数、WBC数、RBC数、及び白血球百分率(differential)が評価され、Sysmex XE 2100、Firma Sysmex、Ecustraat 11、4879 NP Etten-Leurを使用して決定された。AST、ALT、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、クレアチンホスホキナーゼ(CPK)、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)、クレアチニン、尿素、アミラーゼ、リパーゼ、尿酸、グルコース、コレステロール、LDL、HDL、トリグリセリド、ナトリウム、カリウム、カルシウム、塩化物、タンパク質及びアルブミンはHitachi Modular P800、Roche Transistorstraat 41、1332 CK Almereを使用して決定される。血液グルコースレベルは、全処置期間中皮下に挿入された連続グルコースモニタリング装置(Medtronic CGMS iPro(商標) Continuous Glucose Recorder、Medtronic; The Netherlands)を使用して測定された。血清グルコースレベル(自社グルコキナーゼアッセイを使用する)も30分ごとに、SBM前に開始して、SBM後4時間続けて評価された。CGMSの間、対象は全員1日につき少なくとも4回の毛管血糖試験を実施しなければならなかった。収集されたデータは、SMBGとCGMS値の間の相関係数を得るためにCGMSモニターに入力された。SMBG試験はすべてデジタルグルコメーター(Contour、Bayer)を使用して実施された。AG及びUAGレベルは、一晩注入の開始前、開始の10分前及びSBMの30分後に評価された。グレリンのアシル化を保つために、血液試料は直接EDTAチューブに収集され、次に2分以内に1mlのEDTA-血液が氷上で1mlの保存液(72mM NaCl、58mM NaF、4mM 4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオライド塩酸塩(水溶性不可逆性セリンプロテアーゼ阻害剤; AEBSF)を含有する0.0295N HCl、pH3.0に添加され、295mOsm/KgPlasmaは4℃で遠心分離により調製され、次に1mlが100μl 1N HClで酸性化され、アッセイが実施されるまで-80℃で保存された。

グレリンアッセイは、室温で一晩30μl/ウェルの捕捉抗体(PBS中1μg/mlまで希釈されたD4、抗C-末端グレリン(Gutierrezら、2008 PNAS 105:6320〜6325))と一緒のインキュベーションにより被覆されたMSD ELISA 96ウェルプレート(Meso Scale Discovery (MSD)、Gaithersburg、MD、USA)を利用した。捕捉抗体は取り除かれ、ウェルは室温で1時間振盪しながら150μlのカゼインバッファー(Pierce)でブロックされた。AG及びUAGの標準は、それぞれ8ng/ml及び30ng/mlで開始してカゼインバッファー中8つの4×連続希釈液を使用して調製された。保存された血漿はカゼインバッファー中1対1で希釈された。AG及びUAGの検出には別々のプレートが使用された。標準及び試料(25μl/ウェル)は被覆されたELISAプレート上に負荷され、室温で2時間振盪しながらインキュベートされ、PBS-T(150μl/ウェル)で3回洗浄された。C2-4a1及びE8検出抗体(それぞれ、N-末端AG及びN-末端UAG)は、MSDから標準プロトコールを使用してスルホタグ付けされた。次に、前記抗体は0.2×カゼイン/0.05% Tween 20中1対10000で希釈され、25μl/ウェルでそれぞれAG又はUAGプレートに添加された。プレートは室温で1時間振盪しながらインキュベートされた。プレートはPBS-T(150μl/ウェル)で3回洗浄された。最後に、150μlの1×Readバッファー(MSD)がそれぞれのウェルに添加され。プレートは直ちにMSD Sector Imager 6000上で読み取られた。試料についてのAG及びUAG値は、Sector Imagerソフトウェアを使用してそのそれぞれの標準曲線から補間により計算された。

クランプ研究-UAGのランダム化2期間、2処置、二重盲検研究対媒体注入、2.5時間連続静脈内注入により投与された1用量のUAG(10μg/kg/h)を評価する。2.5時間プラセボ/UAG注入の開始時に効果的な正常血糖インスリンクランプを受ける患者において。

統計解析-データ解析はGraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software、Inc. La Jolla、CA 92037 USA)で実施された。結果は平均(±SE)として与えられる。比較はボンフェローニ多重比較、ウィルコクソンマッチドペア符号付順位検定及びANOVA解析を使用して計算された。

図8に提示される実験データに関して、生後7週間、体重275gから300gのスプラーグドーリーラットはペレットダイエットを自由に与えられ、プラスチックケージに単独で収容された。実験は、自由に餌を与えられるラットにおいて光サイクルの開始後2.5時間で実施された。ラットは、媒体プラス媒体、媒体+AG(13μg/kg)又は環状化UAG(6-13)(配列番号25)(42μg/kg)+AG(13μg/kg)を同時に腹腔内注射された。ラットにおける腹腔内注射の完了後直ちに、夜間自由餌が取り除かれ、動物ごとに、予め計量されケージの上から入れられる2ペレットで置き換えられた。食物摂取は、それぞれの時間間隔(30分、1時間、及び2時間)で給餌期間の前及び後の餌重量間の差として計算された。累積食物摂取は、異なる期間の値を合計することにより計算された。

本発明はその特定の実施形態に関連して記載されてきたが、さらなる修正が可能であることは理解されるであろうし、本出願は、一般には本発明の原理に従い、本発明が属する技術分野内の公知の又は慣行の範囲内である本発明からの逸脱を含み、上文に記載される基本的な特長に適合し、添付の特許請求の範囲に従う本発明のいかなる変化、使用又は改作にも及ぶことが意図されている。

明細書において言及される文書はすべて参照により本明細書に組み込まれる。

参考文献一覧

Claims

対象におけるプラダー・ウィリー症候群の処置のための医薬の調製における、有効量の(i)配列番号６に記載される非アシル化グレリンの断片から成るポリペプチド；(ii)配列番号２５に記載される非アシル化グレリンの断片から成るポリペプチド；又は(iii)(i)若しくは(ii)の薬学的に許容される塩の使用。
プラダー・ウィリー症候群が、上昇した循環グレリンレベルと関連している、請求項１に記載の使用。
上昇した循環グレリンレベルが、対象における高血糖、インスリン抵抗性、減少した脂肪利用率、脂肪症、体重増加又はインスリン分泌の抑制のうちの少なくとも1つとさらに関連している、請求項２に記載の使用。
プラダー・ウィリー症候群が、対象において上昇したグレリン/非アシル化グレリン比とさらに関連している、請求項１に記載の使用。
上昇したグレリン/非アシル化グレリン比が、上昇した循環グレリン/非アシル化グレリン比である、請求項４に記載の使用。
医薬が、食餌誘発性体重減少に続いて対象において体重増加をさらに防ぐ、請求項１に記載の使用。
ポリペプチドがリンカー部分を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
対象におけるプラダー・ウィリー症候群の処置のための、有効量の(i)配列番号６に記載される非アシル化グレリンの断片から成るポリペプチド；(ii)配列番号２５に記載される非アシル化グレリンの断片から成るポリペプチド；又は(iii)(i)若しくは(ii)の薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される希釈剤と共に含む医薬組成物。
有効量が、0.001μg/kg〜10μg/kgである、請求項８に記載の医薬組成物。
有効量が、1μg/kg〜1mg/kgである、請求項８に記載の医薬組成物。