TW201625678A - 合成肽 - Google Patents

Abstract

本文提供包含合成之脂酶刺激肽的組合物，以及用其治療高甘油三酯血症及其他病狀及疾病之方法。特定而言，提供展現apoA-V之脂酶刺激活性或使其增強之合成肽(AV-肽)及擬肽物(AV-擬肽物)，以及其使用方法。

Description

合成肽

本申請案主張於2014年11月21日申請之美國臨時申請案第62/082,902號之優先權，該申請案以全文引用之方式併入本文中。

本文提供包含合成之脂酶刺激肽的組合物，以及用其治療高甘油三酯血症及其他病狀及疾病之方法。特定而言，提供展現apoA-V之脂酶刺激活性或使其增強之合成肽(AV-肽)及擬肽物(AV-擬肽物)，以及其使用方法。

在主要醫藥市場上超過35000萬人受高甘油三酯血症(HTG)(TG含量>150mg/dL；100mg/dL為正常)的影響，甘油三酯血症為包括心血管疾病、胰腺炎、糖尿病及肝性脂肪變性之若干疾病的重要危險因素。該群體中約1-2%具有基因遺傳性原發性HTG(>500mg/dL TG)，其可為與嚴重臨床罹病率及死亡率結果相關之單基因或多基因病症。當前對HTG之治療具有許多脫靶效應且不足夠滿足患者之建議目標。

本文提供包含合成之脂酶刺激肽的組合物，以及用其治療高甘油三酯血症及其他病狀及疾病之方法。特定而言，提供展現apoA-V之脂酶刺激活性或使其增強之合成肽(AV-肽)及擬肽物(AV-擬肽物)，以及其使用方法。

本文提供包含肽或多肽之組合物，該肽或多肽與SEQ ID NO：1(全長ApoA-V)具有低於100%之序列一致性，涵蓋與SEQ ID NO：8(AV199-224)具有至少50%之序列一致性(例如>50%、>60%、>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、>95%)的部分，且展現脂酶刺激活性。在一些實施例中，肽或多肽包含與SEQ ID NO：8具有至少80%之序列相似性(例如 >80%、>90%、>95%)之部分。在一些實施例中，肽或多肽與SEQ ID NO：3(AV199-237)具有低於100%之序列一致性但超過50%之序列一致性(例如>50%、>60%、>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、>95%)。在一些實施例中，肽或多肽與SEQ ID NO：3具有至少80%之序列相似性。在一些實施例中，肽或多肽與SEQ ID NO：5(AV199-232)具有低於100%之序列一致性但超過50%之序列一致性(例如>50%、>60%、>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、>95%)。在一些實施例中，肽或多肽與天然apoA-V序列(例如SEQ ID NO：1或其部分(例如SEQ ID NO：5))具有低於100%之序列一致性，但與SEQ ID NO：5(AV199-232)、SEQ ID NO：12(AV-H/K)、SEQ ID NO：23(AV-H/K-2F)、SEQ ID NO：26(AV-H/K-C6S)、SEQ ID NO：27(AV-H/K-Ac/NH₂)及/或SEQ ID NO：28(AV-H/K-2F/HAr)具有50%或更高之序列一致性(例如>50%、>60%、>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、>95%)。

在一些實施例中，組合物包含與SEQ ID NO：5(AV199-232)具有低於100%之序列一致性但超過50%之序列一致性(例如<100%，但>50%、>60%、>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、>95%)的肽。在一些實施例中，肽與SEQ ID NO：5具有至少50%之序列相似性(例如>50%、>55%、>60%、>65%、>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、>95%)。在一些實施例中，肽與SEQ ID NO：10具有低於100%之序列一致性但超過50%之序列一致性(例如<100%，但>50%、>60%、>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、>95%)。在一些實施例中，肽與SEQ ID NO：10具有至少80%之序列相似性(例如>80%、>85%、>90%、>95%、100%)。在一些實施例中，肽或多肽具有與SEQ ID NO：10具有100%序列一致性之部分。在一些實施例中，肽為SEQ ID NO：10。在一些實施例中，肽與SEQ ID NO：11具有低於100%之序列一致性但超過50%之序列一致性(例如<100%，但>50%、>60%、>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、>95%)。在一些實施例中，肽與SEQ ID NO：11具有至少80%之序列相似性(例如>80%、>85%、>90%、>95%、100%)。在一些實施例中，肽或多肽具有與SEQ ID NO：11具有100%序列一致性之部分。在一些實施例中，肽為SEQ ID NO：11。在一些實施例中，肽與SEQ ID NO：12具有低於100%之序列一致性但超過50%之序列一 致性(例如<100%，但>50%、>60%、>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、>95%)。在一些實施例中，肽與SEQ ID NO：12具有至少80%之序列相似性(例如>80%、>85%、>90%、>95%、100%)。在一些實施例中，肽或多肽具有與SEQ ID NO：12具有100%序列一致性之部分。在一些實施例中，肽為SEQ ID NO：12。

在一些實施例中，合成AV-肽之長度為10-50個胺基酸(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及其中之任何範圍(例如20-48、22-46、24-44、26-42、28-40、30-38、32-36))。在一些實施例中，合成AV-肽相對於野生型或天然ApoA-V序列在肽之長度上包含至少1個突變(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或更多及其中之任何範圍)。在一些實施例中，合成AV-肽相對於野生型或天然ApoA-V序列在肽之長度上包含至少1個非保守突變(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或更多及其中之任何範圍)。在一些實施例中，AV-肽相對於野生型或天然ApoA-V序列在肽之長度上包含至少1個保守突變(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或更多及其中之任何範圍)。在一些實施例中，AV-肽相對於野生型或天然ApoA-V序列在肽之長度上包含至少1個半保守突變(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或更多及其中之任何範圍)。在一些實施例中，提供包含合成AV-肽序列之肽或多肽。

在一些實施例中，肽與ApoA-V中長度至少為5個胺基酸(例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50及其中之任何範圍)之部分(例如SEQ ID NO：5)具有低於100%但高於50%(例如55%、60%、70%、80%、 90%、95%及其中之任何範圍)之序列一致性。在一些實施例中，肽與ApoA-V中長度至少為10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34個胺基酸之部分(例SEQ ID NO：5)具有低於100%但高於50%(例如55%、60%、70%、80%、90%、95%及其中之任何範圍)之序列一致性。

在一些實施例中，提供包含肽及/或多肽之組合物，例如在分別闡述於實例1、圖3A-C之描述、圖4A-D之描述及圖8之描述中之一或多種分析中，該等肽及/或多肽相對於SEQ ID NO：1(全長ApoA-V)展現增強之脂酶刺激活性。在一些實施例中，肽及/或多肽相對於SEQ ID NO：1展現增加>10%、增加>20%、增加>30%、增加>40%、增加>50%、增加>60%、增加>70%、增加>80%、增加>90%、>2倍、>3倍、>4倍、>5倍、>6倍、>8倍、>10倍或>20倍之脂酶刺激活性。在一些實施例中，提供包含肽及/或多肽之組合物，該等肽及/或多肽相對於SEQ ID NO：5(AV199-232)展現增強之脂酶刺激活性。在一些實施例中，例如在分別闡述於實例1、圖3A-C之描述、圖4A-D之描述及圖之描述中之一或多種分析中，肽及/或多肽相對於SEQ ID NO：5一者或兩者展現增加>10%、增加>20%、增加>30%、增加>40%、增加>50%、增加>60%、增加>70%、增加>80%、增加>90%、>2倍、>3倍、>4倍、>5倍、>6倍、>8倍、>10倍或>20倍之脂酶刺激活性。在一些實施例中，肽展現α-螺旋特性。在一些實施例中，二級結構預測技術確定該等肽實質上或完全為α螺旋的。

在一些實施例中，本文中之肽及/或多肽包含兩親性α-螺旋。在一些實施例中，本文中之兩親性α-螺旋展現AV-199-232肽之結構域構造(參見例如圖11)。在展開本文中之實施例期間所進行之3D結構模型化、生物資訊及生物化學及生物物理學實驗表明，AV199-232肽及其活性變異體(及包含此類肽之多肽)包含四個結構域，其係根據胺基酸類別及α螺旋上之周圍位置(例如在α螺旋之螺旋輪表示中之空間位置)而非根據一級序列加以定義。AV-199-232及相關肽及多肽之結構域為：結構域1：A1、R5、R12、L16、K19、23A、30D及34E；結構域2：R2、C6、K13、K17、A20、R24及Q31；結構域H：S4、T15、H22及R33；及結構域L：L3、V7、L10、S11、L14、A18、L21、I25、N28、L29及L32。在展開本文中 之實施例期間進行之實驗以及結構域內殘基之身份與以下相符合：結構域1及H(以及結構域2)在刺激脂酶活性中起作用，結構域L在脂質結合或相互作用中起作用，且結構域2在肝素結合中起作用；然而，本文中之實施例不限於任何特定作用機制且實踐此類實施例無需理解該作用機制。在一些實施例中，本文提供包含合成肽或多肽之組合物，該合成肽或多肽包含具有一胺基酸序列之實質上α螺旋區域，該胺基酸序列中至少24個胺基酸(例如24、25、26、27、28、29、30、31、32及其間之任何範圍)且不超過33個胺基酸與SEQ ID NO：5一致或為在其情況下之保守或半保守取代。在一些實施例中，肽或多肽能夠結合於脂蛋白脂酶(LpL)及/或刺激LpL之脂酶活性。在一些實施例中，至少24個胺基酸(例如24、25、26、27、28、29、30、31、32及其間之任何範圍)與SEQ ID NO：5一致或為在其情況下之保守取代。在一些實施例中，至少24個胺基酸(例如24、25、26、27、28、29、30、31、32及其間之任何範圍)與SEQ ID NO：5一致。在一些實施例中，肽或多肽能夠活體外結合於及/或刺激LpL。在一些實施例中，肽或多肽能夠活體內結合於及/或刺激LpL。在一些實施例中，肽或多肽能夠結合肝素。

在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5中之位置的胺基酸係：(i)與SEQ ID NO：5中之對應位置一致，(ii)相對於SEQ ID NO：5中對應位置的保守取代，(iii)相對於SEQ ID NO：5中之對應位置的半保守取代，及/或(iv)相對於SEQ ID NO：5中之對應位置的非保守取代。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5中之位置的胺基酸係：(i)與SEQ ID NO：5中之對應位置一致，(ii)相對於SEQ ID NO：5中之對應位置的保守取代，及/或(iii)相對於SEQ ID NO：5中之對應位置的半保守取代。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5中之位置的胺基酸係：(i)與SEQ ID NO：5中之對應位置一致，及/或(ii)相對於SEQ ID NO：5中之對應位置的保守取代。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5中之位置的胺基酸係：(i)與SEQ ID NO：5中之對應位置一致。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5中之位置的不與SEQ ID NO：5中之對應位置一致且除非另外說明否則不為特定胺基酸或選自一組胺基酸的任何胺基酸 係相對於SEQ ID NO：5中之對應位置的保守取代或半保守取代。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5中之位置的不與SEQ ID NO：5中之對應位置一致且除非另外說明否則不為特定胺基酸或選自一組胺基酸的任何胺基酸係相對於SEQ ID NO：5中之對應位置的保守取代。

在一些實施例中，本文提供包含本文所描述之合成肽或多肽的組合物，該合成肽或多肽包含具有成組殘基之結構域(結構域2)且包含對應於SEQ ID NO：5之位置2、6、13、17、20、24及31的殘基。在一些實施例中，結構域2能夠結合於肝素。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5之位置6的殘基不為半胱胺酸殘基。在一些實施例中，對應於SEQ ID NO：5之位置6的殘基為結構域2中僅有之不與SEQ ID NO：5中之對應位置一致的殘基。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5之位置6的殘基選自由以下組成之群：S、T、N及Q。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5之位置6的殘基為S。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5之位置6的殘基為T。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5之位置6的殘基選自由Y及H組成之群。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5之位置13及17的一個或兩個殘基選自由以下組成之群：高離胺酸(hLys)、R、高精胺酸(hArg)及鳥胺酸。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5之位置17的殘基選自由以下組成之群：Q、N及S。

在一些實施例中，本文提供包含本文所描述之合成肽或多肽的組合物，該合成肽或多肽包含具有成組殘基之結構域(結構域H)，其包含對應於SEQ ID NO：5之位置4、15、22及33的殘基。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5之位置22的殘基不為組胺酸殘基。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5之位置22的殘基選自由以下組成之群：K、hLys、R、hArg及鳥胺酸。在一些實施例中，對應於SEQ ID NO：5之位置22的殘基為K。在一些實施例中，對應於SEQ ID NO：5之位置22的殘基為hLys。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5之位置4的殘基為S。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5之位置4的殘基選自由以下組成之群：T、N及G。在一些實施例中，肽或 多肽中對應於SEQ ID NO：5之位置15及33的殘基分別為T及R。

在一些實施例中，本文提供包含本文所描述之合成肽或多肽的組合物，該合成肽或多肽包含具有成組殘基之疏水性結構域(結構域L),其包含對應於SEQ ID NO：5之位置3、7、10、11、14、18、21、25、28、29及32的殘基。在一些實施例中，疏水性結構域之一或多個殘基不與SEQ ID NO：5之對應位置一致。在一些實施例中，疏水性結構域中對應於SEQ ID NO：5之非極性脂族殘基之一或多個殘基以選自由以下組成之群的非極性芳族殘基取代：F、Y及W。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5之位置10的殘基為非極性芳族殘基。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5之位置10的殘基為F。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5之位置29的殘基為非極性芳族殘基。在一些實施例中，肽或多肽中對應於SEQ ID NO：5之位置29的殘基為F。在一些實施例中，肽或多肽在疏水性結構域中對應於SEQ ID NO：5中之位置包含不與在SEQ ID NO：5中之對應位置的殘基一致的一或多個殘基。在一些實施例中，疏水性結構域中之非一致位置中之至少一者為Y。在一些實施例中，疏水性結構域中之非一致位置中之至少兩者為Y。在一些實施例中，疏水性結構域中之非一致位置中之至少兩者選自由以下組成之群：F、Y及W。在一些實施例中，疏水性結構域中之非一致位置中之至少一者為F。在一些實施例中，疏水性結構域中之非一致位置中之至少兩者為F。在一些實施例中，疏水性結構域中之非一致位置中之兩者為L10F及L29F。在一些實施例中，疏水性結構域中之非一致位置中之至少一者為W。在一些實施例中，疏水性結構域中之非一致位置中之至少兩者為W。在一些實施例中，疏水性結構域中之非一致胺基酸中之至少三者為非極性脂族胺基酸以選自由以下組成之群的非極性芳族胺基酸取代：F、Y及W。在一些實施例中，疏水性結構域中之非一致胺基酸中之至少一者為非極性脂族胺基酸以不同的非極性脂族胺基酸取代。

在一些實施例中，本文提供包含本文所描述之合成肽或多肽的組合物，該合成肽或多肽包含具有成組殘基之結構域(結構域1)，其包含對應於SEQ ID NO：5之位置1、5、12、16、19、23、30及34的殘基。在 一些實施例中，結構域1內之對應於SEQ ID NO：5之離胺酸殘基的一或多個殘基以選自由以下組成之群的殘基取代：R、hArg及hLys。在一些實施例中，結構域1內之對應於SEQ ID NO：5之精胺酸殘基的一或多個殘基以選自由以下組成之群的殘基取代：K、hAKg及hLys。在一些實施例中，結構域1中之所有殘基與SEQ ID NO：5中之對應殘基一致，除了SEQ ID NO：5之一或多個精胺酸或離胺酸殘基以選自由以下組成之群的殘基取代：R、K、hArg及hLys。在一些實施例中，非一致胺基酸中之至少一者為精胺酸以hArg或hLys取代。

在一些實施例中，本文提供包含一序列之肽及多肽，該序列相對於以下序列具有10個或更少(例如10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0或其間之範圍)個取代(例如保守取代、半保守取代、非保守取代)：AR(L/F/Y/W)(S/T/N/G)(R/K/hLys/hArg)(C/S/T/N/Q/Y/H)(V/F/Y/W)QV(L/F/Y/W)S(R/K/hLys/hArg)(K/R/hArg/hLys/Orn)(L/F/Y/W)TL(K/R/hArg/hLys/Orn)(A/F/Y/W)(R/K/hLys/hArg)A(L/F/Y/W)(H/K/hLys/R/hArg/Orn)AR(I/F/Y/W)QQN(L/F/Y/W)DQ(L/F/Y/W)RE(SEQ ID NO：29)，但與SEQ ID NO：5具有低於100%之序列一致性。在一些實施例中，本文提供包含一序列之肽及多肽，該序列相對於以下序列具有10個或更少(例如10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0或其間之範圍)個取代(例如保守取代、半保守取代、非保守取代)：ARX₃X₄X₅X₆X₇QVX₁₀SX₁₂X₁₃X₁₄TLX₁₇X₁₈X₁₉AX₂₁X₂₂ARX₂₅QQNX₂₉DQX₃₂RE，其中：X₃為L、F、Y或W；X₄為S、T、N或G；X₅為R、K、hLys或hArg；X₆為C、S、T、N、Q、Y或H；X₇為V、F、Y或W；X₁₀為L、F、Y或W；X₁₂為R、K、hLys或hArg；X₁₃為K、R、hArg、hLys或Orn；X₁₄為L、F、Y或W；X₁₇為K、R、hArg、hLys或Orn；X₁₈為A、F、Y或W；X₁₉為R、K、hLys或hArg；X₂₁為L、F、Y或W；X₂₂為H、K、hLys、R、hArg或Orn；X₂₅為I、F、Y或W；X₂₉為L、F、Y或W；且X₃₂為L、F、Y或W(SEQ ID NO：29)，但與SEQ ID NO：5具有低於100%之序列一致性。在一些實施例中，本文提供包含一序列之肽及多肽，該序列與SEQ ID NO：29具有100%序列一致性，但與SEQ ID NO：5具有低於100%之序列一致性。

在一些實施例中，本文提供包含本文所描述之合成肽或多肽的組合物，該合成肽或多肽包含選自由以下組成之群的N端修飾：脫胺基、N-低碳烷基、N-二低碳烷基、受約束烷基及N-醯基修飾。在一些實施例中，肽或多肽之C端包含選自由以下組成之群的修飾：醯胺、低碳烷基醯胺、受約束烷基、二烷基醯胺及低碳烷基酯修飾。

在一些實施例中，本文提供醫藥製劑，其包含：(a)本文所描述(例如在前述段落中)之AV-肽或多肽；及(b)生理學上可接受之緩衝液或載劑。在一些實施例中，醫藥製劑進一步包含另一治療劑(例如用於治療HTG、關節硬化、膽固醇升高、心臟病等)。

在一些實施例中，本文提供融合肽或多肽，其包含：(a)本文所描述(例如在前述段落中)之AV-肽或多肽，及(b)官能性肽或多肽片段。在一些實施例中，官能性肽或多肽片段包含信號傳導部分、治療性部分、定位部分(例如細胞引入信號、核定位信號等)、可偵測部分(例如螢光部分、對比劑)或分離/純化部分(例如鏈黴親和素、His₆等)。

在一些實施例中，本文提供編碼本文所描述(例如在前述段落中)之AV-肽或多肽的聚核苷酸。在一些實施例中，本文提供核酸載體(例如質粒、桿粒、病毒載體(例如AAV))，其包含編碼本文所描述(例如在前述段落中)之AV-肽或多肽的聚核苷酸。在一些實施例中，載體進一步包含啟動子及/或一或多個表現元件(例如轉錄增強子、轉譯起始位點、內部核糖體進入位點等)。在一些實施例中，提供以下方法，其包括向個體或樣品投與本文所描述之聚核苷酸或載體(例如用於治療高甘油三酯血症、用於降低甘油三酯之濃度等)。

在一些實施例中，本文提供治療高甘油三酯血症或相關病狀或疾病(例如動脈粥樣硬化、心臟病、急性胰腺炎等)之方法，其包括向罹患高甘油三酯血症或該相關病狀或疾病之個體投與本文所描述(例如在前述段落中)之AV-肽或多肽。

在一些實施例中，本文提供預防高甘油三酯血症或相關病狀或疾病(例如動脈粥樣硬化、心臟病、急性胰腺炎等)之方法，其包括向(例如家族史、遺傳易感性、升高之甘油三酯、生活方式、年齡、性別等)處於 高甘油三酯血症或該相關病狀或疾病風險中之個體投與本文所描述(例如在前述段落中)之AV-肽或多肽。

在一些實施例中，本文提供治療或預防個體之動脈粥樣硬化及/或心血管疾病之方法，其包括向個體投與本文所描述(例如在前述段落中)之AV-肽或多肽。在一些實施例中，投與包括共投與：(a)該肽或多肽，及(b)用於治療及/或預防動脈粥樣硬化及/或心血管疾病之治療及/或治療劑。在一些實施例中，(a)及(b)係同時及/或以單一醫藥製劑之形式投與。在一些實施例中，(a)及(b)係並行及/或以分開的醫藥製劑之形式投與。

在一些實施例中，本文提供降低樣品中之甘油三酯濃度之方法，其包括：(a)向包含(i)甘油三酯及(ii)甘油三酯水解脂酶之樣品中投與本文所描述(例如在前述段落中)之AV-肽或多肽；或(b)向包含甘油三酯之樣品中投與：(i)本文所描述(例如在前述段落中)之AV-肽或多肽，及(ii)甘油三酯水解脂酶。在一些實施例中，甘油三酯水解脂酶選自由以下組成之群：脂蛋白脂酶(LpL)、內皮脂酶(EL)及肝脂酶(HL)。

在一些實施例中，本文提供本文所描述之AV-肽或多肽的用途，其係用於治療高甘油三酯血症或相關病狀或疾病(例如動脈粥樣硬化、心臟病、急性胰腺炎等)。在一些實施例中，本文提供用於用作藥劑的本文所描述之AV-肽或多肽。在一些實施例中，本文提供用於治療高甘油三酯血症或相關病狀或疾病(例如動脈粥樣硬化、心臟病、急性胰腺炎等)之AV-肽或多肽。在一些實施例中，本文提供本文所描述之AV-肽或多肽的用途，其係用於製造用於治療高甘油三酯血症或相關病狀或疾病(例如動脈粥樣硬化、心臟病、急性胰腺炎等)之藥劑。

圖1A-D. (A)人類apoA-V蛋白質序列(成熟蛋白；uniprot/Q6Q788；SEQ ID NO：1)，突出顯示缺失及在各種群體中已確定且與高甘油三酯血症(HTG)相關之若干突變；(B)殘基199-259內之ApoA-V功能喪失型突變/缺失簇，其表明此區域可具有潛在LpL刺激結構域。繪製apoA-V之在殘基199-259內成簇之與高甘油三酯血症及/或CAD有關之所有已知序列變異體，突變豎線及星號表示先前報導為降低apoA-V之LpL 刺激活性的突變；(C)apoA-V之3D模型(Phyre2)預示結構富含α-螺旋；且(D)測試肽AV199-237含有推定白胺酸拉鏈基元(SEQ ID NO：20)。

圖2A-B. 藉由Phyre2預測之apoA-V 3D結構，突出顯示(Ser232_Leu235)del及leu253Pro SNPs之位置(A)。由富含作為已知蛋白質結構破壞者(α-螺旋打斷者)之P及A的序列圍住之所示蛋白質序列(SEQ ID NO：2)(B)。合成肽AV199-237(SEQ ID NO：3)之範本係藉由視覺檢驗進行選擇。肽編號係基於成熟蛋白(信號肽得以移除)來進行。

圖3A-C. 使用螢光TG類似物EnzChek(Invitrogen)進行之脂蛋白脂酶(LpL)活性分析。酶反應混合物由增加濃度之含於100μl Tris緩衝生理鹽水(TBS)中之LpL、1% BSA(pH 7.8)、0.015% Zwittergent3-14及1μM EnzChek受質組成。藉由螢光(λex=482nm，λem=515nm)監測反應，且針對時間繪製相對螢光單位(RFU)(A)。使用BODIPY標記之脂肪酸(BODIPY-FA)來確定在脂酶情況下產生之產物濃度(B)。購自Invitrogen Inc.之EnzChek受質(E33955)的結構(C)。

圖4. 在肝細胞(HepG2)及單核細胞(RAW267.4)細胞株中之脂酶活性分析。在HepG2培養物中，反應依賴於TG-受質之細胞表面接觸。自細胞中移除反應介質使產物之進一步產生停止，且使其返回細胞中使反應再起始(A)。用已知自細胞表面移除脂酶之肝素預洗滌HepG2細胞亦降低TG-受質之水解速率(B)。細胞(C)與純LpL(D)均對不同脂蛋白(VLDL、LDL及HDL)之脫輔基蛋白含量敏感。

圖5. AV199-237肽刺激LpL活性，但僅在富TG脂蛋白存在下如此。添加至LpL中之肽(10μM)不增加酶活性(圖片A)，除非首先將肽與VLDL或LDL一起孵育(B)。添加VLDL或LDL歸因於apoC-III含量而引起LpL活性降低。將AV199-237 LpL刺激活性與LpL之另一活化劑apoC-II肽(C-II50-79)相比較(C)。雖然AV199-237肽在VLDL存在下刺激LpL活性，但AV250-288並不如此(D、E)。

圖6. AV199-237肽有效刺激培養物中活肝細胞中之肝脂酶(HL)的活性(A)。向細胞中添加AV199-237(10μM)使HL活性增加約2.8倍，且在監測反應之整個75min時間段中得以持續(B)。

圖7. 針對脂酶刺激活性對AV殘基199-288進行篩選以確定為刺激LpL活性所必需之最小肽序列。相對活性以++、+及-指示。

圖8. 確定具有完全脂酶刺激活性(B、D)之最小肽序列(A)。將AV199-237縮短5個殘基成為AV199-232產生活性增強，同時減小長度另外對活性具有副作用。藉由添加10μM肽至活體外LpL分析物(B)或肝細胞(HepG2)細胞培養物(D)中來進行分析。在24孔組織培養板中，將細胞在37℃下在200μL TBS、1.5% BSA、0.2% zwittergent 3-14、1μMEnzChek受質中孵育1h。AV199-232亦在已知表現LpL之活THP-1巨噬細胞之培養物中具活性(C)。

圖9. AV199-232藉由改良LpL對受質之親和力來刺激LpL活性。以不同受質濃度(0-25μM)進行脂酶反應(A、C、D)，以確定在+/- VLDL(10μg/ml)及+/- AV199-232(2.5μM)情況下之LpL酶活性的動力學參數。(B)添加VLDL將酶對受質之親和力降低5.3倍，此與由apoC-III產生之抑制一致。AV199-232在V_max及K_m方面僅顯示邊際變化。AV199-232+VLDL使LpL之明顯受質親和力增加7.8倍。使用GraphPad Prism軟體米氏酶動力學方程(Michaelis-Menten enzyme kinetic equation)曲線擬合來確定動力學參數。

圖10. AV199-232為結合肝素之α-螺旋肽。藉由圓二色性光譜學以實驗方式分析肽摺叠及構象(A)且經計算為約42% α-螺旋，其在結合肝素後增加至約76%。使用Phyre2經由電腦模擬之3D模型化亦指示肽可積極地摺叠成α-螺旋(B)。

圖11. AV199-232之結構表示：(A)3D結構模型，經預測為>88%α-螺旋狀(predictprotein.org)，其與圓二色性分析一致；(B)使用Heliquest2自由軟體產生之螺旋輪表示揭示四個不同的結構域(1、2、H及L)；及(C)AV199-232之一級序列，突出顯示在各個個別結構域中之一些所關注之關鍵殘基。

圖12. 為研究結構域之重要性，合成具有所選殘基取代之肽以個別地「敲出」結構域。

圖13. 在結構域1及結構域2中具有敲出取代之AV199-232 肽的脂酶刺激(A)及肝素結合(B)潛能。脂酶活性似乎高度依賴於結構域1與結構域2，同時肝素結合需要結構域2。

圖14. 結構域-H中之H殘基以K(AV-H/K)取代實質上改良AV199-232之脂酶刺激潛能。在不存在VLDL之情況下，AV-H/K刺激LpL活性達1.6倍(A/C)。當在添加至LpL之前與VLDL一起孵育時，AV-H/K刺激LpL活性達8倍，相對於AV199-232增加44%(B/D)。所有肽均在10μM濃度下進行比較。

圖15. AV199-232結合VLDL(A)且肽-脂蛋白複合物刺激LpL活性(B)。

圖16. 調整脂質-結合面改良脂酶刺激效能。

圖17. 對進行脂酶刺激活性測試之示例性AV-肽的概述。顯示序列對脂酶活性具有相對影響。

圖18. 用於評估AV-199-232(SEQ ID NO：5)殘基對脂酶刺激活性之相對影響的丙胺酸掃描。

圖19. 藉由使用Phyre2之基於同源性之模型化繼之以在GalaxyWEB進行之分子改進產生LpL及AV-199-232之3D結構。

圖20. 使用ClusPro 2.0進行之apoC-III與LpL的分子對接(B)。

圖21. 使用ClusPRo2.0進行之AV199-232與LpL之分子對接。

圖22. 對穩定LpL：AV199-232相互作用之接觸殘基的分子模型化預測。

圖23. (A-C)白血球-LpL活性為可偵測的且對AV199-232肽刺激有反應。(D)在正常及脂代謝異常血漿存在下，AV199-232刺激LpL活性。

定義

如本文所用，除非另外明確陳述，否則將以下術語定義為具有以下含義。

術語「胺基酸」係指天然胺基酸、非天然胺基酸及胺基酸類似物，除非另外指出，否則所有均呈其D及L立體異構體形式(若其結構允許此類立體異構形式)。

天然胺基酸包括丙胺酸(Ala或A)、精胺酸(Arg或R)、天冬醯胺(Asn或N)、天冬胺酸(Asp或D)、半胱胺酸(Cys或C)、麩醯胺(Gln或Q)、麩胺酸(Glu或E)、甘胺酸(Gly或G)、組胺酸(His或H)、異白胺酸(Ile或I)、白胺酸(Leu或L)、離胺酸(Lys或K)、甲硫胺酸(Met或M)、苯基丙胺酸(Phe或F)、脯胺酸(Pro或P)、絲胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr或T)、色胺酸(Trp或W)、酪胺酸(Tyr或Y)及纈胺酸(Val或V)。

非天然胺基酸包括但不限於吖丁啶羧酸、2-胺基己二酸、3-胺基己二酸、β-丙胺酸、萘基丙胺酸(「naph」)、胺基丙酸、2-胺基丁酸、4-胺基丁酸、6-胺基己酸、2-胺基庚酸、2-胺基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-胺基庚二酸，三級丁基甘胺酸(「tBuG」)、2,4-二胺基異丁酸、鎖鏈素(desmosine)、2,2'-二胺基庚二酸、2,3-二胺基丙酸、N-乙基甘胺酸、N-乙基天冬醯胺、高脯胺酸(「hPro」或「homoP」)、羥基離胺酸、別羥基離胺酸、3-羥基脯胺酸(「3Hyp」)、4-羥基脯胺酸(「4Hyp」)、異鎖鏈素、別異白胺酸、N-甲基丙胺酸(「MeAla」或「Nime」)、N-烷基甘胺酸(「NAG」)(包括N-甲基甘胺酸，N-甲基異白胺酸)、N-烷基戊基甘胺酸(「NAPG」)(包括N-甲基戊基甘胺酸)、N-甲基纈胺酸、萘基丙胺酸、正纈胺酸(「Norval」)、正白胺酸(「Norleu」)、辛基甘胺酸(「OctG」)、鳥胺酸(「Orn」)、戊基甘胺酸(「pG」或「PGly」)、哌啶酸、硫代脯胺酸(「ThioP」或「tPro」)、高離胺酸(「hLys」)及高精胺酸(「hArg」)。

術語「胺基酸類似物」係指其中C端羧基、N端胺基及側鏈官能基中之一或多者已經可逆或不可逆化學阻斷或以其他方式加以修飾成為另一官能基的天然或非天然胺基酸。舉例而言，天冬胺酸-(β-甲酯)為天冬胺酸之胺基酸類似物；N-乙基甘胺酸為甘胺酸之胺基酸類似物；或丙胺酸甲醯胺為丙胺酸之胺基酸類似物。其他胺基酸類似物包括甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸碸、S-(羧甲基)-半胱胺酸、S-(羧甲基)-半胱胺酸亞碸及S-(羧甲基)-半胱胺酸碸。

如本文所用，術語「肽」涉及藉由肽鍵鍵聯在一起之胺基酸的短聚合物。與其他胺基酸聚合物(例如蛋白質、多肽等)相比之下，肽之長度為約50個胺基酸或更短。肽可包含天然胺基酸、非天然胺基酸、胺基酸類似物及/或經修飾胺基酸。肽可為天然存在之蛋白質的子序列或非天然(合成)序列。

如本文所用，術語「突變肽」係指肽之變異體，其具有不同自然界中存在之稱為「野生型」序列的大多數常見變異體之胺基酸序列。突變肽可為突變蛋白質或多肽之子序列(例如天然存在之蛋白質的不為自然界中之最常見序列的子序列)，或可為不為天然存在之蛋白質或多肽之子序列的肽。舉例而言，「突變ApoA-V肽」可為ApoA-V之突變型式之子序列或可為在天然存在之ApoA-V蛋白中未發現之不同序列。

如本文所用，術語「合成肽」係指具有與在天然肽及/或蛋白質中所發現之胺基酸序列不同之胺基酸序列的肽。合成蛋白不為天然存在之蛋白質的子序列，既非野生型(亦即最豐富者)亦非其突變型式。舉例而言，「合成Apo-V肽」(「sAV肽」)不為天然存在之ApoA-V的子序列。如本文所用之「合成肽」可藉由任何適合之方法(例如重組表現、化學合成、酶促合成等)製備或合成。

術語「肽擬似物」或「擬肽物」係指仿效衍生自蛋白質或肽之序列的肽樣分子。肽擬似物或擬肽物可含有胺基酸及/或非胺基酸組分。擬肽物之實例包括化學修飾肽、類肽(側鏈附加至肽主鏈之氮原子，而非α-碳)、β-肽(胺基鍵結至β碳，而非α碳)等。

如本文所用，「保守」胺基酸取代係指肽或多肽中之胺基酸以具有類似化學性質(諸如尺寸或電荷)之另一胺基酸取代。出於本發明之目的，以下八種基團各自含有彼此保守取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)與甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)與麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)與麩醯胺(Q)；4)精胺酸(R)與離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)及纈胺酸(V)； 6)苯基丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)及蘇胺酸(T)；及8)半胱胺酸(C)與甲硫胺酸(M)。

天然存在之殘基可基於共同側鏈性質分為成多個類別，例如：正極性(組胺酸(H)、離胺酸(K)及精胺酸(R))；負極性(天冬胺酸(D)、麩胺酸(E))；中性極性(絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、天冬醯胺(N)、麩醯胺(Q))；非極性脂族(丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)、異白胺酸(I)、甲硫胺酸(M))；非極性芳族(苯基丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W))；脯胺酸及甘胺酸；及半胱胺酸。如本文所用，「半保守」胺基酸取代係指肽或多肽中之胺基酸以同一類別內之另一胺基酸取代。

在一些實施例中，除非另作說明，否則保守或半保守胺基酸取代亦可涵蓋具有與天然殘基類似之化學性質的非天然存在之胺基酸殘基。此等非天然殘基係典型地藉由化學肽合成而非藉由在生物系統中合成而併入。此等包括但不限於擬肽物及其他反向或顛倒形式之胺基酸部分。在一些實施例中，本文中之實施例可限於天然胺基酸、非天然胺基酸及/或胺基酸類似物。

非保守取代可涉及一個類別之成員換成另一類別之成員。

如本文所用，術語「序列一致性」係指兩個聚合物序列(例如肽、多肽、核酸等)具有單體相同的連續亞單位組合物所達到之程度。術語「序列相似性」係指兩個聚合物序列(例如肽、多肽、核酸等)僅因保守及/或半保守胺基酸取代而不同的程度。「序列一致性百分比」(或「序列相似性百分比」)係如下計算：(1)在比較視窗(例如較長序列之長度、較短序列之長度、指定視窗等)上比較兩個最佳比對序列，(2)確定含有一致(或相似)單體(例如在兩個序列中出現相同胺基酸、在兩個序列出現相似胺基酸)之位置的數目以產生匹配位置的數目，(3)將匹配位置的數目除以比較視窗(例如較長序列之長度、較短序列之長度、指定視窗)中之位置的總數目，且(4)將結果乘以100以產生序列一致性百分比或序列相似性百分比。舉例而言，若肽A與B之長度均為20個胺基酸且在除1處以外之所有位置具有一致胺基酸，則肽A與肽B具有95%序列一致性。若在非一致位置之胺基酸共有相 同生物物理特性(例如兩者均為酸性)，則肽A與肽B將具有100%序列相似性。作為另一實例，若肽C之長度為20個胺基酸且肽D之長度為15個胺基酸，且肽D中之15個胺基酸中有14個與肽C之一部分的彼等胺基酸一致，則肽C與D具有70%序列一致性，但肽D與最佳比較窗口之肽C具有93.3%序列一致性。出於本文中計算「序列一致性百分比」(或「序列相似性百分比」)之目的，將比對序列中之任何空位視為在彼位置處失配。

如本文所用，術語「成組殘基」係指肽、多肽或蛋白質內在三維空間中物理地安置在一起的一組胺基酸。成組殘基在肽、多肽或蛋白質之一級序列中可能或可能不為連續的。殘基可在球形結構域中成組，可存在於相同表面上，或可存在於肽、多肽或蛋白質內之二級結構(例如α螺旋)或三級結構之相同末端或側面。在一些實施例中，除物理地安置在一起之外，成組殘基亦在殘基特性(例如尺寸、極性電荷等)方面展現一定程度之相似性。

如本文所用，術語「個體」泛指任何動物，包括但不限於人類及非人類動物(例如犬、貓、牛、馬、羊、家禽、魚、甲殼動物等)。如本文所用，術語「患者」典型地指正進行疾病或病狀治療之個體。

如本文所用，術語「有效量」係指組合物(例如合成肽)足以實現有益或所需結果之量。有效量可以一或多次投與、施加或劑量進行投與且不旨在限於特定調配物或投藥途徑。

如本文所用，術語「投與(administration/administering)」係指向個體或活體內、活體外或離體細胞、組織及器官給予藥物、前藥或其他藥劑或治療性治療(例如合成肽)之動作。示例性人體投藥途徑可為通過在腦或脊髓之蛛網膜下之間隙(鞘內)、眼睛(眼部)、口腔(經口)、皮膚(局部或經皮)、鼻(鼻內)、肺(吸入)、口腔黏膜(頰內)、耳、直腸、陰道；藉由注射(例如靜脈內、皮下、瘤內、腹膜內等)及其類似途徑。

如本文所用，術語「共投與(co-administration/co-administering)」係指向個體投與至少兩種藥劑(例如多種合成肽或合成肽與另一治療劑)或治療。在一些實施例中，兩種或更多種藥劑或治療之共投與為並行的。在其他實施例中，第一藥劑/治療係在第二 藥劑/治療之前投與。熟習此項技術者瞭解，所用之各種藥劑或治療的調配物及/或投藥途徑可變化。用於共投與之適當劑量可由熟習此項技術者容易地確定。在一些實施例中，當藥劑或治療係共投與時，相應藥劑或治療係以低於適合其單獨投與之劑量進行投與。因此，在共投與藥劑或治療使潛在有害(例如毒性)藥劑之必需劑量降低的實施例中，及/或當共投與兩種或更多種藥劑使得個體對該等藥劑中之一者經由共投與另一藥劑而得到之有益作用敏感時，尤其需要共投與。

如本文所用，術語「治療」意謂獲得有益或預期臨床結果之方法。有益或預期臨床結果可包括症狀減輕、疾病嚴重性降低、抑制疾病或病狀之潛在病因、使處於非晚期狀態之疾病穩定、延遲疾病進展及/或改良或減輕疾病病狀。

如本文所用，術語「醫藥組合物」係指活性劑(例如合成AV肽)與惰性或活性載劑之組合，其使得組合物尤其適合用於活體外、活體內或離體診斷或治療用途。

如本文所用之術語「醫藥學上可接受」或「藥理學上可接受」係指組合物當向個體投與時不實質上產生有害反應，例如毒性、過敏或免疫反應。

如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」係指標準醫藥載劑中之任一者，其包括但不限於磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(例如諸如油/水或水/油乳液)及各種類型之潤濕劑、任何及所有溶劑、分散介質、包衣、月桂基硫酸鈉、等滲及吸收延遲劑、崩解劑(例如馬鈴薯澱粉或澱粉羥乙酸鈉)及其類似物。組合物亦可包括穩定劑及防腐劑。關於載劑、穩定劑及助劑之實例，參見例如Martin,Remington's Pharmaceutical Sciences，第15版，Mack Publ.Co.,Easton,Pa.(1975)，其以全文引用之方式併入本文中。

如本文所用，術語「受約束烷基」係指分枝鏈、環狀、稠合烷基及金剛烷基。

如本文所用，術語「低碳烷基」係指C1至C4烷基(例如甲基、乙基、丙基及丁基)。

本文中之許多實施例係使用開放性「包含」措辭加以描述。 此類實施例涵蓋多個封閉性的「由...組成」及/或「基本上由...組成」實施例，其可替代地使用此類措辭來進行主張或描述。

詳細說明

本文提供包含合成之脂酶刺激肽的組合物，以及用其治療高甘油三酯血症及其他病狀及疾病之方法。特定而言，提供展現apoA-V之脂酶刺激活性或使其增強之合成肽(AV-肽)及擬肽物(AV-擬肽物)，以及其使用方法。

本文提供合成肽(ApoA-V肽或同義詞AV-肽)，在本文所描述之分析中之一或多者中，其刺激包括以下之脂酶子集的甘油三酯(TG)水解活性：脂蛋白脂酶(LpL)、內皮脂酶(EL)及肝脂酶(HL)(例如相對於SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5等達到至少2倍(例如>2倍、>3倍、>4倍、>5倍、>6倍、>7倍、>8倍、>9倍、>10倍或更多倍，或其中之範圍))。此等脂酶係細胞表面酶，其例如降低血漿中之循環TG之濃度。此等脂酶(例如LpL、EL、HL等)對酶活性之刺激使得血漿TG含量降低且為稱為高甘油三酯血症(HTG)之臨床上升高之TG提供高度特異性治療性治療。

甘油三酯(亦為三醯甘油，TG)為由藉由酯鍵鍵聯之甘油及3-脂肪酸組成之一類脂質。TG為植物油及動物脂肪之主要成分，且在所有大量營養素中脂肪酸之能量密度最大，與碳水化合物(例如葡萄糖及糖原)相比其含有約2.2倍多之卡路里能量。在人類中，血漿TG濃度通常維持在約100-150mg/dL。然而，在最近30年以來，TG含量已穩定上升，且目前據估計在工業化世界中約三分之一的人口具有長期升高之血漿TG(>150mg/dL)。此稱為高甘油三酯血症(HTG)之病狀可具有許多病因，包括生活方式/飲食、藥物及遺傳，且其為以下疾病之經識別危險因子：冠狀動脈疾病(CAD)(包括缺血性中風、心臟病)、代謝症候群及胰腺炎(>500mg/dL)(Do,R.等人，(2013)Nat.Genet.45,1345-1352；其以全文引用之方式併入本文中)。亦充分表明高甘油三酯血症(HTG)為發展以下之危險因子：胰島素抗性及糖尿病、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)及癌症。雖然不清楚確切機制，但高甘油三酯血症(HTG)與LDL-膽固醇增加及HDL-膽固醇降低有關，其亦促成促粥樣硬化血脂異常且可能歸因於削弱之脂蛋白加工。HTG患者可分 成具有不同嚴重性之類別，且在許多臨床研究中已估計了該群體中歸入此等類別中之百分比(Do,R.等人，(2013)Nat.Genet.45,1345-1352；Ford等人(2009)Arch.Intern.Med.169,572-578；Christian等人(2011)Am.J.Cardiol.107,891-897；其以全文引用之方式併入本文中)。

TG主要通過脂酶家族(脂蛋白脂酶(LpL)、內皮脂酶(EL)及肝脂酶(HL))之酶促作用自循環中清除，該等脂酶藉由與硫酸乙醯肝素之高親和力相互作用拴系至細胞表面。此等脂酶又在循環中結合富TG脂蛋白(乳糜微粒、VLDL、LDL及HDL)且將其TG水解成遊離脂肪酸及單醯基甘油，其容易由細胞吸收並代謝。脂酶活性受許多與脂蛋白締合之可交換脫輔基脂蛋白(apo)的影響。或許最佳表徵者為apoC-II及apoC-III，其分別刺激及抑制脂酶活性。

在一些實施例中，本文提供用於治療或預防以下中之一或多者的組合物、套組、系統及/或方法：高甘油三酯血症、甘油三酯含量增加、心血管疾病、關節硬化、急性胰腺炎、糖尿病、肝性脂肪變性及/或相關疾病及病狀。在一些實施例中，甘油三酯之水解係藉由本文所描述之組合物及方法活化。在一些實施例中，甘油三酯水解蛋白(例如脂蛋白脂酶(LpL)、內皮脂酶(EL)及肝脂酶(HL))及/或通道係藉由本文所描述之組合物及方法活化。在一些實施例中，組合物及方法用於治療及/或預防：高甘油三酯血症、甘油三酯含量增加、心血管疾病、關節硬化、急性胰腺炎、糖尿病、肝性脂肪變性及/或相關疾病及病狀。在一些實施例中，組合物及方法用於篩選適合用於治療及/或預防以下疾病之肽及多肽：高甘油三酯血症、甘油三酯含量增加、心血管疾病、關節硬化、急性胰腺炎、糖尿病、肝性脂肪變性及/或相關疾病及病狀。

在一些實施例中，本文提供用於治療或預防高甘油三酯血症、甘油三酯含量增加及/或相關疾病及病狀之醫藥組合物、肽、蛋白質、多肽、核酸編碼肽、蛋白質及多肽、前述物質之分子複合物等。在一些實施例中，本文提供AV-肽及多肽(例如包含低於100%序列一致性之全長ApoA-V(SEQ ID NO：1)，或全長ApoA-V之片段(例如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、 SEQ ID NO：8或其截短型式)等)。在一些實施例中，肽為合成肽。在一些實施例中，本文所描述之多肽或肽係藉由一般熟習此項技術者已知之方法來製備。舉例而言，肽或多肽可使用固相多肽合成技術(例如Fmoc或Boc化學)來合成。或者，肽或多肽可使用重組DNA技術(例如使用細菌或真核表現系統)來製備。另外，肽或多肽可在個體內(例如在投與適當載體之後)得到表現。因此，為促進此類方法，本文提供包含編碼多肽之序列的遺傳載體(例如質粒、病毒載體(例如AAV)等)，以及包含此類載體之宿主細胞。此外，本文提供經由此類方法製備之肽及多肽。

在一些實施例中，提供基於ApoA-V之肽及多肽及與其相關之組合物(例如基於ApoA-V之肽及多肽的擬似物、編碼基於ApoA-V之肽及多肽的核酸等)之投與。在一些實施例中，本文提供肽及多肽之投與，其增強三醯甘油降解(例如水解等)或為本文中另外所描述。此類肽及多肽之實例包括選自由以下組成之群的彼等：SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.29。在一些實施例中，提供包含以下序列或由其組成之肽或多肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29。在一些實施例中，提供與以下中之一者具有至少50%之序列一致性(例如至少60%之序列一致性、至少70%之序列一致性、至少80%之序列一致性、至少90%之序列一致性、至少95%之序列一致性等)的肽或多肽：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29。 在一些實施例中，肽及多肽相對於野生型序列(例如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：8)包含至少一種突變。在一些實施例中，肽或多肽包含：ARLSRCVQVLSR(X1)LTL(X2)AKAL(X3)ARIQQNLDQLRE，其中X1、X2及X3獨立地為任何胺基酸(SEQ ID NO：15)；ARLSRCVQVLSR(B1)LTL(B2)AKAL(B3)ARIQQNLDQLRE，其中B1、B2及B3獨立地為任何酸性及/或帶電荷胺基酸(SEQ ID NO：16)；ARLSRCVQVLSR(K/Q)LTL(K/Q)AKAL(H/K/Q)ARIQQNLDQLRE，(SEQ ID NO：17)。在一些實施例中，本文提供如下方法，該方法包括投與(例如向個體、向細胞、向樣品等)以上所提及之ApoA-V肽或多肽中之一或多者。

在展開本文中之實施例期間所進行之實驗證實AV199-232(SEQ ID NO：5)為用於最佳誘導LpL活性之ApoA-V之最小部分(SEQ ID NO：1)。包括生物化學突變分析、電腦研究、分子模型化及丙胺酸掃描之實驗指示AV199-232之(1)與脂酶刺激最低程度相關、(2)與脂酶刺激適度相關及(3)與脂酶刺激高度相關的各種殘基。實驗亦指示其中相對於天然AV199-232序列之取代提供(或可提供)AV-肽之一或多個特性(例如LpL活化、溶解度、脂質結合、肝素結合等)的增強的某些殘基。在一些實施例中，提供包含具有一或多個非天然取代之AV199-232序列(例如SEQ ID NO：5)的AV-肽。

在一些實施例中，AV-肽相對於SEQ ID NO：5在本文中之資料指示與脂酶活性刺激最低程度相關的位置包含保守、半保守及/或非保守取代。在一些實施例中，AV-肽相對於SEQ ID NO：5在本文中之資料指示與脂酶活性刺激最低程度相關的位置包含保守及/或半保守取代。在一些實施例中，AV-肽相對於SEQ ID NO：5在本文中之資料指示與脂酶活性刺激最低程度相關的位置包含保守取代。

在一些實施例中，AV-肽相對於SEQ ID NO：5在本文中之資料指示與脂酶活性刺激適度相關的位置包含保守、半保守及/或某些非保守取代。在一些實施例中，AV-肽相對於SEQ ID NO：5在本文中之資料指示與脂酶活性刺激適度相關的位置包含保守及/或半保守取代。在一些實施例中，AV-肽相對於SEQ ID NO：5在本文中之資料指示與脂酶活性刺激適度 相關的位置包含保守取代。

在一些實施例中，AV-肽相對於SEQ ID NO：5在本文中之資料指示與脂酶活性刺激高度相關的位置包含保守、半保守取代及/或不包含取代。在一些實施例中，AV-肽相對於SEQ ID NO：5在本文中之資料指示與脂酶活性刺激高度相關的位置包含保守取代及/或不包含取代。在一些實施例中，AV-肽相對於SEQ ID NO：5在本文中之資料指示與脂酶活性刺激高度相關的位置不包含取代。

在一些實施例中，在展開本文中之實施例期間所進行之各種實驗指示對特定殘基或殘基類別之取代(例如保守、半保守、非保守)增強對脂酶活性之刺激的殘基(例如與脂酶活性刺激最低限度、適度或高度相關)。由本文所描述之實驗及數據來看，AV199-232肽內之各種此類位置為顯而易見的。由以下SEQ ID NO：29來看可尤其有益之某些取代為顯而易見的：AR(L/F/Y/W)(S/T/N/G)(R/K/hLys/hArg)(C/S/T/N/Q/Y/H)(V/F/Y/W)QV(L/F/Y/W)S(R/K/hLys/hArg)(K/R/hArg/hLys/Orn)(L/F/Y/W)TL(K/R/hArg/hLys/Orn)(A/F/Y/W)(R/K/hLys/hA_rg)A(L/F/Y/W)(H/K/hLys/R/hArg/Orn)AR(I/F/Y/W)QQN(L/F/Y/W)DQ(L/F/Y/W)RE；或ARX₃X₄X₅X₆X₇QVX₁₀SX₁₂X₁₃X₁₄TLX₁₇X₁₈X₁₉AX₂₁X₂₂ARX₂₅QQNX₂₉DQX₃₂RE，其中：X₃為L、F、Y或W；X₄為S、T、N或G；X₅為R、K、hLys或hArg；X₆為C、S、T、N、Q、Y或H；X₇為V、F、Y或W；X₁₀為L、F、Y或W；X₁₂為R、K、hLys或hArg；X₁₃為K、R、hArg、hLys或Orn；X₁₄為L、F、Y或W；X₁₇為K、R、hArg、hLys或Orn；X₁₈為A、F、Y或W；X₁₉為R、K、hLys或hArg；X₂₁為L、F、Y或W；X₂₂為H、K、hLys、R、hArg或Orn；X₂₅為I、F、Y或W；X₂₉為L、F、Y或W；且X₃₂為L、F、Y或W。

在一些實施例中，本文所描述之實驗及分析表明SEQ ID NO：29中允許進行之各種取代增強或不顯著削弱肽之脂酶刺激活性。其他取代亦可由本文所描述之資料指示，且其在本文之實施例範疇內。

在一些實施例中，表1(實例8)提供在本文之實施例範圍內的相對於SEQ ID NO：5之取代。

實施例不受本文所描述之特定取代的限制。在一些實施例中，滿足本文所描述之限制(例如脂族螺旋、LpL刺激、類似結構域構造等)且具有未明確描述之取代的肽在此處之實施例範疇內。在一些實施例中，本文所描述之肽經進一步修飾(例如取代、缺失或添加標準胺基酸；化學修飾；等)。本領域中理解之修飾包括N端修飾、C端修飾(其使肽不發生蛋白降解)、醯胺基之烷基化、烴「釘合(stapling)」(例如用於穩定α-螺旋構象)。在一些實施例中，本文所描述之肽可藉由例如帶電荷殘基之保守殘基取代(K至R、R至K、D至E及E至D)來加以修飾。在一些實施例中，此類保守取代提供例如脂酶及肝素結合位點之微小變化，其目標為改良特異性及/或脂酶刺激效能。舉例而言，富含R殘基之肽傾向於以比富含K之肽高的親和力結合肝素。未端羧基之修飾包括但不限於醯胺、低碳烷基醯胺、受約束烷基(例如分枝鏈、環狀、稠合、金剛烷基)烷基、二烷基醯胺及低碳烷基酯修飾。低碳烷基為C1-C4烷基。此外，一或多個側基或末端基團可由一般熟練之肽化學工作者已知之保護基保護。胺基酸之α-碳可為單甲基化或雙甲基化的。

在一些實施例中，在肽內引入一或多個肽內二硫鍵(例如在兩個半胱胺酸(例如C6與經取代半胱胺酸、兩個經取代半胱胺酸、在AV肽序列外部之一個或兩個半胱胺酸等之間)。在一些實施例中，肽內二硫鍵之存在使肽穩定。

在一些實施例中，本文所描述之任何實施例可包含對應於本文所描述之AV-肽的AV-擬肽物，其具有本領域中瞭解之各種修飾。在一些實施例中，本文所描述之肽序列中之殘基可以具有類似特性(例如疏水性至疏水性、中性至中性等)或具有其他所需特性(例如更酸、更疏水、更不龐大、更龐大等)之胺基酸取代。在一些實施例中，將非天然胺基酸(或除20種標準胺基酸以外之天然存在之胺基酸)加以取代以達成所需性質。

在一些實施例中，將具有在生理條件下帶正電荷之側鏈的殘基或需要帶正電荷之側鏈的殘基以包括但不限於以下之殘基取代：離胺酸、高離胺酸、δ-羥基離胺酸、高精胺酸、2,4-二胺基丁酸、3-高精胺酸、D-精胺酸、精胺醛(精胺酸中之-COOH由-CHO置換)、2-胺基-3-胍基丙酸、 硝基精胺酸(N(G)-硝基精胺酸)、亞硝基精胺酸(N(G)-亞硝基精胺酸)、甲基精胺酸(N-甲基-精胺酸)、ε-N-甲基離胺酸、別羥基離胺酸、2,3-二胺基丙酸、2,2'-二胺基庚二酸、鳥胺酸、對稱二甲基精胺酸、不對稱二甲基精胺酸、2,6-二胺基已炔酸、對胺基苯甲酸及3-胺基酪胺酸以及組胺酸、1-甲基組胺酸及3-甲基組胺酸。

中性殘基為具有在生理條件下不帶電荷之側鏈的殘基。極性殘基較佳在側鏈中具有至少一個極性基團。在一些實施例中，極性基團選自羥基、硫氫基、胺、醯胺及酯基或允許形成氫橋之其他基團。

在一些實施例中，具有在生理條件下為中性/極性之側鏈的殘基或需要中性側鏈之殘基以包括但不限於以下之殘基取代：天冬醯胺、半胱胺酸、麩醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、瓜胺酸、N-甲基絲胺酸、高絲胺酸、別蘇胺酸及3,5-二硝基-酪胺酸及β-高絲胺酸。

具有非極性、疏水性側鏈之殘基為在生理條件下不帶電荷的之殘基，其較佳具有超過0、尤其超過3之親水性指數。在一些實施例中，非極性、疏水性側鏈選自具有1至10個、較佳2至6個碳原子之烷基、伸烷基、烷氧基、烯氧基、烷基磺醯基及鏈烯基磺醯基殘基，或具有5至12個碳原子之芳基。在一些實施例中，將具有非極性、疏水性側鏈之殘基或需要非極性、疏水性側鏈之殘基以包括但不限於以下之殘基取代：白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、苯基丙胺酸、N-甲基白胺酸、第三丁基甘胺酸、辛基甘胺酸、環己基丙胺酸、β-丙胺酸、1-胺基環己基羧酸、N-甲基異白胺酸、正白胺酸、正纈胺酸及N-甲基纈胺酸。

在一些實施例中，將肽及多肽分離且/或純化(或實質上分離且/或實質上純化)。因此，在此類實施例中，肽及/或多肽係以實質上分離形式提供。在一些實施例中，肽及/或多肽係由於例如固相肽合成而分離自其他肽及/或多肽。或者，肽及/或多肽可在重組製備之細胞溶解之後實質上分離自其他蛋白質。可使用蛋白質純化之標準方法(例如HPLC)來實質上純化肽及/或多肽。在一些實施例中，本發明提供一種肽及/或多肽之製劑，其視所需用途而定呈許多調配物形式。舉例而言，在多肽經實質上分離(或甚至與其他蛋白質幾乎完全分離)之情況下，其可在適合用於儲存(例如在冷藏條 件下或在冷凍條件下)之介質溶液中進行調配。此類製劑可含有防護劑(諸如緩衝液)、防腐劑、低溫防護劑(例如糖，諸如海藻糖)等。此類製劑之形式可為溶液、凝膠等。在一些實施例中，ApoA-V肽及/或多肽係製備成凍乾形式。此外，此類製劑可包括其他所需藥劑，諸如小分子或其他肽、多肽或蛋白質。實際上，可提供包含在此所描述之肽及/或多肽之不同實施例的混合物的此類製劑。

在一些實施例中，本文提供本文所描述之肽序列的擬肽物型式或其變異體。在一些實施例中，擬肽物之特徵在於一實體保留其肽等效物之極性(或無極性、疏水性等)、三維尺寸及官能性(生物活性)，但其中所有或一部分肽鍵已經置換(例如由更穩定之鍵聯置換)。在一些實施例中，『穩定』係指對化學降解或由水解酶進行酶促降解更具抵抗力。在一些實施例中，置換醯胺鍵(例如醯胺鍵代用物)之鍵保留醯胺鍵之一些性質(例如構象、空間體積、靜電特性、氫鍵結能力等)。「Drug Design and Development」,Krogsgaard,Larsen,Liljefors及Madsen(編)1996,Horwood Acad.Publishers之第14章提供對設計及合成擬肽物之技術的一般論述且以全文引用之方式併入本文中。適合之醯胺鍵代用物包括但不限於：N-烷基化(schmidt,R.等人，Int.J.Peptide Protein Res.,1995,46,47；其以全文引用之方式併入本文中)、逆翻轉醯胺(Chorev,M.及Goodman,M.,Acc.Chem.Res,1993,26,266；其以全文引用之方式併入本文中)、硫醯胺(Sherman D.B.及Spatola,A.F.J.Am.Chem.Soc.,1990,112,433；其以全文引用之方式併入本文中)、硫酯、膦酸酯、酮基亞甲基(Hoffman,R.V.及Kim,H.O.J.Org.Chem.,1995,60,5107；其以全文引用之方式併入本文中)、羥基亞甲基、氟乙烯基(Allmendinger,T.等人，Tetrahydron Lett.,1990,31,7297；其以全文引用之方式併入本文中)，乙烯基、亞甲基胺(Sasaki,Y及Abe,J.Chem.Pharm.Bull.1997 45,13；其以全文引用之方式併入本文中)、亞甲基硫基(Spatola,A.F.,Methods Neurosci,1993,13,19；其以全文引用之方式併入本文中)、鏈烷(Lavielle,S.等人，Int.J.Peptide Protein Res.,1993,42,270；其以全文引用之方式併入本文中)及磺醯胺基(Luisi,G.等人Tetrahedron Lett.1993,34,2391；其以全文引用之方式併入本文中)。

像醯胺鍵之置換一樣，擬肽物可涉及以二擬肽或三擬肽結構置換較大結構部分，且在此情況下，涉及肽鍵之擬似物部分(諸如唑衍生之擬似物)可以二肽置換形式使用。適合之擬肽物包括還原肽，其中醯胺鍵已藉由用還原劑(例如硼烷或氫化物試劑，諸如氫化鋰鋁)處理而還原為亞甲基胺；此類還原具有添加之優點，即增加分子之總陽離子度。

其他擬肽物包括例如藉由分步合成醯胺官能化聚甘胺酸形成之類肽。一些擬肽物主鏈將可輕易獲自其肽前驅體，諸如已全甲基化之肽，適合之方法由Ostresh,J.M.等人描述於Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)91,11138-11142中；該文獻以全文引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，在使用之前將肽加以處理或調節。舉例而言，可將ApoA-V肽與極低密度脂蛋白(VLDL)一起孵育。在一些實施例中，可將AV-肽與肝素、合成脂蛋白、脂質體或患者自己之脂蛋白一起孵育以增強生物可用性及治療功效。

在一些實施例中，本文所描述之肽係以與其他肽或多肽融合之形式提供。此類融合物可由編碼ApoA-V肽及其他肽/多肽之重組DNA表現或可藉由化學合成來形成。舉例而言，融合物可包含ApoA-V肽及所關注之酶、螢光素酶、核糖核酸酶抑制劑(RNasin)或核糖核酸酶及/或通道蛋白(例如離子通道蛋白)、受體、膜蛋白、胞質蛋白、核蛋白、結構蛋白、磷蛋白、激酶、信號傳導蛋白、代謝蛋白、粒線體蛋白、受體相關蛋白、螢光蛋白、酶受質、轉錄因子、可選標記蛋白、核酸結合蛋白、細胞外基質蛋白、所分泌蛋白質、受體配體、血清蛋白、具有反應性半胱胺酸之蛋白質、轉運蛋白、靶向序列(例如肉豆蔻基化序列)、粒線體定位序列或核定位序列。另一肽/多肽可融合至ApoA-V肽之N端及/或C端。在一個實施例中，融合蛋白包含位於ApoA-V肽之N端的第一肽/多肽及位於C端之另一(不同)肽/多肽。視情況，融合物中之元件由連接序列隔開，該連接序列為例如較佳地具有至少2個胺基酸殘基之連接序列，諸如具有13個且多達40或50個胺基酸殘基之連接序列。在本發明之融合蛋白中存在連接序列不相對於各個別元件之功能實質上改變融合物中之任一元件(例如ApoA-V肽)之功能，此可能歸因於連接序列為融合物中之各元件提供可撓性(自主性)。 在某些實施例中，連接序列為由識別之序列或為可光裂解的。舉例而言，連接序列可包括蛋白酶識別位點。

在一些實施例中，本文提供包含本文所描述之一或多種AV-肽及多肽(例如與SEQ ID NO：5具有低於100%之序列一致性、展現增強之甘油三酯水解脂酶活化等)以及醫藥學上可接受之載體的醫藥組合物。可供應活性肽或多肽(例如在不破壞載劑內之肽或多肽之情況下)之任何載劑均為適合之載劑，且此類載劑為此項技術中熟知的。在一些實施例中，將組合物調配成用於藉由包括但不限於以下之任何適合之途徑進行投與：經口(例如諸如以錠劑、膠囊、顆粒或粉末形式)、舌下、經頰、非經腸(諸如藉由皮下、靜脈內、肌肉內、真皮內或胸骨內注射或輸注(例如以無菌可注射水溶液或非水溶液或懸浮液等形式))、經鼻(包括向鼻膜投與，諸如藉由吸入噴霧)、表面(諸如以乳膏或軟膏形式)、經皮(諸如藉由經皮貼片)、經直腸(諸如以栓劑形式)等。

在一些實施例中，本文提供用於治療罹患(或處於其風險中)高甘油三酯血症及/或需要治療(或預防性治療)之患者的方法。在一些實施例中，以足以治療病狀之量且在足以治療病狀之位置向此類患者遞送包含至少一種本文所描述之AV-肽或多肽的醫藥組合物。在一些實施例中，肽及/或多肽(或包含此類物質之醫藥組合物)可全身或局部遞送至患者，且其將在治療此類患者之醫療專業人員確定用於治療之最適當遞送途徑、時程及劑量之一般技術之內。應瞭解，治療患者之投與方法最佳實質上緩解或甚至消除此類症狀；然而，如許多醫療治一般，若在本發明方法期間、在其之後或以其他方式作為其結果，患者之疾病或病症的症狀減退至可查明之程度，則認為本發明方法之應用為成功的。

醫藥組合物可以與醫藥學上可接受之載劑及視情況存在之賦形劑、助劑等一起根據良好醫藥實踐加以調配之形式進行投與。基於AV-肽之醫藥組合物可呈諸如以下之固體、半固體或液體劑型形式：粉末、溶液、酏劑、糖漿、懸浮液、乳膏、滴劑、糊劑及噴霧。如熟習此項技術者將認識到，視所選投藥途徑(例如丸劑、注射等)而定，確定組合物形式。一般而言，為達成容易且準確之活性醫藥肽或多肽投與，較佳使用單位劑型。 一般而言，治療有效性醫藥化合物以在以總組合物之重量計約0.5%至約99%範圍內之濃度水準(例如以足以提供所需單位劑量之量)存在於此類劑型中。在一些實施例中，醫藥組合物可以單劑量或多劑量投與。特定投藥途徑及給藥方案將由技術人員按照所要治療之個體的病狀及該個體對治療之反應來確定。在一些實施例中，基於AV-肽之醫藥組合物係以用於向個體投與之單位劑型形式提供，其包含AV-肽或多肽(例如與SEQ ID NO：2之一部分具有低於100%之序列一致性等)及一或多種無毒的醫藥學上可接受之載劑、助劑或媒劑。可與此類物質組合以製備單一劑型之活性成分的量將視如以上所指出之各種因素而不同。如在醫藥技術中可用，多種材料可在本發明之組合物中用作載劑、助劑及媒劑。可注射製劑(諸如油性溶液、懸浮液或乳液)可按需要使用適合之分散或潤濕劑及懸浮劑調配成此項技術中已知之形式。無菌可注射製劑可使用無毒的非經腸可接受之稀釋劑或溶劑，諸如無菌無熱原水或1,3-丁二醇。在其他可接受之媒劑及溶劑之中，可使用者為5%葡萄糖注射液、林格氏注射液(Ringer's injection)及等滲氯化鈉注射液(如USP/NF中所描述)。此外，習知可使用無菌、固定油作為溶劑或懸浮介質。出於此目的，可使用任何溫和的固定油，包括合成之甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯。諸如油酸之脂肪酸亦可用於製備可注射組合物。

本文所揭示之涵蓋實質上α螺旋肽區域的肽及多肽可進一步藉由諸如以下化學變化來進行衍生：醯胺化、糖基化、醯化、硫酸鹽化、磷醯化、乙醯基化及環化。此類化學改變可通過化學或生物化學方法以及通過活體內方法或其任何組合而獲得。

在某些實施例中，本文所描述之肽及多肽係藉由修飾末端胺基而衍生。此類修飾包括但不限於脫胺基、N-低碳烷基、N-二低碳烷基、受約束烷基(例如分枝鏈、環狀、稠合、金剛烷基)及N-醯基修飾，其中醯基部分為C6-C20烷基。

在某些實施例中，本文所描述之肽及多肽係藉由修飾末端羧基而衍生。此類修飾包括但不限於醯胺、低碳烷基醯胺、受約束烷基(例如分枝鏈、環狀、稠合、金剛烷基)烷基、二烷基醯胺及低碳烷基酯修飾，其中低碳烷基為C1-C4烷基。此外，一或多個側基或末端基團可由一般熟練 之肽化學工作者已知之保護基保護。胺基酸之α-碳可為單甲基化或雙甲基化的。

在各個實施例中，本文所揭示之肽及多肽係藉由結合於一或多種聚合物或小分子取代基而衍生。

在此等實施例中之某些中，本文所描述之合成肽及多肽係藉由偶合至聚乙二醇(PEG)而衍生。偶合可使用已知方法進行。參見Int.J.Hematology,68：1(1998)；Bioconjugate Chem.,6：150(1995)；及Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Sys.,9：249(1992)，該等文獻全部以全文引用之方式併入本文中。因此，熟習此項技術者將能夠利用此類熟知用於使一或多種聚乙二醇聚合物鍵聯至本文所描述之肽及多肽的技術。適合之聚乙二醇聚合物典型可商購獲得或可藉由熟習此項技術者熟知之技術來製備。聚乙二醇聚合物較佳具有500與20,000之間的分子量且可為分枝鏈或直鏈聚合物。

PEG連接至本文所描述之肽或多肽可藉由偶合至胺基、羧基或硫醇基來實現。此等基團將典型地為N端及C端以及如離胺酸、天冬胺酸、麩胺酸及半胱胺酸一般位於此類天然存在之胺基酸的側鏈上。由於本發明之肽及多肽可藉由固相肽化學技術來製備，故可引入含有具有正交保護基之二胺基及二羧基的多個部分以結合於PEG。

本發明亦提供本文所描述之肽及多肽與一或多種不為聚乙二醇之聚合物的結合。

在一些實施例中，本文所描述之肽及多肽係藉由結合或鍵聯至聚胺基酸(例如聚his、聚arg、聚lys等)及/或各種長度之脂肪酸鏈或將聚胺基酸及/或各種長度之脂肪酸鏈連接至N端或C端或胺基酸殘基側鏈而衍生。在某些實施例中，如以全文引用之方式併入本文中之美國專利第6,552,167號中所描述，本文所描述之肽及多肽係藉由添加精確長度之聚醯胺鏈、尤其聚醯胺鏈而衍生。在其他實施例中，如以全文引用之方式併入本文中之美國專利第5,359,030號及第5,681,811號中所描述，肽及多肽係藉由添加烷基PEG部分來加以修飾。

在所選實施例中，本文所揭示之肽及多肽係藉由結合至包括白蛋白及明膠之聚合物而衍生。參見Gombotz and Pettit,Bioconjugate Chem., 6：332-351,1995，其以全文引用之方式併入本文中。

在其他實施例中，本文所揭示之肽及多肽係結合或融合至免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，諸如抗體Fc區。

在各個實施例中，本文所描述之肽及多肽係藉由連接小分子取代基而衍生，該等小分子取代基包括短鏈烷基及受約束烷基(例如分枝鏈、環狀、稠合、金剛烷基)及芳族基。

在某些實施例中，本文所描述之肽及多肽包含含有C5-C9直鏈或分枝鏈烷基側鏈之烷基甘胺酸胺基酸類似物或環烷基。在一個實施例中，肽或多肽包含烷基甘胺酸，其包含C6-C8直鏈或分枝鏈烷基側鏈。在另一實施例中，多肽包含辛基甘胺酸，其包含C8直鏈烷基側鏈(辛基-甘胺酸)。

本文所描述之肽及多肽可用各種無機及有機酸及鹼製備成鹽。此類鹽包括用有機及無機酸，例如用HCl、HBr、H₂SO₄、H₃PO₄、三氟乙酸、乙酸、甲酸、甲磺酸、甲苯磺酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸及樟腦磺酸製備之鹽。用鹼製備之鹽包括銨鹽、鹼金屬鹽(例如鈉鹽及鉀鹽)、鹼土鹽(例如鈣鹽及鎂鹽)及鋅鹽。該等鹽可藉由習知手段形成，諸如藉由使產物之遊離酸或鹼形式與適當之鹼或酸的一或多種等效物在不溶解鹽之溶劑或介質中或在隨後在真空下或藉由冷凍乾燥移除之溶劑(諸如水)中反應，或藉由在適合之離子交換樹脂上將現有鹽之離子交換為另一離子。

本文所描述之肽及多肽可調配成醫藥學上可接受之鹽及/或其複合物之形式。醫藥學上可接受之鹽包括酸加成鹽，諸如彼等含有以下物質之酸加成鹽：硫酸鹽、鹽酸鹽、磷酸鹽、胺基磺酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、丁二酸鹽、草酸鹽、甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、環己基胺基磺酸鹽及奎尼酸鹽(quinate)。醫藥學上可接受之鹽可獲自酸，諸如鹽酸、硫酸、磷酸、胺基磺酸、乙酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、環己基胺基磺酸及奎尼酸。此類鹽可如下製備，例如藉由使產物之遊離酸或鹼形式與適當之鹼或酸的一或多種等效物在不溶解鹽之溶劑或介質中或在隨後在真空下或藉由冷凍乾燥移除之溶劑(諸如水)中反應，或藉由在適合之 離子交換樹脂上將現有鹽之離子交換為另一離子。

本文所描述之肽及多肽可調配成用於結合本發明之方法使用的醫藥組合物之形式。本文所揭示之組合物可適宜地以適合用於包括以下之非經腸投與的調配物之形式提供：皮下、肌肉內及靜脈內投與、鼻內投與、經肺投與或經口投與。肽及多肽之適合用於各種此類投藥途徑之調配物描述於標準調配物專著(例如E.W.Martin之Remington's Pharmaceutical Sciences)中。亦參見Wang,Y.J.及Hanson,M.A.「Parenteral Formulations of Proteins and Peptides：Stability and Stabilizers」,Journal of Parenteral Science and Technology,Technical Report第10期，增刊42：2S(1988)。

某些本文所描述之肽及多肽可實質上不溶於水且微溶於大多數醫藥學上可接受之質子溶劑及植物油。在某些實施例中，可添加環糊精作為水溶性增強劑。環糊精包括α-環糊精、β-環糊精及γ-環糊精之甲基、二甲基、羥丙基、羥乙基、葡糖基、麥芽糖基及麥芽三糖基衍生物。示例性環糊精溶解度增強劑為羥丙基-β-環糊精(HPBCD)，其可添加至以上所描述之組合物中之任一者中以進一步改良肽或多肽之水溶性特性。在一個實施例中，組合物包含0.1%至20% HPBCD、1%至15% HPBCD或2.5%至10% HPBCD。所用溶解度增強劑之量將視組合物中本發明之肽或多肽的量而定。在某些實施例中，肽可在諸如以下之非水性極性非質子溶劑中加以調配：DMSO、二甲基甲醯胺(DMF)或N-甲基吡咯啶酮(NMP)。

在一些情況下，提供呈單一組合物或溶液形式以便一起投與之肽或多肽及另一活性劑將為適宜的。在其他情況下，將另一藥劑與該多肽分開投與可為更有利的。

關於使用，本文所描述之肽及多肽之醫藥組合物可以單位劑型形式提供，該單位劑型含有在單次投藥中有效之量的肽或多肽。適合用於皮下投與之單位劑型包括預裝填注射器及注入器。

在一些實施例中，AV-肽/多肽係以醫藥組合物形式提供及/或與一或多種其他治療劑共投與(並行或串聯)。此類其他藥劑可用於進一步降低甘油三酯含量或用於治療相關問題(例如膽固醇含量升高、高血壓等)病狀或疾病。其他藥劑可包括但不限於：纖維酸衍生物、菸鹼酸、ω-3脂肪 酸、激素藥物(例如美曲普汀(metreleptin)(MYALEPT))、他汀(例如辛伐他汀(simvastatin)、阿伐他汀(atorvastatin)，羅伐他汀(rosuvastatin)等)、抗血小板劑(例如阿司匹林(aspirin)、氯吡格雷(clopidogrel)、雙嘧達莫(dipyridamole)、噻氯匹定(ticlopidine)等)、抗凝劑(例如殺鼠靈(warfarin)(Coumadin)及肝素)、用於治療糖尿病之藥物(例如磺醯脲、雙胍、美格替奈(meglitinide)、噻唑啶二酮、DPP-4抑制劑、SGLT2抑制劑、α-葡糖苷酶抑制劑、膽汁酸鉗合劑等)、胰島素、GLP-1肽(例如VICTOZA)等。

在一些實施例中，本文所描述之基於AV-肽之組合物係作為套組之一部分而提供。在一些實施例中，本發明之套組包含一或多種基於ApoA-V之肽或多肽。在一些實施例中，套組包含被配置成與一或多種其他組合物(例如醫藥組合物)共投與的基於AV-肽之組合物。在一些實施例中，一或多種基於AV-肽之組合物係與用於使降低甘油三酯或治療或預防高甘油三酯血症或相關疾病或病狀有效增強的一或多種其他藥劑共投與。

在一些實施例中，基於AV-肽之組合物係為降低甘油三酯濃度、增強降解(例如水解)及/或治療或預防高甘油三酯血症、心血管疾病、關節硬化、急性胰腺炎、糖尿病、肝性脂肪變性及/或相關疾病及病狀而提供。對所描述之特徵及實施例的各種修改、重組及變化對熟習此項技術者而言將為顯而易知的，而不會背離本發明之範疇及精神。雖然已描述特定實施例，但應瞭解如所主張之本發明不應過度受限於此類特定實施例。實際上，對所描述之模式及實施例的對相關領域之熟練人員而言明顯的各種修改旨在在以下申請專利範圍之範疇內。

如本文所陳述，在一些實施例中，提供治療高甘油三酯血症之方法。該等方法包括以足以降低血液甘油三酯含量之量、按足以達成以目的之時程向高甘油三酯血症患者投與如本文所描述之肽或多肽且持續足以達成以目的之持續時間。

在某些實施例中，患者具有極限高甘油三酯血症，其定義為在本文所提供之治療之前非空腹血漿甘油三酯(「TG」)含量885mg/dL。在一些實施例中，患者具有嚴重高甘油三酯血症，其定義為治療前TG含量在500與885mg/dL之間。在一些實施例中，患者在治療之前具有難治性 高甘油三酯血症，其定義為TG含量在200mg/dL與500mg/dL之間。在其他實施例中，患者在治療之前具有在150mg/dL與200mg/dL之間的邊界高甘油三酯血症。在常規實施例中，患者將具有高甘油三酯血症，儘管在起始本文所提供之治療之前已用一或多種其他治療劑進行治療。

在某些實施例中，患者將具有乳糜微粒血症。在一些實施例中，患者將具有超過正常值之LDL-c含量。在一些實施例中，患者將具有低於正常含量之HDL-c。

在一些實施例中，患者將具有胰腺炎。在一些實施例中，患者將具有糖尿病。在某些實施例中，患者將具有代謝症候群。一些患者將具有肝脾腫大。一些患者將具有非酒精性脂肪性肝炎(「NASH」)。一些患者將具有脂肪代謝障礙(例如先天性、後天性、全身性、部分性等)。

在某些實施例中，患者為成人。在其他實施例中，患者為兒童。

在多個實施例中，多肽係以足以使甘油三酯含量與即將治療起始前之含量相比降低至少5%、10%、15%、20%或25%或更多之量、按足以達成以目的之時程投與且持續足以達成以目的之持續時間。在一些實施例中，多肽係以足以使甘油三酯含量降低至少30%、35%、40%、45%或50%之量、按足以達成此目的之給藥時程投與且持續足以達成此目的之持續時間。在特定實施例中，多肽係以足以使甘油三酯含量降低至少55%、60%、65%、甚至至少約70%或更多之量、按足以達成此目的之時程投與且持續足以達成此目的之時間。

在某些實施例中，多肽係以不管給藥頻率如何均表述為日等效劑量之量投與，該量為每天50微克(「mcg」)、每天60mcg、每天70mcg、每天75mcg、每天100mcg、每天150mcg、每天200mcg或每天250mcg。在一些實施例中，多肽係以每天500mcg、每天750mcg或每天1毫克(「mg」)之量投與。在其他實施例中，多肽係以不管給藥頻率如何均表述為日等效劑量之量投與，該量為每天1-10mg，包括每天1mg、每天1.5mg、每天1.75mg、每天2mg、每天2.5mg、每天3mg、每天3.5mg、每天4mg、每天4.5mg、每天5mg、每天5.5mg、每天6mg、每天6.5mg、每天7mg、 每天7.5mg、每天8mg、每天8.5mg、每天9mg、每天9.5mg或每天10mg。

在多個實施例中，多肽係按每月給藥時程投與。在其他實施例中，多肽係每兩週投與。在其他實施例中，多肽係每週投與。在某些實施例中，多肽係每天(「每天一次」)投與。在所選實施例中，多肽係一天投與兩次(「每天兩次」)。

在典型實施例中，多肽係投與至少3個月、至少6個月、至少12個月或更久。在一些實施例中，多肽係投與至少18個月、2年、3年或更久。

在典型實施例中，多肽係非經腸投與。在一些非經腸實施例中，多肽係皮下投與。在一些非經腸實施例中，多肽係肌肉內投與。在其他實施例中，多肽係靜脈內投與。在某些實施例中，多肽係藉由皮下植入滲透性微型泵(Intarcia)來進行投與。

在其他實施例中，多肽係鼻內投與。在某些實施例中，多肽係藉由吸入投與。在其他實施例中，多肽係藉由頰內投與或藉由舌下投與而經口投與。

在其他實施例中，多肽係經皮投與。

在某些較佳實施例中，多肽係藉由皮下注射以0.5-5.0mg之量每天投與一次，持續至少6個月。

在典型實施例中，多肽係作為設計成降低甘油三酯含量之膳食的輔助物來進行投與。

在多個實施例中，多肽係與至少一種其他治療劑組合投與。典型地，在此類實施例中，其他治療劑係以單獨的組合物形式投與。在此等實施例中之某些中，其他治療劑係藉由與本文所描述之多肽不同的投藥途徑及/或按不同的給藥時程來進行投與。

在組合實施例中之某些中，至少一種其他藥劑中之至少一者選自由以下組成之群：菸鹼酸、ω-3多不飽和脂肪酸；貝特(fibrate)；米泊美生(mipomersen)；及阿利潑金(alipogene tiparvovec)。在特定實施例中，ω-3多不飽和脂肪酸選自由以下組成之群：乙基二十碳五烯酸(icosapent ethyl)；ω-3羧酸；及ω-3-酸乙酯。在某些實施例中，至少一種其他藥劑為他汀。在 某些實施例中，他汀選自由以下組成之群：普伐他汀(pravastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀、阿伐他汀、氟伐他汀(fluvastatin)，羅伐他汀、替伐他汀(tenivastatin)及匹伐他汀(pitavastatin)。

實驗 實例1 apoA-V中之脂酶刺激結構域

apoA-V為343個胺基酸之相對大的蛋白質且其已被認為具有三種活性：脂質結合、肝素/受體結合及脂酶活化(圖1)。吾人特別關注的是apoA-V中刺激脂酶活性之結構域，而在人類群體中已確定之許多突變已幫助闡明其位置。近來由Mendoza-Barberá及同事進行之描繪在HTG患者中之三種不相關APOA5突變之重要研究(Sharma等人(2014)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.34,2254-2260；其以全文引用之方式併入本文中)識別了顯著削弱apoA-V之脂酶刺激活性的(Ser232-Leu235)del及Leu253Pro。此缺失對應於先前報導之具有強硫酸乙醯肝素結合潛能之富含帶正電荷殘基之42胺基酸序列且顯示為細胞表面結合所必需的(Nilsson等人(2007)Biochemistry 46,3896-3904；其以全文引用之方式併入本文中)。Pro殘基(在Leu253Pro中)當僅置換一個殘基位置時被視為蛋白質結構破壞者且將可能在蛋白質構象中引入顯著變化從而影響周圍區域。此區域亦與一項更早之報導一致，該報導顯示缺失殘基192-238之重組apoA-V具有削弱之結合脂質及活化脂酶活性之能力(Sun等人(2006)Chem.Phys.Lipids 143,22-28；其以全文引用之方式併入本文中)。

繪製apoA-V之與高甘油三酯血症及/或CAD有關之所有已知序列變異體揭示殘基199-259內之突變簇(圖1B)。apoA-V之3D模型係以富含α-螺旋之結構推導出來且預示結構富含α-螺旋(圖1C)。殘基199-259似乎構造成由短環連接之兩個分開的α-螺旋。後續實驗係部分基於構造(例如合成)及測試跨越殘基199-237(AV199-237)與殘基250-288(AV250-288)之兩個肽來加以設計。

apoA-V之3D結構尚未解決，因此在展開本文所描述之實施例期間所進行之實驗中，使用基於網路之伺服器(Phyre2)來預測3D結 構，其表明殘基200-245似乎摺叠成α-螺旋，而不是隨機未摺叠結構(圖2)。序列檢驗揭示螺旋打斷者殘基(P、G)將此結構域與蛋白質序列之其餘部分分開且將α-螺旋之末端區分開。

為尋找脂酶刺激物，採用了脂酶分析，其使用由Molecular Probes供應之可商購獲得之螢光-TG受質(EnzChek)(圖3)。該方案係由Basu等人(Basu等人(2011)J.Lipid Res.52,826-832；其以全文引用之方式併入本文中)改變而來，其中在pH值及洗滌劑方面有微小的修改。對於活體外分析，將LpL(SIGMA)在製備於96孔黑色微量滴定板中之20mM Tris-HCl、150mM NaCl、1% BSA、0.015% Zwittergent 3-14(pH 7.8)、1μM EnzChek受質中稀釋至0.12μg/ml。對於一些分析，將板在37℃下孵育10min。在Synergy H1多模式讀數器中使用分別為482nm及515nm之激發/發射波長進行偵測。分析表明分析物對nmol/L LpL敏感且在增加之酶濃度情況下之直線表明受質濃度不具限制性。此外，可使用BODIPY-C12脂肪酸來定量所製備之產物以確定酶反應之莫耳速率。由於該分析使用無毒受質及低量之中性洗滌劑，故有可能在活細胞情況下使用此分析(圖4)。所分析之脂酶活性對自肝細胞表面移除脂酶(HL)(藉由肝素預洗滌)與在經分離脂蛋白、VLDL、LDL及HDL製劑中存在脫輔基脂蛋白兩者均敏感。

實例2 合成肽

合成(圖2B)並測試對LpL活性之影響(圖5A-B)的第一種肽為AV199-237。起初，當添加肽至LpL中時，未觀測到活性變化；然而，在將肽與極低密度脂蛋白(VLDL)一起孵育然後添加至LpL中後，水解活性增加約4倍。對於AV250-288，在存在(圖5E)或不存在(圖5D)VLDL之情況下，觀測到極小刺激活性或未觀測到刺激活性。然而，在活細胞分析中，AV-肽之脂酶刺激活性不需要VLDL，表明該肽直接作用於脂酶(圖6及8)。在AV199-237情況下之此活性增加超過了在先前報導亦增加LpL活性之apoC-II肽(C-II50-79)情況下所見之結果。亦已報導在高濃度下apoC-II抑制脂酶活性。

AV199-237在細胞培養物中亦極有效刺激脂酶活性(圖6)。 肝脂酶(HL)增加約3倍且該作用為可飽和的，與肽作用於特定且有限集合之脂酶一致。此觀測結果亦為獨特的，因為LpL及HL為不同的脂酶，表明與未曾對HL有影響之apoC-II不同，apoA-V及其擬肽物可刺激LpL與HL兩者。亦值得注意的是，對細胞培養物中HL之刺激持續至少75min(分析停止)。

為確定脂酶刺激功能是否可定位至更短的肽序列，產生一系列縮短之肽以在脂酶分析中進行測試(圖7B、7D)。在活體外LpL與細胞培養物分析兩者中進行之測試均揭示AV199-237可縮短5個殘基且所得AV199-232肽具有完全活性且實際上稍微更有效(圖8)。

實例3 LpL酶動力學及AV199-232

研究了AV199-232對LpL活性之動力學參數(例如Vmax及Km)的影響(圖9A-B)。觀測到添加VLDL使LpL對受質之親和力降低(Km增加)約5倍。此係歸因於VLDL之apoC-III含量。然而，添加AV199-232(2.5μM)使Km實質上提高幾乎8倍，表明AV199-232可能結合於LpL且以變構方式刺激其活性位元點。AV199-232在VLDL中存在apoC-III之情況下亦具功能性。比較了不同脂蛋白對LpL動力學之影響(圖9D)。HDL或LDL兩者均對Km無顯著影響。

鑒於在AV199-232之由交替的極性及非極性殘基組成之序列中似乎存在週期性，研究了肽摺叠成兩親性α-螺旋之可能性(圖10)。將AV199-232與AV199-237兩者藉由圓二色性光譜學加以分析，且發現AV199-232含有α-螺旋結構，其螺旋性質在添加肝素後有所增加證實肝素結合活性。經由電腦模擬分析亦預測到高α-螺旋含量。此等資料驗證了AV-肽之螺旋輪狀外觀之用途，其為用於有助於可視化脫輔基脂蛋白中之功能性結構域構造之常用工具。對AV199-232之呈螺旋輪形式之表示揭示3或4個離散結構域(圖11)。在經構造為螺旋之相對側的極性殘基及非極性殘基(結構域-L)存在下，肽之兩親性質為明顯的。結構域-L負責結合於VLDL。亦在極性側確定結構域-1、結構域-2及結構域-H。

為研究此等結構域對於脂酶活化之潛在重要性，設計一系列 肽，其中有限集合之帶電荷殘基以與α-螺旋結構相容之極性不帶電荷殘基置換(圖12)。結構域1及結構域2與AV199-232活性高度相關。Dom1(Dom1KO；R12Q/D30S)及Dom2(Dom2KO；K13Q/K17Q)中之取代使得LpL刺激活性顯著降低(圖13)。Dom1(E34K)不影響AV199-232活性，表明E34不發揮功能性作用(圖13A)。DomL(DomLKO；L10Q/L21Q/L29Q)內之取代使得活性適度降低(圖13A)。藉由施加增加濃度之肽至肝素-瓊脂糖4B管柱(0.2mL)來比較AV199-232、Dom1KO及Dom2KO之肝素結合活性(圖13B)。測試此等突變肽證實結構域-1為LpL活化所必需的，且結構域-2具有肝素結合位點且亦與LpL之活化高度相關(圖13)。

結構域-H亦為所關注的，因為與其他胺基酸不同，其為僅有的可在接近於細胞表面錨定脂酶處可發現之微酸性pH值下自中性變成正電荷之殘基。合成H以K置換之AV199-232肽(AV-H/K)且評估其對脂酶刺激之影響(圖14)。AV-H/K能夠在不存在VLDL之情況下使LpL活性增加約1.6倍且在VLDL存在下增加約8倍，此對應於相對於AV199-232活性增強44%。

對已設計且針對脂酶刺激進行測試之主要肽之概述列於圖17中。CD分析與經由電腦模擬預測均有力地支持本文所描述之AV-肽的經高度組織化之α-螺旋結構。此結構資訊已允許確定先前在AV199-232中未識別之4個結構域，此與在展開本文所描述之實施例期間所進行之實驗一致，該等結構域中之兩者(結構域-1及結構域-H)對於直接刺激脂酶活性而言為重要的。此外，如由在包括VLDL之情況下的活性改良所證實，脂質結合域-L對活性而言亦為重要的。此後一觀測結果具有許多關於研製AV-肽作為治療劑之積極暗示。首先，TG通常經包裝且在VLDL及其他富TG脂蛋白中循環，且吾人之資料表明AV-肽與此等脂蛋白締合。其次，此脂蛋白親和力可顯著改良其活體內生物可用性。最後，AV-肽能夠克服VLDL中之apoC-III的抑制作用且極接近於apoC-III可能對此活性而言為關鍵的。AV-肽亦在活細胞系統中且在存在不同脂酶家族成員(例如LpL及HL)之情況下起作用之能力亦指示AV-肽可具有強活體內存在度且對HTG具有治療性影響。最後，在結構域-H中H以K取代已實質上改良AV199-232肽之效能。 基於在展開本文所描述之實施例期間所進行之實驗，在本文所描述之範疇內的其他修飾預期可具有類似改良之效能。

實例4

在展開本文中之實施例期間進行實驗，以證實AV199-232結合VLDL且肽-脂蛋白複合物刺激LpL活性。將VLDL(100μg)與AV199-232(50μg)一起孵育且在瓊脂糖CL-4B管柱上藉由凝膠過濾將複合物與遊離肽分離(圖15A)。含有VLDL：AV199-232複合物之空隙部分(Vo)在刺激LpL活性方面為有效的(圖15B)。

在展開本文中之實施例期間進行實驗以確定在AV-H/K肽之結構域L中之突變關鍵殘基之作用，且結果表明調整本文中之AV肽的脂質結合階段的取代適合用於改良脂酶刺激效能。AV-H/K中之L10F及L29F取代(SEQ ID NO：23)使得脂酶刺激活性提高約2倍，而L10Q、L21Q及L29Q取代(SEQ ID NO：22)降低脂酶刺激活性(圖16A,B)。預期L結構域中之L至F及L至Q取代分別使得與VLDL之結合增加及降低。將肽(80μg/ml)與VLDL(20μg/ml)一起預孵育，然後添加LpL及受質。在室溫下連續監測脂酶反應持續16min(A)，或者在37℃下孵育10min(B)。

實例5 AV199-232之丙胺酸掃描

在展開本文中之實施例期間進行實驗以確定AV199-232之個別殘基之側鏈身份的相對重要性。為此，對AV199-232肽進行丙胺酸掃描，將各殘基個別地以丙胺酸殘基加以置換(除了位置1、18、20及23，此等位置已為丙胺酸)，且評估所得肽之脂酶刺激活性(圖18)。脂酶刺激活性顯著降低確定一位置對於直接結合於LpL而言為重要的或者在幫助正確安置AV199-232中之LpL刺激殘基中發揮間接結構性作用。基於此等數據，殘基大致分為三個類別：(1)以丙胺酸置換產生AV199-232之>75%脂酶刺激活性的殘基，(2)以丙胺酸置換產生AV199-232之25-75%脂酶刺激活性的殘基，及(3)以丙胺酸置換產生AV199-232之<25%脂酶刺激活性的殘基。丙胺酸掃描之結果表明歸入此等三個類別之殘基的側鏈(1)與脂酶刺激最低程度相關，(2)與脂酶刺激適度相關，及(3)與脂酶刺激高度相關。在圖18中將在 AV199-232序列中之大多數高度相關之殘基加下劃線。此等結果與本文所呈現之生物化學研究(實例2及3)、分子模型化研究(實例6)及生物資訊學(實例8)資料一致。

實例6 分子模型化及3D對接

藉由使用Phyre2之基於同源性之模型化繼之以在GalaxyWEB進行之模型改進來產生LpL(左)及AV199-232(右)之3D結構(圖19)。LpL以兩種姿態顯示，突出顯示不同功能區域。催化三元體(S132、D156、H241)位於具有充當覆蓋催化袋之蓋子的相關聯22殘基環的「袋」中，且在受質識別中起作用(圖19，左/上)。顯示AV199-232模型具有結構域L(面向下之疏水性脂質結合域)(圖19，右)。

使用ClusPro 2.0(cluspro.bu.edu/login.php)進行分子對接實驗以評估apoC-III與LpL之結合(圖20)。LpL以條帶狀視圖顯示，且apoC-III顯示具有呈球形形式之側鏈。對於apoC-III(PDB ID：2JQ3)，預測對接在脂酶催化位點附近，且apoC-III之N端序列連接至蓋序列之近端邊緣。

使用ClusPro 2.0(cluspro.bu.edu/login.php)進行分子對接實驗以評估AV199-232與LpL之結合。呈現排在頂部之姿態(最高成簇數(highest cluster number))(圖21及22)，顯示LpL(條帶(圖21)或主鏈(圖22))：AV199-232(側鏈球)複合物(左側圖片)。相互作用可因側鏈隔開約4Å或更少且形成鹽橋或H鍵而得以穩定。對LpL：AV199-232接觸點之檢驗指示多至7個殘基配對使AV199-232：LpL相互作用穩定(右側圖片)；(1)R2-D234(2.2Å)，(2)L3-L236(4.8Å)，(3)K13-E62(1.9Å)，(4)K17-D25(1.7Å)，(5)K19-E11(3.1Å)，(5b)H22-E11(4.2Å)，(6)R24-E24(2.1Å)及(7)R33-E35(1.8Å)。此等配對與本文呈現之其他實驗(例如丙胺酸掃描結果)高度一致(圖18)。

實例7 活體內LpL活性刺激

在展開本文中之實施例期間進行實驗以證實AV-肽在刺激人類血液樣品中之LpL活性中具活性，且因此預期在活體內起刺激作用。 圖23A證實在分離自新鮮人類血液之活白血球中之LpL對AV199-232治療作出反應。以肝素移除細胞表面LpL使活性降低。在人類血漿存在下AV-H/K亦刺激LpL(圖23B)。

血漿含有具有作為LpL活性之已知抑制劑的apoC-III及ANGPT4之脂蛋白。然而，AV199-232刺激活白血球中之LpL活性(圖23C)。

在正常及脂代謝異常血漿存在下，AV199-232刺激LpL活性(圖23D)。將AV199-232與來自正常及糖尿病/脂代謝異常血漿之全血漿一起孵育，且然後藉由PEG-8000沈澱分離富TG脂蛋白(Lp)，且添加至LpL分析物中(30μg/ml)。實驗證實AV199-232與血漿中之LpL締合且將其活化。

實例8 AV199-232同源性分析

由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)蛋白質資料庫進行同源性檢索，以確定AV199-232肽序列之直系同源物，且確定在類似序列之間不變或可允許取代之殘基。使用在NCBI BLASTP網站上之缺省參數。結果組織於表1中，以確定一組對AV199-232肽中之殘基適合之胺基酸取代。

以下所列及/或本文提供之所有出版物及專利係以全文引用之方式併入本文中。所描述之本發明組合物及方法之各種修改及變化對熟習此項技術者而言將顯而易知，而不會背離本發明之範疇及精神。雖然已結合特定較佳實施例描述本發明，但應瞭解如所主張之本發明不應過度受限於此類特定實施例。實際上，對所描述之用於進行本發明之模式進行的對相關領域熟練人員而言明顯的各種修改旨在在本發明範疇內。

參考文獻

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<160> 29

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 343

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 60

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 39

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 29

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

<210> 5

<211> 34

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

<210> 6

<211> 32

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

<210> 7

<211> 28

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

<210> 8

<211> 26

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

<210> 9

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變野生型肽

<400> 9

<210> 10

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變野生型肽

<400> 10

<210> 11

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變野生型肽

<400> 11

<210> 12

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變野生型肽

<400> 12

<210> 13

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變野生型肽

<400> 13

<210> 14

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變野生型肽

<400> 14

<210> 15

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變野生型肽

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (13)..(13)

<223> Xaa=任何胺基酸

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (17)..(17)

<223> Xaa=任何胺基酸

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (22)..(22)

<223> Xaa=任何胺基酸

<400> 15

<210> 16

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變野生型肽

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (13)..(13)

<223> Xaa=任何胺基酸

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (17)..(17)

<223> Xaa=任何胺基酸

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (22)..(22)

<223> Xaa=任何胺基酸

<400> 16

<210> 17

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變野生型肽

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (13)..(13)

<223> Xaa=K或Q

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (17)..(17)

<223> Xaa=K或Q

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (22)..(22)

<223> Xaa=H、K或Q

<400> 17

<210> 18

<211> 93

<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

<210> 19

<211> 39

<212> PRT

<213> 智人

<400> 19

<210> 20

<211> 32

<212> PRT

<213> 智人

<400> 20

<210> 21

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變野生型肽

<400> 21

<210> 22

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變野生型肽

<400> 22

<210> 23

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變野生型肽

<400> 23

<210> 24

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變野生型肽

<400> 24

<210> 25

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變野生型肽

<400> 25

<210> 26

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變野生型肽

<400> 26

<210> 27

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變野生型肽

<400> 27

<210> 28

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變野生型肽

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (12)..(12)

<223> Xaa=高精胺酸

<400> 28

<210> 29

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變野生型肽

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (3)..(3)

<223> Xaa=L、F、Y或W

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (4)..(4)

<223> Xaa=S、T、N或G

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (5)..(5)

<223> Xaa=R、K、高離胺酸或高精胺酸

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (6)..(6)

<223> Xaa=C、S、T、N、Q、Y或H

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (7)..(7)

<223> Xaa=V、F、Y或W

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (10)..(10)

<223> Xaa=L、F、Y或W

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (12)..(12)

<223> Xaa=R、K、hLys或hArg

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (13)..(13)

<223> Xaa=K、R、hArg、hLys或Orn

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (14)..(14)

<223> Xaa=L、F、Y或W

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (17)..(17)

<223> Xaa=K、R、hArg、hLys或Orn

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (18)..(18)

<223> Xaa=A、F、Y或W

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (19)..(19)

<223> Xaa=R、K、hLys或hArg

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (21)..(21)

<223> Xaa=L、F、Y或W

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (22)..(22)

<223> Xaa=H、K、hLys、R、hArg或Orn

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (25)..(25)

<223> Xaa=I、F、Y或W

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (29)..(29)

<223> Xaa=L、F、Y或W

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (32)..(32)

<223> Xaa=L、F、Y或W

<400> 29

Claims (27)

1. 一種包含合成肽或多肽之組合物，該合成肽或多肽與SEQ ID NO：1(全長ApoA-V)具有低於100%之序列一致性，涵蓋與SEQ ID NO：8(AV199-224)具有至少50%之序列一致性的部分，且展現脂酶刺激活性。
2. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該肽或多肽與SEQ ID NO：8具有至少80%之序列相似性。
3. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該肽或多肽與SEQ ID NO：3(AV199-237)具有低於100%之序列一致性但超過50%之序列一致性。
4. 如申請專利範圍第3項之組合物，其中該肽或多肽與SEQ ID NO：3具有至少80%之序列相似性。
5. 如申請專利範圍第1項之組合物，其包含與SEQ ID NO：5(AV199-232)具有低於100%之序列一致性但超過50%之序列一致性的肽。
6. 如申請專利範圍第5項之組合物，其中該肽與SEQ ID NO：5具有至少80%之序列相似性。
7. 如申請專利範圍第5項之組合物，其中該肽與SEQ ID NO：10具有低於100%之序列一致性但超過50%之序列一致性。
8. 如申請專利範圍第7項之組合物，其中該肽與SEQ ID NO：10具有至少80%之序列相似性。
9. 如申請專利範圍第5項之組合物，其中該肽與SEQ ID NO：11具有低於100%之序列一致性但超過50%之序列一致性。
10. 如申請專利範圍第9項之組合物，其中該肽與SEQ ID NO：11具有至少80%之序列相似性。
11. 如申請專利範圍第5項之組合物，其中該肽與SEQ ID NO：12具有低於100%之序列一致性但超過50%之序列一致性。
12. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中該肽與SEQ ID NO：12具有至少80%之序列相似性。
13. 如申請專利範圍第1項至第12項中之一項的組合物，其中該肽或多肽相對於SEQ ID NO：1(全長ApoA-V)展現增強之脂酶刺激活性。
14. 一種醫藥製劑，其包含：(a)如申請專利範圍第1項至第13項中之一項 的肽或多肽；及(b)生理學上可接受之緩衝液或載劑。
15. 一種融合肽或多肽，其包含如申請專利範圍第1項至第13項中之一項的肽或多肽以及官能性肽或多肽片段。
16. 如申請專利範圍第15項之融合肽或多肽，其中該官能性肽或多肽片段包含信號傳導部分、治療性部分、定位部分、可偵測部分或分離/純化部分。
17. 一種聚核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1項至第13項中之一項的肽或多肽。
18. 一種核酸載體，其包含如申請專利範圍第17項之聚核苷酸。
19. 如申請專利範圍第18項之核酸載體，其進一步包含啟動子及/或一或多個表現元件。
20. 一種治療高甘油三酯血症或相關病狀或疾病之方法，其包括向罹患高甘油三酯血症或該相關病狀或疾病之個體投與如申請專利範圍第1項至第13項中之一項的肽或多肽。
21. 一種預防高甘油三酯血症或相關病狀或疾病之方法，其包括向處於高甘油三酯血症或該相關病狀或疾病風險中之個體投與如申請專利範圍第1項至第13項中之一項的肽或多肽。
22. 一種治療或預防個體之動脈粥樣硬化及/或心血管疾病之方法，其包括向個體投與如申請專利範圍第1項至第13項中之一項的肽或多肽。
23. 如申請專利範圍第22項之方法，其包括共投與：(a)該肽或多肽，及(b)用於治療及/或預防動脈粥樣硬化及/或心血管疾病之治療及/或治療劑。
24. 如申請專利範圍第23項之方法，其中(a)及(b)係同時及/或以單一醫藥製劑之形式投與。
25. 如申請專利範圍第23項之方法，其中(a)及(b)係並行及/或以分開的醫藥製劑之形式投與。
26. 一種降低樣品中之甘油三酯濃度的方法，其包括：(a)向包含(i)甘油三酯及(ii)甘油三酯水解脂酶之樣品投與如申請專利範圍第1項至第13項中之一項的肽或多肽；或(b)向包含甘油三酯之樣品投與：(i)如申請專利範圍第1項至第13項中 之一項的肽或多肽，及(ii)甘油三酯水解脂酶。
27. 如申請專利範圍第26項之方法，該等甘油三酯水解脂酶選自由以下組成之群：脂蛋白脂酶(LpL)、內皮脂酶(EL)及肝脂酶(HL)。