CN102206249A - 乙型脑炎病毒ns1蛋白特异性b细胞抗原表位多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了乙型脑炎病毒NS1蛋白特异性B细胞抗原表位多肽序列，还公开了该抗原表位多肽在诊断乙型脑炎病毒中的用途及其筛选方法，属于分子免疫学领域。本发明所述的抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所示。本发明JEV NS1蛋白特异性B细胞抗原表位合成多肽、合成表位多肽偶联抗原以及抗原表位融合表达蛋白作为抗原可用于特异性地检测机体免疫或感染后产生的抗JEV NS1蛋白抗体。可用于JEV感染诊断，疫苗免疫效果评价以及鉴别诊断灭活疫苗免疫与自然感染。
Description
技术领域
本发明涉及抗原表位多肽，尤其涉及乙型脑炎病毒JEV NS1蛋白特异性B细胞抗原表位多肽，本发明还涉及该抗原表位多肽在诊断乙型脑炎病毒中的应用，属于分子免疫学领域。
背景技术
流行性乙型脑炎是由乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus，JEV)引起的一种重要蚊媒性人兽共患传染病。该病毒首先于1953年在日本从患者脑组织中分离获得，因此称日本脑炎病毒，所致疾病在日本称日本乙型脑炎。在我国最早于1940年分离此病毒，为了与甲型脑炎相区别，定名为流行性乙型脑炎，简称乙脑。在世界范围内每年有30,000-50,000例乙脑病例，约25％-30％死亡，50％导致永久性中枢神经系统后遗症。我国近年每年的乙脑病例大于5000例，死亡200例以上。对于流行性乙型脑炎病毒多种动物易感，但除人、马和猪外通常不呈现临床症状。对人主要引起中枢神经系统的急性感染，人感染临床上以高热、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭及脑膜刺激征为特征。母猪感染可引起流产、产死胎或木乃伊胎，公猪感染导致睾丸肿大影响繁殖性能为特征，少数猪只感染可能呈现发热和神经症状，而其他猪则大多数不呈显症状。给养猪业造成巨大的经济损失。马属动物易感染，少数引起脑炎与神经症状，马是终末宿主。蚊是JEV的主要传播媒介，猪是该病毒在自然界中最重要的贮存与增殖宿主。乙型脑炎病毒主要在亚洲流行，而最近发现在南半球也有报道，这说明流行性乙型脑炎可能在世界范围内威胁着人类健康。
乙型脑炎病毒JEV属黄病毒科，黄病毒属，为单链正链RNA病毒。基因组约11kb，包含一个大的开放阅读框架(ORF)，两端是5’端和3’端非编码区(UTR)。基因组5’端有帽子结构，但在3’端没有poly(A)尾。ORF编码含3432个氨基酸的前体蛋白，在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为10个成熟蛋白，包含3个结构蛋白(C，prM，E)，7个非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)。病毒粒子呈球形，直径约30nm，有囊膜。JEV只有一个血清型，在抗原性上与西罗病毒、墨罗河谷脑炎病毒、圣路易脑炎病毒等属同一血清群，存在抗原交叉反应。病毒囊膜糖蛋白具有血凝特性，能凝集鹅、鸽、雏鸡等动物红细胞。病毒对热抵抗力弱，56℃30分钟或100℃2分钟即可灭活，但对低温和干燥的抵抗力很强。乙醚、1∶1000的去氧胆酸钠以及常用消毒剂均可灭活病毒，在酸性条件下不稳定，适宜pH8.5～9.0。
采用疫苗进行预防接种是控制该病流行的有效措施。对人或动物机体的JEV抗体检测是了解JEV感染或免疫情况的重要内容，也是指导免疫预防的重要科学依据。NS1蛋白是乙脑病毒的一种重要的非结构蛋白，不存在于病毒粒子结构中，只有在自然感染或弱毒疫苗免疫情况下机体才产生抗NS1蛋白抗体，而灭活疫苗免疫或亚单位疫苗免疫则不产生NS1蛋白抗体。所以检测NS1蛋白抗体可以诊断JEV感染，以及鉴别诊断灭活苗免疫与感染。JEV E蛋白极易与其它黄病毒如登革病毒、西尼罗病毒等产生血清学交叉反应而影响诊断结果。而JEV NS1蛋白抗体特异性强，与特性相近的其它黄病毒如登革病毒、西尼罗病毒等血清学交叉反应极低。以NS1蛋白为靶抗原检测具有很强的特异性。更进一步地，采用NS1蛋白特异性抗原表位多肽为抗原检测相应抗体则可以进一步提高检测的特异性，也可以更好地进行质量标准控制。有利于提高试剂盒的质量标准化与生产控制水平，也可以提高检测诊断结果的特异性。
发明内容：
本发明的目的之一提供乙型脑炎病毒JEV NS1蛋白特异性B细胞抗原表位多肽。
本发明的目的之二是将所述的乙型脑炎病毒JEV NS1蛋白特异性B细胞抗原表位多肽应用于制备成诊断或检测乙型脑炎病毒的试剂。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种乙型脑炎病毒JEV NS1蛋白特异性B细胞抗原表位多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示(340H-HDETTLVRSQV-OH350)。该抗原表位序列在不同JEV毒株中高度保守，只有少数毒株中该序列中第四位氨基酸T突变为A。
通过试验进一步发现，将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中第四位氨基酸残基T替换为A后，所得到的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示(340H-HDEATLVRSQV-OH350)与SEQ ID NO：1具有同样的与NS1蛋白单抗结合活性。
其中，可以对所述的乙型脑炎病毒JEV NS1蛋白特异性B细胞抗原表位的N端或C端进行化学修饰。所述的化学修饰为多肽链N端的自然氨基化或乙酰化，或C端的自然羧基化或酰胺化。
本发明中所述的乙型脑炎病毒JEV NS1蛋白特异性B细胞抗原表位多肽可以通过固相多肽合成方法合成得到，也可以通过基因工程技术制备得到，这些都为本领域人员所通晓。
本发明乙型脑炎病毒JEV NS1蛋白特异性B细胞抗原表位或其连接物可用于制备抗原，用于检测抗乙型脑炎病毒JEV抗体或抗乙型脑炎病毒JEV多肽抗体的试剂。
检测乙型脑炎病毒JEV可以针对NS1蛋白抗原表位的单克隆抗体或针对抗原表位多肽的多克隆抗体，检测方法可以包括间接ELISA、双抗体夹心ELISA、直接免疫荧光技术、间接免疫荧光技术，快速检测试纸条免疫膜层析技术等。
检测乙型脑炎病毒JEV抗体，包括野毒感染产生抗体，疫苗免疫产生抗体，母源抗体，抗JEV单克隆抗体等。检测方法可以包括间接ELISA、双抗体夹心ELISA，快速检测试纸条免疫膜层析技术等。
蛋白质抗原B细胞抗原表位鉴定的方法有多种，如基因工程定点突变表达抗原蛋白分析法、噬菌体随机肽库筛选技术、合成多肽检测技术等。本项发明在鉴定抗原表位中主要采用的是基因工程技术融合表达NS1蛋白，纯化后免疫小鼠，筛选制备单克隆抗体。进一步采用基因工程技术融合表达JEV NS1蛋白重叠多肽(overlapping)，体外免疫反应检测多肽融合蛋白组与NS1蛋白单克隆抗体的结合性鉴定抗原表位序列，进一步缩短表达表位融合蛋白，鉴定抗原表位的序列结构；再应用合成多肽技术验证表位的正确性；用合成表位多肽偶联抗原建立JEV抗体免疫学检测方法。
本发明的有益效果如下：
1.将本发明的乙型脑炎病毒JEV NS1蛋白特异性B细胞抗原表位多肽或多肽与载体蛋白偶联物作为抗原能够检测乙型脑炎病毒JEV抗体或抗乙型脑炎病毒JEV多肽抗体。
2.本发明的乙型脑炎病毒NS1蛋白特异性B细胞抗原表位多肽具有比E蛋白更强的特异性，可减少检测结果的假阳性率。
3.本发明的乙型脑炎病毒NS1蛋白特异性B细胞抗原表位或其连接物作为抗原，抗原纯度更高，可克服基因工程表达抗原纯化中菌体杂蛋白的残留所致的非特异性反应。
4.本发明的乙型脑炎病毒NS1蛋白特异性B细胞抗原表位或其连接物作为抗原检测乙型脑炎病毒JEV抗体或抗乙型脑炎病毒JEV多肽抗体。所生产的抗原可以仪器自动化生产，质量易均一，检测结果更稳定。
附图说明
图1为JEV NS1蛋白的融合表达分析。图中从左至右依次为：M：蛋白分子量标准；1：未经诱导的菌体蛋白；2：28℃诱导后超声裂解上清蛋白；3-9：纯化的蛋白；
图2为NS1单克隆抗体Westerb-blot分析。单抗可结合感染JEV的BHK-21细胞中的NS1蛋白；
图3为不同毒株乙型脑炎NS1蛋白抗原表位多肽序列的同源性比较。图示结果表明本发明中NS1抗原表位序列在不同JEV毒株中高度保守；
图4为表位多肽偶联蛋白检测人血清JEV抗体结果。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
实施例1 JEV NS1蛋白的融合表达与纯化
根据JEV SA14-14-2株NS1基因序列(基因序列号：AF315119)，设计一对引物，上游引物为：5’CGCCCATGGACACTGGATGTGCCATTGAC 3’在上游引物的5’端引物NcoI酶切位点；下游引物为：5’TTAGGATCCTTAAGCAGCGACTAGCACCACATACC 3’下游引物的5’端引入终止子和BamH I酶切位点。提取JEV感染BHK-21细胞中的总RNA，RT-PCR扩增NS1基因。将NS1蛋白基因经NcoI与BamH I酶切位点克隆至原核表达载体pMAL-c5X中，构建了重组融合表达质粒pc5X-NS1。重组质粒转化宿主菌ER2523后，经IPTG诱导得到可溶性的融合蛋白MBP-NS1(图1)。进一步优化了诱导表达条件为28℃，0.3mmol/L IPTG诱导4h。融合蛋白可经淀粉树脂柱进行纯化。Western blot与间接ELISA分析表明重组融合蛋白MBP-NS1具有良好的抗原性和特异性。
实施例2NS1蛋白单克隆抗体的复制与制备
利用表达纯化的融合蛋白MBP-NS1作为免疫原，免疫6周龄BALB/c小鼠，采用淋巴细胞杂交瘤技术进行融合，经有限稀释法获得1株分泌特异性针对JEVNS1抗体的杂交瘤细胞，命名为3G11。经测定3G11单抗亚类属于IgG2a，轻链为κ链。该株杂交瘤细胞所制备的小鼠腹水中抗体ELISA效价达204800，Western blot证实所得杂交瘤细胞分泌的抗体均可特异地与JEV NS1蛋白反应(图2)，间接免疫荧光试验表明单抗3G11能够识别天然的JEV NS1蛋白。同时也表明该单抗的表位是位于NS1蛋白表面的线性抗原表位，可以进一步鉴定其抗原表位序列。
实施例3重叠(over lapping)多肽融合表达系列JEV NS1蛋白抗原多肽片段并进行间接ELISA筛选单克隆抗体抗原表位
根据JEV NS1蛋白氨基酸序列，设计一系列多肽，这些多肽相互重叠，且覆盖JEV NS1蛋白全长。根据每一条多肽氨基酸序列，设计合成一对DNA链，将DNA链插入表达载体与GST进行融合表达。融合表达的系列重组蛋白与JEVNS1特异性单克隆抗体进行应用性分析，鉴定其线性抗原表位。具体流程如下：
设计多肽序列→合成编码多肽序列的DNA链→多肽融合表达载体构建→诱导表达→表达融合蛋白亲和层析纯化→表达产物与单克隆抗体免疫反应性检测→分析JEV NS1蛋白特异性抗原表位。
试验结果见表1、表2。
表1重叠多肽融合蛋白与JEV NS1特异性单克隆抗体3G11ELISA反应检测结果
注：包被抗原为多肽与GST融合表达蛋白，多肽序列分别如表中所示多肽序列。OD值为三个重复孔平均OD值。
表2截短的表位肽融合蛋白与JEV NS1特异性单克隆抗体3G11ELISA反应结果
注：包被抗原为多肽与GST融合表达蛋白，多肽序列分别如表中所示多肽序列。OD值为三个重复孔平均OD值。
实施例4乙型脑炎病毒JEV NS1蛋白B细胞抗原表位的合成
根据NS1特异性B细胞抗原表位的氨基酸序列，应用固相多肽合成技术，采用自动多肽合成仪或人工多肽合成方法。固相树脂采用Fmoc保护的氨基酸Wang树脂或其它树脂，树脂经DMF溶涨、piperidine胶Fmoc保护后，根据氨基酸序列顺序，加入Fmoc保护的氨基酸，在HBTU存在情况下进行酰化反应。酰化反应完成后经过洗涤，再加入第二位的Fmoc-氨基酸进行酰化反应，并洗涤。如此循环，从多肽序列C末端起始向N末端，按照顺序合成完整的多肽链。合成完成后，根据组成肽链氨基酸不同选取适当试剂用TFA法裂解肽链与树脂的连接并用冷乙醚沉淀TFA多肽，经脱盐纯化、LC-MS和HPLC分析鉴定后备用。在整个合成过程中，每个氨基酸酰化反应后可以应用Kaiser法或TMBS法测试反应的完成情况。为了便于使表位多肽和载体蛋白连接，在合成多肽时可以在多肽序列的N末端加一个半胱氨酸。
根据以上所述的固相多肽合成技术，合成了SEQ NO：1表位多肽。
实施例5乙型脑炎病毒JEV NS1蛋白B细胞抗原表位的化学修饰
按照实施例2的方法合成的多肽片段，其N末端为自然氨基修饰，C末端为自然羧基修饰。
N末端乙酰化修饰方法：按照以上介绍的多肽合成至最后一个Fmoc保护氨基酸偶联结束，并进行N末端Fmoc保护基团的去除，然后进行以下操作。取150μl乙酸酐和20μL EIPEA溶于4.8ml DMF中，充分混合并在冰浴中冷却。然后将以上混合液加入多肽合成反应管中反应5min。再依次用5ml DMF和二氯甲烷(DCM)洗2次，每次5min。氮气吹干后按照常规方法进行侧链保护基团的去除、裂解、纯化和鉴定。
C末端酰胺化修饰方法：C末端酰胺化的多肽合成时应选用树脂为Rink树脂。执行合成程序时应对树脂用DMF溶涨20min，然后从C末端第一位氨基酸开始执行合成程序，同前过Fmoc-wang树脂合成方法。
实施例6乙型脑炎JEV NS1蛋白B细胞抗原表位与载体蛋白KLH和BSA的偶联
载体蛋白KLH或BSA 4mg溶于0.5ml含5mM EDTA的PBS(pH7.2)缓冲液中，加入1.0mg连接剂Sulfo-SMCC，充分溶解后在室温孵育60min或37℃孵育30min。应用Sephadex G-25柱或透析方法脱盐纯化Sulfo-SMCC处理的载体蛋白，并用BCA法测定蛋白含量后备用。
称取实施例4所合成的表位多肽4mg，加入0.5ml重蒸馏水溶解多肽，然后将溶解后的多肽与Sulfo-SMCC处理的载体蛋白混合，4℃孵育2小时或反应过夜，分装备用。
实施例7乙型脑炎病毒JEV NS1蛋白B细胞抗原表位氧化实现自身的连接
含半胱氨酸的多肽可以通过巯基的氧化反应形成自身连接。一般情况下应用DMSO介导的氧化反应实现连接，根据多肽的酸碱性，氧化反应可以在微酸或微碱性条件下进行。
微酸性环境下的氧化反应：用适当浓度的醋酸溶解多肽，使多肽的浓度在0.5-1.5mM范围内，醋酸的终浓度不超过5％，用(NH4)2CO3调整多肽溶液的pH为6.0左右，加入10-20％的DMSO，25℃反应5-25h，氧化反应的进行程度可以通过HPLC监测。然后，用1％TFA水和乙腈为流动相，制备型反相HPLC纯化氧化性多肽。
微碱性环境下的氧化反应：用0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.5，溶解多肽至终浓度1.0mM，加入浓度DMSO至终浓度1％，25℃反应过夜，氧化反应的进行程度可以通过HPLC监测。然后用1％TFA水和乙腈为流动相，制备型反相HPLC纯化氧化性多肽。
实施例8乙型脑炎病毒JEV NS1蛋白B细胞抗原表位及多肽偶联蛋白抗原间接ELISA检测猪抗JEV抗体
用JEV NS1蛋白B细胞抗原表位合成多肽以及表位多肽与载体蛋白(KLH)的连接物为包被抗原，包被96孔聚苯乙烯酶标板。用pH9.6，0.1M碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度为5μg/ml，按100μl/孔加入酶标板中，4℃包被过夜。然后用PBST(PBS+0.05％Tween)洗涤酶标板3次；含1％BSA的PBST封闭酶标板，37℃封闭2h，封闭后用洗液PBST洗板3次，立即用于检测或-20℃存放备用。
抗体检测操作程序：加入待检测猪血清(定性检测血清100倍稀释，抗体效价检测血清进行倍比稀释，同时设立阳性血清对照与阴性血清对照以及不加血清的空白对照)，37℃孵育1h，PBST洗液洗涤3次，每次3分钟；加入辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG(Goat-anti-pig IgG-HRP)，37℃孵育1h，PBST洗液洗涤4次，每次3分钟；加入HRP显色底物(TMB显色剂)，室温孵育5-15分钟观察显色反应；充分显色后，加入2M硫酸终止显色反应；用酶标仪测量450nm波长的吸光值；判定结果。
判定结果时：空白对照及阴性血清孔吸光值小于或等于0.2，阳性血清对照孔吸光值大于0.4时结果有效；计算P/N值＝(检测孔OD值-空白对照孔OD值)/(阴性血清OD值-空白对照孔OD值)，P/N值等于或大于2时为阳性；以反应阳性血清的最大稀释倍数为该样品血清的抗体效价。
选取已知的JEV抗体阳性猪血清以及阴性猪血清各20份，分别以NS1表位合成肽与合成肽偶联蛋白KLH为包被抗原进行间接ELISA检测，以检测抗原的检测效果。
试验结果见表3，表4与表5。
表3合成表位多肽SEQ ID NO：1检测猪血清结果
注：包被抗原为抗原表位SEQ ID NO：1合成肽，5μg/ml。该阳性血清效价为400。
表4表位多肽SEQ ID NO：1偶联KLH抗原检测猪血清结果
注：包被抗原为抗原表位SEQ ID NO：1合成肽，5μg/ml。该阳性血清效价为400。
表5多肽及多肽偶联物为抗原检测猪血清结果
实施例9乙型脑炎病毒JEV NS1蛋白B细胞抗原表位间接ELISA检测人抗JEV抗体
实施方法同实施例8，待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清为人血清；二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG(Goat-anti human IgG-HRP)。取临床检测已知JEV抗体阳性与阴性人血清各20份，以表位多肽偶联蛋白(KLH)为包被抗原，间接ELISA检测。检测结果如图4所示，结果准确率为100％。
实施例10乙型脑炎病毒JEV NS1蛋白B细胞抗原表位间接ELISA检测马抗JEV抗体：
实施方法同实施例8，待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清为马血清；二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗马IgG(Goat-anti horse IgG-HRP)。
实施例11乙型脑炎病毒JEV NS1蛋白B细胞抗原表位Dot-ELISA检测猪抗JEV抗：
JEV NS1蛋白B细胞抗原表位多肽或表位多肽与载体的连接物为包被抗原，以BSA为对照抗原。在硝酸纤维素膜上定点包被抗原，2μg/点，37℃固定30min，PBST洗涤6次，2％BSA中4℃封闭过夜，PBST洗涤6次后即可用于抗体检测。
检测抗体时，将待检测血清样品适当稀释后与抗原包被膜于37℃孵育30min，PBST洗涤6次，加入辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG(Goat-anti-pigIgG-HRP)，37℃孵育1h，PBST洗液洗涤6次；加入AEC或DAB底物显色，室温避光孵育10min观察颜色反应。
结果判定时，以包被抗原点呈现棕红色颜色反应，对照抗原点不出现颜色反应者为阳性。
实施例12乙型脑炎病毒JEV NS1蛋白B细胞抗原表位Dot-ELISA检测人抗JEV抗
实施方法同实施例11，待检血清为人血清；二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG(Goat-anti human IgG-HRP)。
实施例13乙型脑炎病毒JEV NS1蛋白B细胞抗原表位Dot-ELISA检测马抗JEV抗
实施方法同实施例11，待检血清为马血清；二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗马IgG(Goat-anti horse IgG-HRP)。
序列表
<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120>乙型脑炎病毒NS1蛋白特异性B细胞抗原表位多肽及其应用
<130>KLPI110275
<170>PatentIn 3.5
<210>1
<211>11
<212>PRT
<213>Japanese Encephalitis virus
<400>SEQ ID NO：1
HDETTLVRSQV
<210>2
<211>11
<212>PRT
<213>Japanese Encephalitis virus
<400>SEQ ID NO：2
HDEATLVRSQV
Claims (6)
1.一种乙型脑炎病毒NS1蛋白特异性B细胞抗原表位多肽，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。
2.一种乙型脑炎病毒NS 1蛋白特异性B细胞抗原表位多肽，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。
3.编码权利要求1或2所述乙型脑炎病毒NS1蛋白特异性B细胞抗原表位多肽的核苷酸序列。
4.如权利要求1或2所述的乙型脑炎病毒NS1蛋白特异性B细胞抗原表位多肽，其特征在于，对所述的乙型脑炎病毒JEV NS1蛋白特异性B细胞抗原表位的N端或C端进行化学修饰。
5.如权利要求1或2所述的乙型脑炎病毒NS1蛋白特异性B细胞抗原表位多肽，其特征在于，所述的化学修饰为多肽链N端的自然氨基化或乙酰化，或C端的自然羧基化或酰胺化。
6.如权利要求1或2所述的乙型脑炎病毒NS1蛋白特异性B细胞抗原表位多肽在制备诊断或检测乙型脑炎病毒试剂中的用途。
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