CN114981288B - 一种抗体结合的特征性表位及其应用 - Google Patents

Abstract

提供一种多肽片段及其制备方法，所述多肽片段包含从N端至C端如X¹X ²X ³X ⁴X ⁵GX ⁶所示的氨基酸序列，其中，X1为S、T、E、Y或F；X2为T、N、G、S或D；X3为H、E、Y、T、K、R或A；X4为G、Y、H、R或M；X5为A、F、Q、H、I或V；X6为W或F。还公开了编码该多肽的分离的核酸分子，并利用该多肽来制作针对PCSK9的多肽疫苗。该多肽片段可与抗PCSK9抗体结合，可检测、筛选或辅助筛选新的抗PCSK9抗体，从而缓解患者对原抗体出现免疫原性强等不良反应的问题。

Description

一种抗体结合的特征性表位及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗体结合的特征性表位及其应用。

背景技术

心血管疾病严重威胁着人类，是所有人口族群的首要死因。据国家心血管病中心发布的《中国心血管病报告2019》显示，我国心血管病(cardiovascular disease，CVD)患病人数已经高达2.9亿，每年约有350万人死于心血管疾病。目前市面上用于降低胆固醇的药物主要有他汀类(statins)、胆固醇吸收抑制剂和普罗布考等。尽管他汀类药物心血管疾病治疗上表现出色，但随着其广泛使用，可能产生的弊端也渐渐被发现。首先，强化他汀治疗患者仍有较高心血管事件残余风险，在2年内发生的风险达22.4％；其次，有大量患者无法耐受他汀类药物，尤其是家族性高胆固醇血症患者，即使接受最大剂量的最有效的他汀类药物治疗，仍然不能达到降低LDL-C浓度的目的；最重要的是，他汀类药物存在多种副作用，如引起患者血糖异常、肌肉毒性、记忆和认知障碍等，副作用的发生率高达20％，严重的副作用会导致横纹肌溶解和急性肾功能衰竭，相当一部分患者因不能忍受副作用带来的肌肉疼痛而终止了治疗。

前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type9，PCSK9)，枯草蛋白酶亚家族的一种新的前蛋白转化酶，是常染色体显性家族性高胆固醇血症的重要影响因子之一。研究发现，PCSK9除了能影响血浆胆固醇水平，调节神经细胞的凋亡，还与炎症反应有一定的相关性。目前对于PCSK9的研究主要集中在对肝脏脂质代谢的调节功能。前期的研究显示，PCSK9可通过促进肝细胞的低密度脂蛋白受体(low-densitylipoprotein receptor，LDL-R)的降解，调节肝脏脂质代谢，进而影响血浆中低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)的水平。但PCSK9存在两种突变类型，功能获得型突变和功能缺失型突变。族群试验显示，若干PCSK9“获得功能”的突变常发生于染色体显性高胆固醇血症的个体，而PCSK9“失去功能”的突变则与血浆胆固醇减少有关，PCSK9功能缺失型突变个体患冠心病的风险明显降低。2005年，Hobbs等在Dallas HeartStudy上报道了携带PCSK9无义突变基因的个体中LDL-C水平会比一般人低28％；在2006，Hobbs等又发表PCSK9基因突变对冠心病的作用，该结果基于一项动脉粥样硬化风险调查，他们对9523个白人和3363个非洲裔美国人进行了长达15年的跟踪观察，发现缺失1个或2个PCSK9功能基因的人群的冠心病的发病率显著低于普通人群。Copenhagen Heart Study发现PCSK9基因的功能性缺失会使LDL-C水平下降11-15％，冠心病患病率下降6-46％。Zimbabwe等报道了PCSK9的缺失突变可使非洲女性的LDL-C水平下降27％。PCSK9抑制剂提供了一种全新的治疗模式来对抗LDL-C，被视为他汀类之后降脂领域取得的最大进步。PCSK9抑制剂的出现，为那些服用他汀类药物时出现严重副作用的患者，及他汀类药物治疗无法达到LDL-C目标水平的患者，如遗传性高胆固醇血症患者带来了福音。

PCSK9抑制剂除了能阻止LDL-R回收，还可以抑制NF-κB通道，从而减少血栓、炎症、血管内皮细胞激活等急性冠状动脉综合症的风险。目前PCSK9抑制剂这个领域潜在的研究项目有抑制蛋白抗体、siRNA、反义寡核苷酸以及小分子抑制剂等。单克隆抗体药物因具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，是目前PCSK9抑制剂研究的主要领域。在动物水平的研究显示，加入中和PCSK9的抗体之后，小鼠肝脏中的LDL-R表达水平显著上升，血液中LDL-C浓度下降30％。对灵长类动物，PCSK9单克隆抗体也表现出显著的效果，LDL-C水平的下降效果可维持数周以上。到目前为止，还没有发现抗PCSK9蛋白单抗类药物有比较明显的毒副作用，只有报道称出现过局部注射反应、腹泻和头疼等较轻微的副作用。赛诺菲的Praluent(Alirocumab)和安进的Repatha(Evolocumab)是目前全球市场唯二获批的人源化的PCSK9抗体。根据汤森路透对2015年获批药物潜力销售排行榜，到2019年前者的销售规模将达到44.14亿美元，而后者的销售规模将会达到18.62亿美元。我国CVD患者众多，在2015年统计的结果显示，CVD患人数已经高达2.9亿，每年约有350万人死于心血管疾病，然而我国在PCSK9抑制剂领域的研究却严重滞后，完全不能满足CVD患者的需求。

抗体药物是目前新药研发的主要方向，在传染病的诊断、防治和生物科学研究领域都已得到了广泛的应用。到2015年截止，已经有48个抗体药物成功上市，仅2014年4月至2015年3月期间就有7个抗体药物成功获批。2015年全球销售排名前10的药物中有6个都为抗体药物。自1993年Hamers等在骆驼血液中发现了天然缺失轻链的重链抗体后，纳米抗体(Nanobody，Nb)逐渐取代其他的小型抗体，逐渐成为新型抗体药物研发的热点。Nb通常只有15kDa左右，约传统抗体大小的十分之一，其内部存在二硫键，表面有大量亲水残基，对热和pH有较强的抵抗力；Nb缺乏Fc段和轻链的性质使其能够识别传统抗体无法识别的隐蔽表位或小表位，且避免了补体反应；此外，纳米抗体还具有稳定性高、毒性低、可溶性强、易于靶点筛选和易于在原核微生物中直接表达，经济性好等诸多优势。序列同源性分析显示，骆驼Nb的VHH胚系基因序列和人VH3高度同源，但CDR1和CDR3比人的稍长，CDR3在三级结构中向外凸出，因而推测有更高的抗原结合的特异性和亲和力。鉴于以上优点，Nb正被逐步开发为疾病诊断和治疗方面的单抗药物，广泛的应用与酶的抑制剂，肿瘤、感染和炎症等生物抑制剂的开发上。然而，纳米抗体微小的体积虽为其治疗功能提供了很多的优势，但小分子蛋白在体内极容易被消除。通过基因工程将Nb改造成靶点酶、跨膜蛋白或者双价化能够有效地提高抗体活力和稳定性等，以达到研究目的。在对抑制病毒复制的研究中发现，双价纳米抗体的有效性至少是单价纳米抗体的60倍，并且在动物体内作用时间更长，有效地延迟了动物的死亡时间。抗体药物的前景巨大，但国内抗体药物仍然处于起步阶段。因此，开发国产化PCSK9抗体抑制剂，满足我国国民对于抗体药物的迫切需求，具有深远而积极的意义。

2015年，国际药企巨头安进和赛诺菲/再生元先后经FDA批准上市两款PCSK9抑制剂Repatha和Praluent，迄今为止，二者销量逐年升高，每年营收高达5-7亿美元。2014年10月17日，安进控告赛诺菲/再生元的Praluent侵犯了其Repatha三项专利权(专利号为No.US8563698，US8829165和US8859741)；最后赛诺菲败诉，他们被禁止在美国销售新的PCSK9抑制剂药物Praluent，由此可见表位保护的重要性，如今Praluent在国际上的销量不足Repatha的一半(据报道，赛诺菲是在以下表位的氨基酸上侵权安进的专利：S153，I154，P155，R194，D238，A239，I369，S372，D374，C375，T377，C378，F379，V380，和S381)。

发明内容

为解决现有技术中缺乏有效的PCSK9抗原表位及靶向该表位的抗体的技术问题，本发明提供了一种抗体结合的特征性表位例如PCSK9抗原表位及其应用。

目前已经上市的药物结合PCSK9的表位一般都处于PCSK9的前导区(31-152)和催化区(153-425)，当病人对此类药物产生耐药或不反应时，需要结合PCSK9其它表位的药物。PCSK9的前导区和催化区内很多关键的表位氨基酸已经被赛诺菲或者安进公司申请专利保护，而PCSK9的C端区域很多氨基酸表位尚未被保护；之前的研究显示VHH4-Fc抗体结合PCSK9的亲和力高达0.6nM，在PCSK9转基因大鼠模型上降脂药效可达约40％的水平，说明该抗体具有极好的应用前景，该抗体所结合的表位也可以用来筛选新的抗PCSK9的抗体。

为解决上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种多肽片段，其中，所述多肽片段包含从N端至C端如X¹X²X³X⁴X⁵GX⁶所示的氨基酸序列，其中，X¹为S、T、E、Y或F，优选为S；X²为T、N、G、S或D，优选为T；X³为H、E、Y、T、K、R或A，优选为H；X⁴为G、Y、H、R或M，优选为G；X⁵为A、F、Q、H、I或V，优选为A；X⁶为W或F，优选为W。

优选地，所述多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示。

本发明中阐述的VHH4-Fc对于PCSK9的结合表位处于C端区域(第447-453的：STHGAGW[SEQ ID NO：9])为一新的表位，如图1为PCSK9蛋白氨基酸序列和分区结构示意图。其中VHH4-Fc指的是纳米抗体VHH4融合了抗体恒定区Fc形成的嵌合抗体，VHH4的序列见专利1(申请号：201711298806.3)和专利2(申请号：PCT/CN2020/074624；PCSK9的单域抗体及其应用)。

优选地，所述多肽片段与VHH4抗体或其变体特异性结合，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：23(VHH4)或如SEQ ID NO：24所示(VHH4-hFc)。

更优选地，所述突变为在所述抗体的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸残基的缺失、增加或替换。与纳米抗体VHH4或VHH4-Fc的氨基酸序列相似度80％以上视为与本发明所述的多肽片段结合的抗体的范围。即所述突变与所述抗体的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％的同一性并保持所述抗体的功能。

Fc区既可以指人的抗体的恒定区，也可以指任何物种抗体的Fc恒定区，所述目标抗体包含任何物种的全部Fc亚型，即包含如IgG1Fc，IgG2Fc等。任何有关VHH4的分子修饰包括但不限于甲基化修饰、糖基化修饰，PEG修饰，小分子偶联如KLH-VHH4以及VHH4与对应轻链的二聚化形成抗体的Fab分子等。Fc亦可以替换为如人血清白蛋白形成HSA-VHH4或VHH4-HSA等任意融合VHH4的蛋白。由此，所述多肽片段可以结合的抗体为融合有人血清白蛋白的融合蛋白。

鉴定表位有很多种方法：包括蛋白结晶后晶体衍射法(X-ray法)和丙氨酸扫描突变法等；X-ray法鉴定效率高，精度高，但是存在成本高、抗原抗体复合物不好结晶、对复合物纯度要求高等缺点；丙氨酸扫描突变法需要突变大量的抗原分子，需要蛋白量大，而且有些部位氨基酸突变后表达量极低甚至不能表达，成本也很高。本发明中采用了对随机多肽库进行噬菌体展示的方法进行抗体结合抗原表位的鉴定，随后再采用Western进行表位验证，具有效率高，成本低的优势。

为解决上述技术问题，本发明的第二方面提供了一种分离的核酸分子，其编码如上所述的多肽片段。

为解决上述技术问题，本发明的第三方面提供了一种表达载体，其包含如上所述的分离的核酸分子；优选地，所述表达载体的基础载体(即骨架载体)为pMECS。

为解决上述技术问题，本发明的第四方面提供了一种转化体，其含有如上所述的分离的核酸分子或表达载体。优选地，所述转化体的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

为解决上述技术问题，本发明的第五方面提供了一种PCSK9抗原组合，其包括氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示的多肽片段中的两种或多种。

为解决上述技术问题，本发明的第六方面提供了一种多肽疫苗，其特征在于，其由以下方法制备而成：将包括氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示的多肽片段中的至少一种作为抗原产生的可特异性结合PCSK9的多克隆抗体。

为解决上述技术问题，本发明的第七方面提供了一种配体，所述配体可以特异性结合如上所述的多肽片段，但所述配体不为氨基酸序列如SEQ ID NO：23或在SEQ ID NO：24所示的抗体。

为解决上述技术问题，本发明的第八方面提供了一种抑制剂，其可以靶向抑制如上所述的分离的核酸分子。优选地，所述抑制剂为siRNA或mRNA疫苗。

为解决上述技术问题，本发明的第九方面提供了一种试剂盒，其包括如上所述的多肽片段，和/或，如上所述的配体。

为解决上述技术问题，本发明的第十方面提供了一种上述的多肽片段的制备方法，其包括如下步骤：培养如上所述的转化体，使其表达获得表达产物。

优选地，所述的制备方法还包括纯化所述的表达产物的步骤。

为解决上述技术问题，本发明的第十方面提供了一种所述的多肽片段、所述的分离的核酸分子、所述的表达载体、所述的转化体、所述的PCSK9抗原组合或所述的试剂盒在制备特异性结合PCSK9的抑制剂或检测PCSK9蛋白的制剂或PCSK9疫苗中的应用。

为解决上述技术问题，本发明的第十一方面提供了一种如上所述的配体、所述的抑制剂在制备竞争性抑制抗PCSK9抗体的试剂中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明探寻到不同以往抗体的结合表位，丰富了抗PCSK9抗体的结合表位的多样性。阐明了先前研发抗体VHH4-Fc与目标抗原PCSK9的相互作用机制，解析了相互作用表位。阐述了目标抗体和PCSK9抗原相互结合的表位，有利于提升VHH4-Fc该药物的市场价值，也有利于对VHH4-Fc的进一步改造和优化。更重要的是，还可以利用该新的抗原表位来制作针对PCSK9的多肽疫苗；以及该多肽片段可与抗PCSK9抗体结合，可用于检测、筛选或辅助筛选新的抗PCSK9的抗体，以缓解现有技术中患者对原抗体出现免疫原性强等不良反应的问题。

附图说明

图1为人PCSK9的氨基酸序列；

图2为VHH4-Fc与PCSK9亲和力测定结果示意图；

图3为新型抗体与Repatha结合抗原表位差异鉴定实验；

图4为人PCSK9抗原三种突变体的氨基酸序列对比示意图；

图5为人PCSK9及其三种突变体的Western Blot验证。

具体实施方式

实施例1 VHH4-Fc和人PCSK9亲和力检测

对于Fc标签融合蛋白VHH4-Fc，采用基于SPR技术的Protein A芯片捕获法来测定它与人PCSK9(hPCSK9)之间的亲和力。首先用Protein A芯片捕获VHH4-Fc抗体，再进样(流过)5个不同浓度的hPCSK9抗原进行亲和力的测定，结合时间设置为120s，解离时间设置位180s，再生溶液选取的是pH 2.0的100mM的甘氨酸溶液，系统溶液为1×PBST。如图2，最终的亲和力结果，是基于Biacore T200内置的评价软件给出的拟合曲线，再得出koff和kon值，由公式KD(nM)＝koff(1/s)/kon(1/Ms)计算得出。参数说明：Rmax为最大响应值，通常是处于0-100RU之间；Chi²值小于等于1/10Rmax视为测定结果可靠。测定结果显示：VHH4-Fc与hPCSK9的结合常数是1.872×10⁶，解离常数是1.288×10^-3，Rmax(最大结合值)是24.71RU，Chi²值为0.693，最终拟合得出的亲和力为0.6879nM。

图2中，横坐标指的是抗原抗体反应的时间轴，单位是(秒，s)；纵坐标指的是抗原抗体的结合或者解离时的响应值，单位是Response units(RU)。不同的曲线代表进样不同浓度的抗体。本实验的亲和力是在25℃的反应条件下测试得到。

实施例2表位差异检测

表位差异检测(epitope binning test)的目的是为了检测筛选出的抗体与上市药物Evolocumab(商品名：Repatha，瑞百安)结合人PCSK9表位的异同。本节共采用两种方案来检测CN201711298806.3和PCT/CN2020/074624的VHH4的抗体(其氨基酸序列如SEQ IDNO：23所示)与已经上市的抗体药物结合靶点抗原PCSK9的表位差异。

第一种方案是基于SPR技术的亲和动力学检测，设置Biacore T200的反应温度为室温(即25℃)，取一张新的CM5芯片，将上市抗体Evolocumab用1×PBS稀释至1μg/mL，然后偶联至通道2上，偶联水平拟定位约270RU，与此同时，保持1通道为空白对照。接下来，将带his标签的人PCSK9(简称hPCSK9-his)抗原用1×PBS稀释至5μg/mL，设置程序将其作为样本1(Sample 1)自动进样，结合时间设置为90s，如果人PCSK9抗原表面Evolocumab的特异性结合位点全部被饱和，结合和解离曲线都将进入平台期。接着，将抗体VHH4-his(浓度5μg/mL，用1×PBS稀释)作为样本2(Sample 2)继续进样60s，如果VHH4与Evolocumab结合hPCSK9的表位不同，曲线将会继续升高；反之，曲线将继续保持平台期。两种样本的解离时间均设置为120s，再生溶液为pH2.0的100mM的甘氨酸，系统溶液为1×PBST。

第二种方案为双抗体“夹心”ELISA法：取一块新的96孔ELISA板，每孔包被100ng的Evolocumab，条件为4℃过夜。次日用1×PBST洗涤三次后，用3％的BSA封闭96孔板孔底没有结合抗体的位点，条件为室温封闭1小时。用1×PBST洗涤三次后，接着用5μg/mL的hPCSK9-Fc抗原作为“一抗”室温孵育1小时；接着用1×PBST洗涤五次后，用系列倍比稀释的VHH4-his加到孔中，去结合人hPCSK9-Fc抗原上的抗原表位，如果Evolocumab和VHH4-his等新型抗体结合表位相同，VHH4-his将不会再结合hPCSK9-Fc而被洗掉，反之，VHH4-his不会被洗掉。接下来加辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗his标签的二抗(1∶5000稀释)，室温反应1h。随后，用1×PBST洗涤三次后，每孔加入100μL的HRP底物TMB，在室温黑暗的环境中反应5～10min，随后加入50μL 1M的浓硫酸终止反应，用酶标仪读取OD450吸光值。

表位差异鉴定结果如图3所示，图3的A为基于表面等离子共振技术(SPR)检测VHH4和上市药物结合人PCSK9抗原表位的差异检测实验，所示为利用亲和动力学的方法测定的结果，横坐标为时间轴，纵坐标为相对响应值；共包含多个阶段，如基线阶段(baseline)，捕获Evolocumab阶段(capture evolocumab)，PCSK9进样并结合稳定的阶段(injecthPCSK9)，VHH4进样阶段(inject VHH4)和解离阶段(dissociation阶段)。在第一个阶段，捕获Evolocumab后，反应曲线稳定在1200RU左右；在PCSK9-his进样后，Evolocumab与PCSK9-his开始结合，并最终稳定在约1350RU，证明PCSK9上Evolocumab的特异性结合位点被其自身饱和，随着VHH4的进样，反应曲线进一步上升，表明PCSK9上除了Evolocumab的特异性结合位点，还存在VHH4的特异性结合位点，证实VHH4抗体和Evolocumab结合PCSK9的表位不尽相同。

图3的B为基于双抗体“夹心”ELISA技术检测(VHH4)和上市药物结合人PCSK9抗原表位的差异检测实验，横坐标代表不同浓度的VHH4；纵坐标代表OD450的吸光值。首先是在ELISA板中包被过量的Evolocumab，然后加入hPCSK9-Fc(作为“一抗”)，Evolocumab将PCSK9上的特异性结合位点完全饱和，接着加入VHH4-his(作为“二抗”)，如果VHH4-his与Evolocumab结合PCSK9的位点相同，最终在洗涤时将完全被洗掉，图3B中实验结果显示，VHH4与PCSK9在Evolocumab饱和其结合位点后仍有结合曲线，证实VHH4新型抗体和Evolocumab结合PCSK9的表位不尽相同。图3B右侧为双抗体夹心ELISA的实验原理示意图。

实施例3表位鉴定实验

(1)噬菌体展示库的构建

取1μL随机多肽库和噬菌体质粒pMECS相连接的DNA产物转化TG感受态细胞(相关分析克隆的步骤参见分子克隆实验指南(第2版)_(美)J.萨姆布鲁克(Joseph Sambrook))；37℃复苏2h，梯度稀释至10¹、10²和10³，分别取300μL涂布平板，37℃，过夜培养，计算克隆数，约10⁵个克隆/平板。采用上述相同的转化方法，大量转化，直到文库的克隆数达到10⁷以上。将所有克隆用LB洗脱下，5,000g，离心5min，沉淀用2mLLB悬浮，加入等体积的30％甘油，-80℃冻存。

(2)噬菌体扩增和拯救

采用辅助噬菌体对随机多肽的噬菌体文库进行扩增和拯救。将步骤(1)中保存的单克隆文库接入100mL培养基中培养至对数生长期，加入MOI为20的辅助噬菌体，室温，静置30min，低速离心后，沉淀用培养基悬起，接入300mL培养基中，培养过夜。次日，3,000g离心30min，收集上清，加入PEG沉淀噬菌体，冰上静置30min，3,000g离心30min，沉淀为噬菌体随机多肽库，用PBS悬浮沉淀后，测定其滴度为2.9×10¹²pfu/mL。

(3)亲和VHH4-Fc的噬菌体库淘洗和拯救

取100ng VHH4-Fc蛋白包被ELISA板，4℃，过夜孵育。次日，加入拯救出的VHH4-Fc特异的噬菌体，室温，孵育2h；PBST洗孔10次，加入100μL三乙胺，室温，孵育30min，收集的噬菌体即为获得的亲和VHH4-Fc的噬菌体库；取10μL感染TG细胞涂布平板，用于测定筛选后的克隆数测定，剩余的筛选后的噬菌体的用于扩增。按上述如此步骤反复淘选进行三至四轮多肽筛选。

(4)ELISA评价可以特异性结合VHH4-Fc的多肽的富集程度

ELISA板包被100ng的VHH4-Fc蛋白，4℃孵育过夜；次日加2％的BSA室温封闭1h；实验组分别加入每轮淘洗后扩增的噬菌体，对照组加入等量野生型的噬菌体，室温，孵育2h；PBST洗10次，以去除没有结合的噬菌体；加入HRP标记的抗M13抗体，室温孵育1h；加入显色液，避光反应10-30min，测吸光值，吸光值随着淘洗次数逐渐上升，并在第三轮到第四轮淘洗时趋于稳定，表明特异性的抗体得到了富集。

(5)鉴定VHH4-Fc特异性结合的多肽的阳性克隆

ELISA板包被100ng的VHH4-Fc，4℃孵育过夜；取最后一轮筛选获得的噬菌体涂布的平板，随机挑取38个单克隆于1mL培养基中，37℃，培养至对数期，加入1mM IPTG诱导过夜；次日，离心收集菌沉，破碎后，5,000g离心15min，收集上清；同时取ELISA板，加2％的BSA室温封闭1h；实验组每孔加入单克隆破碎上清，对照组加入空白TG破碎上清，室温，孵育2h；PBST洗10次，加入鼠抗HA标签的抗体，室温1h；PBST洗3-5次，加入AP标记的抗鼠IgG抗体，室温1h；加入底物，反应10-20min，在酶标仪上读取吸光值；当吸光值与对照孔比值大于2.1(Baseline)时，判定为阳性克隆；并将阳性克隆对应孔的大肠杆菌送Sanger测序。

(6)阳性克隆的序列分析

分析Sanger测序结果显示，共有8种独特型多肽与VHH4-Fc存在特异性结合，如下表2中的黑体字母加下划线代表了表位中可能存在的的固定氨基酸序列，比照PCSK9抗原的氨基酸序列，推断出VHH4-Fc与人PCSK9的作用表位(公共基序)可能为第447-453位的“STHGAGW”(序列位置见图1)。

我们总结出要保护的VHH4-Fc抗体结合的具体表位，应该包括但不限于氨基酸特征：(N端-X¹X²X³X⁴X⁵GX⁶-C端)，其中X代表20种氨基酸中的任意一种氨基酸，但一般地来讲，第1位X1经常为S、T、E和F中的任意一种氨基酸；第2位X2经常为T、Y、G、S和D中的任意一种氨基酸；第3位X3经常为H、E、Y、T、K和A中的任意一种氨基酸；第4位X4经常为G、Y、H、和R中的任意一种氨基酸；第5位X5经常为A、F、Q、H、I和V中的任意一种氨基酸；第7位X6经常为W和F中的任意一种氨基酸。

文中所述氨基酸密码子的对照表如下：

表1氨基酸密码子对照表

表2基于随机多肽库和噬菌体展示技术鉴定到的多肽

实施例4表位验证实验

随后我们设计了两种有关这一表位的PCSK9分子截断突变体，如下图4列出了三种突变体氨基酸的序列对比，其中标黄的部分为截断的部分氨基酸，其中PCSK9-mu01(SEQ ID NO：20)为截断无关表位的对照，PCSK9-mu02(SEQ ID NO：21)和PCSK9-mu03(SEQ ID NO：22)为截断部分推测表位的突变体。

如图5，将表达以上PCSK9蛋白及其突变体的哺乳细胞培养上清和细胞裂解物进行SDS-PAGE电泳，每五个一组，点样顺序从左到右分别为PCSK9-mu01、PCSK9-mu02、PCSK9-mu02(重复上样)、PCSK9-mu03和野生型PCSK9(PCSK9-WT)；其中泳道1-5和11-15为表达PCSK9的细胞培养上清，泳道6-10和16-20为表达PCSK9的细胞裂解沉淀物，主要考察表达的目的蛋白处于胞内还是胞外；后将电泳胶转膜做WesternBlot验证，主要考察截断突变后的PCSK9是否仍可以正常表达(图5A)以及是否可以和VHH4-hFc结合(图5B)，结果如图5所示，PCSK9-WT(泳道5、10、15和20的76kDa处)在细胞培养上清和沉淀中均有表达，而其他三种PCSK9突变体均在胞内表达(泳道6-9)，此外，截断突变对照PCSK9-mu01(泳道16)在截断后仍可以与VHH4-hFc发生结合，说明截断的多肽不是VHH4-hFc和PCSK9结合的关键表位；然而对于突变体PCSK9-mu02，虽然Anti-HA抗体检测胞内有表达(泳道7和8有条带)，但与VHH4-hFc几乎不再结合(泳道17和18无条带)；突变体PCSK9-mu03情况类似，虽然Anti-HA抗体检测胞内有表达(图A泳道9的48kDa处有条带)，但VHH4-hFc与PCSK9-mu03不再结合(图B泳道19的48kDa处无条带)，这说明“STHGAGW”(位于hPCSK9的第447-453位)确实为目标抗体VHH4-hFc与人PCSK9抗原的相互结合表位，或至少是hPCSK9空间表位的一部分。

对比实施例1 Evolocumab表位鉴定实验

将实施例3中的VHH-Fc替换为Evolocumab，其它实验步骤同实施例3。由此获得了与Evolocumab高亲和力结合的部分多肽。由下表3可知VHH4-Fc与Evolocumab结合的多肽片段完全不同，即这两个抗体结合完全不同的抗原表位。

表3基于随机多肽库和噬菌体展示技术鉴定到的多肽

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。

Claims (14)

1.一种多肽片段，其特征在于，所述多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示。

2.如权利要求1所述的多肽片段，其特征在于，所述多肽片段与VHH4抗体或其突变体或其分子修饰体特异性结合，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:23或如SEQ ID NO:24所示。

3.如权利要求2所述的多肽片段，其特征在于，所述突变为在所述抗体的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸残基的缺失、增加或替换，且所述突变与所述抗体的氨基酸序列具有至少80％的同一性并保持所述抗体的功能，所述分子修饰为甲基化修饰、糖基化修饰、PEG修饰、小分子偶联。

4.如权利要求3所述的多肽片段，其特征在于，所述小分子偶联为KLH-VHH4。

5.如权利要求2所述的多肽片段，其特征在于，所述多肽片段可以结合的抗体为融合蛋白。

6.如权利要求5所述的多肽片段，其特征在于，所述的融合蛋白为融合有人血清白蛋白的融合蛋白。

7.一种分离的核酸分子，其编码如权利要求1-6任一项所述的多肽片段。

8.一种表达载体，其包含如权利要求7所述的分离的核酸分子。

9.如权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的基础载体为pMECS。

10.一种转化体，其含有如权利要求7所述的分离的核酸分子或权利要求8或9所述的表达载体。

11.如权利要求10所述的转化体，其特征在于，所述转化体的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

12.一种试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1-6任一项所述的多肽片段。

13.一种权利要求1-6任一项所述的多肽片段的制备方法，其包括如下步骤：培养如权利要求10或11所述的转化体，使其表达获得表达产物。

14.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括纯化所述的表达产物的步骤。