KR102257462B1 - 항-pcsk9 단일클론 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항-PCSK9 단일클론 항체, 상기 항체 가변 영역 및 CDR 영역을 함유하는 아미노산 시퀀스, 상기 단일클론 항체의 획득 방법 및 용도를 제공한다. 파지 항체 라이브러리에서 PCSK9를 저항하는 단일클론 항체를 선별하되, 사슬 치환법에 의한 파지 라이브러리 구축 방법을 통하여 친화도 성숙을 진행하는데, 먼저 초기 스크리닝으로 획득한 단일클론 항체의 경쇄 CDR1, 2, 3 영역 돌연변이에 라이브러리를 구축하고 스크리닝한 다음, 친화도가 높은 단일클론 항체를 선택하고, 그 중쇄 CDR1, 2, 3 영역 돌연변이에 라이브러리를 구축하고 스크리닝하여, 최종 높은 친화도의 항-PCSK9 단일클론 항체를 획득한다. 상기 PCSK9 항체는 PCSK9에 훌륭한 친화도가 있고, PCSK9와 그 리간드의 결합을 억제할 수 있어, 이상지방혈증, 심뇌혈관질환 및 혈전폐색성질환의 치료에 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 항체공학 기술분야에 관한 것으로, 구체적으로 말하면, 인간 항-PCSK9 단일클론 항체(fully human anti-Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin Type 9 (PCSK9) monoclonal antibody) 및 그 획득 방법과 응용에 관한 것이다.
PCSK9 (전구 단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 유형 9, Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)는 전구 단백질 컨버타제 패밀리 프로테아제 K 서브 패밀리에 속한다. 인간 PCSK9 유전자는 염색체 lp32.3에 위치하는데, 길이는 약 22kb이고, 총 12개의 엑손이 있으며, 코드에 692개의 아미노산 잔기의 단백질이 함유되어 있다. PCSK9 단백질은 시그널 펩타이드, 프로 도메인, 촉매 도메인 및 카복실기 말단 도메인 (V도메인)으로 구성되었는데, 이는 가용성 74kDa의 전구체로 합성되고, 소포체 중에서 자체 촉매분해 되어 14 kDa의 프로펩타이드 및 60 kDa의 성숙된 프로테아제를 생성한다. PCSK9는 주로 간, 장, 신장에서 발현되며, 피부 및 신경계통에서도 일부 발현되지만, 단지 간 중의 PCSK9만 혈액순환계통에 분비될 수 있다.
연구에 따르면, PCSK9는 저밀도 지단백질 수용체(LDLR)의 분해를 매개하여 혈장 중의 LDL 콜레스테롤(LDL-C) 수준을 조절할 수 있으며, LDLR가 간 내의 LDL 내포 과정을 매개하는 것은 순환계통에서 LDL 을 제거하는 주요한 수단이다. LDLR은 하나의 멀티 도메인 단백질로써, 세포외 도메인이 상피세포증식인자 전구체 홈도메인 EGF-A, EGF-B, EGF-C와 긴밀히 연결된다. PCSK9가 LDLR 분해를 매개하려면 먼저 LDLR에 결합되어야 하는데, LDLR 상 결합 부위는 주로 EGF-A이고, PCSK9와 EGF-A의 조성물을 형성한다. 연구에 따르면, PCSK9 는 초저밀도 지단백질 수용체, 아폴리포프로테인 B 수용체, 아폴리포프로테인 E 수용체 2를 통하여서도 콜레스테롤 대사를 조절할 수 있지만, 그 중의 분자 기구는 불명확하다.
기초연구 및 임상시험에 따르면, 외생 개입조치를 통하여 PCSK9의 활성을 억제할 경우, 혈장 중의 LDL 제거를 다그칠 수 있어 혈지를 낮추는 역할을 한다. 현재, PCSK9 억제제에는 주로 단일클론 항체, 안티센스 올리고디옥씨뉴클리오티더스, 소분자간섭RNA, 펩타이드 및 소분자 억제제 등이 포함된다.
단일클론 항체 약물은 올해 생물 의약 분야의 연구개발 열점으로써, 표적성이 강하고, 특이성이 높으며, 독부작용이 적은 등 특징을 구비하고 있기에, 약품 치료 분야의 최신 발전 방향을 대표한다. PCSK9를 표적으로 하는 단일클론 항체는 PCSK9와 특이적인 결합을 발생하여, PCSK9와 LDLR의 상호작용을 차단하고, LDLR 분해 과정을 늦춤으로써 LDL-C 수준을 낮추는 역할을 발휘할 수 있다. 임상실험 데이터는 항-PCSK9 단일항체 약물의 안전성, 효과성 및 독특한 임상 응용가치를 나타낸다.
인간 항체는 치료성 항체 발전의 주요한 방향이다. 항체 라이브러리 기술의 출현은 인간 항체의 제조 스크리닝에 훌륭한 기술 플랫폼을 제공한다. 항체 라이브러리 기술은 과거 단일 항체 연구 제조 과정에 꼭 필요하던 하이브리도마 과정을 피하였을 뿐만 아니라, 심지어 면역 과정을 경과하지 않고 각 종 항체 유전자 및 항체 분자 단편(fragment)을 획득할 수 있다. 파지 항체 라이브러리는 가장 일찍 출현된, 또한 현재 가장 광범위하게 응용되는 항체 라이브러리이다. 파지 항체 라이브러리는 항체 유전자의 내원에 근거하여 면역 라이브러리와 비 면역 라이브러리로 나뉘는데, 비 면역 라이브러리는 천연 라이브러리, 반합성 라이브러리 및 전합성 라이브러리를 포함한다. 파지 항체 라이브러리의 스크리닝은 항체 친화도 성숙 과정을 시뮬레이션하는데, 일반적으로, 항원을 고상 매개체에 코팅하고, 스크리닝 예정인 파지 항체 라이브러리를 첨가하여, 높은 친화도의 특이적인 항체를 획득 할 때까지 여러 라운드의 “흡착-세척-용출-증폭” 과정(다시 말하여, 패닝)을 거친다.
현재 여러 제약회사들에서 PCSK9 관련 단일항체 약물을 적극 개발하고 있다. 암젠의 Repatha (evolocumab)와 사노피/리제네론의 Praluent (alirocumab)는 모두 인간 항체로서, 2015년에 이미 선후로 출시가 허가되어, 1차 고콜레스테롤 혈증 및 가족성 고콜레스테롤 혈증(이형 접합체 및 동형 접합체) 의 치료에 사용되고 있다. 스타틴에 Evolocumab을 추가하여 사용할 경우, 1차 고콜레스테롤 혈증 환자의 LDL-C를 77% 낮출 수 있고, 이형 접합체 가족성 고콜레스테롤 혈증 환자의 LDL-C를 68% 낮출 수 있으며, 동형 접합체 가족성 고콜레스테롤 혈증 환자의 LDL-C 를 31% 낮출 수 있다. Evolocumab은 내성이 좋고, 현재 아무런 뚜렷한 안전성 문제가 없다. 파이저의 인간 단일항체 bococizumab은 3차 임상 진행 중이고, 노바르티스의 인간 단일항체 lodelcizumab은 2차 임상 진행 중이다. 로슈와 MSD도 임상시험 실시 중에 있다.
현재, 국내 당해 분야에는 자주적으로 연구 개발한, 높은 친화도를 구비한 항-PCSK9 인간 항체가(fully human antibody) 여전히 부족하다.
본 발명은 항-PCSK9 단일클론 항체를 제공하는데, 본 발명은 전합성 항체 라이브러리에서 항-PCSK9 단일클론 항체를 선별한 다음, 컴퓨터이용설계(CAD)로 분석하고, 작은 용량의 합성 파지 항체 경쇄 라이브러리를 구축하는 방법을 통하여, 스크리닝을 통하여 획득한 항-PCSK9 단일클론 항체의 경쇄 CDR1, 2, 3 영역 돌연변이에 라이브러리를 구축하고, 스크리닝한 후, 친화도가 높은 단일클론 항체를 선택하여, 그 중쇄 CDR1, 2, 3영역 돌연변이에 라이브러리를 구축하고 스크리닝을 진행한 다음, 최종 높은 친화도의 항-PCSK9 단일클론 항체를 획득한다. 본 발명의 항-PCSK9 항체는 새로운 시퀀스를 구비하는데, 당해 항체는 체외에서, 특히 세포 수준 상 기능이 훌륭하여, 의학 응용 전망이 아주 밝다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 항-PCSK9 단일클론 항체는,
경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 상기 경쇄의 상보 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 표시되고, 상기 중쇄 상보 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 표시되며, LCDR1은 RASQSIDNRLT(SEQ ID NO. 22), RASQSVRNWLD(SEQ ID NO.23), RASQGINSWLN(SEQ ID NO.24), RASQNVNNWLN(SEQ ID NO.25), RASQNINSWLN(SEQ ID NO.26), RASQNINNWLN(SEQ ID NO.27), RASQGIHNWLN(SEQ ID NO.28), RASQDVDSWLT(SEQ ID NO.29), RASQSVRNWLN (SEQ ID NO.30), RASQDVRNWLT(SEQ ID NO.31) 또는 RASQSIRSYLN (SEQ ID NO.32) 중 어느 하나를 포함하고; LCDR2는 DASSRQS(SEQ ID NO.33), GASTLES(SEQ ID NO.34), AASTRET (SEQ ID NO.35), GASSRQS (SEQ ID NO.36), GASTRPT (SEQ ID NO.37), DASNRQS (SEQ ID NO.38), GASNLAS(SEQ ID NO.39), DASNLQS(SEQ ID NO.40) 또는 DASSRPT(SEQ ID NO.41) 중 어느 하나를 포함하고; LCDR3 은 QQPENDPTT(SEQ ID NO.42), QQDNDIPLT(SEQ ID NO.43), QQWNNTPNT (SEQ ID NO.44), QQDNDMPLT (SEQ ID NO.45), QQWFDVPTT (SEQ ID NO.46), QQWDDTPNT(SEQ ID NO.47), QQNSNIPLT(SEQ ID NO.48), QQDSKIPLT(SEQ ID NO.49), QQWTDTPLT(SEQ ID NO.50), QQDDSTPPT(SEQ ID NO.51) 또는 QQGDSMPMT(SEQ ID NO.52) 중 어느 하나를 포함하고; HCDR1 은 GGTFTNNA (SEQ ID NO.53), GYTVTSYG (SEQ ID NO.54) 또는 GYSLTSYG (SEQ ID NO.55) 중 어느 하나를 포함하고; HCDR2 는 RIIPMFGMA(SEQ ID NO.56), WLSFYNGNT(SEQ ID NO.57), WVTFYNGNT(SEQ ID NO.58), WVSFYQGNT(SEQ ID NO.59), WVSFYNGQT(SEQ ID NO.60) 또는 WVSFYNGNS (SEQ ID NO.61) 중 어느 하나를 포함하고; HCDR3은 AREGIPMI (SEQ ID NO.62), ARGYSLDV(SEQ ID NO.63), ARGYGMSI(SEQ ID NO.64), ARGFGMDR(SEQ ID NO.65), ARGYGMTV (SEQ ID NO.66) 또는 ARGFGLSV (SEQ ID NO.67)를 포함한다.
그중, 상기 경쇄 가변 영역 아미노산 시퀀스는 바람직하게 SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.20 또는 SEQ ID NO.21 중 어느 하나이다.
그중, 상기 중쇄 가변 영역 아미노산 시퀀스는 바람직하게 SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9 또는 SEQ ID NO.10 중 어느 하나이다.
그중, 상기 중쇄 가변 영역 HCDR1 시퀀스는 GYTVTSYG(SEQ ID NO.54) 또는 GYSLTSYG(SEQ ID NO.55)에서 선택된 아미노산 시퀀스이고; 상기 경쇄 가변 영역 LCDR1 시퀀스는 RASQSVRNWLD (SEQ ID NO. 23), RASQNVNNWLN (SEQ ID NO.25), RASQNINSWLN (SEQ ID NO.26), RASQNINNWLN(SEQ ID NO.27) 또는 RASQDVDSWLT(SEQ ID NO.29) 중 어느 한 아미노산 시퀀스에서 선택되고; 상기 중쇄 가변 영역 HCDR2 시퀀스는 WVSFYQGNT (SEQ ID NO.59), WVSFYNGQT (SEQ ID NO.60) 또는 WVSFYNGNS (SEQ ID NO.61) 중 어느 한 아미노산 시퀀스에서 선택되고; 상기 경쇄 가변 영역 LCDR2 시퀀스는 GASTLES (SEQ ID NO.34), AASTRET (SEQ ID NO.35), GASSRQS (SEQ ID NO.36), GASTRPT (SEQ ID NO.37) 또는 GASNLAS (SEQ ID NO.39) 중 어느 한 아미노산 시퀀스에서 선택되며, 상기 중쇄 가변 영역 HCDR3 시퀀스는 ARGYSLDV(SEQ ID NO.63), ARGYGMSI(SEQ ID NO.64), ARGFGMDR(SEQ ID NO.65) 또는 ARGYGMTV(SEQ ID NO.66) 중 어느 한 아미노산 시퀀스에서 선택되고; 상기 경쇄 가변 영역 LCDR3 시퀀스는 QQDNDIPLT(SEQ ID NO.43), QQDNDMPLT(SEQ ID NO.45), QQWFDVPTT (SEQ ID NO.46), QQWDDTPNT (SEQ ID NO.47) 또는 QQDSKIPLT (SEQ ID NO.49) 중 어느 한 아미노산 시퀀스에서 선택된다.
그중, 본 발명은 또한 상기 경쇄 또는 상기 중쇄를 포함하는 여러 가지 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 제공한다.
그중, 본 발명은 또한 상기 경쇄 또는 상기 중쇄를 포함하는 여러 가지 항체를 제공하는데, 상기 항체는 특이적으로 PCSK9에 결합하고, PCSK9와 LDLR의 결합을 차단하며, 세포 표면의 LDLR 수량 또는 혈액순환계통 중 LDLR 수준을 높이고, 혈액순한계통 중 LDL 또는 LDL-C 수준을 낮춘다.
그중, 본 발명은 또한 상기 경쇄 또는 상기 중쇄를 포함하는 여러 가지 폴리뉴클레오티드 시퀀스 또는 조합을 제공한다.
그중, 상기 항-PCSK9 단일클론 항체의 중쇄 불변 영역은 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하고, 상기 경쇄 불변 영역은 Ck 또는Cλ를 포함한다.
그중, 상기 중쇄 불변 영역은 바람직하게 IgG4 또는 IgG2이고, 바람직하게는 상기 중쇄의 진핵 발현 벡터 또는 원핵 생물 발현 벡터이다.
그중, 상기 경쇄 불변 영역은 바람직하게 Ck이고, 바람직하게는 상기 경쇄의 진핵 발현 벡터 또는 원핵 생물 발현 벡터이다.
그중, 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드 시퀀스 또는 조합을 포함하는 재조합 DNA 발현 벡터를 제공하는데, 상기 재조합 DNA 발현 벡터의 DNA 시퀀스에는 항-PCSK9 항체를 코드화하는 상기 중쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역의 DNA 시퀀스가 포함된다.
그중, 본 발명은 또한 상기 재조합 DNA 발현 벡터를 형질감염하는 숙주세포를 제공하는데, 상기 숙주세포에는 원핵세포, 효모, 곤충 세포 또는 포유동물 세포가 포함된다.
그중, 상기 원핵세포는 바람직하게 대장균이다.
그중, 상기 포유동물 세포는 바람직하게, HEK293E세포, CHO세포 또는 NS0세포이다.
그중, 본 발명은 또한 상기 경쇄 또는 상기 중쇄를 포함하는 여러 가지 전장 항체(whole-length antibody), 단일사슬 항체, 단일 도메인 항체, 이중 특이항체, 항체 약물 결합체(antibody drug conjugate)를 제공한다.
그중, 본 발명은 또한 상기 경쇄 또는 상기 중쇄를 함유하는 여러 가지 단일클론 항체, 인공 벡터, 약물 또는 약학 조성물을 제공한다.
그중, 상기 단일클론 항체는 전장 항체 및 항-PCSK9 단일클론 항체의 단편을 포함하는데, 상기 단편은 Fab, Fab’, F(ab’）2, Fv 또는 ScFv을 포함하되 이에 한정되지 않는다.
그중, 본 발명은 또한 상기 경쇄 또는 상기 중쇄를 포함하는 검사시약 또는 시약 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 항체는 PCSK9 활성을 제거, 억제 또는 낮춤으로써, 질환을 개선, 완화, 억제 또는 예방하는데 사용될 수 있는데, 상기 질환에는 이상지방혈증（dyslipidemia）, 심뇌혈관질환（cerebrovascular diseases） 및 혈전폐쇄성질환（thrombotic occlusive diseases）이 포함된다.
그중, 상기 이상지방혈증에는 콜레스테롤이 높이 오르거나, 트리글리세라이드가 높이 오르거나, 저밀도 지단백질이 높이 오르거나, 고밀도 지단백질이 낮게 내려가는 것이 포함된다. 상기 심뇌혈관질환에는 관상동맥경화성 심장병, 급성 심근경색, 동맥죽상경화, 중풍 및 말초 동맥 폐쇄성 질환이 포함된다.
본 발명의 항-PCSK9 단일클론 항체를 획득하는 방법은 이하 단계를 포함한다.
(1)항-PCSK9 단일사슬 항체의 바이오패닝, 세 라운드의 항체 라이브러리 농축 스크리닝을 통하여, 전합성 ScFv 파지 라이브러리에서 친화도가 높은 항체 시퀀스 DFSK9-1을 획득하는데, 그 중쇄 DFSK9-H1은 SEQ ID NO.1인 아미노산 시퀀스를 구비하고, 그 경쇄 DFSK9-L1은 SEQ ID NO. 11인 아미노산 시퀀스를 구비한다.
(2)DFSK9-1을 기반으로, 컴퓨터 3급 구조 시뮬레이션을 통하여, 상보 결정 영역 CDRl, CDR2, CDR3 돌연변이 항체 라이브러리를 설계 및 구축하고, 이 돌연변이 항체 라이브러리에 바이오패닝 및 양성 클론의 스크리닝 및 검정을 진행하여, 서로 다른 경쇄를 함유하는 10가지 단일사슬 항체 시퀀스를 획득하는데, 각각 DFSK9-2, DFSK9-3, DFSK9-4, DFSK9-5, DFSK9-6, DFSK9-7, DFSK9-8, DFSK9-9, DFSK9-10, DFSK9-11이라 명명하고, 대응되는 경쇄 가변 영역은 각각 DFSK9-L2, DFSK9-L3, DFSK9-L4, DFSK9-L5, DFSK9-L6, DFSK9-L7, DFSK9-L8, DFSK9-L9, DFSK9-L10 및 DFSK9-L11이라 명명하며, 이에 대응되는 아미노산 시퀀스는 각각SEQ ID NO.12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.20 및 SEQ ID NO.21이고, 상기 단일사슬 항체를 파지 수준 상 친화도 비교를 진행한다.
(3)친화도가 높은 클론 5 주(strain), DFSK9-2, DFSK9-4, DFSK9-5, DFSK9-6 및 DFSK9-8을 선출하고, 중쇄 상보 결정 영역 CDR1, CDR2, CDR3 돌연변이 항체 라이브러리를 설계 구축한 다음, 당해 중쇄 돌연변이 항체 라이브러리에 바이오 패닝 및 양성 클론의 스크리닝 및 검정을 진행하여, 서로 다른 10 가지 단일사슬 항체 시퀀스를 획득하고, 각각 DFSK9-12, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20 및 DFSK9-21이라 명명하는데, 그중, DFSK9-12, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20 및 DFSK9-21 의 경쇄 가변 영역 시퀀스는 각각 DFSK9-L2, DFSK9-L8, DFSK9-L5, DFSK9-L6, DFSK9-L5, DFSK9-L6, DFSK9-L5, DFSK9-L4, DFSK9-L6, DFSK9-L6이며, 이에 대응되는 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.16이고, DFSK9-12, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20 및 DFSK9-21 의 중쇄 가변 영역 시퀀스는 각각 DFSK9-H2, DFSK9-H8, DFSK9-H7, DFSK9-H3, DFSK9-H6, DFSK9-H4, DFSK9-H4, DFSK9-H9, DFSK9-H5, DFSK9-H10이며, 이에 대응되는 아미노산 시퀀스는 각각 SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.10이고, 상기 단일사슬 항체를 파지 수준 상 친화도 비교를 진행한다.
(4) (3) 중 상기 단일클론 중쇄 가변 영역 유전자 및 경쇄 가변 유전자를 진핵 발현 벡터에 복제하고, 숙주세포를 형질감염하여, 항-PCSK9 단일클론 항체의 전반 저항을 획득한다.
그중, 상기 CDR은 상보 결정 영역（complementarity-determining region)이고, 상기 ScFv 는 단일사슬 항체(single-chain fragment variable )이며, 상기 ADCs 는 항체 약물 결합체(antibody-drug conjugates)이고, 상기 LDLR은 저밀도 지단백질 수용체(Low Density Lipoprotein Receptor)이며, 상기 LDL-C 는 저밀도 지단백질 콜레스테롤(Low Density Lipoprotein-Cholesterol)이고, 상기 HEK293E 세포는 인간 신장 293E 세포(human embryonic kidney 293E cell)이며, CH0 세포는 중국 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cell)이고, NS0 세포는 마우스 NS0 흉선종 세포이다.
경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 상기 경쇄의 상보 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 표시되고, 상기 중쇄 상보 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 표시되며, LCDR1은 RASQSIDNRLT(SEQ ID NO. 22), RASQSVRNWLD(SEQ ID NO.23), RASQGINSWLN(SEQ ID NO.24), RASQNVNNWLN(SEQ ID NO.25), RASQNINSWLN(SEQ ID NO.26), RASQNINNWLN(SEQ ID NO.27), RASQGIHNWLN(SEQ ID NO.28), RASQDVDSWLT(SEQ ID NO.29), RASQSVRNWLN (SEQ ID NO.30), RASQDVRNWLT(SEQ ID NO.31) 또는 RASQSIRSYLN (SEQ ID NO.32) 중 어느 하나를 포함하고; LCDR2는 DASSRQS(SEQ ID NO.33), GASTLES(SEQ ID NO.34), AASTRET (SEQ ID NO.35), GASSRQS (SEQ ID NO.36), GASTRPT (SEQ ID NO.37), DASNRQS (SEQ ID NO.38), GASNLAS(SEQ ID NO.39), DASNLQS(SEQ ID NO.40) 또는 DASSRPT(SEQ ID NO.41) 중 어느 하나를 포함하고; LCDR3 은 QQPENDPTT(SEQ ID NO.42), QQDNDIPLT(SEQ ID NO.43), QQWNNTPNT (SEQ ID NO.44), QQDNDMPLT (SEQ ID NO.45), QQWFDVPTT (SEQ ID NO.46), QQWDDTPNT(SEQ ID NO.47), QQNSNIPLT(SEQ ID NO.48), QQDSKIPLT(SEQ ID NO.49), QQWTDTPLT(SEQ ID NO.50), QQDDSTPPT(SEQ ID NO.51) 또는 QQGDSMPMT(SEQ ID NO.52) 중 어느 하나를 포함하고; HCDR1 은 GGTFTNNA (SEQ ID NO.53), GYTVTSYG (SEQ ID NO.54) 또는 GYSLTSYG (SEQ ID NO.55) 중 어느 하나를 포함하고; HCDR2 는 RIIPMFGMA(SEQ ID NO.56), WLSFYNGNT(SEQ ID NO.57), WVTFYNGNT(SEQ ID NO.58), WVSFYQGNT(SEQ ID NO.59), WVSFYNGQT(SEQ ID NO.60) 또는 WVSFYNGNS (SEQ ID NO.61) 중 어느 하나를 포함하고; HCDR3은 AREGIPMI (SEQ ID NO.62), ARGYSLDV(SEQ ID NO.63), ARGYGMSI(SEQ ID NO.64), ARGFGMDR(SEQ ID NO.65), ARGYGMTV (SEQ ID NO.66) 또는 ARGFGLSV (SEQ ID NO.67)를 포함한다.
그중, 상기 경쇄 가변 영역 아미노산 시퀀스는 바람직하게 SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.20 또는 SEQ ID NO.21 중 어느 하나이다.
그중, 상기 중쇄 가변 영역 아미노산 시퀀스는 바람직하게 SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9 또는 SEQ ID NO.10 중 어느 하나이다.
그중, 상기 중쇄 가변 영역 HCDR1 시퀀스는 GYTVTSYG(SEQ ID NO.54) 또는 GYSLTSYG(SEQ ID NO.55)에서 선택된 아미노산 시퀀스이고; 상기 경쇄 가변 영역 LCDR1 시퀀스는 RASQSVRNWLD (SEQ ID NO. 23), RASQNVNNWLN (SEQ ID NO.25), RASQNINSWLN (SEQ ID NO.26), RASQNINNWLN(SEQ ID NO.27) 또는 RASQDVDSWLT(SEQ ID NO.29) 중 어느 한 아미노산 시퀀스에서 선택되고; 상기 중쇄 가변 영역 HCDR2 시퀀스는 WVSFYQGNT (SEQ ID NO.59), WVSFYNGQT (SEQ ID NO.60) 또는 WVSFYNGNS (SEQ ID NO.61) 중 어느 한 아미노산 시퀀스에서 선택되고; 상기 경쇄 가변 영역 LCDR2 시퀀스는 GASTLES (SEQ ID NO.34), AASTRET (SEQ ID NO.35), GASSRQS (SEQ ID NO.36), GASTRPT (SEQ ID NO.37) 또는 GASNLAS (SEQ ID NO.39) 중 어느 한 아미노산 시퀀스에서 선택되며, 상기 중쇄 가변 영역 HCDR3 시퀀스는 ARGYSLDV(SEQ ID NO.63), ARGYGMSI(SEQ ID NO.64), ARGFGMDR(SEQ ID NO.65) 또는 ARGYGMTV(SEQ ID NO.66) 중 어느 한 아미노산 시퀀스에서 선택되고; 상기 경쇄 가변 영역 LCDR3 시퀀스는 QQDNDIPLT(SEQ ID NO.43), QQDNDMPLT(SEQ ID NO.45), QQWFDVPTT (SEQ ID NO.46), QQWDDTPNT (SEQ ID NO.47) 또는 QQDSKIPLT (SEQ ID NO.49) 중 어느 한 아미노산 시퀀스에서 선택된다.
그중, 본 발명은 또한 상기 경쇄 또는 상기 중쇄를 포함하는 여러 가지 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 제공한다.
그중, 본 발명은 또한 상기 경쇄 또는 상기 중쇄를 포함하는 여러 가지 항체를 제공하는데, 상기 항체는 특이적으로 PCSK9에 결합하고, PCSK9와 LDLR의 결합을 차단하며, 세포 표면의 LDLR 수량 또는 혈액순환계통 중 LDLR 수준을 높이고, 혈액순한계통 중 LDL 또는 LDL-C 수준을 낮춘다.
그중, 본 발명은 또한 상기 경쇄 또는 상기 중쇄를 포함하는 여러 가지 폴리뉴클레오티드 시퀀스 또는 조합을 제공한다.
그중, 상기 항-PCSK9 단일클론 항체의 중쇄 불변 영역은 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하고, 상기 경쇄 불변 영역은 Ck 또는Cλ를 포함한다.
그중, 상기 중쇄 불변 영역은 바람직하게 IgG4 또는 IgG2이고, 바람직하게는 상기 중쇄의 진핵 발현 벡터 또는 원핵 생물 발현 벡터이다.
그중, 상기 경쇄 불변 영역은 바람직하게 Ck이고, 바람직하게는 상기 경쇄의 진핵 발현 벡터 또는 원핵 생물 발현 벡터이다.
그중, 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드 시퀀스 또는 조합을 포함하는 재조합 DNA 발현 벡터를 제공하는데, 상기 재조합 DNA 발현 벡터의 DNA 시퀀스에는 항-PCSK9 항체를 코드화하는 상기 중쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역의 DNA 시퀀스가 포함된다.
그중, 본 발명은 또한 상기 재조합 DNA 발현 벡터를 형질감염하는 숙주세포를 제공하는데, 상기 숙주세포에는 원핵세포, 효모, 곤충 세포 또는 포유동물 세포가 포함된다.
그중, 상기 원핵세포는 바람직하게 대장균이다.
그중, 상기 포유동물 세포는 바람직하게, HEK293E세포, CHO세포 또는 NS0세포이다.
그중, 본 발명은 또한 상기 경쇄 또는 상기 중쇄를 포함하는 여러 가지 전장 항체(whole-length antibody), 단일사슬 항체, 단일 도메인 항체, 이중 특이항체, 항체 약물 결합체(antibody drug conjugate)를 제공한다.
그중, 본 발명은 또한 상기 경쇄 또는 상기 중쇄를 함유하는 여러 가지 단일클론 항체, 인공 벡터, 약물 또는 약학 조성물을 제공한다.
그중, 상기 단일클론 항체는 전장 항체 및 항-PCSK9 단일클론 항체의 단편을 포함하는데, 상기 단편은 Fab, Fab’, F(ab’）2, Fv 또는 ScFv을 포함하되 이에 한정되지 않는다.
그중, 본 발명은 또한 상기 경쇄 또는 상기 중쇄를 포함하는 검사시약 또는 시약 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 항체는 PCSK9 활성을 제거, 억제 또는 낮춤으로써, 질환을 개선, 완화, 억제 또는 예방하는데 사용될 수 있는데, 상기 질환에는 이상지방혈증（dyslipidemia）, 심뇌혈관질환（cerebrovascular diseases） 및 혈전폐쇄성질환（thrombotic occlusive diseases）이 포함된다.
그중, 상기 이상지방혈증에는 콜레스테롤이 높이 오르거나, 트리글리세라이드가 높이 오르거나, 저밀도 지단백질이 높이 오르거나, 고밀도 지단백질이 낮게 내려가는 것이 포함된다. 상기 심뇌혈관질환에는 관상동맥경화성 심장병, 급성 심근경색, 동맥죽상경화, 중풍 및 말초 동맥 폐쇄성 질환이 포함된다.
본 발명의 항-PCSK9 단일클론 항체를 획득하는 방법은 이하 단계를 포함한다.
(1)항-PCSK9 단일사슬 항체의 바이오패닝, 세 라운드의 항체 라이브러리 농축 스크리닝을 통하여, 전합성 ScFv 파지 라이브러리에서 친화도가 높은 항체 시퀀스 DFSK9-1을 획득하는데, 그 중쇄 DFSK9-H1은 SEQ ID NO.1인 아미노산 시퀀스를 구비하고, 그 경쇄 DFSK9-L1은 SEQ ID NO. 11인 아미노산 시퀀스를 구비한다.
(2)DFSK9-1을 기반으로, 컴퓨터 3급 구조 시뮬레이션을 통하여, 상보 결정 영역 CDRl, CDR2, CDR3 돌연변이 항체 라이브러리를 설계 및 구축하고, 이 돌연변이 항체 라이브러리에 바이오패닝 및 양성 클론의 스크리닝 및 검정을 진행하여, 서로 다른 경쇄를 함유하는 10가지 단일사슬 항체 시퀀스를 획득하는데, 각각 DFSK9-2, DFSK9-3, DFSK9-4, DFSK9-5, DFSK9-6, DFSK9-7, DFSK9-8, DFSK9-9, DFSK9-10, DFSK9-11이라 명명하고, 대응되는 경쇄 가변 영역은 각각 DFSK9-L2, DFSK9-L3, DFSK9-L4, DFSK9-L5, DFSK9-L6, DFSK9-L7, DFSK9-L8, DFSK9-L9, DFSK9-L10 및 DFSK9-L11이라 명명하며, 이에 대응되는 아미노산 시퀀스는 각각SEQ ID NO.12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.20 및 SEQ ID NO.21이고, 상기 단일사슬 항체를 파지 수준 상 친화도 비교를 진행한다.
(3)친화도가 높은 클론 5 주(strain), DFSK9-2, DFSK9-4, DFSK9-5, DFSK9-6 및 DFSK9-8을 선출하고, 중쇄 상보 결정 영역 CDR1, CDR2, CDR3 돌연변이 항체 라이브러리를 설계 구축한 다음, 당해 중쇄 돌연변이 항체 라이브러리에 바이오 패닝 및 양성 클론의 스크리닝 및 검정을 진행하여, 서로 다른 10 가지 단일사슬 항체 시퀀스를 획득하고, 각각 DFSK9-12, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20 및 DFSK9-21이라 명명하는데, 그중, DFSK9-12, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20 및 DFSK9-21 의 경쇄 가변 영역 시퀀스는 각각 DFSK9-L2, DFSK9-L8, DFSK9-L5, DFSK9-L6, DFSK9-L5, DFSK9-L6, DFSK9-L5, DFSK9-L4, DFSK9-L6, DFSK9-L6이며, 이에 대응되는 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.16이고, DFSK9-12, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20 및 DFSK9-21 의 중쇄 가변 영역 시퀀스는 각각 DFSK9-H2, DFSK9-H8, DFSK9-H7, DFSK9-H3, DFSK9-H6, DFSK9-H4, DFSK9-H4, DFSK9-H9, DFSK9-H5, DFSK9-H10이며, 이에 대응되는 아미노산 시퀀스는 각각 SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.10이고, 상기 단일사슬 항체를 파지 수준 상 친화도 비교를 진행한다.
(4) (3) 중 상기 단일클론 중쇄 가변 영역 유전자 및 경쇄 가변 유전자를 진핵 발현 벡터에 복제하고, 숙주세포를 형질감염하여, 항-PCSK9 단일클론 항체의 전반 저항을 획득한다.
그중, 상기 CDR은 상보 결정 영역（complementarity-determining region)이고, 상기 ScFv 는 단일사슬 항체(single-chain fragment variable )이며, 상기 ADCs 는 항체 약물 결합체(antibody-drug conjugates)이고, 상기 LDLR은 저밀도 지단백질 수용체(Low Density Lipoprotein Receptor)이며, 상기 LDL-C 는 저밀도 지단백질 콜레스테롤(Low Density Lipoprotein-Cholesterol)이고, 상기 HEK293E 세포는 인간 신장 293E 세포(human embryonic kidney 293E cell)이며, CH0 세포는 중국 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cell)이고, NS0 세포는 마우스 NS0 흉선종 세포이다.
본 발명을 종래 기술과 비교할 때 이로운 효과는 이하와 같다.
본 발명의 여러 가지 새로운 항-PCSK9 항체는 기질(substrate)에 결합하는 친화도가 높고, PCSK9와 LDLR의 결합을 훌륭하게 차단할 수 있을 뿐더러, 또한 세포 표면의 LDLR 분포 및 발현을 영향할 수 있기에, 세포 표면의 LDL-R와 LDL의 결합 능력을 향상하여, 세포가 LDL에 대한 섭취 및 분해를 증가함으로써, 세포 외 LDL 및 LDL-C 함량을 낮추고, LDL, LDL-C 및 총 콜레스테롤을 낮추는 목적을 달성할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 단일클론 항체는 PCSK9 활성을 제거, 억제 또는 낮춤으로써, 질환을 개선, 완화, 억제 또는 예방하는데 사용될 수 있는데, 상기 질환에는 이상지방혈증, 심뇌혈관질환 및 혈전폐쇄성질환이 포함되며, 이상지방혈증에는 콜레스테롤이 높이 오르거나, 트리글리세라이드가 높이 오르거나, 저밀도 지단백질이 높이 오르거나, 고밀도 지단백질이 낮게 내려가는 것이 포함되고, 심뇌혈관질환에는 관상동맥경화성 심장병, 급성 심근경색, 동맥죽상경화, 중풍 및 말초 동맥폐쇄성질환 등이 포함된다.
도 1은 pScFvDisb-Sl플라스미드 측면도이다;
도 2는 경쇄 돌연변이 항체 라이브러리 양성 클론 파지 단일클론 ELISA 에 의한 단일사슬 항체의 상대 친화도 검정을 나타낸 도이다;
도 3은 경쇄 돌연변이 항체 라이브러리 양성 클론 파지 변화도(gradient) ELISA 에 의한 단일사슬 항체의 상대 친화도 비교를 나타낸 도이다;
도 4는 중쇄 돌연변이 항체 라이브러리 양성 클론 파지 단일클론 ELISA 에 의한 단일사슬 항체의 상대 친화도 검정을 나타낸 도이다;
도 5는 중쇄 돌연변이 항체 라이브러리 양성 클론 파지 변화도(gradient) ELISA 에 의한 단일사슬 항체의 상대 친화도 비교를 나타낸 도이다;
도 6은 pTSEG4 플라스미드 측면도이다;
도 7은 pTSEK 플라스미드 측면도이다;
도 8은 항-PCSK9 전항체와 PCSK9가 분자 수준 상 결합 시험을 나타낸 도이다;
도 9는 항-PCSK9 전항체가 LDLR와 PCSK9의 결합을 경쟁적으로 억제하는 실험을 나타낸 도이다;
도 10은 항-PCSK9 전항체 생물학 활성 실험을 나타낸 도이다.
도 2는 경쇄 돌연변이 항체 라이브러리 양성 클론 파지 단일클론 ELISA 에 의한 단일사슬 항체의 상대 친화도 검정을 나타낸 도이다;
도 3은 경쇄 돌연변이 항체 라이브러리 양성 클론 파지 변화도(gradient) ELISA 에 의한 단일사슬 항체의 상대 친화도 비교를 나타낸 도이다;
도 4는 중쇄 돌연변이 항체 라이브러리 양성 클론 파지 단일클론 ELISA 에 의한 단일사슬 항체의 상대 친화도 검정을 나타낸 도이다;
도 5는 중쇄 돌연변이 항체 라이브러리 양성 클론 파지 변화도(gradient) ELISA 에 의한 단일사슬 항체의 상대 친화도 비교를 나타낸 도이다;
도 6은 pTSEG4 플라스미드 측면도이다;
도 7은 pTSEK 플라스미드 측면도이다;
도 8은 항-PCSK9 전항체와 PCSK9가 분자 수준 상 결합 시험을 나타낸 도이다;
도 9는 항-PCSK9 전항체가 LDLR와 PCSK9의 결합을 경쟁적으로 억제하는 실험을 나타낸 도이다;
도 10은 항-PCSK9 전항체 생물학 활성 실험을 나타낸 도이다.
본 발명의 상세한 실시방법은 실시예를 참조하되, 특별한 설명이 없을 경우, 실시예에서 설명하는 실험방법과 시약은 모두 일반적인 실험방법과 시약이다. 이하 실시예는 단지 본 발명을 설명하고 해석하기 위한 것으로 본 발명에 대한 부당한 제한이 아니다.
본 발명은 특이적으로 PCSK9에 결합하는 단일클론 항체를 제공하는데, 상기 중쇄 가변 영역 시퀀스는SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 5, , 6, 7, 8, 9 및 10 중 어느 하나를 포함하며, 상기 경쇄 가변 영역 시퀀스는SEQ ID NO.11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21 중 어느 하나를 포함한다.
바람직하게, 상기 특이적으로 PCSK9에 결합하는 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역 시퀀스는SEQ ID NO.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 중 어느 하나에서 선택되고, 상기 경쇄 가변 영역 시퀀스는SEQ ID NO. 12, 14, 15, 16 및 18 중 어느 하나에서 선택된다.
경쇄 파지 라이브러리 스크리닝을 통하여, 상기 항체 경쇄 또는 그 기능성 단편의 경쇄 상보 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 아미노산 시퀀스는 이하 아미노산 시퀀스 중 임의 조합(표 1 에 표시된바와 같음)에서 선택된다.
본 발명은 특이적으로 PCSK9에 결합하는 단일클론 항체를 제공하는데, 상기 중쇄 가변 영역 시퀀스는SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 5, , 6, 7, 8, 9 및 10 중 어느 하나를 포함하며, 상기 경쇄 가변 영역 시퀀스는SEQ ID NO.11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21 중 어느 하나를 포함한다.
바람직하게, 상기 특이적으로 PCSK9에 결합하는 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역 시퀀스는SEQ ID NO.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 중 어느 하나에서 선택되고, 상기 경쇄 가변 영역 시퀀스는SEQ ID NO. 12, 14, 15, 16 및 18 중 어느 하나에서 선택된다.
경쇄 파지 라이브러리 스크리닝을 통하여, 상기 항체 경쇄 또는 그 기능성 단편의 경쇄 상보 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 아미노산 시퀀스는 이하 아미노산 시퀀스 중 임의 조합(표 1 에 표시된바와 같음)에서 선택된다.
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표 1 경쇄 각개 CDR영역의 아미노산 시퀀스
중쇄 파지 라이브러리 스크리닝을 통하여, 상기 체 중쇄 또는 그 기능성 단편 중쇄의 상보 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 은 각각 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 으로 표시되고, HCDR1 은 GGTFTNNA(SEQ ID NO.53), GYTVTSYG(SEQ ID NO.54) 또는 GYSLTSYG(SEQ ID NO.55) 중 어느 하나이며, HCDR2는 RIIPMFGMA(SEQ ID NO.56), WLSFYNGNT (SEQ ID NO.57), WVTFYNGNT (SEQ ID NO.58), WVSFYQGNT(SEQ ID NO.59), WVSFYNGQT(SEQ ID NO.60) 또는 WVSFYNGNS(SEQ ID NO.61) 중 어느 하나이고, HCDR3 은 AREGIPMI (SEQ ID NO.62), ARGYSLDV(SEQ ID NO.63), ARGYGMSI (SEQ ID NO.64), ARGFGMDR(SEQ ID NO.65), ARGYGMTV(SEQ ID NO.66) 또는 ARGFGLSV(SEQ ID NO.67) 중 어느 하나이다.
바람직하게, 중쇄 파지 라이브러리 스크리닝을 통하여, 상기 특이적으로 PCSK9에 결합하는 단일클론 항체는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 시퀀스의 중쇄 가변 영역 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 시퀀스를 함유한 경쇄 가변 영역을 포함하되, 그중, 상기 중쇄 가변 영역 HCDR1 시퀀스는 GYTVTSYG(SEQ ID NO.54) 또는 GYSLTSYG(SEQ ID NO.55)의 아미노산 시퀀스에서 선택되고, 상기 경쇄 가변 영역 LCDR1 시퀀스는 RASQSVRNWLD (SEQ ID NO.23), RASQNVNNWLN (SEQ ID NO.25), RASQNINSWLN (SEQ ID NO.26), RASQNINNWLN(SEQ ID NO.27) 또는 RASQDVDSWLT(SEQ ID NO.29) 중 어느 한 아미노산 시퀀스에서 선택되며, 상기 중쇄 가변 영역 HCDR2 시퀀스는 WVSFYQGNT(SEQ ID NO.59), WVSFYNGQT(SEQ ID NO.60) 또는 WVSFYNGNS(SEQ ID NO.61) 중 어느 한 아미노산 시퀀스에서 선택되고, 상기 경쇄 가변 영역 LCDR2시퀀스는 GASTLES (SEQ ID NO.34), AASTRET (SEQ ID NO.35), GASSRQS (SEQ ID NO.36), GASTRPT(SEQ ID NO.37) 또는 GASNLAS(SEQ ID NO.39) 중 어느 한 아미노산 시퀀스에서 선택되며, 상기 중쇄 가변 영역 HCDR3 시퀀스는 ARGYSLDV(SEQ ID NO.63), ARGYGMSI (SEQ ID NO.64), ARGFGMDR(SEQ ID NO.65) 또는 ARGYGMTV (SEQ ID NO.66) 중 어느 한 아미노산 시퀀스에서 선택되고, 상기 경쇄 가변 영역 LCDR3 시퀀스는 QQDNDIPLT(SEQ ID NO.43), QQDNDMPLT(SEQ ID NO.45), QQWFDVPTT(SEQ ID NO.46), QQWDDTPNT (SEQ ID NO.47) 또는 QQDSKIPLT (SEQ ID NO.49) 중 어느 한 아미노산 시퀀스에서 선택된다.
본 발명은 전합성 ScFv 단일사슬 파지 항체 라이브러리로 특이성 항체를 획득하는 방법을 사용하는데, 상기 특이적으로 PCSK9에 결합하는 인간 단일클론 항체는 파지 항체 라이브러리 기술로 스크리닝하여 획득하는 것으로서, 그 단계는 이하와 같다.
(1)항-PCSK9 단일사슬 항체의 바이오패닝, 세 라운드의 항체 라이브러리 농축 스크리닝을 통하여, 친화도가 높은 항체 시퀀스 DFSK9-1을 획득한다.
(2)DFSK9-1을 기반으로, 컴퓨터이용설계를 통하여, 경쇄 CDR123 돌연변이 라이브러리를 구축하고, 당해 항체 라이브러리에 바이오패닝 및 양성 클론의 스크리닝 및 검정을 진행하여, 10가지 서로 다른 경쇄 항체 시퀀스의 클론 DFSK9-2, DFSK9-3, DFSK9-4, DFSK9-5, DFSK9-6, DFSK9-7, DFSK9-8, DFSK9-9, DFSK9-10, DFSK9-11을 획득한다. 상기 10가지 단일사슬 항체를 파지 수준에서 친화도 비교를 진행한다.
(3)친화도가 높은 클론 5주를 선출하여 중쇄 CDR123 라이브러리를 구축하고, 바이오패닝 및 양성 클론의 스크리닝을 진행하여, 10 가지 서로 다른 시퀀스의 단일사슬 항체 DFSK9-12, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20, DFSK9-21을 획득하고, 상기 단일사슬 항체를 파지 수준 상에서 친화도 비교를 진행한다.
(4)(3) 의 상기 단일클론 중쇄 가변 영역 유전자 및 경쇄 가변 유전자를 진핵 발현 벡터에 복제하고, 숙주세포를 형질감염하여, 항-PCSK9 단일클론 항체의 전반 저항을 획득한다.
바람직하게, （4)의 항-PCSK9 단일클론 항체의 전반 저항에 친화도 및 생물활성 시험을 다시 진행한다.
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구체적인 실시예
이하 도면과 실시예에 결부하여 본 발명을 상세하게 설명한다.
실시예 1 항-PCSK9 단일사슬 항체의 바이오패닝
유전자 복제 방법을 사용하여 pCom3 벡터를 개조하고, 개조 후 벡터를 pScFvDisb-Sl (도 1)라 명명한다. 당해 벡터를 기반으로 전합성 파지 항체 라이브러리를 구축한다.
면역튜브에 항원 PCSK9-His lOμg/lml/튜브를 코팅하고, 4°C에서 밤새 코팅한다. PBST-4%milk 로 면역튜브와 파지 항체 라이브러리（파지 투여량 약 109- 1012) 를 각각 밀봉하고, 37°C에서 lh동안 밀봉한다. 밀봉한 파지 항체 라이브러리를 면역튜브에 첨가하여 항원과 항체의 결합을 진행하되, 37°C에서 1h 동안 반응시킨다. PBST-PBS 로 결합하지 못한 파지를 세척 제거하는데, 0.1M pH2.2의 Glycine-HCl로 용출하고, 1.5M pH8.8의 Tris-HCl로 용출액을 pH7.0 좌우 되게 중화시킨다. 용출액이 0D값이 약 0.5-0.8 로 성장한 XLl-Blue균액 10ml를 감염시키도록 하고, 37°C에서 30min동안 방치한 다음 150rpm으로 lh 동안 진탕 배양한다. 균액 1%를 꺼내어 변화도(gradient) 희석을 진행하고, 2YTATG 작은 플레이트 위에 도포하여, 파지 산출량을 계산하는데 사용한다. 나머지 균액은 원심 분리한 후 2YTATG 큰 플레이트 위에 도포하여, 37°C에서 밤새 배양한다. 밤새 배양한 균을 2YTATG 액체 배양기에 이전하여, 증식기까지 쉐이크한 다음 M13K07 헬퍼 파지를 첨가하여 감염시키고, 28°C에서 밤새 배양하여 파지를 증폭하며, PEG6000-NaCl로 파지를 침전 정제하여 다음 라운드의 스크리닝에 사용하는데, 총 세 라운드의 파지 라이브러리 농축 스크리닝을 진행한다.
실시예 2 항-PCSK9 단일사슬 항체의 양성 클론 스크리닝
세 라운드의 스크리닝 경과 후, 잘 분리된 단일클론 콜로니를 선택하여, 2YTATG 액체 배양기가 첨가된 96웰 딥웰 플레이트(deep 96-well plate)에 접종하고, 37°C에서 220rpm으로 약 5h동안, 증식기까지 배양하고, 매 웰에 약 1010 의 헬퍼 파지 M13K07을 첨가하고, 37°C에서 30min 동안 방치한 후, 150rpm 으로 lh 동안 진탕 배양한다. 4000Rpm 으로, 15min 동안 원심 분리하고, 2YTATKA액체 배양기에서 침전 재현탁하고, 28°C에서 220rpm 으로 밤새 배양한다. 4000rpm 으로, 4°C에서 15min 동안 원심 분리하고, 파지가 함유된 상청액을 흡수하여 단일클론 ELISA 검정을 진행한다. 친화도가 높은 단일사슬 항체 DFSK9-1을 획득하고, 그 중쇄 가변 영역은 DFSK9-H1이라 명명하며, 그 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO.1을 참조하며, 그 경쇄 가변 영역은 DFSK9-L1이라 명명하고, 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO. 11을 참조한다.
SEQ ID NO.1 (DFSK9-H1 중쇄 가변 영역 시퀀스 ）：
QVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGGTFTNNAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPMFGMANYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREGIPMIWGQGTTVTVSS
SEQ ID N0. 11 (DFSK9-L1 경쇄 가변 영역 시퀀스）：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDNRLTWYQQKPGKAPKLLIYDASSRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPENDPTTFGQGTKVEIK
실시예 3 단일사슬 항체 DFSK9-1에 체외 친화도 성숙 진행
3.1.DFSK9-1 경쇄 CDR123 돌연변이 라이브러리 구축
NheI과 NotI로 PScFvDisb-DFSK9-l 플라스미드에 더블 효소 절단을 진행하고, 효소 절단 생성물에 아가로스겔 전기영동을 진행하고, 겔 절단 후 크기가 5.5Kb인 스트라이프(stripe)를 회수하는데, NheI과 NotI로, 합성된 경쇄 돌연변이 유전자 VLCDR123M에 더블 효소 절단을 진행하고, 일반 생성물 회수 시약 키트로 생성물을 회수한다. 돌연변이 유전자와 벡터는 3: 1의 몰비로, T4 DNA 리가아제를 통하여 16°C에서 4h 동안 연결한다. 전기 충격법으로 연결 생성물을 XLl-Blue일렉트로콤피턴트 상태로 전화시킨다. 37°C에서, 150rpm으로 lh동안 진동 배양하고 복구한다. 균액을 1% 채취하여 희석 후 작은 플레이트에 코팅하고, 라이브러리 용량을 계산한다. 나머지 균액을 4000rpm으로 15min 동안 원심 분리한 다음, 2YTATG 큰 플레이트 위에 침전 도포하고, 37°C에서 거꾸로 방치하여 밤새 배양한다. 구축된 항체 라이브러리 용량은 약 108이고, 무작위로 클론 20개를 선택하여 시퀀스 분석을 진행하는데, 시퀀스 정확도 및 다양성은 모두 90% 이상이다.
3.2.파지 항체 라이브러리 바이오패닝 및 양성 클론 스크리닝
실시예 1 과 실시예 2의 방법에 따라 바이오패닝 및 양성 클론 스크리닝을 진행하고, 친화도가 높은 클론에 시퀀스 측정을 진행하고, 총 10가지 서로 다른 단일사슬 항체 시퀀스를 획득하는데, 각각 DFSK9-2, DFSK9-3, DFSK9-4, DFSK9-5, DFSK9-6, DFSK9-7, DFSK9-8, DFSK9-9, DFSK9-10, DFSK9-11이라 명명하고, 대응되는 경쇄 가변 영역은 DFSK9-L2, DFSK9-L3, DFSK9-L4, DFSK9-L5, DFSK9-L6, DFSK9-L7, DFSK9-L8, DFSK9-L9, DFSK9-L10, DFSK9-L11 이라 명명하며, 이들에 대응되는 아미노산 시퀀스는 각각SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20 및SEQ ID NO. 21을 참조한다. 경쇄 가변 영역 시퀀스 SEQ ID NO.12- SEQ ID NO.21 은 이하와 같다.
SEQ ID NO.12 (DFSK9-L2 경쇄 가변 영역 시퀀스):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRNWLDWYQQKPGKAPKLLIYGASTLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDNDIPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.13 (DFSK9-L3 경쇄 가변 영역 시퀀스):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINSWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTRETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNNTPNTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.14 (DFSK9-L4 경쇄 가변 영역 시퀀스):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVNNWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTRETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDNDMPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.15 (DFSK9-L5 경쇄 가변 영역 시퀀스):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINSWLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWFDVPTTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.16 (DFSK9-L6 경쇄 가변 영역 시퀀스):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINNWLNWYQQKPGKAPKLLIYGASTRPTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWDDTPNTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.17 (DFSK9-L7 경쇄 가변 영역 시퀀스):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIHNWLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNSNIPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.18 (DFSK9-L8 경쇄 가변 영역 시퀀스):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVDSWLTWYQQKPGKAPKLLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDSKIPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.19 (DFSK9-L9 경쇄 가변 영역 시퀀스):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRNWLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWTDTPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.20 (DFSK9-L10 경쇄 가변 영역 시퀀스):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVRNWLTWYQQKPGKAPKLLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDDSTPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.21 (DFSK9-L11 경쇄 가변 영역 시퀀스）:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSRPTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDSMPMTFGQGTKVEIK
단일클론 파지 라이브러리 ELISA 검정 결과는 도 2에 도시된 바와 같다.
3.3.파지 수평 변화도(gradient) 희석 ELISA에 의한 항-PCSK9단일사슬 항체의 상대 친화도 검증
본 실시예 3.2에서 획득한 클론에 단일클론 파지에 전시(display) 및 정제를 진행하고, 파지 수평의 변화도 희석 ELISA에 의해 단일사슬 항체의 상대 친화도를 검증한다.
pH7.2 인 0.01M PBS 완충액으로 PCSK9-His (300ng/웰/100μl)를 코팅하고, 4°C에서 밤새 코팅한다. PBST로 3회 세척하고, PBST-4%milk에 37°C에서 lh동안 밀봉한다. PBST-4%milk를 첨가하여 5배 변화도로 희석된 정제 파지 샘플（l00μl/웰(well)）을 37°C에서 lh동안 방치한다. PBST로 5회 세척하고, PBST-4%milk를 첨가하여 1:5000 로 희석된 anti-M13-HRP 단일클론 항체（100μl/웰）를 37°C에서 lh동안 방치한다. TMB 발색시약키트（100μl/웰）로 발색하되, 실온에서 lOmin 발색하고, 2M H2S04 (50μl/웰）로 발색을 종료한다. 마이크로플레이트 판독기의 파장을 450nm 및 630nm으로 데이터를 판독한다. GraphPad Prism 5 Demo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 그라프를 그리는데, 결과는 도 3에 도시된 바와 같이, 획득한 파지 단일사슬 항체는 전부 PCSK9 에 결합할 수 있고, 또한 DFSK9-2, DFSK9-4, DFSK9-5, DFSK9-6 및 DFSK9-8 의 친화도는 다른 클론보다 뚜렷이 높기에, 상기 5 개 단일사슬 항체를 선택하여 다음 라운드의 시험을 진행한다.
실시예 4 획득한 항-PCSK9 단일사슬 항체에 다시 체외 친화도 성숙 진행
4.1사슬치환법으로 중쇄CDR123 돌연변이 라이브러리 구축
NcoI-HF 와 KpnI 로 실시예 3. 3 의 DFSK9-2, DFSK9-4, DFSK9-5, DFSK9-6 및 DFSK9-8 등 5가지 단일사슬 항체의 혼합 플라스미드에 대해 더블 효소 절단을 진행하고, 겔 절단 후 크기가 5.5Kb인 스트라이프(stripe)를 회수하고, NcoI-HF와 KpnI로, 합성된 중쇄 돌연변이 라이브러리 유전자VHCDR123M에 더블 효소 절단을 진행하는데, 일반 회수 시약키트로 효소 절단 생성물을 회수한다. 돌연변이 유전자와 벡터는 3: 1의 몰비로, T4 DNA리가아제를 통하여 16°C에서 4h동안 연결한다. 전기 충격법으로 연결 생성물을 XL1 일렉트로콤피턴트 상태로 전화시킨다. 37°C에서 150rpm으로 lh동안 배양하고 복구한다. 균액을 1% 채취하여 희석 후 작은 플레이트에 코팅하고, 라이브러리 용량을 계산한다. 나머지 균액을 4000rpm으로 15min동안 원심 분리한 다음, 2YTATG 큰 플레이트 위에 침전 도포하고, 37°C에서 거꾸로 방치하여 밤새 배양한다. 구축된 항체 라이브러리 용량은 약 5*108이고, 무작위로 클론 20개를 선택하여 시퀀스 분석을 진행하는데, 시퀀스 정확도 및 다양성은 모두 90% 이상이다.
4.2.파지 항체 라이브러리 바이오패닝 및 양성 클론 스크리닝
실시예 4.1의 항체 라이브러리에 파지 전시 및 정제를 진행한다. 당해 라이브러리에서 항-PCSK9 단일사슬 항체를 패닝한다. 파지 항체 라이브러리의 바이오패닝 방법 및 양성 클론의 스크리닝은 실시예 1 및 실시예 2와 같다. 시퀀스 측정 결과 총 10가지 서로 다른 항-PCSK9항체 시퀀스를 스크리닝하였는데, 각각 DFSK9-12, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20, DFSK9-21이라 명명한다. 그중, DFSK9-12 의 경쇄 가변 영역 시퀀스는 DFSK9-L2이고, 대응되는 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO. 12를 참조한다. DFSK9-13의 경쇄 가변 영역 시퀀스는 DFSK9-L8이고, 대응되는 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO. 18을 참조한다. DFSK9-14, DFSK9-16 및 DFSK9-18의 경쇄 가변 영역 시퀀스는 DFSK9-L5이고, 대응되는 아민산 시퀀스는 SEQ ID NO. 15를 참조한다. DFSK9-15, DFSK9-17, DFSK9-20 및 DFSK9-21의 경쇄 가변 영역 시퀀스는 DFSK9-L6이고, 대응되는 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO.16을 참조한다. DFSK9-19의 경쇄 가변 영역 시퀀스는 DFSK9-L4이고, 대응되는 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO.14를 참조한다. DFSK9-12의 중쇄 가변 영역 시퀀스는 DFSK9-H2이고, 대응되는 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO.2를 참조한다. DFSK9-13의 중쇄 가변 영역 시퀀스는 DFSK9-H8이고, 대응되는 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO.8을 참조한다. DFSK9-14의 중쇄 가변 영역 시퀀스는 DFSK9-H7이고, 대응되는 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO.7을 참조한다. DFSK9-15의 중쇄 가변 영역 시퀀스는 DFSK9-H3이고, 대응되는 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO.3을 참조한다. DFSK9-16의 중쇄 가변 영역 시퀀스는 DFSK9-H6이고, 대응되는 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO.6을 참조한다. DFSK9-17 및 DFSK9-18의 중쇄 가변 영역 시퀀스는 DFSK9-H4이고, 대응되는 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO.4를 참조한다. DFSK9-19의 중쇄 가변 영역은 DFSK9-H9이고, 대응되는 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO.9를 참조한다. DFSK9-20의 중쇄 가변 영역은 DFSK9-H5이고, 대응되는 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO.5를 참조한다. DFSK9-21 의 중쇄 가변 구역 시퀀스는 DFSK9-H10이고, 대응되는 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO.10을 참조한다. 경쇄 가변 영역 시퀀스는 실시예 3.2의 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16 및 SEQ ID NO.18을 참조한다. 중쇄 가변 영역 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO.2- SEQ ID NO.10은 이하와 같다.
SEQ ID NO.2 ( DFSK9-H2 중쇄 가변 영역 시퀀스 ）：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWLSFYNGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.3 ( DFSK9-H3 중쇄 가변 영역 시퀀스 ）：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQ GLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.4 ( DFSK9-H4 중쇄 가변 영역 시퀀스 ）：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQ GLEWMGWVSFYNGNSNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.5 ( DFSK9-H5 중쇄 가변 영역 시퀀스 ）：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQ GLEWMGWVSFYNGNSNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGMDRWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.6 ( DFSK9-H6 중쇄 가변 영역 시퀀스):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYQGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGMDRWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.7 ( DFSK9-H7 중쇄 가변 영역 시퀀스) :
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYGMSIWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.8 ( DFSK9-H8 중쇄 가변 영역 시퀀스):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYQGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYGMTVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.9 ( DFSK9-H9 중쇄 가변 영역 시퀀스):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVTFYNGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGLSVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.10 ( DFSK9-H10 중쇄 가변 영역 시퀀스 ）：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGMDRWGQGTTVTVSS
단일클론 phage ELISA에 의한 phage-Abs의 상대 친화도 검증은 도 4에 도시된 바와 같다.
4. 3. 변화도 희석 파지 ELISA에 의한 항-PCSK9 단일사슬 항체의 친화도 검증
본 실시예 4. 2에서 획득한 클론에 단일클론 파지의 전시 및 정제를 진행하고, 파지 변화도 희석 ELISA 실험을 진행하여 단일사슬 항체의 친화도를 검정하는데, 방법은 실시예 3의 3. 3과 같다. 결과는 도 5에 도시된 바와 같이, 스크리닝된 10가지 서로 다른 단일사슬 항체는 모두 PCSK9에 잘 결합하고, 또한 친화도가 최초의 단일사슬DFSK9-1보다 높다.
실시예 5 항-PCSK9 전항체의 친화도 검정
5.1항-PCSK9 전항체의 제조
실시예 4에서 스크리닝한 항체의 중쇄 VH를 중쇄 불변 영역 유전자(γ4)를 함유한 벡터 pTSEG4 (도 6)에 복제하고, 경쇄 VK 유전자를 경쇄 불변 영역 유전자(k사슬）를 함유한 벡터pTSEK (도 7)에 복제하는데, 벡터pTSEG4 및 pTSEK는 모두 PTT 벡터를 기반으로 개조 획득한 것이다. PTT 벡터의 제조과정은 참고문헌 (Yves.Durocher,Sylvie.Perret and Amine.Kamen Nucleic Acids Research, 2002Vol.30, No.2e9)에 상세한 설명이 되어 있다. 순식간에 HEK293E 세포를 형질감염하고, 전항체 발현을 진행한다. AKTA기기 protein A친화도 칼럼 정제를 사용하여 전항체 단백질을 획득한다.
5.2전항체와 PCSK9의 결합 실험
pH7.2 인 0.01M PBS 완충액으로 PCSK9-His (300ng/웰/100μl)를 코팅하고, 4°C에서 밤새 코팅한다. 300μl/웰 PBST (1‰ Tween 20)로 3회 세탁하고, PBST-4%milk를 첨가하여 37°C에서 lh동안 밀봉한다. 서로 다른 희석도의 전항체 DFSK9-1, DFSK9-12, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20 및 DFSK9-21을 첨가한다. 11가지 전항체의 최고 농도는 50ug/ml이고, 5배 변화도로 희석하고, 매개 전항체에 8개 변화도를 적용하여, 37°C에서 lh동안 인큐베이션한다. 300μl/웰 PBST로 5회 세척한 다음, PBST-4%milk를 이용하여 1:5000 비례로 희석한 산양 항 인간IgG-HRP 2차항체를 첨가하여, 37°C에서 lh동안 인큐베이션한다. 300μl/웰PBST로 5회 세척하고, TMB 발색 시약 키트 (100μl/웰）를 이용하여 발색하되, 실온에서 10min 동안 발색한 다음, 2M H2S04(50μl/웰)로 발색을 종료한다. 마이크로플레이트 판독기의 파장을 450nm 및 630nm으로 데이터를 판독한다. GraphPad Prism 5 Demo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 그라프를 그리는데, 실험 결과는 도 8 및 표 2에 표시된 바와 같이, 모든 항체는 PCSK9 분자와 잘 결합하는데, 그중, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-20 및 DFSK9-21 은 상대적으로 높은 친화도를 구비한다.
표 2 전항체 친화도 EC50값
5. 3 전항체가 LDLR와 PCSK9의 결합을 경쟁적으로 억제하는 실험
pH7. 2 짜리 0.01M PBS 로 LDLR-Fc(100ng/웰/100μl)를 코팅하되, 4°C에서 밤새 코팅한다. PBST로 3회 세탁하고, PBST-4%milk를 첨가하여, 37°C에서 lh동안 밀봉한다. PBST-4%milk를 이용하여 희석한, 2μg/ml 농도의 PCSK9-His (100μl/웰）을 첨가하고, 37°C에서 lh 동안 인큐베이션한다. PBST-4%milk 를 첨가하여 서로 다른 희석도의 전항체 DFSK9-1, DFSK9-12, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20 및 DFSK9-21을 희석한다. 11가지 전항체의 최고 농도는 100ug/ml이고, 5배 변화도로 희석하고, 매개 전항체에 8개 변화도를 적용하여, 37°C에서 2h동안 인큐베이션한다. PBST로 5회 세척하고, PBST-4%milk로 희석한 마우스 항His IgG-HRP 2차항체를 첨가하여, 37°C에서 lh동안 인큐베이션한다. TMB 발색시약키트（100μl/웰）로 발색하되, 실온에서 10min동안 발색하고, 2M H2S04 ( 50μl/웰）로 발색을 종료한다. 마이크로플레이트 판독기의 파장을 450nm 및 630nm으로 데이터를 판독한다. GraphPad Prism 5 Demo 소프트웨어를 이용하여 그라프를 그리는데, 실험결과는 도 9 및 표 3에 표시된 바와 같이, 모든 항체는 효과적으로 PCSK9와 LDLR의 결합을 억제하는데, 그중, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-20 및 DFSK9-21 의 억제 능력이 약간 더 강하다.
표 3 전항체 경쟁 실험 IC50값
5.4 BIAcore X100 전항체 친화도 측정
포획법을 사용하여 전항체 친화도를 측정한다. 산양 항인간IgG를 CM5 칩 표면에 커플링하고, DFSK9-1, DFSK9-12, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20 및 DFSK9-21을 각각 희석하여, 약 200RU 좌우의 항체가 산양 항인간IgG에 포획되도록 확보한다. PCSK9에 일련의 농도 변화도（200nM, 100nM, 50nM, 25nM, 12. 5nM, 6. 25nM, 3. 125nM, 1. 5625nM, 0. 78125nM)를 설정하여, 고상 표면을 흘러 지나가게 하고, 항체의 친화도를 측정한다. 그 결과 스크리닝한 항체가 모두 높은 친화도（표 4 참조)를 구비하고 있음을 발견하는데, 친화도가 가장 높은 8가지 전항체를 선택하여 생물학 활성 실험을 진행한다.
표 4 항-PCSK9 전항체 친화도 상수 측정 수치
실시예
6 항
-
PCSK9
전항체
생물학 활성 실험
HepG2 세포를 2.5X105 cells/ml로 96웰에 접종한다. 다음날, 10%의 FBS EMEM 생장 배양기를 80μl의 5% 아포지질단백질FBS를 함유한 분석 배양기로 바꾸고, 37°C에서 24h 동안 배양한다. 다음날, 분석 배양기로 희석한, 서로 다른 희석도의 전항체（10μl/웰）를 HepG2 세포가 접종된 배양 플레이트에 첨가한다. 8가지 전항체의 최고 농도는 900nmol/L이고, 3배 변화도로 희석하며, 매개 전항체에 8개 변화도를 적용한다. 다음, 30nmol/L의 PCSK9 용액(10μl/웰）을 첨가하고, 잘 혼합한 후 37°C에서 5% C02 조건하에 4h 동안 배양한다. 매 웰에 10ul 0.lmg/m L의 B0DIPY 표기가 된LDL 용액을 첨가하고, 잘 혼합한 후 37°C에서 5% C02 조건 하에 계속하여 15-20h 동안 배양한다. 매 웰에 200μl의 PBS를 첨가하여 2회 세척한다. 매 웰에 l00μl PBS를 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기 파장을 490nm 및 520nm으로 상대 형광유닛 RFU수치를 판독한다. GraphPad Prism 5 Demo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 그라프를 그리는데, 결과는 도 10에 도시된 바와 같이, 동형IgG로 음성 대조하면, 도면에서 8개 항체가 사용량 의뢰적 방식으로 PCSK9와 저밀도 지단백질 수용체 LDLR와의 결합을 차단할 수 있고, HepG2 세포 내에서 저밀도 지단백질 LDL의 섭취율을 증가하고, 각 항체 사이 생물학 활성에 큰 차이가 없다는 것을 보아낼 수 있다.
표 5 생물학 활성 실험 EC50값
당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게, 구체적인 실시예는 단지 본 발명에 대해 예시적 설명을 진행한 것으로, 본 발명의 구체적인 실현이 상기 방식의 제한을 받지 않음이 분명하다. 본 발명의 방법 구상 및 기술 방안을 이용하여 진행하는 모든 비 실질적인 개진, 또는 개진을 거치지 않고 직접 본 발명의 구상 및 기술방안을 다른 경우에 응용하는 것은 모두 본 발명의 보호범위에 속한다.
SEQUENCE LISTING
<110> BEIJING DONGFANG BIOTECH CO.,LTD.(북경 동방백태 생물공학 주식회사)
<120> 항-PCSK9 단일클론 항체
<160> 67
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Asn Asn
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Met Phe Gly Met Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Gly Thr Met Thr Thr Asp Pro Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Pro Met Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Leu Ser Phe Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Gly Thr Met Thr Thr Asp Pro Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Ser Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Val Ser Phe Tyr Asn Gly Gln Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Gly Thr Met Thr Thr Asp Pro Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Ser Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Val Ser Phe Tyr Asn Gly Asn Ser Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Gly Thr Met Thr Thr Asp Pro Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Ser Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Val Ser Phe Tyr Asn Gly Asn Ser Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Gly Thr Met Thr Thr Asp Pro Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Gly Met Asp Arg Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Val Ser Phe Tyr Gln Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Gly Thr Met Thr Thr Asp Pro Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Gly Met Asp Arg Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Val Ser Phe Tyr Asn Gly Gln Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Gly Thr Met Thr Thr Asp Pro Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Met Ser Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Val Ser Phe Tyr Gln Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Gly Thr Met Thr Thr Asp Pro Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Met Thr Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Val Thr Phe Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Gly Thr Met Thr Thr Asp Pro Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Gly Leu Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Val Ser Phe Tyr Asn Gly Gln Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Gly Thr Met Thr Thr Asp Pro Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Gly Met Asp Arg Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Asn Arg
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Pro Glu Asn Asp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Asn Trp
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asn Asp Ile Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Arg Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Asn Thr Pro Asn
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asn Asn Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Arg Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asn Asp Met Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Ser Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Phe Asp Val Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Pro Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Asp Thr Pro Asn
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile His Asn Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ser Asn Ile Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asp Ser Trp
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Ser Lys Ile Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Asn Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Asp Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Arg Asn Trp
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Tyr
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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<400> 67
Ala Arg Gly Phe Gly Leu Ser Val
1 5
Claims (17)
- 항-PCSK9 단일클론 항체로서, 경쇄 및 중쇄를 포함하되,
상기 중쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:1이고 상기 경쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:11인 DFSK9-1;
상기 중쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:2이고 상기 경쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:12인 DFSK9-12;
상기 중쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:8이고 상기 경쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:18인 DFSK9-13;
상기 중쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:7이고 상기 경쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:15인 DFSK9-14;
상기 중쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:3이고 상기 경쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:16인 DFSK9-15;
상기 중쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:6이고 상기 경쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:15인 DFSK9-16;
상기 중쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:4이고 상기 경쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:16인 DFSK9-17;
상기 중쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:4이고 상기 경쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:15인 DFSK9-18;
상기 중쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:9이고 상기 경쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:14인 DFSK9-19;
상기 중쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:5이고 상기 경쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:16인 DFSK9-20; 및
상기 중쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:10이고 상기 경쇄의 가변 영역의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO:16인 DFSK9-21; 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-PCSK9 단일클론 항체.
- 제1항에 따른 경쇄 또는 중쇄를 포함하는 단백질.
- 제1항에 따른 경쇄 또는 중쇄를 포함하는 항체로서,
특이적으로 PCSK9에 결합하는 항체.
- 제1항에 따른 중쇄 또는 경쇄를 코딩하기 위한 폴리뉴클레오티드.
- 제4항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 DNA 발현 벡터.
- 제5항에 따른 재조합 DNA 발현 벡터를 형질감염하는 숙주세포로서,
원핵세포, 효모, 곤충 세포 또는 포유동물 세포를 포함하는 숙주세포.
- 제6항에 있어서,
상기 원핵세포는 대장균이고, 상기 포유동물 세포는 HEK293E 세포, CHO 세포 또는 NS0 세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
- 제1항에 있어서,
상기 항-PCSK9 단일클론 항체의 중쇄의 불변 영역에 IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4 가 포함되고; 상기 경쇄의 불변 영역이 CK 또는Cλ를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-PCSK9 단일클론 항체.
- 제8항에 있어서,
상기 중쇄의 불변 영역이 IgG4 또는 IgG2이고, 상기 경쇄의 불변 영역이 Ck인 것을 특징으로 하는 항-PCSK9 단일클론 항체.
- 제1항에 따른 경쇄 또는 중쇄를 포함하는 항체로서,
PCSK9 활성을 제거, 억제 또는 낮춤으로써 질환을 개선, 완화, 억제 또는 예방하는데 사용될 수 있고, 상기 질환에는 이상지방혈증, 심뇌혈관질환 및 혈전폐쇄성질환이 포함되는 항체.
- 삭제
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