CN109963877B - Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及PCSK9抗体、其抗原结合片段及其医药用途。进一步地,本发明涉及包含所述PCSK9抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体,以及包含PCSK9抗体及其抗原结合片段的药物组合物,以及其作为降血脂药物的用途。特别地,本发明涉及一种人源化的PCSK9抗体在制备用于治疗PCSK9介导的疾病或病症的药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及PCSK9抗体、PCSK9抗体的抗原结合片段、包含所述PCSK9抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体,以及包含所述PCSK9抗体及其抗原结合片段的药物组合物,以及其作为降血脂药物的用途。
背景技术
高胆固醇血症是一种以血清胆固醇水平升高为主要特征的脂类代谢异常疾病,其主要表现为血清胆固醇水平升高,导致胆固醇在血管聚集,形成动脉粥样硬化。大量的临床及实验研究结果都证实,脂质代谢异常和冠心病的发生、发展有着密切的关系。因此,降低血液中的胆固醇浓度成了目前治疗和预防动脉粥样硬化的一个主要手段。
目前,临床上调节脂类代谢的药物主要以他汀类为主。立普妥(Liptor)作为全世界应用最广泛的降胆固醇药物,也是医药史上最畅销药物,通过阻断肝脏生产胆固醇的酶作用,减少胆固醇的产生,增加肝脏从血液中摄取更多的胆固醇,进而减低血液中胆固醇浓度。但是立普妥也有其不足之处,首先,立普妥可以降低30%-40%的低密度脂蛋白,但仍然有很多病人的血脂无法降低到有效的浓度(低密度脂蛋白浓度<50mg/dL);其次病人对立普妥的响应率也有人种差异。因此,很多病人需要一个更为有效的降低血脂的药物。
家族性高胆固醇血症(Familial hypercholesterolemia,FM)是一种常染色体单基因显性遗传性疾病,其临床特征为血总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(low densitylipoprotein-cholesterol,LDL-c)显著升高、睑黄瘤、角膜弓以及早发的心血管疾病。低密度脂蛋白受体(LDL receptor,LDLR)基因突变致其缺陷或缺乏,LDL-c不能顺利转运到肝脏清除,以致血中LDL-c水平升高。目前已明确3种基因与FM的发生有关,它们分别是LDLR基因、载脂蛋白B100基因和PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)基因。
前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type9,PCSK9)是一种前蛋白转化酶,属于分泌的枯草杆菌酶家族的蛋白酶K亚族。该编码蛋白是作为可溶性酶原合成,在内质网中经过自身催化分子内加工成为有活性的PCSK9。研究表明,PCSK9可促进LDL受体的降解从而增加血浆中LDL胆固醇含量,而LDL受体介导肝内的LDL胞吞过程,后者是从循环系统清除LDL的主要途径。有研究发现,12.5%的高胆固醇血症(ADH)患者检测有PCSK9基因突变。PCSK9突变形式多样,根据突变对PCSK9调节LDL-C水平的不同影响可分为两类:功能缺失型和功能获得型。其中功能缺失型突变与低血胆固醇水平有关,有预防冠状动脉粥样硬化性心脏病发生的作用,非洲人群中低胆固醇的PCSK9突变率高于其他种族。PCSK9功能获得型突变体通过增加PCSK9的功能、降低LDLR的表达而升高血浆胆固醇水平,可以导致严重高胆固醇血症和早发冠状动脉粥样硬化性心脏病。目前发现的PCSK9功能获得型突变包括:D374Y、S127R、F216L、N157K、R306S等。其中,与PCSK9野生型相比,D374Y突变体细胞表面的LDLR减少了36%,S127R突变有相应减少了10%。
抗体药物的稳定性是影响抗体成药性的关键因素之一,作为一种基因重组表达的产物,抗体药物在其生产、运输、存储及体内使用的过程中会发生多种物理和化学降解,如二硫键错配、氧化、脱酰胺化、异构化等。从而引起抗体表面电荷基团的改变,间接导致抗体结构转变,最终影响抗体药物理化性质和体内外生物学功能。其中,异构化和脱酰胺是抗体分子常见的两种化学降解途径,对抗体的稳定性、生物学功能和生物利用度造成严重影响(Electrophoresis.2010Jun;31(11):1764-72.)。
抗体中天冬氨酸(Asp)位点易发生非酶促的翻译后修饰,该修饰使Asp经过一个环化的亚酰胺的过程,最终形成异构化的Asp。目前,Asp异构化作为常见的蛋白降解途径已经在多种抗体中发现。有文献报道,抗体CDR区的Asp异构化可显著降低抗体的亲和力和化学稳定性,并最终影响抗体在疾病治疗中的应用潜能。(Biotechnol Bioeng.2010 Feb 15;105(3):515-523;MAbs.2014 Mar-Apr;6(2):327-39.)。因此,有目的的降低抗体CDR区特定位点的Asp异构化或突变Asp位点,有望成为提高抗体稳定性和功能的手段之一。
目前PCSK9作为一个极具潜力的新的靶标已成为高胆固醇血症研究的热点,对于深入了解胆固醇代谢的机制和寻求新的治疗手段有重要意义。有多家跨国制药公司在研发针对PCSK9的单克隆抗体,相关的专利有WO2011111007、WO2011072263、WO2012101251、WO2012088313、WO2013039958、WO2013016648、WO2013008185等。
本发明提供有着更高亲和力、更高选择性、更高生物活性和化学稳定性的PCSK9抗体。
发明内容
本发明提供一种特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段,所述PCSK9抗体或其抗原结合片段包含包含以下CDR区:
i)HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列分别如SEQ ID NO:12、13和31所示;
ii)LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列分别如SEQ ID NO:15、16和17所示。
在本发明一个优选的实施方案中,SEQ ID NO:31所示的HCDR3序列为QYDYX1EX2WYFDV,其中:X1可选自D、E、H、M、N或Q;X2可选自D、E、H、M、N或Q;但X1与X2不能同时为D。
在本发明另一个优选的实施方案中,HCDR3的序列选自SEQ ID NO:38-47中的任一个所示的序列。
在本发明另一个优选的实施方案中,其中所述的所述PCSK9抗体或其抗原结合片段包含包含以下CDR区:
a)HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列分别如SEQ ID NO:12、13和38所示,LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列分别如SEQ ID NO:15、16和17所示;
b)HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列分别如SEQ ID NO:12、13和39所示,LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列分别如SEQ ID NO:15、16和17所示;
c)HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列分别如SEQ ID NO:12、13和40所示,LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列分别如SEQ ID NO:15、16和17所示;
d)HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列分别如SEQ ID NO:12、13和41所示,LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列分别如SEQ ID NO:15、16和17所示;
e)HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列分别如SEQ ID NO:12、13和42所示,LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列分别如SEQ ID NO:15、16和17所示;
f)HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列分别如SEQ ID NO:12、13和43所示,LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列分别如SEQ ID NO:15、16和17所示;
g)HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列分别如SEQ ID NO:12、13和44所示,LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列分别如SEQ ID NO:15、16和17所示;
h)HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列分别如SEQ ID NO:12、13和45所示,LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列分别如SEQ ID NO:15、16和17所示;
i)HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列分别如SEQ ID NO:12、13和46所示,LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列分别如SEQ ID NO:15、16和17所示;
或
g)HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列分别如SEQ ID NO:12、13和47所示,LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列分别如SEQ ID NO:15、16和17所示。
在本发明另一个优选的实施方案中,所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体或鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体的抗原结合片段。
在本发明另一个优选的实施方案中,所述PCSK9抗体的轻链可变区进一步包含鼠源κ链或鼠源κ链变体的轻链FR区;其中所述PCSK9抗体的重链可变区进一步包含鼠源IgG1或鼠源IgG1变体的重链FR区。
在本发明另一个优选的实施方案中,所述PCSK9抗体的轻链进一步包含鼠源κ链或含鼠源κ链变体的轻链恒定区;其中所述PCSK9抗体的重链进一步包含鼠源IgG1或鼠源IgG1变体的重链恒定区。
在本发明另一个优选的实施方案中,所述的人源化抗体的重链可变区上的重链FR区序列来源于人种系重链IGHV1-2*02和hjh2的组合序列或其突变序列;所述重链FR区序列包含人种系重链IGHV1-2*02的FR1、FR2、FR3区序列和hjh2的FR4区序列或人种系重链IGHV1-2*02的FR1、FR2、FR3区序列和hjh2的FR4区序列的突变序列。
在本发明另一个优选的实施方案中,所述的人源化抗体含有SEQ ID NO:32所示的重链可变区;或SEQ ID NO:32所示的重链可变区的变体;其中所述SEQ ID NO:32所示的重链可变区的变体是在SEQ ID NO:32所示的重链可变区上具有1-10个氨基酸的插入、缺失或替换的变体。所述的氨基酸的插入、缺失或替换可以是用现有技术,为提高抗体如亲和性、半衰期等性能做的改进,如用亲和力成熟修改CDR区的氨基酸,或者用回复突变修改FR区的氨基酸。
在本发明另一个优选的实施方案中,所述的人源化抗体的重链FR区序列有0-10个氨基酸的回复突变,优选为一个或多个选自T30N、R87T、R72A、T74K、M48I、V68A、M70L、R38K和R67K的氨基酸回复突变。
在本发明另一个优选的实施方案中,所述人源化抗体包含选自SEQ ID NO:32-37中的任一个序列所示的重链可变区。
在本发明另一个优选的实施方案中,所述的人源化抗体的轻链可变区上的轻链FR区序列来源于人种系轻链IGKV1-39*01和hjk2.1的组合序列及其突变序列;所述轻链FR区序列包含人种系轻链IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3区序列和hjk2.1的FR4区序列或人种系轻链IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3区序列和hjk2.1的FR4区序列的突变序列。
在本发明另一个优选的实施方案中,所述人源化抗体进一步包含SEQ ID NO:24-27中的任一个序列所示的轻链可变区。
在本发明另一个优选的实施方案中,所述人源化抗体包含重链可变区序列和/或轻链可变区序列,所述重链可变区序列选自SEQ ID NO:32-37所示的任一个序列;所述轻链可变区序列选自SEQ ID NO:24-27所示的任一个序列。
在本发明另一个优选的实施方案中,所述的PCSK9抗体包含选自SEQ ID NO:32-37中的任一个序列所示重链可变区和SEQ ID NO:24-27中的任一个序列所示的轻链可变区。
在本发明另一个优选的实施方案中,所述PCSK9抗体包含选自SEQ ID NO:48-57中的任一个序列所示的重链可变区和SEQ ID NO:24-27中的任一个序列所示的轻链可变区。
在本发明另一个优选的实施方案中,所述PCSK9抗体包含:
1)SEQ ID:48所示的重链可变区和SEQ ID:24所示的轻链可变区;
2)SEQ ID:48所示的重链可变区和SEQ ID:25所示的轻链可变区;
3)SEQ ID:48所示的重链可变区和SEQ ID:26所示的轻链可变区;
4)SEQ ID:48所示的重链可变区和SEQ ID:27所示的轻链可变区;
5)SEQ ID:49所示的重链可变区和SEQ ID:24所示的轻链可变区;
6)SEQ ID:49所示的重链可变区和SEQ ID:25所示的轻链可变区;
7)SEQ ID:49所示的重链可变区和SEQ ID:26所示的轻链可变区;
8)SEQ ID:49所示的重链可变区和SEQ ID:27所示的轻链可变区;
9)SEQ ID:50所示的重链可变区和SEQ ID:24所示的轻链可变区;
10)SEQ ID:50所示的重链可变区和SEQ ID:25所示的轻链可变区;
11)SEQ ID:50所示的重链可变区和SEQ ID:26所示的轻链可变区;
12)SEQ ID:50所示的重链可变区和SEQ ID:27所示的轻链可变区;
13)SEQ ID:51所示的重链可变区和SEQ ID:24所示的轻链可变区;
14)SEQ ID:51所示的重链可变区和SEQ ID:25所示的轻链可变区;
15)SEQ ID:51所示的重链可变区和SEQ ID:26所示的轻链可变区;
16)SEQ ID:51所示的重链可变区和SEQ ID:27所示的轻链可变区;
17)SEQ ID:52所示的重链可变区和SEQ ID:24所示的轻链可变区;
18)SEQ ID:52所示的重链可变区和SEQ ID:25所示的轻链可变区;
19)SEQ ID:52所示的重链可变区和SEQ ID:26所示的轻链可变区;
20)SEQ ID:52所示的重链可变区和SEQ ID:27所示的轻链可变区;
21)SEQ ID:53所示的重链可变区和SEQ ID:24所示的轻链可变区;
22)SEQ ID:53所示的重链可变区和SEQ ID:25所示的轻链可变区;
23)SEQ ID:53所示的重链可变区和SEQ ID:26所示的轻链可变区;
24)SEQ ID:53所示的重链可变区和SEQ ID:27所示的轻链可变区;
25)SEQ ID:54所示的重链可变区和SEQ ID:24所示的轻链可变区;
26)SEQ ID:54所示的重链可变区和SEQ ID:25所示的轻链可变区;
27)SEQ ID:54所示的重链可变区和SEQ ID:26所示的轻链可变区;
28)SEQ ID:54所示的重链可变区和SEQ ID:27所示的轻链可变区;
29)SEQ ID:55所示的重链可变区和SEQ ID:24所示的轻链可变区;
30)SEQ ID:55所示的重链可变区和SEQ ID:25所示的轻链可变区;
31)SEQ ID:55所示的重链可变区和SEQ ID:26所示的轻链可变区;
32)SEQ ID:55所示的重链可变区和SEQ ID:27所示的轻链可变区;
33)SEQ ID:56所示的重链可变区和SEQ ID:24所示的轻链可变区;
34)SEQ ID:56所示的重链可变区和SEQ ID:25所示的轻链可变区;
35)SEQ ID:56所示的重链可变区和SEQ ID:26所示的轻链可变区;
36)SEQ ID:56所示的重链可变区和SEQ ID:27所示的轻链可变区;
37)SEQ ID:57所示的重链可变区和SEQ ID:24所示的轻链可变区;
38)SEQ ID:57所示的重链可变区和SEQ ID:25所示的轻链可变区;
39)SEQ ID:57所示的重链可变区和SEQ ID:26所示的轻链可变区;和
40)SEQ ID:57所示的重链可变区和SEQ ID:27所示的轻链可变区。
在本发明另一个优选的实施方案中,所述PCSK9抗体的重链进一步包含人源IgG1或其变体的重链恒定区;优选氨基酸突变延长抗体在血清中的半衰期的人源IgG1变体的重链恒定区,更优选包含引入YTE突变的人源IgG1变体的重链恒定区。其中所述PCSK9抗体的轻链进一步包含人源κ其变体的轻链恒定区。
在本发明另一个优选的实施方案中,所述人源化抗体包含SEQ ID NO:28或SEQ IDNO:29所示的重链恒定区和SEQ ID NO:30所示轻链恒定区。
本发明进一步提供一种药物组合物,其含有治疗有效量的如上所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段,以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明进一步提供一种编码如上所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段的DNA分子。
本发明进一步提供一种如上所述的DNA分子的表达载体。
本发明进一步提供一种如上所述的表达载体转化的宿主细胞,所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞,优选为真核细胞,更优选哺乳动物细胞。
本发明进一步提供一种用于生产如上所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段的方法,所述方法包括将如前述项所述的宿主细胞在培养物中进行培养以形成并积累如上所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段,以及从培养物回收所积累的PCSK9抗体或其抗原结合片段。
本发明进一步提供一种用于免疫检测或测定人PCSK9的方法,所述方法包括在适合与人PCSK9特异性结合的条件下,使用如上所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段特异性结合人PCSK9的步骤。
本发明进一步提供一种用于检测或测定人PCSK9的试剂,所述试剂包含如上所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段。
本发明进一步提供一种如上所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段或如上所述的药物组合物在制备用于治疗PCSK9介导的疾病或病症的药物中的用途,其中所述的疾病或病症优选为胆固醇相关疾病(其包括“血清胆固醇相关疾病”);更优选为高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠状动脉心脏病、卒中、心血管疾病、阿尔茨海默病和一般性的异常脂血症;最优选高胆固醇血症、异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病。
本发明进一步提供一种上述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段、或上述的药物组合物治疗PCSK9介导的疾病或病症的方法,所述方法包括向个体施用有效量的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段。其中所述的疾病或病症优选为胆固醇相关疾病;更优选为高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠状动脉心脏病、卒中、心血管疾病、阿尔茨海默病和一般性的异常脂血症;最优选高胆固醇血症、异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病。
本发明进一步提供一种如上所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段或如上所述的药物组合物在制备用于诊断PCSK9介导的疾病或病症的试剂中的用途。
可以使用本发明的PCSK9抗体或其抗原结合片段诊断的示例性疾病包括胆固醇相关疾病(其包括“血清胆固醇相关疾病”),其包括以下的任何一种或多种:高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠状动脉心脏病、卒中、心血管疾病、阿尔茨海默病和一般性的异常脂血症(其显示为例如提高的总血清胆固醇、提高的LDL、提高的甘油三酯、提高的极低密度脂蛋白(VLDL)和/或低的HDL)。
在一方面中,本发明提供治疗或预防个体中的高胆固醇血症和/或至少一种以下症状的方法:异常脂血症、动脉粥样硬化、心血管疾病(CVD)或冠状动脉心脏病,所述方法包括向所述个体施用有效量的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段。本发明还提供有效量的拮抗胞外或循环PCSK9的抗PCSK9抗体其抗原结合片段在制备药物中的用途,所述药物用于治疗或预防个体的高胆固醇血症和/或至少一种以下症状:异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病。
本发明提供的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段进一步具有消除CDR区异构化的特性,具有更好的稳定。
附图说明
图1:本发明抗体载体构建中的引物设计示意图。
图2:本发明抗体载体构建示意图。
图3:不同h001-4-YTE抗体HCDR3区域D103位点突变体与野生型PCSK9蛋白的结合能力曲线,结果显示D103位点的氨基酸替换不影响抗体与野生型PCSK9的结合活性。
图4:不同h001-4-YTE抗体HCDR3区域D105位点突变体与野生型PCSK9蛋白的结合能力曲线,数据结果显示,D105位点氨基酸替换不影响PCSK9抗体与野生型PCSK9蛋白的结合能力。
图5:不同h001-4-YTE抗PCSK9抗体浓度中HepG2细胞的LDL摄取变化。数据结果显示PCSK9抗体能够促进HepG2细胞摄取LDL。
图6:不同h001-4-WT抗PCSK9抗体浓度中HepG2细胞的LDL摄取变化。数据结果显示PCSK9抗体能够促进HepG2细胞摄取LDL。
图7:注射h001-4-WT抗PCSK9抗体的小鼠血清中LDL-c浓度随时间变化(*:p<0.05,vs IgG,**:p<0.01,vs IgG)。数据结果显示PCSK9抗体能够降低过表达人PCSK9的小鼠血清中LDL-c浓度。
图8:注射h001-4-WT抗PCSK9抗体的小鼠血清中相对IgG组的LDL-c浓度变化。数据结果显示相对IgG组,PCSK9抗体能够降低过表达人PCSK9的小鼠血清中LDL-c浓度。
图9:本发明抗体在食蟹猴体内药效及药代检测。附图显示h001-4-WT和h001-4-YTE均能够明显降低食蟹猴体内LDL的含量,且h001-4-YTE的降低持续时间要优于h001-4-WT。
具体实施方式
术语定义
为了更容易理解本发明,以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义,本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
本发明所述的“抗体”指免疫球蛋白,是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同,故其抗原性也不同。据此,可将免疫球蛋白分为五类,或称为免疫球蛋白的同种型,即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE,其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别,又可分为不同的亚类,如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
在本发明中,本发明所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区,所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
在本发明中,本发明所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区,所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大,为可变区(Fv区);靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定,为恒定区(Fc区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性,又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成,从氨基端到羧基端依次排列的顺序为:FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3;重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3,HCDE2-3),或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。
本发明的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体,优选人源化抗体。
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人PCSK9的单克隆抗体。制备时用PCSK9抗原注射试验对象,然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中,所述的鼠源PCSK9抗体或其抗原结合片段,可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区,或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”,是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体,可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体,要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤,然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因,再要据需要克隆人抗体的恒定区基因,将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中,最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中,所述的PCSK9嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链Fc区。所述的PCSK9嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链Fc区,优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区,或者使用氨基酸突变(如YTE突变)后延长抗体在血清中的半衰期的IgG1、IgG2或IgG4变体。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”,也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody),是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架,即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分,从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得),以及在Kabat,E.A.等人,1991Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时,引起的活性下降,可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变,以保持活性。本发明的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。在本发明一个优选的实施方案中,所述的PCSK9人源化抗体小鼠的CDR序列选自SEQ ID NO:12,13,31,15,16或17所示的序列;人的抗体可变区框架经过设计选择,其中所述抗体轻链可变区上的轻链FR区序列,来源于人种系轻链IGKV1-39*01和hjk2.1的组合序列;其中所述抗体重链可变区上的重链FR区序列,来源于人种系重链IGHV1-2*02和hjh2的组合序列。为避免免疫原性下降的同时,引起的活性下降,可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变,以保持活性。
本发明中所述的“抗原结合片段”,指具有抗原结合活性的Fab片段,Fab’片段,F(ab’)2片段,以及与人PCSK9结合的Fv片段ScFv片段;Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区,但没有恒定区,并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地,Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头,且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链,称为单链抗体(single chain antibody)或单链Fv(sFv)。本发明的术语“与PCSK9结合”,指能与人PCSK9相互作用。本发明的术语“抗原结合位点”指抗原上不连续的,由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域,所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中,人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羰基端。然而,Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明,Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统,其也被称为EU索引,如在Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列),5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中所述。Fc区域是抗体的效应子功能所必需的。效应子功能包括启动补体依赖的细胞毒性(CDC)、启动吞噬作用和抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)并通过胞转作用转运抗体通过细胞屏障。此外,Fc区域对维持IgG类抗体的血清半衰期至关重要(Ward和Ghetie,Ther.Immunol.2:77-94(1995))。研究发现IgG抗体的血清半衰期由Fc和新生Fc受体(FcRn)的结合来介导。FcRn是由跨膜α链和可溶性β链(β2-微球蛋白)组成的异源二聚体。美国专利号6,165,745公开了一种通过将突变引入编码抗体的DNA片段生产生物半衰期减少的抗体的方法。该突变包括在Fc-绞链结构域的位置253、310、311、433或434处的氨基酸取代。美国专利号6,277,375B1公开了含有突变型IgG分子的组合物,该分子相对野生型IgG血清半衰期增加,其中该突变型IgG分子含有以下氨基酸取代:在252位苏氨酸取代亮氨酸,在254位苏氨酸取代丝氨酸,或在256位苏氨酸取代苯丙氨酸(M252Y、S254T和T256E)。也公开了在位置433、435或436处具有氨基酸取代的突变型IgG。美国专利号6,528,624公开了含有IgG Fc区域的一种抗体的变体,该变体在人IgG Fc区域的一个或多个氨基酸位置(位置270、322、326、327、329、331、333和334)具有氨基酸取代。PCT公开号WO 02/060919A2公开了修饰的IgG,该修饰的IgG包含的IgG恒定区相对于野生型IgG恒定区含有一个或多个氨基酸修饰,其中该修饰的IgG与含有野生型IgG恒定区的IgG相比增加了半衰期,并且其中一个或多个氨基酸修饰位于以下一个或多个位置:251、253、255、285-290、308-314、385-389、和428-435。具体地,本文所述“YTE”或“YET突变”指IgG1的Fc区的一个突变组合,用于促进Fc区与人FcRn的结合,延长抗体在人血清中的半衰期。YTE突变子包含三个“YTE突变子”的组合:M252Y、S254T和T256E,残基编号是根据EU编号系统,其也被称为EU索引,如在Kabat等(参考U.S.专利No.7,658,921所述)对IgG重链进行编号。相较于野生型抗体,YTE突变抗体大大延长了抗体在血清中的半衰期,如Dall’Acqua等人,J.Biol.Chem.281:23514-24(2006)和U.S.专利号No.7,083,784。
现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法,如冷泉港的抗体实验技术指南,5-8章和15章。例如,老鼠可以用人PCSK9或其片段免疫,所得到的抗体能被复性、纯化,并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件,从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到,或者从免疫球蛋白杂志,2001ISBN012441351上获得。
本发明工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如,编码重链和轻链的cDNA序列,可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术,哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化,特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人PCSK9特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如,用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用PH梯度法洗脱结合的抗体,用SDS-PAGE检测抗体片段,收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体,也可以用常规方法去除,比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻,如-70℃,或者冻干。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时,是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触,以及试剂与流体的接触,其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时,是指治疗处理、预防或预防性措施,研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂,例如包含本发明的任一种结合化合物的组合物,所述患者具有一种或多种疾病症状,而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常,在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂,以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化,例如患者的疾病状态、年龄和体重,以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法,可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效,但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定,其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸,使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓,一般而言,多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology ofthe Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页,(第4版))。另外,结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。
“有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化:例如,待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“外源性”指根据情况在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据情况在细胞、生物或人体内产生的物质。
“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时,例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时,那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如,在序列最佳比对时,如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源,那么两个序列为60%同源。一般而言,当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用,并且所有这类名称都包括后代。因此,单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物,而不考虑转移数目。还应当理解的是,由于故意或非有意的突变,所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下,其由上下文清楚可见。
本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美国专利号4,683,195中所述扩增的程序或技术。一般来说,需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息,使得可以设计寡核苷酸引物;这些引物在序列方面与待扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring HarborSymp.Ouant.Biol.51:263;Erlich编辑,(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例,但不是唯一的实例,所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶,以扩增或产生核酸的特定部分。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生,该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如,“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物,所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药,利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
实施例与测试例
以下结合实施例进一步描述本发明,但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,如冷泉港的抗体技术实验手册,分子克隆手册;或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂,为市场购买的常规试剂。
实施例1、PCSK9抗原及检测用蛋白的制备
蛋白设计及表达
以人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(人PCSK9,Uniprot号:Q8MBP7)作为本发明PCSK9的模板,设计本发明涉及的抗原及检测用蛋白的氨基酸序列,可选的在PCSK9蛋白基础上融合不同的标签如his标签或促进免疫的肽段如PADRE肽,分别克隆到pTT5载体上(Biovector,Cat#:102762)或pTargeT载体上(promega,A1410),在293细胞瞬转表达或CHO-S稳定表达,纯化,获得编码本发明抗原及检测用蛋白。
带His标签的PCSK9:PCSK9-His6,用于免疫原免疫小鼠或检测试剂;
注释:划横线部分为信号肽,斜体部分为His6-tag(6组氨酸标签)。
带PADRE肽和His标签的PCSK9:PCSK9-PADRE-His6,作为免疫原,所含PADRE肽可以促进免疫;
注释:划横线部分为信号肽,双划线部分为linker,点划线部分为PADRE肽,斜体部分为His6-tag。
带TEV酶切位点的PCSK9与his标签融合蛋白:PCSK9-TEV-His6,可通过TEV酶切获得N-PCSK9(N端PCSK9结构域),作为免疫原;
注释:划横线部分为信号肽,双划线部分为TEV酶切位点,斜体部分为His6-tag。
PCSK9-D374Y突变蛋白,带his标签:PCSK9-D374Y-His6,作为检测试剂;
注释:划横线部分为信号肽,斜体部分为His6-tag。
PCSK9:插入生物素接受肽BP15及his标签的PCSK9蛋白:PCSK9-BP15-His6,作为检测试剂,BP15肽位置在表达过程中能够进行生物素标记,免除体外生物素标记及可能导致的构象变化;
注释:划横线部分为信号肽,双划线部分为生物素接受肽,斜体部分为His6-tag。
PCSK9-Y:插入生物素接受肽及his标签的PCSK9D374Y突变体蛋白:PCSK9-D374Y-BP15-His6,检测蛋白;
注释:划横线部分为信号肽,双划线部分为生物素接受肽,斜体部分为His6-tag。
带Flag标签和His标签的PCSK9受体蛋白LDLR胞外域片段:LDLR-ECD-Flag-His6,检测试剂;
注释:划横线部分为信号肽,双划线部分为Flag标签,斜体部分为His6-tag。
LDLR-Fc:缩短形式的LDLR胞外域片段与hIgG1-Fc融合蛋白(具有与PCSK9结合活性):LDLR-sECD-Fc(hIgG1)作为检测试剂;
注释:划横线部分为信号肽,双划线部分为缩短形式的具有与PCSK9结合活性的LDLR胞外域片段(LDLR-sECD),斜体部分为hIgG1-Fc部分。
更加缩短形式的LDLR胞外域片段与hIgG1-Fc融合蛋白(具有与pCSK9结合活性):LDLR-ssECD-Fc(hIgG1)作为检测试剂;
注释:划横线部分为信号肽,双划线部分为更加缩短形式的具有与PCSK9结合活性的LDLR胞外域片段(LDLR-ssECD),斜体部分为hIgG1-Fc部分。
实施例2、PCSK9、LDLR相关重组蛋白的纯化重组蛋白以及杂交瘤抗体、重组抗体的纯化
1、带His标签的重组蛋白的纯化步骤:
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质,并将缓冲液换置换为PBS,加入咪唑至终浓度为5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡镍柱,冲洗2-5倍柱体积。将置换后的上清样品上IMAC柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液冲洗柱子,至A280读数降至基线。后用PBS+10mM咪唑冲洗层析柱,除去非特异结合的杂蛋白,并收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白,并收集洗脱峰。收集的洗脱液浓缩后用凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化,流动相为PBS。去聚体峰,收集洗脱峰。所得到的蛋白经电泳,肽图,LC-MS鉴定为正确后分装备用。得到带His标签的PCSK9-His6(SEQ ID NO:1)、PCSK9-PADRE-His6(SEQ ID NO:2)、PCSK9-TEV-His6(SEQ ID NO:3)PCSK9-D374Y-His6(SEQ ID NO:4)、PCSK9-BP15-His6(SEQID NO:5)、PCSK9-D374Y-BP15-His6(SEQ ID NO:6)用于本发明抗体的免疫原或检测试剂。其中PCSK9-TEV-His6纯化后通过TEV酶进行酶切,酶切产物再利用IMAC柱结合去除TEV酶、未酶切完全的PCSK9-TEV-His6或切除的带His标签的C端结构域片段,IMAC流出液中浓缩获得仅留N端结构域的PCSK9片段(缩写为N-pCSK9),作为免疫原用于小鼠免疫。
2、带His标签和Flag标签的LDLR-ECD-Flag-His6(SEQ ID NO:7)重组蛋白的纯化步骤:
将样品高速离心去除杂质,并浓缩至适当体积。利用0.5×PBS平衡flag亲和柱,冲洗2-5倍柱体积。将除杂后的细胞表达上清样品上柱。用0.5×PBS冲洗柱子,至A280读数降至基线。用含有0.3M NaCl的PBS冲洗柱子,冲洗杂蛋白,并收集。用0.1M乙酸(pH3.5-4.0)洗脱目的蛋白,并收集,调节pH至中性。收集的洗脱液浓缩后用凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化,流动相为PBS。去聚体峰,收集洗脱峰收集样品经电泳,肽图,LC-MS鉴定正确后分装备用。得到带FLAG/His6标签的LDLR-ECD-Flag-His6(SEQ ID NO:7),用于本发明抗体的性能测试。
3、LDLR的Fc融合蛋白的纯化步骤:
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质,浓缩至适当体积后上Protein A柱。用PBS冲洗柱子,至A280读数降至基线。用100mM sodium acetate pH3.0洗脱目的蛋白,用1MTris-HCl中和。洗脱样品适当浓缩后利用PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化,去聚体的峰收集好后分装备用。此方法用来纯化LDLR-sECD-Fc(hIgG1)(SEQ ID NO:8)和LDLR-ssECD-Fc(hIgG1)(SEQ ID NO:9)。两者可用作PCSK9抗体功能性测试。
实施例3、抗人PCSK9杂交瘤单克隆抗体的制备
1、免疫
抗人PCSK9单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用SJL白小鼠,雌性,6周龄(北京维通利华实验动物技术有限公司,动物生产许可证号:SCXK(京)2012-0001)。饲养环境:SPF级。小鼠购进后,实验室环境饲养1周,12/12小时光/暗周期调节,温度20-25℃;湿度40-60%。将已适应环境的小鼠按两种方案免疫(A/B),每组6-10只。免疫抗原为带His标签的人PCSK9-His6(SEQ ID NO:1)、pCSK9-PADRE-His6(SEQ ID NO:2)及N-PCSK9(SEQ ID NO:3)。
方案A用弗氏佐剂(sigma Lot Num:F5881/F5506)乳化:首免用弗氏完全佐剂(CFA),其余加强免疫用弗氏不完全佐剂(IFA)。抗原与佐剂比例为1∶1,100μg/只(首免),50μg/只(加强免疫)。第0天腹膜内(IP)注射100μg/只的乳化后抗原,首免后每两周一次,共6-8周。
方案B用Titermax(sigma Lot Num:T2684)与Alum(Thremo Lot Num:77161)交叉免疫。抗原与佐剂(titermax)比例为1∶1,抗原与佐剂(Alum)比例为3∶1,10-20μg/只(首免),5μg/只(加强免疫)。第0天腹膜内(IP)注射20/10μg/只的乳化后抗原,首免后每周一次,Titermax和Alum交替使用,共6-11周。免疫四周后,根据背部结块和腹部肿胀情况,选择背部或腹膜内注射抗原。
2、细胞融合
选择血清中抗体滴度高(见后面的测试例1和2,结合PCSK9的ELISA方法)并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合,融合前72小时冲刺免疫所选小鼠,PCSK9-His6 10μg/只,腹腔注射。采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞。融合好的杂交瘤细胞用HAT完全培养基(含20%FBS、1×HAT和1×OPI的RPMI-1640培养基)重悬,分装于96孔细胞培养板中(1×105/150μl/孔),37℃,5%CO2孵育。融合后的第5天加入HAT完全培养基,50μl/孔,37℃,5%CO2孵育。融合后第7天~8天,根据细胞生长密度,全换液,培养基为HT完全培养基(含20%FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培养基),200μl/孔,37℃,5%CO2孵育。
3、杂交瘤细胞筛选
融合后第10-11天,根据细胞生长密度,进行结合PCSK9或PCSK9-Y的ELISA方法检测(见测试例1和2)。并将结合ELISA检测的阳性孔细胞进行PCSK9或PCSK9-Y与LDLR结合的阻断ELISA检测(见测试例3和4),阳性孔换液,并根据细胞密度及时扩大至24孔板中。移入24孔板的细胞株经过复测后进行保种和第一次亚克隆。第一次亚克隆筛选(见测试例1和2)为阳性的进行保种,并进行第二次亚克隆。第二次亚克隆为阳性(见测试例1和2)的进行保种和蛋白表达。多次融合获得有阻断PCSK9或PCSK9-Y与LDLR结合效果(见测试例3和4)的杂交瘤细胞。
通过阻断实验和结合实验筛选得到杂交瘤克隆mAb-001,用无血清细胞培养法进一步制备抗体,按纯化实例纯化抗体,供在检测例中使用。
4、杂交瘤阳性克隆序列测定
从阳性杂交瘤中克隆序列过程如下。收集对数生长期杂交瘤细胞,用Trizol(Invitrogen,Cat No.15596-018)按照试剂盒说明书步骤提取RNA,用PrimeScriptTMReverse Transcriptase试剂盒反转录(Takara,Cat No.2680A)。将反转录得到的cDNA采用mouse Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)进行PCR扩增后送测序公司测序。得到mAb-001的重链和轻链可变区DNA序列对应的氨基酸序列,其中测得杂交瘤克隆mAb-001的鼠抗可变区序列如下:
>mAb-001 VH
>mAb-001 VL
注:顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,序列中斜体为FR序列,下划线为CDR序列。
表1.各重链及轻链CDR区序列
实施例4、抗人PCSK9杂交瘤单克隆抗体的人源化
1、杂交瘤克隆mAb-001人源化构架选择
通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库和MOE软件,分别挑选与mAb-001同源性高的重轻链可变区种系基因作为模板,将这两个鼠源抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中,形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。其中氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。
鼠源抗体mAb-001的人源化轻链模板为IGKV1-39*01和hjk2.1,人源化重链模板为IGHV1-2*02和hjh2,人源化后得到人源化抗体h001-1的可变区序列如下:
>h001-1 VH
>h001-1 VL
注:顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,序列中斜体为FR序列,下划线为CDR序列。
2、杂交瘤克隆mAb-001的模板选择和回复突变设计,见下表2;杂交瘤克隆回复突变后的人源化序列组合见表4。
表2.杂交瘤克隆回复突变设计
注:如S66D表示依照Kabat编号系统,将66位S突变回D。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。
各突变体可变区具体序列如下表3:
表3.各突变体可变区具体序列表
注:序列中横线部分为CDR区。
表4.鼠抗mAb-001人源化序列组合
h001_VL.1 | h001_VL.1A | h001_VL.1B | h001_VL.1C | |
h001_VH.1 | h001-1 | h001-2 | h001-3 | h001-4 |
h001_VH.1A | h001-5 | h001-6 | h001-7 | h001-8 |
h001_VH.1B | h001-9 | h001-10 | h001-11 | h001-12 |
h001_VH.1C | h001-13 | h001-14 | h001-15 | h001-16 |
h001_VH.1D | h001-17 | h001-18 | h001-19 | h001-20 |
h001_VH.1E | h001-21 | h001-22 | h001-23 | h001-24 |
注:该表表示各种序列及其突变序列组合所得的人源化抗体可变区部分的组合。如h001-1表示,人源化抗体h001-1的轻重链分别包含轻链h001_VL.1、重链h001_VH.1所示的轻链和重链可变区。其它类推。
3、将以上的人源化可变区序列组合与来自人IgG的重链恒定区和人kappa链的轻链恒定区连接,进行抗体化,重链恒定区来自人IgG1(如SEQ ID NO:28),轻链恒定区来自人kappa链(如SEQ ID NO:30)。得到相应的人源化抗体,进行结合PCSK9的ELISA方法检测(见测试例1),和结合PCSK9-Y的ELISA方法检测(见测试例2);并将结合ELISA检测的阳性孔细胞进行PCSK9/LDLR结合的阻断ELISA检测(见测试例4),和进行PCSK9-Y/LDLR结合的阻断ELISA检测(见测试例3);结果见表5-8。
结果显示,本发明得到的PCSK9抗体与PCSK9和PCSK9-Y有较高的结合活性;并且能有效阻断PCSK9/PCSK9-Y与LDLR之间的结合。
实施例5、构建和表达抗人PCSK9人源化抗体IgG1-YTE形式
实施例4抗体选用人重链IgG1/轻链kappa的恒定区与各可变区组合形成全长抗体,还可选用在Fc段做了YTE的IgG1重链恒定区突变来增加对应IgG1抗体在血清中的半衰期(例如将h001-4的重链恒定区替换为进行了YTE突变的重链恒定区变体,序列如SEQ IDNO:29所示,得到抗体h001-4-YTE,与之相对应地,h001-4也称为h001-4 WT)。同样地,也可选用本领域其它已知的突变来增加抗体性能。重链恒定区序列(人IgG1):
重链恒定区序列(IgG1-YTE):
轻链恒定区序列:
1.重组嵌合抗体的分子克隆
杂交瘤筛选所获得的阳性抗体分子经过测序后,得到可变区编码基因序列。以测序所得序列设计首尾引物,以测序基因为模板,经过PCR搭建各抗体VH/VK基因片段,再与表达载体pHr(带信号肽及hIgG1/hkappa恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)进行同源重组,构建重组嵌合抗体全长表达质粒VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr,形成h001嵌合抗体。
2.人源化抗体的分子克隆
人源设计之后的抗体序列,经过密码子优化后产生人密码子偏好的编码基因序列,设计引物PCR搭建各抗体VH/VK基因片段,再与表达载体pHr(带信号肽及hIgG1/hkappa恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)进行同源重组,构建人源化抗体全长表达质粒VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr。
3.重组嵌合抗体以及人源化抗体的表达与纯化
分别表达抗体轻重链的质粒以1∶1.2的比例转染HEK293E细胞,6天后收集表达上清,高速离心去除杂质,用Protein A柱进行纯化。用PBS冲洗柱子,至A280读数降至基线。用pH3.0-pH3.5的酸性洗脱液洗脱目的蛋白,用1M Tris-HCl,pH8.0-9.0中和。洗脱样品适当浓缩后,利用PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化,以去除聚体,收集单体峰,分装备用。
实施例6、h001系列抗体的重链CDR3突变体
抗体中天冬氨酸异构化是影响抗体化学稳定性的主要因素之一,尤其是抗体CDR区部分天冬氨酸异构化修饰,一般选择尽量避免或者突变降低。根据加速稳定性试验和计算机模拟抗体结构及热点预测,发现h001系列抗体重链HCDR3区DED位点(即D103/E104/D105)中的天冬氨酸容易发生异构化,根据氨基酸性质和计算机抗体结构模拟技术,对上述位点的氨基酸可以进行任意的氨基酸取代,以有效消除或降低该位点的异构化,优选地,h001系列抗体的重链可变区CDR3突变体为:
QYDY X1E X2WYFDV(SEQ ID NO:31),其中X1为h001系列抗体的重链可变区第103位氨基酸残基,X1可选自Asp、Glu、His、Met、Asn或Gln;X2为h001系列抗体的重链可变区第105位氨基酸残基;X2可选自Asp、Glu、His、Met、Asn或Gln。但是,X1、X2不能同时为Asp。
进一步地,含上述第103、105位突变的CDR3与含有不同回复突变的FR区可形成如下的重链可变区:
>h001_VH.1-CDR3突变体(SEQ ID NO:32)
>h001_VH.1A-CDR3突变体(SEQ ID NO:33)
>h001_VH.1B-CDR3突变体(SEQ ID NO:34)
>h001_VH.1C-CDR3突变体(SEQ ID NO:35)
>h001_VH.1D-CDR3突变体(SEQ ID NO:36)
>h001_VH.1E-CDR3突变体(SEQ ID NO:37)
示例性地,h001系列抗体重链的CDR3突变体(SEQ ID NO:31)的具体突变形式及h001VH.1的具体突变形式见以下突变体及表5和表6。
表5.h001系列抗体重链CDR3的突变体序列
表6.h001_VH.1的CDR3突变体重链可变区序列
注:序列中横线部分为CDR区。
以下用测试方法验证本发明抗体性能及有益效果。
测试例1、PCSK9抗体结合野生型PCSK9蛋白的ELISA实验
本发明PCSK9抗体与PCSK9的结合力测试,通过抗体与固定在ELISA板上野生型PCSK9(WT-PCSK9,SEQ ID NO:5)的结合的量来检测。
用PBS稀释链霉亲和素(sigma,CAT#S4762)至2μg/ml,包被在96孔ELISA板上,4℃放置过夜。洗板后,在37℃用Tris缓冲液(含0.9mM氯化钙、0.05%Tween 20和5%脱脂奶粉)封闭2小时。洗板,加入内部生产的生物素标记的PCSK9(bio-WT-PCSK9,用含0.9mM氯化钙、0.05%Tween 20和1%脱脂奶粉的Tris缓冲液稀释)100μl/孔,37℃孵育1小时。洗板,加入不同浓度稀释的抗PCSK9抗体样品,37℃孵育1小时。再洗板,加入辣根过氧化物酶-羊抗人(H+L)抗体(jackson,CAT#109-035-088),37℃孵育1小时。再洗板,加入四甲基联苯胺溶液显色。最后加入终止液,在酶标仪上测量OD450,并计算其EC50值。
本发明嵌合抗体、回复突变后抗体与PCSK9的结合力ELISA实验,结果见表7。
表7.本发明PCSK9抗体与PCSK9的结合活性测试
结果显示,本发明PCSK9抗体与PCSK9有较高的结合活性。
对于消除抗体CDR区中天冬氨酸所带来的异构化问题,示例性地,在一个具体实施方式中,以抗体h001-4-YTE为基础,对抗体重链CDR3进行突变(h001-4D105H,即在h001-4-YTE的基础上对抗体重链可变区CDR3中第105位D突变为H的突变体,其他突变体命名类推),检测不同CDR3突变体与PCSK9的结合活性。示例性的突变体如:h001-4-YTE D103E、h001-4-YTE D103H、h001-4-YTE D103M、h001-4-YTE D103N、h001-4-YTE D103Q、h001-4-YTED105E、h001-4-YTE D105H、h001-4-YTE D105M、h001-4-YTE D105N、h001-4-YTE D105Q等。小量表达并纯化获得各突变体抗体,参照测试例1的实验方法检测各突变体对于野生型PCSK9蛋白的结合能力。结果见表8、图3和图4。
表8.本发明PCSK9抗体突变体与PCSK9的结合活性测试
克隆号 | EC50(nM) |
h001-4-YTE | 0.229 |
h001-4-YTE D103H | 0.135 |
h001-4-YTE D103M | 0.248 |
h001-4-YTE D103N | 0.070 |
h001-4-YTE D103Q | 0.257 |
h001-4-YTE D105E | 0.148 |
h001-4-YTE D105H | 0.059 |
h001-4-YTE D105M | 0.124 |
h001-4-YTE D105N | 0.065 |
h001-4-YTE D105Q | 0.116 |
结果显示在抗体重链CDR3中对D103或D105的氨基酸替换仍保持新抗体与野生型PCSK9的结合活性。
测试例2、PCSK9抗体结合PCSK9-Y的ELISA实验
本发明PCSK9抗体与PCSK9-Y的结合力测试,通过抗体与固定在ELISA板上PCSK9-Y(突变型PCSK9,SEQ ID NO:6)的结合的量来检测。
用PBS稀释链霉亲和素(sigma,CAT#S4762)至2μg/ml,包被在96孔ELISA板上,4℃放置过夜。洗板后,在37℃用Tris缓冲液(含0.9mM氯化钙、0.05%Tween 20和5%脱脂奶粉)封闭2小时。洗板,加入内部生产的生物素标记的PCSK9-Y(bio-PCSK9-Y,用含0.9mM氯化钙、0.05%Tween 20和1%脱脂奶粉的Tris缓冲液稀释)100μl/孔,37℃孵育1小时。洗板,加入不同浓度稀释的抗PCSK9抗体样品,37℃孵育1小时。再洗板,加入辣根过氧化物酶-羊抗人(H+L)抗体(jackson,CAT#109-035-088),37℃孵育1小时。再洗板,加入四甲基联苯胺溶液显色。最后加入终止液,在酶标仪上测量OD450,并计算其EC50值。
本发明嵌合抗体、回复突变后抗体与突变型PCSK9的结合力ELISA实验,结果见表9。
表9.本发明PCSK9抗体与PCSK9-Y的结合活性测试
结果显示,本发明PCSK9抗体与PCSK9-Y有较高的结合活性。
测试例3、PCSK9抗体对LDLR-FC/PCSK9-Y结合的阻断
抗PCSK9抗体对LDLR-FC(SEQ ID NO:8)和PCSK9-Y(突变型PCSK9,SEQ ID NO:6)结合的阻断能力测试,通过检测在抗体存在的条件下,PCSK9-Y与LDLR结合的量来确定。
用磷酸缓冲液稀释LDLR-FC,至2μg/ml,包被在96孔ELISA板(Costar,CAT#3590)上,4℃放置过夜。洗板后,在37℃用Tris缓冲液(含0.9mM氯化钙、0.05%Tween 20和5%脱脂奶粉)封闭2小时。洗板,加入生物素标记的PCSK9-Y(bio-PCSK9-Y,用含0.9mM氯化钙、0.05%Tween 20和1%脱脂奶粉的Tris缓冲液稀释至终浓度1μg/ml),和抗体样品(用含0.9mM氯化钙、0.05%Tween 20和1%脱脂奶粉的Tris缓冲液稀释)的混合液100μl/孔,37℃孵育1小时。洗板,加入辣根过氧化物酶-链霉亲和素(sigma,CAT#S2438),37℃孵育1小时。再洗板,加入四甲基联苯胺溶液显色。最后加入终止液,在酶标仪上测量OD450,并计算其IC50值。
本发明嵌合抗体、回复突变后抗体对LDLR-FC/PCSK9-Y结合的阻断效果测试,结果见表10:
表10.本发明PCSK9抗体阻断PCSK9-Y与LDLR之间结合的效果测试
克隆号 | IC50(μg/ml) |
h001-1 | 0.5658 |
h001-2 | 0.4553 |
h001-3 | 0.4749 |
h001-4 | 0.5302 |
h001-5 | 0.4677 |
h001-6 | 0.4374 |
h001-7 | 0.5150 |
h001-8 | 0.4145 |
h001-9 | 0.5203 |
h001-10 | 0.5142 |
Ch-001 | 0.3915 |
结果显示,本发明PCSK9抗体能有效阻断PCSK9-Y与LDLR之间的结合。
用上面所述方法,测试本发明PCSK9抗体对其它形式的LDLR-FC(内部生产的,序列见SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9)和PCSK9-Y(SEQ ID NO:5)结合的阻断能力,实验证明本发明PCSK9抗体能有效阻断PCSK9与缩短形式的LDLR之间的结合。
测试例4、PCSK9抗体对LDLR-FC/PCSK9结合的阻断
本发明PCSK9抗体对LDLR-FC(内部生产的,序列为SEQ ID NO:8)和PCSK9(SEQ IDNO:5)结合的阻断能力测试,通过检测在抗体存在的条件下,PCSK9与LDLR结合的量来确定。
用磷酸缓冲液稀释LDLR-FC至5μg/ml,包被在96孔ELISA板上,4℃放置过夜。洗板后,在37℃用Tris缓冲液(含0.9mM氯化钙、0.05%Tween 20和5%脱脂奶粉)封闭2小时。洗板,加入生物素标记的PCSK9(bio-WT-PCSK9,用含0.9mM氯化钙、0.05%Tween 20和1%脱脂奶粉的Tris缓冲液稀释至终浓度2μg/ml)和抗体样品(用含0.9mM氯化钙、0.05%Tween 20和1%脱脂奶粉的Tris缓冲液稀释)的混合液100μl/孔,37℃孵育1小时。洗板,加入辣根过氧化物酶-链霉亲和素(sigma,CAT#S2438),37℃孵育1小时。再洗板,加入四甲基联苯胺溶液显色。最后加入终止液,在酶标仪上测量OD450,并计算其IC50值。
本发明嵌合抗体、回复突变后抗体对LDLR-FC/PCSK9结合的阻断效果测试,结果见表11。
表11.本发明PCSK9抗体阻断PCSK9与LDLR之间结合的效果测试
克隆号 | IC50(μg/ml) |
h001-1 | 0.4997 |
h001-2 | 0.6750 |
h001-3 | 0.7021 |
h001-4 | 0.7597 |
h001-5 | 4.322 |
h001-6 | 0.6620 |
h001-7 | 0.6521 |
h001-8 | 0.7738 |
h001-9 | 0.9230 |
h001-10 | 0.8290 |
Ch-001 | 0.8363 |
结果显示,本发明PCSK9抗体能有效阻断PCSK9与LDLR之间的结合。
用上面所述方法,测试本发明PCSK9抗体对其它形式的LDLR-FC(内部生产的,序列见SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9)和PCSK9(SEQ ID NO:5)结合的阻断能力,实验证明本发明PCSK9抗体能有效阻断PCSK9与缩短形式的LDLR之间的结合。
测试例5、PCSK9抗体对LDL的摄取实验
HepG2细胞(中科院细胞库,#CAT,TCHu72)培养在DMEM培养基(Hyclone,#CATSH30243.01B)中(含10%胎牛血清,Gibco,#CAT 10099-141)。当细胞覆盖80-90%时,消化吹散后计数1.5*104cells/孔铺于96孔板。24小时后,更换培养基为DMEM,10%无脂蛋白血清(Millipore,CAT#LP4)。48小时后,用磷酸缓冲液洗2次,加入在4℃预孵育1小时的含PCSK9(SEQ ID NO:1,终浓度10μg/ml)和抗体样品(用培养基稀释至不同浓度)的混合物,以及终浓度10μg/ml的(Invitrogen,CAT#L3483),37℃孵育。6小时后,用磷酸缓冲液洗板2次,用酶标仪读取荧光值(EX485nm/EM535nm)。然后加入50μl/孔细胞活性发光检测试剂(Promega,G7571),读取化学发光值。LDL摄取结果如图5,图6所示,数据结果显示本发明PCSK9抗体能够促进HepG2细胞摄取LDL。
测试例6、BIAcore检测PCSK9抗体亲和力实验
按照人Fab捕获试剂盒(Cat.#28-9583-25,GE)说明书中所述的方法,将人Fab捕获分子共价偶联于CM5生物传感芯片(Cat.#BR-1000-12,GE)上,从而亲和捕获待测抗体,然后于芯片表面流经人PCSK9抗原(带His标签的人PCSK9:PCSK9-His6,SEQ ID NO:1),利用Biacore仪器实时检测反应信号从而获得结合和解离曲线,通过拟合得到亲和力数值,见表12。在实验中每个循环解离完成后,用人Fab捕获试剂盒(GE)里配置的再生溶液将生物芯片洗净再生。
表12:抗PCSK9抗体的亲和力
本发明PCSK9抗体与人PCSK9抗原有强亲和力。
用上面相似的方法,检测本发明PCSK9抗体与PCSK9-Y(SEQ ID NO:4)的亲和力,显示本发明PCSK9抗体与PCSK9-Y抗原有较强亲和力。
测试例7、PCSK9抗体体内药效实验
本实验构建过表达人PCSK9的小鼠模型,进行尾静脉注射PCSK9抗体,来评价本发明PCSK9抗体在过表达人PCSK9的小鼠体内降低LDL-c的作用。人IgG(从混合的正常人血清中,利用传统的亲和层析方法如ProteinA纯化获得的人免疫球蛋白)作为空白对照。
C57Bl/6小鼠(购自上海西普尔·必凯实验动物有限责任公司)实验室环境适应5天,通过尾静脉注射AAV-PCSK9病毒(北京本元正阳基因技术有限公司),注射4×1011v.g.。注射病毒后于实验前一天禁食过夜,眼眶取血,用HDL和LDL/VLDL胆固醇定量试剂盒(购自BioVision公司,货号#K613-100)检测LDL-c,根据LDL-c浓度随机分组,每组6只小鼠(n=6),进行尾静脉注射给药,内部生产的人IgG、h001-4-WT抗体给药剂量为10mg/kg(人IgG、h001-4-WT抗体用PBS配制,浓度为1mg/ml)。取血前禁食6小时,给药后第24、48、72、96小时眼眶取血,37℃放置1小时,3500rpm离心10分钟,取血清保存在-80℃。
最后一次取血清后,把冻存的血清在同一天检测。用HDL和LDL/VLDL胆固醇定量试剂盒检测血清中LDL-c浓度,按照试剂盒说明书操作。
实验结果如图7所示,正常小鼠血清LDL-c浓度约为12mg/dl。注射AAV8-PCSK9病毒后,血清中LDL-c浓度达平均40mg/dl。分组后给药,给药24小时后,与人IgG组相比,h001-4-WT组LDL-c浓度下降50%;给药48小时后,h001-4-WT组LDL-c浓度下降49%;给药72小时后,h001-4-WT组LDL-c浓度下降32%;给药96小时后,h001-4-WT组LDL-c浓度下降20%,如表13和图8所示。
综上,h001-4-WT能够降低过表达人PCSK9的小鼠血清中LDL-c浓度,且药效持续到72小时。
表13.各组小鼠血清中LDL-c浓度变化
测试例8、竞争性实验
在竞争性ELISA实验中,我们将一种抗体包板过夜,之后同时加入生物素化的pCSK9-his和50倍于包板浓度的竞争抗体,包板抗体和溶液中的抗体将竞争性结合抗原,之后检测板上抗原的信号。结果显示,h001-4和21B12(US8030457B2)自身能够竞争性结合抗原外,h001-4和21B12之间无明显竞争结合,提示两者抗原表位的不同,具体结果参见表14。
表.14
IR(%) | h001-4 | 21B12 |
h001-4 | 95.97 | 0.42 |
21B12 | 3.86 | 97.78 |
测试例9、食蟹猴体内药效及药代检测
为考察本发明的抗体在体内的作用效果及代谢情况,尝试了在食蟹猴体内给药实验,分别给药h001-4-WT及h001-4-YTE。采用静脉注射给药,剂量选择3mg/kg,每组3只雄性食蟹猴。约2~4ml/分钟,缓慢推注。通过不同时间点取血检测脂蛋白尤其是低密度脂蛋白(LDL)及血清中抗体浓度,其中脂蛋白检测点为给药前和给药后1、4、8、12、16、20、24、28天,PK采血点为给药前、给药后15分钟、30分钟、1小时、3小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72、96、120小时、144小时、168小时、336小时、504小时、672小时。
试验结果显示(图9)h001-4-WT和h001-4-YTE均能够明显降低食蟹猴体内LDL的含量,且h001-4-YTE的降低持续时间要优于h001-4-WT。
药代取血点血清样品通过ELISA检测其中h001-4-WT和h001-4-YTE的含量,方法参考测试例1所述,结果显示h001-4-WT在食蟹猴体内半衰期为4天,而h001-4-YTE在食蟹猴体内半衰期为7.3天,YTE相比WT具有明显延长的体内半衰期。
测试例10、PCSK9抗体异构化水平检测
PCSK9抗体在缓冲液中放置40度加速若干时间后,取出约30μg,加入高浓度盐酸胍变性,然后加入DTT还原二硫键,再置换到20mM His缓冲液中(pH 6.0),加入trypsin胰酶,37℃反应过夜。使用Q-Exactive质谱仪依赖数据的采集(data-dependent acquisition)模式采集肽段的一级和二级MS,利用Pepfinder软件比对理论序列,设置天冬酰胺的脱酰胺、甲硫氨酸的氧化和天冬氨酸的异构为可变修饰,特异性酶切位点为K和R。谱图分析完成后,导出发生修饰和未发生修饰的肽段列表,根据各自的强度计算位点发生修饰的比例。
示例性的,通过LC-MS分析比较发现h001-4-YTE D103N、h001-4-YTE D105E或h001-4-YTE D105N突变能够有效降低或消除异构化修饰的发生,结果如表15所示。
表15:PCSK9突变抗体的异构化水平
样品编号 | 0天异构化% | 7天异构化% | 14天异构化% |
h001-4YTE | 7.54 | 23.22 | 35.54 |
h001-4-YTE D105N | 1.07 | 27.92 | 31.78 |
h001-4-YTE D105E | 6.23 | 5.68 | 7.74 |
h001-4-YTE D103N | 0 | 0 | 0 |
Claims (17)
1.一种特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段,所述PCSK9抗体或其抗原结合片段包含如下的CDR区:
i)HCDR1和HCDR2的序列分别如SEQ ID NO:12和13所示,HCDR3选自SEQ ID NO:38-47中任一个所示的序列;
ii)LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列分别如SEQ ID NO:15、16和17所示。
2.根据权利要求1所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段,其中所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体或鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体的抗原结合片段。
3.根据权利要求2所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段,其中所述PCSK9抗体的轻链可变区进一步包含鼠源κ链的轻链FR区;其中所述PCSK9抗体的重链可变区进一步包含鼠源IgG1的重链FR区。
4.根据权利要求2所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段,其中所述PCSK9抗体的轻链进一步包含鼠源κ链的轻链恒定区;其中所述PCSK9抗体的重链进一步包含鼠源IgG1的重链恒定区。
5.根据权利要求2所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段,其中所述的PCSK9抗体包含选自SEQ ID NO:48-57中的任一个序列所示重链可变区和SEQ ID NO:27所示的轻链可变区。
6.根据权利要求2所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段,其中所述人源化抗体包含SEQID NO:28或29所示的重链恒定区和SEQ ID NO:30序列所示的轻链恒定区。
7.一种药物组合物,其含有治疗有效量的根据权利要求1至6任一项所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段,以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
8.一种DNA分子,其编码根据权利要求1-6任一项所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段。
9.一种表达载体,其含有根据权利要求8所述的DNA分子。
10.一种用根据权利要求9所述的表达载体转化的宿主细胞,所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞,所述宿主细胞为真核细胞。
12.根据权利要求10所述的宿主细胞,所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
13.权利要求1至6任一项所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段或如权利要求7所述的药物组合物在制备用于治疗PCSK9介导的胆固醇相关的疾病或病症药物中的用途。
14.根据权利要求13所述的用途,其中所述的疾病或病症选自高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠状动脉心脏病、卒中、心血管疾病、阿尔茨海默病和一般性的异常脂血症。
15.根据权利要求13所述的用途,其中所述的疾病或病症选自高胆固醇血症、异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病。
16.用于生产如权利要求1至6任一项所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段的方法,所述方法包括将权利要求10至12任一项所述的宿主细胞在培养物中进行培养以形成并积累权利要求1至6任一项所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段,以及从培养物中回收所积累的所述PCSK9抗体或其抗原结合片段。
17.用于检测或测定人PCSK9的试剂,所述试剂包含权利要求1至6任一项所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段。
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