TWI735499B - Pcsk9抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 - Google Patents
Pcsk9抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI735499B TWI735499B TW105143912A TW105143912A TWI735499B TW I735499 B TWI735499 B TW I735499B TW 105143912 A TW105143912 A TW 105143912A TW 105143912 A TW105143912 A TW 105143912A TW I735499 B TWI735499 B TW I735499B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- seq
- variable region
- chain variable
- heavy chain
- light chain
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本發明涉及PCSK9抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途。進一步地,本發明涉及包含該PCSK9抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體,以及包含PCSK9抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物,以及其作為降血脂藥物的用途。特別地,本發明涉及一種人源化的PCSK9抗體在製備用於治療PCSK9介導的疾病或病症的藥物中的用途。
Description
本發明涉及PCSK9抗體、PCSK9抗體的抗原結合片段、包含該PCSK9抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體,以及包含該PCSK9抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物,以及其作為降血脂藥物的用途。
高膽固醇血症是一種以血清膽固醇水準升高為主要特徵的脂類代謝異常疾病,其主要表現為血清膽固醇水準升高,導致膽固醇在血管聚集,形成動脈粥樣硬化。大量的臨床及實驗研究結果都證實,脂質代謝異常和冠心病的發生、發展有著密切的關係。因此,降低血液中的膽固醇濃度成為了目前治療和預防動脈粥樣硬化的一個主要手段。
隨著我國國民生活水準的快速提高,血脂異常也成為了危害我國城鄉居民的主要因素。據2012年統計資料,我國每年死亡人數中約有40%死於心血管疾病。目前,我國成人血脂異常患病率為18.6%,估計全國血脂異常現患人數1.6億。不同類型的血脂異常現患率分別為:高膽固醇
血症2.9%,高甘油三酯血症11.9%,低高密度脂蛋白血症7.4%;另有3.9%的人血膽固醇邊緣升高。2012年衛生部疾病預防控制專家委員會慢性病防治分委會達成的“慢性病防治中國專家共識”中提到,我國有3300萬高膽固醇血症患者,而從局部地區看,我國血脂異常發病率情況遠比上述資料要嚴重。
目前,臨床上調脂藥物主要以他汀類為主。立普妥(Liptor)作為全世界應用最廣泛的降膽固醇藥物,也是醫藥史上最暢銷藥物,通過阻斷肝臟生產膽固醇的酶作用,減少膽固醇的生產,從而增加肝臟從血液中攝取更多的膽固醇,進而減低血液中膽固醇濃度。但是立普妥也有其不足之處,首先從資料看,立普妥可以降低30%-40%的低密度脂蛋白,但仍然有很多病人依然無法到達有效的降低血脂(低密度脂蛋白濃度<50mg/dL),其次病人對立普妥的回應率也有人種差異。這些原因,致使病人需要一個更為有效的降低血脂的藥物。
家族性高膽固醇血症(Familial hypercholesterolemia,FM)是一種常染色體單基因顯性遺傳性疾病,其臨床特徵為血總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-c)顯著升高、瞼黃瘤、角膜弓以及早發的心血管疾病。低密度脂蛋白受體(LDL receptor,LDLR)基因突變致其缺陷或缺乏,LDL-c不能順利轉運到肝臟清除,以致血中LDL-c水準升高。目前已明確3種基因與FM的發生有關,它們分別是LDLR基因、載脂蛋白
B100基因和PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)基因。
前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是一種前蛋白轉化酶,屬於分泌的枯草桿菌酶家族的蛋白酶K亞族。該編碼蛋白是作為可溶性酶原合成的,在內質網中經過自身催化分子內加工。實驗結果顯示,PCSK9促進LDL受體的降解從而增加血漿中LDL膽固醇含量,而LDL受體介導肝內的LDL胞吞過程,後者是從循環系統清除LDL的主要途徑。研究發現,12.5%的高膽固醇血症(ADH)患者檢測有PCSK9基因突變。PCSK9突變形式多樣,根據突變對PCSK9調節LDL-C水準的不同影響可分為兩類:功能缺失型和功能獲得型。其中功能缺失型突變與低血膽固醇水準有關,有預防冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發生的作用,非洲人群中低膽固醇的PCSK9突變率高於其他種族。PCSK9功能獲得型突變體通過增加PCSK9的功能、降低LDLR的表達而升高血漿膽固醇水準,可以導致嚴重高膽固醇血症和早發冠狀動脈粥樣硬化性心臟病,目前發現的PCSK9功能獲得型突變包括:D374Y、S127R、F216L、N157K、R306S等。其中,與PCSK9野生型相比,D374Y突變體細胞表面的LDLR減少了36%,S127R突變有相應減少了10%。
目前PCSK9作為一個極具潛力的,新的靶標已成為高膽固醇血症研究的熱點,對於深入瞭解膽固醇代謝的機制和尋求新的治療手段有重要意義。有多家跨國製藥公司在研發針對PCSK9的單株抗體,它通過在血液中中和
PCSK9,從而增加了肝臟表面LDL受體的濃度,進而達到降低血液中LDL濃度的目標。相關的專利有WO2011111007、WO2011072263、WO2013170367、WO2013169886、WO2013148284、WO2013091103、WO2013039958、WO2013039969、WO2013016648、WO2013008185、WO2012170607、WO2012168491、WO2012154999、WO2012109530、WO2012101251、WO2012088313、US8829165 B2、US8563698B2、US8859741B2、US8871913B2、US8871914B2、US8883983B2、WO2012058137和WO2012054438。
本發明提供有著更高親和力、更高選擇性、更高生物活性的PCSK9抗體。
本發明提供一種PCSK9抗體或其抗原結合片段,其包含一個或多個選自以下的CDR:如序列SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示的、或與SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有至少95%序列同一性的序列所示的HCDR;和如序列SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的、或與SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17具有至少95%序列同一性的序列所示的LCDR。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其包含分別如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的HCDR1、
HCDR2和HCDR3,或包含分別與SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14具有至少95%序列同一性的序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其包含分別如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3,或包含分別與SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17具有至少95%序列同一性的序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
上述的具有至少95%序列同一性的胺基酸序列,可以是藉由親和力成熟的技術手段,對本發明的CDR區進行突變獲得的。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體或其片段。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中該PCSK9抗體的輕鏈可變區進一步包含鼠源κ鏈或鼠源κ鏈變體的輕鏈FR區、或者鼠源λ鏈或鼠源λ鏈變體的輕鏈FR區;其中該PCSK9抗體的重鏈可變區進一步包含鼠源IgG1或其變體的重鏈FR區、或IgG2或其變體的重鏈FR區、或IgG3或其變體的重鏈FR區。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中該鼠源抗體包含SEQ
ID NO:10的重鏈可變區序列和SEQ ID NO:11的輕鏈可變區序列。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中該PCSK9抗體的輕鏈進一步包含鼠源κ鏈或其變體的輕鏈恒定區、或者鼠源λ鏈或其變體的輕鏈恒定區;其中該PCSK9抗體重鏈進一步包含鼠源IgG1或其變體的重鏈恒定區、或IgG2或其變體的重鏈恒定區、或IgG3或其變體的重鏈恒定區。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段為嵌合抗體或其片段。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其片段。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中該人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列來源於人種系重鏈,IGHV1-2*02和hjh2的組合序列及其突變序列;其包含人種系重鏈IGHV1-2*02的FR1、FR2、FR3區和hjh2的FR4區及其突變序列,或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中該人源化抗體含有SEQ ID NO:18所示的重鏈可變區;或SEQ ID NO:18變體所示的重鏈可變區;其中該SEQ ID NO:18變體是在SEQ ID
NO:18所示的重鏈可變區位置上具有0-10個胺基酸變化的序列。該胺基酸變化可以是用現有技術,為提高抗體如親和性、半衰期等性能做的改進,如用親和力成熟修改CDR區的胺基酸,或者用回復突變修改FR區的胺基酸。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中該人源化抗體重鏈FR區序列有0-10個胺基酸的回復突變,較佳為一個或多個選自T30N、R87T、R72A、T74K、M48I、V68A、M70L、R38K和R67K的胺基酸回復突變。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中該人源化抗體包含選自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的序列所示的重鏈可變區。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中該人源化抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列來源於人種系輕鏈範本IGKV1-39*01和hjk2.1的組合序列及其突變序列;其包含人種系輕鏈IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3區和hjk2.1的FR4區及其突變序列,或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中該人源化抗體進一步包含SEQ ID NO:24所示的、或SEQ ID NO:24變體所示的輕鏈可變區;該SEQ ID NO:24變體是在SEQ ID NO:24所
示的輕鏈可變區位置上具有0-10的胺基酸變化。該胺基酸變化可以是用現有技術,為提高抗體如親和性、半衰期等性能做的改進,如用親和力成熟修改CDR區的胺基酸,或者用回復突變修改FR區的胺基酸。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中該SEQ ID NO:24變體是在SEQ ID NO:24所示的輕鏈可變區的FR區位置上具有0-10個胺基酸的回復突變;較佳的,該回復突變選自T5S,S66D,Q3V和A49S的胺基酸回復突變;較佳為A43S的胺基酸變化。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中該人源化抗體包含選自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的序列所示的輕鏈可變區。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中該人源化抗體包含重鏈可變區序列和/或輕鏈可變區序列,該重鏈可變區序列選自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示的序列,或該重鏈可變區序列選自與SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23具有至少95%序列同一性的序列;該輕鏈可變區序列選自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示的序列,或該輕鏈可變區序列選自與SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27具有
至少95%序列同一性序列。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中該PCSK9抗體包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區:1)SEQ ID NO:18的重鏈可變區和SEQ ID NO:25的輕鏈可變區,2)SEQ ID NO:18的重鏈可變區和SEQ ID NO:26的輕鏈可變區,3)SEQ ID NO:18的重鏈可變區和SEQ ID NO:27的輕鏈可變區,4)SEQ ID NO:19的重鏈可變區和SEQ ID NO:24的輕鏈可變區,5)SEQ ID NO:19的重鏈可變區和SEQ ID NO:25的輕鏈可變區,6)SEQ ID NO:19的重鏈可變區和SEQ ID NO:26的輕鏈可變區,7)SEQ ID NO:19的重鏈可變區和SEQ ID NO:27的輕鏈可變區,8)SEQ ID NO:20的重鏈可變區和SEQ ID NO:24的輕鏈可變區,9)SEQ ID NO:20的重鏈可變區和SEQ ID NO:25的輕鏈可變區,10)SEQ ID NO:20的重鏈可變區和SEQ ID NO:26的輕鏈可變區,
11)SEQ ID NO:20的重鏈可變區和SEQ ID NO:27的輕鏈可變區,12)SEQ ID NO:21的重鏈可變區和SEQ ID NO:24的輕鏈可變區,13)SEQ ID NO:21的重鏈可變區和SEQ ID NO:25的輕鏈可變區,14)SEQ ID NO:21的重鏈可變區和SEQ ID NO:26的輕鏈可變區,15)SEQ ID NO:21的重鏈可變區和SEQ ID NO:27的輕鏈可變區,16)SEQ ID NO:22的重鏈可變區和SEQ ID NO:24的輕鏈可變區,17)SEQ ID NO:22的重鏈可變區和SEQ ID NO:25的輕鏈可變區,18)SEQ ID NO:22的重鏈可變區和SEQ ID NO:26的輕鏈可變區,19)SEQ ID NO:22的重鏈可變區和SEQ ID NO:27的輕鏈可變區,20)SEQ ID NO:23的重鏈可變區和SEQ ID NO:24的輕鏈可變區,21)SEQ ID NO:23的重鏈可變區和SEQ ID NO:25的輕鏈可變區,22)SEQ ID NO:23的重鏈可變區和SEQ ID NO:26的輕鏈可變區,
23)SEQ ID NO:23的重鏈可變區和SEQ ID NO:27的輕鏈可變區,和24)SEQ ID NO:18的重鏈可變區和SEQ ID NO:24的輕鏈可變區。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中該PCSK9抗體的重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恒定區,或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列;較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4或使用胺基酸突變延長抗體在血清中的半衰期的IgG1、IgG2或IgG4變體的重鏈恒定區,更佳包含引入YTE突變的IgG1、IgG2或IgG4重鏈恒定區;其中所述PCSK9抗體的輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的恒定區,或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。
在本發明另一個較佳的實施方案中,本發明所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中該人源化抗體包含選自以下的重鏈和輕鏈:1)SEQ ID NO:28的重鏈和SEQ ID NO:30的輕鏈,和2)SEQ ID NO:32的重鏈和SEQ ID NO:30的輕鏈。
本發明進一步提供一種醫藥組成物,其含有治療有效量的如上所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
本發明進一步提供一種編碼如上所述的PCSK9抗體或
其抗原結合片段的DNA分子。
本發明進一步提供一種如上所述的DNA分子的表達載體。
本發明進一步提供一種如上所述的表達載體轉化的宿主細胞,該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞,較佳為真核細胞,更佳為哺乳動物細胞。
本發明進一步提供一種如上所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段或如上所述的醫藥組成物,在製備用於治療PCSK9介導的疾病或病症的藥物中的用途,其中該疾病或病症較佳為膽固醇相關疾病(其包括“血清膽固醇相關疾病”);更佳為高膽固醇血症、心臟病、代謝綜合症、糖尿病、冠狀動脈心臟病、中風、心血管疾病、阿爾茨海默病和一般性的異常脂血症;最佳為高膽固醇血症、異常脂血症、動脈粥樣硬化、CVD或冠狀動脈心臟病。
可以使用本發明的抗體診斷的示例性疾病包括膽固醇相關疾病(其包括“血清膽固醇相關疾病”),其包括以下的任何一種或多種:高膽固醇血症、心臟病、代謝綜合症、糖尿病、冠狀動脈心臟病、中風、心血管疾病、阿爾茨海默病和一般性的異常脂血症(其顯示為例如提高的總血清膽固醇、提高的LDL、提高的甘油三酯、提高的極低密度脂蛋白(VLDL)和/或低的HDL)。
在一方面中,本發明提供治療或預防個體中的高膽固醇血症和/或至少一種以下症狀的方法:異常脂血症、動脈粥樣硬化、心血管疾病(CVD)或冠狀動脈心臟病,該方法
包括向所述個體施用有效量的抗PCSK9抗體。本發明還提供有效量的拮抗胞外或循環PCSK9的抗PCSK9抗體在製備藥物中的用途,該藥物用於治療或預防個體的高膽固醇血症和/或至少一種以下症狀:異常脂血症、動脈粥樣硬化、CVD或冠狀動脈心臟病。
第1圖為本發明抗體載體構建中的引子設計示意圖。
第2圖為本發明抗體載體構建示意圖。
第3圖為不同h001-4-YTE抗PCSK9抗體濃度中HepG2細胞的LDL攝取變化。資料結果顯示PCSK9抗體能夠促進HepG2細胞攝取LDL。
第4圖為不同h001-4-WT抗PCSK9抗體濃度中HepG2細胞的LDL攝取變化。資料結果顯示PCSK9抗體能夠促進HepG2細胞攝取LDL。
第5圖為注射h001-4-WT抗PCSK9抗體的小鼠血清中LDL-c濃度隨時間變化(*:p<0.05,vs IgG,**:p<0.01,vs IgG)。資料結果顯示PCSK9抗體能夠降低過表達人PCSK9的小鼠血清中LDL-c濃度。
第6圖為注射h001-4-WT抗PCSK9抗體的小鼠血清中相對IgG組的LDL-c濃度變化。資料結果顯示相對IgG組,PCSK9抗體能夠降低過表達人PCSK9的小鼠血清中LDL-c濃度。
第7圖為本發明抗體在食蟹猴體內藥效及藥代檢測。該圖顯示h001-4-WT和h001-4-YTE均能夠明顯降低食蟹猴
體內LDL的含量,且h001-4-YTE的降低持續時間要優於h001-4-WT。
術語定義
為了更容易理解本發明,以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義,本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
本發明所述的“抗體”指免疫球蛋白,是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恒定區的胺基酸組成和排列順序不同,故其抗原性也不同。據此,可將免疫球蛋白分為五類,或稱為免疫球蛋白的同種型,即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE,其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別,又可分為不同的亞類,如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恒定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本發明中,本發明所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恒定區,該輕鏈恒定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本發明中,本發明所述的抗體重鏈可變區可進一步
包含重鏈恒定區,該重鏈恒定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大,為可變區(Fv區);靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定,為恒定區(Fc區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性,又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成,從胺基端到羧基端依次排列的順序為:FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3;重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本發明所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3,HCDE2-3),或者符合kabat和chothia的編號規則(HCDR1)。
本發明的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體,較佳為人源化抗體。
術語“鼠源抗體”在本發明中為根據本領域知識和技能製備的對人PCSK9的單株抗體。製備時用PCSK9抗原注射試驗對象,然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的雜交瘤。在本發明一個較佳的實施方案中,該鼠源PCSK9抗體或其抗原結合片段,可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恒定區,或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其變體的重鏈恒定區。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”,是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恒定區融合而成的抗體,可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體,要選建立分泌鼠源性特異性單抗的雜交瘤,然後從小鼠雜交瘤細胞中選殖可變區基因,再根據需要選殖人抗體的恒定區基因,將小鼠可變區基因與人恒定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中,最後在真核工業系統或原核工業系統中表達嵌合抗體分子。在本發明一個較佳的實施方案中,該PCSK9嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈Fc區。該PCSK9嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈Fc區,較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恒定區,或者使用胺基酸突變(如YTE突變)後延長抗體在血清中的半衰期的IgG1、IgG2或IgG4變體。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”,也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody),是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架,即不同類型的人種系抗體框架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分,從而誘導的強烈的抗體可變抗體反應。此類框架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得),以及在Kabat,E.A.等人,1991 Sequences of Proteins of
Immunological Interest,第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時,引起的活性下降,可對所述的人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變,以保持活性。本發明的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。在本發明一個較佳的實施方案中,該PCSK9人源化抗體小鼠的CDR序列選自SEQ ID NO:12,13,14,15,16或17;人的抗體可變區框架經過設計選擇,其中該抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列,來源於人種系輕鏈IGKV1-39*01和hjk2.1的組合序列;其中該抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列,來源於人種系重鏈IGHV1-2*02和hjh2的組合序列。為避免免疫原性下降的同時,引起的活性下降,可對該人抗體可變區可進行最少反向突變,以保持活性。
本發明中所述的“抗原結合片段”,指具有抗原結合活性的Fab片段,Fab’片段,F(ab’)2片段,以及與人PCSK9結合的Fv片段ScFv片段;其包含選自SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:17中的一個或多個本發明抗體的CDR區。Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區,但沒有恒定區,並具有全部抗原結合位元元點的最小抗體片段。一般地,Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭,且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈,稱為單鏈抗體(single chain antibody)或單鏈Fv(sFv)。本發明的術語“與PCSK9結合”,指能與人PCSK9相互作用。本發明的
術語“抗原結合位點”指抗原上不連續的,由本發明抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
術語“Fc區”在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈的C端區域,該區域包含至少一部分的恒定區。該術語包括天然序列Fc區和變體Fc區。在某些實施方案中,人IgG重鏈Fc區從Cys226或Pro230延伸至重鏈的羰基端。然而,Fc區的C端賴胺酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外說明,Fc區或恒定區中的胺基酸殘基的編號是根據EU編號系統,其也被稱為EU索引,如在Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫學感興趣的蛋白質的序列),5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。Fc區域是抗體的效應子功能所必需的。效應子功能包括啟動補體依賴的細胞毒性(CDC)、啟動吞噬作用和抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)並藉由胞轉作用轉運抗體通過細胞屏障。此外,Fc區域對維持IgG類抗體的血清半衰期至關重要(Ward和Ghetie,Ther.Immunol.2:77-94(1995))。研究發現IgG抗體的血清半衰期由Fc和新生Fc受體(FcRn)的結合來介導。FcRn是由跨膜α鏈和可溶性β鏈(β 2-微球蛋白)組成的異源二聚體。美國專利第6,165,745號公開了一種藉由將突變引入編碼抗體的DNA片段生產生物半衰期減少的抗體的方法。該突變包括在Fc-絞鏈結構域的位置253、310、311、433或434處的胺基酸取代。美國專利第6,277,375B1號公開了含有突變
型IgG分子的組合物,該分子相對野生型IgG血清半衰期增加,其中該突變型IgG分子含有以下胺基酸取代:在252位蘇胺酸取代亮胺酸,在254位蘇胺酸取代絲胺酸,或在256位蘇胺酸取代苯丙胺酸(M252Y、S254T和T256E)。也公開了在位置433、435或436處具有胺基酸取代的突變型IgG。美國專利第6,528,624號公開了含有IgG Fc區域的一種抗體的變體,該變體在人IgG Fc區域的一個或多個胺基酸位置(位置270、322、326、327、329、331、333和334)具有胺基酸取代。PCT公開號WO 02/060919A2公開了修飾的IgG,該修飾的IgG包含的IgG恒定區相對於野生型IgG恒定區含有一個或多個胺基酸修飾,其中該修飾的IgG與含有野生型IgG恒定區的IgG相比增加了半衰期,並且其中一個或多個胺基酸修飾位於以下一個或多個位置:251、253、255、285-290、308-314、385-389、和428-435。具體地,本文所述“YTE”或“YET突變”指IgG1的Fc區的一個突變組合,用於促進Fc區與人FcRn的結合,延長抗體在人血清中的半衰期。YTE突變子包含三個“YTE突變子”的組合:M252Y、S254T和T256E,殘基編號是根據EU編號系統,其也被稱為EU索引,如在Kabat等(參考美國專利第7,658,921號所述)對IgG重鏈進行編號。相較於野生型抗體,YTE突變抗體大大延長了抗體在血清中的半衰期,如e.g.,Dall’ Acqua et al,J.Biol.Chem.281:23514-24(2006)和美國專利第7,083,784號。
現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的
方法,如冷泉港的抗體實驗技術指南,5-8章和15章。例如,老鼠可以用人PCSK9或其片段免疫,所得到的抗體能被覆性、純化,並且可以用一般的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用一般方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因資料庫和MOE軟體,從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http://imgt.cines.fr得到,或者從免疫球蛋白雜誌,2001ISBN012441351上獲得。
本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用一般方法製備和純化。比如,編碼重鏈(SEQ ID NO:28)和輕鏈(SEQ ID NO:30)的cDNA序列,可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術,哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化,特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與人PCSK9特異性結合的抗體得到穩定的選殖株。陽性的選殖株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用一般技術純化。比如,用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法沖提結合的抗體,用SDS-PAGE檢測抗體片段,收集。抗體可用一般方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體,也可以用一般方法去除,比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍,如-70℃,或者凍乾。
“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時,是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸,以及試劑與流體的接觸,其中該流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時,是指治療處理、預防或預防性措施,研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑,例如包含本發明的任一種結合化合物的組合物,該患者具有一種或多種疾病症狀,而已知所述治療劑對這些症狀具有治療作用。通常,在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑,以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化,例如患者的疾病狀態、年齡和體重,以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法,可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效,但是根據本領域已知的任何統計
學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra核對總和Wilcoxon檢驗確定,其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸,使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉,一般而言,多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224頁,(第4版))。另外,結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破壞生物學活性。
“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化:例如,待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“外源性”指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據情況在細胞、生物或人體內產生的物質。
“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼
基或胺基酸單體亞基佔據時,例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時,那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如,在序列最佳比對時,如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源,那麼兩個序列為60%同源。一般而言,當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
本文使用的表述“細胞”、“細胞株”和“細胞培養物”可互換使用,並且所有這類名稱都包括後代。因此,單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物,而不考慮轉移數目。還應當理解的是,由於故意或非有意的突變,所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下,其由上下文清楚可見。
本文使用的“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美國專利第4,683,195號中所述擴增的程式或技術。一般來說,需要獲得來自目標地區域末端或之外的序列資訊,使得可以設計寡核苷酸引子;這些引子在序列方面與待擴增範本的對應鏈相同或相似。2個引子的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列和由總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質體序列等。一般參見Mullis等(1987)Cold
Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51:263;Erlich編輯,(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本文使用的PCR被視為用於擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應法的一個實例,但不是唯一的實例,所述方法包括使用作為引子的已知核酸和核酸聚合酶,以擴增或產生核酸的特定部分。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生,該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如,“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物,所述其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目標是促進對生物體的給藥,利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
實施例與測試例
以下結合實施例進一步描述本發明,但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照一般條件,如冷泉港的抗體技術實驗手冊,分子選殖手冊;或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑,為市場購買的一般試劑。
實施例1、PCSK9抗原及檢測用蛋白的製備
蛋白設計及表達
以UniProt Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9(人PCSK9,Uniprot號:Q8MBP7)作為本發明PCSK9的範本,設計本發明涉及的抗原及檢測用蛋白的胺基酸序列,可選的在PCSK9蛋白基礎上融合不同的標籤如his標籤或促進免疫的肽段如PADRE肽,分別選殖到pTT5載體上(Biovector,Cat#:102762)或pTargeT載體上(promega,A1410),在293細胞瞬轉表達或CHO-S穩定表達,純化,獲得編碼本發明抗原及檢測用蛋白。
帶PADRE肽和His標籤的PCSK9:PCSK9-PADRE-His6,作為免疫原,所含PADRE肽可以促進免疫;
SEQ ID NO:2注釋:劃橫線部分為信號肽,雙劃線部分為linker,點劃線部分為PADRE肽,斜體部分為His6-tag。
帶TEV酶切位點的PCSK9與his標籤融合蛋白:PCSK9-TEV-His6,可藉由TEV酶切獲得N-PCSK9(N端pCSK9結構域),作為免疫原;
SEQ ID NO:3注釋:劃橫線部分為信號肽,雙劃線部分為TEV酶切位點,斜體部分為His6-tag。
PCSK9:插入生物素接受肽BP15及his標籤的PCSK9蛋白:PCSK9-BP15-His6,作為檢測試劑,BP15肽位置在表達過程中能夠進行生物素標記,免除體外生物素標記及可能導致的構象變化;
SEQ ID NO:5注釋:劃橫線部分為信號肽,雙劃線部分為生物素接受肽,斜體部分為His6-tag。
PCSK9-Y:插入生物素接受肽及his標籤的PCSK9 D374Y突變體蛋白:PCSK9-D374Y-BP15-His6,檢測蛋白;
SEQ ID NO:6注釋:劃橫線部分為信號肽,雙劃線部分為生物素接受肽,斜體部分為His6-tag。
帶Flag標籤和His標籤的pCSK9受體蛋白LDLR胞外域片段:LDLR-ECD-Flag-His6,檢測試劑
SEQ ID NO:7注釋:劃橫線部分為信號肽,雙劃線部分為Flag標籤,斜體部分為His6-tag;
LDLR-Fc:縮短形式的LDLR胞外域片段與hIgG1-Fc融合蛋白(具有與PCSK9結合活性):LDLR-sECD-Fc(hIgG1)作為檢測試劑
SEQ ID NO:8
注釋:劃橫線部分為信號肽,雙劃線部分為縮短形式的具有與PCSK9結合活性的LDLR胞外域片段(LDLR-sECD),斜體部分為hIgG1-Fc部分;
更加縮短形式的LDLR胞外域片段與hIgG1-Fc融合蛋白(具有與pCSK9結合活性):LDLR-ssECD-Fc(hIgG1)作為檢測試劑
SEQ ID NO:9注釋:劃橫線部分為信號肽,雙劃線部分為更加縮短形式的具有與PCSK9結合活性的LDLR胞外域片段(LDLR-ssECD),斜體部分為hIgG1-Fc部分。
實施例2、PCSK9、LDLR相關重組蛋白的純化重組蛋白以及雜交瘤抗體、重組抗體的純化
1、帶His標籤的重組蛋白的純化步驟:
將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質,並將緩衝液
換置換為PBS,加入咪唑至終濃度為5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡鎳管柱,沖洗2-5倍管柱體積。將置換後的上清樣品上IMAC管柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液沖洗管柱,至A280讀數降至基線。後用PBS+10mM咪唑沖洗層析管柱,除去非特異結合的雜蛋白,並收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液沖提目標蛋白,並收集沖提峰。收集的沖提液濃縮後用凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化,流動相為PBS。去聚體峰,收集沖提峰。所得到的蛋白經電泳,肽圖,LC-MS鑒定為正確後分裝備用。得到帶His標籤的PCSK9-His6(SEQ ID NO:1)、PCSK9-PADRE-His6(SEQ ID NO:2)、PCSK9-TEV-His6(SEQ ID NO:3)PCSK9-D374Y-His6(SEQ ID NO:4)、PCSK9-BP15-His6(SEQ ID NO:5)、PCSK9-D374Y-BP15-His6(SEQ ID NO:6)用於本發明抗體的免疫原或檢測試劑。其中PCSK9-TEV-His6純化後藉由TEV酶進行酶切,酶切產物再利用IMAC柱結合去除TEV酶、未酶切完全的PCSK9-TEV-His6或切除的帶His標籤的C端結構域片段,IMAC流出液中濃縮獲得僅留N端結構域的PCSK9片段(縮寫為N-PCSK9),作為免疫原用於小鼠免疫。
2、帶His標籤和Flag標籤的LDLR-ECD-Flag-His6(SEQ ID NO:7)重組蛋白的純化步驟:
將樣品高速離心去除雜質,並濃縮至適當體積。利用0.5×PBS平衡flag親和管柱,沖洗2-5倍管柱體積。將除
雜後的細胞表達上清樣品上管柱。用0.5×PBS沖洗柱子,至A280讀數降至基線。用含有0.3M NaCl的PBS沖洗柱子,沖洗雜蛋白,並收集。用0.1M乙酸(pH3.5-4.0)沖提目標蛋白,並收集,調節pH至中性。收集的沖提液濃縮後用凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化,流動相為PBS。去聚體峰,收集沖提峰收集樣品經電泳,肽圖,LC-MS鑒定正確後分裝備用。得到帶FLAG/His6標籤的LDLR-ECD-Flag-His6(SEQ ID NO:7),用於本發明抗體的性能測試。
3、LDLR的Fc融合蛋白的純化步驟:
將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質,濃縮至適當體積後上Protein A管柱。用PBS沖洗管柱,至A280讀數降至基線。用100mM sodium acetate pH3.0沖提目標蛋白,用1M Tris-HCl中和。沖提樣品適當濃縮後利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化,去聚體的峰收集好後分裝備用。此方法用來純化LDLR-sECD-Fc(hIgG1)(SEQ ID NO:8)和LDLR-ssECD-Fc(hIgG1)(SEQ ID NO:9)。兩者可用作PCSK9抗體功能性測試。
實施例3、抗人PCSK9雜交瘤單株抗體的製備
1、免疫
抗人PCSK9單株抗體藉由免疫小鼠產生。實驗用SJL白小鼠,雌性,6周齡(北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物生產許可證號:SCXK(京)2012-0001)。飼養環
境:SPF級。小鼠購進後,實驗室環境飼養1週,12/12小時光/暗週期調節,溫度20-25℃;濕度40-60%。將已適應環境的小鼠按兩種方案免疫(A/B),每組6-10隻。免疫抗原為帶His標籤的人PCSK9-His6(SEQ ID NO:1)、PCSK9-PADRE-His6(SEQ ID NO:2)及N-PCSK9(SEQ ID NO:3)。
方案A用弗氏佐劑(sigma Lot Num:F5881/F5506)乳化:首次免疫用弗氏完全佐劑(CFA),其餘加強免疫用弗氏不完全佐劑(IFA)。抗原與佐劑比例為1:1,100μg/隻(首次免疫),50μg/隻(加強免疫)。第0天腹膜內(IP)注射100μg/只的乳化後抗原,首次免疫後每兩週一次,共6-8周。
方案B用Titermax(sigma Lot Num:T2684)與Alum(Thremo Lot Num:77161)交叉免疫。抗原與佐劑(titermax)比例為1:1,抗原與佐劑(Alum)比例為3:1,10-20μg/隻(首次免疫),5μg/隻(加強免疫)。第0天腹膜內(IP)注射20/10μg/隻的乳化後抗原,首次免疫後每週一次,Titermax和Alum交替使用,共6-11週。免疫四週後,根據背部結塊和腹部腫脹情況,選擇背部或腹膜內注射抗原。
2、細胞融合
選擇血清中抗體效價高(見後面的測試例1和2,結合PCSK9的ELISA方法)並且效價趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合,融合前72小時衝刺免疫所選小鼠,PCSK9-His610μg/隻,腹腔注射。採用優化的PEG介導的融合步驟將
脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞(ATCC® CRL-8287TM)進行融合得到雜交瘤細胞。融合好的雜交瘤細胞用HAT完全培養基(含20%FBS、1×HAT和1×OPI的RPMI-1640培養基)重懸,分裝於96孔細胞培養板中(1×105/150μl/孔),37℃,5% CO2孵育。融合後的第5天加入HAT完全培養基,50μl/孔,37℃,5% CO2孵育。融合後第7天~8天,根據細胞生長密度,全換液,培養基為HT完全培養基(含20%FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培養基),200μl/孔,37℃,5% CO2孵育。
3、雜交瘤細胞篩選
融合後第10-11天,根據細胞生長密度,進行結合PCSK9或PCSK9-Y的ELISA方法檢測(見測試例1和2)。並將結合ELISA檢測的陽性孔細胞進行PCSK9或PCSK9-Y與LDLR結合的阻斷ELISA檢測(見測試例3和4),陽性孔換液,並根據細胞密度及時擴大至24孔板中。移入24孔板的細胞株經過複測後進行保種和第一次次選殖。第一次次選殖篩選(見測試例1和2)為陽性的進行保種,並進行第二次次選殖。第二次次選殖為陽性(見測試例1和2)的進行保種和蛋白表達。多次融合獲得有阻斷PCSK9或PCSK9-Y與LDLR結合效果(見測試例3和4)的雜交瘤細胞。
藉由阻斷實驗和結合實驗篩選得到雜交瘤選殖株
mAb-001,用無血清細胞培養法進一步製備抗體,按純化實例純化抗體,供在檢測例中使用。
其中測得雜交瘤選殖株mAb-001的鼠抗可變區序列如下:>mAb-001 VH
SEQ ID NO:10>mAb-001VL
SEQ ID NO:11注:順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,序列中斜體為FR序列,底線為CDR序列。
實施例4、抗人PCSK9雜交瘤單株抗體的人源化
1、雜交瘤選殖株mAb-001人源化框架選擇
藉由比對IMGT人類抗體重輕鏈可變區種系基因資料庫和MOE軟體,分別挑選與mAb-001同源性高的重輕鏈可變區種系基因作為範本,將這兩個鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源範本中,形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。其中胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並注釋。
鼠源抗體mAb-001的人源化輕鏈範本為IGKV1-39*01和hjk2.1,人源化重鏈範本為IGHV1-2*02和hjh2,人源化後得到人源化抗體h001-1的可變區序列如下:>h001-1 VH
SEQ ID NO:18>h001-1 VL
SEQ ID NO:24注:順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,序列中斜體為FR序列,底線為CDR序列。
2、雜交瘤選殖株mAb-001的範本選擇和回復突變設計,見下表2;雜交瘤選殖株回復突變後的人源化序列組合見表4。
3、將以上的人源化序列組合進行抗體化,重鏈恒定區來自人IgG1,輕鏈恒定區來自人kappa鏈。得到相應的人源化抗體,進行結合pCSK9的ELISA方法檢測(見測試例1),和結合pCSK9-Y的ELISA方法檢測(見測試例2);並將結合ELISA檢測的陽性孔細胞進行pCSK9/LDLR結合的阻斷ELISA檢測(見測試例4),和進行pCSK9-Y/LDLR結
合的阻斷ELISA檢測(見測試例3);結果見表5-8。
結果顯示,本發明得到的PCSK9抗體與PCSK9和PCSK9-Y有較高的結合活性;並且能有效阻斷PCSK9/PCSK9-Y與LDLR之間的結合。
實施例5、構建和表達抗人PCSK9人源化抗體IgG1及IgG1-YTE形式
本發明構建和表達抗人PCSK9人源化抗體的方法如下:
1、引子設計:利用線上軟體DNAWorks(v3.2.2)(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)設計多條引子合成VH/VK含重組所需基因片段:5’-30bp Signal peptide+VH/VK+30bp CH1/CL-3’。引子設計原則:目標基因2與目標基因1有2個aa不一樣,則另設突變位點所在引子,如第1圖所示。
2、片段拼接:按照TaKaRa公司Primer STAR GXL DNA聚合酶操作說明書,用上面設計的多條引子,分兩步PCR擴增得到VH/VK含重組所需基因片段。
3、表達載體pHr(帶信號肽及恒定區基因(CH1-FC/CL)片段)構建及酶切
利用一些特殊的限制性內切酶,如BsmBI,識別序列與酶切位點不同的特性設計構建表達載體pHr(帶信號肽及恒定區基因(CH1-FC/CL)片段),如第2圖所示。BsmBI酶切載體,切膠回收備用。
4、重組構建表達載體VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr
VH/VK含重組所需基因片段與BsmBI酶切回收表達載體pHr(帶信號肽及恒定區基因(CH1-FC/CL)片段)按3:1比例分別加入DH5 α受容細胞中,0℃冰浴30min,42℃熱擊90秒,加入5倍體積LB medium,37℃孵育45min,塗布LB-Amp平板,37℃培養過夜,挑取單株送測序得到各目標選殖株。
本發明的抗體可以,但不限於以上設計構建方式。以h001-4為例進行抗體及其突變體設計,得到①h001-4-WT:h001-4的IgG1形式,即人源化序列組合h001-4,結合來自人IgG1的重鏈恒定區,與來自人kappa鏈的輕鏈恒定區;②h001-4-YTE:h001-4-IgG1-YTE形式,即人源化序列組合h001-4,結合突變的人IgG1(YTE突變)的重鏈恒定區,與來自人kappa鏈的輕鏈恒定區。突變的人IgG1也可以是別種形式的突變。得到的抗體及突變的抗體用BIAcore檢測其親和力(測試例6),結果見表9。
本發明構建和表達抗人PCSK9人源化抗體(IgG1及IgG1-YTE形式)序列如下:h001-4 IgG1形式,重鏈恒定區來自人IgG1,輕鏈恒定區來自人kappa輕鏈:重鏈胺基酸序列(人IgG1):
SEQ ID NO:28重鏈DNA序列:
SEQ ID NO:29
h001-4-kappa輕鏈胺基酸序列:
SEQ ID NO:30輕鏈DNA序列:
SEQ ID NO:31 h001-4-IgG1-YTE(輕鏈為h001-4-kappa:SEQ ID NO:30)重鏈胺基酸序列:IgG1-YTE
SEQ ID NO:32重鏈DNA序列:
SEQ ID NO:33備註:底線部分為信號肽DNA序列
以下用生化測試方法驗證本發明性能及有益效果。
測試例1、PCSK9抗體結合野生型PCSK9蛋白的ELISA實驗
本發明PCSK9抗體與PCSK9的結合力測試,藉由抗體與固定在ELISA板上野生型PCSK9(WT-PCSK9,SEQ ID NO:5)的結合的量來檢測。
用PBS稀釋鏈黴親和素(sigma,CAT#S4762)至2μg/ml,包被在96孔ELISA板上,4℃放置過夜。洗板後,在37℃用Tris緩衝液(含0.9mM氯化鈣、0.05% Tween 20和5%脫脂奶粉)封閉2小時。洗板,加入內部生產的生物素標記的PCSK9(bio-WT-PCSK9,用含0.9mM氯化鈣、
0.05% Tween 20和1%脫脂奶粉的Tris緩衝液稀釋)100μl/孔,37℃孵育1小時。洗板,加入不同濃度稀釋的抗PCSK9抗體樣品,37℃孵育1小時。再洗板,加入辣根過氧化物酶-羊抗人(H+L)抗體(jackson,CAT#109-035-088),37℃孵育1小時。再洗板,加入四甲基聯苯胺溶液顯色。最後加入終止液,在酶標儀上測量OD450,並計算其EC50值。
本發明嵌合抗體、回復突變後抗體與PCSK9的結合力ELISA實驗,結果見表5。
結果顯示,本發明PCSK9抗體與PCSK9有較高的結合活性。
測試例2、PCSK9抗體結合PCSK9-Y的ELISA實驗
本發明PCSK9抗體與PCSK9-Y的結合力測試,藉由抗體與固定在ELISA板上PCSK9-Y(突變型PCSK9,SEQ ID NO:6)的結合的量來檢測。
用PBS稀釋鏈黴親和素(sigma,CAT#S4762)至2μg/ml,包被在96孔ELISA板上,4℃放置過夜。洗板後,在37℃用Tris緩衝液(含0.9mM氯化鈣、0.05% Tween 20和5%脫脂奶粉)封閉2小時。洗板,加入內部生產的生物素標記的PCSK9-Y(bio-PCSK9-Y,用含0.9mM氯化鈣、0.05% Tween 20和1%脫脂奶粉的Tris緩衝液稀釋)100μl/孔,37℃孵育1小時。洗板,加入不同濃度稀釋的抗PCSK9抗體樣品,37℃孵育1小時。再洗板,加入辣根過氧化物酶-羊抗人(H+L)抗體(jackson,CAT#109-035-088),37℃孵育1小時。再洗板,加入四甲基聯苯胺溶液顯色。最後加入終止液,在酶標儀上測量OD450,並計算其EC50值。
本發明嵌合抗體、回復突變後抗體與突變型PCSK9的結合力ELISA實驗,結果見表6。
結果顯示,本發明PCSK9抗體與PCSK9-Y有較高的結合活性。
測試例3、PCSK9抗體對LDLR-FC/PCSK9-Y結合的阻斷
抗PCSK9抗體對LDLR-FC(SEQ ID NO:8)和PCSK9-Y(突變型PCSK9,SEQ ID NO:6)結合的阻斷能力測試,藉由檢測在抗體存在的條件下,PCSK9-Y與LDLR結合的量來確定。
用磷酸緩衝液稀釋LDLR-FC,至2μg/ml,包被在96孔ELISA板(Costar,CAT#3590)上,4℃放置過夜。洗板後,在37℃用Tris緩衝液(含0.9mM氯化鈣、0.05% Tween 20和5%脫脂奶粉)封閉2小時。洗板,加入生物素標記的PCSK9-Y(bio-PCSK9-Y,用含0.9mM氯化鈣、0.05% Tween 20和1%脫脂奶粉的Tris緩衝液稀釋至終濃度1μg/ml),和抗體樣品(用含0.9mM氯化鈣、0.05% Tween 20和1%脫脂奶粉的Tris緩衝液稀釋)的混合液100μl/孔,37℃孵育1小時。洗板,加入辣根過氧化物酶-鏈黴親和素(sigma,CAT#S2438),37℃孵育1小時。再洗板,加入四甲基聯苯胺溶液顯色。最後加入終止液,在酶標儀上測量
OD450,並計算其IC50值。
結果顯示,本發明PCSK9抗體能有效阻斷PCSK9-Y與LDLR之間的結合。
用上面所述方法,測試本發明PCSK9抗體對其它形式的LDLR-FC(內部生產的,序列見SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9)和PCSK9-Y(SEQ ID NO:5)結合的阻斷能力,實驗證明本發明PCSK9抗體能有效阻斷PCSK9與縮短形式的
LDLR之間的結合。
測試例4、PCSK9抗體對LDLR-FC/PCSK9結合的阻斷
本發明PCSK9抗體對LDLR-FC(內部生產的,序列為SEQ ID NO:8)和PCSK9(SEQ ID NO:5)結合的阻斷能力測試,藉由檢測在抗體存在的條件下,PCSK9與LDLR結合的量來確定。
用磷酸緩衝液稀釋LDLR-FC至5μg/ml,包被在96孔ELISA板上,4℃放置過夜。洗板後,在37℃用Tris緩衝液(含0.9mM氯化鈣、0.05% Tween 20和5%脫脂奶粉)封閉2小時。洗板,加入生物素標記的PCSK9(bio-WT-PCSK9,用含0.9mM氯化鈣、0.05% Tween 20和1%脫脂奶粉的Tris緩衝液稀釋至終濃度2μg/ml)和抗體樣品(用含0.9mM氯化鈣、0.05% Tween 20和1%脫脂奶粉的Tris緩衝液稀釋)的混合液100μl/孔,37℃孵育1小時。洗板,加入辣根過氧化物酶-鏈黴親和素(sigma,CAT#S2438),37℃孵育1小時。再洗板,加入四甲基聯苯胺溶液顯色。最後加入終止液,在酶標儀上測量OD450,並計算其IC50值。
本發明嵌合抗體、回復突變後抗體對LDLR-FC/PCSK9結合的阻斷效果測試,結果見表8。
結果顯示,本發明PCSK9抗體能有效阻斷PCSK9與LDLR之間的結合。
用上面所述方法,測試本發明PCSK9抗體對其它形式的LDLR-FC(內部生產的,序列見SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9)和PCSK9(SEQ ID NO:5)結合的阻斷能力,實驗證明本發明PCSK9抗體能有效阻斷PCSK9與縮短形式的LDLR之間的結合。
測試例5、PCSK9抗體對LDL的攝取實驗
HepG2細胞(中科院細胞庫,#CAT,TCHu72)培養在DMEM培養基(Hyclone,#CAT SH30243.01B)中(含10%胎牛血清,Gibco,#CAT 10099-141)。當細胞覆蓋80-90%時,消化吹散後計數1.5*104cells/孔鋪於96孔板。24小時後,更換培養基為DMEM,10%無脂蛋白血清(Millipore,CAT#LP4)。48小時後,用磷酸緩衝液洗2次,加入在4℃預孵育1小時的含PCSK9(SEQ ID NO:1,終濃度10μg/ml)和抗體樣品(用培養基稀釋至不同濃度)的混合物,以及終濃度10μg/ml的BODIPY-®LDL(Invitrogen,CAT#L3483),37℃孵育。6小時後,用磷酸緩衝液洗板2次,用酶標儀讀取螢光值(EX485nm/EM535nm)。然後加入50μl/孔CellTiter-Glo®細胞活性發光檢測試劑(Promega,G7571),讀取化學發光值。LDL uptake結果如第3圖,第4圖所示,資料結果顯示本發明PCSK9抗體能夠促進HepG2細胞攝取LDL。
測試例6、BIAcore檢測PCSK9抗體親和力實驗
按照人Fab捕獲試劑盒(Cat.# 28-9583-25,GE)說明書中所述的方法,將人Fab捕獲分子共價偶聯於CM5生物傳感晶片(Cat.# BR-1000-12,GE)上,從而親和捕獲待測抗體,然後於晶片表面流經人PCSK9抗原(帶His標籤的人PCSK9:PCSK9-His6,SEQ ID NO:1),利用Biacore儀器即時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線,藉由擬合得到親和力數值,見表9。在實驗中每個循環解離完成後,
用人Fab捕獲試劑盒(GE)裡配置的再生溶液將生物晶片洗淨再生。
本發明PCSK9抗體與人PCSK9抗原有強親和力。
用上面相似的方法,檢測本發明PCSK9抗體與PCSK9-Y(SEQ ID NO:4)的親和力,顯示本發明PCSK9抗體與PCSK9-Y抗原有較強親和力。
測試例7、PCSK9抗體體內藥效實驗
本實驗構建過表達人PCSK9的小鼠模型,進行尾靜脈注射PCSK9抗體,來評價本發明PCSK9抗體在過表達人PCSK9的小鼠體內降低LDL-c的作用。人IgG(從混合的正常人血清中,利用傳統的親和層析方法如ProteinA純化獲得的人免疫球蛋白)作為空白對照。
C57B1/6小鼠(購自上海西普爾.必凱實驗動物有限責任公司)實驗室環境適應5天,藉由尾靜脈注射AAV-PCSK9病毒(北京本元正陽基因技術有限公司),注射4×1011v.g.。注射病毒後於實驗前一天禁食過夜,眼眶取血,用HDL and LDL/VLDL Cholesterol Quantification Kit(購自BioVision公司,貨號#K613-100)檢測LDL-c,根據LDL-c濃度隨機分組,每組6隻小鼠(n=6),進行尾靜脈注射給藥,內部生產
的人IgG、h001-4-WT抗體給藥劑量為10mg/kg(人IgG、h001-4-WT抗體用PBS配製,濃度為1mg/ml)。取血前禁食6小時,給藥後第24、48、72、96小時眼眶取血,37℃放置1小時,3500rpm離心10分鐘,取血清保存在-80℃。
最後一次取血清後,把凍存的血清在同一天檢測。用HDL and LDL/VLDL Cholesterol Quantification Kit檢測血清中LDL-c濃度,按照試劑盒說明書操作。
實驗結果如第5圖所示,正常小鼠血清LDL-c濃度約為12mg/dl。注射AAV8-PCSK9病毒後,血清中LDL-c濃度達平均40mg/dl。分組後給藥,給藥24小時後,與人IgG組相比,h001-4-WT組LDL-c濃度下降50%;給藥48小時後,h001-4-WT組LDL-c濃度下降49%;給藥72小時後,h001-4-WT組LDL-c濃度下降32%;給藥96小時後,h001-4-WT組LDL-c濃度下降20%,如表10和第6圖所示。
綜上,h001-4-WT能夠降低過表達人PCSK9的小鼠血清中LDL-c濃度,且藥效持續到72小時。
測試例8、競爭性實驗
在競爭性ELISA實驗中,我們將一種抗體包板過夜,之後同時加入生物素化的pCSK9-his和50倍於包板濃度的競爭抗體,包板抗體和溶液中的抗體將競爭性結合抗原,之後檢測板上抗原的信號。結果顯示,h001-4和21B12(US8030457B2)自身能夠競爭性結合抗原外,h001-4和21B12之間無明顯競爭結合,提示兩者抗原決定基的不同。
測試例9、食蟹猴體內藥效及藥物代謝檢測
為考察本發明的抗體在體內的作用效果及代謝情況,嘗試了在食蟹猴體內給藥實驗,分別給藥h001-4-WT及h001-4-YTE。採用靜脈注射給藥,劑量選擇3mg/kg,每組3隻雄性食蟹猴。約2~4mL/分鐘,緩慢推注。藉由不同時間點取血檢測脂蛋白尤其是低密度脂蛋白(LDL)及血清中抗體濃度,其中脂蛋白檢測點為給藥前和給藥後1、4、8、12、16、20、24、28天,PK採血點為給藥前、給藥後15分鐘、30分鐘、1小時、3小時、8小時、12小時、24小時、48小時、72、96、120小時、144小時、168小時、336小時、504小時、672小時。
試驗結果顯示(第7圖)h001-4-WT和h001-4-YTE均能夠明顯降低食蟹猴體內LDL的含量,且h001-4-YTE的
降低持續時間要優於h001-4-WT。
藥物代謝取血點血清樣品藉由ELISA檢測其中h001-4-WT和h001-4-YTE的含量,方法參考測試例1所述,結果顯示h001-4-WT在食蟹猴體內半衰期為4天,而h001-4-YTE在食蟹猴體內半衰期為7.3天,YTE相比WT具有明顯延長的體內半衰期。
<110> 江蘇恆瑞股份有限公司、上海恆瑞股份有限公司
<120> PCSK9抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
<130> 760083CPCT
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帶His標籤的pCSK9:pCSK9-His6,用於免疫原免疫小鼠或檢測試劑
<210> 2
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帶PADRE和His標籤的pCSK9:pCSK9-PADRE-His6,作為免疫原,所含PADRE肽可以促進免疫
<210> 3
<211> 704
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帶TEV酶切位點的pCSK9與his標籤融合蛋白:pCSK9-TEV-His6,可藉由TEV酶切獲得N-pCSK9(N端pCSK9結構域),作為免疫原
<210> 4
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pCSK9-D374Y突變蛋白,帶his標籤:pCSK9-D374Y-His6,作為檢測試劑
<210> 5
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 插入生物素接受肽及his標籤的pCSK9蛋白:pCSK9-BP15-His6,作為檢測試劑,BP15肽位置在表達過程中能夠進行生物素標記,免除體外生物素標記及可能導致的構建變化
<210> 6
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 插入生物素接受肽及his標籤的pCSK9 D374Y突變體蛋白:pCSK9-D374Y-BP15-His6,檢測蛋白
<210> 7
<211> 802
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帶Flag標籤和His標籤的pCSK9受體蛋白LDLR胞外域片段:LDLR-ECD-Flag-His6,檢測試劑
<210> 8
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 縮短形式的LDLR胞外域片段與hIgG1-Fc融合蛋白(具有與pCSK9結合活性)
:LDLR-sECD-Fc(hIgG1)作為檢測試劑
<210> 9
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 更加縮短形式的LDLR胞外域片段與hIgG1-Fc融合蛋白(具有與pCSK9結合活性):LDLR-ssECD-Fc(hIgG1)作為檢測試劑
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 鼠
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> 鼠
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> 鼠
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 鼠
<210> 18
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ch-001
<210> 19
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-VH.1A
<210> 20
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-VH.1B
<210> 21
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-VH.1C
<210> 22
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-VH.1D
<210> 23
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-VH.1E
<210> 24
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ch-001 hVL.1(CDR接枝)
<210> 25
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-VL.1A
<210> 26
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-VL.1B
<210> 27
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-VL.1C
<210> 28
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-4-IgG1
<210> 29
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-4-IgG1
<210> 30
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-4-kappa
<210> 31
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-4-kappa
<210> 32
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-4-IgG1-YTE
<210> 33
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-4-IgG1-YTE
Claims (34)
- 一種PCSK9抗體或其抗原結合片段,其包含分別如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,和分別如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
- 如申請專利範圍第1項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該PCSK9抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體或其片段。
- 如申請專利範圍第1項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該PCSK9抗體的輕鏈可變區進一步包含鼠源κ鏈或鼠源κ鏈變體的輕鏈FR區、或者鼠源λ鏈或鼠源λ鏈變體的輕鏈FR區;其中,該PCSK9抗體的重鏈可變區進一步包含鼠源IgG1或其變體的重鏈FR區、或IgG2或其變體的重鏈FR區、或IgG3或其變體的重鏈FR區。
- 如申請專利範圍第3項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其包含SEQ ID NO:10所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:11所示的輕鏈可變區。
- 如申請專利範圍第1項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該PCSK9抗體的輕鏈進一步包含鼠源κ鏈或其變體的輕鏈恒定區、或者鼠源λ鏈或其變體的輕鏈恒定區;其中,該PCSK9抗體重鏈進一步包含鼠源IgG1或其變體的重鏈恒定區、或IgG2或其變體的重鏈 恒定區、或IgG3或其變體的重鏈恒定區。
- 如申請專利範圍第1項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該PCSK9抗體或其抗原結合片段為嵌合抗體或其片段。
- 如申請專利範圍第1項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其片段。
- 如申請專利範圍第7項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列來源於人種系重鏈,IGHV1-2*02和hjh2的組合序列或其突變序列;該人源化抗體包含人種系重鏈IGHV1-2*02的FR1、FR2、FR3區和hjh2的FR4區或其突變序列。
- 如申請專利範圍第8項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該人源化抗體含有SEQ ID NO:18所示的重鏈可變區;或SEQ ID NO:18變體所示的重鏈可變區;其中,該SEQ ID NO:18變體是在SEQ ID NO:18所示的重鏈可變區位置上具有1-10個胺基酸變化的序列。
- 如申請專利範圍第9項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該SEQ ID NO:18變體是在SEQ ID NO:18所示的重鏈可變區的FR區位置上具有1-10個胺基酸的回復突變。
- 如申請專利範圍第10項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該回復突變選自T30N、R87T、R72A、 T74K、M48I、V68A、M70L、R38K和R67K的胺基酸回復突變。
- 如申請專利範圍第8項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該人源化抗體包含選自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的序列所示的重鏈可變區。
- 如申請專利範圍第7項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該人源化抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列來源於人種系輕鏈範本IGKV1-39*01和hjk2.1的組合序列或其突變序列;該人源化抗體包含人種系輕鏈IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3區和hjk2.1的FR4區或其突變序列。
- 如申請專利範圍第13項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該人源化抗體進一步包含SEQ ID NO:24所示的、或SEQ ID NO:24變體所示的輕鏈可變區;該SEQ ID NO:24變體是在SEQ ID NO:24所示的輕鏈可變區位置上具有1-10的胺基酸變化的序列。
- 如申請專利範圍第14項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該SEQ ID NO:24變體是在SEQ ID NO:24所示的輕鏈可變區的FR區位置上具有1-10個胺基酸的回復突變。
- 如申請專利範圍第15項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該回復突變選自T5S、S66D、Q3V和A49S的胺基酸回復突變。
- 如申請專利範圍第15項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該回復突變為A43S的胺基酸變化。
- 如申請專利範圍第13項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該人源化抗體包含選自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的序列所示的輕鏈可變區。
- 如申請專利範圍第7項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該人源化抗體包含重鏈可變區序列和/或輕鏈可變區序列,該重鏈可變區序列選自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示的序列,或該重鏈可變區序列選自與SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23具有至少95%序列同一性的序列;該輕鏈可變區序列選自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示的序列,或該輕鏈可變區序列選自與SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27具有至少95%序列同一性序列。
- 如申請專利範圍第7項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該PCSK9抗體包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區:1)SEQ ID NO:18的重鏈可變區和SEQ ID NO:25的輕鏈可變區,2)SEQ ID NO:18的重鏈可變區和SEQ ID NO:26的輕鏈可變區, 3)SEQ ID NO:18的重鏈可變區和SEQ ID NO:27的輕鏈可變區,4)SEQ ID NO:19的重鏈可變區和SEQ ID NO:24的輕鏈可變區,5)SEQ ID NO:19的重鏈可變區和SEQ ID NO:25的輕鏈可變區,6)SEQ ID NO:19的重鏈可變區和SEQ ID NO:26的輕鏈可變區,7)SEQ ID NO:19的重鏈可變區和SEQ ID NO:27的輕鏈可變區,8)SEQ ID NO:20的重鏈可變區和SEQ ID NO:24的輕鏈可變區,9)SEQ ID NO:20的重鏈可變區和SEQ ID NO:25的輕鏈可變區,10)SEQ ID NO:20的重鏈可變區和SEQ ID NO:26的輕鏈可變區,11)SEQ ID NO:20的重鏈可變區和SEQ ID NO:27的輕鏈可變區,12)SEQ ID NO:21的重鏈可變區和SEQ ID NO:24的輕鏈可變區,13)SEQ ID NO:21的重鏈可變區和SEQ ID NO:25的輕鏈可變區,14)SEQ ID NO:21的重鏈可變區和SEQ ID NO:26的輕鏈可變區, 15)SEQ ID NO:21的重鏈可變區和SEQ ID NO:27的輕鏈可變區,16)SEQ ID NO:22的重鏈可變區和SEQ ID NO:24的輕鏈可變區,17)SEQ ID NO:22的重鏈可變區和SEQ ID NO:25的輕鏈可變區,18)SEQ ID NO:22的重鏈可變區和SEQ ID NO:26的輕鏈可變區,19)SEQ ID NO:22的重鏈可變區和SEQ ID NO:27的輕鏈可變區,20)SEQ ID NO:23的重鏈可變區和SEQ ID NO:24的輕鏈可變區,21)SEQ ID NO:23的重鏈可變區和SEQ ID NO:25的輕鏈可變區,22)SEQ ID NO:23的重鏈可變區和SEQ ID NO:26的輕鏈可變區,23)SEQ ID NO:23的重鏈可變區和SEQ ID NO:27的輕鏈可變區,和24)SEQ ID NO:18的重鏈可變區和SEQ ID NO:24的輕鏈可變區。
- 如申請專利範圍第7項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該PCSK9抗體的重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恒定區,或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列; 其中,該PCSK9抗體的輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的恒定區,或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第21項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該PCSK9抗體的重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2或IgG4或使用胺基酸突變延長抗體在血清中的半衰期的IgG1、IgG2或IgG4變體的重鏈恒定區。
- 如申請專利範圍第21項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該PCSK9抗體的重鏈進一步包含引入YTE突變的IgG1、IgG2或IgG4重鏈恒定區。
- 根據申請專利範圍第21項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,其中,該人源化抗體包含選自以下的重鏈和輕鏈:1)SEQ ID NO:28的重鏈和SEQ ID NO:30的輕鏈,和2)SEQ ID NO:32的重鏈和SEQ ID NO:30的輕鏈。
- 一種醫藥組成物,其含有治療有效量的根據申請專利範圍第1至24項中任一項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段,以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
- 一種編碼根據申請專利範圍第1至24項中任一項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段的DNA分子。
- 一種含有根據申請專利範圍第26項所述的DNA分子的表達載體。
- 一種用根據申請專利範圍第27項所述的表達載體轉化的宿主細胞,該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。
- 如申請專利範圍第28項所述的表達載體轉化的宿主細胞,該宿主細胞為真核細胞。
- 如申請專利範圍第28項所述的表達載體轉化的宿主細胞,該宿主細胞為哺乳動物細胞。
- 一種申請專利範圍第1至24項中任一項所述的PCSK9抗體或其抗原結合片段、或申請專利範圍第28項所述的醫藥組成物,在製備用於治療PCSK9介導的疾病或病症的藥物中的用途。
- 如申請專利範圍第31項所述的用途,其中,該疾病或病症為膽固醇相關疾病。
- 如申請專利範圍第31項所述的用途,其中,該疾病或病症為高膽固醇血症、心臟病、代謝綜合症、糖尿病、冠狀動脈心臟病、中風、心血管疾病、阿爾茨海默病和一般性的異常脂血症。
- 如申請專利範圍第31項所述的用途,其中,該疾病或病症為高膽固醇血症、異常脂血症、動脈粥樣硬化、CVD或冠狀動脈心臟病。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201511024618.2 | 2015-12-31 | ||
CN201511024618 | 2015-12-31 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW201725216A TW201725216A (zh) | 2017-07-16 |
TWI735499B true TWI735499B (zh) | 2021-08-11 |
Family
ID=59224496
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW105143912A TWI735499B (zh) | 2015-12-31 | 2016-12-29 | Pcsk9抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10793643B2 (zh) |
JP (1) | JP7032662B2 (zh) |
KR (1) | KR20180093068A (zh) |
CN (1) | CN107406511B (zh) |
AU (1) | AU2016382932B2 (zh) |
BR (1) | BR112018013256A2 (zh) |
CA (1) | CA3009904A1 (zh) |
HK (1) | HK1244828A1 (zh) |
MX (1) | MX2018007925A (zh) |
RU (1) | RU2739208C2 (zh) |
TW (1) | TWI735499B (zh) |
WO (1) | WO2017114230A1 (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020532491A (ja) * | 2017-06-30 | 2020-11-12 | 江▲蘇▼恒瑞医▲薬▼股▲フン▼有限公司Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | Pcsk−9抗体を含む医薬組成物及びその使用 |
CN110981962B (zh) * | 2019-12-19 | 2022-07-12 | 中国药科大学 | Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其应用 |
TW202144436A (zh) | 2020-03-19 | 2021-12-01 | 大陸商江蘇恒瑞醫藥股份有限公司 | 膽固醇相關疾病的治療方法 |
CN114369164A (zh) * | 2020-10-15 | 2022-04-19 | 苏州君盟生物医药科技有限公司 | 抗pcsk9单克隆抗体的生产工艺 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090122352A1 (en) * | 2004-05-18 | 2009-05-14 | Silverbrook Research Pty Ltd | Computer system incorporating a target and symbol data sensing arrangement |
Family Cites Families (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993022332A2 (en) | 1992-04-24 | 1993-11-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells |
US6277375B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobulin-like domains with increased half-lives |
EP1355919B1 (en) | 2000-12-12 | 2010-11-24 | MedImmune, LLC | Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof |
US7658921B2 (en) | 2000-12-12 | 2010-02-09 | Medimmune, Llc | Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof |
US7572618B2 (en) * | 2006-06-30 | 2009-08-11 | Bristol-Myers Squibb Company | Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants |
JOP20080381B1 (ar) | 2007-08-23 | 2023-03-28 | Amgen Inc | بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9) |
AR070315A1 (es) * | 2008-02-07 | 2010-03-31 | Merck & Co Inc | Anticuerpos 1b20 antagonistas de pcsk9 |
TWI516501B (zh) * | 2008-09-12 | 2016-01-11 | 禮納特神經系統科學公司 | Pcsk9拮抗劑類 |
JO3672B1 (ar) * | 2008-12-15 | 2020-08-27 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9). |
AR079336A1 (es) | 2009-12-11 | 2012-01-18 | Irm Llc | Antagonistas de la pro-proteina convertasa-subtilisina/quexina tipo 9 (pcsk9) |
BR112012022917A2 (pt) | 2010-03-11 | 2017-01-10 | Pfizer | anticorpos com ligação a antígeno dependente de ph |
WO2012054438A1 (en) | 2010-10-22 | 2012-04-26 | Schering Corporation | Anti-pcsk9 |
US20140121123A1 (en) | 2010-10-29 | 2014-05-01 | Kevin Caili Wang | Methods for diversifying antibodies, antibodies derived therefrom and uses thereof |
MA34818B1 (fr) | 2010-12-22 | 2014-01-02 | Genentech Inc | Anticorps anti-pcsk9 et procédés d'utilisation |
BR112013018740A2 (pt) | 2011-01-28 | 2019-01-08 | Sanofi Sa | anticorpos humanos para pcsk9 para uso em métodos de tratamento de grupos específicos de indivíduos |
CN103562227B (zh) | 2011-02-11 | 2016-12-21 | 诺瓦提斯公司 | Pcsk9拮抗剂 |
JOP20200043A1 (ar) * | 2011-05-10 | 2017-06-16 | Amgen Inc | طرق معالجة أو منع الاضطرابات المختصة بالكوليسترول |
WO2012168491A1 (en) | 2011-06-10 | 2012-12-13 | Novartis Ag | Pharmaceutical formulations of pcsk9 antagonists |
WO2012170607A2 (en) | 2011-06-10 | 2012-12-13 | Novartis Ag | Use of pcsk9 antagonists |
EP2731623A1 (en) | 2011-07-14 | 2014-05-21 | Pfizer Inc | Treatment with anti-pcsk9 antibodies |
AR087305A1 (es) | 2011-07-28 | 2014-03-12 | Regeneron Pharma | Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit |
CN103930444B (zh) | 2011-09-16 | 2020-08-04 | 瑞泽恩制药公司 | 用前蛋白转化酶枯草溶菌素-9(PCSK9)抑制剂降低脂蛋白(a)水平的方法 |
AR087715A1 (es) * | 2011-09-16 | 2014-04-09 | Lilly Co Eli | Anticuerpos anti pcsk9 y usos de los mismos |
EP2794661B1 (en) | 2011-12-20 | 2019-03-06 | Adaerata, Limited Partnership | Single domain antibodies as inhibitors of pcsk9 |
WO2013148284A1 (en) | 2012-03-29 | 2013-10-03 | Genentech, Inc. | Antibodies that bind to a pcsk9 cleavage site and methods of use |
US9255154B2 (en) | 2012-05-08 | 2016-02-09 | Alderbio Holdings, Llc | Anti-PCSK9 antibodies and use thereof |
US20150140005A1 (en) | 2012-05-17 | 2015-05-21 | Cyon Therapeutics Inc. | Methods and Uses for Proprotein Convertase Subtilisin Kexin 9 (PCSK9) Inhibitors |
RU2015101113A (ru) * | 2012-06-15 | 2016-08-10 | Дженентек, Инк. | Антитела против pcsk9, составы, дозы и способы применения |
EP2970501A2 (en) * | 2013-03-15 | 2016-01-20 | Amgen, Inc. | Human antigen binding proteins that bind to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 |
CN105001336A (zh) * | 2014-04-18 | 2015-10-28 | 上海复旦张江生物医药股份有限公司 | Pcsk9拮抗剂 |
WO2015200438A1 (en) * | 2014-06-24 | 2015-12-30 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | High affinity antibodies against pcsk9 |
CN104861071B (zh) * | 2015-04-27 | 2019-04-12 | 南京师范大学 | 针对pcsk9的全人源单克隆抗体的可变区基因及其应用 |
CN105037554B (zh) * | 2015-06-12 | 2019-04-12 | 成都贝爱特生物科技有限公司 | 抗人pcsk9抗体的制备及其用途 |
-
2016
- 2016-12-20 US US16/066,567 patent/US10793643B2/en active Active
- 2016-12-20 RU RU2018125003A patent/RU2739208C2/ru active
- 2016-12-20 MX MX2018007925A patent/MX2018007925A/es unknown
- 2016-12-20 JP JP2018533863A patent/JP7032662B2/ja active Active
- 2016-12-20 KR KR1020187020978A patent/KR20180093068A/ko not_active Application Discontinuation
- 2016-12-20 CA CA3009904A patent/CA3009904A1/en active Pending
- 2016-12-20 BR BR112018013256-0A patent/BR112018013256A2/zh active Search and Examination
- 2016-12-20 CN CN201680013073.1A patent/CN107406511B/zh active Active
- 2016-12-20 AU AU2016382932A patent/AU2016382932B2/en active Active
- 2016-12-20 WO PCT/CN2016/111053 patent/WO2017114230A1/zh active Application Filing
- 2016-12-29 TW TW105143912A patent/TWI735499B/zh active
-
2018
- 2018-04-02 HK HK18104378.4A patent/HK1244828A1/zh unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090122352A1 (en) * | 2004-05-18 | 2009-05-14 | Silverbrook Research Pty Ltd | Computer system incorporating a target and symbol data sensing arrangement |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3398968A1 (en) | 2018-11-07 |
US20190016825A1 (en) | 2019-01-17 |
RU2739208C2 (ru) | 2020-12-21 |
TW201725216A (zh) | 2017-07-16 |
HK1244828A1 (zh) | 2018-08-17 |
MX2018007925A (es) | 2018-08-29 |
AU2016382932B2 (en) | 2022-12-08 |
RU2018125003A (ru) | 2020-02-03 |
EP3398968A4 (en) | 2019-08-07 |
US10793643B2 (en) | 2020-10-06 |
KR20180093068A (ko) | 2018-08-20 |
CA3009904A1 (en) | 2017-07-06 |
CN107406511A (zh) | 2017-11-28 |
WO2017114230A1 (zh) | 2017-07-06 |
CN107406511B (zh) | 2021-01-19 |
JP2019509254A (ja) | 2019-04-04 |
RU2018125003A3 (zh) | 2020-05-13 |
JP7032662B2 (ja) | 2022-03-09 |
AU2016382932A1 (en) | 2018-07-19 |
BR112018013256A2 (zh) | 2018-12-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11780923B2 (en) | PD-L1 antibody, antigen-binding fragment thereof and medical application thereof | |
RU2757813C2 (ru) | Антитело против lag-3, его антигенсвязывающий фрагмент и их фармацевтическое применение | |
WO2018095428A1 (zh) | Cd47抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
EP3689909A1 (en) | Tigit antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical use thereof | |
WO2018177393A1 (zh) | B7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
WO2015085847A1 (zh) | Pd-1抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
WO2019091449A1 (zh) | Cd96抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
TWI735499B (zh) | Pcsk9抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 | |
WO2018153366A1 (zh) | Tim-3抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
CN114829395B (zh) | 抗angptl3抗体及其应用 | |
CN109963877B (zh) | Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
JP2022535810A (ja) | 抗結合組織成長因子抗体およびその適用 | |
EP3398968B1 (en) | Pcsk9 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medicinal application thereof | |
RU2819228C2 (ru) | Антитело против фактора роста соединительной ткани и его применение | |
RU2807484C2 (ru) | Антитело к pd-1, его антигенсвязывающий фрагмент и его фармацевтическое применение |