CN110981962B - Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其应用 - Google Patents

Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型高活性抗人PCSK9抗体、其抗原结合片段及其应用。本发明以人PCSK9为抗原，通过杂交瘤技术获得抗人PCSK9抗体杂交瘤细胞，并从中克隆得到鼠源抗人PCSK9抗体可变区氨基酸序列，在此基础上采用CDR‑graft技术构建抗PCSK9人源化抗体，再通过体外亲和力成熟获得新型的、高活性、高亲和力抗人PCSK9人源化抗体。本发明所述抗体可特异性结合人PCSK9，有效抑制PCSK9介导的肝细胞表面低密度脂蛋白受体的降解，显著增强肝细胞对低密度脂蛋白胆固醇的摄取，可应用于制备预防和治疗PCSK9介导的包括高胆固醇血症、高血脂症、糖尿病、肥胖症、动脉粥样硬化以及心脑血管疾病等相关疾病的药物。

Description

PCSK9抗体、其抗原结合片段及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种抗人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proproteinconvertase subtilisin/kexin 9,PCSK9)的抗体、其抗原结合片段及其医药用途。
背景技术
心血管疾病(CVD)是目前严重危害人类健康的主要疾病之一。临床数据显示，血浆低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平异常升高是诱发CVD的主要危险因素(Nature reviews Disease primers 2017,3:17093)。人体血液中LDL-C的清除则主要通过肝细胞表面低密度脂蛋白受体(low-density lipoproteinreceptor,LDLR)来完成，LDL-C与LDLR 结合后形成LDL-C/LDLR复合物进入溶酶体，LDL-C被降解，而LDLR重新回到细胞膜表面循环利用。
前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是一种由692个氨基酸组成的糖蛋白，属前蛋白转化酶(proprotein convertases,PCs)家族中的第九个成员，是一种分泌型丝氨酸蛋白酶，主要在肝脏和肠道等组织中表达，然后分泌到血液中(J Biol Chem.2004；279(47):48865-48875；Trends Biochem Sci.2007；32(2):71-77)。PCSK9进入血液循环后可与肝细胞表面LDLR的表皮生长因子样结构域特异性结合，引导其进入肝细胞到达溶酶体，使LDLR在溶酶体中降解，从而导致肝细胞表面LDLR减少，进而降低肝脏结合和清除LDL-C的能力，最终导致血液中LDL-C 水平升高(Proc Natl Acad Sci U S A.2008；105(35):13045-13050)。因此，PCSK9已成为治疗高胆固醇血症的重要治疗靶点,通过抑制PCSK9可以治疗高胆固醇血症及其相关的并发症如脂肪肝、动脉粥样硬化等疾病(Annu Rev PharmacolToxicol.2014；54:273-293；J Clin Lipidol. 2016；10:1073-80)。
除此之外，最新研究显示,PCSK9升高与肥胖及2型糖尿病(Pediatr Diabetes2017,18(8): 755-760；Diabetes Metab Res Rev 2016,32(2):193-199.)密切相关，也与肾病综合症及蛋白尿等慢性肾病(Int Urol Nephrol 2017,49(6):1015-1024)密切相关，因此，通过抑制PCSK9可以成为预防和治疗这些与PCSK9升高相关疾病的重要手段。
目前已有多种PCSK9抑制剂处于研发阶段或已获批上市成为治疗高胆固醇血症的药物, 主要有以下几种：(1)单克隆抗体和模拟肽，原理是阻断PCSK9与LDLR的结合，如赛诺菲/ 再生元研发的Alirocumab以及安进研发的Evolocumab抗PCSK9单克隆抗体已于2015年获得美国FDA批准上市；(2)小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)和反义寡核苷酸，原理是通过基因沉默作用来抑制PCSK9的生物合成；(3)小分子物质等(Nature ReviewsDrug Discovery 2012,11(5):367-383)。
Figure BDA0002325591350000011
和Milstein发明的杂交瘤技术可制备特异性靶向目标抗原的单克隆抗体，其基本原理是将小鼠免疫后的脾细胞与人骨髓瘤细胞进行融合，从而获得既具有脾细胞分泌抗体能力又具有骨髓瘤细胞体外连续传代特性的杂交瘤细胞。然而，杂交瘤细胞制备的单抗在临床应用中会诱发人抗鼠抗体反应(human anti-mouse antibody reaction,HAMA)，因此，为了降低其免疫原性需要对其进行人源化改造，具体可将鼠源抗体互补决定区(complementarity determining regions,CDR)移植到同源性最高的人源抗体框架区(framework region,FR)上，同时保留鼠源FR 区对维持CDR区空间构象至关重要的氨基酸残基(Proteins 2012,80(3):896-912)。杂交瘤细胞制备的单抗除了需要降低HAMA反应外，其亲和力通常也无法达到临床治疗需要，因此可以模拟体细胞高频突变和克隆选择过程对其进行亲和力体外成熟。由于体细胞高频突变主要发生在抗体CDR区，可以通过丙氨酸扫描定点突变技术对CDR区氨基酸残基进行扫描突变，并确定其亲和力变化，从而筛选出参与抗体-抗原相互作用的必须氨基酸残基和可突变氨基酸残基，最终筛选获得亲和力提高的高活性突变体(mAbs 2011,3(3):479-486)。
本发明公开了一种新型高活性抗人PCSK9的人源化单克隆抗体，它可有效抑制PCSK9 对肝细胞表面LDLR的降解，显著增强肝细胞LDLR水平和对LDL-C的吸收功能，在预防和治疗高胆固醇血症、脂肪肝、动脉粥样硬化等疾病以及其它与PCSK9升高相关的疾病如肥胖、2 型糖尿病、肾病等方面具有重要潜在药用价值。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的上述技术问题，本发明提供了一种新型高活性抗人PCSK9 人源化抗体，它可有效抑制PCSK9对肝细胞表面LDLR的降解，显著增强肝细胞LDLR水平和对LDL-C的吸收功能，可应用于制备预防和治疗高胆固醇血症、脂肪肝、动脉粥样硬化等疾病以及其它与PCSK9升高相关的疾病如肥胖、2型糖尿病以及肾病综合症及蛋白尿等疾病的药物。
技术方案：本发明公开了一种PCSK9抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含至少一个选自如SEQ ID NO：6-8所示氨基酸序列的重链可变区。
进一步的，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的重链CDR1,SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的重链CDR2，SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的重链CDR3,或者它们在重链CDR1、CDR2和/或CDR3中具有一个或多个氨基酸经过置换、缺失、添加或者修饰后得到的变异体。
本发明还公开了一种PCSK9抗体或其抗原结合片段，其包含至少一个选自如SEQID NO： 9-11所示氨基酸序列的轻链可变区。
进一步的，所述抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的轻链CDR1，SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的轻链CDR2，SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的轻链 CDR3,或者它们在轻链CDR1、CDR2和/或CDR3中具有一个或多个氨基酸经过置换、缺失、添加或者修饰后得到的变异体。
优选的，本发明所述PCSK9抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：6-8所示氨基酸序列的重链可变区，和如SEQ ID NO：9-11所示氨基酸序列的轻链可变区。
进一步的，本发明所述PCSK9抗体或其抗原结合片段，其VH CDR1、CDR2和CDR3分别具有如SEQ ID NO：6-8所示的氨基酸序列，且其VL CDR1、CDR2和CDR3分别具有如SEQ IDNO:9-11所示的氨基酸序列。
本发明所述一种PCSK9抗体或其抗原结合片段，包括选自如SEQ ID NO.3所示或与其具有至少85％序列同一性的重链可变区。
进一步的，包括选自如SEQ ID NO.4所示或与其具有至少85％序列同一性的轻链可变区。
具体的，本发明所述PCSK9抗体或其抗原结合片段，包含选自SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.12、 SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列，或者包含选自与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.12、 SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
上述PCSK9抗体或其抗原结合片段选自如下结构形式：全长抗体、Fab、F(ab’)、F(ab’)2、 Fv、scFv、双链抗体、微抗体、双特异抗体、多特异抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、重链可变区和完整轻链融合的抗体功能性片段VH-L和一个或多个CDR的排列、串联或组合而成的抗体功能性片段。
本发明还提供了一种能够产生所述PCSK9抗体或其抗原结合片段的杂交瘤细胞株5E12，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:C2019323，地址：武汉市武汉大学，保藏时间：2019年12月12日。
本发明还提供了一种编码上述PCSK9抗体或其抗原结合片段的DNA分子，以及含有所述 DNA分子的表达载体，以及用该表达载体转化的宿主细胞。
本发明还提供了一种含有上述PCSK9抗体或其抗原结合片段的抗体偶联物、试剂盒或者药物组合物。
其中，所述抗体偶联物包括上述PCSK9抗体或抗原结合片段以及偶联部分。其中，所述偶联部分为化学药物或毒素或可检测的标记；所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
进一步优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述抗PCSK9抗体或抗原结合部分；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
本发明还公开了上述PCSK9抗体或其抗原结合片段在制备治疗高胆固醇血症、高血脂症、糖尿病、肥胖症、动脉粥样硬化以及心脑血管疾病等相关疾病药物中的应用。
本申请采用杂交瘤技术，以重组人PCSK9蛋白为免疫抗原，多次免疫Balb/c小鼠，取免疫后小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，多轮筛选获得可表达高亲和力抗人PCSK9抗体的杂交瘤细胞株5E12，该细胞株表达抗人PCSK9单克隆抗体mAb5E12。对该单克隆抗体可变区编码基因进行DNA测序，并经NCBI_blastn在线服务器和DNASTAR软件分析后得到该抗体重、轻链可变区核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，其对应的重、轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4。
采用CDR移植技术(CDR-grafting)对单克隆抗体mAb5E12进行人源化改造。首先依据抗体mAb5E12可变区氨基酸序列，设计得到如SEQ ID NO：5所示的抗人PCSK9鼠源单链抗体 m5E12scFv氨基酸序列。根据kabat原则确定该鼠源抗体的CDR区和FR区，得到其重链CDR1 、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO： 11。然后，通过CDR-grafting技术对m5E12scFv进行人源化改造，设计得到如SEQ ID NO：12 和SEQID NO：13所示的抗人PCSK9的人源化单链抗体h5E12scFv和其回复突变单链抗体h5E12scFv-bm氨基酸序列。在此基础上，借助计算机辅助设计技术同源模建鼠源单链抗体m5E12scFv以及人源化单链抗体h5E12scFv和h5E12scFv-bm三维结构，并计算结构间的均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)，由此在计算机水平判断该人源化设计是否改变鼠源抗体CDR区构象，最终得到CDR区构象未改变的抗人PCSK9人源化单链抗体h5E12scFv和 h5E12scFv-bm。通过竞争性ELISA检测抗原结合特异性，结果显示m5E12scFv、h5E12scFv和 h5E12scFv-bm均可与mAb5E12竞争性结合PCSK9抗原，说明它们与mAb5E12具有相同抗原识别位点。此外，在细胞水平采用Western Blot及LDL-C吸收功能性实验结果证明，人源化单链抗体h5E12scFv可显著抑制PCSK9介导的LDLR降解，增强肝细胞对LDL-C的吸收，其生物学活性明显优于h5E12scFv-bm。说明抗体FR区人源化改造并未改变CDR区构象。
采用丙氨酸扫描定点突变技术(alanine scanning mutagenesis)对抗人PCSK9人源化单链抗体 h5E12scFv进行体外亲和力成熟。首先通过one-step质粒定点突变技术，对抗体h5E12scFv的 CDR-H3和CDR-L3关键氨基酸位点进行丙氨酸扫描，构建各位点被丙氨酸替代的单链抗体突变体，表达纯化后与PCSK9抗原共同处理HepG2细胞，通过LDL吸收细胞功能实验检验其抑制PCSK9介导的LDLR降解的生物活性，结果显示第230位Leu突变为Ala后生物活性明显升高，说明第230位Leu是影响抗体-抗原亲和力但又不是抗体和抗原结合所必须的氨基酸残基。在此基础上，对第230位Leu进行饱和定点突变，并确定其活性变化，同时与阳性对照 Ali-scFv(阳性药Alirocumab的单链抗体，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，由阳性药 Alirocumab的VH、VL通过柔性连接肽(GGGGS)3连接而成)做比较。由此筛选出第230位Leu 突变为Ala、Ser或Gly后抑制PCSK9的生物活性明显提高的三个单链抗体h5E12scFv-L230A、 h5E12scFv-L230S、h5E12scFv-L230G(其氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，第230位X分别代表Ala、Ser、Gly氨基酸残基)。其中，h5E12scFv-L230S抑制PCSK9的生物学活性高于阳性药Alirocumab的单链抗体Ali-scFv，而h5E12scFv-L230A及h5E12scFv-L230G的生物学活性与Ali-scFv相当。
采用重叠延伸聚合酶链式反应(overlap extension polymerase chainreaction)分别将抗人 PCSK9人源化单链抗体h5E12scFv、h5E12scFv-L230A、h5E12scFv-L230S、h5E12scFv-L230G的可变区与人源抗体IgG1亚型的的恒定区连接，构建抗人PCSK9人源化全长抗体h5E12、 h5E12-L230A、h5E12-L230S、h5E12-L230G。然后采用悬浮细胞CHO-3E7表达全长抗体h5E12、 h5E12-L230A、h5E12-L230S、h5E12-L230G。表达纯化后与PCSK9抗原共同处理HepG2细胞，通过LDL吸收细胞功能实验检验四种抗体抑制PCSK9介导的LDLR降解的生物活性，结果显示(图8)，四种抗人PCSK9全长抗体中，h5E12-L230G组LDL吸收水平最高，与阳性对照 Alirocumab组相当。
有益效果：本发明提供了一种高活性抗人PCSK9人源化单链抗体及其活性功能片段或变体或全长化抗体，以及其在制备诊断、预防和治疗高血脂症、动脉粥样硬化、心脑血管疾病、脂肪肝及其它与PCSK9升高相关的疾病如肥胖、2型糖尿病、肾病综合症及蛋白尿等慢性肾病药物中的应用。
附图说明
图1：抗人PCSK9鼠源单克隆抗体mAb5E12亚型鉴定示意图；
图2：鼠源和人源化单链抗体同源模建构象图；
图3：竞争性ELISA分析鼠源及人源化单链抗体的抗原结合特异性，其中:*p<0.05,vs mAb5E12 group；***p<0.001,vs mAb5E12 group；n＝3,means±SEM；
图4：Western Blot检测PCSK9抗原单独或者分别联合m5E12scFv、h5E12scFv和h5E12scFv-bm抗体处理HepG2细胞后细胞总LDLR表达水平，其中:**p<0.01,vs PCSK9group；***p<0.001,vs PCSK9 group；n＝3,means±SEM；
图5：抗人PCSK9单链抗体m5E12scFv、h5E12scFv和h5E12scFv-bm对HepG2细胞吸收LDL的影响，其中，**p<0.01,vs PCSK9 group；***p<0.001,vs PCSK9 group；n＝3,means±SEM；
图6：丙氨酸扫描定点突变技术确定h5E12scFv的CDR-H3和CDR-L3区影响抗体-抗原相互作用的关键氨基酸残基；
图7：抗人PCSK9单链抗体h5E12scFv第230位饱和定点突变后对HepG2细胞吸收LDL的影响，(n＝3,means±SEM)；
图8：抗人PCSK9全长抗体h5E12、h5E12-L230A、h5E12-L230S和h5E12-L230G对HepG2 细胞吸收LDL的影响，###表示与空白对照组比较p<0.001；***表示与PCSK9组比较p<0.001,(n＝5, means±SEM)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明。以下实施例中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。
实施例1抗人PCSK9单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备
将50μL浓度为400μg/mL由CHO 3E7细胞(南京金斯瑞生物科技有限公司)表达的重组人PCSK9抗原与Quickantibody-Mouse 5W佐剂(北京康碧泉生物科技有限公司)等体积迅速混匀。按产品说明书方法肌肉注射免疫6-8周龄雌性Balb/c小鼠(南京市江宁区青龙山动物养殖场)3次。免疫结束后，采用间接ELISA检测血清效价，效价达到1:640000。取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag14(来源于上海中国科学院细胞库)按5:1混匀后，离心弃上清，缓慢加入 1mL 37℃预温的PEG-1450(SIGMA-ALDRICH)促融，静置2min。缓慢加入10mL 37℃预温的无血清培养基终止PEG促融作用，37℃反应8min。此外，在细胞融合前一天从8周龄健康ICR 小鼠(南京市江宁区青龙山动物繁殖场)腹腔中抽取巨噬细胞，HAT选择性培养基(SIGMA-ALDRICH)重悬后按每孔接种1×104个细胞(体积为100ul)至96孔板中，培养过夜制备饲养层细胞。融合细胞加入至5块铺有饲养层细胞的96孔板中，融合第4天可观察到256个孔中出现细胞克隆团，计算融合率为53％。融合后第5天进行HAT半换液，第7天HAT全换液，第10天改用HT培养基(SIGMA-ALDRICH)培养。待细胞克隆团汇合度达40％时进行 ELISA检测，阳性杂交瘤孔40个。经过三次亚克隆、ELISA筛选后，最终得到1株杂交瘤细胞株，根据所在孔板位置命名为5E12，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:C2019323，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏时间：2019年12月12日。
实施例2抗人PCSK9单克隆抗体mAb5E12的制备和纯化
采用体内诱生法大量制备单克隆抗体。首先将0.5mL约1×106个5E12杂交瘤细胞注射接种于Balb/c小鼠(南京市江宁区青龙山动物繁殖场)腹腔内，杂交瘤细胞不断分泌抗体于腹水中， 7-10天后小鼠腹腔明显肿大，此时采集腹水，并于4℃下6500rpm离心20min。取上清用PBS 缓冲液稀释10倍并调整pH至7.4，0.22μm微孔滤膜过滤后，上样至0.01M磷酸盐缓冲液预平衡的HiTrap Protein A HP(GE Healthcare)亲和层析预装柱(柱体积1mL,上样流速0.5mL/min)，然后用0.01M磷酸盐缓冲液洗去非特异性杂蛋白，再用0.1M柠檬酸缓冲液(pH3.0)洗脱目的蛋白，收集液用1M Tris盐酸缓冲液(pH9.0)进行中和，得到纯化的抗人PCSK9单克隆抗体 mAb5E12。
实施例3抗人PCSK9单克隆抗体mAb5E12亚型鉴定
采用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(武汉三鹰生物技术有限公司)对单克隆抗体 mAb5E12进行亚型鉴定。酶标板上预包被了针对小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgM、 Kappa、Lambda的特异性抗体，具体依据产品说明书所述操作方法进行鉴定，结果显示(图1)，抗人PCSK9单克隆抗体mAb5E12为IgG1亚类，Kappa型。
实施例4抗人PCSK9单克隆抗体mAb5E12重、轻链可变区基因克隆及序列测定
首先收集对数生长期的杂交瘤细胞5E12，利用RNA提取试剂盒(TaKaRa)提取总RNA， RT-PCR逆转录试剂盒(TaKaRa)反转录合成cDNA。然后根据已鉴定的抗体mAb5E12亚型设计重、轻链可变区引物(见表1)，其中VH-F(上游引物)和VH-R(下游引物)扩增重链可变区， VL-F(上游引物)和VL-R(下游引物)扩增轻链可变区，上、下游引物分别含有Hind III和EcoR I(下划线标记)酶切位点。以cDNA为模板，按照Taq Plus DNA Polymerase(TaKaRa)说明书设置 PCR反应体系和循环参数，扩增重、轻链可变区基因，经Hind III和EcoR I双酶切后分别克隆到质粒载体pUC19中，得到重链可变区基因重组质粒pUC19-VH和轻链可变区基因重组质粒pUC19-VL，DNA序列测定得到单克隆抗体mAb5E12重链可变区核苷酸序列(SEQID NO：1)，及mAb5E12轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：2)，其对应的重、轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4。
表1扩增抗体mAb5E12重、轻链可变区简并引物
Figure BDA0002325591350000061
简并密码子说明:R＝A/G；Y＝C/T；M＝A/C；S＝C/G；W＝A/T；N＝A/T/C/G
实施例5抗人PCSK9单克隆抗体mAb5E12的人源化设计
在已克隆的鼠源单克隆抗体mAb5E12的基础上，将其VH和VL通过(GGGGS)3柔性肽连接，设计出鼠源抗人PCSK9单链抗体m5E12scFv(氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示)，并以该序列为模板进行人源化改造。
1.CDR移植技术构建抗人PCSK9人源化单链抗体
采用CDR移植(CDR-grafting)技术(Proteins 2012,80(3):896-912.)对单克隆抗体mAb5E12进行人源化改造。首先利用NCBI_Blastp分别对鼠源抗体mAb5E12的VH、VL氨基酸序列进行序列比对，各自筛选出鼠源打分最高的100个IgG1、Kappa氨基酸序列。将mAb5E12的VH、 VL氨基酸序列分别和NCBI_Blastp筛选出的序列通过Bioedit进行多序列比对，分析各区域的相似性，结合IMGT在线服务器以及NCBI_Igblast在线服务器的分区结果，定义鼠源抗体 mAb5E12的重、轻链FR区和CDR区。由此得到m5E12scFv重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，其轻链CDR1、CDR2 和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示。
将鼠源单抗mAb5E12重链CDRs区移植到同源性最高的人源抗体重链FRs区(GenBank:AMK70123.1)上，轻链CDRs区移植到同源性最高的人源抗体轻链FRs区(GenBank:APZ85158.1)上，VH、VL通过柔性连接肽(GGGGS)3连接，从而设计出抗人PCSK9 人源化单链抗体h5E12scFv氨基酸序列，如SEQ ID NO：12所示。然后通过Schrodinger、MOE 、Protean等软件以及Epitopia、UCL等在线服务器对鼠源单链抗体m5E12scFv的氨基酸序列进行表位扫描分析、氨基酸表面可及性分析、结构比对分析来筛选出鼠源抗体FR区可能影响 CDR区构象的16个关键氨基酸残基(见表2)，对这些氨基酸残基进行回复突变(back-mutating)，设计抗人PCSK9人源化单链抗体回复突变体h5E12scFv-bm，其氨基酸序列如SEQID NO：13 所示。
表2重、轻链可变区关键氨基酸残基
Figure BDA0002325591350000062
Figure BDA0002325591350000071
2.单链抗体同源模建
首先依据m5E12scFv、h5E12scFv、h5E12scFv-bm氨基酸序列，通过Schrodinger软件同源模建其三维构象。然后利用Gromacs软件对其结构进行分子动力学优化，得到精确的单链抗体三维模型。最后利用MOE软件比较m5E12scFv、h5E12scFv和h5E12scFv-bm的RMSD值，提取三种抗体结构的CDR区构象进行比较，固定原m5E12scFv的空间位置，以C-α位移为标准，计算出三种抗体结构的
Figure BDA0002325591350000072
因此可近似认为是同一个结构。三种单链抗体空间构象如图2所示，其中，图2A为m5E12scFv构象图，图2B为h5E12scFv构象图，图2C 为h5E12scFv-bm构象图，图2D为m5E12scFv、h5E12scFv和h5E12scFv-bm三种抗体构象重叠图，这三种构象间的
Figure BDA0002325591350000073
说明三者可近似认为是同一个结构。由此说明，基于m5E12scFv的结构，在维持CDR构象的基础上，已成功设计了抗人PCSK9人源化单链抗体。
实施例6单链抗体原核表达质粒的构建、表达和纯化
1.单链抗体原核表达质粒的构建
(1)依据实施例4中已构建的重组质粒pUC19-VH和pUC19-VL中的鼠源单抗mAb5E12重、轻链可变区基因序列，设计引物(见表3)。以mVH-F(上游引物)和mVH-R(下游引物)扩增m5E12scFv重链可变区，以mVL-F(上游引物)和mVL-R(下游引物)扩增m5E12scFv轻链可变区。然后以扩增产物为模板，按照PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TaKaRa)说明书设置反应体系和循环参数，采用重叠延伸PCR技术扩增获得m5E12scFv基因片段。
(2)h5E12scFv和h5E12scFv-bm编码基因人工合成后分别构建了重组质粒 pUC19-h5E12scFv和pUC19-h5E12scFv-bm。在此基础上，以pUC19-h5E12scFv和 pUC19-h5E12scFv-bm重组质粒为模板，设计加端引物(见表3)，按照PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TaKaRa)说明书设置反应体系和循环参数，分别扩增获得h5E12scFv和 h5E12scFv-bm基因片段。
表3单链抗体PCR扩增引物表
Figure BDA0002325591350000074
Figure BDA0002325591350000081
注：m:鼠源抗体m5E12scFv引物；h:人源化抗体h5E12scFv引物；bm:人源化抗体h5E12scFv-bm引物。在重链上游引物5’端添加Nco I酶切位点和保护碱基,重链下游引物5’端添加(GGGGS)3柔性肽碱基序列；在轻链上游引物5’端添加(GGGGS)3柔性肽碱基序列,轻链下游引物5’端添加his-tag标签、Hind III酶切位点和保护碱基。
(3)分别将PCR扩增获得的上述m5E12scFv、h5E12scFv和h5E12scFv-bm基因片段经Nco I/Hind III双酶切后插入原核表达载体pET27b(Novagen)，构建成pET27b-m5E12scFv、pET27b-h5E12scFv、pET27b-h5E12scFv-bm重组表达质粒，并转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)(生工生物工程有限公司)中进行摇瓶表达。于16℃经0.2mM IPTG诱导表达18h后，离心收集菌体，超声破壁后，破壁液上清经Ni离子亲和层析(GE Healthcare)、超滤管浓缩及Superdex 75(GE Healthcare)分子筛柱层析后获得纯化的单链抗体蛋白，用于后续生物活性分析。
实施例7抗人PCSK9人源化单链抗体抗原结合特异性检测及生物活性分析
1.竞争性ELISA分析单链抗体的抗原结合特异性
竞争性ELISA可用来检测抗人PCSK9人源化单链抗体是否与鼠源单抗mAb5E12结合至抗原的同一表位，其原理为：全长抗体mAb5E12带有恒定区，可结合HRP-conjugated羊抗鼠二抗，HRP催化底物成为有色产物，显色程度与mAb5E12的量成正比。单链抗体h5E12scFv、h5E12scFv-bm及m5E12scFv不含恒定区，若它们与全长鼠源单抗mAb5E12竞争结合PCSK9抗原同一表位，则与抗原结合的mAb5E12的量会减少，显色程度也会减弱。具体步骤如下：用包被缓冲液稀释PCSK9抗原至终浓度5μg/mL，200μL/孔，4℃过夜孵育；PBS清洗三次后，加入5％BSA封闭液(200μL/孔)，37℃封闭2h；用PBS洗三次后，mAb5E12单独或者分别与m5E12scFv、h5E12scFv、h5E12scFv-bm共同作为一抗结合PCSK9抗原，37℃孵育2h(每组给药方式见表4)；PBS洗三次后，加入HRP-conjugated羊抗鼠二抗(生工生物工程有限公司)， 37℃孵育1h；PBS洗三次后，加入TMB进行显色反应。结果如图3所示，由此证明m5E12scFv 、h5E12scFv和h5E12scFv-bm与mAb5E12具有相同的抗原识别位点，它们可与mAb5E12竞争性结合PCSK9抗原。其中，h5E12scFv-bm虽然也可与mAb5E12竞争性结合PCSK9，但是结合能力较h5E12scFv弱。由此说明，抗体FR区的改变并没有改变CDR区构象。
表4 ELISA鉴定单链抗体特异性实验分组
Figure BDA0002325591350000082
2.人源化单链抗体对PCSK9降解肝细胞LDLR的影响
本实验基于检测单链抗体阻断PCSK9介导的HepG2细胞(来源于上海中国科学院细胞库) 表面LDLR降解水平来判断其生物活性。具体步骤如下：培养HepG2细胞至对数生长期，按照1×106cells/孔的密度接种至6孔板，500μL/孔，37℃过夜培养；次日，将原培养基替换成不含血清的Opti-MEM培养基(Gibco)继续于37℃培养2h；将HepG2细胞分为6组，每组给药方式见表5；培养12h后弃去培养液上清，每孔加100μL裂解液提取细胞总蛋白，WesternBlot检测HepG2细胞LDLR的降解情况，结果见图4。采用Image J分析灰度值进行统计分析结果显示，抗PCSK9人源化单链抗体h5E12scFv、h5E12scFv-bm均可抑制PCSK9介导的LDLR 降解，但h5E12scFv具有更高的抑制活性。
表5 Western Blot检测HepG2细胞总LDLR数量的变化实验分组
Figure BDA0002325591350000091
3.人源化单链抗体对HepG2细胞摄取LDL的影响
培养HepG2细胞至对数生长期，按照3×105cells/mL的密度接种至96孔板，100μL/孔， 37℃过夜培养；次日，将原培养基替换成不含血清的Opti-MEM培养基继续于37℃培养12h；将HepG2细胞分为7组，当晚给药，每组给药方式见表6；第三天上午稀释适量体积的Dil-LDL 溶液至2μg/μL，每孔加入1μL稀释液，继续避光培养4h；PBS洗两次后，检测相对荧光单位值(Relative fluorescenceunits,RFU),，并进行数据统计，结果表明(图5)，抗PCSK9人源化单链抗体h5E12scFv、h5E12scFv-bm均可抑制PCSK9引起的HepG2细胞摄取LDL水平的下降，但h5E12scFv抑制活性更高。尽管如此，h5E12scFv抑制PCSK9的活性仍略低于阳性药 Alirocumab的单链抗体Ali-scFv。Ali-scFv氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，由Alirocumab 的VH、VL通过柔性连接肽(GGGGS)3连接而成，其编码基因人工合成后可通过实施例6所述方法构建pET27b-Ali-scFv重组表达质粒，然后表达纯化获得。阳性药Alirocumab是由赛诺菲和再生元联合研发的抗人PCSK9单克隆抗体药物，已获美国FDA批准上市。
为了进一步提高h5E12scFv生物学活性，后续实验将对h5E12scFv进行进一步亲和力成熟实验。
表6 HepG2细胞摄取LDL水平的变化实验分组
Figure BDA0002325591350000092
Figure BDA0002325591350000101
实施例8抗人PCSK9人源化单链抗体h5E12scFv体外亲和力成熟
1.筛选h5E12scFv中影响抗体-抗原相互作用的关键氨基酸残基
(1)构建人源化单链抗体h5E12scFv的CDR3区丙氨酸扫描突变体
筛选出影响抗体-抗原亲和力但又不是抗体和抗原结合所必须的氨基酸残基位点是抗体亲和力成熟的关键(PLoS One.2015；10:e0134600)。单链抗体包含6个CDR区，按照参与抗体-抗原相互作用的程度而言，通常CDR3>CDR2>CDR1，故优先通过丙氨酸扫描定点突变技术筛选 h5E12scFv(氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示)的VH和VL的CDR3区关键氨基酸残基。为此，首先确定CDR3区拟突变氨基酸残基，由于Tyr、Trp、Asn和Ser常参与抗原识别，故对Tyr 、Trp、Asn和Ser以外的氨基酸残基进行丙氨酸扫描，拟突变位点见表7；然后根据突变位点设计部分重叠引物(见表8)，将拟突变位点氨基酸密码子突变为丙氨酸密码子(GCT/GCC/GCA/GCG)，具体步骤如下：以pET27b-h5E12scFv为模板进行one-step PCR，按照PrimeSTAR Max DNApolymerase(TaKaRa)说明书设置反应体系和循环参数，定点突变扩增全长质粒，然后扩增产物经Dpn I(TaKaRa)于37℃消化2h后，分别转化至宿主菌E.coliBL21(DE3)中，采用实施例6中所述方法进行表达和纯化，获得10个h5E12scFv CDR3区丙氨酸扫描突变体蛋白，包括h5E12scFv-F99A、h5E12scFv-H100A、h5E12scFv-D102A、h5E12scFv-D104A、h5E12scFv-F106A、h5E12scFv-D107A、h5E12scFv-R227A、h5E12scFv-P229A 、h5E12scFv-L230A和h5E12scFv-T231A。
表7 h5E12scFv CDR-H3和CDR-L3拟突变位点统计表
Figure BDA0002325591350000102
表8 h5E12scFv CDR-H3和CDR-L3定点突变引物表
Figure BDA0002325591350000103
Figure BDA0002325591350000111
(2)LDL摄取细胞实验筛选影响抗体-抗原相互作用的关键氨基酸残基
通过HepG2细胞摄取LDL功能性实验，对上述10个h5E12scFv的CDR3区丙氨酸扫描突变体抑制PCSK9的生物学活性进行检测，方法同实施例7。结果显示(图6)，抗体h5E12scFv第230位Leu突变为Ala后抑制PCSK9降低HepG2细胞摄取LDL的活性增强，说明该位点是影响抗体-抗原亲和力但又不是抗体和抗原结合所必须的氨基酸残基；抗体h5E12scFv第107 位Asp突变为Ala后抑制PCSK9降低HepG2细胞摄取LDL的活性丧失，说明该位点是抗体和抗原结合所必须的氨基酸残基。因此，后续实验将把第230位Leu进一步突变为其余18种氨基酸残基，并检测其活性变化，从而筛选出最适合该位点的氨基酸残基。
2.人源化单链抗体h5E12scFv第230位点饱和定点突变及高活性突变体筛选
以pET27b-h5E12scFv-L230A质粒为模板进行h5E12scFv第230位Leu饱和定点突变，突变引物见表9，按照PrimeSTAR Max DNA polymerase(TaKaRa)说明书设置反应体系和循环参数，定点突变扩增全长质粒，构建h5E12scFv CDR3第230位除Ala和Leu以外的18个突变体表达质粒。扩增产物经Dpn I(TaKaRa)于37℃消化2h后，分别转化至宿主菌E.coliBL21(DE3) 中。于16℃，0.2mM IPTG诱导摇瓶表达18h后，离心收集菌体，破壁上清经Ni离子亲和层析纯化后，超滤管浓缩，再利用Superdex 75色谱柱进一步纯化，得到纯化的目的蛋白，用于活性分析。
表9 h5E12scFv-L230饱和定点突变引物表
Figure BDA0002325591350000121
Figure BDA0002325591350000131
通过HepG2细胞摄取LDL的功能性实验(方法同实施例7)，对人源化单链抗体h5E12scFv 及其它19个第230位Leu分别被不同氨基酸替代的突变体进行活性检测。结果显示(图7)，第 230位Leu分别被Ala、Ser、Gly替代后所得到的突变体h5E12scFv-L230A、h5E12scFv-L230S和 h5E12scFv-L230G抑制PCSK9的生物学活性较h5E12scFv显著提高。突变体h5E12scFv-L230S 抑制PCSK9的生物学活性高于阳性对照Ali-scFv(阳性药Alirocumab的单链抗体，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，由阳性药Alirocumab的VH、VL通过柔性连接肽(GGGGS)3连接而成)， h5E12scFv-L230A及h5E12scFv-L230G抑制PCSK9的生物学活性与阳性对照Ali-scFv相当。
人源化单链抗体h5E12scFv第230位Leu分别被Ala、Ser、Gly等氨基酸替代后所得到的突变体h5E12scFv-L230A、h5E12scFv-L230S和h5E12scFv-L230G等突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，其中第230位Xaa分别代表Ala、Ser、Gly等其它氨基酸残基。
实施例9抗人PCSK9人源化全长抗体的真核表达质粒的构建、表达和纯化
编码全长抗体的基因由3部分组成：信号肽，可变区，恒定区。信号肽是位于蛋白N-端的5-30个氨基酸，是影响分泌蛋白表达的重要因素。抗人PCSK9人源化全长抗体重、轻链信号肽氨基酸序列分别为SEQ ID NO：16(GenBank:CAA34971.1)、SEQ ID NO：17(GenBank:S24320))。依据人源化单链抗体h5E12scFv、h5E12scFv-L230A、h5E12scFv-L230S和h5E12scFv-L230G可变区序列，结合人源化抗体IgG1恒定区序列(重、轻链恒定区核苷酸序列分别为SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19，其对应的重、轻链恒定区氨基酸序列分别为SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21)，采用同一套引物(见表10)扩增编码人源化全长抗体h5E12、 h5E12-L230A、h5E12-L230S、h5E12-L230G的重、轻链基因序列。以H-F1/H-R1、H-F2/H-R2 引物对分别扩增重链可变区、恒定区基因序列，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：22；以扩增产物为模板，选择H-F0/H-R2引物对，采用重叠延伸PCR技术扩增重链全长基因序列 common-H(h5E12、h5E12-L230A、h5E12-L230S、h5E12-L230G四种抗体重链由同一组基因序列编码)，重链全长氨基酸序列为SEQ ID NO：23。以L-F1/L-R1、L-F2/L-R2引物对分别扩增轻链可变区、恒定区基因序列，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：24，其中第96位Xaa 分别代表Leu、Ala、Ser、Gly等其它氨基酸残基；以扩增产物为模板，选择L-F0/L-R2引物对，采用重叠延伸PCR技术分别扩增轻链全长基因序列h5E12-L、h5E12-L230A-L、 h5E12-L230S-L、h5E12-L230G-L，轻链全长氨基酸序列为SEQ ID NO：25，其中第118位Xaa 分别代表Leu、Ala、Ser、Gly等其它氨基酸残基。重、轻链全长基因片段经EcoR I/Hind III 双酶切后插入真核表达载体pTT5(Novagen)，构建pTT5-common-H、pTT5-h5E12-L、 pTT5-h5E12-L230A-L、pTT5-h5E12-L230S-L、pTT5-h5E12-L230G-L重组表达质粒。重、轻链重组表达质粒共转染悬浮细胞CHO 3E7表达全长抗体，表达产物依次采用protein A亲和层析柱和superdex 200分子筛进行纯化。
表10单链抗体全长化PCR扩增引物
Figure BDA0002325591350000141
实施例10抗人PCSK9人源化全长抗体对HepG2细胞摄取LDL的影响
通过HepG2细胞摄取LDL的功能性实验(方法同实施例7)，对人源化全长抗体h5E12、 h5E12-L230A、h5E12-L230S、h5E12-L230G进行活性检测。重复5次实验，结果显示(图8)，四种抗人PCSK9全长抗体中，h5E12-L230G组LDL吸收水平最高，与阳性对照Alirocumab 组相当。全长抗体结果结合图7单链抗体结果表明：全长抗体抑制PCSK9介导LDLR降解，促进LDL吸收的能力与单链抗体基本一致。
实施例11抗人PCSK9人源化全长抗体体内降LDL-C活性分析
选择C57BL/6J雄性小鼠，采用尾静脉高压注射人PCSK9重组表达质粒构建高血脂模型[Liu F,et al.GENE THERAPY,1999,6:1258-1266]，即5s内对每只小鼠(均重20g)尾静脉注射2mL (体重10％)含50μg pEE12.4-PCSK9重组质粒的生理盐水溶液，使人PCSK9在小鼠体内过表达造模，正常对照组给予2mL生理盐水。造模后第6天，模型组分为2组，其中一组(n＝6) 摘眼球取血用于检测造模效果，另一组(n＝6)尾静脉给予100ul生理盐水，而正常对照组(n＝6) 尾静脉给予100ul生理盐水。造模后第6天，阳性药Alirocumab组和h5E12-L230G抗体组均设立高、中、低3个剂量组(n＝6)，分别按10、3、1mg/kg剂量尾静脉注射给药(给药容积 100ul)。给药后对小鼠禁食不禁水饲养18h，然后摘眼球采集血样并取肝脏。血样放置于4℃冰箱4h后，4000rpm/min离心15min，小心吸取血清，按照试剂盒说明书(南京建成生物工程研究所)方法测定各组小鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。结果(表11)显示，h5E12-L230G抗体可剂量依赖性显著降低小鼠血浆中LDL-C水平，其治疗效果与阳性对照药Alirocumab相当。
表11抗PCSK9全长抗体对高血脂模型小鼠血浆胆固醇LDL-C、TC的影响
Figure BDA0002325591350000151
“n“表示动物数；“###“表示和正常对照组相比，P<0.001；”*“、”**“、”***“分别表示和模型对照组相比，P<0.05、P<0.01、P<0.001(n＝6，values are means±SEM)。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> PCSK9抗体、其抗原结合片段及应用
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 357
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
gaagttcagc tggagcagtc aggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta cactttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagcgg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggagag attaatccta gcaacggtcg tactgaccac 180
agtgagaagt tcaagaacaa ggccacactg actgttgaca aatcctccac cacagcctac 240
ttgcaactca gcagcctgac atccgaggac tcttcggtct attactgtgc aaggttccac 300
tatgattacg actactttga ttactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357
<210> 2
<211> 321
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 2
gatattgtga tcacccagtc tacaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
gtcacctgca aggccagtcg gaatgtgggt aatagtgtag gctggtatca acagaaacca 120
gggcaatctc ctaaaatatt gatttattcg gcatcctacc ggtacagtgg ggtccatgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240
gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacaggt atccgctcac gttcggtgaa 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 3
Glu Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asp His Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe His Tyr Asp Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Thr Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asn Val Gly Asn Ser
20 25 30
Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ile Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val His Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 5
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asp His Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe His Tyr Asp Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Thr Lys Phe
130 135 140
Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser
145 150 155 160
Arg Asn Val Gly Asn Ser Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
165 170 175
Ser Pro Lys Ile Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val
180 185 190
His Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Asn Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Leu Glu Leu
225 230 235 240
Lys His His His His His His
245
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 7
Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asp His Ser Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 8
Phe His Tyr Asp Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 9
Lys Ala Ser Arg Asn Val Gly Asn Ser Val Gly
1 5 10
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 10
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 11
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 12
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asp His Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe His Tyr Asp Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
130 135 140
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
145 150 155 160
Arg Asn Val Gly Asn Ser Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
165 170 175
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val
180 185 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Asn Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
225 230 235 240
Lys His His His His His His
245
<210> 13
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asp His Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe His Tyr Asp Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Thr Ser Ser
130 135 140
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
145 150 155 160
Arg Asn Val Gly Asn Ser Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
165 170 175
Ala Pro Lys Ile Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val
180 185 190
His Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Asn Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Val Glu Ile
225 230 235 240
Lys His His His His His His
245
<210> 14
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys His Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ser Asn Trp Gly Asn Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu
130 135 140
Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln
145 150 155 160
Ser Val Leu Tyr Arg Ser Asn Asn Arg Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr
180 185 190
Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys His His His His His His
245 250
<210> 15
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (230)
<223> Xaa分别代表Ala、Ser、Gly等其它氨基酸残基
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asp His Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe His Tyr Asp Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
130 135 140
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
145 150 155 160
Arg Asn Val Gly Asn Ser Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
165 170 175
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val
180 185 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Asn Arg Tyr Pro Xaa Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
225 230 235 240
Lys His His His His His His
245
<210> 16
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val Gln Ser
<210> 17
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Ser Gly Ala Arg Cys
20
<210> 18
<211> 987
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
gccagcacaa agggcccatc cgtgttccct ctggccccta gctccaagag cacctctggc 60
ggcaccgctg ccctgggctg cctggtgaag gattacttcc cagagcctgt gaccgtgagc 120
tggaatagcg gcgctctgac atctggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtccagc 180
ggactgtact ccctgagctc tgtggtgaca gtgcctagtt ctagtctggg cacacagaca 240
tacatctgta acgtgaacca caagccttct aacaccaagg tggataagaa ggtggagcct 300
aagagctgcg ataagaccca cacctgtcct ccctgtcctg ccccagaggc cgccggagga 360
cctagcgtgt ttctgttccc acctaagcct aaggacacac tgatgatcag cagaacccct 420
gaggtgacat gtgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggatc ctgaggtgaa gtttaattgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgct aagaccaagc ctagagagga gcagtacggc 540
agcacctaca gggtggtgtc tgtgctgaca gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 600
gaatataagt gcaaggtgtc taacaaggcc ctgcctgccc ctatcgagaa gaccattagc 660
aaggctaagg gccagcctag agagcctcag gtgtacacac tgcctcctag cagggatgag 720
ctgaccaaga accaggtgag cctgacttgc ctggtgaagg gcttctaccc atctgatatc 780
gccgtggagt gggagtctaa cggacagcct gagaacaact acaagaccac acctcctgtg 840
ctggatagcg atggctcttt cttcctgtac tctaagctga cagtggataa gagcagatgg 900
cagcagggca acgtgttctc ctgtagcgtg atgcatgagg ccctgcataa ccactacacc 960
cagaagtctc tgagcctgtc tcctggc 987
<210> 19
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
agaaccgtgg ccgctccaag cgtgttcatc tttccaccct ctgacgagca gctgaagtcc 60
ggaaccgcct ccgtggtgtg cctgctgaac aacttctacc ctcgcgaggc caaggtgcag 120
tggaaggtgg ataacgctct gcagagcggc aattctcagg agtccgtgac cgagcaggac 180
agcaaggatt ctacatattc cctgagctct accctgacac tgtctaaggc cgattacgag 240
aagcacaagg tgtatgcttg cgaggtgacc catcagggcc tgtccagccc agtgacaaag 300
tcctttaata ggggcgagtg t 321
<210> 20
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 22
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asp His Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe His Tyr Asp Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asp His Ser
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe His Tyr Asp Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly
465
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (96)
<223> Xaa分别代表Leu、Ala、Ser、Gly等其它氨基酸残基
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asn Val Gly Asn Ser
20 25 30
Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Xaa
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (118)
<223> Xaa分别代表Leu、Ala、Ser、Gly等其它氨基酸残基
<400> 25
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Arg Asn Val Gly Asn Ser Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Tyr Asn Arg Tyr Pro Xaa Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235

Claims (7)

1.一种PCSK9抗体或其抗原结合片段，其特征在于，PCSK9抗体的重链可变区的CDR1-3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6-8所示，轻链可变区的CDR1-3的氨基酸序列分别为SEQIDNO:9-11所示。
2.根据权利要求1所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括如SEQ IDNO.3所示的重链可变区和如SEQ ID NO.4所示的轻链可变区。
3.根据权利要求1或2所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段选自如下结构形式：全长抗体、Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、scFv、微抗体、多特异抗体、嵌合抗体或CDR移植抗体。
4.产生PCSK9抗体或其抗原结合片段的杂交瘤细胞株5E12，其特征在于，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C2019323。
5.一种编码权利要求1-3中任一所述PCSK9抗体或其抗原结合片段的DNA分子，以及含有所述DNA分子的表达载体，以及用该表达载体转化的宿主细胞。
6.一种含有权利要求1-3中任一所述PCSK9抗体或其抗原结合片段的抗体偶联物、试剂盒或者药物组合物。
7.权利要求1-3中任一所述PCSK9抗体或其抗原结合片段在制备治疗高血脂症药物中的应用。
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