CN112480254B - 抗人白细胞介素-33受体的抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

抗人白细胞介素-33受体的抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种抗人IL‑33R抗体以及其制备方法和应用。本申请的抗人IL‑33R抗体能够与hIL‑33R特异性结合，具有良好的抑制KU812细胞分泌IL‑5的效果，可应用于治疗IL‑33R相关疾病，例如免疫介导的炎症性疾病。

Description

抗人白细胞介素-33受体的抗体及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及抗体领域，更具体地，本申请涉及抗白细胞介素-33R的抗体及其制备方法和应用。
发明背景
特应性皮炎(Atopic dermatitis，AD)是一种常见的慢性炎症性疾病，以瘙痒性皮肤病变为特征，在发达国家成年人口中有很大比例(高达10％)受到影响。越来越多的证据表明，它与其他过敏性疾病如哮喘和食物过敏有关。AD也是一个称为特应性三月的过程的一部分，从AD发展为过敏性鼻炎和哮喘。哮喘也是一种最常见的呼吸道疾病，机体对外在或内在的过敏原或非过敏原等产生应答，临床上表现为反复的阵发性胸闷及呼吸困难，严重哮喘发作甚至会危及生命。临床研究证实，Th2型细胞因子是过敏型及非过敏嗜酸性粒细胞型哮喘疾病发生发展的重要介导因子。
白细胞介素(interlukin，IL)-33，是属于IL-1家族的一种与炎症相关的细胞因子。白细胞介素-33受体(IL-33R)是IL-33的结合受体，它在许多涉及病理炎症的多种细胞类型上表达。这些细胞包括淋巴细胞，特别是表达IL-5和IL- 13的T辅助细胞、自然杀伤细胞(NK)和自然杀伤T细胞(NKT)，以及许多所谓的先天免疫细胞。在这些细胞上结合到IL-33R的IL-33导致广泛表达的联合受体(即IL-1R辅助蛋白(ACP))的募集和促炎信号的激活，类似于IL-1和 IL-18。IL-33诱导的细胞反应的例子包括炎症细胞因子的产生，如IL-5、IL-6、 IL-13、TNF、IFN-γ。IL-33对先天性和适应性免疫细胞的促炎作用最终促进了许多病理过程。在肺部，这些症状包括气道炎症增加、粘液分泌、气道高反应性和纤维化重塑。IL-33还可以通过促进促炎性细胞因子的产生，促进关节局部炎症以及皮肤和关节的高伤害。通过其对嗜碱性细胞和IgE致敏肥大细胞的有效作用，IL-33也可引发过敏性休克，在过敏性疾病中发挥作用。这些疾病中的许多是慢性的和渐进性的，难以治疗，需要更有效的治疗。
基因和功能研究已经在患者和动物模型中证明了IL-33及其受体IL-33R在特应性皮炎发生、发展中的中心作用。通过调节各种关键免疫细胞，IL-33在过敏性炎症疾病(包括AD和过敏性哮喘)中发挥关键作用，，多个临床前模型证实当其活性被药理学或遗传学方法阻断时，过敏反应显著降低。文中所用的参比抗体RG6149来自于专利US2014/0004107A1，目前正处于临床二期阶段，适应症为哮喘和特应性皮炎。
本领域已有能结合IL-33R的抗体，例如US2017/0066831A1、 US2014/0004107A1、US9637535B2、US2012/0213774A1中所公开的。本发明旨在开发高亲和力结合IL-33R的抗体，以更高效能中和IL-33R活性，阻断IL-33R 介导的病理反应。有望用于治疗多种过敏性炎症疾病(包括AD、哮喘、类风湿关节炎和过敏性鼻炎)。
发明内容
本申请的发明人进行了大量试验，得到了一组可以通过特异性阻断IL-33与细胞表面IL-33受体(IL-33R)结合从而阻断IL33信号传导的单克隆抗体，其能够阻断IL-33R介导的生物学活性。
第一方面，本申请提供了一种特异性结合IL-33R的抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含HCDR3序列，任选地还包含HCDR1 和/或HCDR2序列。在一些实施方案中，上述HCDR1序列包含选自SEQ ID NOs： 41，47，53，59，65，71，77，83，89和95的氨基酸序列。在一些实施方案中，上述HCDR2序列包含选自SEQ ID NOs：42，48，54，60，66，72，78，84，90 和96的氨基酸序列。在一些实施方案中，上述HCDR3序列包含选自SEQ IDNOs：43，49，55，61，67，73，79，85，91和97的氨基酸序列。
在一些实施方案中，上述重链可变区包含与选自SEQ ID NOs：2，6，10，14， 18，22，26，30，34和38的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，或者所述重链可变区包含选自SEQ ID NOs：2，6，10，14，18，22，26，30，34和 38的氨基酸序列。
在一些实施方案中，特异性结合IL-33R的抗体或其抗原结合部分还包含轻链可变区，其中所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和/或LCDR3序列。在某些实施方案中，所述LCDR1序列包含选自SEQ ID NOs：44，50，56，62，68， 74，80，86，92和98的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述LCDR2序列包含选自SEQ ID NOs：45，51，57，63，69，75，81，87，93和99的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述LCDR3序列包含选自SEQ ID NOs：46，52，58，64， 70，76，82，88，94和100的氨基酸序列。
在一些实施方案中，上述轻链可变区包含与选自SEQ ID NOs：4，8，12，16， 20，24，28，32，36和40的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；或者所述轻链可变区包含选自SEQ ID NOs：4，8，12，16，20，24，28，32，36和 40的氨基酸序列。
在一些实施方案中，特异性结合IL-33R的抗体或其抗原结合部分的重链包含选自SEQ ID NOs：103，109，115和121的氨基酸序列或者与上述序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。任选地，所述抗体或其抗原结合部分的轻链包含选自SEQ ID NOs：106，112，118和124的氨基酸序列或者与上述序列具有至少 80％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一方面所述特异性结合IL-33R的抗体为鼠源单克隆抗体。
在一些实施方案中，第一方面所述特异性结合IL-33R的抗体为人源化抗体。
在一些实施方案中，本文公开的IL-33R抗体或其抗原结合部分与抗体35H、 53H、54H、82H或结合IL-33R上的相同表位，或者与35H、53H、54H、82H竞争结合于IL-33R。其中所述抗体35H的重链序列如SEQ ID NO：103所示，轻链序列如SEQ ID NO：106所示；以及所述抗体53H的重链序列如SEQ ID NO： 109所示，轻链序列如SEQ ID NO：112所示；以及所述抗体54H的重链序列如 SEQ ID NO：115所示，轻链序列如SEQ ID NO：118所示；以及所述抗体82H的重链序列如SEQ ID NO：121所示，轻链序列如SEQ ID NO：124所示。
本文公开的抗体或其抗原结合部分能够抑制KU812细胞的IL-5分泌。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分以小于150pM、优选为小于21pM的 Kd结合于IL-33R。
第二方面，本申请提供了一种核苷酸分子，所述核苷酸分子编码如上所述的特异性结合IL-33R的抗体或其抗原结合部分。
第三方面，本申请提供了一种表达载体，所述表达载体含有如上所述的核苷酸分子。
在一些实施方案中，所述表达载体为pTT5、pUC57、pDR1、pcDNA3.1(+)、 pDHFF或pCHO 1.0等。
第四方面，本申请提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的表达载体。在一些实施方案中，所述宿主细胞为HEK293、COS、CHO、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1等。
第五方面，本申请提供了一种制备第一方面所述的特异性结合IL-33R的抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在使得第四方面所述的宿主细胞能够产生所述抗体或其抗原结合部分的表达条件下，培养所述的宿主细胞，从而表达所述抗体或其抗原结合部分；以及
b)分离并纯化a)表达的所述抗体或其抗原结合部分。
第六方面，本申请提供了一种药物组合物，所述组合物包含第一方面所述的抗IL-33R抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，所述组合物用于治疗IL-33R相关的疾病。
第七方面，本申请提供了第一方面所述的抗IL-33R抗体或其抗原结合部分、或第六方面所述的组合物在制备用于预防或治疗IL-33R相关疾病，例如免疫介导的炎症反应或炎症性疾病的药物中的应用。
本申请的抗IL-33R抗体或其抗原结合部分能够特异性与IL-33R结合，具有以下的一种或多种效应：阻断IL-33与IL-33R的结合；抑制KU812细胞的IL-5 分泌。本申请的抗IL-33R抗体或其抗原结合部分可以用于预防或治疗IL-33R相关疾病，例如免疫介导的炎症性疾病。
附图说明
图1为建株鼠源抗人IL-33R单克隆抗体对人IL-33R结合的测定结果。
图2为建株鼠源抗人IL-33R单克隆抗体对hIL-33结合hIL-33R的阻断的实验结果。
图3为优选人源化抗人IL-33R单克隆抗体对hIL-33结合hIL-33R的阻断的实验结果。
图4为优选人源化的抗人IL-33R单克隆抗体抑制KU812细胞分泌IL-5的实验结果。
具体实施方式
本申请提供了特异性结合于IL-33R的新的抗IL-33R抗体或其抗原结合部分。在优选实施方案中，本申请的抗体或其抗原结合部分以高亲和力结合于人IL- 33R且抑制IL-33R的活性。本申请还提供了编码该抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、制备和纯化该抗体的方法以及所述抗体或其抗原结合片段的医学和生物学应用，例如预防或治疗IL-33R相关疾病或病症。本申请还涵盖使用所述抗体或其抗原结合片段来检测IL-33R及调节IL-33R活性的方法。
为容易地理解本申请，首先定义本文中使用的某些术语。
本文所用术语“抗体”指包含四条多肽链，即通过双硫键互连的两条重链(H) 链及两条轻链(L)的免疫球蛋白分子，以及其多聚体(例如IgM)。各重链包含重链可变区(缩写为VH)及重链恒定区(缩写为CH)。重链恒定区包含三个域，即CH1、 CH2及CH3。各轻链包含轻链可变区(缩写为VL)及轻链恒定区(缩写为CL)。轻链恒定区包含一个域(CL1)。VH及VL区可进一步细分成称为互补决定区(CDR) 的高变区，其中穿插有称为构架区(FR)的保守区。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区段。抗原结合域可以包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)或上述两者。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术从完整抗体分子制备，所述标准技术包括蛋白水解消化或重组遗传工程化技术等。抗原结合部分的非限制性实例包括：Fab片段；F(ab′)2片段；Fd片段；Fv片段；单链Fv(scFv)分子；单域抗体；dAb片段及由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如分离的CDR)。术语“抗原结合部分”也包括其它工程化的分子，如双抗体、三抗体、四抗体及微型抗体等。
如本文所用，术语“重链可变区(VH)”及“轻链可变区(VL)”分别指单一抗体可变重链及轻链区，其包含FR1、2、3及4及CDR 1、2及3。
本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即kabat定义和Chothia定义。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定VH和VL序列中CDR区序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR序列。在本文中，重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3分别简称为HCDR1、HCDR2及HCDR3；轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3分别简称为LCDR1、LCDR2及LCDR3。
对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中CDR区序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http：//www.abysis.org/)。
如本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合，例如抗体以比其对非特异性抗原的亲和性大至少两倍的亲和性结合于特异性抗原的能力。然而应了解，抗体能够特异性结合于两种或更多其序列相关的抗原。例如，本发明的抗体可特异性结合于人类与非人类(例如非人类灵长动物)的IL-33R。
本文所用术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和 /或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要具有所期望的生物学活性。
如本文所用，术语“同源性”被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同的残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同源性。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。本文所述的“至少80％同源性”是指同源性为80％至100％中的任一值，例如85％、90％、95％、99％等。
如本文所用，术语“IL-33R相关疾病”包括与IL-33R信号通路激活相关的疾病和/或症状。示例性IL-33R相关疾病或病症包括免疫介导的炎症反应，例如特应性皮炎、哮喘等。
一方面，本申请提供了特异性结合IL-33R的抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和/或轻链可变区。下表1-5中示例性列出了适用于本申请公开的抗体的CDR、VH、VL、重链和轻链氨基酸序列及对应的核苷酸序列。在某些实施方案中，抗IL-33R抗体或其抗原结合部分包含HCDR3、HCDR2或HCDR1 序列，其独立地选自表1中所示的HCDR3、HCDR2或HCDR1序列中任一者。在某些实施方案中，本申请的抗IL-33R抗体可进一步包含轻链CDR，其独立地选自表2中所示的轻链CDR1、CDR2或CDR3序列中任一者。举例而言，本申请的抗IL-33R抗体可包含表3和4中所示的重链可变域中的任一者，任选地与表3和4中所示的轻链可变域中的任一者配对。
表1：示例性鼠源抗人IL-33R抗体的重链CDR氨基酸序列
Figure SMS_1
Figure SMS_2
表2：示例性鼠源抗人IL-33R抗体的轻链CDR氨基酸序列
Figure SMS_3
表3：示例性鼠源抗人IL-33R抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列
Figure SMS_4
表4：示例性人源化抗人IL-33R抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列
Figure SMS_5
Figure SMS_6
表5：示例性人源化抗人IL-33R抗体的重链和轻链的氨基酸序列
Figure SMS_7
在一些实施方案中，在一些实施方案中，上述HCDR1序列包含选自SEQ ID NOs：41，47，53，59，65，71，77，83，89和95的氨基酸序列。在一些实施方案中，上述HCDR2序列包含选自SEQ ID NOs：42，48，54，60，66，72，78， 84，90和96的氨基酸序列。在一些实施方案中，上述HCDR3序列包含选自SEQ ID NOs：43，49，55，61，67，73，79，85，91和97的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，HCDR3选自SEQ ID NOs：43，49，55，61，67，73， 79，85，91和97所示的氨基酸序列。在优选的实施方案中，HCDR3选自61， 73，79和91所示的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，HCDR2选自SEQ ID NOs：42，48，54，60，66，72， 78，84，90和96所示的氨基酸序列。在优选的实施方案中，HCDR2选自60， 72，78和90所示的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，HCDR1选自SEQ ID NOs：41，47，53，59，65，71， 77，83，89和95所示的氨基酸序列。在优选的实施方案中，HCDR1选自59， 71，77和89所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体重链可变区包含选自SEQ ID NOs：2， 6，10，14，18，22，26，30，34和38的氨基酸序列。在具体的实施方案中，所述重链可变区由选自SEQID NOs：2，6，10，14，18，22，26，30，34和38的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本文公开的抗体重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NOs：2，6，10，14，18，22，26，30，34和38所示序列具有至少80％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同源性。在优选的实施方案中，所述重链可变区与SEQID NOs：102，108，114或120所示的氨基酸序列具有99％以上的同源性。
本文公开的抗体或其抗原结合部分在包含重链可变区的基础上还可以进一步包含轻链可变区。
在一些实施方案中，所述轻链可变区的LCDR3选自SEQ ID NOs：46，52， 58，64，70，76，82，88，94和100所示的氨基酸序列。在优选的实施方案中， LCDR3选自SEQ ID NOs：64，76，82和94所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR2选自SEQ ID NOs：45，51，57，63，69，75， 81，87，93和99所示的氨基酸序列。在优选的实施方案中，LCDR2选自SEQ ID NOs：63，75，81和93所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR1选自SEQ ID NOs：44，50，56，62，68，74， 80，86，92和98所示的氨基酸序列。在优选的实施方案中，LCDR1选自SEQ ID NOs：62，74，80和92所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体轻链可变区包含选自SEQ ID NOs：4， 8，12，16，20，24，28，32，36和40的氨基酸序列。在具体的实施方案中，所述轻链可变区由选自SEQID NOs：4，8，12，16，20，24，28，32，36和40的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本文公开的抗体轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NOs：4，8，12，16，20，24，28，32，36和40所示序列具有至少80％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同源性。在优选的实施方案中，所述轻链可变区与SEQID NOs：105，111，117或123所示序列具有99％以上的同源性。
在一些实施方案中，本文公开的抗体的重链或重链可变区、轻链或轻链可变区可以在上述所列举的各自对应的具体氨基酸序列的基础上取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且得到的突变体仍保持结合IL-33R的活性。
在某些实施方案中，上述氨基酸取代、缺失或添加的数目为1-30个，优选为1-20个，更优选为1-10个。在优选的实施方案中，序列变体与原氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。在更优选的实施方案中，序列变体与原氨基酸序列相差约1、2、3、4或5个氨基酸的取代、缺失或添加。在具体的实施方案中，所述氨基酸取代为保守性取代。
在优选的实施方案中，本文公开的抗体为抗体35H，53H，54H或82H。其中所述抗体35H的重链序列如SEQ ID NO：103所示，轻链序列如SEQ ID NO：106所示；以及所述抗体53H的重链序列如SEQ ID NO：109所示，轻链序列如 SEQ ID NO：112所示；以及所述抗体54H的重链序列如SEQ ID NO：115所示，轻链序列如SEQ ID NO：118所示；以及所述抗体82H的重链序列如SEQ ID NO：121所示，轻链序列如SEQ ID NO：124所示。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合部分与抗体35H，53H， 54H或82H结合人白细胞介素-33R上的相同表位，或者与35H，53H，54H，82H 竞争结合于人白细胞介素-33R。
在一些的实施方案中，本文公开的抗体为单克隆抗体。在具体的实施方案中，本文公开的抗体为人源化的抗体。
本文公开的抗体或其抗原结合部分能够特异性结合IL-33R。在具体的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合人IL-33R或猴IL-33R。在优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合人IL-33R。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合部分能够抑制KU812分泌IL-5。
例如，本申请的发明人对本文公开的抗人IL-33R单克隆抗体进行了体外、体内生物学实验，结果表明此抗体能够很好地与IL-33R进行结合。
具体地，本申请的发明人对抗人IL-33R单克隆抗体进行了结合检测、阻断 IL-33与IL-33R结合的实验分析、体外细胞功能检测等实验。实验结果表明，本文公开的抗人IL-33R单克隆抗体可以结合IL-33R，阻断IL-33与IL-33R之间的信号传导，抑制了炎症反应的发生。
本申请还提供了编码本文公开的抗体或其抗原结合部分的核苷酸分子、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、以及制备和纯化该抗体的方法。
在一些实施方案中，编码所述抗体或其抗原结合部分的核苷酸分子可操作地连接到调控序列，调控序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。
在一些实施方案中，任何合适的表达载体都可以用于本申请。例如，所述表达载体可以为pTT5、pUC57、pDR1、pcDNA3.1(+)、pDHFF及pCHO 1.0中的一种。表达载体中可以包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。
在一些实施方案中，可用的宿主细胞为含有上述表达载体的细胞，可以是真核细胞，如哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统均可用于本申请的抗体或其抗原结合部分的表达。例如，HEK293细胞、COS、CHO、NS0、sf9及sf21等均可适用于本发明。所述宿主细胞也可以为含有上述表达载体的原核细胞，例如可以为 DH5α、BL21(DE3)或TG1等。
在一些实施方案中，本文公开的抗人IL-33R单克隆抗体的制备方法包括：在表达条件下，培养宿主细胞，从而表达抗人IL-33R单克隆抗体；分离和纯化表达的抗人IL-33R单克隆抗体。利用上述方法，可以将重组蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。
在一些实施方案中，可以利用亲和层析的方法对本文公开的抗人IL-33R抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的抗人IL-33R抗体。
在一些实施方案中，本文公开的人源化的抗人IL-33R单克隆抗体是通过以下方法得到的：利用实验室制备的hIL-33R抗原免疫Balb/c小鼠，在多次免疫小鼠滴度较高后取小鼠脾细胞与杂交瘤细胞融合并筛选出具有抑制IL-33R功能活性的杂交瘤细胞株。更具体地，本申请的发明人通过大量实验，首先分别表达了 hIL-33R抗原、hIL-33，在此基础上利用不同的佐剂与IL-33R抗原混合免疫小鼠，然后进一步将上述小鼠的脾细胞与杂交瘤细胞株sp2/0融合，融合后的杂交瘤利用IL-33R抗原筛选出阳性细胞株，在验证其对IL-33与IL-33R结合的阻断并确实抑制IL-33R的功能后获得目标细胞株。将目标分子进行人源化改造后，将轻链和重链基因同时克隆到真核表达载体pTT5中。将上述表达载体通过瞬时转染HEK293细胞，用无血清培养基培养生产抗体，用Protein A亲和柱分离或纯化人源化的抗人IL-33R单克隆抗体。
在另外一些实施方案中，可以使用本领域的常规技术，例如PCR诱变进一步改变鼠源的亲本抗体来产生抗体的嵌合或人源化形式或其他变异形式。本申请的亲本抗体可以在例如抗原互补决定区(CDR)结构域内被诱变来产生变异抗体，可筛选其目的性质的存在，例如结合亲和力(更低的KD)、IC50、特异性、优先结合等等。优选地，变异抗体中目的性质是相对于亲本抗体中性质的改善。优选氨基酸替代变异抗体，并且亲本抗体分子的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或 10个氨基酸残基被去除且在它的位置上插入不同的残基。用于替代诱变的最感兴趣的位点是一个或更多个CDR区，但是也考虑框架区(FR)改变。优选保守的氨基酸替代，也可引入非保守氨基酸改变并用获得的变异抗体筛选目的性质。
本申请还提供了抗IL-33R抗体、或者包含抗IL-33R抗体的组合物在制备用于预防或治疗IL-33R相关疾病或症状的药物中的用途。在一些实施方案中，所述IL-33R相关疾病或症状为免疫介导的炎症反应或免疫介导的炎症性疾病。
在一些实施方案中，本文公开的抗人IL-33R抗体可以作为抗免疫介导的炎症反应药物使用。本申请所称的抗免疫介导的炎症反应药物，指具有抑制和/或治疗免疫介导的炎症反应的药物，例如，它可以延迟免疫介导的炎症反应相关症状的发展和/或降低这些症状的严重程度。在一些实施方案中，所述药物可以减轻已存在的炎症反应伴随症状并防止其他症状的出现。在一些实施方案中，所述药物还可以减少或防止炎症反应的转移。
本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。
应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。
上述公开内容总体上描述了本申请，以下实施例是对本申请作进一步的说明，不应理解为对本申请的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述。
实施例
实施例1人IL-33R胞外蛋白抗原、人IL-33His标签蛋白、参比抗体RG6149的制备。
人IL-33R序列来自于UniProt(UniProtKB-Q01638)，该基因的克隆载体购买于义翘神州(Cat：HG10105-M)。以该载体为模板，通过PCR法将hfc片段和Flag 标签(DYKDDDDK)分别插入到hIL-33R的胞外段(19-328位氨基酸)的C端得到hIL-33R-ECD-hfc和hIL-33R-ECD-flag片段。hIL-33R-ECD-hfc和hIL-33R-ECD- flag片段再重组连接到pTT5载体中，然后进行测序验证，选取序列完全正确的克隆进行真核表达生产。通过PEI法分别将hIL-33R-ECD-hfc-pTT5和hIL-33R-ECD-flag-pTT5载体转染至HEK 293E细胞系(实验室保存)。利用含3mM的丙戊酸的 Freestyle293培养基(购自Gibco公司)培养5天后，利用protein A(购自GE)、Flag亲和层析(购自Sigma公司)从细胞培养上清中纯化得到蛋白用于以下小鼠免疫和进一步分析与研究。
人IL-33序列来自于UniProt(UniProtKB-O95760)，由生工生物公司按照Cricetulus griseus的密码子使用偏好进行密码子优化并合成第112-270位氨基酸片段，将序列克隆到pET-28a(+)载体(来源自生工生物公司)中，得到了pET-hIL-33-His。利用镍柱(购自GE)从大肠杆菌上清中纯化得到蛋白用于以下进一步分析与研究。
参比抗体RG6149的氨基酸序列来自于专利US20140004107(A1)。抗体的恒定区选用IgG1。经过密码子优化后全基因合成核苷酸序列，将序列亚克隆到pUC57 载体(来源自生工生物公司)中，得到了pUC57-RG6149-VH、pUC57-RG6149-VL、 pUC57-IgG1-CH、pUC57-IgG1-CL。通过PCR法将RG6149的可变区VH、VL分别和IgG1-CH，IgG1-CL进行拼接得到RG6149-HC、RG6149-LC片段克隆到pTT5表达载体，测序验证确认获得了正确的克隆载体标记为RG6149-HC-pTT5，RG6149- LC-pTT5。将这两个载体瞬时转染至HEK293E细胞系，利用含3mM的丙戊酸的 Freestyle293培养基培养5天后，利用Protein A亲和层析柱(购自GE公司)从细胞培养上清中纯化RG6149抗体蛋白。
实施例2 hIL-33R-hfc的免疫
将100μg/鼠的hIL-33R-hfc抗原在用生理盐水稀释成75μl后，与等体积的弗氏完全佐剂混合，并经超声乳化完全后对4-5周龄的Balb/c小鼠(购自上海灵畅生物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0018)进行皮下多点注射。三周后，将50μg/鼠的蛋白同样稀释成75μl后与等体积弗氏不完全佐剂混合，超声乳化完全后对小鼠进行皮下多点免疫，两周后再次重复此免疫。所有小鼠在第三次免疫后一周剪尾、取血分离血清，利用包被hIL-33R-hfc抗原的ELISA进行血清滴度的检测。对于血清抗体效价＞10000的小鼠，在取血后一周进行冲击免疫：尾静脉注射10μg抗原蛋白/100μl生理盐水/鼠。
滴度的检测通过ELISA方法进行：利用hIL-33R-hfc抗原包被ELISA板，包被浓度为1μg/ml，每孔100μl，4℃包被过夜。PBST(含0.5％Tween-20的PBS) 洗板2次后拍干。每孔加入含1％BSA的包被液封闭200μl，常温下封闭4小时后拍干，至-20℃冰箱中保存待用。检测时在ELISA板中每孔加入不同浓度的小鼠血清100μl，设2个复孔，室温孵育1.5小时。PBST洗涤3次后拍干。加入用 PBST1∶10000倍稀释的HRP标记的兔抗鼠Ig抗体(购自Sigma公司)100μl，室温孵育1小时。PBST洗涤3次后拍干。每孔加100μl显色液(临用前将ELISA 显色A液与显色B液按照1∶1的体积比混匀)显色，随后每孔加入100μl 2M H2SO4终止液终止反应。立即用酶标仪(Molecular Device)在450nm波长处测量各孔OD值。
实施例3杂交瘤融合和筛选
小鼠冲击免疫三天后取脾细胞进行融合。
生长状态良好的杂交瘤sp2/0细胞(来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，保藏号为TCM-18)在37℃、5％CO2孵箱中培养，融合前一天换液。融合与筛选过程如下：取小鼠脾脏，研磨洗涤后计数。将脾细胞和sp2/0细胞以10∶1 的比例混合，1500rpm离心7分钟。洗去上清液。1分钟内加入1ml PEG(1450)，轻摇90秒，在2.5分钟内加入无血清DMEM培养液(购自Gibco公司)5ml，再一次性加5ml无血清培养液终止反应，静置5分钟，1280rpm离心8分钟。按照一块96孔板两百万个sp2/0细胞的数量，将细胞均匀接种入96孔板，每孔 200μl。先用含次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、甲胺蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)的HAT培养基筛选，每3～4天半量换液，第10天改用HT培养基。10天后，待杂交瘤细胞铺满96孔板底部大于10％时，取上清用hIL-33R-hfc抗原包被的酶标板进行ELISA检测。ELISA检测方法如实施例2 中所述方法相同。同时利用同样的ELISA检测方法利用hIL-33R-flag对抗体进行复筛。挑选出hu-IL-33R阳性杂交瘤克隆于24孔板中扩大培养并通过有限稀释法进行亚克隆。获得稳定表达目的抗体的杂交瘤株后进行保种建库。
实施例4鼠源的抗人IL-33R单克隆抗体对hIL-33R-ECD-hfc结合hIL-33的阻断
用ELISA方法研究鼠源的抗人hIL-33R单克隆抗体对IL-33结合hIL-33R- ECD-hfc的阻断。hIL-33R-ECD-hfc抗原包被酶标板，封闭后同时加入生物素化的hIL-33-his和300μl亚克隆中的鼠源的抗人hIL-33R单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清，最终加入HRP抗体进行显色检测。保留能阻断hIL-33和hIL-33R-ECD-hfc结合的细胞株进入下一轮的亚克隆。
实施例5鼠源的抗人IL-33R单克隆抗体对人IL-33R-ECD-hfc结合的EC50
将优选的鼠源抗人IL-33R单克隆抗体通过Protein G亲和层析柱亲和纯化后，用BCA法定量。抗人IL-33R单克隆抗体与hIL-33R-ECD-hfc的结合的EC50 利用ELISA进行检测。将1μg/ml的hIL-33R-ECD-hfc抗原包被ELISA板，加入不同浓度的鼠源抗人IL-33R单克隆抗体进行检测。
我们对160个建株抗体进行了分析，图1为代表性实验结果。表6所列为部分优选抗体的EC50数据，这些抗体对人IL-33R的亲和力较高，EC50均在 35ng/ml以下。
表6：示例性鼠源抗人hIL-33R单克隆抗体对hIL-33R-ECD-hfc的亲和力
抗体编号 EC50(ng/ml)
2 19.5
8 22.9
11 23.7
17 28.4
21 25.4
31 27.6
35 33.7
47 28.1
49 27.9
51 26.0
53 22.5
54 17.3
65 22.1
67 31.1
78 18.7
82 21.2
93 25.5
98 21.4
118 26.0
122 24.6
实施例6鼠源的抗人IL-33R单克隆抗体对hIL-33R-ECD-hfc结合hIL-33的阻断的 IC50
将优选的鼠源抗人IL-33R单克隆抗体通过Protein G亲和层析柱亲和纯化后，用BCA法定量。用ELISA方法研究鼠源的抗人hIL-33R单克隆抗体对IL- 33结合hIL-33R-ECD-hfc的阻断。我们对160个建株抗体进行了分析，图2为代表性实验结果。表7所列为部分优选抗体的IC50数据，IC50均在350ng/ml以下。
表7：示例性鼠源抗人IL-33R单克隆抗体对hIL-33R-ECD-hfc结合hIL-33的阻断
抗体编号 IC50(ng/ml)
2 210.0
8 242.9
11 183.0
17 175.0
21 173.0
31 234.7
35 108.8
47 195.3
49 141.4
51 235.6
53 345.9
54 241.8
65 325.0
67 279.5
78 200.9
82 237.0
93 175.3
98 216.6
118 238.0
122 138.8
实施例7鼠源的抗人IL-33R单克隆抗体序列的测定
使用Trizol(购自上海生工生物)提取各杂交瘤细胞株的总RNA，用逆转录试剂盒(购自Thermo公司)将mRNA逆转录成cDNA，以Mouse Ig-Primer Set (购自Novagen公司)为引物通过PCR扩增鼠源的抗人hIL-33R单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区基因，然后将PCR产物克隆入pMD18-T载体，测序并分析可变区基因序列。根据多种功能实验和早期成药性分析结果，我们最终挑取了表1和2所列中前8个抗体作为先导抗体，测序获取了其轻重链可变区核苷酸序列。在GenBank中对转化而来的氨基酸序列进行比对分析，所有序列均符合小鼠IgG可变区基因的特征。
实施例8抗人IL-33R单克隆抗体的人源化
根据序列分析结果，挑取35、53、54和82号抗体进行了嵌合抗体和人源化抗体的构建。嵌合抗体的构建通过截取鼠源抗体的重链可变区和轻链可变区，利用overlapping PCR分别与人IgG1的轻重链恒定区连接而成。
根据Kabat法则对鼠源的抗人IL-33R单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列进行分析并确定了3个CDR和4个FR。以54号抗体为例，通过在NCBI IgBlast与人IgG胚系序列(Germline)进行同源性比较，选择IGHV1-46*01为重链CDR移植模板，将鼠源的抗人IL-33R单克隆抗体54的重链CDR区移植入IGHV1-46*01骨架区，构建成重链的CDR移植抗体。同样地，经过与人IgG胚系序列同源性比较，选择IGKV3-11*01为轻链CDR移植模板，将鼠源的抗人IL-33R单克隆抗体54的轻链CDR区移植入 IGKV3-11*01的骨架区，构建成轻链的CDR移植抗体，所得的抗体定义为54- Gr(54-Grafting)。同时，在此基础上，对一些框架区的氨基酸位点进行了回复突变。在进行回复突变时，将氨基酸序列进行了Kabat编码，位点的位置由Kabat 码指示。优选地，对于重链可变区，将Kabat编码第27位的Y回复为鼠源的F，将Kabat编码第29位的F回复为鼠源的I，将Kabat编码第30位的T回复为鼠源的N，将Kabat编码第69位的M回复为鼠源的L，将Kabat编码第71位的R 回复为鼠源的A，将Kabat编码第78位的V回复为鼠源的A；对于轻链可变区序列，将Kabat编码第19位的A回复为鼠源的V，将Kabat编码第21位的突变为为I，将Kabat编码第58位的I回复为鼠源的V。上述可变区基因序列由生工生物按照Cricetulus griseus的密码子使用偏好进行密码子优化并合成。将合成的人源化可变区序列与人IgG1恒定区相连，此抗体定义为54号抗体的人源化抗体(54-Humanization，54H)。
利用上述相同原理，对其余3个抗体同样进行了人源化。利用pTT5载体分别构建人源化重链、轻链的瞬时表达载体，将上述轻重链组合利用HEK293系统进行瞬时转染并表达抗体。HEK293细胞在Free Style 293 Expression Medium(购自Gibco公司)培养基中培养，利用PEI转染法将质粒转入细胞5天后收取细胞上清，利用Protein A纯化后获得抗体。
实施例9人源化的抗人IL-33R单克隆抗体对hIL-33结合hIL-33R-ECD-hfc的阻断
将优选的人源化抗人IL-33R单克隆抗体通过Protein A亲和层析柱亲和纯化后，用BCA法定量。用ELISA方法研究人源化的抗人hIL-33R单克隆抗体对IL- 33结合hIL-33R-ECD-hfc的阻断。图3为代表性实验结果，表8所列为部分优选抗体的IC50数据。实验结果表明优选的人源化抗人IL-33R单克隆抗体对hIL- 33结合hIL-33R-ECD-hfc的阻断能力显著高于参比抗体RG6149。
表8：人源化抗体对对hIL-33结合hIL-33R-ECD-hfc的阻断
抗体 IC50(ng/ml)
RG6149 403.1
35H 310.7
53H 216.1
54H 71.3
82H 271.3
实施例10人源化的抗人IL-33R单克隆抗体对KU812分泌IL-5的抑制
取生长状态良好的KU812细胞(ATCC，CRL-2099)，计数后与终浓度为 50ng/ml的重组hIL-33重悬成5x105/ml的细胞悬液。培养基为RPMI1640培养基 (购自Gibco公司)，其含10％胎牛血清(购自Sigma公司)、100U/ml青霉素 (购自Gibco公司)和100mg/ml链霉素(购自Gibco公司)，称为RPMI-1640完全培养基。37℃，5％CO2中孵育培养0.5小时后加入不同浓度的抗体。用培养基溶液稀释不同浓度的人源化的抗人IL-33R单克隆抗体(250μg/ml，3倍稀释， 9个不同浓度)，每孔100μl，加入至96孔平底细胞培养板中(购自Corning公司)，然后每孔加入100μl的细胞悬液。每组设立2个复孔，37℃，5％CO2中孵育培养24小时。取上清按照IL-5ELISA检测试剂盒(R&D)说明书操作检测 IL-5的分泌，利用酶标仪(MolecularDevice)在450nm波长处测量各孔OD值。
我们对优选的4个人源化抗人IL-33R单克隆抗体进行KU812分泌IL-5的抑制功能活性分析(图4)，优选4个抗体的数据见表9。实验结果表明优选的人源化抗人IL-33R单克隆抗体35H、53H、54H和82H对KU812细胞分泌IL-5的抑制作用更强，表明它们的功能活性显著优于参比抗体RG6149。
表9：不同人源化抗体对KU812分泌IL-5的抑制
抗体 IC50(ng/ml)
RG6149 220.4
35H 106.5
53H 44.8
54H 18.1
82H 180.3
实施例11人源化的抗人IL-33R单克隆抗体对IL-33R的亲和力
表达纯化4个优选人源化抗体的亲和力通过Biacore T200(GE healthcare) 检测，参比抗体RG6149作为对照。具体实验方法为：利用Protein-A CM5传感芯片(GEhealthcare)，以FC1(Flow cell 1)为参照通道，FC2(Flow cell2)为样品通道。在FC2通道分别捕获人源抗体或对照抗体，随后注射不同浓度的hIL-33R-ECD-Flag。循环条件为：在FCs所有通道中以50μl/min注射4min分析物，解离时间为20min，以10μl/min速率注射6M盐酸胍(国药集团化学试剂有限公司)30s进行表面再生，然后利用Biacore T200 EvaluationSoftware Ver 1.0计算捕获抗体的信号和无捕获抗体的信号差值及相互作用的亲和力。如表10所显示，人源化后的抗体35H、53H、54H和82H对hIL-33R-Flag的亲和力显著高于参比抗体RG6149。
表10：不同人源化抗体对hIL-33R的亲和力
抗体 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(pM)
RG6149 5.679x 105 8.198x 10-5 144.4
35H 1.247x 106 1.386x 10-4 111.1
53H 1.906x 106 1.392x 10-4 73.0
54H 5.001x 106 1.013x 10-4 20.3
82H 1.019x 106 5.015x 10-5 49.2
可以理解，尽管本申请以某种形式被说明，但本申请并不局限于本说明书中所显示和描述的内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本申请的范围的前提下还可对所述实施方式和/或某一特征或参数做出各种变化。这些变化都在本申请要求保护的范围内。
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Figure ISB0000184942300000021
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Claims (15)

1.特异性结合人白细胞介素-33R的抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中：
(a)所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：77所示，所述HCDR2的氨基酸如SEQ ID NO：78所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：79所示；所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO：80所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：81所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQID NO：82所示；或
(b)所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：71所示，所述HCDR2的氨基酸如SEQ ID NO：72所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：73所示；所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO：74所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：75所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQID NO：76所示。
2. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，(a)中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示。
3. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，(b)中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。
4. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，(a)中所述抗体为人源化的抗体，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：114所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：117所示。
5. 如权利要求4所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：115所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：118所示。
6. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，(b)中所述抗体为人源化的抗体，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：108所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：111所示。
7. 如权利要求6所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：109所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：112所示。
8.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体或其抗原结合部分以小于150pM的Kd结合于人白细胞介素-33R。
9.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体或其抗原结合部分能够抑制KU812细胞的IL-5分泌。
10.药物组合物，其包含权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的载体。
11.核苷酸分子，其编码权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
12.表达载体，其包含权利要求11所述的核苷酸分子。
13.宿主细胞，其包含权利要求11所述的核苷酸分子或权利要求12所述的表达载体。
14. 产生权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的方法，其包括：
a)在使得权利要求13所述的宿主细胞能够产生所述抗体或其抗原结合部分的表达条件下，培养所述宿主细胞，从而表达抗体或其抗原结合部分；以及
b)分离并纯化步骤a)中表达的所述抗体或其抗原结合部分。
15.权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、或者权利要求10所述的药物组合物在制备用于预防或治疗IL-33R相关疾病的药物中的用途，所述IL-33R相关疾病为免疫介导的炎症性疾病；所述免疫介导的炎症性疾病是特应性皮炎或哮喘。
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