JP7032662B2 - Pcsk9抗体、その抗原結合フラグメント及び医薬用途 - Google Patents
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Description
1)配列番号:18の重鎖可変領域及び配列番号:25の軽鎖可変領域;
2)配列番号:18の重鎖可変領域及び配列番号:26の軽鎖可変領域;
3)配列番号:18の重鎖可変領域及び配列番号:27の軽鎖可変領域;
4)配列番号:19の重鎖可変領域及び配列番号:24の軽鎖可変領域;
5)配列番号:19の重鎖可変領域及び配列番号:25の軽鎖可変領域;
6)配列番号:19の重鎖可変領域及び配列番号:26の軽鎖可変領域;
7)配列番号:19の重鎖可変領域及び配列番号:27の軽鎖可変領域;
8)配列番号:20の重鎖可変領域及び配列番号:24の軽鎖可変領域;
9)配列番号:20の重鎖可変領域及び配列番号:25の軽鎖可変領域;
10)配列番号:20の重鎖可変領域及び配列番号:26の軽鎖可変領域;
11)配列番号:20の重鎖可変領域及び配列番号:27の軽鎖可変領域;
12)配列番号:21の重鎖可変領域及び配列番号:24の軽鎖可変領域;
13)配列番号:21の重鎖可変領域及び配列番号:25の軽鎖可変領域;
14)配列番号:21の重鎖可変領域及び配列番号:26の軽鎖可変領域;
15)配列番号:21の重鎖可変領域及び配列番号:27の軽鎖可変領域;
16)配列番号:22の重鎖可変領域及び配列番号:24の軽鎖可変領域;
17)配列番号:22の重鎖可変領域及び配列番号:25の軽鎖可変領域;
18)配列番号:22の重鎖可変領域及び配列番号:26の軽鎖可変領域;
19)配列番号:22の重鎖可変領域及び配列番号:27の軽鎖可変領域;
20)配列番号:23の重鎖可変領域及び配列番号:24の軽鎖可変領域;
21)配列番号:23の重鎖可変領域及び配列番号:25の軽鎖可変領域;
22)配列番号:23の重鎖可変領域及び配列番号:26の軽鎖可変領域;
23)配列番号:23の重鎖可変領域及び配列番号:27の軽鎖可変領域;及び
24)配列番号:18の重鎖可変領域及び配列番号:24の軽鎖可変領域。
から成る群より選択される1つの重鎖可変領域及び1つの軽鎖可変領域を含む。
PCSK9抗体の軽鎖は、更にヒトκ鎖、ヒトλ鎖またはそれらの変異体、またはそれらの配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列に由来する定常領域を含む。
1)配列番号:28の重鎖及び配列番号:30の軽鎖;及び
2)配列番号:32の重鎖及び配列番号:30の軽鎖。
から成る群より選択される1つの重鎖及び1つの軽鎖を含む。
本発明をより理解しやすくするため、専門用語及び科学用語を以下に具体的に定義する。本明細書の他の場所で具体的に定義されている場合を除き、ここで使用される他の全ての専門用語及び科学用語は、当業者により一般に理解される意味をもつ。
タンパク質の設計と発現
本発明のPCSK9のテンプレートとしてUniprotプロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケクシン9型(ヒトPCSK9、Uniprot No.:Q8MBP7)を用いて、抗原及び試験タンパク質のアミノ酸配列を設計する。必要に応じて、PCSK9タンパク質をPADREペプチド等の免疫化を促進するhisタグまたはペプチド等の異なる標識と融合させ、次いでpTT5ベクター(Biovector, Cat#:102762)またはpTargeTベクター(promega, A1410)にそれぞれクローニングし、一時的に293細胞に、または安定にCHO-Sに発現し、精製した。最後に、本発明の抗原及び試験タンパク質を得た。
Hisタグを有するPCSK9:PCSK9-His6、マウスを免疫するための免疫原、または検出試薬として使用される。
MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQHHHHHH 配列番号:1
注:下線付きの配列はシグナルペプチドであり、斜体部分はHis-タグ配列(His6-タグ)である。
PADREペプチド及びHis-タグを有するPCSK9:PCSK9-PADRE-His6、免疫原として使用され、そこに含まれるPADREペプチドが免疫化を促進できる;
MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQGSGAKFVAAWTLKAAAHHHHHH 配列番号:2
注:下線付きの配列はシグナルペプチドであり、二重下線の配列はリンカーであり、点線の配列はPADREペプチドであり、斜線部分はHis6-タグである。
TEV切断部位及びHis-タグを有するPCSK9の融合タンパク質:PCSK9-TEV-His6、N-PCSK9(N末端PCSK9ドメイン)、免疫原として使用され、TEV酵素で得られる;
MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHENLYFQGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQHHHHHH
配列番号:3
注:下線付きの配列はシグナルペプチドであり、二重下線の配列はTEV切断部位であり、斜体部分はHis6-タグである。
His-タグを有するPCSK9-D374Y突然変異タンパク質:PCSK9-D374Y-His6、検出試薬として使用される;
MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSYCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQHHHHHH 配列番号:4
注:下線付きの配列はシグナルペプチドであり、斜線部分はHis6-タグである。
ビオチン受容ペプチドBP15及びHisタグを挿入されたPCSK9タンパク質:PCSK9-BP15-His6。ビオチンは、検出試薬として、発現中にBP15ペプチド位置に標識され、in vitroでのビオチン標識を回避し、その結果、起こりうる立体構造の変化を回避する。
MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQGSTSGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH
配列番号:5
注:下線付きの配列はシグナルペプチドであり、二重下線の配列はビオチン受容ペプチドであり、斜線部分はHis6-タグである。
ビオチン受容ペプチドBP15及びHisタグを挿入されたPCSK9 D374Y突然変異タンパク質:PCSK9-D374Y-BP15-His6、検出タンパク質として:
MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSYCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQGSTSGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH
配列番号:6
注:下線付きの配列はシグナルペプチドであり、二重下線の配列はビオチン受容ペプチドであり、斜線部分はHis6-タグである。
Flagタグ及びHisタグを有するPCSK9受容体タンパク質LDLR細胞外ドメイン:LDLR-ECD-Flag-His6、検出試薬として;
MGPWGWKLRWTVALLLAAAGTAVGDRCERNEFQCQDGKCISYKWVCDGSAECQDGSDESQETCLSVTCKSGDFSCGGRVNRCIPQFWRCDGQVDCDNGSDEQGCPPKTCSQDEFRCHDGKCISRQFVCDSDRDCLDGSDEASCPVLTCGPASFQCNSSTCIPQLWACDNDPDCEDGSDEWPQRCRGLYVFQGDSSPCSAFEFHCLSGECIHSSWRCDGGPDCKDKSDEENCAVATCRPDEFQCSDGNCIHGSRQCDREYDCKDMSDEVGCVNVTLCEGPNKFKCHSGECITLDKVCNMARDCRDWSDEPIKECGTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECLCPDGFQLVAQRRCEDIDECQDPDTCSQLCVNLEGGYKCQCEEGFQLDPHTKACKAVGSIAYLFFTNRHEVRKMTLDRSEYTSLIPNLRNVVALDTEVASNRIYWSDLSQRMICSTQLDRAHGVSSYDTVISRDIQAPDGLAVDWIHSNIYWTDSVLGTVSVADTKGVKRKTLFRENGSKPRAIVVDPVHGFMYWTDWGTPAKIKKGGLNGVDIYSLVTENIQWPNGITLDLLSGRLYWVDSKLHSISSIDVNGGNRKTILEDEKRLAHPFSLAVFEDKVFWTDIINEAIFSANRLTGSDVNLLAENLLSPEDMVLFHNLTQPRGVNWCERTTLSNGGCQYLCLPAPQINPHSPKFTCACPDGMLLARDMRSCLTEAEAAVATQETSTVRLKVSSTAVRTQHTTTRPVPDTSRLPGATPGLTTVEIVTMSHQALGDVAGRGNEKKPSSVRDYKDDDDKHHHHHH
配列番号:7
注:下線付きの配列はシグナルペプチドであり、二重下線の配列はFlagタグであり、斜体部分はHis6-タグである。
切断されたLDLR細胞外ドメインとhIgG1 Fc(PCSK9結合活性を有する)との融合タンパク質であるLCDR-Fc:LDLR-sECD-Fc(hIgG1)、検出試薬として;
MEFGLSWLFLVAILKGVQCGTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECLCPDGFQLVAQRRCEDIDECQDPDTCSQLCVNLEGGYKCQCEEGFQLDPHTKACKEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号:8
注:下線付きの配列はシグナルペプチドであり、二重下線の配列はPCSK9結合活性を有する切断されたLDLR細胞外ドメイン(LDLR-sECD)であり、斜線部分はhIgG1-Fcである。
より切断されたLDLR細胞外ドメインとhIgG1 Fc(PCSK9結合活性を有する)との融合タンパク質:LDLR-ssECD-Fc(hIgG1)、検出試薬として;
MEFGLSWLFLVAILKGVQCGTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECLCPDGFQLVAQRRCEDIDEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号:9
注:下線付きの配列はシグナルペプチドであり、二重下線の配列はPCSK9結合活性を有するより切断されたLDLR細胞外ドメイン(LDLR-ssECD)であり、斜線部分はhIgG1-Fcである。
1.His-タグを有する組換えタンパク質の精製工程:
細胞発現上清試料を高速遠心分離によって遠心分離し、不純物を除去した。緩衝液をPBSで交換し、イミダゾールを添加して最終濃度5 mMとした。ニッケルカラムを5 mMイミダゾールを含有するPBS溶液で平衡化し、カラムの2~5倍容量で洗浄した。緩衝液交換後の上清試料をIMACカラムに負荷した。該カラムを5 mMイミダゾールを含有するPBS溶液で、A280での読み取り値がベースラインまで低下するまで洗浄した。次に、クロマトグラフィーカラムをPBS+10 mMイミダゾールで洗浄し、非特異的結合タンパク質を除去し、流出物を集めた。300 mMイミダゾールを含有するPBS溶液で標的タンパク質を溶出し、溶出ピークを集めた。集めた溶出液を濃縮し、ゲルクロマトグラフィー(GE)Superdex 200で更に精製(移動相:PBS)した。多量体ピークを除去し、溶出ピークを集めた。得られたタンパク質を電気泳動、ペプチドマップ及びLC-MSにより同定した。PCSK9-His6(配列番号:1)、PCSK9-PADRE-His6(配列番号:2)、PCSK9-TEV-His6(配列番号:3)、PCSK9-D374Y-His6(配列番号:4)、PCSK9-BP15-His6(配列番号:5)及びPCSK9-D374Y-BP15-His6(配列番号:6)を得て、本発明の免疫原または検出試薬として使用した。PCSK9-TEV-His6を精製し、TEV酵素で切断し、IMACカラムで得られた生成物からTEV酵素、不完全に切断されたPCSK9-TEV-His6またはHis-タグ付きのC末端ドメインフラグメントを除去した。IMAC流出液を濃縮し、M末端PCSK9ドメインフラグメントのみを残し、マウスを免疫化するための免疫原として使用した。
2.Hisタグ及びFlagタグを有するLDLR-ECD-Flag-His6(配列番号:7)の組換えタンパク質の精製工程:
高速遠心分離により試料を遠心分離し、不純物を除去した。次いで試料を適切な容量に濃縮した。Flag親和性カラムを0.5×PBSで平衡化し、カラムの2~5倍容量で洗浄した。不純物を除去した後、細胞発現上清試料をカラムに負荷した。該カラムを0.5×PBSで、A280での読み取り値がベースラインまで低下するまで洗浄した。0.3M NaClを含有するPBSでカラムを洗浄し、タンパク質を洗浄し、集めた。標的タンパク質を0.1M酢酸(pH3.5~4.0)で溶出し、集めた後、pH値を中性に調整した。集めた溶出液を濃縮し、ゲルクロマトグラフィー(GE)Superdex 200で更に精製(移動相:PBS)した。多量体ピークを除去し、溶出ピークを集めた。得られたタンパク質を電気泳動、ペプチドマップ及びLC-MSにより同定した。FLAG/His6タグを有するLDLR-ECD-Flag-His6(配列番号:7)が得られ、本発明の抗体の性能試験に使用した。
3.LDLR Fcの融合タンパク質の精製工程:
高速遠心分離により細胞発現上清試料を遠心分離し、不純物を除去した。次いで試料を適切な容量に濃縮し、プロテインAカラムに負荷した。該カラムをPBSで、A280での読み取り値がベースラインまで低下するまで洗浄した。標的タンパク質を100 mM酢酸ナトリウム(pH3.0)で溶出した後、1M Tris-HClで中和した。溶出した試料を適切に濃縮し、PBSで予め平衡化したゲルクロマトグラフィー(GE)Superdex 200で更に精製した。多量体を含まないピークを集めた。この方法を用いてLDLR-sECD-Fc(hIgG1)(配列番号:8)及びLDLR-ssECD-Fc(hIgG1)(配列番号:9)を精製した。両者ともPCSK9抗体の性能試験に使用できる。
1.免疫処置
マウス(実験用SJL白マウス、メス、6週齢(北京Weitong Lihua実験動物技術有限公司、動物生産ライセンス番号:SCXK(Beijing)2012-0001)給餌環境:SPFレベル)を免疫して抗ヒトPCSK9モノクローナル抗体は作製した。マウスを購入した後、動物を実験室に、12/12時間の明/暗サイクル、温度20~25℃、湿度40~60%の条件で1週間保持した。環境に適応したマウスを1群あたり6~10匹で、次の2つのスキームに従って免疫化した。免疫原は、Hisタグを有するヒトPCSK9-His6(配列番号:1)、PCSK9-PADRE-His6(配列番号:2)及びN-PCSK9(配列番号:3)であった。
スキームA:フロイント免疫賦活剤(Sigmaロット番号:F5881/F5506)による乳化:完全フロイント免疫賦活剤(CFA)による初回免疫、不完全フロイント免疫賦活剤(IFA)による追加免疫。抗原と免疫賦活剤の比は、1:1、100 μg/マウス(初回免疫の場合)、50 μg/マウス(追加免疫の場合)であった。0日目に乳化抗原をマウスに100 μg/マウスで腹腔内(IP)注射し、初回免疫の後は2週間ごとに1回、合計6~8週間実施した。
スキームB:Titermax(Sigmaロット番号:T2684)及びAlum(Thremoロット番号:77161)でマウスを交叉免疫した。抗原と免疫賦活剤(titermax)の比は1:1、抗原と免疫賦活剤(Alum)の比は3:1、10~20 μg/マウス(初回免疫の場合)、5 μg/マウス(追加免疫の場合)であった。0日目に、乳化抗原をマウスに20/10 μg/マウスで腹腔内(IP)注射し、初回免疫の後は1週間に1回、Titermax及びAlumを交互に合計6~11週間使用した。免疫処置の4週間後に背部及び腹部の腫脹状態に応じ、背部または腹腔内の抗原注射方法を選択した。
2.細胞融合
脾臓細胞融合のために、血清における抗体価が高く、かつ力価が一定する傾向を示すマウス(試験1及び2をPCSK9のELISAと合わせて参照)を選択した。融合の72時間前に、選択したマウスにPCSK9-His6を10 μg/マウスで腹腔内注射により免疫した。脾臓リンパ球及び骨髄腫細胞Sp2/0(ATCC(登録商標)CRL-8287TM)を融合して、PEGを介して最適化された融合手順によりハイブリドーマ細胞を得た。融合されたハイブリドーマ細胞を、HAT完全培地(20%FBS、1×HAT及び1×OPIを含有するRPMI-1640培地)で再懸濁した後、96ウェル細胞培養プレート(1×105/150 μl/ウェル)に入れ、37℃及び5%CO2で培養した。融合後5日目に、HAT完全培地を50 μl/ウェルで加え、37℃及び5%CO2で培養した。融合後の7日目~8日目に、細胞増殖密度に基づいて、全培地をHT完全培地(20%FBS、1×HT及び1×OPIを含有するRPMI-1640培地)に交換し、200 μl/ウェル、37℃、5%CO2で培養した。
3.ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
融合後の10日目から11日目に、細胞増殖密度に基づいて、PCSK9またはPCSK9-Y結合についてのELISA試験を行った(試験1及び2参照)。阻害ELISA試験(試験3及び試験4参照)においてLDLRに結合するPCSK9またはPCSK9-Yの阻害を試験するため、結合ELISA試験に陽性細胞を使用した。陽性ウェルの培地を交換し、細胞を細胞密度に基づいて24ウェルプレートに拡大した。24ウェルプレートに移された細胞株を保存し、再試験後に初回サブクローン化した。初回サブクローンのスクリーニング後の陽性細胞(試験1及び2参照)を保存し、2次サブクローンに供した。タンパク質発現のために2次サブクローンの後の陽性細胞(試験1及び2参照)を保存した。複数回の融合の後、PCSK9またはPCSK9-YのLDLRとの結合を阻害できるハイブリドーマ細胞を得た。
阻害アッセイ及び結合アッセイのスクリーニングによりハイブリドーマクローンmAb-001を得た。無血清細胞培養により抗体を更に調製した。例示した精製工程に従って抗体を精製し、検出に用いた。
ハイブリドーマクローンmAb-001のマウス可変領域の配列は以下の通りであった:
> mAb-001 VH
QVHLQQSGAELAKPGASVKLSCKASGYTFNDYWMHWVKERPGQGLEWIGYINPSSGFTKYHQNFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTYDDSAVYYCARQYDYDEDWYFDVWGTGTTVTVSS
配列番号:10
> mAb-001VL
DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNFLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGRGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSFNLFTFGSGTKLEIK
配列番号:11
注:順序はFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4であり、斜線部分はFR配列であり、下線部分はCDR配列である。
1.ハイブリドーマクローンmAb-001のためのヒト化フレームの選択
IMGTヒト抗体重鎖及び軽鎖可変領域生殖系列遺伝子データベース及びMOEソフトウェアを比較することにより、mAb-001と高い相同性を有する重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子をテンプレートとして選択した。該2つのマウス抗体のCDRをそれぞれ対応するヒトテンプレートに移植して、順序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の可変領域配列を形成した。Kabat付番システムに従ってアミノ酸残基を付番し、注解した。
マウス抗体mAb-001のヒト化軽鎖テンプレートはIGKV1-39*01及びhjk2.1であり、ヒト化重鎖テンプレートはIGHV1-2*02及びhjh2である。ヒト化抗体h001-1のヒト化後の可変領域配列を以下に示す:
> h001-1 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSGFTKYHQNFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARQYDYDEDWYFDVWGQGTTVTVSS
配列番号:18
> h001-1 VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNSRTRKNFLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSFNLFTFGQGTKLEIK
配列番号:24
注:順序はFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4であり、斜体部分はFR配列であり、下線部分はCDR配列である。
2.ハイブリドーマクローンmAb-001のテンプレート選択及び逆突然変異設計を表2に示す。ハイブリドーマの逆突然変異後のヒト化配列の組合せを表2に示す。
ヒトFR領域配列に移植表現マウス抗体CDRを移植し、その突然変異可変領域の特異的な配列は表3に示すとおりである:
3.上記ヒト化配列を組合せて、重鎖定常領域がヒトIgG1由来であり、軽鎖定常領域がヒトκ鎖由来である抗体を形成した。対応するヒト化抗体を得て、ELISA法(試験1参照)によりPCSK9への結合について検出し、ELISA法(試験2参照)によりPCSK9-Yへの結合について検出した。上記ELISA法で検出された結合陽性細胞を、阻害ELISA試験(試験4参照)におけるPCSK9/LDLR結合の阻害について更に検出し、阻害ELISA試験(試験3参照)におけるPCSK9-Y/LDLR結合の阻害について更に検出した。それらの結果を表5~8に示す。
その結果、本発明で得られたPCSK9抗体は、PCSK9及びPCSK9-Yとの結合活性が高く、また、該抗体はPCSK9/PCSK9-YとLDLRとの結合を効果的に阻害できることが示された。
抗ヒトPCSK9ヒト化抗体の構築及び発現の方法を以下に示す:
1.プライマー設計:オンラインソフトウェアDNAWorks(v3.2.2, http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)を用いて、組換えに必要な遺伝子フラグメント:
5'~30bpシグナルペプチド+VH/VK+30bp CH1/CL-3'を含有するVH/VKを合成し、複数のプライマーを設計した。プライマー設計の原則:標的遺伝子2が2つのアミノ酸中の標的遺伝子1と異なる場合、図1に示すように、突然変異部位に位置する更なるプライマーを設計した。
2.フラグメントスプライシング:TakaRa Primer STAR GXL DNAポリメラーゼのマニュアルに従って、上記で設計した複数のプライマーを用いて2段階PCR増幅を行い、組換えに必要な遺伝子フラグメントを含有するVH/VKを得た。
3.発現ベクターpHr(シグナルペプチド及び定常領域遺伝子(CH1-FC/CL)フラグメントを有する)の構築及び制限酵素消化
図2に示すように、酵素消化部位とは異なる配列を認識するBsmBIのようないくつかの特別な復帰酵素を用いて、発現ベクターpHr(シグナルペプチド及び定常領域遺伝子(CH1-FC/CL)フラグメントを有する)を設計し、構築した。BsmBIを用いてベクターを切断し、ゲルを切断し、使用のため回収した。
4.組換え発現ベクターVH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHrの構築
組換えに必要な遺伝子フラグメントを含有するVH/VK及びBsmBI酵素で消化した回収発現ベクターpHr(シグナルペプチド及び定常領域遺伝子(CH1-FC/CL)フラグメントを含む)をDH5α適格細胞に3:1の比率で加え、0℃の氷浴中で30分間培養し、42℃で90秒間熱ショックし、5倍量のLB培地を添加し、37℃で45分間培養し、LB-Ampプレートに移し、37℃で終夜培養した。単一クローンを採取し、配列決定を行った。
上記の方法で本発明の抗体を構築できるが、この方法に限定されない。例えば、抗体h001-4及びその変異体を設計し、次のものを得る。:1)h001-4-WT:h001-4のIgGフォーマット、即ち、ヒトIgG1由来の重鎖定常領域及びヒトκ鎖由来の軽鎖定常領域を有するヒト化配列の組合せh001-4;2)h001-4-YTE:h001-4-IgG1-YTEフォーマット、即ち、変異体ヒトIgG1(YTE突然変異)の重鎖定常領域及びヒトκ鎖由来の軽鎖定常領域を有するヒト化配列の組合せh001-4。突然変異ヒトIgG1は、他の形態の突然変異であってもよい。得られた抗体及び変異体抗体をBIAcore検出(試験6)により親和性について検出し、その結果を表9に示す。
構築及び発現された抗ヒトPCSK9ヒト化抗体(IgG1及びそのIgG1-YTEフォーマット)の配列を以下に示す:
H001-4 IgG1フォーマット、重鎖定常領域はヒトIgG1に由来し、軽鎖定常領域はヒトκ軽鎖に由来する:
重鎖アミノ酸配列(ヒトIgG1):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSGFTKYHQNFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARQYDYDEDWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号:28
重鎖DNA配列:
AtggagtttgggctgagctggctttttcttgtcgcgattcttaagggtgtccagtgcCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCGAGCGTAAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCGACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCAGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTACATCAACCCCAGCAGCGGCTTTACCAAGTATCACCAGAACTTCAAAGACAGGGTGACCATGACCAGGGACACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGCAATACGACTACGACGAGGACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAAGGAACCACCGTGACTGTGAGCAGCgcttcgaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号:29
h001-4-kappa
軽鎖アミノ酸配列:
DIVMSQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNSRTRKNFLAWYQQKPGKSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSFNLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号:30
軽鎖DNA配列:
atggacatgcgcgtgcccgcccagctgctgggcctgctgctgctgtggttccccggctcgcgatgcGACATCGTGATGTCTCAGAGCCCATCTAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTAACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAAAGCCTGCTGAACAGCAGGACCCGCAAGAACTTCCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGtctCCCAAGTTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCTAGTCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCAAGCAGAGCTTCAATCTGTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttga
配列番号:31
h001-4-IgG1-YTE(軽鎖はh001-4-κ:配列番号:30)
重鎖アミノ酸配列:IgG1-YTE
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSGFTKYHQNFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARQYDYDEDWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号:32
重鎖DNA配列:
AtggagtttgggctgagctggctttttcttgtcgcgattcttaagggtgtccagtgcCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCGAGCGTAAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCGACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCAGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTACATCAACCCCAGCAGCGGCTTTACCAAGTATCACCAGAACTTCAAAGACAGGGTGACCATGACCAGGGACACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGCAATACGACTACGACGAGGACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAAGGAACCACCGTGACTGTGAGCAGCgcttcgaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctctacatcacccgggagcctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号:33
注:下線部分はシグナルペプチドDNA配列である。
本発明の性能及び利点は、以下に示す生化学試験によって確認されている。
ELISAプレートに固定された野生型PCSK9タンパク質(WT PCSK9、配列番号:5)に結合する抗体の量を計測することにより、本発明の抗PCSK9抗体のPCSK9へ結合する能力を測定した。
ストレプトアビジン(Sigma, CAT#S4762)をPBSで2 μg/mlに希釈し、96ウェルのELISAプレートに4℃で終夜コーティングした。プレートを洗浄した後、37℃でトリス緩衝液(0.9 mM CaCl2、0.05%Tween 20及び5%スキムミルクを含有する)で2時間ブロッキングした。次いでプレートを再度洗浄し、自家調製のビオチン標識PCSK9(0.9 mM CaCl2、0.05%Tween 20及び1%スキムミルクを含有するトリス緩衝液で希釈したbio-WT-PCSK9)を100 μl/ウェルで添加し、37℃で1時間培養した。洗浄後、プレートに異なる濃度に希釈されたPCSK9抗体の試料を加え、37℃で1時間培養した。次いでプレートを再度洗浄し、HRP-ヤギ抗ヒト(H+L)抗体(jackson, CAT#109-035-088)を添加し、37℃で1時間培養した。次いでプレートを再度洗浄し、現像のためにテトラメチルベンジジン溶液を添加した。最後に、停止溶液を加え、マイクロプレートリーダーでOD450値を計測した後、EC50を計算した。
本発明のキメラ抗体及び逆突然変異抗体のヒトPCSK9タンパク質へ結合する能力に関するELISA試験の結果を表5に示す。
本データは、本発明のヒト化抗体が、ヒトPCSK9タンパク質に対してより高い結合活性を有することを示す。
ELISAプレート上に固定されたPCSK9-Y(変異体PCSK9、配列番号:6)に結合する抗体の量を計測することにより、本発明の抗PCSK9抗体のPCSK9-Yへの結合する能力を測定した。
ストレプトアビジン(Sigma, CAT#S4762)をPBSで2 μg/mlに希釈し、96ウェルのELISAプレートに4℃で終夜コーティングした。プレートを洗浄した後、37℃でトリス緩衝液(0.9 mM CaCl2、0.05%Tween 20及び5%スキムミルクを含有する)で2時間ブロッキングした。次いで、プレートを再度洗浄し、自家調製のビオチン標識PCSK9-Y(0.9 mM CaCl2、0.05%Tween 20及び1%スキムミルクを含有するトリス緩衝液で希釈したbio-PCSK9-Y)を100 μl/ウェルで添加し、37℃で1時間培養した。洗浄後、プレートに異なる濃度に希釈されたPCSK9抗体の試料を加え、37℃で1時間培養した。次いでプレートを再度洗浄し、HRP-ヤギ抗ヒト(H+L)抗体(jackson, CAT#109-035-088)を添加し、37℃で1時間培養した。次いでプレートを再度洗浄し、現像のためにテトラメチルベンジジン溶液を添加した。最後に、停止溶液を加え、マイクロプレートリーダーでOD450値を計測した後、EC50を計算した。
本発明のキメラ抗体及び逆突然変異抗体の変異体PCSK9へ結合する能力に関するELISA試験の結果を表6に示す。
本データは、本発明のヒト化抗体がPCSK9-Yに対してより高い結合活性を有することを示す。
抗PCSK9抗体がLDLR-FC(配列番号:8)のPCSK9-Y(変異体PCSK9、配列番号:6)への結合を阻害する能力は、該抗体の存在下でLDLRに結合するPCSK9-Yの量を計測することにより測定した。
LDLR-FCをリン酸塩緩衝液で2 μg/mlに希釈し、96ウェルのELISAプレート(Costar, CAT#3590)にコーティングした後、4℃で終夜培養した。プレートを洗浄した後、37℃でトリス緩衝液(0.9 mM CaCl2、0.05%Tween 20及び5%スキムミルクを含有する)で2時間ブロッキングした。次いでプレートを再度洗浄し、ビオチン標識PCSK9-Y(0.9 mMCaCl2、0.05%Tween 20及び1%スキムミルクを含有するトリス緩衝液で最終濃度1 μg/mlに希釈したbio-PCSK9-Y)及び抗体試料(0.9 mM CaCl2、0.05%Tween 20及び1%スキムミルクを含有するトリス緩衝液で希釈)の混合物を100 μl/ウェルで加え、37℃で1時間培養した。次いでプレートを再度洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ-ストレプトアビジン(Sigma, CAT#S2438)を添加し、37℃で1時間培養した。次いでプレートを洗浄し、現像のためにテトラメチルベンジジン溶液を添加した。最後に、停止溶液を添加し、OD450値をマイクロプレートリーダーで計測した後、IC50を計算した。
LDLR-FC/PCSK9-Yの結合に対する本発明のキメラ抗体及び逆突然変異抗体の阻害効果の阻害試験の結果を表7に示す。
データは、本発明のPCSK9抗体がPCSK9-YのLDLRへの結合を効率的に阻害できることを示す。
上記の方法で、本発明のPCSK9抗体は他のLDLR-FCのフォーマット(自家調製、配列番号:7または配列番号:9で示される配列)のPCSK9-Y(配列番号:5)への結合に対する阻害作用についても試験した。その結果、本発明のPCSK9抗体が、切断されたLDLRに対するPCSK9-Yの結合を効率的に阻害できることが示された。
本発明のPCSK9抗体がLDLR-FC(自家製、配列は配列番号:8に示す)のPCSK9(配列番号:5)への結合を阻害する能力は、該抗体の存在下でLDLRに結合するPCSK9の量を測定することにより検出した。
LDLR-FCをリン酸塩緩衝液で5 μg/mlに希釈し、96ウェルのELISAプレートにコーティングした後、4℃で終夜培養した。プレートを洗浄し、次いで37℃でトリス緩衝液(0.9 mM CaCl2、0.05%Tween 20及び5%スキムミルクを含む)で2時間ブロッキングした。次いでプレートを再度洗浄し、ビオチン標識PCSK9(0.9 mMCaCl2、0.05%Tween 20及び1%スキムミルクを含有するトリス緩衝液で最終濃度2 μg/mlに希釈したbio-WT-PCSK9)及び抗体試料(0.9 mM CaCl2、0.05%Tween 20及び1%スキムミルクを含有するトリス緩衝液で希釈)の混合物を100 μl/ウェルで添加し、37℃で1時間培養した。次いでプレートを再度洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ-ストレプトアビジン(Sigma, CAT#S2438)を添加し、37℃で1時間培養した。次いでプレートを洗浄し、現像のためにテトラメチルベンジジン溶液を添加した。最後に、停止溶液を添加し、OD450をマイクロプレートリーダーで計測した後、IC50を計算した。
LDLR-FC/PCSK9への結合に対する本発明のキメラ抗体及び逆突然変異抗体の阻害効果の阻害試験の結果を表8に示す。
本データは、本発明のPCSK9抗体がPCSK9のLDLRへの結合を効率的に阻害できることを示す。
上記の方法で、本発明のPCSK9抗体は他のLDLR-FCのフォーマット(自家調製、配列番号:7または配列番号:9で示される配列)のPCSK9(配列番号:5)への結合に対する阻害作用についても試験した。その結果、本発明のPCSK9抗体が、切断されたLDLRに対するPCSK9の結合を効率的に阻害できることが示された。
HepG2細胞(中国科学院細胞バンク、CAT#、TCHu72)をDMEM培地(Hyclone, CAT# SH30243.01B)(10%FBS, Gibco, CAT# 10099-141を含有する)中で培養した。細胞がプレートの80~90%を覆うった際、細胞を吹き飛ばして温浸し、カウントし、1.5×104細胞/ウェルで96ウェルプレートに蒔いた。24時間後、DMEM及びリポタンパク質を含まない10%血清(Millipore, CAT#LP4)で培地を交換した。48時間後、プレートをPBS緩衝液で2回洗浄し、次いで4℃で1時間プレ培養したPCSK9(配列番号:1、最終濃度10 μg/ml)及び抗体試料(培地で様々な濃度に希釈したもの)を含有する混合物及び最終濃度10 μg/mlのBODIPY-(登録商標)LDL(Invitrogen, CAT#L3483)を添加し、37℃で培養した。6時間後、プレートをPBS緩衝液で2回洗浄した。マイクロプレートリーダー(EX485 nm/EM535 nm)で蛍光値を読み取った後、50 μl/ウェルのCellTiter-Glo(登録商標)細胞活性発光検出試薬(Promega, G7571)を加え、化学発光値を読み取った。LDL取込みの結果を図3及び4に示したが、これは本発明のPCSK9抗体がHepG2細胞によりLDL取込みを促進できることを示している。
ヒトFab捕獲キット(CAT#28-9583-25, GE)に記載の方法に従って、ヒトFab捕捉分子はCM5バイオチップ(CAT#BR-1000-12, GE)に共有結合し、試験抗体が親和性を獲得した。次に、ヒトPCSK9抗原(Hisタグを有するヒトPCSK9:PCSK9-His6、配列番号:1)をバイオチップの表面に流し、Biacore装置を用いて反応シグナルをリアルタイムで検出し、関連曲線及び解離曲線を得た。最後に、以下の表9に示すようにフィッティングし、親和性の値を得た。実験で各解離サイクルが終了した後、バイオチップを洗浄し、ヒトFab捕獲キット(GE)において再生溶液で再生した。
その結果、本発明のPCSK9抗体はPCSK9抗原に対して強い親和性を有することが実証された。
同じ方法を用いて本発明のPCSK9抗体のPCSK9-Y(配列番号:4)に対する親和性を検出した。その結果、本発明のPCSK9抗体はPCSK9-Y抗原に対して強い親和性を有することが実証された。
ヒトPCSK9過剰発現マウスモデルを構築し、マウスに尾静脈を介してPCSK9抗体を注射した。ヒトPCSK9過剰発現マウスにおけるin vivoでのLDL-cレベルの低下に対する本発明によるPCSK9抗体の効果を評価した。ヒトIgG(混合正常ヒト血清から、プロテインA等の伝統的アフィニティークロマトグラフィーによって精製されたヒト免疫グロブリン)をブランク対照として使用した。
C57Bl/6マウス(Shanghai Sippr-BK Laboratory Animal Co.、Ltd.から購入)を実験室環境に5日間順応し、4×1011 vgのAAV-PCSK9ウイルス(Benyuan Zhengyang Gene Technology Co. Ltd.)を尾静脈を介して注射した。ウイルス注射後、マウスを終夜絶食させた。翌日に眼瞼から血液を採取し、HDL及びLDL/VLDLコレステロール定量キット(BioVisionから購入、CAT#K613-100)でLDL-cを検出した。LDL-cの濃度に応じてマウスを無作為に群分し(6匹/群(n=6))、尾静脈注射で抗体を投与した。自家調製のヒトIgG及びh001-4-WT抗体を10mg/kgの用量で投与した(ヒトIgG及びh001-4-WT抗体の調製はいずれもPBS中で行われ、濃度は1mg/mlであった)。採血の6時間前に絶食させた。投与24時間後、48時間後、72時間後及び96時間後に眼瞼から採血し、37℃で1時間保温し、3500rpmで10分間遠心分離し、血清を-80℃で保存した。
最後の採血後、全ての凍結血清を同日に試験した。血清中のLDL-c濃度は、キットの取扱い説明書に従ってHDL及びLDL/VLDLコレステロール定量キットで測定した。
図5に示すように、正常マウスの血清におけるLDL-c濃度が約12 mg/dlであることが結果で示された。AAV8-PCSK9ウイルスを注射した後、血清中LDL-cの平均濃度は40mg/dlであった。マウスを群分し、投薬した。表10及び図6に示すように、投与24時間後にh001-4-WT群のLDL-c濃度は、IgG群と比べ50%減少し;投与48時間後にh001-4-WT群のLDL-c濃度は49%減少し;投与72時間後にh001-4-WT群のLDL-c濃度は32%減少し;投与96時間後にh001-4-WT群のLDL-c濃度は20%減少した。
まとめとして、h001-4-WTはヒトPCSK9過剰発現マウスの血清におけるLDL-c濃度を低下させることができ、この効果は72時間持続した。
競合的ELISA実験では、プレートを1つの抗体で終夜コーティングした。次いでビオチン-PCSK9-hisとコーティング抗体の50倍濃度の競合抗体を共に加えた。コーティング抗体は競合抗体と競合して抗原に結合する。次いでプレートの抗原シグナルを測定した。その結果、h001-4と21B12(US8030457B2)が抗原との結合に競合でき、2つの抗体の間に著しい競合結合はないことが示された。これは2つの抗体の抗原エピトープが異なることを示唆している。
本発明の抗体のin vivo効果及び代謝を調べるために、h001-4-WT及びh001-4-YTEをカニクイザルマカクにそれぞれin vivoで投与した。投与量は静脈内投与で3mg/kgであった。各群には3匹の雄カニクイザルマカクが含まれた。静脈注射の速度は約2~4mL/分であった。血清中のリポタンパク質、特に低密度リポタンパク質(LDL)の濃度及び抗体濃度を測定するために異なる時点で血液試料を採取した。リポタンパク質測定用の時点は、投与前及び投与後1、4、8、12、16、20、24及び28日であった。PK用の採血時点は、投与前及び投与後15分、30分、1時間、3時間、8時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、144時間、168時間、336時間、504時間及び672時間であった。
その結果(図7)、h001-4-WT及びh001-4-YTEとも、カニクイザルマカクにおけるLDLの量を有意に減少させることができ、h001-4-YTEによる減少の持続時間は、h001-4-WTによるものより優れていることが示された。
PKのために採取した血清試料中のh001-4-WT及びh001-4-YTEの量をELISA法(試験1に記載)で測定した。その結果、カニクイザルマカクにおけるh001-4-WTの半減期は4日間であり、カニクイザルマカクにおけるh001-4-YTEの半減期は7.3日間であることが示された。YTEはWTより著しく増加したin vivo半減期を有している。
Claims (33)
- それぞれ配列番号:12、配列番号:13及び配列番号:14で示されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み;及びそれぞれ配列番号:15、配列番号:16及び配列番号:17で示されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む、PCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記PCSK9抗体またはその抗原結合フラグメントがマウス抗体またはそのフラグメントである、請求項1に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- PCSK9抗体軽鎖可変領域が、更にマウスκ鎖に由来する軽鎖FR領域、またはマウスλ鎖に由来する軽鎖FR領域を含み;PCSK9抗体重鎖可変領域が、更にマウスIgG1に由来する重鎖FR領域、マウスIgG2に由来する重鎖FR領域、またはマウスIgG3に由来する重鎖FR領域を含む、請求項2に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号:10の重鎖可変領域及び配列番号:11の軽鎖可変領域を含む、請求項3に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- PCSK9抗体軽鎖が、更にマウスκ鎖に由来する軽鎖定常領域、またはマウスλ鎖に由来する軽鎖定常領域を含み;PCSK9抗体重鎖が、更にマウスIgG1に由来する重鎖定常領域、マウスIgG2に由来する重鎖定常領域、またはマウスIgG3に由来する重鎖定常領域を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- PCSK9抗体またはその抗原結合フラグメントがキメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項1に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- PCSK9抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化抗体またはそのフラグメントである、請求項1に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヒト化抗体の重鎖可変領域の重鎖FR配列が、ヒト生殖系列重鎖IGHV1-2*02及びhjh2の組合せ配列に由来し;該ヒト化抗体が、ヒト生殖系列重鎖IGHV1-2*02のFR1、FR2、FR3及びhjh2を含む、請求項7に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヒト化抗体が、配列番号:18の重鎖可変領域;または配列番号:18の変異体で示される重鎖可変領域を含み;該配列番号:18の変異体が、配列番号:18で示される重鎖可変領域に1~10個のアミノ酸変化を有する配列である、請求項8に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号:18の変異体が、配列番号:18で示される重鎖可変領域のFR領域に1~10個のアミノ酸逆突然変異を有する、請求項9に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 逆突然変異が、T30N、R87T、R72A、T74K、M48I、V68A、M70L、R38K及びR67Kから成る群より選択される、請求項10に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヒト化抗体が、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号:22及び配列番号:23から成る群より選択される重鎖可変領域を含む、請求項8に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヒト化抗体の軽鎖可変領域の軽鎖FR配列が、ヒト生殖系列軽鎖IGKV1-39*01及びhjk2.1の組合せ配列に由来し;該ヒト化抗体が、ヒト生殖系列IGKV1-39*01のFR1、FR2、FR3及びhjk2.1のFR4を含む、請求項7に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヒト化抗体が、更に配列番号:24で示される軽鎖可変領域または配列番号:24の変異体で示される軽鎖可変領域を含み;該配列番号:24の変異体が、配列番号:24で示される軽鎖可変領域に1~10個のアミノ酸変化を有する、請求項13に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号:24の変異体が、配列番号:24で示される軽鎖可変領域のFR領域に1~10個のアミノ酸逆突然変異を有する、請求項14に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 逆突然変異が、T5S、S66D、Q3V及びA49Sから成る群より選択される、請求項15に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヒト化抗体が、配列番号:25、配列番号:26及び配列番号:27から成る群より選択される軽鎖可変領域を含む、請求項13に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヒト化抗体は、1つの重鎖可変領域及び/または1つの軽鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域が、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号:22及び配列番号:23から成る群より選択され、または該重鎖可変領域が、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号:22及び配列番号:23に対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列から成る群より選択され;該軽鎖可変領域が、配列番号:25、配列番号:26及び配列番号:27から成る群より選択され、または該軽鎖可変領域が、配列番号:25、配列番号:26及び配列番号:27に対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列から成る群より選択される、請求項7に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- PCSK9抗体が、
1)配列番号:18の重鎖可変領域配列及び配列番号:25の軽鎖可変領域配列、
2)配列番号:18の重鎖可変領域配列及び配列番号:26の軽鎖可変領域配列、
3)配列番号:18の重鎖可変領域配列及び配列番号:27の軽鎖可変領域配列、
4)配列番号:19の重鎖可変領域配列及び配列番号:24の軽鎖可変領域配列、
5)配列番号:19の重鎖可変領域配列及び配列番号:25の軽鎖可変領域配列、
6)配列番号:19の重鎖可変領域配列及び配列番号:26の軽鎖可変領域配列、
7)配列番号:19の重鎖可変領域配列及び配列番号:27の軽鎖可変領域配列、
8)配列番号:20の重鎖可変領域配列及び配列番号:24の軽鎖可変領域配列、
9)配列番号:20の重鎖可変領域配列及び配列番号:25の軽鎖可変領域配列、
10)配列番号:20の重鎖可変領域配列及び配列番号:26の軽鎖可変領域配列、
11)配列番号:20の重鎖可変領域配列及び配列番号:27の軽鎖可変領域配列、
12)配列番号:21の重鎖可変領域配列及び配列番号:24の軽鎖可変領域配列、
13)配列番号:21の重鎖可変領域配列及び配列番号:25の軽鎖可変領域配列、
14)配列番号:21の重鎖可変領域配列及び配列番号:26の軽鎖可変領域配列、
15)配列番号:21の重鎖可変領域配列及び配列番号:27の軽鎖可変領域配列、
16)配列番号:22の重鎖可変領域配列及び配列番号:24の軽鎖可変領域配列、
17)配列番号:22の重鎖可変領域配列及び配列番号:25の軽鎖可変領域配列、
18)配列番号:22の重鎖可変領域配列及び配列番号:26の軽鎖可変領域配列、
19)配列番号:22の重鎖可変領域配列及び配列番号:27の軽鎖可変領域配列、
20)配列番号:23の重鎖可変領域配列及び配列番号:24の軽鎖可変領域配列、
21)配列番号:23の重鎖可変領域配列及び配列番号:25の軽鎖可変領域配列、
22)配列番号:23の重鎖可変領域配列及び配列番号:26の軽鎖可変領域配列、
23)配列番号:23の重鎖可変領域配列及び配列番号:27の軽鎖可変領域配列、及び
24)配列番号:18の重鎖可変領域配列及び配列番号:24の軽鎖可変領域配列。
から成る群より選択される1つの重鎖可変領域及び1つの軽鎖可変領域を含む、請求項7に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。 - PCSK9抗体の重鎖が、更にヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4、またはそれらの配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列に由来する重鎖定常領域を含み;
PCSK9抗体が、更にヒトκ鎖、ヒトλ鎖、またはそれらの配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列に軽鎖定常領域を含む、請求項6~19のいずれか1項に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。 - PCSK9抗体の重鎖が、ヒトIgG1、IgG2またはIgG4に由来する重鎖定常領域を含むか、またはアミノ酸変異を介して血清中の抗体の半減期を延長させるヒトIgG1、IgG2またはIgG4変異体の重鎖定常領域を含む、請求項20に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- PCSK9抗体の重鎖が、YTE突然変異が導入されたIgG1、IgG2またはIgG4の重鎖定常領域を含む、請求項21に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヒト化抗体が、
1)配列番号:28の重鎖及び配列番号:30の軽鎖、及び
2)配列番号:32の重鎖及び配列番号:30の軽鎖。
から成る群より選択される1つの重鎖及び1つの軽鎖を含む、請求項20に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 請求項1~23のいずれか1項に記載の治療的有効量のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント及び1つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含有する、医薬組成物。
- 請求項1~23のいずれか1項に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするDNA分子。
- 請求項25に記載のDNA分子を含む発現ベクター。
- 宿主細胞が、原核細胞及び真核細胞から成る群より選択される、請求項26に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 宿主細胞が、真核細胞である、請求項27に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 宿主細胞が、哺乳動物細胞である、請求項27に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項1~23のいずれか1項に記載のPCSK9抗体またはその抗原結合フラグメント、または請求項24に記載の医薬組成物の、PCSK9媒介性疾患または障害を治療するための医薬品の調製における使用。
- 疾患または障害が、コレステロール関連疾患である、請求項30に記載の使用。
- 疾患または障害が、高コレステロール血症、心臓病、メタボリックシンドローム、糖尿病、冠状動脈性心疾患、脳卒中、心血管疾患、アルツハイマー病及び一般的な脂質異常症から成る群より選択される、請求項30に記載の使用。
- 疾患または障害が、高コレステロール血症、脂質異常症、粥状動脈硬化、CVDまたは冠状動脈性心疾患である、請求項30に記載の使用。
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