MX2012010481A - Anticuerpos con union de antigenos dependiente del ph. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos con unión dependiente de pH a su antígeno de tal forma que la afinidad de unión al antígeno a pH fisiológico (es decir, pH 7.4) es mayor que a pH endosómico (es decir, pH 6.0 o 5.5); en otras palabras, la proporción de KD o la proporción de Koff a pH 5.5/pH 7.4 o a pH 6.0/pH 7.4 es más de, o varía entre, 2, 3, 4, 8, 10, 16, 20, 30, 40, o 100 o más; tales anticuerpos dependientes de pH se disocian preferencialmente del antígeno en el endosoma; esto puede incrementar la semivida del anticuerpo, en comparación con los anticuerpos con KD equivalentes a pH 7.4 pero con ninguna unión dependiente de pH, cuando el antígeno es uno que sufre la eliminación mediada por antígeno (por ejemplo, PCSK9); los anticuerpos con unión dependiente de pH pueden disminuir la semivida de antígeno total cuando el antígeno sufre eliminación reducida cuando se une a anticuerpo (por ejemplo, lL6); los anticuerpos con unión dependiente de pH también pueden prolongar el decrecimiento en antígeno que no está unido a anticuerpo; esto puede ser importante cuando se antagoniza un antígeno objetivo típicamente presente a niveles altos (por ejemplo, IgE, DKK1, C5 y SOST); además, tales anticuerpos pueden incrementar la semivida de antígeno cuando el antígeno es un receptor y el receptor tiene eliminación incrementada cuando se une a anticuerpo (por ejemplo, receptor de GMCSF).

Description

ANTICUERPOS CON UNIÓN DE ANTÍGENOS DEPENDIENTE DEL PH CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos, por ejemplo, los anticuerpos de longitud completa o partes de unión a antígeno de los mismos, que tienen unión dependiente de pH de tal forma que la proporción de KD y/o de k0ff a pH endosómico de pH/pH fisiológico (por ejemplo, pH 5.5/pH 7.4 o pH 6.0/pH 7.4) es 2 o mayor.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los anticuerpos monoclonales (mAbs) han llegado a ser importantes opciones terapéuticas para numerosas enfermedades (Brekke y Sandlie, Nat Rev Drug Discov 2: 52-62, 2003; Maggon, Curr Med Chem 14: 1978-1987, 2007). La mayoría de los mAb murinos ahora en el mercado son anticuerpos IgG. Su semivida relativamente larga está mediada por unión de FcRn. La captación de IgG en la célula tiene lugar mediante pinocitosis en fase fluida y la IgG se une subsiguientemente a FcRn en el ambiente acidificado (pH 6.0) del compartimento endosómico (Lobo y col., J Pharm Sci 93: 2645-2668, 2004). Se piensa que IgG unida a FcRn está protegida de la degradación por reciclaje a la superficie celular donde el pH neutro facilita la disociación y la liberación de la IgG en circulación. La IgG no unida, en contraste, se cree que se transfiere a los lisosomas y se degrada subsiguientemente (Lencer y Blumberg, Trends Cell Biol 15: 5-9, 2005).

Recientemente, se han aplicado diversas tecnologías para optimizar la actividad funcional de un anticuerpo IgG introduciendo sustituciones específicas con el fin de reducir dosis y/o frecuencia de dosis y mejorar la eficacia y la seguridad (Presta, Curr. Opinión Immunol 20: 460-470, 2008). Generalmente, la optimización de anticuerpos IgG puede clasificarse en manipular la región constante de Fe, para tener impacto sobre unión de anticuerpo a FcRn, FcyR y el sistema de complemento y en manipular la región variable para tener impacto sobre la afinidad de unión.

Varios trabajos describen la manipulación de la región constante para incrementar la unión a ' receptores de Fe y potenciar así la función efectora de un anticuerpo lgG1 (Stavenhagen y col., Cáncer Res 67: 8882-8890, 2007; Zalevsky y col., Blood 113: 3735-3743, 2009). Se ha mostrado que sustituciones tales como S239D/I332E/A330L o F243L/R292P/Y300U en lgG mejoran la unión al "(receptor de Fe Illa y presentan citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo superior (ADCC) y actividad in vitro superior y eficacia in vivo superior comparadas con la lgG1 de tipo silvestre. Así, en comparación con anticuerpos de tipo silvestre, los anticuerpos con tales sustituciones se espera que muestren eficacia superior a la misma dosis o eficacia comparable a dosis más baja y/o con menor frecuencia de dosificación en el ser humano.

Otro procedimiento para reducir la dosis y/o la frecuencia de dosificación es reducir la eliminación de un anticuerpo IgG. Se comunica que la semivida larga de anticuerpos IgG es dependiente de su unión a FcRn. Por lo tanto, se han estudiado extensamente las sustituciones que aumentan la afinidad de unión de la IgG a FcRn a pH 6.0 manteniendo mientras la dependencia de pH de la interacción manipulando la región constante (Ghetie y col., Nature Biotech. 15: 637-640, 1997; Hinton y col., JBC 279: 6213-6216, 2004; Dall'Acqua y col., J Immunol 1 17: 1129-1 138, 2006). Sustituciones tales como M428UN434S, condujeron a semivida incrementada y a un efecto farmacodinámino incrementado en las variantes (Zalevsky y col., Nature Biotech. 28: 157-159, 2010). Varios trabajos han comunicado incremento exitoso en la semivida introduciendo sustituciones tales como T250Q/M428L o M252Y/S254T7T256E para incrementarla unión a FcRn a un pH ácido. En un estudio farmacocinético en primate no humano, la sustitución de T250Q/M428L para lgG1 mostró una semivida de 35 días, un incremento significativo de la semivida de 14 días de lgG1 por encima de la lgG1 de tipo silvestre (Hinton y col., J Immunol 76: 346-356, 2006).

Aunque sustituciones en la región constante son capaces de incrementar significativamente las funciones de anticuerpos IgG terapéuticos, las sustituciones en la región conservada de un modo estricto tienen el riesgo de inmunogenicidad en ser humano (Presta, ant., 2008; De Groot y Martin, Clin Immunol 131 : 189-201 , 2009) y la sustitución en la secuencia de región variable altamente diversa podría ser menos inmunogénica. Los informes que se refieren a la región variable incluyen manipular los residuos de CDR para mejorar afinidad de unión al antígeno (Rothe y col., Expert Opin Biol Ther 6: 177-187, 2006; Bostrom y col., Methods Mol Biol 525: 353-376, 2009; Thie y col., Methods Mol Biol 525: 309-322, 2009) y manipular los CDR y los restos estructurales para mejorar la estabilidad (Wórn y Plückthun, J Mol Biol 305: 989-1010, 2001 ; Ewert y col., Methods 34: 184-199, 2004) y disminuir el riesgo de inmunogenicidad (De Groot y Martin, ant., 2009; Jones y col., Methods Mol Bio 525: 405-423, XIV, 2009). Como se indica, se puede lograr afinidad mejorada para el antígeno por maduración de afinidad usando la presentación de fagos o ribosomas de una biblioteca al azar. Se puede obtener racionalmente estabilidad mejorada a partir de diseño racional basado en secuencia y basado en estructura. El riesgo de inmunogenicidad disminuido (desinmunización) puede llevarse a cabo por diversas metodologías de humanización y por la eliminación de epítopos de células T, lo que se puede predecir usando en tecnologías de sílice o se puede determinar por ensayos in vitro.. Adicionalmente, se han manipulado regiones variables para bajar pl. Se observó una semivida más larga para estos anticuerpos en comparación con anticuerpos de tipo silvestre a pesar de unión de FcRn comparable (Igawa y col., PEDS, Advance Access, doi: 10.1093/protein/gzq009, 2010).

La presente invención se refiere a manipular o a seleccionar anticuerpos con unión de antígenos dependiente de pH para modificar semivida de anticuerpo y/o de antígeno. La semivida de anticuerpo lgG2 se puede acortar si los mecanismos de eliminación mediados por antigenos degradan el anticuerpo cuando está unido al antígeno. De forma similar, el complejo antígeno:anticuerpo puede tener impacto en la semivida del antígeno, bien prolongando la semivida protegiendo el antígeno de los procesos de degradación típicos, o bien acortando la semivida por medio de degradación mediada por anticuerpo. La presente invención se refiere a anticuerpos con afinidad más alta por antígenos a pH 7.4 según se compara con pH endosómico (es decir, pH 5.5-6.0) de tal forma que la proporción KD a pH 5.5/pH 7.4 o a pH 6.0/pH 7.4 es 2 o más.

La invención se refiere a un anticuerpo con unión dependiente de pH tal a su antígeno y procedimientos de diseñar, preparar y usar tales anticuerpos. Ejemplos de antígenos objetivo de anticuerpos útiles tales como kexina subtilisina convertasa proproteína de tipo 9 (PCSK9), también conocida como NARC-1 , IgE, proteína relacionada con dickkopf 1 (DKK1), Complemento 5 (C5), esclerostina (SOST) y receptor de GMCSF.

Se ha identificado PCSK9 como una proteína con una mutación genética en algunas formas de hipercolesterolemia familiar. PCSK9 está sintetizada como un zimógeno que sufre procesamiento autocatalitico en un resto particular en el retículo endoplásmico. Estudios de población han mostrado que algunas mutaciones de PCSK9 son de "ganancia de función" y se encuentran en individuos con hipercolesterolemia dominante autosómica, mientras que otras mutaciones de "pérdida de función" (LOF) están ligadas con colesterol reducido en plasma. Estudios de morbilidad y mortalidad en este grupo demostraron claramente que reducir función de PCSK9 disminuyó significativamente el riesgo de enfermedad cardiovascular.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos con unión dependiente de pH a su antígeno de tal forma que la afinidad de unión al antigeno a pH fisiológico (es decir, pH 7.4) es mayor que a pH endosomico (es decir, pH 6.0 o 5.5). En otras palabras, la proporción de KD O la proporción de k0ff a pH 5.5/pH 7.4 o a pH 6.0/pH 7.4 es más de, o varía entre, 2, 3, 4, 8, 10, 16, 20, 30, 40, o 100 o más. Tales anticuerpos dependientes de pH se disocian preferencialmente del antígeno en el endosoma. Esto puede incrementar la semivida del anticuerpo, en comparación con los anticuerpos con KD equivalentes a pH 7.4 pero sin ninguna unión dependiente de pH, cuando el antígeno es uno que sufre la eliminación mediada por antígeno (por ejemplo, PCSK9). Los anticuerpos con unión dependiente de pH pueden disminuir la semivida de antígeno total cuando el antígeno sufre eliminación reducida cuando se une a anticuerpo (por ejemplo, IL6). Los anticuerpos con unión dependiente de pH también pueden prolongar la disminución mediada por anticuerpo en antígeno que no está unido a anticuerpo. Esto puede ser importante cuando se antagoniza un antígeno objetivo presente típicamente a niveles altos (por ejemplo, IgE, DKK1 , C5 y SOST). Además, tales anticuerpos pueden incrementar la semivida de antígeno cuando el antígeno es un receptor y el receptor tiene eliminación incrementada cuando se une a anticuerpo (por ejemplo, receptor de GMCSF). En cualquier modalidad de la invención descrita a continuación, la KD y la k0ff pueden medirse bien a 25°C o bien a 37°C.

En una modalidad preferida, el anticuerpo con unión dependiente de pH que une específicamente un antígeno con una afinidad más alta a pH 7.4 que a pH 6.0, en el que la proporción de KD y/o la proporción de k0ff pH 6.0/pH 7.4 y a 25°C es más de, o varía entre, 2, 3, 4, 8, 10, 16, o más, y en el que el anticuerpo ha reducido eliminación in vivo de plasma cuando se expone a dicho antígeno según se compara con un anticuerpo sin unión dependiente de pH que tenga una afinidad similar por el antígeno a pH 7.4, pero que tenga una proporción de KD y/o k0ff comparable a pH 6.0/pH 7.4 que sea inferior a 2. Preferentemente, el antígeno no es receptor de interleucina-6 (IL6R), o, preferentemente, el anticuerpo no es un anticuerpo Fv3-m73, Fv4-m73 o H3pl/L73 anti-IL6R como se desvela en el documento WO 2010/106812 o el documento WO 2009/041621.

En otra modalidad preferida, el anticuerpo con unión dependiente de pH que une específicamente un antígeno con una afinidad más alta a pH 7.4 que a pH 6.0, en el que la proporción de K D y/o la proporción de k0ff a pH 6.0/pH 7.4 y a 25°C es más de, o varía entre, 2, 3, 4, 8, 10, 16, o más, y en el que el antígeno está tanto unido a membrana como soluble in vivo y en el que el anticuerpo media localización incrementada a un receptor de membrana celular según se compara con un anticuerpo que tenga una afinidad similar por el antígeno a pH 7.4 pero que tenga una proporción comparable de Ko y/o de koff a pH 6.0/pH 7.4 que sea inferior a 2. Preferentemente, el antígeno no es el IL6R o, preferentemente, el anticuerpo no es un anticuerpo anti-IL6R Fv3-m73, Fv4-m73 o H3pl/L73 como se describe en el documento WO 2010/106812 o en el documento WO 2009/041621. En otra modalidad preferida, el antígeno es un receptor soluble que es una estructura señuelo no señalizadora. Todavía en otras modalidades preferidas, el anticuerpo con unión dependiente de pH es un conjugado de fármacos de anticuerpos, media citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC).

La invención incluye un anticuerpo con unión dependiente de pH que se une específicamente a un antígeno con una afinidad más alta a pH 7.4 que a pH 6.0, en el que la proporción de K D y/o la proporción de koff a pH 6.0/pH 7.4 y a 25CC es más de, o varía entre, 2, 3, 4, 8, 10, 16, o más, y en el que el decrecimiento en la cantidad in vivo de anticuerpo no unido a antígeno se prolonga cuando se expone a dicho anticuerpo en comparación con un anticuerpo sin unión dependiente de pH que tenga una afinidad similar por el antígeno a pH 7.4, pero tenga una proporción comparable de KD y/o de k0ff a pH 6.0/pH 7.4 que sea menos de 2.

La invención proporciona un anticuerpo con unión dependiente de pH que se une específicamente a un antígeno con una afinidad más alta a pH 7.4 que a pH 6.0, en el que la proporción de KD y/o la proporción de k0ff a pH 6.0/pH 7.4 y a 25°C es más de, o varía entre, 2, 3, 4, 8, 10, 16, o más, y en el que hay una disminución en la cantidad de anticuerpo unido a antígeno in vivo en comparación con un anticuerpo sin unión dependiente de pH que tenga una afinidad similar por el antígeno a pH 7.4, pero tenga una proporción de K o y/o de koff a pH 6.0/pH 7.4 y a 25°C que sea menos de 2. En una modalidad preferida, el antígeno es osteopontina.

La invención también proporciona un anticuerpo agonista con unión dependiente de pH que se une específicamente a un antígeno con una afinidad más alta a pH 7.4 que a pH 6.0, en el que la proporción de KD y/o la proporción de koff a pH 6.0/pH 7.4 y a 25°C es más de, o varía entre, 2, 3, 4, 8, 10, 16, o más, y en el que el antigeno es un receptor y el receptor tiene eliminación reducida in vivo cuando se expone a dicho anticuerpo en comparación con un anticuerpo que tenga afinidad similar por el receptor a pH 7.4, pero tenga una proporción comparable de KD y/o de k0ff a pH 6.0/pH 7.4 que sea menos de 2. En una modalidad preferida, el receptor es receptor de GMCSF.

En otras modalidades preferidas de cualquiera de los anticuerpos precedentes, la proporción de KD O la proporción de k0« a pH 6.0/pH 7.4 es más de, o varía entre, 20, 30, 40 o 100 o más. En otras modalidades preferidas, la proporción de KD o koff a pH 6.0/pH 7.4 varía entre 2-3, 2-4, 2-8, 2-10, 2-16, o 2-20 o más, o 3-4, 3-8, 3-10, 3-16 o 3-20, o 4-8, 4-10, 4-16, o 4-20 o más, u 8 a 10, 8-16, 8-20 o más, 10-16, 10-20 o más, o 16-20 o más.

En otras modalidades preferidas de los anticuerpos previamente descritos, la unión de anticuerpo al antígeno a pH 7.4 y a pH 25°C tiene una KD de aproximadamente 0.01 nM a aproximadamente 100 nM, o, más preferentemente, a aproximadamente 0.1 nM a aproximadamente 10 nM.

En otras modalidades preferidas de los anticuerpos previamente descritos, la unión del anticuerpo al antigeno a pH 7.4 tiene una k0ff de aproximadamente 1x10E-4 s-1 a aproximadamente 1x10E-1 s-1 , más preferentemente, de aproximadamente 1x10E-3 s-1 a aproximadamente 1x10E-1 s-1.

En otra modalidad preferida de los anticuerpos descritos previamente, el antigeno es PCSK9. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-PCSK9 no es el anticuerpo de PCSK9 H1 M300N (véase el documento US2010/0166768). En otras modalidades preferidas, el antigeno es IgE, C5, o DKK1 y, en modalidades preferidas, la KD varia entre 1.0 nM a aproximadamente 10 nM o entre 1.0 nM a aproximadamente 100 nM.

La invención también proporciona un procedimiento de prolongar dosificación y/o disminuir la dosis terapéutica para tratar un paciente con un anticuerpo terapéutico, comprendiendo dicho procedimiento administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de cualquiera de los anticuerpos previamente descritos de la invención, en el que dicho anticuerpo tiene un efecto farmacodinámico prolongado y/o una semivida prolongada comparado con un anticuerpo que tenga afinidad similar a pH 7.4, pero que tenga una proporción de KD y/o una proporción de koff a pH 6.0/7.4 y a 25°C que sea menos de 2.

También está contemplado por la invención un procedimiento de fabricar un anticuerpo con semivida prolongada y/o efecto farmacodinámico por regulación de afinidad de unión de anticuerpos en una manera dependiente de pH, comprendiendo dicho procedimiento seleccionar para residuos de histidina de CDR de anticuerpos u otros residuos que optimizan el microambiente que afecta a pKa, de tal forma que la unión de antígeno a anticuerpo tiene una proporción de Ko y/o una proporción de kCff a pH 6.0/pH 7.4 que es más de, o varía entre, 2, 3, 4, 8, 10, 16, o más. La invención contempla también anticuerpos elaborados por este procedimiento, incluyendo anticuerpos con 1 , 2, 3, 4, 5 o más sustituciones de histidina en los residuos de CDR que optimizan el microambiente que afecta a pKa.

En una modalidad preferida del procedimiento descrito anteriormente, el procedimiento comprende además mutagenizar el anticuerpo para lograr afinidad a anticuerpo con una KD a pH 7.4 de al menos 100 nM como se mide a 25°C. En otra modalidad, la invención proporciona una biblioteca de anticuerpos enriquecida con histidinas en residuos de CDR u otros residuos que optimizan el microambiente que afecta a pKa.

En otras modalidades preferidas, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a PCSK9 y comprende una región determinante de la complementariedad de región variable de cadena pesada (VH) uno (CDR1), una CDR2 de VH, y una CDR3 de VH de la secuencia de aminoácidos de VH mostrada en SEQ ID N.°: 4 o 5 o una variante de las mismas que tenga una, dos, tres o más sustituciones de aminoácidos conservadoras en CDR1 , CDR2, y/o CDR3.

En una modalidad preferida, el anticuerpo comprende adicionalmente la CDR1 , la CDR2 y la CDR3 de la región variable de cadena ligera (VL) de la secuencia de aminoácidos de VL mostrada en SEQ ID N.°: 3 o una variante de la misma que tenga una, dos, tres o más sustituciones conservadoras de aminoácidos en CDR1 , CDR2, y/o CDR3.

La invención también proporciona anticuerpo aislado que se une específicamente a PCSK9 y comprende una región determinante de complementariedad de región variable de cadena pesada (VH) uno (CDR1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N.°: 6 , una CDR2 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N.°: 7 , y/o CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N.0.: 8, o una variante de las mismas que tenga una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos en CDR1 , CDR2, y/o CDR3, asi como un anticuerpo aislado que se une específicamente a PCSK9 y comprende una CDR1 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N.°: 6 , una CDR2 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N.°: 7 , y/o CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N.°: 9 , o una variante de las mismas que tenga una, dos, tres o más sustituciones conservadoras de aminoácidos en CDR1 , CDR2, y/o CDR3.

En una modalidad adicional, la invención contempla un anticuerpo aislado que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 (VL) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N.°: 10, una CDR2 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N.°: 11 , y/o CDR3 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N.°: 12 , o una variante de las mismas que tienen uno, dos, tres o más sustituciones conservadoras de aminoácidos en CDR1 , CDR2, y/o CDR3.

En modalidades preferidas de lo anterior, el anticuerpo comprende adicionalmente una VL de CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N.°: 10 , una CDR2 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N.°: 1 1 , y/o CDR3 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N.°: 12 , o una variante de las mismas que tienen uno, dos, tres o más sustituciones conservadoras de aminoácidos en CDR1 , CDR2, y/o CDR3, preferentemente, la región VH comprende SEQ ID N.°: 4 o SEQ ID N°: 5 y la región VL comprende SEQ ID N.°: 3, o una variante de las mismas que tienen uno, dos, tres o más sustituciones conservadoras de aminoácidos en la SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N °: 5 y/o SEQ ID N °: 3.

En otra modalidad preferida de los anticuerpos de PCSK9 de la presente invención, el anticuerpo tiene una o más mutaciones de Fe, preferentemente, N434S, N434H, mutante doble M428L-N434H, mutante doble M428L-N434A, mutante doble T250Q-M428L, y mutante doble M428L-N434S.

En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo o parte de unión a antigeno del mismo, codificada por los plásmidos depositados en la ATCC y que tiene N.° de Acceso de ATCC PTA-10547, o PTA-10548, y/o PTA-10549.

También están contempladas por la invención composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente, una célula hospedante que recombinantemente produce el anticuerpo de cualquiera de los anticuerpos descritos previamente, un ácido nucleico aislado que codifica cualesquiera anticuerpos descritos previamente y un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos previamente descritos.

También está contemplado por la invención un procedimiento para reducir un nivel de LDL-colesterol en la sangre de un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos de la invención dirigido a antígeno PCSK9.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una gráfica que muestra el incremento en la concentración de anticuerpo a lo largo del tiempo como una función de la proporción de KD.

Figura 2 es una gráfica que muestra la disminución en ligando libre (antígeno) a lo largo del tiempo como una función de la proporción de KD- Figuras 3A-3B son gráficas que muestran el efecto de cambiar kD y kA en la concentración de anticuerpo a lo largo del tiempo.

Las figuras 4A-4B son presentaciones de mapa de calor que muestran cuantos días más un anticuerpo con unión dependiente de pH suero podría disminuir concentración de antígeno como una función de Q (R), semivida en suero de antígeno y concentración sérica de antigeno. R es equivalente a la proporción de KD a pH endosómico frente a pH fisiológico.

Las figuras 5A-5B validan la predictíbilidad del modelado de anticuerpos dependiente de pH. El modelo predijo exitosamente la concentración de anticuerpo total para 5A10 (Figura 5A). La figura 5B es una gráfica que demuestra el efecto del curso temporal de 5A10 en LDL.

Las figuras 6A-6B también validan la predictíbilidad del modelado de anticuerpos dependiente de pH. El modelo predijo exitosamente la concentración de anticuerpo total para 5L1721 H23 6L3H3 (6L3H3) (Figura 6A). La figura 6B es una gráfica que demuestra el efecto del curso temporal de 6L3H3 en LDL. El anticuerpo de unión dependiente de pH 6L3H3 prolongó el intervalo en el que LDL estuvieron disminuyendo en comparación con 5A 0.

Las figuras 7A-7B muestran el curso temporal del efecto de colesterol total cuando se administran diversos anticuerpos de PCSK9. La figura 7A muestra el efecto dependiente de dosis de 5A10 en colesterol total. La figura 7B muestra el efecto dependiente de dosis de anticuerpo dependiente de pH 5L1721 H23 _ 6H3. Este efecto se prolonga en comparación con el efecto de 5A10.

Las figuras 8A-8B son gráficas que muestran que los anticuerpos con unión dependiente de pH, 5L1721 H23 _6H3 y 5L1721 H23 _ 6L3H3, tienen degradación de anticuerpo reducida y una semivida prolongada comparados con anticuerpos sin unión dependiente de pH. La figura 8B es una gráfica que demuestra que el efecto mostrado en la Figura 8A se debe a degradación mediada por objetivo. La degradación de anticuerpo en ratones con PCSK9 anulado aumenta espectacularmente tras la inyección de PCSK9.

Las figuras 9A-9B son gráficas que ilustran el efecto de anticuerpos antagonistas de PCSK9 sensibles a pH y de anticuerpos antagonistas de PCSK9 no sensibles a pH en los niveles de colesterol en ratones. Mientras que no se detectó cambio espectacular en niveles de HDL (Figura 9A), los anticuerpos sensibles a pH mediaron una reducción más prolongada en niveles de LDL comparados con anticuerpo L1 L3 no dependiente de pH.

La figura 10 es una gráfica que demuestra que los anticuerpos PCSK9 con unión dependiente de pH tienen una semivida in vivo prolongada comparada con los anticuerpos no dependientes de pH.

La figura 11 es un mapa de calor que muestra el mapa de modelado general para unión dependiente de pH. Tales anticuerpos dirigidos contra antígenos DKK1 , IgE, o C5, pueden incrementar significativamente el número de días que el antigeno experimentó niveles reducidos de antígeno comparado con un anticuerpo sin unión dependiente de pH.

La figura 12 modela el curso temporal para concentración de antígeno tras la administración de un anticuerpo con unión dependiente de pH dirigido contra antígeno IgE.

La figura 3 modela el curso temporal para la concentración de antígeno tras la administración de un anticuerpo con unión dependiente de pH dirigido contra antígeno DKK1.

La figura 14 modela el curso temporal para la concentración de antígeno después de administración de un anticuerpo con unión dependiente de pH dirigido contra antígeno C5.

La figura 15 detalla el modelo de tráfico para anticuerpos con unión dependiente de pH usado para modelar.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos con unión dependiente de pH a su antígeno de tal forma que la afinidad de unión al antígeno a pH fisiológico (es decir, pH 7.4) es mayor que a pH endosómico (es decir, pH 6.0 o 5.5). En otras palabras, la proporción de KD o ofí a pH 5.5/pH 7.4 o a pH 6.0/pH 7.4 es más de, o varía entre, 2, 3, 4, 8, 10, 16, 20, 30, 40, o 100 o más. Tales anticuerpos dependientes de pH se disocian preferencialmente del antígeno en el endosoma. Esto puede incrementar semivida de anticuerpos en la circulación, en comparación con los anticuerpos con equivalente KD a pH 7.4 pero sin ninguna unión dependiente de pH, cuando el antígeno es uno que sufre la eliminación mediada por antígeno (por ejemplo, PCSK9). Los anticuerpos con unión dependiente de pH pueden disminuir la semivida del antígeno total promedio cuando el antígeno sufre eliminación reducida cuando se une a anticuerpo (por ejemplo, IL6). Los anticuerpos con unión dependiente de pH también pueden prolongar la disminución en antigeno que no está unido a anticuerpo. Esto puede ser importante cuando se antagoniza un antígeno objetivo presente típicamente a niveles altos (por ejemplo, IgE, DKK1 , C5 y SOST). Además, tales anticuerpos pueden incrementar semivida de antígeno cuando el antígeno es un receptor y el receptor ha incrementado la eliminación cuando está unido a anticuerpo (por ejemplo, receptor de GMCSF).

Si el antígeno media degradación mediada por objetivo, después usar después tales anticuerpos con unión dependiente de pH para lograr disociación en el endosoma puede incrementar el efecto farmacodinámico del anticuerpo, por ejemplo, cuando el antígeno sufre la eliminación mediada por objetivo (por ejemplo, PCSK9). El anticuerpo con unión dependiente de pH se disocia del antígeno, se escapa de degradación mediada por antígeno, puede reciclarse fuera de la célula por medio de unión de FcRn y tendrá una semivida más larga que un anticuerpo con KD similar a pH 7.4 pero sin ninguna unión dependiente de pH.

Usar tales anticuerpos con unión dependiente de pH es también útil terapéuticamente cuando el antígeno soluble está presente a concentración alta (por ejemplo, IgE, C5, DKK1 , o SOST). Después de disociación del antígeno en el endosoma y de degradación de antígeno en la lisozima, el anticuerpo puede reciclarse en el plasma para unir antígeno libre adicional, puede prolongar la disminución en antígenos no unidos a anticuerpos, y puede disminuir la dosis terapéutica requerida, en comparación con un anticuerpo con Ko similar a pH 7.4 pero sin unión dependiente de pH.

Adicionalmente, usar anticuerpos con unión dependiente de pH puede ser útil cuando el antígeno está presente unido en membrana así como en forma soluble, por ejemplo, un receptor, y se desea para potenciar a la forma unida a membrana. Disociando a partir de la forma soluble, el anticuerpo tiene la oportunidad incrementada para re-unirse a la forma de membrana, incrementando el anticuerpo en proximidad a la membrana celular. Si unido a la membrana toma forma en una manera divalente, la afinidad efectiva puede ser más alta, o la velocidad de disociación efectiva puede ser más baja, por el efecto de avidez.

Esto tiene aplicación para usar conjugados anticuerpo-fármaco (CAF) cuando se toma como objetivo un antígeno presente tanto en forma unida a membrana como en forma soluble. En células que contienen FcRn en el endotelio, los antígenos solubles se eliminarían con el CAF reciclándose al compartimento de plasma teniendo en cuenta oportunidad para unirse a antigeno unido a membrana. Con anticuerpos con unión dependiente de pH, la unión incrementada a la forma de membrana enlazada, bien divalentemente o bien monovalentemente, causará la internalización de anticuerpos incrementada con el antígeno unido a membrana y muerte celular. Si se une al receptor en una forma divalente, la avidez puede incrementar la afinidad efectiva eficaz o puede ralentizar la velocidad de disociación efectiva.

El mecanismo por CCDA y la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) también se pueden explotar en usar anticuerpos con unión dependiente de pH. En células que contienen FcRn en el endotelio, el antígeno soluble se aclarará y el CAF se reciclará al compartimento de plasma, teniendo en cuenta la oportunidad de unir antígeno unido a membrana. Liberar los anticuerpos del receptor soluble incrementará el anticuerpo libre disponible que podrá unirse después a antígeno unido a membrana e incrementará matanza celular.

Técnicas Generales La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo células recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la habilidad en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía, tal como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook y col., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.l. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Biol. y P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, y D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y P.F. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel y col., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullís y col., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan y col., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Coligan y col., Janeway Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Carril (Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Definiciones Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unión específica a un objetivo, tal como un carbohidrato, polinucleótído, lípído, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, localizado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en el presente documento, el término abarca no sólo anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también cualquier fragmento de unión a antígeno de los mismos (es decir, "parte de unión a antígeno") o de cadena simple de los mismos, las proteínas de condensación que comprenden un anticuerpo y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antigeno, incluyendo, por ejemplo sin limitación, cadena sencilla (scFv) y anticuerpos de dominio (por ejemplo, anticuerpos de dominio humanos, de camélidos o de tiburones), maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, vNAR y bis-scFv (véase por ejemplo, Hollinger y Hudson, Nature Biotech 23: 1 126-1 136, 2005). Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgG, IgA, o IgM (o subclase de los mismos), y el anticuerpo no es necesario que sea de cualquier clase particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo del dominio constante de sus cadenas pesadas, se pueden asignar las inmunoglobulinas a diferentes clases: Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de éstos pueden además dividirse en "subclases" (isotipos), por ejemplo IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA e lgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

El término "parte de unión de antigenos" de un anticuerpo, tal como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo intacto que retiene(n) la capacidad de unir específicamente a un antígeno dado (por ejemplo, objetivo X). Las funciones de unión de antígeno de un anticuerpo se pueden llevar a cabo por fragmentos de un anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de unión comprendidos dentro del término "parte de unión de antígenos" de un anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')2, un fragmento Fd constituido por los dominios VH y CH1 , un fragmento Fv constituido por los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo de dominio sencillo (dAb) (Ward y cois., Nature 341 : 544-546, 1989), y una región determinante de complementariedad aislada (CDR).

Como se usa en el presente documento, la "CDR" puede definirse de acuerdo con cualquiera de las definiciones de Kabat, de Chothia, extendida, de AbM, de contacto, y/o conformacional. La identidad de los residuos aminoacídicos en un anticuerpo particular que conforman una CDR puede determinarse usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las CDR de un anticuerpo pueden identificarse como regiones hipervariables definidas originariamente por Kabat y col. Véase E.A. Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C. Las posiciones de las CDR también pueden definirse como las estructuras de bucles estructurales que describieron originariamente Chotia y otros. Véase, por ejemplo, Chothia y col., Nature 342: 877-883, 1989. Otras estrategias de identificación de CDR incluyen la "definición de AbM," que está a medio camino entre Kabat y Chotia y se deriva usando el software de modelado de anticuerpos Oxford Molecular's AbM (actualmente Accelrys ®), o la "definición de contacto" de las CDR en base a los contactos de antígenos observados, expuesta en MacCallum y col., J. Mol. Biol. 262: 732-745, 1996. En otra aproximación, referida en el presente documento como la "definición conformacional" de las CDR, las posiciones de las CDR pueden identificarse como los residuos que hacen contribuciones entálpicas a la unión a antígenos. Véase, por ejemplo, Makabe y col., Journal of Biological Chemistry, 283: 1156-1166, 2008. Todavía otras definiciones limite pueden no seguir estrictamente una de las aproximaciones anteriores, pero no obstante se solaparán con al menos una parte de CDR de Kabat, aunque pueden puede acortarse o alargarse a la luz de predicción o de hallazgos experimentales de que residuos o grupos de residuos o incluso CDR enteros no tienen impacto significativamente en unión a antígenos. Como se usa en el presente documento, un CDR puede referirse a CDR definido por cualquier aproximación conocida en la técnica, incluyendo combinaciones de aproximaciones.

Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo monoclonal", se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos salvo por posibles mutaciones, por ejemplo mutaciones naturales, que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un determinante individual sobre un antígeno. El modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se puede interpretar como producción requerida del anticuerpo por cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usarse de acuerdo con la presente invención pueden prepararse por el procedimiento de hibridoma descrito primeramente por Kohler y Milstein, 1975, Nature 256: 495, o pueden fabricarse mediante procedimientos de ADN recombinante tal como se describe en la Patente de los E.E.U.U. N.°: 4,816,567. Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse a partir de colecciones de fagos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty y col., 1990, Nature 348: 552-554, por ejemplo.

Como se usa en el presente documento, anticuerpos "humanizados" se refiere a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos), anticuerpos que son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas, o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. Preferentemente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor están reemplazados por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, o conejo que tengan la especificidad, afinidad, y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias importadas de CDR o las secuencias estructurales importadas, pero están incluidos para retinar y optimizar la actuación del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos los al menos uno y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá óptimamente al menos una parte de una región o dominio constante (Fe) de inmunoglobulina, típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Se prefieren anticuerpos que tienen regiones Fe modificadas como se describen en el documento WO 99/58572. Otras formas de anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (CDR L1 , CDR L2, CDR L3, CDR H1 , CDR H2 y/o CDR H3) que están alteradas con respecto al anticuerpo original, que se denominan también una o más CDR "derivadas de" una o más CDR del anticuerpo original.

Como se usa en el presente documento, "anticuerpo humano" quiere decir un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un anticuerpo que se pueden producir por un ser humano y/o que se ha elaborado usando cualquiera de las técnicas para elaborar anticuerpos humanos conocidas por aquellos expertos en la técnica o descritas en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de cadena pesada humano o al menos un polipéptido de cadena ligera humano. Un ejemplo tal es un anticuerpo que comprende polipéptidos de cadena ligera murina y cadena pesada humana. Los anticuerpos humanos pueden producirse usando diversas técnicas conocidas en la técnica. En una modalidad, el anticuerpo humano se selecciona a partir de una biblioteca de fagos, donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan y col., 1996, Nature Biotechnology, 14: 309-314; Sheets y cois., 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. (EE.UU.) 95: 6157-6162; Hoogenboom y Winter, 1991 , J. Mol. Biol., 227: 381; Marks y col., 1991 , J. Mol. Biol., 222: 581). Los anticuerpos humanos pueden también fabricarse mediante inmunización de animales dentro de los que los loci de ¡nmunoglobulina humana se han introducido transgénicamente en lugar de los loci endógenos, por ejemplo, los ratones en los que los genes de inmunoglobulinas endógenas están parcialmente o completamente inactivados. Esta técnica se describe en las Patentes de EE.UU. N.oS: 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661 ,016. Alternativamente, el anticuerpo humano se puede preparar mediante linfocitos B humanos que se inmortalizan que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno objetivo (linfocitos B tales que pueden recuperarse de un individuo o que pueden haber sido inmunizados in vitro). Véase, por ejemplo, Colé y col. Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner y col., 1991 , J. Immunol., 147 (1): 86-95; y la Patente de EE.UU. N.°: 5,750,373.

Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o a la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, bien solas o bien en combinación. Como se conoce en la técnica, las regiones variables de la cadena pesada y ligera cada constan cada una de cuatro regiones estructurales (FR) conectadas por tres regiones de determinación de complementariedad (CDR) que contienen regiones hipervariables. Las CDR en cada cadena se mantienen conjuntamente en proximidad cercana por las FR y, con las otras CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de anticuerpos. Hay al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) una aproximación en base a variabilidad de secuencia entre especies cruzada (es decir, Kabat y col. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a ed., 1991 , National Institutes of Health, Bethesda MD))¡ y (2) una aproximación en base a estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Al-lazikani y col., 1997, J. Molec. Biol. 273: 927-948). Como se usa en el presente documento, una CDR se puede referir a CDR definidas bien por aproximación o por una combinación de ambas aproximaciones.

Como se conoce en la técnica una "región constante" de un anticuerpo se refiere a la región constante de la cadena ligera del anticuerpo o a la región constante de la cadena pesada del anticuerpo, bien solas o bien en combinación.

Como se usa en el presente documento, el término "PCSK9" se refiere a cualquier forma de PCSK9 y a variantes de la misma que conserven al menos parte de la actividad de PCSK9. A menos que se indique de forma diferente, tal como por una referencia específica a PCSK9 humana, PCSK9 incluye todas las especies de mamíferos PCSK9 de secuencia nativa, por ejemplo, humanas, caninas, felinas, equinas y bovinas. Una PCSK9 humana ejemplar se encuentra como Número De Acceso Uniprot Q8NBP7 (SEQ ID N.°: 16).

Tal como se usa en el presente documento, un "anticuerpo antagonista de PCSK9" se refiere a un anticuerpo que es capaz de inhibir actividad biológica de PCSK9 y/o de inhibir más adelante en la(s) ruta(s) mediadas por señalización de PCSK9, incluyendo regulación a la baja del LDLR mediada por PKSK9 y disminución mediada por PCSK9 en eliminación en la sangre de LDL. Un anticuerpo antagonista de PCSK9 dependiente de pH comprende anticuerpos que bloquean, antagonizan, suprimen o reducen (incluyendo significativamente a cualquier grado) actividad biológica de PCSK9, incluyendo anticuerpos que bloquean, antagonizan, suprimen o reducen rutas de señalización mediadas más adelante por PCSK9, tales como interacción de LDLR y/o provocación de respuesta celular a PCSK9. Para el propósito de la presente invención, se entenderá explícitamente que el término "anticuerpo antagonista de PCSK9" engloba todos los términos, títulos y estados funcionales y características previamente identificados por los que PCSK9 en sí, una actividad biológica de PCSK9 (incluyendo pero no limitadas a su capacidad para mediar cualquier aspecto de la interacción con el LDLR, regulación a la baja de LDLR, y eliminación a la baja de LDL), o las consecuencias de la actividad biológica, son sustancialmente anulados, disminuidos, o neutralizados en cualquier grado significativo. En algunas modalidades, un anticuerpo antagonista de PCSK9 dependiente de pH se une a PCSK9 y evita la interacción con el LDLR. Ejemplos de anticuerpos antagonistas de PCSK9 se proporcionan en el presente documento.

Los términos "polipéptido", "oligopéptido", "péptido" y "proteína" se usan intercambiablemente en el presente documento para referirse a cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, preferentemente, relativamente corta (por ejemplo, 10-100 aminoácidos). La cadena pueden ser lineal o ramificada, puede comprender aminoácidos modificados y/o puede interrumpirse por no aminoácidos. Los términos también abarcan una cadena de aminoácidos que se ha modificado de forma natural o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente marcador. También están incluidos dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que los polipéptidos pueden aparecer como cadenas individuales o como cadenas asociadas.

Como se conoce en la técnica, "polinucleótído," o "ácido nucleico," tal como se usan intercambiablemente en el presente documento, se refieren a cadenas de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o bases, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se pueda incorporar dentro de una cadena por polimerasa de ADN o de ARN. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación para la estructura de nucleótidos puede impartirse antes o después de ensamblaje de la cadena. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido se puede modificar adicionalmente después de polimerización, tal como por conjugación con un componente marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "caperuzas", la sustitución de uno o más de los nucleótidos que se dan en la naturaleza por un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellas que contienen restos laterales, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, las nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellas con intercalantes (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), aquellas que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellas que contienen alquilantes, aquellas con enlaces no modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos anoméricos alfa, etc.), asi como formas no modificadas del/de los polinucleótido(s). Adicionalmente, cualesquiera de los grupos hidroxilo de ordinario presentes en los azúcares se pueden reemplazar, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, se pueden proteger por grupos protectores estándar, o se pueden activar para preparar enlaces a nucleótidos adicionales, o se pueden conjugar a soportes sólidos. Los OH terminales de 5' y de 3' OH pueden estar fosforilados o pueden estar sustituidos con aminas o con restos de grupos caperuza orgánicos desde 1 hasta 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivatizarse a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos pueden contener también formas análogas de azúcares de ribosa o de desoxirribosa que se conocen generalmente en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alilo, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclico, azúcares alfa- o beta-anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos aciclicos y análogos nucleosídicos tales como ribósido de metilo. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden estar reemplazados por grupos de unión alternativos. Estos grupos de unión alternativos incluyen, pero no se limitan a, modalidades en las que el fosfato es reemplazado por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(0)OR ', CO o CH2 (" formacetal"), en los que cada R o R 'es independientemente H o alquilo sustituido o insustituido (1-20 C) que contiene opcionalmente un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido necesitan ser idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos referidos en el presente documento, incluyendo ARN y ADN.

Un anticuerpo "se une específicamente" o "se une preferencialmente" a un objetivo si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente, y/o con mayor duración de lo que se une a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente o preferencialmente a un epítopo de PCSK9 es un anticuerpo que se une a este epítopo con mayor afinidad, avidez, más fácilmente, y/o con duración mayor de lo que se une a otros epítopos de PCSK9 o no epítopos de PCSK9. Se entiende también leyendo esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o resto o epítopo) que específicamente se une o preferencialmente se une a un primer objetivo puede o no puede unirse específicamente o preferencialmente a una segunda diana. Como tal, la "unión específica" o la "unión preferencial" no necesariamente requiere (aunque se pueda incluir) la unión exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a la unión quiere decir unión preferencial.

Un "señuelo no señalizador" es una isoforma de receptor soluble o una proteína de unión que secuestra ligando de el/los receptor(es) conocido(s).

Como se usa en el presente documento, "sustancialmente puro" se refiere a material que es al menos puro (es decir, libre de contaminantes) al 50%, más preferentemente, al menos puro al 90%, más preferentemente, al menos puro al 95%, aún más preferentemente, al menos puro al 98%, y lo más preferentemente, al menos puro al 99%.

Una "célula hospedante" incluye una célula individual o un cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor para vector(es) para incorporación de insertos de polinucleótidos. Las células hospedantes incluyen la progenie de una única célula hospedante, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN genómico) a la célula progenitora original debido a mutación natural, accidental o derivada. Una célula hospedante incluye células transfectadas in vivo con un polinucleótido/con polinucleótidos de esta invención.

Como se conoce en la técnica, el término "región Fe" se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina. La "región Fe" puede ser una secuencia nativa de la región Fe o una región Fe variante. Aunque los límites de la región Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, la región Fe de la cadena pesada de la IgG humana se define usualmente extendiéndose a partir de un residuo aminoacídico en la posición Cys226, o Pro230, hasta el extremo carboxilo de la misma. La numeración de los residuos en la región Fe es la del índice EU como en Kabat. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. La región Fe de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, CH2 y CH3.

Tal como se usa en la técnica, "receptor de Fe" y "FcR" describen un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FCYRII, y FCYRIII, incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente ayustadas de estos receptores. Los receptores de FCYRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activador") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, 1991 , Ann. Rev. Immunol., 9: 457-92; Capel y col., 1994, Immunomethods, 4: 25-34; y de Haas y col., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41. "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternales al feto (Guyer y col., 1976 J. Immunol., 1 17: 587; y Kim y col., 1994, J. Immunol., 24: 249).

El término "competir", como se usa en el presente documento con respecto a un anticuerpo, quiere decir que un primer anticuerpo, o una parte de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo en una manera suficientemente similar a la unión de un segundo anticuerpo, o de una parte de unión a antigeno del mismo, de tal forma que el resultado de unión del primer anticuerpo con su epítopo cognado está disminuido de forma detectable en presencia del segundo anticuerpo en comparación con la unión del primer anticuerpo en ausencia del segundo anticuerpo. La alternativa, donde la unión del segundo anticuerpo a su epítopo también está disminuida de forma detectable en presencia del primer anticuerpo, puede ser el caso, pero no necesariamente es el caso. Es decir, un primer anticuerpo pueden inhibir la unión de un segundo anticuerpo a su epítopo sin que el segundo anticuerpo inhiba la unión del primer anticuerpo a su respectivo epítopo. Sin embargo, donde cada anticuerpo inhibe de forma detectable la unión del otro anticuerpo con su epítopo o ligando cognado , sea en la misma, mayor, o menor medida, los anticuerpos se dice que "compiten de forma cruzada" unos con otros para unión con su(s) respectivo(s) epítopo(s). Tanto los anticuerpos competidores como los anticuerpos que compiten de forma cruzada están comprendidos por la presente invención. Sin tener en cuenta el mecanismo por el que tiene lugar dicha competición o competición cruzada (por ejemplo, impedimento estérico, cambio conformacional, o unión a un epítopo común, o a parte del mismo), el trabajador experto apreciaría, basándose en las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, que tales anticuerpos competidores y anticuerpos de competición cruzada están comprendidos por y pueden ser útiles para los procedimientos revelados en el presente documento.

Una "región de Fe funcional" posee al menos una función efectora de una secuencia nativa de la región Fe. Las "funciones efectoras" ejemplares incluyen unión a C1q¡ CDC; unión de receptor de Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo; fagocitosis; regulación a la baja de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptores de linfocitos B), etc. Tales funciones efectoras generalmente requieren que la región de Fe se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un anticuerpo de dominio variable) y se pueda evaluar usando diversos ensayos conocidos en la técnica para evaluar tales funciones efectoras de anticuerpos.

Una "región Fe de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región de Fe encontrada en la naturaleza. Una "región de Fe variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de aquella de una región Fe de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácidos, retiene aún al menos una función efectora de la región de Fe de secuencia nativa. Preferentemente, la región de Fe variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región de Fe de secuencia nativa o con una región de Fe de un polipéptido parental, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y preferentemente, de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región de Fe de secuencia o en la región de Fe del polipéptido parental. La región de Fe variante en el presente documento poseerá preferentemente al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia con una región de Fe de secuencia nativa y/o con una región de Fe de un polipéptido parental, y lo más preferentemente, al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con las mismas, más preferentemente, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con las mismas.

Por "Nivel de Efecto Biológico Anticipado Mínimo (MABEL)" se quiere decir el nivel de dosis anticipado mínimo que conduce a un efecto biológico mínimo en seres humanos. Los factores de seguridad se aplican usualmente para el cálculo para la primera dosis en el hombre de MABEL. El cálculo de MABEL debería utilizar toda la información de farmacocinética y de farmacodinámica in vitro e in vivo relevante.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" y "terapéuticamente efectivo" son aproximaciones para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los propósitos de esta invención relacionados con anticuerpos antagonistas de PCSK9 dependientes de pH, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: potenciación de eliminación de LDL y reducción de incidencia o mejora de colesterol aberrante y/o niveles de lipoproteínas resultantes de trastornos metabólicos y/o trastornos alimenticios, o incluyendo hipercolesterolemia familiar, dislipídemia aterogénica, aterosclerosis, y, más generalmente, enfermedad cardiovascular (CVD).

"Reducir incidencia" quiere decir cualquier forma de reducir gravedad (que puede incluir reducir necesidad de y/o cantidad de (por ejemplo, exposición a) otros fármacos y/o terapias) usada generalmente para esta afección. Tal como se entiende por aquellos expertos en la técnica, los individuos pueden variar en términos de su respuesta al tratamiento y, como tal, por ejemplo, un "procedimiento para reducir incidencia" refleja administrar el anticuerpo dependiente de pH en base a una expectativa razonable de que tal administración pueda probablemente causar una reducción tal en la incidencia en ese individuo en particular.

"Mejorar" quiere decir una disminución o mejora de uno o más síntomas después de administrar un tratamiento en comparación con no administrar un tratamiento. "Mejorar" también incluye acortamiento o reducción en la duración de un síntoma.

Como se usa en el presente documento, un "dosificación efectiva" o "cantidad eficaz" de fármaco, compuesto, o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para afectar uno o más resultados beneficiosos o deseados cualesquiera. Para uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad, o retardar la aparición de la enfermedad, incluyendo síntomas bioquímicos, histológicos y/o comportamentales de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para uso terapéutico de un anticuerpo antagonista de PCSK9 dependiente de pH, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos tales como reducir hipercolesterolemia o uno o más síntomas de dislipidemia, aterosclerosis, CVD, o enfermedad cardiaca coronaria, disminuir la dosis de otras medicaciones requeridas para tratar la enfermedad, potenciar el efecto de otra medicación, y/o retrasar la progresión de la enfermedad de los pacientes. Una dosificación efectiva se puede administrar en una o más administraciones. Para los propósitos de esta invención, una dosificación efectiva de fármaco, compuesto, o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para llevar a cabo tratamiento profiláctico o terapéutico bien directamente o bien indirectamente. Tal como se entiende en el contexto clínico, una dosificación efectiva de un fármaco, compuesto, o composición farmacéutica puede o no puede lograrse en conjunción con otro fármaco, compuesto, o composición farmacéutica. Así, una "dosificación efectiva" se puede considerar en el contexto de administrar uno o más agentes terapéuticos y un agente individual se puede considerar que se da en una cantidad eficaz si, junto con uno o más de otros agentes, se puede lograr o se logra un resultado deseable.

Un "individuo" o un "sujeto" es un mamífero, más preferentemente, un ser humano. Los mamíferos también incluyen, pero no se limitan a, animales de granja, animales deportivos, mascotas, primates, caballos, perros, gatos, ratones y ratas.

Como se usa en el presente documento, "vector" significa una construcción, que es capaz de suministrar, y, preferentemente, expresar uno o más gene(s) o secuencia(s) de interés en una célula hospedante. Ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores víricos, vectores de expresión de ADN desnudo o de ARN desnudo, vectores de plásmidos, de cósmidos o de fagos, vectores de expresión de ADN o de ARN asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o de ARN encapsulados en liposomas y ciertas células eucariotas, tales como células productoras.

Como se usa en el presente documento, "secuencia de control de expresión" quiere decir una secuencia de ácidos nucleicos que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Una secuencia de control de expresión puede ser un promotor, tal como un promotor constitutivo o un promotor inducible, o un potenciador. La secuencia de control de expresión se une de manera operable a la secuencia de ácidos nucleicos a transcribirse.

Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material que, cuando se combina con un ingrediente activo, permite al ingrediente retener actividad biológica y es no reactivo con el sistema inmune del sujeto. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión de aceite en agua, y diversos tipos de agentes humectantes. Diluyentes preferentes para aerosol o administración parenteral son solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina normal (NaCI al 0.9%). Las composiciones que comprenden dichos vehículos se formulan por procedimientos convencionales bien conocidos (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; y Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20a Edición, Mack Publishing, 2000).

El término "kon", como se usa en el presente documento, se refiere a la velocidad constante para asociación de un anticuerpo a un antígeno. Específicamente, las constantes de velocidad (kony k0ff) y las constantes de disociación en el equilibrio se miden usando fragmentos de anticuerpo Fab (es decir, univalentes) y antígeno.

El término "koff", como se usa en el presente documento, se refiere a la velocidad constante para disociación de un complejo antígeno/anticuerpo.

El término "KD", como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de disociación en el equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno.

Determinaciones de las constantes de velocidad de asociación y disociación, ka y k<j respectivamente, para determinar proporciones de KD y koff , se hacen usando un biosensor basado en resonancia de plasmón superficial para caracterizar una interacción analito/ligando en condiciones en las que el analito es monovalente con respecto a la unión de un ligando que está inmovilizado a baja capacidad sobre una superficie del sensor por medio de un reactivo de captura. El análisis se lleva a cabo usando metodología de valoración cinética como se describe en Karlsson y col., Anal. Biochem 349, 136-147, 2006. El chip sensor, el reactivo de captura, y el tampón de ensayo empleados para un ensayo se eligen para dar captura de forma estable a ligando sobre la superficie del sensor, para minimizar unión no específica del analito a las superficies y para producir las respuestas de unión a analito que son apropiadas para análisis cinético, por las recomendaciones en Myszka, J. Mol. Recognit 12, 279-284, 1999. Las respuestas de unión a analito por interacción de analito/ligando están referidas de forma doble y se ajustan a un "modelo limitado de transporte de masas" de Langmuir 1 :1 con ka, ka y m¾x como parámetros a nivel mundial según se describen en Myszka & Mcrton y col., Biophys. Chem 64, 127-137 (1997). La constante de disociación en el equilibrio, KD, se deduce a partir de la proporción de las constantes de velocidad cinética, KD= kd/ka. Tales determinaciones tienen lugar preferentemente a 25°C o a 37°C.

A. Procedimientos para evitar o tratar trastornos En un aspecto con respecto a anticuerpos antagonistas de PCSK9 dependientes de pH, la invención proporciona un procedimiento para tratar o prevenir hipercolesterolemia, y/o al menos un síntoma de dislipidemia, aterosclerosis, CVD o enfermedad cardiaca coronaria, en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un anticuerpo antagonista de PCSK9 dependiente de pH que antagoniza PCSK9 circulante.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una cantidad efectiva de un anticuerpo antagonista de PCSK9 dependiente de pH que antagoniza PCSK9 circulante para usar en tratar o prevenir hipercolesterolemia, y/o al menos un síntoma de dislipidemia, aterosclerosis, CVD o enfermedad cardiaca coronaria, en un individuo. La invención además proporciona el uso de una cantidad efectiva de un anticuerpo antagonista de PCSK9 dependiente de pH que antagoniza PCSK9 extracelular o circulante en la elaboración de un medicamento para tratar o prevenir hipercolesterolemia, y/o al menos un síntoma de dislipidemia, aterosclerosis, CVD o enfermedad cardiaca coronaria, en un individuo.

Ventajosamente, la administración terapéutica del anticuerpo da como resultado colesterol en la sangre más bajo y/o LDL en la sangre más bajas. Preferentemente, el colesterol en la sangre y/o las LDL en la sangre son al menos aproximadamente el 10% o el 15% más bajos que antes de su administración. Más preferentemente, el colesterol en la sangre y/o las LDL en la sangre son al menos aproximadamente el 20% más bajos que antes de la administración del anticuerpo. Aún más preferentemente, el colesterol en la sangre y/o las LDL en la sangre son al menos el 30% más bajos que antes de la administración del anticuerpo. Ventajosamente, el colesterol en la sangre y/o las LDL en la sangre son al menos el 40% más bajos que antes de la administración del anticuerpo. Más ventajosamente, el colesterol en la sangre y/o las LDL en la sangre son al menos el 50% más bajos que antes de la administración del anticuerpo. Muy preferentemente, el colesterol en la sangre y/o las LDL en la sangre son al menos el 60% más bajos que antes de la administración del anticuerpo. Lo más preferentemente, el colesterol en la sangre y/o las LDL en la sangre son al menos el 70% más bajos que antes de la administración del anticuerpo.

Con respecto a todos los procedimientos descritos en el presente documento, la referencia a anticuerpos dependientes de pH frente a cualquier antígeno apropiado también incluye composiciones que comprenden uno o más agentes adicionales. Estas composiciones pueden comprender adicionalmente excipientes adecuados, tales como excipientes farmacéuticamente aceptables que incluyen tampones, que se conocen bien en la técnica. La presente invención se puede usar sola o en combinación con otros procedimientos convencionales de tratamiento.

Los anticuerpos dependientes de pH se pueden administrar a un individuo por medio de cualquier vía adecuada. Debería ser patente para una persona experta en la técnica que los ejemplos descritos en el presente documento no pretenden ser limitantes pero pretenden ser ilustrativos de las técnicas disponibles. De acuerdo con ello, en algunas modalidades, el anticuerpo dependiente de pH se administra a un individuo de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, mediante vías intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, transdérmica, subcutánea, intraarticular, sublingualmente, intrasinovial, por medio de insuflación, intratecal, oral, por inhalación o tópica. La administración puede ser sistémica, por ejemplo, administración intravenosa, o localizada. Los nebulizadores comercialmente disponibles para formulaciones líquidas, incluyendo nebulizadores a chorro y nebulizadores ultrasónicos son útiles para administración. Las formulaciones líquidas puede estar directamente nebulizadas y el polvo liofilizado puede nebulizarse después de la reconstitución. Alternativamente, el anticuerpo dependiente de pH puede aerosolizarse usando una formulación de fluorocarbono y un inhalador de dosis medida, o puede inhalarse como un polvo liofilizado y molido.

En una modalidad, un anticuerpo dependiente de pH se administra por medio de técnicas de administración específica de sitio o por medio de administración local dirigida. Ejemplos de técnicas específicas de sitio o de técnicas dirigidas locales incluyen diversas fuentes de dispositivos implantables del anticuerpo dependiente de pH o del desarrollo local de catéteres, tales como catéteres de infusión, catéteres permanentes, o catéteres de aguja, injertos sintéticos, envolturas adventicias, derivaciones y endoprótesis vasculares u otros dispositivos ¡mplantables, vehículos específicos de sitio, inyección directa, o aplicación directa. Véase, por ejemplo, documento PCT Publ. N.°: WO 00/53211 y la Patente de los EE.UU. N.°: 5,981 ,568.

Diversas formulaciones de un anticuerpo dependiente de pH se pueden usar para administración. En algunas modalidades, el anticuerpo dependiente de pH puede administrarse puro. En algunas modalidades, el anticuerpo dependiente de pH y un excipiente farmacéuticamente aceptable pueden estar en diversas formulaciones. Se conocen en la técnica excipientes farmacéuticamente aceptables y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente eficaz. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o actuar como un diluyente. Excipientes adecuados incluyen pero no se limitan a agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar osmolaridad, agentes encapsulantes, tampones, y potenciadores de penetración cutánea. Los excipientes así como las formulaciones para administración de fármacos parenteral y no parenteral están expuestos en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20a Edición, Mack Publishing (2000).

Estos agentes se pueden combinar con vehículos farmacéuticamente aceptables tales como solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y similares. El régimen particular de dosificación, es decir, dosis, ritmo y repetición, dependerá del individuo en particular y de la historia médica de ese individuo.

Los anticuerpos con unión dependiente de pH también se pueden administrar por medio de inhalación, como se describe en el presente documento. Generalmente, para administración de anticuerpos dependientes de pH anticuerpos, una dosificación candidata inicial puede ser de aproximadamente 2 mg/kg. Para el propósito de la presente invención, unas dosificaciones diarias típicas podrían variar desde aproximadamente cualquiera de aproximadamente 3 pg/kg a 30 pg/kg a 300 pg/kg a 3 mg/kg, a 30 mg/kg, a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Por ejemplo, se puede usar dosificación de aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 2.5 mg/kg, de aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 10 mg/kg y de aproximadamente 25 mg/kg. Para las administraciones repetidas durante varios días o más tiempo, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que tiene lugar una supresión de los síntomas o hasta que se logran suficientes niveles terapéuticos, por ejemplo, para reducir niveles de LDL en sangre. Un régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis inicial de aproximadamente 2 mg/kg, seguida por una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 1 mg/kg del anticuerpo, o seguida por una dosis de mantenimiento de aproximadamente 1 mg/kg cada dos semanas. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles, dependiendo del patrón de deterioro farmacocinético que el médico desee lograr. Por ejemplo, en algunas modalidades, se contempla la dosificación de una a cuatro veces a la semana. En otras modalidades se contempla la dosificación una vez al mes o una vez cada dos meses o cada tres meses. Se hace un seguimiento del progreso de esta terapia fácilmente por técnicas convencionales y ensayos. El régimen de dosificación (incluyendo el anticuerpo usado) puede variar en función del tiempo.

Para el propósito de la presente invención, la dosificación adecuada de un anticuerpo dependiente de pH dependerá del anticuerpo (o composiciones de mismo) empleado, del tipo y gravedad de los síntomas a tratarse, de si el agente se administra para fines preventivos o terapéuticos, de la terapia anterior, de la historia clínica del paciente y de la respuesta al agente, de los niveles de antígeno de la sangre del paciente, de la velocidad de síntesis y de la velocidad de eliminación para antígeno del paciente, de la velocidad de eliminación de los pacientes para el agente administrado, y de la discrección del médico que atiende. Típicamente al trabajador clínico se le administra un anticuerpo dependiente de pH hasta que se alcanza una dosis que logra el resultado deseado. La dosis y/o la frecuencia puede variar a lo largo del curso del tratamiento. Las consideraciones empíricas, tales como la semivida, generalmente contnbuirán a la determinación de la dosificación. Por ejemplo, los anticuerpos que son compatibles con el sistema inmunitario humano, tales como anticuerpos humanizados o anticuerpos totalmente humanos, pueden usarse para prolongar la semivida del anticuerpo y para evitar el que el anticuerpo sea atacado por el sistema inmune del hospedante. La frecuencia de la administración puede determinarse y ajustarse durante el curso de la terapia, y está en general, pero no necesariamente, basada en tratamiento y/o supresión y/o mejora y/o retardo de síntomas, por ejemplo, hipercolesterolemia. Alternativamente, las formulaciones de liberación continua sostenida de anticuerpos pueden ser apropiadas. Se conocen en la técnica diversas formulaciones y dispositivos para lograr liberación sostenida.

En una modalidad, las dosificaciones para un anticuerpo antagonista pueden determinarse empíricamente en individuos a quienes se han dado una administración o más administraciones de un anticuerpo antagonista. Se están dando a los individuos dosificaciones incrementantes de un anticuerpo. Para evaluar la eficacia, se puede seguir un indicador de la enfermedad.

La administración de un anticuerpo dependiente de pH de acuerdo con el procedimiento en la presente invención puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, de la afección fisiológica del receptor, de si el propósito de la administración es terapéutico o profiláctico, y de otros factores conocidos por los médicos expertos. La administración de un anticuerpo dependiente de pH puede ser esencialmente continua durante un periodo de tiempo preseleccionado o puede estar en una serie de dosis espaciadas.

En algunas modalidades, más de un anticuerpo antagonista puede estar presente. Pueden estar presentes al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco diferentes, o más anticuerpos antagonistas y/o péptidos. Generalmente, esos anticuerpos o péptidos pueden tienen actividades complementarias que no se afectan adversamente unas a otras. Un anticuerpo dependiente de pH también se puede usar en conjunción con otros productos terapéuticos. Un anticuerpo dependiente de pH también se pueden usar junto con otros agentes que sirven para potenciar y/o complementar la efectividad de los agentes.

Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metilparabeno o propilparabeno; catecol; resorcínol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de peso molecular bajo (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA, azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteínas); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenoglicol (PEG).

Se preparan liposomas que contienen el anticuerpo dependiente de pH de anticuerpos por procedimientos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein, y col., 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82: 3688; Hwang, y col., 1980, Proc. Nati Acad. Sci. USA 77: 4030; y las Patentes de los EE.UU. N.oS: 4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas con tiempo de circulación potenciada se describen en la Patente de Estados Unidos N.° 5,013,556. Los liposomas particularmente útiles se pueden generar por el procedimiento de evaporación en fase reversa con una composición lipidica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina PEG-derivatizada (PEG-PE). Los liposomas se extruden a través de filtros de tamaño de poro definido para proporcionar liposomas con el diámetro deseado.

Los ingredientes activos pueden atraparse también en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroxímetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20a Edición, Mack Publishing (2000).

Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida.

Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (Patente de Estados Unidos N.° 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y 7 etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico degradable-ácido glicólico tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), isobutirato de acetato de sacarosa y poli-D-(-)-3-hidroxibutíríco.

Las formulaciones a usarse para administración in vivo deben ser estériles. Esto puede lograrse fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Las composiciones de anticuerpos dependientes de pH terapéuticas generalmente se introducen en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón que puede horadarse por una aguja de inyección hipodérmica.

Las emulsiones adecuadas pueden prepararse usando emulsiones grasas comercialmente disponibles, tales como Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™ , Lipofundin™ y Lipiphysan™. El ingrediente activo puede bien disolverse en una composición de emulsión pre-mezclada o bien alternativamente puede disolverse en un aceite (por ejemplo, aceite de soja, aceite de alazor; aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de maíz o aceite de almendra) y una emulsión formada después mezclando con un fosfolípido (por ejemplo, fosfolipidos de huevos, fosfolipidos de soja o lecitina de soja) y agua. Se apreciará que pueden añadirse otros ingredientes, por ejemplo glicerol o glucosa, para ajustar la tonicidad de la emulsión. Las emulsiones adecuadas contendrán típicamente hasta aceite al 20%, por ejemplo, entre el 5 y el 20%. La emulsión grasa puede comprender gotitas de grasa entre 0.1 y 1.0 pm, particularmente 0.1 y 0.5 pm, y tiene un pH en el intervalo de 5.5 a 8.0.

Las composiciones de emulsión pueden ser aquellas preparadas mezclando un anticuerpo dependiente de pH con Intralipid™ o con los componentes del mismo (aceite de soja, fosfolípidos de huevo, glicerol y agua).

Composiciones para inhalación o insuflación incluyen soluciones y suspensiones en disolventes farmacéuticamente aceptables, acuosos u orgánicos, o mezclas de los mismos, y polvos. Las composiciones liquidas o sólidas pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados como se expone anteriormente. En algunas modalidades, las composiciones se administran por la vía respiratoria oral o nasal para efecto local o sistémico. Se pueden nebulizar composiciones en disolventes farmacéuticamente aceptables preferentemente estériles por uso de gases. Las soluciones nebulizadas pueden respirarse directamente a partir del dispositivo nebulizador o el dispositivo nebulizador puede estar unido a una máscara facial, a una tienda de nebulización o a una máquina de respiración de presión positiva intermitente. Se pueden administrar composiciones en solución, en suspensión o en polvo, preferentemente oralmente o nasalmente, a partir de dispositivos que administran la formulación en una manera apropiada.

B. Anticuerpos dependientes de pH Los anticuerpos útiles en la presente invención pueden abarcar anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, Fab', F (ab')2, Fv, Fe, etc.), anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos heteroconjugados, mutantes de cadena sencilla (ScFv), de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de dominio), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida, incluyendo variantes de glucosilación de anticuerpos, variantes de las secuencias de aminoácidos de anticuerpos y anticuerpos modificados covalentemente. Los anticuerpos pueden ser murinos, de rata, se seres humanos, o de cualquier otro origen (incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados).

En algunas modalidades, el anticuerpo dependiente de pH es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo dependiente de pH también puede ser humanizado. En otras modalidades, el anticuerpo es humano.

En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una región constante modificada, tal como una región constante que es inmunológicamente inerte, es decir, que tiene una reducción de potencial para que provoque una respuesta inmunitaria. En algunas modalidades, la región constante se modifica tal como se describe en Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624; en la publicación PCT N.° W099/58572; y/o en la solicitud de patente del Reino Unido N.° 9809951.8. El Fe puede ser lgG2 humana o ser lgG4 humana. El Fe puede ser lgG2 humana que contiene la mutación de A330P331 a S330S331 (lgG2Aa), en la que los residuos aminoacídicos están numerados con referencia a la secuencia de lgG2 de tipo salvaje. Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una región constante de lgG4 que comprende las mutaciones siguientes (Armour y col., 2003, Molecular Immunology 40 585-593): de E233F234L235 a P233V234A235 (lgG4Ac), en las que la numeración es con referencia a lgG4 de tipo salvaje. En otra modalidad más, el Fe es lgG4 humana de E233F234L235 a P233V234A235 con deleción de G236 (lgG4Ab). En otra modalidad, el Fe es cualquier Fe de lgG4 humana (lgG4, lgG4Ab o lgG4Ac) que contenga la mutación de estabilización de bisagra de S228 a P228 (Aalberse y col., 2002, Immunology 105, 9-19). En otra modalidad, el Fe puede ser Fe aglucosilado.

En algunas modalidades, la región constante se aglucosila mutando el residuo de unión a oligosacárido (tal como Asn297) y/o flanqueando residuos que son parte de la secuencia de reconocimiento de glucosilación en la región constante. En algunas modalidades, la región constante se aglucosila por glucosilación enlazada en N de manera enzimática. La región constante se puede aglucosilar por glucosilación enlazada en N de manera enzimática o mediante expresión en una célula hospedante deficiente en glucosilación.

Una manera de determinar la afinidad de unión de anticuerpos a antígeno es midiendo la afinidad de unión de fragmentos Fab monofuncionales del anticuerpo. Para obtener fragmentos Fab monofuncionales, se puede escindir un anticuerpo (por ejemplo, IgG) con papaína o expresar de manera recombinante. Se puede determinar la afinidad de un fragmento Fab de un anticuerpo mediante resonancia de plasmón superficial (sistema de resonancia de plasmón superficial (SPR) Biacore3000™, Biacore, INC, Piscataway NJ), equipado con chips sensores de estreptavidina pre-inmovilizada (SA) usando el tampón de desplazamiento HBS-EP (HEPES 0.01 M, pH 7.4, NaCI 0.15, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0.005% v/v). El antígeno biotinilado se puede diluir en tampón HBS-EP hasta una concentración de menos de 0.5 pg/ml e inyectar a través de los canales de chip individuales usando tiempos de contacto variables, para lograr dos intervalos de densidad de antígeno, de 50-200 unidades de respuesta (RU) para estudios cinéticos detallados o bien de 800-1 ,000 RU para ensayos de rastreo. Estudios de regeneración han mostrado que NaOH 25 mM en etanol al 25% v/v retira de manera efectiva el Fab unido mientras mantiene la actividad de antígeno en el chip durante 200 inyecciones. Normalmente, se inyectan diluciones en serie (concentraciones de extensión de KD estimada de 0.1 -10x) de muestras de Fab purificadas durante 1 min a ? ??µ?/minuto y se permiten tiempos de disociación de hasta 2 horas. Se determinan las concentraciones de las proteínas de Fab mediante eletroforesis de SDS-PAGE y/o ELISA usando un Fab de concentración conocida (tal como se determina mediante análisis de aminoácidos) como patrón. Se obtienen velocidades de asociación (kA) y velocidades de disociación (kD) cinéticas simultáneamente ajustando los datos globalmente a un modelo de unión de Langmuir 1 :1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6. 99-110) usando el programa de evaluación BIA. Los valores de la constante de disociación en el equilibrio (KD) se calculan como kD/kA- Este protocolo es adecuado para su uso en la determinación de la afinidad de unión de un anticuerpo a cualquier antigeno, incluyendo el ser humano u otras especies de mamíferos (tales como ratón, rata, primate). La afinidad de unión de un anticuerpo generalmente se mide a 25°C, pero también se puede medir a 37°C.

Los anticuerpos se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. La ruta y el programa de inmunización del animal hospedante en general son acordes con técnicas convencionales y establecidas para la estimulación y producción de anticuerpos, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. En la técnica se conocen técnicas generales para la producción de anticuerpos humanos y de ratón y/o se describen en el presente documento. Para anticuerpos dependientes de pH contra PCSK9, un procedimiento actualmente preferido de preparación de los anticuerpos comprende la inmunización de animales inactivados en PCSK9 (PCSK9 -/-) tal como se describe en el presente documento.

Se contempla que cualquier sujeto mamífero incluyendo seres humanos o células productoras de anticuerpos de los mismos se puede manipular para servir como base para la producción de líneas celulares de hibridoma de mamífero, incluyendo humano. Normalmente, el animal hospedante se inocula intraperitonealmente, intramuscularmente, oralmente, subcutáneamente, intraplantar, y/o intradérmicamente con una cantidad de inmunógeno, incluyendo como se describe en el presente documento.

Se pueden preparar hibridomas a partir de los linfocitos y las células de mieloma inmortalizadas usando la técnica de hibridación de células somáticas general de Kohler, B. y Milstein, C, 1975, Nature 256:495-497 o la modificada por Buck, D. W., y cois., 1982, In Vitro, 18:377-381. En la hibridación se pueden usar líneas de mieloma disponibles, incluyendo, pero sin limitarse a X63-Ag8.653 y las de Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., EE.UU. En general, la técnica implica fusionar las células de mieloma y células linfoides usando un fusógeno tal como polietilenoglicol, o mediante medios eléctricos bien conocidos por los expertos en la técnica. Después de la fusión, las células se separan del medio de fusión y se cultivan en un medio de crecimiento selectivo, tal como un medio hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), para retirar células parentales no hib dadas. Se puede usar cualquiera de los medios descritos en el presente documento, complementado con o sin suero, para cultivar los hibridomas que segregan anticuerpos monoclonales. Como otra alternativa a la técnica de fusión celular, se pueden usar linfocitos B inmortalizados por el EBV para producir los anticuerpos monoclonales de PCSK9 de la presente invención. Los hibridomas se expanden y se subclonan, si se desea, y los sobrenadantes se someten a ensayo para determinar su actividad anti-inmunógeno mediante procedimientos de inmunoensayo convencionales (por ejemplo, radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático o inmunoensayo de fluorescencia).

Los hibridomas que se pueden usar como una fuente de anticuerpos abarcan todos los derivados, células de la progenie de los hibridomas parentales que producen anticuerpos monoclonales específicos para PCSK9, o una porción de los mismos.

Se pueden cultivar los hibridomas que producen dichos anticuerpos in vitro o in vivo usando procedimientos conocidos. Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar del medio de cultivo o de fluidos corporales, mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como precipitación con sulfato de amonio, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía y ultrafiltración, si se desea. La actividad no deseada, si está presente, se puede retirar, por ejemplo, llevando a cabo la preparación sobre adsorbentes preparados a partir del inmunógeno unido a una fase sólida y eluyendo o liberando los anticuerpos deseados del inmunógeno. La inmunización de un animal hospedante con PCSK9 humano, o un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos diana conjugado con una proteína que es inmunogénica en las especies que se van a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa de california, seroalbúmina, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja usando un agente derivacional o bifuncional, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de los residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de los residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCI2 o R1N=C=NR, en la que R y R1 son grupos alquilo diferentes, puede proporcionar una población de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales).

Una vez que se han generado o seleccionado los anticuerpos, se pueden optimizar los anticuerpos para una unión dependiente de pH, por ejemplo, tal como se describe en el ejemplo 1 , en el presente documento.

Si se desea, el anticuerpo dependiente de pH (monoclonal o policlonal) de interés se puede secuenciar y después se puede clonar la secuencia de polinucleótidos en un vector para expresión o propagación. Se puede mantener la secuencia que codifica el anticuerpo de interés en un vector en una célula hospedante y después se puede expandir la célula hospedante y congelar para su uso futuro. Se puede llevar a cabo la producción de anticuerpos monoclonales recombinantes en cultivo celular a través de la clonación de genes de anticuerpo a partir de linfocitos B por medios conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Tiller y col., 2008, J. Immunol. Methods 329, 112; patente de los EE.UU. N.° 7,314,622.

En una alternativa, se puede usar la secuencia polinucleotídica para manipulación genética para "humanizar" el anticuerpo o para mejorar la afinidad, u otras características del anticuerpo. Por ejemplo, se puede diseñar la región constante para que se parezca más a las regiones constantes humanas para evitar la respuesta inmunitaria si se usa el anticuerpo en ensayos clínicos y en tratamientos en seres humanos. Se puede desear la manipulación genética de la secuencia de anticuerpo para obtener una afinidad mayor a antígeno y una mayor eficacia. Será patente para un experto en la técnica que se pueden hacer uno o más cambios de polinucleótidos al anticuerpo dependiente de pH y mantener todavía su capacidad de unión de antígenos.

Hay cuatro etapas generales para humanizar un anticuerpo monoclonal. Éstas son: (1 ) determinar el nucleótido y secuencia de aminoácidos predicha de los dominios variables ligeros y pesados de anticuerpo de partida; (2) diseñar el anticuerpo humanizado, es decir, decidir qué región estructural de anticuerpo usar durante el procedimiento de humanización; (3) las técnicas/metodologías de humanización actuales; y (4) la transfección y expresión del anticuerpo humanizado. Véase, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. N.— 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 6,331 ,415; 5,530,101 ; 5,693,761 ; 5,693,762; 5,585,089; y 6,180,370.

Se ha descrito un número de moléculas de anticuerpo "humanizadas" que comprende un sitio de unión a antígeno derivado de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos o que tienen regiones V de roedores o de roedores modificadas y sus CDR asociadas condensadas a dominios constantes humanos. Véase, por ejemplo, Winter y cois., 1991, Nature 349:293-299; Lobuglio y cois., 1989, Proa Nat. Acad. Sc¡. USA 86:4220-4224; Shaw y col., 1987, J Immunol. 138:4534-4538; y Brown y col., 1987, Cáncer Res. 47:3577-3583. Otras referencias describen CDR de roedores injertadas en una región estructural (FR) de soporte humana antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado. Véase, por ejemplo, Riechmann y cois., 1988, Nature 332:323-327; Verhoeyen y cois., 1988, Science 239:1534-1536; y Jones y col., 1986, Nature 321 :522-525. Otra referencia describe CDR de roedores soportados por regiones estructurales de roedores recombinantemente diseñadas. Véase, por ejemplo, la publicación de patente europea N.° 0519596. Estas moléculas "humanizadas" se diseñan para minimizar la respuesta inmunológica no deseada hacia moléculas de anticuerpo anti-humanas de roedores lo que limita la duración y eficacia de las aplicaciones terapéuticas de esos restos en receptores humanos. Por ejemplo, se puede diseñar la región constante de anticuerpo de tal forma que sea inmunológicamente inerte (por ejemplo, no activa la lisis por complemento). Véanse, por ejemplo, la publicación PCT N.° WO99/58572; la solicitud de patente del Reino Unido N.° 9809951.8. Otros procedimientos de humanizar anticuerpos que también se pueden utilizar se describen en Daugherty y col., 1991 , Nucí. Acids Res. 19:2471-2476 y en las patentes de los EE.UU. N.— 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; 5,866,692; 6,210,671 ; y 6,350,861; y en la publicación PCT N 0 WO 01/27160.

En otra alternativa más, se pueden obtener los anticuerpos totalmente humanos usando ratones comercialmente disponibles que se han diseñado para expresar proteínas de inmunoglobulina humana específicas. También se pueden usar animales transgénicos que están diseñados para producir una respuesta inmunitaria más deseable o más fuerte para la generación de anticuerpos humanizados o humanos. Ejemplos de tal tecnología son Xenomouse™ de Abgenix, Inc. (Fremont, CA), HuMAb-Mouse® y TC Mouse™ de Medarex, Inc. (Princeton, NJ), y el ratón Veloclmmune ® de Regeneran Pharmaceuticals, Inc. (Tarrytown, NY).

En una alternativa, se pueden preparar de manera recombinante los anticuerpos y expresar usando cualquier procedimiento conocido en la técnica. En otra alternativa, se pueden preparar de manera recombinante los anticuerpos mediante la tecnología de presentación en fagos. Véanse, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. N.— 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; y 6,265,150; y Winter y cois., 1994, Annu. Rev. Immunol. 12:433- 455. Alternativamente, se puede usar la tecnología de presentación en fagos (McCafferty y col., 1990, Nature 348:552-553) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulinas a partir de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, se clonan los genes del dominio V del anticuerpo en marco dentro de un gen de proteínas de la cubierta principal o secundaria de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se presentan como fragmentos funcionales de anticuerpos sobre la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra esas propiedades. Así, el fago imita algunas de las propiedades del linfocito B. Se puede realizar la presentación en fagos en una variedad de formatos; véase por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., 1993, Current Opinión in Structural Biology 3:564-571. Se pueden usar varias fuentes de segmentos de genes V para la presentación en fagos. Clackson y cois., 1991 , Nature, 352:624-628 aislaron una colección diversa de anticuerpos contra oxazolona de una pequeña colección combinatoria aleatoria de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos contra una serie diversa de antígenos (incluyendo autoantigenos) siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Marks y col., 1991 , J. Mol. Biol. 222:581-597, o Griffith y col., 1993, EMBO J. 12:725-734. En una respuesta inmunitaria natural, los genes de anticuerpos acumulan mutaciones en una tasa alta (hipermutación somática). Algunos de los cambios introducidos conferirán afinidad más alta, y los linfocitos B que presentan ¡nmunoglobulina de superficie de afinidad alta se replican y se diferencian preferentemente durante la exposición a antígeno posterior. Este procedimiento natural se puede imitar empleando la técnica conocida como "mezclado de cadenas". (Marks y col., 1992, Bio/Technol. 10:779-783). En este procedimiento, la afinidad de los anticuerpos humanos "primarios" obtenidos mediante la presentación en fagos se puede mejorar reemplazando secuencialmente los genes de región V de cadena ligera y pesada con repertorios de variantes que se producen de manera natural (repertorios) de genes de dominio V obtenidos a partir de donantes no inmunizados. Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con afinidades en el intervalo pM-nM. Una estrategia para preparar repertorios de anticuerpos de fagos muy grandes (también conocidos como "la madre de todas las colecciones") se ha descrito por Waterhouse y col., 1993, Nucí. Acids Res. 21 :2265-2266. También se puede usar el mezclado de genes para derivar anticuerpos humanos de anticuerpos de roedores, en los que el anticuerpo humano tiene especificidades y afinidades similares al anticuerpo de roedor de partida. De acuerdo con este procedimiento, que también se denomina como "impronta de epítopo", el gen de dominio V de cadena pesada o ligera de anticuerpos de roedores obtenido mediante la técnica de presentación en fagos es reemplazado por un repertorio de genes del dominio V humanos, creando quimeras humano-roedor. La selección de antígenos da como resultado el aislamiento de regiones humanas variables que pueden restaurar un sitio de unión a antígeno funcional, es decir, el epítopo gobierna (impronta) la elección del compañero. Cuando el procedimiento se repite para reemplazar el dominio V de roedor restante, se obtiene un anticuerpo humano (véase publicación PCT N.° WO 93/06213). A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos de roedores mediante injerto de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen residuos de CDR o estructurales de origen de roedor.

Es patente que aunque la discusión anterior se aplica a anticuerpos humanizados, los principios generales discutidos se aplican a anticuerpos de personalización para su uso, por ejemplo, en perros, gatos, primates, equinos y bovinos. Además es evidente que se pueden combinar uno o más aspectos de la humanización de un anticuerpo descrito en el presente documento, por ejemplo, injerto de CDR, mutación estructural y mutación de CDR.

Los anticuerpos se pueden preparar de manera recombinante aislando en primer lugar los anticuerpos y las células productoras de anticuerpo a partir de animales hospedantes, obteniendo la secuencia génica, y usando la secuencia génica para expresar de manera recombinante el anticuerpo en células hospedantes (por ejemplo, células CHO). Otro procedimiento que se puede emplear es el de expresar la secuencia de anticuerpo en plantas (por ejemplo, tabaco) o en leche transgénica. Se han dado a conocer procedimientos para expresar anticuerpos de manera recombinante en plantas o en leche. Véase, por ejemplo, Peeters, 2001 , y col. Vaccine 19:2756; Lonberg, N. y D. Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol 13:65; y Pollock, y col., 1999, J Immunol Methods 231 :147. Los procedimientos para preparar derivados de anticuerpos, por ejemplo, humanizados, de cadena simple, etc, son conocidos en la técnica.

También se pueden emplear los inmunoensayos y las técnicas de clasificación de citometria de flujo tales como la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para aislar anticuerpos que son específicos para el antígeno deseado.

Los anticuerpos pueden estar unidos a muchos vehículos. Los vehículos pueden ser activos y/o inertes. Ejemplos vehículos bien conocidos incluyen polipropileno, poliestireno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, vidrio, celulosas modificadas y naturales, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble o bien insoluble para los propósitos de la invención. Los expertos en la técnica conocerán otros vehículos adecuados para unir a anticuerpos, o podrán determinar tales, usando experimentación de rutina. En algunas modalidades, el vehículo comprende un resto que dirige el miocardio.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de ese ADN. Una vez aislado, el ADN se puede introducir en vectores de expresión (tales como los vectores de expresión dados a conocer en la publicación PCT N.° WO 87/04462), que después se transfectan dentro de células hospedantes tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster Chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otro modo proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedantes recombinantes. Véase, por ejemplo, la publicación PCT N.° WO 87/04462. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de cadena ligera y pesada humanos en lugar de las secuencias murinas homologas, Morrison y col., 1984, Proc. Nat. Acad. Sci. 81 :6851 , o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido distinto de inmunoglobulina. De esa manera, los anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" se preparan para que tengan la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal en el presente documento.

Los polipéptidos y anticuerpos dependientes de pH derivados de los anticuerpos se pueden identificar o caracterizar usando procedimientos conocidos en la técnica, de modo que se detecta y/o se mide la reducción, mejora o neutralización de la actividad biológica. En algunas modalidades, se identifica un polipéptido o anticuerpo dependiente de pH incubando un agente candidato con antígeno y uniendo con monitorización y/o reducción auxiliar o neutralización de una actividad biológica. Se puede llevar a cabo el ensayo de unión con polipéptido(s) de antígeno purificado o con células que expresan de manera natural, o transfectar para expresar, el polipéptido(s). En una modalidad, el ensayo de unión es un ensayo de unión competitivo, en el que se evalúa la capacidad de un anticuerpo candidato para competir con un antagonista conocido para determinar la unión. Se puede llevar a cabo el ensayo en diversos formatos, incluyendo el formato de ELISA. En otras modalidades, se identifica un anticuerpo dependiente de pH incubando un agente candidato con el antígeno y uniendo con monitorización y con la inhibición auxiliar de la expresión de LDLR y/o la eliminación de colesterol de la sangre.

Después de la identificación inicial, se puede confirmar adicionalmente la actividad de un anticuerpo dependiente de pH candidato y refinar mediante bioensayos que se sabe que prueban las actividades biológicas marcadas. Alternativamente, se pueden usar bioensayos para la detección selectiva de candidatos directamente. Algunos de los procedimientos para identificar y caracterizar anticuerpos, péptidos o aptámeros se describen en detalle en los ejemplos.

Se pueden caracterizar los anticuerpos con unión dependiente de pH usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento es el de identificar el epítopo al que se une, o "mapeo de epitopos." Hay muchos procedimientos conocidos en la técnica para el mapeo y la caracterización de la localización de epitopos sobre proteínas, incluyendo resolver la estructura cristalina de un complejo anticuerpo-antígeno, ensayos de competición, ensayos de expresión de fragmento de gen y ensayos basados en péptido sintético, tal como se describe, por ejemplo, en el capítulo 1 1 de Harlow y Lañe, Using Antibodies, a Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1999). En un ejemplo adicional, se puede usar el mapeo de epitopos para determinar la secuencia a la que se une un anticuerpo dependiente de pH. El mapeo de epitopos está comercialmente disponible a partir de varias fuentes, por ejemplo, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Holanda). El epítopo puede ser un epítopo lineal, es decir, contenido en un único tramo de aminoácidos, o un epítopo conformacional formado por una interacción tridimensional de aminoácidos que no tienen que estar necesariamente contenidos en un único tramo. Se pueden aislar péptidos de diversas longitudes (por ejemplo, al menos de 4-6 aminoácidos de longitud) o sintetizar (por ejemplo, de manera recombinante) y usar para ensayos de unión con un anticuerpo. En otro ejemplo, el epítopo al que se une el anticuerpo dependiente de pH se puede determinar de un rastreo sistemático usando péptidos solapantes derivados de la secuencia de antígeno y determinando la unión por el anticuerpo. De acuerdo con el ensayo de expresión de fragmento de gen, la fase de lectura abierta que codifica el antígeno se fragmenta aleatoriamente o bien mediante construcciones genéticas específicas y se determina la reactividad de los fragmentos de antígeno expresados con el anticuerpo que se van a analizar. Los fragmentos de gen se pueden producir, por ejemplo, mediante PCR y después transcribir y traducir en proteína in vitro, en presencia de radiactivos aminoácidos. Después se determina la unión del anticuerpo a los fragmentos marcados radiactivamente mediante electroforesis en gel e inmunoprecipitación. También se pueden identificar ciertos epítopos usando grandes colecciones de secuencias peptídicas aleatorias presentadas en la superficie de partículas de fagos (colecciones de fagos). De manera alternativa, se puede someter a prueba una colección de fragmentos peptídicos solapantes para analizarse la unión al anticuerpo de prueba en ensayos de unión simple. En un ejemplo adicional, se puede realizar la mutagénesis de un dominio de unión a antígenos, experimentos de intercambio de dominio y mutagénesis mediante alanina para identificar residuos requeridos, suficientes y/o necesarios para la unión de epítopos. Por ejemplo, se pueden realizar experimentos de intercambio de dominio usando un antígeno mutante en el que se han reemplazado (intercambiado) diversos fragmentos del polipéptido con secuencias de antígeno de otra especie, o una proteína estrechamente relacionada pero antigénicamente distinta (tal como otro miembro de la familia proproteína convertasa). Evaluando la unión del anticuerpo al antígeno mutante, se puede avaluar la importancia del fragmento de antígeno particular a la unión de anticuerpo.

Otro procedimiento más que se puede usar para caracterizar un anticuerpo dependiente de pH es usar ensayos de competición con otros anticuerpos conocidos por unirse al mismo antígeno para determinar sí el anticuerpo dependiente de pH se une al mismo epítopo como otros anticuerpos. Los ensayos de competición se conocen bien por los expertos en la técnica.

Se puede usar un vector de expresión para dirigir la expresión de un anticuerpo dependiente de pH. Un experto en la técnica está familiarizado con la administración de vectores de expresión para obtener la expresión de una proteína exógena in vivo. Véase, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. N.— 6,436,908; 6,413,942; y 6,376,471. La administración de vectores de expresión incluye administración sistémica o local, incluyendo inyección, administración oral, administración cateterizada o por pistola genética y administración tópica. En otra modalidad, el vector de expresión se administra directamente al ganglio o tronco simpático, o en una arteria coronaria, atrio, ventrículo o pericardio.

También se puede usar liberación dirigida de composiciones terapéuticas que contienen un vector de expresión o polinucleótidos subgenómicos. Las técnicas de liberación de ADN mediada por receptores se describen, por ejemplo, en Findeis y col., 1993, Trends Biotechnol. 11 :202; Chiou y cois., 1994, Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.); Wu y cois., 1988, J. Biol. Chem. 263:621 ; Wu y cois., 1994, J. Biol. Chem. 269:542; Zenke y col., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:3655; Wu et al., 1991 , J. Biol. Chem. 266:338. Las composiciones terapéuticas que contienen un polinucleótido se administran en un intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 mg de ADN para administración local en un protocolo de terapia génica. Intervalos de concentración de aproximadamente 500 ng a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 µ9 a aproximadamente 2 mg, de aproximadamente 5 µ9 a aproximadamente 500 µ9, y de aproximadamente 20 µ9 a aproximadamente 100 µ9 de ADN también se pueden usar durante un protocolo de terapia génica. Los polinucleótidos y polipéptidos terapéuticos se pueden liberar usando vehículos de liberación génica. El vehículo de liberación génica puede ser de origen vírico o no vírico (véase en general, Jolly, 1994, Cáncer Gene Therapy 1 :51 ; Kimura, 1994, Human Gene Therapy 5:845; Connelly, 1995, Human Gene Therapy 1 :185; y Kaplitt, 1994, Nature Genetics 6:148). Se puede inducir la expresión de tales secuencias codificantes usando promotores heterólogos o mamíferos endógenos. La expresión de la secuencia codificante pueden ser constitutiva o bien regulada.

Los vectores basados en virus para la administración de un polinucleótido deseado y la expresión en una célula deseada se conocen bien en la técnica. Ejemplos de vehículos basados en virus incluyen, pero no se limitan a, retrovirus recombinantes (véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT N.— WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; las patentes de los EE.UU. N.— 5,219,740 y 4,777,127; la patente de GB N.° 2,200,651 ; y la patente de EP N 0 0 345 242), vectores basados en alfavirus (por ejemplo, vectores víricos Sindbis, virus del bosque de Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), virus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) y virus de encefalitis equina venezolana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), y virus adeno-asociados (AAV) vectores (véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT N.— WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191 ; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655). La administración de ADN enlazado a adenovirus muerto tal como se describe en Curiel, 1992, Hum. Gene Ther. 3:147, también se puede emplear.

También se pueden emplear procedimientos y vehículos de liberación no víricos, incluyendo, pero sin limitarse a, ADN condensado policatiónico enlazado o no enlazado a adenovirus muerto solo (véase, por ejemplo, Curiel, 1992, Hum. Gene Ther. 3:147); ADN enlazado a ligando (véase, por ejemplo, Wu, J., 1989, Biol. Chem. 264:16985); células de vehículos de liberación de celulares eucariotas (véanse, por ejemplo, la patente de los EE.UU. N.° 5,814,482; las publicaciones PCT N.— WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; y WO 97/42338) y fusión o neutralización de carga de nucleico con las membranas celulares. También se puede emplear ADN desnudo. Procedimientos de introducción de ADN desnudo ejemplares se describen en la publicación PCT N.° WO 90/1 1092 y en la patente de los EE.UU. N.° 5,580,859. Los liposomas que pueden actuar como vehículos de liberación de genes se describen en la patente de los EE.UU. N.° 5;422;120; las publicaciones PCT N.— WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; y el documento EP 0524968. Estrategias adicionales se describen en Philip, 1994, Mol. Cell Biol., 14:241 1 , y en Woffendin, (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. 91 :1581.

Esta invención comprende composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden anticuerpos descritos en el presente documento o preparados mediante los procedimientos y que tienen las características descritas en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, las composiciones comprenden uno o más anticuerpos dependientes de pH y/o uno o más polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican uno o más de estos anticuerpos. Estas composiciones pueden comprender adicionalmente excipientes adecuados, tales como excipientes farmacéuticamente aceptables que incluyen tampones, que se conocen bien en la técnica.

La invención también proporciona partes de CDR de anticuerpos dependientes de pH (incluyendo CDR de Chotia y de Kabat). La determinación de regiones CDR está dentro del alcance de la técnica. Se entiende que en algunas modalidades, las CDR pueden ser una combinación de las CDR de Kabat y Chotia (también denominadas "CDR combinadas" o "CDR extendidas"). En algunas modalidades, las CDR son las CDR de Kabat. En otras modalidades, las CDR son los CDR de Chothia. En otras palabras, en modalidades con más de una CDR, las CDR pueden ser cualquiera de Kabat, Chothia, CDR de combinación, o combinaciones de las mismas.

La invención también proporciona procedimientos de preparar cualquiera de estos anticuerpos o polipéptidos. Los anticuerpos de esta invención se pueden preparar mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los polipéptidos se pueden producir mediante degradación proteolítica u otra degradación de los anticuerpos, mediante procedimientos recombinantes (es decir, polipéptidos de fusión o simples) tal como se describe anteriormente o mediante síntesis química. Los polipéptidos de los anticuerpos, especialmente los polipéptidos más cortos de hasta aproximadamente 50 aminoácidos, se elaborada convenientemente mediante síntesis química. Los procedimientos de síntesis química se conocen en la técnica y están comercialmente disponibles. Por ejemplo, se podría producir un anticuerpo mediante un sintetizador de polipéptidos automatizado empleando el procedimiento de fase sólida. Véanse también, las patentes de los EE.UU. N.— 5,807,715; 4,816,567 y 6,331,415.

En otra alternativa, los anticuerpos y péptidos se pueden preparar de manera recombinante usando procedimientos que se conocen bien en la técnica. En una modalidad, un polinucleótido comprende una secuencia que codifica las regiones variables de cadena pesada y/o de cadena ligera de anticuerpo 4A5, 5A10, 6F6, 7D4 o L1 L3. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés se puede mantener en un vector en una célula hospedante y después la célula hospedante se puede expandir y congelar para uso futuro. Los vectores (incluyendo vectores de expresión) y las células hospedantes se describen adicionalmente en el presente documento.

La invención también comprende scFv de anticuerpos de esta invención. Los fragmentos de región variable de cadena individual se preparan enlazando las regiones variables de cadena pesada y/o ligera usando un péptido de enlace corto. Bird y cois., 1988, Science 242:423-426. Un ejemplo de un péptido de enlace es (GGGGS) 3(SEQ ID N.°:22), que puentea aproximadamente 3.5 nm entre el extremo carboxi de una región variable y el extremo amino de la otra región variable. Se han diseñado y usado enlazadores de otras secuencias. Bird et al., 1988, supra. Los enlazadores deben ser polipéptidos flexibles, cortos y preferiblemente constituidos por menos de aproximadamente 20 residuos de aminoácidos. A su vez, los enlazadores se pueden modificar para funciones adicionales, tales como unión de fármacos o unión a soportes sólidos. Las variantes de cadena individual se pueden producir bien recombinante o sintéticamente. Para la producción sintética de scFv, se puede usar un sintetizador automatizado. Para la producción recombinante de scFv, se puede introducir un plásmido adecuado que contiene polinucleótido que codifica el scFv dentro de una célula hospedante adecuada, bien eucariota, tal como células de levadura, planta, insecto o mamífero o procariota, tal como E. coli. Los polinucleótidos que codifican el scFv de interés se pueden preparar mediante manipulaciones rutinarias tales como la ligación de polinucleótidos. El scFv resultante se puede aislar usando técnicas de purificación proteica estándar conocidas en la técnica.

También están comprendidas otras formas de anticuerpos monocatenarios, tales como los diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos biespecíficos, bivalentes en los que los dominios VH y VL se expresan sobre una única cadena polipeptídica, pero usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de este modo a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión de antígeno (véase por ejemplo, Holliger, P., et al., 1993, Proc. Nati. Acad Sci. USA 90:6444-6448, y Poljak y cois., 1994, Structure 2.1 121-1123).

Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos, anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes, usando los anticuerpos descritos en el presente documento. Los procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Suresh y col., 1986, Methods in Enzymology 121 :210). Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basaba en la coexpresión de dos pares de cadenas ligeras - cadenas pesadas de inmunoglobulina, teniendo las dos cadenas pesadas diferentes especificidades (Millstein y Cuello, 1983, Nature 305, 537-539).

De acuerdo con una estrategia en la preparación de anticuerpos biespecíficos, se fusionan los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. Preferiblemente, la fusión es con un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones CH2 y CH3 bisagra. Se prefiere tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, presente al menos en una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan dentro de un organismo hospedante adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en las modalidades cuando las razones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. No obstante, es posible insertar las secuencias codificantes por dos o por las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en razones iguales da como resultado rendimientos altos o cuando las razones no son de particular importancia.

En una estrategia, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada -cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Esta estructura asimétrica, con una cadena ligera de inmunoglobulina sólo en una mitad de la molécula biespecífica, facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas. Esta estrategia se describe en la publicación PCT N.° WO 94/04690.

Los anticuerpos heteroconjugados, que comprenden dos anticuerpos unidos covalentemente, también están dentro del alcance de la invención. Tales anticuerpos se han usado para marcar para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (patentes de los EE.UU. N.— 4,676,980) y para el tratamiento de infección por VIH (publicaciones PCT N.— WO 91/00360 y WO 92/200373; documento EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden preparar usando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Las técnicas y los agentes de reticulación adecuados se conocen bien en la técnica y se describen en la patente de los EE.UU. N.° 4,676,980.

Los anticuerpos quiméricos o híbridos también se pueden preparar in vitro usando procedimientos conocidos de química de proteínas de síntesis, incluyendo las que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato.

Se puede preparar el anticuerpo humanizado que comprende una o más CDR de anticuerpos 5A10 o 7D4 o una o más CDR derivadas de anticuerpos 5A10 o 7D4, por ejemplo, usando cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar cuatro etapas generales para humanizar un anticuerpo monoclonal. Éstas son: (1) determinar el nucleótido y secuencia de aminoácidos predicha de los dominios variables ligeros y pesados de anticuerpo de partida; (2) diseñar el anticuerpo humanizado, es decir, decidir qué región estructural de anticuerpo usar durante el procedimiento de humanización; (3) usar las técnicas/metodologías de humanización actuales; y (4) transfectar y expresar el anticuerpo humanizado. Véanse, por ejemplo, las patentes de los EE.UU N.— 4,816,567; 5,807,715; 5;866,692; 6,331 ,415; 5,530,101 ; 5,693,761 ; 5,693,762; 5,585,089; y 6,180,370.

En los anticuerpos humanizados recombinantes, la parte Fe se puede modificar para evitar la interacción con el receptor de Fcy ? y el complemento y los sistemas inmunitarios. Las técnicas para la preparación de tales anticuerpos se describen en el documento WO 99/58572. Por ejemplo, la región constante se puede diseñar para parecerse más a las regiones constantes humanas para evitar la respuesta inmunitaria si el anticuerpo se usa en ensayos clínicos y tratamientos en seres humanos. Véase, por ejemplo, las patentes de los EE.UU N.— 5,997,867 y 5,866,692.

El anticuerpo humanizado que comprende las regiones variables de cadena ligera o pesada o una o más CDR de un anticuerpo o sus variantes, o una o más CDR derivadas del anticuerpo o sus variantes, se puede preparar usando cualquier procedimiento conocido en la técnica.

Los anticuerpos humanizados se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica.

La invención abarca modificaciones a los anticuerpos y polipéptidos de la invención, incluyendo anticuerpos funcionalmente equivalentes, lo que no afecta de manera significativa a sus propiedades y variantes que tienen afinidad y/o actividad potenciada o disminuida. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos se puede mutar para obtener un anticuerpo con la afinidad de unión deseada a su antígeno. La modificación de polipéptidos es una práctica rutinaria en la técnica y no es necesario describirla en detalle en el presente documento. La modificación de polipéptidos se ejemplifica en los ejemplos. Los ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos, una o más deleciones o adiciones de aminoácidos que no cambian significativamente de manera perjudicial la actividad funcional, o que madura (potencia) la afinidad del polipéptido por su ligando, o uso de análogos químicos.

Las inserciones de las secuencias de aminoácidos incluyen fusiones en los extremos amino y/o carboxilo que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, asi como inserciones intrasecuencia de residuos aminoacídicos únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo en el extremo N o el anticuerpo fusionado a una marca de epítopo. Otras variantes de inserciones de una molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima o a un polipéptido que aumenta la semivida del anticuerpo en la circulación sanguínea.

Las variantes de sustitución tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo retirado y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan las alteraciones de las FR. En el cuadro 1 se muestran sustituciones conservativas bajo el encabezamiento de "sustituciones conservativas". Si tales sustituciones provocan un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares", o como se describe más adelante en referencia a clases de aminoácidos, y cribar los productos.

CUADRO 1 Sustituciones aminoacidicas Se logran modificaciones sustanciales de las propiedades biológicas del anticuerpo seleccionando sustituciones que difieren de forma significativa en su efecto para mantener (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo, en forma de una conformación de lámina o hélice, (b) la carga o capacidad hidrófoba de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que se producen de manera natural se dividen en grupos basados en propiedades comunes de las cadenas laterales: (1) No polares: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) Polar sin carga: Cys, Ser, Thr Asn, Gln; (3) Ácidos (cargados negativamente): Asp, Glu; (4) Básicos (cargados positivamente): Lys, Arg; (5) Residuos que influyen en la orientación de las cadenas: Gly, Pro; y (6) Aromáticos: Trp, Tyr, Phe, His.

Las sustituciones no conservadoras se preparan intercambiando un miembro de una de estas clases por otra clase.

Cualquier residuo de cisteína no implicado en mantener la conformación apropiada del anticuerpo también puede ser sustituido, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir reticulaciones aberrantes. A la inversa, se pueden añadir enlace(s) de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad, en particular cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv.

Las modificaciones de aminoácidos pueden variar desde el cambio o la modificación de uno o más aminoácidos hasta el rediseño completo de una región, tal como la región variable. Los cambios en la región variable pueden alterar la especificidad y/o afinidad de unión. En algunas modalidades, no se hacen más de uno a cinco sustituciones de aminoácidos conservadoras dentro un dominio de CDR. En otras modalidades, no se hacen más de una a tres sustituciones de aminoácidos conservadoras dentro un dominio de CDR. Aún en otras modalidades, el dominio de CDR es CDR H3 y/o CDR L3.

Las modificaciones también incluyen polipéptidos glucosilados y no glucosilados, así como polipéptidos con otras modificaciones postraduccionales, tales como, por ejemplo, glucosilación con diferentes azúcares, acetilación y fosforilación. Los anticuerpos están glucosilados en posiciones conservadas en sus regiones constantes (Jefferis y Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright y Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). Las cadenas laterales de oligosacáridos de las inmunoglobulinas afectan a la función de las proteínas (Boyd y col., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe y Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) y a la interacción intramolecular entre partes de la glucoproteína, que puede afectar a la conformación y la superficie tridimensional presentada de la glucoproteína (Jefferis y Lund, referencia anterior; Wyss y Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Los oligosacáridos también pueden servir para dirigir una glucoproteína a ciertas moléculas basándose en estructuras de reconocimiento específicas. También se ha comunicado que la glucosilación de los anticuerpos afectar al CCDA. En particular, se comunicó que las células CHO con expresión regulada por tetraciclina de ß(1 ,4)-?-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una formación de catalización de glucosiltransferasa de GlcNAc separada, tienen una actividad de CCDA mejor (Umana y cois., 1999, Nature Biotech. 17:176-180).

Normalmente, la glucosilación de los anticuerpos está enlazada a N o enlazada a O. Enlazada a N se refiere a la unión del resto carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparragina. Las secuencias tnpeptídicas asparragina-X-serina, asparragina-X-treonina y asparragina-X-cisteína, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparragina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias tnpeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glucosilacíón potencial. La glucosilación enlazada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, lo más habitualmente serina o treonina, aunque también se pueden usar 5-hidroxiprolína o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glucosilación al anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de tal forma que contenga una o más de las secuencias tnpeptídicas anteriormente descritas (para los sitios de glucosilación enlazados a N). La alteración también se puede realizar mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glucosilación enlazados a O).

También se puede alterar el patrón de glucosilación de los anticuerpos sin alterar la secuencia de nucleótidos subyacente. La glucosilación depende considerablemente de la célula hospedante usada para expresar el anticuerpo. Dado que el tipo celular usado para la expresión de glucoproteínas recombinantes, por ejemplo, anticuerpos, como terapia potencial raramente es la célula nativa, se pueden esperar variaciones en el patrón de glucosilacion de los anticuerpos (véase, por ejemplo, Hse y cois., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070).

Además de la elección de las células hospedantes, los factores que afectan a la glucosilacion durante la producción recombinante de anticuerpos incluyen el modo de crecimiento, la formulación del medio, la densidad de cultivo, la oxigenación, el pH, esquemas de purificación y similares. Se han propuesto diversos procedimientos para modificar el patrón de glucosilacion logrado en un organismo hospedante particular incluyendo introducir o sobreexpresar ciertas enzimas implicadas en la producción de oligosacáridos (patentes de los EE.UU. N.— 5,047,335, 5,510,261 y 5,278,299. Se puede eliminar enzimáticamente la glucosilacion, o ciertos tipos de glucosilacion, de la glucoproteína, por ejemplo, usando endoglucosidasa H (Endo H), N-glucosidasa F, endoglucosidasa F1 , endoglucosidasa F2, endoglucosidasa F3. Además, la célula hospedante recombinante se puede modificar genéticamente para ser defectiva en el procesamiento de ciertos tipos de polisacáridos. Estas técnicas y otras similares se conocen bien en la técnica.

Otros procedimientos de modificación incluyen usar técnicas de acoplamiento conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, medios enzimáticos, sustitución oxidativa y quelación. Las modificaciones se pueden usar, por ejemplo, para unir etiquetas para inmunoensayo. Los polipéptidos se preparan usando procedimientos establecidos en la técnica y se pueden analizar usando ensayos estándar conocidos en la técnica, de los que algunos se describen más adelante y en los ejemplos.

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo comprende una región constante modificada, tal como una región constante que es inmunológicamente inerte o parcialmente inerte, por ejemplo, no activa la lisis mediada por complemento, no estimula CCDA, o no activa microglia; o tienen actividades reducidas (en comparación con el anticuerpo no modificado) en una cualquiera o más de los siguientes: activar la lisis mediada por complemento, estimular CCDA o activar microglia. Se pueden usar diferentes modificaciones de la región constante para lograr un nivel óptimo y/o una combinación de las funciones efectoras. Véase, por ejemplo, Morgan et al., 1995, Immunology 86:319-324; Lund y cois., 1996, J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969; Idusogie y cois., 2000, J. Immunology 164:4178-4184; Tao y col., 1989, J. Immunology 143: 2595-2601 ; y Jefferis y cois., 1998, Inmunological Reviews 163:59-76. En algunas modalidades, la región constante se modifica tal como se describe en Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624; en la publicación PCT N.° W099/58572; y/o en la solicitud de patente de Reino Unido N.° 9809951.8. En otras modalidades, el anticuerpo comprende una región constante de lgG2 de cadena pesada humana que comprende las siguientes mutaciones: de A330P331 a S330S331 (numeración de aminoácidos con referencia a la secuencia de lgG2 de tipo salvaje). Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624. Aún en otras modalidades, la región constante es aglucosilada para glucosilación enlazada a N. En algunas modalidades, la región constante es aglucosilada para glucosilación enlazada a N mutando el residuo aminoacídico glucosilado o los residuos flanqueantes que son parte de la secuencia de reconocimiento de N-glucosilación en la región constante. Por ejemplo, el sitio de N-glucosilación N297 se puede mutar a A, Q, K o H. Véase, Tao y col., 1989, J. Immunology 143: 2595-2601 ; y Jefferis y cois., 1998, Inmunológicos Reviews 163:59-76. En algunas modalidades, la región constante es aglucosilada para glucosilación enlazada a N. La región constante se puede aglucosilar por glucosilación enlazada a N de manera enzimática (tal como retirar el carbohidrato mediante la enzima Pngasa), o mediante expresión en una célula hospedante deficiente en glucosilación.

Otras modificaciones de anticuerpos incluyen anticuerpos que se han modificado tal como se describe en la publicación PCT N.° WO 99/58572. Estos anticuerpos comprenden, además de un dominio de unión dirigido a la molécula diana, un dominio efector que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa a todo o parte de un dominio constante de una cadena pesada de inmunoglobulina humana. Estos anticuerpos pueden unir la molécula diana sin activar la lisis dependiente de complemento significativa, o la destrucción mediada por células de la diana. En algunas modalidades, el dominio efector puede unir específicamente FcRn y/o FcyRIlb. Éstos normalmente se basan en dominios quiméricos derivados de dos o más dominios de cadena pesada C H2 de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos modificados de este modo son particularmente adecuados para su uso en terapia de anticuerpo crónica, para evitar reacciones inflamatorias y otras reacciones adversas a la terapia de anticuerpo convencional.

La invención incluye con modalidades de afinidad madurada. Por ejemplo, los anticuerpos con afinidad madurada se pueden producir mediante procedimientos conocidos en la técnica (Marks y col., 1992, Bio/Technology, 10:779-783; Barbas y col., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91 :3809-3813; Schier y col., 1995, Gene, 169:147-155; Yelton y col., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson y col., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9; Hawkins y col., 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896; y publicación PCT N.° WO2004/058184).

Se pueden usar los siguientes procedimientos para el ajuste de la afinidad de un anticuerpo y para caracterizar una CDR. Una forma de caracterizar una CDR de un anticuerpo y/o de alterar (tal como mejorar) la afinidad de unión de un polipéptido, tal como un anticuerpo se denomina "mutagénesis mediante colecciones". En general, la mutagénesis mediante colecciones funciona como sigue. Una o más posiciones de aminoácidos en la CDR se reemplazan con dos o más (tales como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20) aminoácidos usando procedimientos reconocidos en la técnica. Esto genera colecciones pequeñas de clones (en algunas modalidades, una para cada posición aminoacídica que se analiza), cada una con una complejidad de dos o más miembros (si dos o más aminoácidos están sustituidos en cada posición). En general, la colección también incluye un clon que comprende el aminoácido nativo (no sustituido). Se rastrea un número pequeño de clones, por ejemplo, aproximadamente 20-80 clones (dependiendo de la complejidad de la colección), de cada colección para determinar su afinidad de unión al polipéptido diana (u otra diana de unión), y se identifican los candidatos con un incremento, la misma, una disminución o ninguna unión. Los procedimientos para determinar la afinidad de unión se conocen bien en la técnica. Se puede determinar la afinidad de unión usando el análisis de resonancia en plasmón superficial Biacore, que detecta diferencias en la afinidad de unión de aproximadamente 2 veces o mayor. Biacore es particularmente útil cuando el anticuerpo de partida ya se une con una afinidad relativamente alta, por ejemplo una K D de aproximadamente 10 nM o menos. El rastreo usando resonancia de plasmón superficial Biacore se describe en los ejemplos, en el presente documento.

Se puede determinar la afinidad de unión usando Kinexa Biocensor, ensayos de proximidad de centelleo, ELISA, inmunoensayo de ORIGEN (IGEN), desactivación de fluorescencia, transferencia de fluorescencia y/o presentación de levaduras. También se puede rastrear la afinidad de unión usando un bioensayo adecuado.

En algunas modalidades, cada posición aminoacídica en un CDR es reemplazada (en algunas modalidades, una de cada vez) con todos los 20 aminoácidos naturales usando procedimientos de mutagénesis reconocidos por la técnica (de los que algunos se describen en el presente documento). Esto genera colecciones pequeñas de clones (en algunas modalidades, una para cada posición aminoacídica que se analiza), cada uno con una complejidad de 20 miembros (si todos los 20 aminoácidos están sustituidos en cualquier posición).

En algunas modalidades, la colección que se va a rastrear comprende sustituciones en dos o más posiciones, que pueden estar en la misma CDR o en dos o más CDR. Así, la colección puede comprender sustituciones en dos o más posiciones en una CDR. La colección puede comprender sustitución en dos o más posiciones en dos o más CDR. La colección puede comprender sustitución en 3, 4, 5 o más posiciones, tales posiciones encontradas en dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR. Se puede preparar la sustitución usando codones de redundancia baja. Véase, por ejemplo, el cuadro 2 de Balint y cois., 1993, Gene 137 (1): 109-18).

La CDR puede ser CDRH3 y/o CDRL3. La CDR puede ser una o más de CDRL1 , CDRL2, CDRL3, CDRH1 , CDRH2, y/o CDRH3. La CDR puede ser una CDR de Kabat, una CDR de Chothia o una CDR extendida.

Se pueden secuenciar candidatos con una unión mejorada, identificando así un muíante de sustitución de CDR que da como resultado una afinidad mejorada (también denominada una sustitución "mejorada"). También se pueden secuenciar los candidatos que se unen, identificando así una sustitución de CDR que retiene la unión.

Se pueden llevar a cabo múltiples rondas de rastreo. Por ejemplo, los candidatos (comprendiendo cada uno una sustitución de aminoácido en una o más posiciones de una o más CDR) con unión mejorada también son útiles para el diseño de una segunda colección que contiene al menos el aminoácido original y sustituido en cada posición de CDR mejorada (es decir, la posición aminoacídica en la CDR en la que un mutante de sustitución mostró unión mejorada). La preparación, el rastreo, y la selección de esta colección se discute a continuación.

La mutagénesis mediante colección también proporciona un medio para caracterizar una CDR, en la medida en que la frecuencia de los clones con unión mejorada, la misma unión, unión disminuida o ninguna unión también proporciona información relativa a la importancia de cada posición aminoacídica para la estabilidad del complejo anticuerpo-antígeno. Por ejemplo, si una posición de la CDR retiene la unión cuando se cambia a todos los 20 aminoácidos, esa posición se identifica como una posición que es improbable que se requiera para la unión al antígeno. En cambio, si una posición de CDR retiene la unión sólo en un porcentaje pequeño de sustituciones esa posición se identifica como una posición que es importante para la función CDR. Así, los procedimientos de mutagénesis mediante colecciones generan información relacionada con las posiciones en las CDR que se pueden cambiar a muchos aminoácidos distintos (incluyendo todos los 20 aminoácidos), y posiciones en las CDR que no se pueden cambiar o que sólo se pueden puede cambiar a unos pocos aminoácidos.

Los candidatos con afinidad mejorada se pueden combinar en una segunda colección, que incluye el aminoácido mejorado, el aminoácido original y pueden incluir adicionalmente sustituciones adicionales en esa posición, dependiendo de la complejidad de la colección que se desee, o se permite usando el rastreo deseado o el procedimiento de selección. Además, si se desea, y se puede aleatorizar una posición aminoacídica adyacente a al menos dos o más aminoácidos. La aleatorización de aminoácidos adyacentes puede permitir flexibilidad conformacional adicional en la CDR mutante, que, a su vez, puede permitir o facilitar la introducción de un gran número de mutaciones mejoradas. La colección también puede comprender sustitución en las posiciones que no muestran afinidad mejorada en la primera ronda de rastreo.

La segunda colección se rastrea o se selecciona para determinar los miembros de la colección con afinidad de unión mejorada y/o alterada usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo rastreo usando análisis de resonancia en plasmón superficial Biacore, y selección usando cualquier procedimiento conocido en la técnica para la selección, incluyendo la presentación en fagos, presentación de levadura y presentación de ribosomas.

La invención también comprende proteínas de fusión que comprenden uno o más fragmentos o regiones de los anticuerpos o polipéptidos de esta invención. En una modalidad, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de una región de cadena ligera variable mostrada en la SEQ ID N °: 3 y/o al menos 10 aminoácidos de una región de la cadena pesada variable mostrada en la SEQ ID N°: 4 o 5. En otras modalidades, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente el 20, al menos aproximadamente 25 o al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos de la región de cadena ligera variable y/o al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente el 20, al menos aproximadamente 25, o al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos de la región de la cadena pesada variable. En otra modalidad, el polipéptido de fusión comprende una o más CDR. Aún en otras modalidades, el polipéptido de fusión comprende CDR H3 (VH CDR3) y/o CDR L3 (VL CDR3). Para los propósitos de esta invención, una proteína de fusión contiene uno o más anticuerpos y otra secuencia de aminoácidos a la que no está unida en la molécula no nativa, por ejemplo, una secuencia heteróloga o una secuencia homologa de otra región. Secuencias heterólogas ejemplares incluyen, pero no se limitan a una "marca" tal como una marca de FLAG o una marca de 6His. Las marcas se conocen bien en la técnica.

Se puede crear un polipéptido de fusión mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, sintética o recombinantemente. Normalmente, se preparan las proteínas de fusión de esta invención preparando y expresando un polinucleótido que los codifica usando procedimientos recombinantes descritos en el presente documento, aunque también se pueden preparar mediante otros medios conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, síntesis química.

Esta invención también proporciona composiciones que comprenden anticuerpos o polipéptidos conjugado (por ejemplo, enlazados) a un agente que facilite el acoplamiento a un soporte sólido (tal como biotina o avidina). Por simplicidad, se hará referencia generalmente a anticuerpos con la comprensión de que estos procedimientos se aplican a cualquier unión de antígeno y/o modalidades de antagonistas descritas en el presente documento. Conjugación generalmente se refiere a enlazar estos componentes tal como se describe en el presente documento. El enlace (que en general es la fijación estos componentes en asociación próxima al menos para administración) se puede lograr de varias maneras. Por ejemplo, es posible una reacción directa entre un agente y un anticuerpo cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleófilo, tal como un grupo amino o grupo sulfhidrilo, sobre uno puede reaccionar con un grupo que contenga carbonilo, tal como un anhídrido o un haluro ácido o con un grupo alquilo que contiene un buen grupo saliente (por ejemplo, un haluro) en el otro.

Un anticuerpo o polipéptido de esta invención se puede enlazar a un agente marcador tales como una molécula fluorescente, una molécula radiactiva o a cualquier otro marcador conocido en la técnica. En la técnica se conocen marcadores que proporcionan generalmente (directa o bien indirectamente) una señal.

La invención también proporciona composiciones (incluyendo composiciones farmacéuticas) y kits que comprenden, como esta divulgación deja claro, cualquiera o todos los anticuerpos y/o polipéptidos descritos en el presente documento.

La invención también proporciona polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos y los péptidos de la invención, y vectores y células hospedantes que comprenden el polinucleótido.

En otro aspecto, la invención proporciona polinucleótidos que codifican cualquiera de los anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpos) y polipéptidos descritos en el presente documento, tales como anticuerpos y polipéptidos que tienen dañada la función efectora. Los polinucleótidos se pueden preparar y expresar mediante procedimientos conocidos en la técnica.

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones (tales como composiciones farmacéuticas) que comprenden cualquiera de los polinucleótidos de la invención. En algunas modalidades, la composición comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo tal como se describe en el presente documento. En otra modalidad, la composición comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica cualquiera de los anticuerpos y polipéptidos descritos en el presente documento. Aún en otras modalidades, la composición comprende uno o ambos de los polinucleótidos mostrados en SEQ ID N.°: 23 y SEQ ID NO: 24. Vectores de expresión, y administración de composiciones de polinucleótido se describen adicionalmente en el presente documento.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para preparar cualquiera de los polinucleótidos descritos en el presente documento.

Los polinucleótidos complementarios a cualquiera de tales secuencias también están comprendidos por la presente invención. Los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificante o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o de ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de HnRNA, que contienen intrones y que corresponden a una molécula de ADN de una manera individualizada, y moléculas de ARNm, que no contienen intrones. Las secuencias codificantes o no codificantes pueden estar presentes, pero no es necesario, dentro de un polinucleótido de la presente invención, y un polinucleótido puede estar enlazado, pero no es necesario, a otras moléculas y/o materiales de soporte.

Los polinucleótidos puede comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un anticuerpo o una parte del mismo) o puede comprender una variante de esta secuencia. Las variantes de polinucleótidos contienen una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones de tal forma que la inmunorreactividad del polipéptido codificado no está disminuida, en relación con una molécula inmunorreactiva nativa. El efecto sobre la inmunorreactividad del polipéptido codificado generalmente se puede evaluar tal como se describe en el presente documento. Preferiblemente, las variantes presentan al menos aproximadamente una identidad del 70%, más preferiblemente, al menos aproximadamente una identidad del 80%, aún más preferiblemente, al menos aproximadamente una identidad del 90%, y lo más preferiblemente, al menos aproximadamente una identidad del 95% con una secuencia de polinucleótidos que codifica un anticuerpo nativo o una porción del mismo.

Se dice que dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean su correspondencia máxima tal como se describe a continuación. Normalmente las comparaciones entre dos secuencias se lleva a cabo comparando las secuencias sobre una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similaridad de secuencia. Una "ventana de comparación" tal como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, normalmente de 30 a aproximadamente 75, o de 40 a aproximadamente 50, en el que se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que la dos secuencias estén óptimamente alineadas.

El alineamiento óptimo de secuencias para comparación se puede llevar a cabo usando el programa Megalign en el grupo Lasergene de software bioinformático (DNASTAR, Inc., Madison, Wl), usando parámetros por defecto. Este programa abarca varios esquemas de alineación descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure (National Biomedical Research Foundation, Washington DC), Vol. 5, Supl. 3, páginas 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes páginas 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, (Academic Press, Inc., San Diego, CA); Higgins, D.G. y Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. y Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971 , Comb. Theor. 11 :105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principies and Practice of Numerical Taxonomy (Freeman Press, San Francisco, CA); Wilbur, W.J. y Lipman, D.J., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:726-730.

Preferiblemente, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas óptimamente sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en la que la parte de la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos, normalmente del 5 al 15 por ciento o del 10 al 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones idénticas en las que las bases de ácidos nucleicos idénticos o el residuo aminoacídico se producen en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas entre el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia.

Las variantes también o alternativamente, pueden ser sustancialmente homologas a un gen nativo, o una porción o complemento del mismo. Tales variantes de polinucleótidos pueden hibridar en condiciones moderadamente restrictivas a secuencia de ADN que se produce de manera natural que codifica un anticuerpo nativo (o una secuencia complementaria).

"Condiciones moderadamente restrictivas" adecuadas incluyen prelavar en una solución de 5 X SSC, SDS al 0.5%, EDTA 1.0 mM (pH 8.0); hibridar a 50°C-65°C, 5 X SSC, durante toda una noche; seguido de lavar dos veces a 65°C durante 20 minutos con cada una de 2X, 0.5X y 0.2X SSC que contiene SDS al 0.1 %.

Tal como se usa en el presente documento, "condiciones altamente rigurosas" o "condiciones altamente restrictivas" son aquellas que: (1) emplean fuerza iónica baja y temperatura alta para lavar, por ejemplo cloruro de sodio 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/dodecil sulfato de sodio al 0.1 % a 50°C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) albúmina sérica bovina al 0.1 %/Ficol al 0.1 %/polivinilpirrolidona al 0.1 %/tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (NaCI 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 pg/ml), SDS al 0.1 %, y sulfato de dextrano al 10% a 42°C, con lavados a 42°C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55°C, seguido de lavado de alta rigurosidad constituido por 0.1 x SSC que contiene EDTA a 55°C. El experto en la técnica reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. según sea necesario para adaptar factores tales como longitud de sonda y similares.

Apreciarán los expertos en la técnica que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido tal como se describe en el presente documento. Algunos de estos polinucleótidos portan homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. Sin embargo, los polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codón están contemplados específicamente por la presente invención. Adicionalmente, los alelos de los genes que comprenden las secuencias de polinucleótidos proporcionados en el presente documento están dentro del alcance de la presente invención. Los alelos son genes endógenos que están alterados como resultado de una o más mutaciones, tales como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. La proteína y el ARNm resultante pueden tener, pero no es necesario, una función o estructura alterada. Los alelos se pueden identificar usando técnicas estándar (tales como hibridación, amplificación y/o comparación de secuencias de datos).

Los polinucleótidos de esta invención se pueden obtener usando síntesis química, procedimientos recombinantes o PCR. Los procedimientos de síntesis química de polinucleótidos se conocen bien en la técnica y no es necesario describirlos en detalle en el presente documento. Un experto en la técnica puede usar las secuencias que se proporcionan en el presente documento y un sintetizador de ADN comercial puede producir una secuencia de ADN deseada.

Para preparar polinucleótidos usando procedimientos recombinantes, se puede insertar un polinucleótido que comprende una secuencia deseada dentro de un vector adecuado, y a su vez, el vector se puede introducir dentro de una célula hospedante adecuada para replicación y amplificación, tal como se discute adicionalmente en el presente documento. Los polinucleótidos se pueden insertar en células hospedantes mediante cualquier medio conocido en la técnica. Las células se transforman introduciendo un polinucleótido exógeno mediante captación directa, endocitosis, transfección, apareamiento-F o electroporación. Una vez introducido, el polinucleótido exógeno se puede mantener dentro de la célula como un vector no integrado (tal como un plásmido) o integrar en el genoma de la célula hospedante. El polinucleótido amplificado de esta manera se puede aislar a partir de la célula hospedante mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, supra.

Alternativamente, la PCR permite la reproducción de secuencias de ADN. La tecnología de PCR se conoce bien en la técnica y se describe en las patentes de los EE.UU. N.~ 4,683,195, 4,800,159, 4,683,202 y 4,754,065, así como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullís y col., 1994, eds. (Birkauswer Press, Boston, MA).

Puede obtenerse ARN usando el ADN aislado en un vector apropiado e insertándolo en una célula hospedante adecuada. Cuando se replica la célula y el ADN se transcribe en ARN, entonces, se puede aislar el ARN usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica, tal como se expone en Sambrook y col., 1989, ant., por ejemplo.

Los vectores de clonación adecuados se pueden construir de acuerdo con técnicas estándar, o se pueden seleccionar a partir de un gran número de vectores de clonación disponibles en la técnica. Mientras que el vector de clonación seleccionado puede variar de acuerdo con la célula hospedante que se desea usar, los vectores de clonación útiles generalmente tendrán la capacidad de auto-replicarse, pueden poseer una única diana para una endonucleasa de restricción particular, y/o pueden portar genes para un marcador que se puede usar para seleccionar los clones que contienen el vector. Ejemplos adecuados incluyen plásmidos y virus bacterianos, por ejemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por ejemplo, pBS SK +) y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1 , pCR1 , RP4, ADN de fago, y vectores transportadores tales como pSA3 y pAT28. Estos y muchos otros vectores de clonación están disponibles a partir de vendedores comerciales tales como BioRad, Strategene e Invitrogen.

En general, los vectores de expresión son construcciones de polinucleótidos replicables que contienen un polinucleótido de acuerdo con la invención. Está implícito que un vector de expresión debe ser replicable en las células hospedantes como episomas o bien como una parte integral del ADN cromosómico. Vectores de expresión adecuados incluyen pero no se limitan a plásmidos, vectores víricos, incluyendo adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, cósmidos, y vector(es) de expresión dados a conocer en la publicación PCT N.° WO 87/04462. En general, los componentes de los vectores pueden incluir, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal; un origen de replicación; uno o más genes marcadores; elementos de control transcripcional adecuados (tales como promotores, potenciadores y terminador). Para la expresión (es decir, la traducción), normalmente también se requieren uno o más elementos de control traduccional, tales como sitios de unión a ribosoma, sitios de iniciación de traducción y codones de parada.

Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés se pueden introducir en la célula hospedante mediante cualquiera de un número de medios apropiados, incluidos electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano, u otras sustancias; bombardeo con microproyectiles; lipofección; e infección (por ejemplo, en la que vector es un agente infeccioso tales como el virus de la vacuna). La elección de introducir vectores o polinucleótidos dependerá frecuentemente de las características de la célula hospedante.

La invención también proporciona células hospedantes que comprenden cualquiera de los polinucleótidos descritos en el presente documento. Se puede usar cualquier célula hospedante que pueda sobreexpresar ADN heterólogo para el propósito de aislar los genes que codifican el anticuerpo, el polipéptido o la proteína de interés. Ejemplos no limitantes de células hospedantes de mamífero incluyen pero no se limitan a células COS, HeLa, NSO y CHO. Véase también la publicación PCT N.° WO 87/04462. Células hospedantes distintas de mamífero adecuadas incluyen procariotas (tales como E. eolio B. subtillis) y levadura (tales como S. cerevisae , S. pombe ; o K. lactis). Preferiblemente, las células hospedantes expresan los ADNC a un nivel de aproximadamente 5 veces más alta, más preferiblemente, 10 veces más alta, incluso más preferiblemente, 20 veces más alta que aquella de la del correspondiente anticuerpo endógeno o proteína de interés, si está presente, en las células hospedantes. El rastreo de las células hospedantes para una unión especifica a antigeno se lleva a cabo mediante un inmunoanálisis o FACS. Se puede identificar una célula que sobreexpresa el anticuerpo o proteína de interés.

C. Composiciones Las composiciones usadas en los procedimientos de la invención comprenden una cantidad efectiva de un anticuerpo dependiente de pH o un polipéptido derivado de anticuerpo dependiente de pH, descrito en el presente documento. Ejemplos de tales composiciones, así como cómo formularlas, también se describen en una sección anterior y a continuación. En una modalidad, la composición comprende uno o más anticuerpos dependientes de pH. En otras modalidades, el anticuerpo dependiente de pH reconoce el PCSK9 humano. Aún en otras modalidades, el anticuerpo dependiente de pH es humanizado. Aún en otras modalidades, el anticuerpo dependiente de pH comprende una región constante que no activa una respuesta inmunitaria no deseada o no querida, tal como una lisis mediada por anticuerpo o CCDA. En otras modalidades, el anticuerpo dependiente de pH de comprende una o más CDR del anticuerpo (tal como una, dos, tres, cuatro, cinco, o, en algunas modalidades, las seis CDR). En algunas modalidades, el anticuerpo dependiente de pH es humano.

La composición usada en la presente invención pueden comprender adicionalmente vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes o estabilizadores (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20a Ed., 2000, Lippincott Williams y Wilkins, Ed. K. E. Hoover), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones, y pueden comprender tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de peso molecular bajo (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivínilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparragina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextranos; agentes quelantes tales como EDTA, azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn- proteínas); y/o tensioactívos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Excipientes farmacéuticamente aceptables se describen adicionalmente en el presente documento.

En una modalidad, el anticuerpo se administra en una formulación como una solución acuosa estéril que tiene un pH que varía desde aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.5 y que comprende de desde aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo, desde aproximadamente 1 milimolar hasta aproximadamente 100 milimolar de tampón de histidina, desde aproximadamente 0.01 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml de polisorbato 80, desde aproximadamente 100 milimolar hasta aproximadamente 400 milimolar de trehalosa y desde aproximadamente 0.01 milimolar hasta aproximadamente 1.0 milimolar de EDTA disódico dihidratado.

También se puede usar el anticuerpo dependiente de pH y composiciones del mismo junto con otros agentes que sirven para potenciar y/o complementar la eficacia de los agentes.

D. Kits La invención también proporciona kits para su uso en los procedimientos actuales. Los kits de la invención incluyen uno o más contenedores que comprenden un anticuerpo dependiente de pH (tal como un anticuerpo humanizado) o péptido descritos en el presente documento e instrucciones para su uso de acuerdo con cualquiera de los procedimientos de la invención descritos en el presente documento. En general, estas instrucciones comprenden una descripción de la administración del anticuerpo dependiente de pH para los tratamientos terapéuticos descritos anteriormente.

En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunas modalidades, el anticuerpo es humano. En otras modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Las instrucciones referidas al uso de un anticuerpo dependiente de pH incluyen generalmente información de dosificación, del programa de dosificación y de la vía de administración para el tratamiento deseado. Los contenedores pueden ser dosis unitarias, envases a granel (por ejemplo, envases de múltiples dosis) o dosis subunitarias. Las instrucciones suministradas en los kits de la invención normalmente son instrucciones escritas en un prospecto o etiqueta (por ejemplo, una lámina de papel incluida en el kit), pero también son aceptables las instrucciones legibles a máquina (por ejemplo, instrucciones realizadas en un disco de almacenamiento óptico o magnético).

Los kits de esta invención están en un envase adecuado. Los envases adecuados incluyen, pero no se limita a, viales, botellas, botes, envases flexible (por ejemplo, bolsas de plásticos o Mylar sellados), y similares. También se contemplan los envases para su uso en combinación con un dispositivo específico, tal como un inhalador, dispositivo de administración nasal (por ejemplo, un atomizador) o un dispositivo de infusión tal como una minibomba. Un kit puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón que puede horadarse mediante una aguja de inyección hipodérmica). El contenedor también puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón que puede horadarse mediante una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo dependiente de pH. El contenedor (por ejemplo, jeringa prellenada o autoinyector) puede comprender adicionalmente un segundo agente farmacéuticamente activo.

Los kits pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales tales como tampones e información interpretativa. Normalmente, el kit comprende un contenedor y una etiqueta u prospecto(s) en o asociado con el contenedor.

Mutaciones y Modificaciones Para expresar los anticuerpos de la presente invención, los fragmentos de ADN que codifican regiones VH y VL se pueden obtener en primer lugar usando cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente. También se pueden introducir diversas modificaciones, por ejemplo, mutaciones, deleciones y/o adiciones dentro de la secuencias de ADN usando procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede llevar a cabo la mutagénesis usando procedimientos estándar, tales como mutagénesis mediada por PCR, en los que los nucleótidos mutados están incorporados dentro de los cebadores de PCR de tal forma que el producto de la PCR contiene las mutaciones deseadas o la mutagénesis dirigida a sitio.

Un tipo de sustitución, por ejemplo, que se pueden hacer es la de cambiar una o más cisteínas en el anticuerpo, que puede ser químicamente reactivas, por otro residuo, tal como, sin limitación, alanina o serina. Por ejemplo, puede haber una sustitución de una cisteína no canónica. Se puede hacer la sustitución en una CDR o una región estructural de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo. En algunas modalidades, la cisteína es canónica.

También se pueden modificar los anticuerpos, por ejemplo, en los dominios variables de las cadenas pesadas y/o ligeras, por ejemplo, para alterar una propiedad de unión del anticuerpo. Por ejemplo, se puede hacer una mutación en una o más de las regiones CDR para incrementar o disminuir la KD del anticuerpo por el antígeno, para incrementar o disminuir la kD, o para alterar la especificidad de unión del anticuerpo. Las técnicas en mutagénesis dirigida a sitio son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col. y Ausubel y col., supra.

También se puede hacer una modificación o mutación en una región estructural o dominio constante para incrementar la semivida de un dependiente de pH. Véase, por ejemplo, la publicación PCT N.° WO 00/09560. También se puede hacer una mutación en una región estructural o dominio constante para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo, para proporcionar un sitio para unión covalente o no covalentes a otra molécula, o para alterar tales propiedades como fijación de complemento, unión a FcR y citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos. De acuerdo con la invención, una único anticuerpo puede tener mutaciones en una cualquiera o en más de las CDR o regiones estructurales del dominio variable o en el dominio constante.

En un proceso conocido como "germinación", ciertos aminoácidos en las secuencias de VH y VL se pueden mutar para que se emparejen con las que se encuentran de forma natural en las secuencias de VH y VL de línea germinal. En particular, las secuencias de aminoácidos de las regiones estructurales en las secuencias VH y VL se pueden mutar para que se emparejen con las secuencias de línea germinal para reducir el riesgo de inmunogenicidad cuando se administra el anticuerpo. Las secuencias de ADN de línea germinal para genes de VH y VL humanos se conocen en la técnica (véase por ejemplo, la base de datos de secuencias de línea germinal humana "Base"; véase también Kabat, E. A., y col. (1991) Sequen ees of Proteins of Inmunológica Inertes, Quinta Edición, U.S. Departamento of Meath and Human Cervices, NIH Pul. N.°:91-3242; Toninos y col., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox y cois., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836.

Otro tipo de sustitución de aminoácidos que se pueden hacer es la de retirar sitios proteolíticos potenciales en el anticuerpo. Tales sitios se pueden producir en una CDR o región estructural de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo. La sustitución de residuos de cisteína y la eliminación de sitios proteolíticos puede disminuir el riesgo de heterogeneidad en el producto de anticuerpo y así incrementar su homogeneidad. Otro tipo de sustitución de aminoácidos elimina los pares asparragina-glicina, que forman sitios de desamidacion potenciales, alterando uno o ambos de los residuos. En otro ejemplo, se puede escindir la lisina del extremo C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo dependiente de pH de la invención. En diversas modalidades de la invención, las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos pueden incluir opcionalmente una secuencia señal.

Una vez que se han obtenido los fragmentos de ADN que codifican los segmentos de VH y VL de la presente invención, estos fragmentos de ADN se pueden manipular adicionalmente mediante técnicas de ADN recombinante estándar, por ejemplo para convertir los genes de región variable a genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, a genes de fragmento Fab o a un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se enlaza operativamente al otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. El término "enlazado operativamente", tal como se usa en este contexto, se pretende que signifique que los dos fragmentos de ADN están unidos de forma tal que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanezcan en el marco.

El ADN aislado que codifica la región VH se puede convertir en un gen de la cadena pesada de longitud completa enlazando operativamente el ADN que codifica VH a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de la cadena pesada (CH1 , CH2 y CH3). Las secuencias de genes de región constante de la cadena pesada humana se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., y col., 1991 , Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publ. N.°: 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de la cadena pesada puede ser una región constante de lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, Ig o IgD, pero lo más preferiblemente es una región constante lgG1 o lgG2. La secuencia de región constante de IgG puede ser cualquiera de los diversos alelos o alotipos conocidos que tienen lugar entre diferentes individuos, tales como Gm (1 ), Gm (2), Gm (3), y Gm (17). Estos alotipos representan una sustitución de aminoácidos naturales que se produce de manera natural en las regiones constantes de lgG1. Para un gen de cadena pesada de fragmento Fab, el ADN que codifica VH se puede enlazar operativamente a otra molécula de ADN que codifica sólo la región constante de la cadena pesada CH1. La región constante de la cadena pesada CH1 se puede derivar de cualquiera de los genes de la cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la región VL se puede convertir en un gen de la cadena ligera de longitud completa (así como un gen de la cadena ligera de Fab) enlazando operativamente el ADN que codifica VL con otra molécula de ADN que codifica la región constante de la cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de región constante de la cadena ligera humanos se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., y col., 1991 , Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publ. N.°: 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de la cadena ligera puede ser una región constante kappa o lamda. La región constante kappa puede ser cualquiera de los diversos alelos conocidos que tienen lugar entre diferentes individuos, tales como lnv(1), lnv(2), e lnv(3). La región constante lambda se pueden derivar de cualquiera de los tres genes lambda.

Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL están enlazados de forma operativa a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de modo que las secuencias VH y VL se pueden expresar como una proteína de cadena única contigua, con las regiones VL y VH unidas mediante el enlazador flexible (Véase por ejemplo, Bird y cois., 1988, Science 242:423-426; Huston y cois., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty y col., 1990, Nature 348:552-554. El anticuerpo monocatenario puede ser monovalente, si sólo se usa un único VH y VL, bivalente, si se usan dos VH y VL o polivalente, si se usan más de dos VH y VL. Se pueden generar anticuerpos polivalentes o biespecíficos que se unen específicamente a antígeno y a otra molécula.

En otra modalidad, se puede preparar inmunoadhesina o anticuerpo de fusión que comprende todo o una porción de un anticuerpo de la invención enlazado a otro polipéptido. En otra modalidad, sólo los dominios variables del anticuerpo están unidos al polipéptido. En otra modalidad, el dominio VH de un anticuerpo está enlazado a un primer polipéptido, mientras que el dominio VL de un anticuerpo está enlazado a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido de un modo tal que los dominios VH y V pueden interactuar entre sí para formar un sitio de unión a antígeno. En otra modalidad preferida, el dominio VH se separa del dominio VL mediante un enlazador de tal forma que los dominios VH y VL pueden interactuar entre sí. El anticuerpo VH-enlazador-Vi. se enlaza después al polipéptido de interés. Además, se pueden crear anticuerpos de fusión en los que dos (o más) anticuerpos de cadena individual están enlazados entre sí. Esto es útil si se quiere crear un anticuerpo divalente o polivalente en una única cadena polipeptídica, o si se quiere crear un anticuerpo biespecífico.

En otras modalidades, se pueden preparar otros anticuerpos modificados usando anticuerpo dependiente de pH que codifica moléculas de ácido nucleico. Por ejemplo, se pueden preparar "cuerpos Kappa" (III y col., 1997, Protein Eng. 10:949-57), " inicuerpos" (Martin y cois., 1994, EMBO J. 13:5303-9), "Diacuerpos" (Holliger y cois., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448), o "Janusins" (Traunecker y cois., 1991 , EMBO J. 10:3655-3659 y Traunecker y cois., 1992, Int. J. Cáncer (Supl.) 7:51-52) usando técnicas de biología molecular estándar siguiendo las enseñanzas de la memoria descriptiva.

Se pueden producir anticuerpos biespecíficos o fragmentos de unión a antígeno mediante una variedad de procedimientos incluyendo la fusión de hibridomas o el enlace de fragmentos Fab. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 , Kostelny y col., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Además, se pueden formar anticuerpos biespecíficos como "diacuerpos" o "Janusins." En algunas modalidades, el anticuerpo biespecifico se une a dos epítopos diferentes de antígeno. En algunas modalidades, los anticuerpos modificados descritos anteriormente se preparan usando uno o más de los dominios variables o regiones CDR de un anticuerpo humano proporcionado en el presente documento.

Generación de anticuerpos específicos de antígeno Se depositó el ADN de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos representativos de la presente invención, 5L1721 H23_6L3 y 5L1721 H23_6L3H3, en la American Type Culture Collection (ATCC) (bajo los términos de tratado de Budapest) el 22 de diciembre del 2009, y se les asignaron los números de acceso del cuadro 2.Todas las restricciones de la disponibilidad para el público de los plásmidos así depositados se eliminarán irrevocablemente después de la emisión de una patente a partir de la memoria descriptiva de la presente invención. Las referencias de los anticuerpos para las cadenas pesada y ligera de 5L1721 H23 _ 6L3 son UC-H5H23 y UC-H5L1721-6L3, respectivamente. Las referencias de los anticuerpos para las cadenas pesada y ligera de 5L1721 H23 _ 6L3H3 son UC-H5H23-6H3 y UC-H5L 721-6L3, respectivamente.

CUADRO 2 Referencia de los anticuerpos N° de acceso de ATCC UC-H5H23 PTA-10547 UC-H5H23-6H3 PTA-10548 UC-H5L1721-6L3 PTA-10549 EJEMPLOS EJEMPLO 1 Modelado de la unión dependiente de pH del anticuerpo al antí eno de PCSK9 Se usó un modelado por ordenador para predecir si un anticuerpo con unión a antigenos dependiente de pH podría repercutir en la semivida del anticuerpo la duración de la disminución de la concentración sérica de PCSK9. Para el propósito de este modelado se hicieron las siguientes asunciones: Una dosis de 1 uM de anticuerpo en sangre; semivida de anticuerpo (no dependiente de pH) de 21 días; una duración de funcionamiento de la simulación de 100 días; para el anticuerpos dependiente de pH, una KA = 1e5/M/s, una KD a pH neutro = KD* KA , la unión dependiente de pH se modela como un incremento en KD en los endosomas ácidos; y KD a pH ácido = R * KD a pH neutro.

Las tasas de tiempo de cambio de la especie en el modelo se especifican en términos de parámetros de modelo mediante las ecuaciones diferenciales a continuación. En general, se deja que el modelo avance con niveles de anticuerpo ajustados a cero hasta que alcanza un estado estacionario; a ese tiempo, se estimula un bolo de anticuerpo reestableciendo [mAb] desde cero hasta un nivel reflector de la dosis, y después permitiendo que el modelo descrito más adelante avance.

M " * P. creado " capacitación activa M ~ praleína.on I J + kP,offlp- WW " k proteína I L»L ' '-DLRÍPJ *k,,OFFILDL-P-LDLR)-2konmulrolmAb\p] + k ¡mAh-P] 'M off, neutro -k fPI-k A¡P] I endocaptaaón endocaptaaón temprano PJ+ 2k ¡mAh-P PJ- ' - c on, neutro off, neutro V V'A - k ¡..creado ~ k trasparente [LDLY k proteína, onl RIL ] * k, off / LDL¦ LDLKJ - k proteínas I P IALD + « gjj I LDL¦ P ['? = k ¡..creado " k trasnparente k prol na on/ LDlAwLJ + k , ojf f LDLKJ - prm naml LDlAp ] + k \P- LDLR J + k / LD ¦ LDI.R Jin P, off reciclado -k lmAb]-k A/mAbJ I endocaptaaón endocaptaaón temprano P¡ + k / Ab PJ - '- '- on, neutro off, neutro V k , -i k (l-A)F/mAb l' PJ endocaptaaon(l-A)l-lmAb],empram¡ endocaptaaón activo + + V v /mAb-PJ,= 2k / mAhlp ] - k /mAb PJ-k /mAb-PJ + 2k / Ab¦ P¦ P } on, neutro off, eutro on, eutro off, neutro k /mAb-P/-k A\ mAb¦ P J k ( 1 - A)F mAb¦ P / endocaptaaón endocaptaaón temprano endocaptaaón tardío - + y v -k JmAb PJ endocaptaaón lmAb P Py= k ImAb- P\P] -2k / mAb¦ P¦ PJ/ mAb¦ P¦ P ] on, neutro off. neutro k ¡mAb-P PI-k A/mAb P PJ k ( 1 - A)fl mAb¦ P¦ P / endocaptaaón endocaptaaón temprano endocaptaaón tardío y V - 2k I mAb P) caplaciónacliva l LDL¦ LDLR ]' - k RIL / - k /LDL I.DLKJ-k / LDL¦ LDLltlp / proteína, on i-, off proteína, on + * / LDL¦ P¦ LDLR J - k / LDL¦ P. off int ernalizacíón [P · LDLR]' = k [LDLRIP] -k [P- LDLR] -k [P¦ LDLRILDL] proteína, on P, ojf proleinu, on + k [LDL¦ P¦ LDLR] - k [P¦ LDLR] ?, off int ernalizacinn [LDL P¦ LDLR]' = k [LDL¦ WLRI ] - k [LDL · P¦ IDLR] k [P LDLRILDL] proteína, on P, ojf protem' a, n - k [LDL¦ P LDLR] - k [LDL P LDLR] L , ojf i ni ernalización [P¦ LDLR]irí= k [P LDLR] -k [P · LDLR] int ernalización reciclado in [LDL¦ LDLR] ' = k [LDL LDLR] - k [LDL · LDLR] in int ernalización reciclado in [LDL¦ P¦ LDLR] '= k [LDL¦ P¦ IJDLR] - k [ DL¦ P¦ LDLR] in int ernalización reciclado in k [mAb]-k A[mAb] endocaptación endocaptación temprano [mAb] · = -2k [mAb] [P] temprano y on, neutro temprano temprano temprano k t (\- A)\mAb] endocaptación temprano + k [mAh-P] off, neutro temprano V temprano , _ ~kendocaptac ió \m^ P]~ ^endocaptac ión A\mj4b ^temprano [mAb i )¡eniprano - ~ + ¿/con , neutro \wAb itemprano I' ¡temprano ^temprano ~ * jf , neutro [MAO · P]¡emprano ~ k n , neutro \mAb¦ P](emprano l^ emprano + ^ ^ff t neutro [>nAb¦ P '· P]temprano endocaptación temprano r n í ' P ] A ' mAb '¦ F [mAb-P- P]llmpr!m< = P- F- p— + kmmumt[ mAb¦ P]tlmprlm PJ„mpram, endocaptación (l-A)[mAb.p.P]lemprano ¦2knjr^, mAb-P-P], V t.emprano kendocapalu ión^- A)\mAb ,,mprunu , ,. ,,·, [mAb]iartj¡0 2*<on,addiAmAh)lart/io[l]larclio + koff ,ácido\mAb¦ P ardio v tardío "endocaptación (\-A)(\-F)[mAb}larJ¡l> V tardío . ^en captación^ ~ ^)[P]tempra o [^¡tardío ~ ^kon,ácido\mA"]iardioV ]tardio + kojf ácido\mA" " "uardio ~ k(mácido[ Ai) 1 P]tardioV})tardio * tardío JJ k encíocapi ación ^ ~ mAh¦ PJfemprano ^ I mAb¦ l'],ard¡0'= ¡7 + KonáciJo lmAb]lard¡0l PJlardh - off , ácido I mAb¦ P 1 ,arJ¡„ tardío k k 2k endocaptación (\- A)l-\ Ab¦ P] ,· - off, ácido [mAb¦ P]lardio[P]lorJh + off, ácido [mAb-P- P),ard¡(> 2?£ ^tardío k endocaplaáón (1 - ?)(1 - F)[mAb P]lar !o k endocaplaáón li . . Jlard¡0'= - + K onecido I mAh¦ '? lord ''I , ardi " off .ácido I tardío k K endocaplación - A)F[mAb¦ P¦ P]lardh endocapiación <' " AW ~ Hím b · P - P]lordh [mAb]oc va - - on,ácido[mAb]acl¡vs [P]aciiva + off ,ácido\mAb¦ P]activa ~ endocapiación (1 - A){\ - F)\mAb}aci¡va ak endocaptación (1- A)F\mAb]acl¡va 2K k k Inactiva = - °",ácid°\mAb}activa{P}activa + "ff , ácido (mAb¦ P) actjva - on,ácido [mAb¦ P}activa\P} activa 1k ak + off, ácido [mAb¦ P¦ P]ocljva - endocaptación (1 - A)[P]acliva k v 2k k [mAb P]acliva'= endocaptación [mAb¦ P) + on,ácido [mAb)acl¡va[P)acliva - off , ácido [mAb¦ P acl¡va ^activa -kon,ácido ¡mAb¦ P]acllva [ P ] acúva + * off, ácido I mAb¦ P¦ P)acllva-ak endocaptación < ' " AJI mAb¦ PJocliva 21c v k 2k lmAb P P]aajva'= endocaptación I mAb¦ P¦ P ) + „„, ácido / Ah¦ P ] aajvol P ] acl¡m - off .ácido / mAb¦ P¦ P Jacljm ^activa ak - endocaptación <' " A)[mAb¦ P¦ P]acliva Los parámetros usados en el modelo se describen a continuación en el cuadro 3. En algunos casos, los parámetros se derivan de otras cantidades medidas o fisiológicamente relevantes; éstas también se indican en el cuadro.

CUADRO 3 (N) = mAb no dependiente de pH; (AS) = mAb dependiente de Ph Una representación del modelado se muestra en la figura 1 . El incremento de la razón de KD de pH endosómico (es decir, pH 5.5 o 6.0)/pH fisiológico 7.4 desde 1 hasta 2 dio como resultado un incremento en la concentración de anticuerpo a lo largo del tiempo, que se correlacionó con el valor de la razón de KD. Cuando se cambió la razón de KD, o kD o kA, se cambió la concentración de ligando libre de antígeno (figura 2) así como la concentración de anticuerpo (figuras 3A-3B) en correlación con el incremento de la razón de KD (figura 2), el incremento de kp (figura 3A) y la disminución de kA (figura 3B). Estos resultados no eran dependientes después de la designación de si el pH endosómico era de 5.5 o de 6.0.

Se construyó una presentación de mapa de calor (figuras 4A-4B) para un modelo general de anticuerpos con unión dependiente de pH, mostrando de forma efectiva cuántos días más el anticuerpo con unión dependiente de pH debería disminuir la concentración sérica de antígeno sobre lo observado para un anticuerpo no dependiente de pH. Los días de inactivación se definen por la integral de: 1-(Csuero(t))/(Csuero (t = 0)) desde el día O hasta el día 100, por ejemplo, una reducción del 100% en la concentración sérica durante N días seguido por una vuelta al nivel de pretratamiento correspondería a N días de inactivación. Los mapas de calor muestran el incremento en días de inactivación para los anticuerpos dependientes de pH, en comparación con los anticuerpos de control, en base a la razón de KD a pH neutro y también a la KD(R). Se ven los efectos a lo largo de todos los valores de KD modelados, particularmente entre 0.01 y 100 nM, y más particularmente entre KD de 0.1 y 10 nM. Los cambios en ciertos parámetros, por ejemplo, tamaño de dosis, cinéticas de anticuerpo, duración de simulación u otras cantidades conducirá a algunas diferencias en los valores mostrados en los mapas de calor.

Las predicciones del modelado para el funcionamiento de anticuerpos de PCSK9, con o sin unión dependiente de pH, correlacionaron bien con los resultados experimentales reales. En la figura 5A, se muestra la concentración de anticuerpo total sobre el tiempo después de administrar el anticuerpo 5A10, que no tiene unión dependiente de pH y una razón de KD de 1.1. Los niveles de LDL equivalente se muestran en la figura 5B. En la figura 6A, se muestra la concentración de anticuerpo total durante el tiempo después de administrar el anticuerpo 5L1721 H23 _ 6L3H3, que tiene unión dependiente de pH y una razón de KD de 14.4. Los niveles de LDL equivalente también se muestran en la figura 6B. Para estos modelos y experimentos en las figuras 5A-5B y 6A-6B, se asume un pH de 5.5 y los valores experimentales de KD para los anticuerpos se calcularon a pH 5.5. El anticuerpo de unión dependiente de pH demostró concentración de anticuerpo total prolongada y una inhibición prolongada de niveles de LDL en comparación con 5A10. Una descripción adicional del modelo general para los anticuerpos con unión dependiente de pH se muestra en el ejemplo 4.

EJEMPLO 2 Generación y rastreo de anticuerpos anti-PCSK9 con unión de PCSK9 dependiente de pH Se llevó a cabo mutagénesis mediante histidina para todas las CDR del anticuerpo monoclonal h5A10 (también conocido como marco 5A10 hu). Este anticuerpo proviene de anticuerpo monoclonal de ratón 5A10 (también conocido como 5A10.B8), pero tiene regiones estructurales humanas. La secuencia del anticuerpo h5A10 usado como plantilla de partida se muestra a continuación (CDR están en fuente negrita): Cadena Ligera Variable: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGK APKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQRYSTP RTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 1 ) Cadena Pesada Variable: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAP GQGLEWMGEINPSGGRTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVY ELSSLRSEDTA VYYCARERPLYAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 2) Se clonó el anticuerpo h5A10 en un vector de expresión bacteriano, que permite la expresión de Fab en el periplasma de E. coli. Usando cebadores, se mutó cada posición de CDR a histidina, dando como resultado 58 mutantes de histidina individuales del anticuerpo 5A10.

Se expresaron los anticuerpos con estos mutantes de histidina individuales en el periplasma de E. coli después de la inducción con IPTG y se purificó usando una marca de histidina en el extremo C-terminal del CH1. Se midieron las afinidades de Fab purificado a pH 5.5 y 7.4 con Biacore. Se encontraron mutaciones influenciando la razón de K D de pH 5.5/pH 7.4 en cuatro CDR diferentes (L1 , L2, H2 y H3). El cambio dependiente de pH en la KD varió entre mínimamente disminuido y significativamente disminuido.

Las mutaciones de tres CDR (L1 , L2 y H2) incrementaron la razón K D de pH 5.5/pH 7.4 sin destruir la afinidad a pH 7.4, y se generaron los anticuerpos combinando las CDR que contienen estas mutaciones. Para h5A10 y todos los mutantes, la secuencia de CDR1 (H1) de la cadena pesada es GYTFTSYYMH (SEQ ID N.°: 6). Para 5A10, los mutantes simples, dobles y triples, y 5L1721 H23 _ 6H3, la CDR3 (L3) de cadena ligera, es QQRYSTPRT (SEQ ID N.°: 27). Para los otros mutantes con afinidad madurada y mutantes basados en L1 L3, L3 es QQRYSLWRT (SEQ ID N.°: 12). Las secuencias de CDR de los anticuerpos que contienen estas diversas combinaciones de mutaciones se muestran en el cuadro 4 a continuación. Los identificadores de s números de secuencia se proporcionan entre paréntesis.

CUADRO 4 No se realizaron cambios en las secuencias estructurales para estos anticuerpos en comparación con 5A10.B8. Por ejemplo, las secuencias para las cadenas pesadas variables de 5L1721 H23 _ 6L3 y 5L1721 H23 _ 6L3H3 se proporcionan a continuación. Se usó la misma cadena ligera variable en cada uno de estos anticuerpos y también se proporcionan a continuación. Las CDR están destacadas en negrita.

Cadena ligera Variable de 5L1721 H23 6L3 y 5L1721 H23 6L3H3: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVHTAVAWYQQKPGK APKLLIYHASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQRYSLW RTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 3) Cadena pesada Variable 5L1721 H23 6L3: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAP GQGLEWMGEIHPSGGRTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVY ELSSLRSEDTA VYYCARERPLYAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 4) Cadena pesada Variable 5L1721 H23 6L3H3: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAP GQGLEWMGEIHPSGGRTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTA VYYCARERPLYASDLWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 5) Cadena ligera Variable (kappa) de 5L1721 H23 6L3 v 6L3H3 5L1721H23 gatatccagatgacacagtccccatcctccctgtctgcctctgtgggcgaccgcgtcacca tcacctgcaaggcctctcaggatgtgcatactgctgtagcctggtatcagcagaagccaggcaaagcccca aaactgctgatctaccatgcatcctaccgctacactggtgtcccatcacgcttcagtggcagtggctctggtac agatttcaccttcaccattagcagcctgcaaccagaagatattgccacttattactgccagcaacgttatagtct gtggcgcacgttcggtcaaggcaccaagctggagatcaaa (SEQ ID N.°: 23) Cadena pesada Variable de 5L1721 H23 6L3H3 caggtgcagctggtgcagtctggtgctgaggtgaagaagcctggcgcttccgtgaaggtt tcctgcaaagcatctggttacacctttaccagctactatatgcactgggtgcgccaagcccctggtcaaggcct ggagtggatgggcgagattcatcctagcggcggtcgtactaactacaatgagaagttcaagagccgcgtga ctatgactcgcgatacctccaccagcactgtctacatggaactgagctctctgcgctctgaggacactgctgtg tattactgtgcccgcgagcgccccctgtatgctagcgacctgtggggccagggtaccacggtcaccgtctcct ca (SEQ ID N.°: 24) Estos anticuerpos se expresaron y purificaron para la determinación de su KD a 7.4 y su razón KD de pH5.5/pH 7.4, tal como se midió sobre un biosensor de resonancia de plasmón superficial Biacore 3000 equipado con una chip sensor de calidad para investigación usando un tampón de desplazamiento HBS-EP (Biacore AB, Uppsala, Suecia - ahora GE Healthcare). Se acoplaron con amina IgG anti-Ms policlonales de conejo a niveles de saturación sobre el chip usando una química de N-hidroxisuccinimida/etildimetilaminopropilcarbodiimida (NHS/EDC) estándar. El tampón se forma atmosférica a HBS-EP+1 mg/ml de BSA+1 mg/ml CM-dextrano. Se diluyeron IgG de PCSK9 de longitud completa hasta aproximadamente 15 Mg/ml y se capturó durante 1 min a 5 µ l/min para dar niveles de aproximadamente 500RU por célula de flujo, dejando un blanco para servir como canal de referencia. Se inyectaron hPCSK9 3.73-302 nM o mPCSK9 2.54-206 nM como una serie de 3 veces de 5 miembros durante 1 min a 100 µ?/min. Se monitorizó la disociación durante 5 min. Se regeneró el chip después de la última inyección de cada valoración con dos pulsos de 30 segundos de ácido fosfórico 100 mM. Los ciclos de tampón proporcionan blancos para referenciar doblemente los datos, que se ajustaron después globalmente a un modelo de unión simple usando software de Biaevaluation v.4.1. Se dedujeron las afinidades a partir del cociente de las constantes de velocidad cinética (KD = kD/kA). Los resultados para la afinidad de PCSK9 humano se muestran en el cuadro 5, y los resultados para la afinidad de PCSK9 de ratón se muestran en el cuadro 6. Estos datos muestran que los anticuerpos se pueden diseñar y seleccionar para tener afinidad más alta por PCSK9 humano o de ratón a pH 7.4, y una afinidad inferior a pH 5.5.

CUADRO 5 Afinidades de unión para los anticuerpos anti-PCSK9 que se unen a PCSK9 humano a pH 7.4 y 5.5.

CUADRO 6 Afinidades de unión para los anticuerpos anti-PCSK9 que se unen a PCSK9 de ratón a pH 7.4 y 5.5.

Afinidad y parámetros cinéticos para los anticuerpos de PCSK9 h5A10 y 5L1721 H23 _ 6L3H3 así como el anticuerpo de PCSK9 H1 M300N (véase el documento US2010/0166768, por ejemplo, en el cuadro 7). Todos los experimentos se realizaron en un biosensor Biacore 2000.

Se preparó un chip sensor de Fe anti-humana activando todas las células de flujo de un chip sensor CM4 Biacore con una mezcla 1 :1 (v/v) de EDC 400 mM y NHS 100 mM durante 7 minutos, a un caudal de 10 µ/minuto. Un reactivo de Fe anti-humano (Fragmento F(AB')2 de cabra 2 a Fe de IgG Humano, N.° de catálogo de Cappel: 55053) se diluyó a 60 pg/ml en acetato de sodio 10 mM pH 5.0 y se inyectó en todas las células de flujo durante 7 minutos a 20 µ?/minuto. Se bloquearon todas las células de flujo con etilendiamina 100 mM en tampón borato150 mM, pH 8.5, durante 7 minutos a 10 pl/minuto.

Se hizo funcionar el ensayo cinético usando una metodología de valoración cinética tal como se describe en Karlsson y col., Anal. Biochem 349 , 136-147 (2006).

Se capturó el mismo anticuerpo (por ejemplo, 5L1721 H23 _ 6L3H3) sobre células de flujo aguas en dirección 3' (células de flujo 2, 3 y 4) a 2 pg/ml a un caudal de 10 µ?/min durante 30 segundos, 60 segundos y 120 segundos para las células de flujo 2, 3 y 4 respectivamente. Se usó la célula de flujo 1 como superficie de referencia. Después de la captura de anticuerpos, se inyectó PCSK9 a 30 µ?/min sobre todas las células de flujo en una serie de inyecciones de concentración baja a alta. La concentración superior era de PCSK9 200 nM y el factor de dilución era de 3 veces. Cada inyección de PCSK9 era de dos minutos, el tiempo de disociación después de la inyección de PCSK9 200 nM era de 20 minutos. Se realizó un grupo similar de inyecciones con tampón de desplazamiento en lugar de PCSK9 para propósitos de referenciación doble (referenciación doble tal como se describe en Myszka, J. Mol. Recognit 12 , 279-284, 1999). Después de cada ciclo de análisis se regeneraron todas las células de flujo con tres inyecciones de30 segundos de ácido fosfórico 75 mM. Se ajustaron globalmente los sensogramas a partir de las células de flujo 2 y 3 para un par PCSK9/anticuerpo dado a un Langmuir 1 :1 simple con un modelo de unión de transporte de masa.

Se realizaron los experimentos a pH 6.0 y 7.4 usando muestra y tampones de desplazamiento de fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, Tween-20 al 0.05%, pH 6 y fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, Tween-20 al 0.05%, pH 7.4, respectivamente.

CUADRO 7 Unión dependiente de pH EJEMPLO 3 Los anticuerpos de unión de PCSK9 dependiente de pH tienen un efecto farmacodinámico prolongado en la disminución del colesterol A. Los anticuerpos de antagonista de unión de PCSK9 dependiente de pH disminuyen el colesterol sérico durante una duración prolongada en ratones Para determinar si los anticuerpos de antagonista de unión de PCSK9 dependiente de pH pueden disminuir los niveles de colesterol in vivo durante una duración prolongada en comparación con anticuerpos no dependientes de pH, se sometieron a prueba los efectos del curso temporal de anticuerpos sensibles a ácidos 5L1721 H23_6H3 y 5L1721 H23_6L3H3 y anticuerpos no sensibles a ácidos h5A10 (sólo dosificados a 10 mg/kg) y 5A10.B8 sobre colesterol sérico cuando se inyectan a 1 , 3, o 10 mg/kg en ratones. Los cuatro anticuerpos tienen afinidades de unión similares de 5-14 nM a pH neutro (PH 7.4) a PCSK9 de ratón. Los anticuerpos 5L1721 H23 _6H3 y 5L1721 H23 _ 6L3H3 tienen afinidades reducidas de 117nM y 408nM, respectivamente, a pH 5.5, mientras que h5A10 y 5A10.B8 tienen una KD a pH 5.5 similar a la de 7.4 (5.2 nM). Se mantuvieron ratones C57/bl6, de 6 a 7 semanas de edad, en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, se extrajo sangre para recoger aproximadamente 70 µ? de suero en el dia 7. Se inyectaron por vía IV anticuerpos de PCSK9 de antagonista y un anticuerpo monoclonal de apareamiento de isotipo de control que no se une a ninguna proteína de mamífero conocida en ratones C57/bl6 macho de 7 semanas de edad y se recogieron muestras de suero en los días 5, 12, 19, 26, 61 , y 75 después la inyección. Se analizaron todas las muestras de suero para determinar el colesterol total, triglicéridos, colesterol HDL sobre el instrumento Ace Alera (Alfa Wassermann, West Caldwell, NJ) y se calcularon los niveles de colesterol de LDL usando la ecuación Friedewald. Las figuras 7A-7B muestran una disminución rápida y dependiente de dosis en los niveles de colesterol totales después de la inyección de un anticuerpo de antagonista de PCSK9. Los niveles de colesterol de LDL en ratones eran demasiado bajos para medirse y calculare de forma fiable. Con una dosis de 10 mg/kg, los cuatro anticuerpos redujeron el colesterol de HDL en un 35-40% en los días 5 y 12, mientras que los animales inyectados con 5L1721 H23_6H3 y 5L1721 H23 6L3H3 no se recuperaron hasta el día 61. Los animales inyectados con h5A10 y 5A10.B8 volvieron a niveles de línea base en los días 26 y 33, respectivamente.

B. Los anticuerpos de unión de PCSK9 dependiente de pH tienen una semivida prolongada en ratones Se determinaron con concentraciones de suero de anticuerpos en el mismo estudio descrito en el ejemplo b para determinar si los anticuerpos anti-PCSK9 sensibles al pH daban como resultado una semivida de anticuerpo prolongada. Los anticuerpos anti-PCSK9 normales tales como h5A10 y 5A10.B6 tienen una semivida más corta dependiente de dosis en comparación con los anticuerpos que se unen a otros antigenos solubles, debido a la degradación mediada por PCSK9 del complejo anticuerpo/antígeno. Tal como se muestra en la figura 8A, la propiedad de unión dependiente de pH redujo la degradación de anticuerpo y prolongó la semivida de los anticuerpo anti-PCSK9 5L1721 H23_6H3 y 5L1721 H23_6L3H3. Para demostrar adicionalmente que la prolongación de PK de 5L1721 H23_6H3 y 5L1721 H23_6L3H3 era resultado de la disminución de la eliminación mediada por PCSK9 de los anticuerpos, se llevó a cabo un estudio de curso temporal similar en ratones inactivados en PCSK9. Las diferencias en las concentraciones de anticuerpo de suero y las velocidades de reducción entre los anticuerpos sensible y no sensibles a pH eran insignificantes hasta que se inyectaron 3 mg/kg de PCSK9 humana en los ratones. Después de esta inyección, los anticuerpos de PCSK9 no sensibles a PH demostraron un incremento en la degradación en comparación con los anticuerpos sensibles a PH y el anticuerpo de control negativo (figura 8B). Estos resultados indican que la disminución observada en la degradación de anticuerpos de PCSK9 de unión de PCSK9 dependiente de pH resultan de la disociación del anticuerpo de PCSK9 y, por lo tanto, del rescate del anticuerpo de la degradación mediada por PCSK9.

C. Los anticuerpos de antagonista de PCSK9 sensible a pH disminuyen el colesterol sérico durante una duración prolongada en monos La figura 9B ilustra el efecto de los anticuerpos de antagonista de anti-PCSK9 sensible a PH, 5L1721 H23_6H3 y 5L1721 H23_6L3H3, y el anticuerpo anti-PCSK9 no sensible L1 L3 sobre los niveles de colesterol de LDL sérico de macacos de Java como porcentaje de control. Los anticuerpos (1.5 mg/kg de cada) se administraron el día 0 a macacos de Java hembras por medio de inyección en bolo i.v.. El colesterol de LDL se redujo hasta un 50% de la linea base por día en los tres grupos tratados con anticuerpo. Mientras que los niveles de colesterol de LDL volvían a la línea base en el día 10 después de la administración de anticuerpo no sensible a pH, el colesterol de LDL se mantenía suprimido hasta el día 21 en monos tratados con anticuerpos sensibles a pH. Los niveles HDL permanecían esencialmente sin cambios como resultado del tratamiento con anticuerpos (figura 9A). La figura 10 demuestra que la semivida de anticuerpos anti-PCSK9 sensibles a pH se prolongaba en comparación con L1 L3 no sensible a pH.

EJEMPLO 4 Modelado General para anticuerpos con unión a antígenos dependiente de pH Se usó un modelado de ordenador para predecir si un anticuerpo con unión dependiente de pH a su antígeno genérico podría repercutir en la semivida del anticuerpo y/o en la duración de la disminución de la cantidad de antígeno o la concentración sérica. Para los propósitos de este modelado, se hicieron las siguientes asunciones: 1 ) anticuerpo, dosis 1 uM de anticuerpo en sangre, semivida de anticuerpo de 21 días; 2) funcionamiento de simulación durante 100 días; unión a anticuerpo y unión dependiente de pH, KA = 1e5/M/s, KD a pH neutro = KD * KA; la unión dependiente de pH se modela como un incremento en KD en los endosomas ácidos, KD a pH ácido = R * KQ a pH neutro.

La figura 15 detalla el modelo de tráfico para anticuerpos con unión dependiente de pH usado para el modelado y las ecuaciones que definen el modelo son como sigue: d/dt(Dosis Normal) = - k dist*Dosis Normal d/dt(mAb) = k_dist*Dosis_Normal- (mAb*kon*Antígeno_normal)+ (kon*KD* mAb_antígeno) - k_sangre_endo*mAb/ VNorm + f1* k_sangre_endo*mAb_e/ VNorm + ( 1 -f 1 )* f2*k_sangre_endo*mAb_le/ VNorm d/dt(mAb_antígeno) = (mAb*kon*Antígeno_normal)- (kon*KD* mAb_antígeno) - k_sangre_endo*mAb_antígeno/ VNorrT1 + f1* k_sangre_endo*mAb_antígeno_e/ VNorm + ( 1 -f 1 ) * f2*k_sangre_endo*cmplx_le/ VNorm d/dt(Antígeno_normal) = - (mAb*kon*Antígeno_normal)+ (kon*KD* mAb antígeno) + ln(2)/Semivida_antígeno*nivel_antígeno ln(2)/Semivida_antígeno*Antígeno_normal - k_sangre_endo*Antígeno_normal/ orm + f1 * k_sangre_endo*Endosomas_antígeno_e/ VNorm d/dt (mAb_e) = k_sangre_endo*mAb / VEndo -f1 *k_sangre_endo*mAb_e / VEnd0 - (mAb_e*kon*Endosomas_antígeno_e)+ (kon*KD* mAb_antígeno_e) - (1-f1) *k_sangre_endo *mAb_e/ VEndo d/dt(mAb_antigeno_e) = k_sangre_endo*mAb_antigeno / VEndo -f1*k_sangre_endo*mAb_antigeno_e / VEndo + (mAb_e*kon*Endosomas_antigeno_e)- (kon*KD* mAb_antigeno_e) - (1-f1) *k_sangre_endo *mAb_antigeno_e/ VEndo d/dt(Endosomas_antigeno_e) = k_sangre_endo*Antigeno_normal/ VEndo f1*k_sangre_endo*Endosomas_antigeno_e / VEndo (mAb_e*kon*Endosomas_antigeno_e)+ (kon*KD* mAb_antigeno_e) - (1-f1) *k_sangre_endo *Endosomas_antigeno_e / VEndo d/dt(mAb_le) = -(1-f1)* f2*k_sangre_endo* mAbJe/ VLEndo + (1-f1) *k_sangre_endo *mAb_e/ VLEndo - (mAb_le*kon*Antigeno_le)+ (R*kon*KD* cplxje) - (1-f1)*(1-f2)*k_sangre_endo*mAb_le/ VLEndo d/dt(cplx_le) = -(1-f1)* f2*k_sangre_endo*cplx_le/ VLEndo + (1-f1) *k_sangre_endo *mAb_antígeno_e/ VLEndo + (mAb_le*kon*Antigeno_le)-(R*kon*KD* cplxje) -(1-f1)*(1-f2)*k_sangre_endo*cplx_le/ VLEndo d/dt(Antigeno_le) = + (1 -f 1 ) *k_sangre_endo *Endosomas_antígeno_e/ VLEndo - (mAb_le*kon*Antigeno_le)+ (R*kon*KD* cplxje) - (1-f1) *k_sangre_endo*Antigeno_le/ VLEndo Los parámetros usados en el modelo se describen a continuación en el cuadro 8.

CUADRO 8 Los mapas de calor mostrados en las figuras 4A-4B muestran cuánto más podría repercutir un anticuerpo con unión dependiente de pH en la inactivación de antígeno sobre la inactivación por un anticuerpo sin unión dependiente de pH. Esta cantidad de inactivación se determina midiendo el área entre las curvas de antígeno de los dos anticuerpos sobre la simulación de 100 días. Se puede considerar cuántos días más podría repercutir un anticuerpo con unión dependiente de pH en la inactivación de antígeno sobre la inactivación por un anticuerpo sin unión dependiente de pH, aunque estos dos sistemas de medida no tienen que correlacionarse exactamente. Las áreas más claras sobre el mapa reflejan una duración más larga y/o una inactivación más fuerte del antígeno libre. El mapa de calor para la figura 1 1 muestra cómo podrían repercutir los anticuerpos potenciales con unión a antígenos dependiente de pH sobre antígenos inactivados si el antígeno era DKK1 , IgE o C5. Para cada uno de estos antígenos, un anticuerpo con unión dependiente de pH podría prolongar la inactivación de antígeno.

La figura 12 muestra un modelado más detallado para un anticuerpo con unión a dependiente de pH a IgE. Se produce una duración prolongada de la inactivación de IgE del anticuerpo tiene una KD de aproximadamente 1 nM o mayor y una razón de KD a pH 6.0/pH 7.4 (R) de 3 o más.

Un análisis similar para el antígeno de DKK1 se muestra en la figura 13 y para C5 en la figura 14. Para DKK1 , un intervalo ideal de KD es de 1 .0-100 nM para el intervalo de la razón KD de 3-30. Para C5, el intervalo ideal de KD también es de 1 .0-100 nM para el intervalo de la razón KD de 3-30.

EJEMPLO 5 Generación y rastreo de anticuerpos anti-lgE con unión IgE dependiente de pH Se hicieron sustituciones de histidina en las posiciones de los residuos subrayados en el anticuerpo anti-lgE 5.948-H100Y, que tiene las siguientes secuencias de aminoácidos de cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) (las CDR están en fuente negrita).

VL DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRNGYNYLDWYLQ KPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCM QALQTPPATFGGGTKVEIK (SEQ ID N °: 25) VH QVQ LVQSGAEVKKPGASVKVSC KASG YTFTSYDI NWVRQATG QGLEWMGWMDPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTA \/YYCARGYYDSDGYYSFSGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID N.°: 26) Se sometieron a prueba los anticuerpos para determinar la unión a IgE a 25°C. Para la determinación de afinidades y de constantes cinéticas, se realizaron todos los experimentos en un biosensor Biacore T200.

Se preparó una superficie de captura de biotina mediante inmovilización de NeutrAvidin: se activaron todas las células de flujo de un chip sensor de CM4 Biacore con una mezcla 1 :1 (v/v) mezcla de EDC 400 mM y NHS 100 mM durante 7 minutos, a un caudal de 10 µ?/minuto. NeutrAvidin (Pierce, n.° de producto: 31000) se diluyó a 100 g/m en acetato de sodio 10 mM pH 4.5 y se inyectó sobre todas las células de flujo durante 7 minutos a 20 µ?/minuto. Se bloquearon todas las células de flujo con etilendiamina 100 mM en tampón borato 150 mM pH 8.5 durante 7 minutos a 10 µ?/minuto.

El constructo de IgE (IgE-Fc (Ch2-Ch3-Ch4) humana, expresado y purificado en el laboratorio) se biotiniló mínimamente incubando IgE con una cantidad equimolar de EZ-Link NHS-CL-CL-biotina (Thermo Scientific, n.° de catálogo 21343) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se retiró la biotina por medio de intercambio de tampón.

Todos los experimentos con Biacore se realizaron usando dos de las cuatro células de flujo (1y 2 o 3 y 4) del chip sensor en paralelo. Se usó la célula de flujo en dirección 3' como célula de flujo de análisis mientras que se usó la otra célula de flujo como superficie de referencia. Así, se capturó la IgE biotinilada (B-lgE) sobre la célula de flujo de análisis y se inyectó cada fragmento Fab purificado sobre ambas. El sensograma de la célula de flujo de referencia se restó del de la célula de flujo de análisis.

Se diluyó B-lgE en el tampón de desplazamiento hasta una concentración final de 5 pg/ml inmediatamente antes de la captura. A pH 6.0, se inyectó B-lgE a 10 ul/min durante 60 segundos. A pH 7.4, se inyectó B-lgE durante 80 segundos para obtener niveles de captura similares. Se hizo funcionar el ensayo cinético usando una metodología de valoración cinética tal como se describe en Karlsson y col., Anal Biochem 349 : 136-147, 2006.

Después de la captura de B-lgE, se inyectó un fragmento Fab purificado a 30 µ?/min en células de flujo de análisis y de referencia en una serie de inyecciones de concentración baja a alta. La concentración superior de Fab varió desde 30 nM hasta 200 nM y el factor de dilución era de 3 veces. Se inyectó cada dilución de Fab durante 2 minutos, seguido por un tiempo de disociación final de 30 minutos después de la última inyección. Se realizó un grupo de similar de inyecciones tampón de desplazamiento en lugar de Fab para propósitos referenciación doble (referenciación doble tal como se describe en Myszka, J Mol Recognit 12 : 279-284, 1999). Se ajustaron globalmente los sensogramas de referenciación doble a un Langmuir 1 :1 simple con un modelo de unión de transporte de masa.

Se realizaron los experimentos a pH 6.0 y 7.4 usando muestra y tampones de desplazamiento de fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, Tween-20 al 0.05%, 1 mg/ml de BSA, pH 6 y fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, Tween-20 al 0.05%, 1 mg/ml de BSA, pH 7.4, respectivamente.

Tal como se muestra en el cuadro 9 más adelante, la sustitución de histidina en el anticuerpo de IgE 5.948-H100Y dio como resultado exitosamente anticuerpos con una kD más rápida a pH 6.0 y razones de KD y kD más altas a pH 6.0/pH 7.4.

CUADRO 9 Efecto de la sustitución de histidina sobre la unión a antíqeno por anticuerpos de IgE Las revelaciones de todas las referencias citadas en el presente documento se incorporan mediante referencia en el presente documento.

Claims (31)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo con unión dependiente de pH que se une específicamente a un antígeno con una afinidad más alta a pH 7.4 que a pH 6.0, en el que la proporción de KD y/o la proporción de k0ff a pH 6.0/pH 7.4 y a 25°C es más de, o varía entre, 2, 3, 4, 8, 10, 16, o más, y en el que el anticuerpo tiene eliminación en plasma in vivo reducida cuando se expone a dicho antígeno comparado con un anticuerpo sin unión dependiente de pH que tiene una afinidad similar por el antígeno a pH 7.4, pero tiene una proporción de KD y/o de koff comparable a pH 6.0/pH 7.4 que es menos de 2.

2. - Un anticuerpo con unión dependiente de pH que une específicamente un antígeno con una afinidad más alta a pH 7.4 que a pH 6.0, en el que la proporción de KD y/o la proporción de kotf a pH 6.0/pH 7.4 y a 25°C es más de, o varía entre, 2, 3, 4, 8, 10, 16, o más, y en el que el antígeno está tanto unido a membrana como soluble in vivo y en el que el anticuerpo media localización incrementada a un receptor de membrana celular según se compara con un anticuerpo que tiene una afinidad similar por el antígeno a pH 7.4 pero que tiene una proporción comparable de KD y/o de k0ff a pH 6.0/pH 7.4 que es menos de 2.

3. - El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque el antígeno no es el receptor de interleucina-6.

4. - El anticuerpo de la reivindicación 2, caracterizado además porque el antigeno es un receptor soluble que es un señuelo no señalizador.

5. - El anticuerpo de la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho anticuerpo con unión dependiente de pH es un conjugado de fármaco de anticuerpo, media citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC).

6. - Un anticuerpo con unión dependiente de pH que se une específicamente a un antígeno con una afinidad más alta a pH 7.4 que a pH 6.0, en el que la proporción de KD y/o la proporción de koff a pH 6.0/pH 7.4 y a 25°C es más de, o varía entre, 2, 3, 4, 8, 10, 16, o más, y en el que el decrecimiento en la cantidad in vivo de antígeno no unido a anticuerpo se prolonga cuando se expone a dicho anticuerpo en comparación con un anticuerpo sin unión dependiente de pH que tiene una afinidad similar por el antígeno a pH 7.4, pero tiene una proporción comparable de KD y/o de k0ff a pH 6.0/pH 7.4 que es menos de 2.

7. - Un anticuerpo con unión dependiente de pH que se une específicamente a un antígeno con una afinidad más alta a pH 7.4 que a pH 6.0, en el que la proporción de KD y/o la proporción de k0ff a pH 6.0/pH 7.4 y a 25°C es más de, o varía entre, 2, 3, 4, 8, 10, 16, o más, y en el que hay un decrecimiento en la cantidad in vivo de antígeno unido a anticuerpo comparado con un anticuerpo sin unión dependiente de pH que tiene una afinidad similar por el antígeno a pH 7.4, pero tiene una proporción de KD y/o de k0ff comparable a pH 6.0/pH 7.4 que es menos de 2.

8. - Un anticuerpo agonista con unión dependiente de pH que se une específicamente a un antígeno con una afinidad más alta a pH 7.4 que a pH 6.0, en el que la proporción de KD y/o la proporción de k0ff a pH 6.0/pH 7.4 y a 25°C es más de, o varía entre, 2, 3, 4, 8, 10, 16, o más, y en el que el antígeno es un receptor y el receptor tiene eliminación reducida in vivo cuando se expone a dicho anticuerpo en comparación con un anticuerpo que tiene afinidad similar por el receptor a pH 7.4, pero tiene una proporción comparable de KD y/o de koff a pH 6.0/pH 7.4 que es menos de 2.

9. - El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la proporción de KD o la proporción de k0ff a pH 6.0/pH 7.4 es más de, o varía entre, 20, 30, 40 o 100 o más.

10. - El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado además porque la unión del anticuerpo al antígeno a pH 7.4 tiene una KD de aproximadamente 0.01 nM a aproximadamente 100 nM.

11.- El anticuerpo de la reivindicación 10, caracterizado además porque la unión del anticuerpo al antígeno a pH 7.4 tiene una KD de aproximadamente 0.1 nM a aproximadamente 10 nM.

12. - El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-1 1 , caracterizado además porque la unión del anticuerpo al antígeno a pH 7.4 tiene una koff de aproximadamente 1 x 10E-4 s-1 a aproximadamente 1 x 10E-1 s-1.

13. - El anticuerpo de la reivindicación 12, caracterizado además porque la unión del anticuerpo al antígeno a pH 7.4 tiene una k0ff de aproximadamente 1 x 10E-3 s-1 a aproximadamente 1 x 10E-1 s-1.

14. - El anticuerpo de la reivindicación 1 , caracterizado además porque el antígeno es PCSK9.

15. - El anticuerpo de la reivindicación 6, caracterizado además porque el antigeno es IgE, C5, o DKK1 y la KD varía entre 1.0 n a aproximadamente 10 nM o entre 1.0 nM a aproximadamente 100 nM.

16. - El uso del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en la elaboración de un medicamento para reducir el nivel de LDL-colesterol en la sangre de un sujeto que lo necesite, en donde el medicamento está adpatado para prolongar la dosificación en intervalo y/o disminuir la dosis terapéutica, y en donde dicho anticuerpo tiene un efecto farmacodinámico prolongado y/o una semivida prolongada comparado con un anticuerpo que tiene afinidad similar a pH 7.4, pero que tiene una proporción de KD y/o una proporción de koff a pH 6.0/7.4 y a 25°C que es menos de 2.

17.- Un procedimiento de fabricar un anticuerpo con semivida prolongada y/o efecto farmacodinámico prolongado por regulación de afinidad de unión de anticuerpos en una manera dependiente de pH, comprendiendo dicho procedimiento seleccionar residuos de histidina de CDR de anticuerpos u otros residuos que optimizan el microambiente que afecta a pKa, de tal forma que la unión de antígeno a anticuerpo tiene una proporción de KD y/o una proporción de koff a pH 6.0/pH 7.4 que es más de, o varía entre, 2, 3, 4, 8, 10, 16, o más.

18.- Una biblioteca de anticuerpos enriquecida por histidinas en residuos de CDR u otros residuos que optimizan el microambiente que afecta a pKa.

19. - El procedimiento de la reivindicación 17, caracterizado además porque comprende adicionalmente mutagenizar el anticuerpo para lograr afinidad a anticuerpo con una KD a pH 7.4 de al menos 100 nM.

20. - Un anticuerpo aislado que se une específicamente a PCSK9 y comprende una región variable de cadena pesada (VH) una región determinante de la complementariedad (CDR1 ), una CDR2 de VH y una CDR3 de VH de la secuencia de aminoácidos de VH mostrada en SEQ ID N.°: 4 o 5 o una variante de las mismas que tiene una, dos, tres o más sustituciones conservadoras de aminoácidos en CDR1 , CDR2, y/o CDR3.

21. - El anticuerpo aislado de la reivindicación 20, caracterizado además porque comprende adicionalmente CDR1 , CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera (VL) de la secuencia de aminoácidos de VL mostrada en la SEQ ID N.°: 3 o una variante de la misma que tiene una, dos, tres o más sustituciones de aminoácidos conservadoras en CDR1 , CDR2, y/o CDR3.

22. - El anticuerpo aislado de la reivindicación 21 , caracterizado además porque la CDR1 de VH tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID N.°: 6, la CDR2 de VH tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID N.°: 7, la CDR3 de VH tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID N.°: 8 o 9, la CDR1 de VL tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID N.°: 10, la CDR2 de VL tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N.°: 11 , y la CDR3 de VL tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N.°: 12 o una variante del mismo que tiene una, dos, tres o más sustituciones de aminoácidos conservadoras en CDR1 , CDR2, y/o CDR3.

23 - El anticuerpo aislado de la reivindicación 22, caracterizado además porque el CDR3 de VH tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 9 o una variante de la misma que tiene una, dos, tres o más sustituciones conservadoras de aminoácidos en CDR1 , CDR2, y/o CDR3.

24. - El anticuerpo aislado de la reivindicación 23, caracterizado además porque el la región de VH comprende SEQ ID N.°: 4 o SEQ ID N°: 5 y la región VL comprende SEQ ID N.°: 3.

25. - El anticuerpo aislado de la reivindicación 24, caracterizado además porque la región VH comprende SEQ ID N.°: 5.

26. - Un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo, codificada por el plásmido depositado en la ATCC y que tiene N.° de Acceso de ATCC PTA-10547, o PTA-10548, y/o PTA-10549.

27. - Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-26.

28.- Una célula hospedante que produce recombinantemente el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 -26.

29.- Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-26.

30.- Un plásmido aislado según se deposita en la ATCC y que tiene N 0 de Acceso de ATCC PTA-10547, o PTA-10548, y/o PTA-10549.

31 - El uso del anticuerpo de las reivindicaciones 1-26, en la elaboración de un medicamento para reducir el nivel de LDL-colesterol en la sangre de un sujeto en necesidad del mismo.