CN101636179B - Pcsk9拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

公开了人蛋白原转化酶枯草溶菌素-可新9型(PCSK9)的拮抗剂。公开的拮抗剂有效抑制PCSK9功能，因此提供了用于治疗与PCSK9活性相关的病症的合意拮抗剂。本发明还公开了编码所述拮抗剂的核酸、载体、宿主细胞和含有这些拮抗剂的组合物。还公开了制备PCSK9特异性拮抗剂的方法和使用这些拮抗剂抑制或拮抗PCSK9功能的方法，这些方法构成了本公开内容的另外的重要方面。

Description

PCSK9拮抗剂
与相关申请的交叉引用
本申请要求2006年11月7日提交的美国临时申请60/857,293和60/857,248的权益。
有关联邦资助的研发的声明
不适用。
对缩微胶片附录的参考
不适用。
发明背景
蛋白原转化酶枯草溶菌素-可新9型(proprotein convertase subtilisin-kexin type 9)(下文称为“PCSK9”)，又名神经凋亡调节转化酶1(“NARC-1”)，是一种蛋白酶K样枯草杆菌酶，经鉴定为分泌型枯草杆菌酶家族的第9个成员；参见Seidah等，2003 PNAS 100：928-933。编码PCSK9的基因定位在人染色体1p33-p34.3；Seidah等，见上文。PCSK9在能够增殖和分化的细胞中表达，包括例如肝细胞、肾间质细胞、回肠(intestinal ileum)和结肠上皮以及胚胎端脑神经元；Seidah等，见上文。
PCSK9的最初合成是约72kDa的无活性酶前体或酶原的形式，经过内质网(“ER”)中的自催化性分子内加工来激活其功能性。已报道，这种内部加工事件发生在产生头三个N末端残基Ser-Ile-Pro的SSVFAQ↓SIPWNL158基序(Benjannet等，2004 J.Biol.Chem.279：48865-48875)，并且该事件是离开ER所必需的；Benjannet等，见上文；Seidah等，见上文。然后断开的蛋白被分泌。断开的肽保持与活化并分泌的酶相关；见上文。
人PCSK9的基因序列约22kb长，有12个外显子，编码692个氨基酸的蛋白，例如可见保藏号NP_777596.2。已保藏人、小鼠和大鼠PCSK9核酸序列；分别参见例如GenBank登录号：AX127530(及AX207686)、AX207688和AX207690。
几个专利出版物中公开并/或要求保护PCSK9，这些出版物包括但不限于：PCT出版物WO 01/31007、WO 01/57081、WO 02/14358、WO 01/98468、WO 02/102993、WO 02/102994、WO 02/46383、WO 02/90526、WO 01/77137以及WO 01/34768；美国出版物US 2004/0009553和US 2003/0119038；欧洲出版物EP 1440981、EP 1067182和EP 1471152。
PCSK9在肝细胞和神经元细胞的分化中发挥作用(Seidah等，见上文)，在胚胎肝脏中高表达，并且与胆固醇体内平衡强烈相关。最近的研究似乎暗示了其在胆固醇生物合成或摄取中的特定作用。在饲喂胆固醇的大鼠的研究中，Maxwell等发现，PCSK9以类似于牵涉胆固醇生物合成的三个其他基因的方式被下调，Maxwell等，2003 J.Lipid Res.44：2109-2119。有趣的是，和牵涉胆固醇代谢的其它基因一样，PCSK9的表达也受甾醇调控元件-结合蛋白(“SREBP”)的调控；见上文。后来，这些发现得到PCSK9转录调控研究的支持，该研究证明此类调控在参与脂蛋白代谢的其它基因中非常典型。Dubuc等，2004Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.24：1454-1459。PCSK9的表达被他汀类(statins)上调，这是由于这些药物的降胆固醇效应；见上文。此外，PCSK9启动子有两个涉及胆固醇调控的保守性位点、甾醇调控元件和Sp1位点；见上文。PCSK9的腺病毒表达已显示可导致循环LDL显著的时间依赖性增加(Benjannet等，2004 J.Biol.Chem.279：48865-48875)。此外，删除PCSK9基因的小鼠肝LDL受体水平增加，LDL从血浆中清除更快；Rashid等，2005 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：5374-5379。最近据报道，将用PCSK9瞬时转染的HepG2细胞的培养基转移到未转染的HepG2细胞时，减少细胞表面LDLR的数量和LDL的内化；参见Cameron等，2006Human Mol.Genet.15：1551-1558。结论是PCSK9或者经PCSK9作用的因子被分泌并能够降解转染的和未转染的细胞中的LDLR。更近来，据证实，加到HepG2细胞培养基中的纯化PCSK9具有以剂量和时间依赖性方式减少细胞表面LDLR数目的作用。Lagace等，2006 J.Clin.Invest.116：2995-3005。
PCSK9基因中的很多突变已确定与以下病症相关：常染色体显性高胆固醇血症(“ADH”)、以血浆中低密度脂蛋白(“LDL”)颗粒显著升高为特征的遗传性代谢紊乱(可导致早发性心血管衰竭)；参见Abifadel等，2003 Nature Genetics 34：154-156；Timms等，2004 Hum.Genet.114：349-353；Leren，2004 Clin.Genet.65：419-422。后来Abifadel等(见上文)发表的对S127R突变的研究报道，携带这种突变的患者血浆中总胆固醇和apoB100较高，原因是(1)含有apoB100的脂蛋白例如低密度脂蛋白(“LDL”)、极低密度脂蛋白(“VLDL”)和中密度脂蛋白(“IDL”)的过量产生，和(2)所述脂蛋白清除或转化的相关减少；Ouguerram等，2004Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.24：1448-1453。
综合起来，上述研究证实了PCSK9在调控LDL产生中起作用的事实。PCSK9的表达或上调与增加的LDL胆固醇的血浆水平有关，PCSK9表达的抑制或缺乏与LDL胆固醇血浆水平低有关。值得注目的是，与PCSK9序列变化相关的较低水平的LDL胆固醇可提供针对冠心病的保护；Cohen，2006 N.Engl.J.Med.354：1264-1272。
非常希望鉴定到有效治疗心血管疾病的化合物和/或试剂。临床试验已证明LDL胆固醇含量减少与冠状动脉(coronary)事件率直接相关；Law等，2003 BMJ 326：1423-1427。此外，最近已证明，血浆LDL胆固醇含量终生中度减少与冠状动脉事件的发生率大幅减少显著相关；Cohen等，见上文。甚至在非脂质相关心血管风险因子高度盛行(prevalence)的群体中也是如此；见上文。因此，对LDL胆固醇含量进行管理控制大有裨益。
因此，制备抑制或拮抗PCSK9活性和PCSK9在各种治疗状况下所发挥的相应作用的、基于治疗的PCSK9拮抗剂非常重要。
发明概述
本发明涉及PCSK9拮抗剂，特别是人PCSK9拮抗剂。PCSK9的蛋白特异性拮抗剂(或本文称为“PCSK9特异性拮抗剂″)是有效抑制PCSK9功能的PCSK9蛋白特异性结合分子或蛋白，它们在治疗与PCSK9功能相关或受PCSK9功能影响的病症中非常重要，所述病症包括但不限于高胆固醇血症、冠心病、代谢综合征、急性冠状动脉综合征和相关病症。PCSK9特异性拮抗剂的特征在于，对PCSK9的选择性识别和结合。PCSK9特异性拮抗剂不显示对除PCSK9之外的物质的显著结合，除了在那些特殊情况下：使拮抗剂补充带有另外的、与PCSK9特异性结合部分不同的特异性。在具体实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为1.2X10-6或更少。在具体实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为1X10-7或更少。在另外的实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为1X10-8或更少。在其它实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为5X10-9或更少，或1X10-9或更少。其他实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为1X10-10或更少，1X10-11或更少，或1X10-12或更少。在具体实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂不以上述水平结合其它蛋白。
PCSK9特异性拮抗剂有效抵抗对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制。已屡次证明，PCSK9特异性拮抗剂对PCSK9对LDL摄取的影响呈剂量依赖性抑制。因此，PCSK9特异性拮抗剂对降低血浆LDL胆固醇水平非常重要。所述拮抗剂还可在检测和定量PCSK9中用于各种诊断目的。
在具体实施方式中，本发明包括PCSK9特异性拮抗剂，以及，在具体实施方式中，本发明包括抗体分子，所述抗体分子包含公开的重链和/或轻链可变区、具有一个或多个保守性氨基酸取代的等同物和它们的同源物(homologs)。具体实施方式包括分离的PCSK9特异性拮抗剂，所述拮抗剂含有公开的CDR结构域或重链和/或轻链CDR结构域的组(sets)以及它们的以具有一个或多个保守性氨基酸取代为特征的等同物。本领域技术人员将理解，可将保留了拮抗PCSK9能力的PCSK9特异性拮抗剂片段插入各种构架(frameworks)中，参见例如美国专利6,818,418以及其中的参考文献，它们讨论了可用于展示抗体环的各种支架(scaffolds)，所述抗体环之前基于抗原结合来选择。另选方案中，可使用重组方法掺入编码VL和VH的基因，例如使用可使VL和VH成为单一蛋白链(或者称为单链Fvs(“ScFVs”))的合成接头，在该单一蛋白链中VL和VH区域配对形成单价分子；参见例如，Bird等，1988 Science 242：423-426，以及Huston等，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883。
PCSK9特异性拮抗剂和片段可以是各种非基于抗体的支架的形式，包括但不限于高亲和性多聚体(avimers)(Avidia)；DARPins(MolecularPartners)；Adnectins(Adnexus)，Anticalins(Pieris)和Affibodies(Affibody)。科学文献中对用于蛋白结合的可选支架的使用进行了很多评价，参见例如Binz & Plückthun，2005 Curr.Opin.Biotech.16：1-11。因此，具有PCSK9选择性的、可抵抗对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制、非基于抗体的支架或拮抗剂分子构成了本发明的重要实施方式。
另一方面，本发明提供编码公开的PCSK9特异性拮抗剂的核酸。在具体方面，本发明提供编码PCSK9特异性拮抗剂的核酸，在具体实施方式中提供了编码本文公开的抗体分子的核酸，所述抗体分子包含本文公开的重链可变区和轻链可变区以及它们的选择组分，尤其是公开的各自的CDR3区域。另一方面，本发明提供包含所述核酸的载体。另一方面，本发明提供包含编码公开的PCSK9特异性拮抗剂(在特定实施方式中是所述公开的抗体分子和它们的组分)的核酸的分离的细胞。另一方面，本发明提供包含本发明多肽或载体的分离的细胞。
另一方面，本发明提供制备选择性结合PCSK9的PCSK9特异性拮抗剂的方法，所述PCSK9特异性拮抗剂包括抗体、抗原结合片段、衍生物、嵌合分子、上述任何物质与另一种多肽的融合物、或能够特异性结合PCSK9的可选结构/组成(compositions)。该方法包括在允许PCSK9特异性拮抗剂表达和/或装配(assembly)的条件下培养细胞并从细胞中分离所述拮抗剂，所述细胞包含编码PCSK9特异性拮抗剂的核酸，或包含编码它们的一个或多个组分的独立的核酸，其中当所述核酸表达时，合起来(collectively)产生所述拮抗剂。本领域技术人员还可用标准的重组DNA技术获得本文公开的PCSK9特异性拮抗剂。
另一方面，本发明提供拮抗PCSK9活性或功能、或PCSK9的已注意到的作用(noted effect)的方法，该方法包括使表达PCSK9(或用PCSK9处理)的感兴趣的细胞、细胞群体或组织样品与本文公开的PCSK9特异性拮抗剂在允许所述拮抗剂结合PCSK9的条件下接触。本发明的具体实施方式包括这样的方法：其中所述细胞是人细胞。根据本发明的拮抗剂有效抑制PCSK9功能。发现本文公开的PCSK9特异性拮抗剂剂量依赖性抑制PCSK9对LDL摄取的影响。
另一方面，本发明提供在对象中拮抗PCSK9活性的方法，所述对象表现与PCSK9活性相关的病症或其中对特定对象而言PCSK9起作用(functioning)是禁忌(contraindicated)的病症，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的本发明PCSK9特异性拮抗剂。在选择实施方式中，所述病症可以是高胆固醇血症、冠心病、代谢综合征、急性冠状动脉综合征或相关病症。另一方面，本发明提供药物组合物或其它组合物，其包含本发明PCSK9特异性拮抗剂和药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、稳定剂、缓冲剂或设计用来便于将所需量的拮抗剂给予治疗个体的另选物质(alternative)。
本发明还涉及在细胞样品中鉴定PCSK9拮抗剂的方法，其包括向细胞样品提供纯化的PCSK9和标记的LDL颗粒；向该细胞样品提供怀疑是PCSK9拮抗剂的分子；培养该细胞样品一段时间，所述时间足以允许细胞摄取LDL颗粒；通过除去上清液来分离细胞样品中的细胞；减少(reducing)标记的LDL颗粒的非特异性结合；裂解细胞；定量细胞裂解物中保留的标记物的量；以及鉴定导致定量的标记物的量相比于单独给予PCSK9时观察到的标记物的量有所增加的那些候选拮抗剂。导致定量的标记物的量增加的候选拮抗剂是PCSK9拮抗剂。已证明该方法是用于鉴定PCSK9特异性拮抗剂的有效手段，因此形成了本发明的重要方面。
下表提供了本发明中所讨论的序列的概览。
表1
  SEQ ID NO：   描述
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  SEQ ID NO：   描述
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附图简述
图1说明Fab表达载体pMORPH_x9_MH。
图2说明外极性(Exopolar)PCSK9突变体的效力如何与血浆LDL-胆固醇相关。
图3A-3D说明1CX1G08和3CX4B08剂量依赖性抑制对LDL摄取的PSCK9依赖性影响。图3B和3D有两个对照：(i)仅为细胞的对照，其显示细胞LDL摄取的基础水平，和(ii)细胞+PCSK9(25μg/ml)对照，其显示LDL-摄取的PCSK9-依赖性丧失(loss)水平。用图中所示固定浓度(25μg/ml)的PCSK9和递增浓度的Fab进行包括Fab和PCSK9的滴定试验。图3A和3C显示IC-50计算值。
图4A-4D显示3BX5C01和3CX2A06剂量依赖性抑制对LDL摄取的PSCK9依赖性影响。图4B和4D有两个对照：(i)仅为细胞的对照，其显示细胞LDL摄取的基础水平，和(ii)细胞+PCSK9(25μg/ml)对照，其显示LDL-摄取的PCSK9-依赖性丧失水平。用图中所示固定浓度(25μg/ml)的PCSK9和递增浓度的Fab进行包括Fab和PCSK9的滴定试验。图4A和4C显示IC-50计算值。
图5A-5B显示3CX3D02剂量依赖性抑制对LDL摄取的PSCK9依赖性影响。图5B有两个对照：(i)仅为细胞的对照，其显示细胞LDL摄取的基础水平，和(ii)细胞+PCSK9(25μg/ml)对照，其显示LDL-摄取的PCSK9-依赖性丧失水平。用图中所示固定浓度(25μg/ml)的PCSK9和递增浓度的Fab进行包括Fab和PCSK9的滴定试验。图5A显示IC-50计算值。
图6显示以下同种型的Fc结构域的序列比较：IgG1(SEQ ID NO：89的残基24-353)、IgG2(SEQ ID NO：90的残基7-332)、IgG4(SEQ ID NO：91的残基7-333)和IgG2m4(SEQ ID NO：92的残基7-332)。
发明详述
本发明涉及PCSK9拮抗剂，特别是人PCSK9拮抗剂。根据本发明的PCSK9的蛋白特异性拮抗剂(或“PCSK9特异性拮抗剂″)有效抑制PCSK9的功能，从而在治疗与PCSK9功能相关/受PCSK9功能影响的病症中非常重要，所述病症包括但不限于高胆固醇血症、冠心病、代谢综合征、急性冠状动脉综合征和相关病症。本文提及PCSK9功能或PCSK9活性时指需要PCSK9、或被PCSK9加剧或增强的任何活性/功能。本文已证明，PCSK9特异性拮抗剂抵抗对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制特别有效。已屡次证明，公开的拮抗剂对PCSK9对LDL摄取的影响呈剂量依赖性抑制。
因此，本文公开的PCSK9特异性拮抗剂是用于降低血浆LDL胆固醇水平的理想分子。PCSK9特异性拮抗剂应用于具有商业或家庭兽医(domestic veterinary)重要性的任何灵长类动物、哺乳动物或脊椎动物。PCSK9特异性拮抗剂还可应用于具有LDL受体的任何细胞群体或组织。检测LDL摄取并从而检测对LDL摄取的各种影响的方法描述于文献中；参见例如，Barak & Webb，1981 J.Cell Biol.90：595-604，和Stephan & Yurachek，1993 J.Lipid Res.34：325330。此外，测定血浆中的LDL胆固醇的方法充分描述于文献中；参见例如，McNamara等，2006 Clinica Chimica Acta369：158-167。
PSCK9特异性拮抗剂还在检测和定量PCSK9中应用于各种诊断目的。
本文定义的PCSK9特异性拮抗剂选择性识别并特异性结合PCSK9。本文所用术语“选择性”或“特异性”指这样的事实：所述公开的拮抗剂不显示对除PSCK9之外的物质的显著结合，除了在那些特殊情况下：其中补充拮抗剂使其具有另外的、与PCSK9特异性结合部分不同的特异性(例如，双特异性或双官能分子，其中所述分子设计用于结合或行使两种功能，其中至少一种是特异性结合PCSK9)。PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为1.2X10-6或更少。在具体实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为5X10-7或更少、2X10-7或更少或1X10-7或更少。在另外的实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为1X10-8或更少。在其它实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为5X10-9或更少，或1X10-9或更少。其他实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为1X10-10或更少，1X10-11或更少，或1X10-12或更少。在具体实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂不以上述水平结合其它蛋白。KD指获得自Kd(具体结合分子-靶蛋白相互作用的解离速率)与Ka(具体结合分子-靶蛋白相互作用的结合速率)之比(或Kd/Ka，以摩尔浓度(M)表示)的解离常数。可使用本领域充分建立的方法测定KD值。测定结合分子的KD的优选方法是通过使用表面等离子共振，例如生物传感器系统，如BiacoreTM(GE Healthcare Life Sciences)系统。
已显示PCSK9特异性拮抗剂剂量依赖性地抑制对LDL摄取的PCSK9依赖性影响。因此，PCSK9特异性拮抗剂的表征为它们抵抗PCSK9依赖性抑制LDL摄取进入细胞的能力。这种通过LDL受体将LDL摄取入细胞，在本文中称为“细胞LDL摄取”。在具体实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂拮抗对LDL摄取进入细胞的PCSK9-依赖性抑制，显示IC50为1.2X10-6或更少。在具体实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂拮抗对LDL摄取进入细胞的PCSK9-依赖性抑制，显示KD为5X10-7或更少、2X10-7或更少、或1X10-7或更少。在另外的具体实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂拮抗对细胞LDL摄取的PCSK9-依赖性抑制，显示IC50为1X10-8或更少。在其他实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂拮抗对细胞LDL摄取的PCSK9-依赖性抑制，显示IC50为5X10-9或更少、2X10-9或更少、或1X10-9或更少。其他实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂拮抗对细胞LDL摄取的PCSK9-依赖性抑制，显示IC50为1X10-10或更少，KD为1X10-11或更少、或KD为1X10-12或更少。可通过与对照进行统计学比较，或通过本领域用于评价对PCSK9功能的负作用或抑制的现有可选方法(即，能评价对PCSK9功能的拮抗作用的任何方法)来定量测定被任何PCSK9特异性拮抗剂抑制的程度。在具体实施方式中，所述抑制是至少约10％抑制。其它实施方式中，所述抑制是至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
本发明的PCSK9特异性拮抗剂可以是对PCSK9蛋白有特异性的任何结合分子，包括但不限于下文定义的抗体分子、任何PCSK9特异性结合结构、任何特异性结合PCSK9的多肽或核酸结构和掺入各种蛋白支架的上述任何物质；包括但不限于各种非基于抗体的支架以及能够提供选择性结合PCSK9的各种结构，包括但不限于小的模块化免疫药物(modularimmunopharmaceuticals)(或“SMIP”；参见，Haan & Maggos，2004年1月6日，Biocentury)；免疫蛋白(参见例如，Chak等，1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：6437-6442)；细胞色素b562(参见Ku和Schultz，1995Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6552-6556)；肽α2p8(参见Barthe等，2000Protein Sci.9：942-955)；高亲和力多聚体(avimers)(Avidia；参见Silverman等，2005 Nat.Biotechnol.23：1556-1561)；DARPins(MolecularPartners；参见Binz等，2003 J.Mol.Biol.332：489-503；Forrer等，2003FEBS Lett.539：2-6)；Tetranectins(参见，Kastrup等，1998 Acta.Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.54：757-766)；Adnectins(Adnexus；参见，Xu等，2002Chem.Biol.9：933-942)；Anticalins(Pieris；参见Vogt & Skerra，2004Chemobiochem.5：191-199；Beste等，1999 Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：1898-1903；Lamla & Erdmann，2003 J.Mol.Biol.329：381-388；andLamla & Erdmann，2004 Protein Expr.Purif.33：39-47)；A-结构域蛋白(参见North & Blacklow，1999 Biochemistry 38：3926-3935)；脂质运载蛋白(Lipocalins)(参见Schlehuber & Skerra，2005 Drug Discov.Today10：23-33)；重复基序蛋白，例如Ankyrin重复蛋白(参见Sedgwick &Smerdon，1999 Trends Biochem.Sci.24：311-316；Mosavi等，2002 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：16029-16034；and Binz等，2004 Nat.Biotechnol.22：575-582)；昆虫防御素A(参见Zhao等，2004 Peptides 25：629-635)；Kunitz结构域(参见Roberts等，1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：2429-2433；Roberts等，1992 Gene 121：9-15；Dennis & Lazarus，1994 J.Biol.Chem.269：22129-22136；Dennis & Lazarus，1994 J.Biol.Chem.269：22137-22144)；PDZ-结构域(Domains)(参见Schneider等，1999 Nat.Biotechnol.17：170-175)；蝎毒素，例如卡律蝎毒素(Charybdotoxin)(参见Vita等，1998 Biopolymers 47：93-100)；笫10纤维结合蛋白III型结构域(或10Fn3；参见Koide等，1998 J.Mol.Biol.284：1141-1151，和Xu等，2002Chem.Biol.9：933-942)；CTLA-4(胞外结构域；参见Nuttall等，1999Proteins 36：217-227；Irving等，2001 J.Immunol.Methods 248：31-45)；打结素(Knottins)(参见Souriau等，2005 Biochemistry 44：7143-7155和Lehtio等，2000 Proteins 41：316-322)；新抑癌蛋白(Neocarzinostatin)(参见Heyd等2003 Biochemistry 42：5674-5683)；碳水化合物结合模块4-2(CBM4-2；参见Cicortas等，2004 Protein Eng.Des.Sel.17：213-221)；淀粉酶抑肽(Tendamistat)(参见McConnell & Hoess，1995 J.Mol.Biol.250：460-470，和Li等，2003 Protein Eng.16：65-72)；T细胞受体(参见Holler等，2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：5387-5392；Shusta等，2000 Nat.Biotechnol.18：754-759；Li等，2005 Nat.Biotechnol.23：349-354)；Affbodies(Affibody；参见Nord等，1995 Protein Eng.8：601-608；Nord等，1997 Nat.Biotechnol.15：772-777；Gunneriusson等，1999 Protein Eng.12：873-878)；以及文献中认可的其他选择性结合蛋白或支架；参见例如，Binz & Plückthun，2005 Curr.Opin.Biotech.16：1-11；Gill & Damle，2006 Curr.Opin.Biotechnol.17：1-6；Hosse等，2006 Protein Science 15：14-27；Binz等，2005 Nat.Biotechnol.23：1257-1268；Hey等，2005 Trends in Biotechnol.23：514-522；Binz &Plückthun，2005 Curr.Opin.Biotech.16：459-469；Nygren & Skerra，2004 J.Immunolog.Methods 290：3-28；Nygren & Uhlen，1997 Curr.Opin.Struct.Biol.7：463-469。抗体及抗原结合片段的使用在文献中有充分定义。科学文献中对用于蛋白结合的可选支架的使用进行了充分评价，参见例如参见，例如Binz & Plückthun，2005 Curr.Opin.Biotech.16：1-11；Gill & Damle，2006 Curr.Opin.Biotechnol.17：1-6；Hosse等，2006 Protein Science15：14-27；Binz等，2005 Nat.Biotechnol.23：1257-1268；Hey等，2005Trends in Biotechnol.23：514-522；Binz & Plückthun，2005 Curr.Opin.Biotech.16：459-469；Nygren & Skerra，2004 J.Immunolog.Methods290：3-28；Nygren & Uhlen，1997 Curr.Opin.Struct.Biol.7：463-469。因此，具有对PCSK9选择性的、抵抗PCSK9依赖性细胞LDL摄取抑制的、非基于抗体的支架或拮抗剂分子构成了本发明的重要实施方式。适体(aptamers)(能够选择性结合靶分子的核酸或肽分子)是一个具体的例子。它们可选自随机序列文库或从天然来源例如核糖开关(riboswitches)中鉴定。肽适体、核酸适体(例如，结构核酸，包括基于DNA和RNA的结构)和核酸诱饵(decoys)可有效地选择性结合并抑制感兴趣的蛋白；参见，例如Hoppe-Seyler & Butz，2000 j.Mol.Med.78：426-430；Bock等，1992 Nature355：564-566；Bunka & Stockley，2006 Nat.Rev.Microbiol.4：588-596；Martell等，2002 Molec.Ther.6：30-34；Jayasena，1999 Clin.Chem.45：1628-1650。
可用合适的技术来实现各种PCSK9特异性拮抗剂的表达和选择，所述技术包括但不限于噬菌体展示(参见，例如国际申请号WO 92/01047；Kay等，1996，肽和蛋白的噬菌体展示：实验室手册(Phage Display of Peptides andProteins：A Laboratory Manual)，圣地亚哥：学术出版社(Academic Press))、酵母展示、细菌展示、T7展示和核糖体展示(参见例如Lowe & Jermutus，2004Curt.Pharm.Biotech.517-527)。
如本文所述的“抗体分子”或“抗体”指选择性结合于PCSK9的免疫球蛋白衍生结构，包括但不限于全长或完整的抗体、抗原结合片段(实际上(physically)或概念上(conceptually)衍生自抗体结构的片段)、任何上述物质的衍生物、嵌合分子、任何上述物质与另一种多肽的融合物、或为了选择性结合/抑制PCSK9功能的目的而掺入任何上述物质的任何可选结构/组成。“完整”抗体或“全长”抗体指包含两条重链(H)和两条轻链(L)的蛋白，所述重链和轻链通过二硫键相互连接，所述蛋白包含：(1)就重链而言，包含可变区(本文缩写为“VH”)和含有三个结构域CH1、CH2、CH3的重链恒定区；和(2)就轻链而言，包含轻链可变区(本文缩写为″VL″)和含有一个结构域CL的轻链恒定区。
本文所用术语“分离的”描述一种特性，该特性涉及公开的PCSK9特异性拮抗剂、核酸或其他物质，使它们与其在自然界中被发现的形式不同。这种差异可以是例如，它们与自然界中发现的形式的纯度不同，或它们与自然界中发现的形式的结构不同或形成与自然界中发现的形式不同的结构的一部分。未在自然界中发现的结构，例如包括重组人免疫球蛋白结构，包括但不限于具有优化的CDR的重组人免疫球蛋白结构。未在自然界中发现的结构的其他例子是基本不含其他细胞物质的PCSK9特异性拮抗剂或核酸。分离的PCSK9特异性拮抗剂通常不含具有不同蛋白特异性(即，对PCSK9之外的蛋白具有亲和性)的其他蛋白-特异性拮抗剂。
抗体片段(更具体地说抗原结合片段)是具有抗体可变区或其片段(包含一个或多个公开的CDR3结构域，重链和/或轻链)的分子，其赋予对PCSK9特别是人PCSK9的选择性结合。含有此类抗体可变区的抗体片段包括但不限于以下抗体分子：Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异性抗体分子(包含连接至第二功能部分的本文公开的PCSK9特异性抗体或抗原结合片段的抗体分子，所述第二功能部分具有不同于该抗体的结合特异性，包括不限于另一种肽或蛋白，例如抗体或受体配体)、双特异性单链Fv二聚体、分离的CDR3、小体、“scab”、dAb片段、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、小体、基于蛋白支架的人工抗体，包括但不限于纤维结合蛋白III型多肽抗体(参见例如美国专利6,703,199和国际申请No.WO 02/32925和WO 00/34784)或细胞色素B(参见例如Nygren等，1997 Curr.Opinion Struct.Biol.7：463-469)。抗体部分或结合片段可以是天然的，或部分地或完全地合成制备的。可通过本领域技术人员所知的各种方法制备此类抗体部分，所述方法包括但不限于常规技术，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。
在一个具体方面，本发明提供拮抗PCSK9功能的分离的PCSK9特异性拮抗剂。具体实施方式中，所述PCSK9特异性拮抗剂抑制PCSK9对细胞LDL摄取的拮抗作用。公开的PCSK9特异性拮抗剂有效拮抗PCSK9对LDL摄取的抑制，因此构成用于降低血浆LDL胆固醇水平的理想分子；参见例如Cohen等，2005 Nat.Genet.37：161-165(其中等位基因PCSK9无义突变的杂合子个体中观察到血浆LDL胆固醇水平的显著降低)；Rashid等，2005Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：5374-5379(其中证实PCSK9-敲除小鼠肝细胞中的LDLR数目增加，血浆LDL清除加快并且血浆胆固醇水平显著降低)；Cohen等，2006 N.Engl.J.Med.354：1264-1272(其中，PCSK9功能缺失突变的杂合子人显示出明显减少发展动脉粥样硬化性心脏病的长期风险)。
通过重复实验，5种PCSK9特异性拮抗剂(即抗体分子1CX1G08、3BX5C01、3CX2A06、3CX3D02和3CX4B08)剂量依赖性抑制PCSK9对LDL摄取的影响。因此，在具体实施方式中，本发明包括PCSK9特异性拮抗剂，在更具体的实施方式中，本发明包括抗体分子，所述抗体分子内包含重链和/或轻链可变区，以及它们的等同物(特征是具有一个或多个保守性氨基酸取代)或同源物。具体实施方式包括分离的PCSK9特异性拮抗剂，其含有本文公开的CDR结构域或本文公开的重链和/或轻链CDR结构域的组，或它们的等同物(以具有一个或多个保守性氨基酸取代为特征)。本文所用术语“结构域”或“区域”简单地指抗体分子的各部分，其中将存在(reside)或者当前存在有争论(at issue)的序列或片段。
在具体实施方式中，本发明提供分离的PCSK9特异性拮抗剂，更具体的实施方式中为抗体分子，所述抗体分子包含选自以下的重链可变区：SEQID NO：11、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：61和SEQ IDNO：79；它们的等同物(以具有一个或多个保守性氨基酸取代为特征)；以及它们的同源物。公开的拮抗剂能抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制。在具体实施方式中，本发明提供本文公开的拮抗剂的同源物，其特征在于与本文公开的拮抗剂至少90％同源；所述拮抗剂抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制。
在具体实施方式中，本发明提供分离的PCSK9特异性拮抗剂，更具体的实施方式中为抗体分子，所述抗体分子包含选自以下的轻链可变区：SEQID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99和SEQ IDNO：101；它们的等同物(以具有一个或多个保守性氨基酸取代为特征)；以及它们的同源物。公开的拮抗剂能抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制。在具体实施方式中，本发明提供本文公开的拮抗剂的同源物，其特征在于与本文公开的拮抗剂至少90％同源；所述拮抗剂抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制。
在具体实施方式中，本发明提供分离的PCSK9特异性拮抗剂，更具体的实施方式中为抗体分子，所述抗体分子包含：(i)包含SEQ ID NO：11的重链可变区和包含SEQ ID NO：93的轻链可变区；(ii)包含SEQ ID NO：27的重链可变区和包含SEQ ID NO：95的轻链可变区；(iii)包含SEQ ID NO：45的重链可变区和包含SEQ ID NO：97的轻链可变区；(iv)包含SEQ IDNO：61的重链可变区和包含SEQ ID NO：99的轻链可变区；(v)包含SEQID NO：79的重链可变区和包含SEQ ID NO：101的轻链可变区；或前述抗体分子的等同物(其特征在于在规定序列中具有一个或多个保守性氨基酸取代)。具体实施方式是所述拮抗剂抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制。
具体实施方式中，本发明提供分离的PCSK9特异性拮抗剂，更具体的实施方式中为PCSK9抗体分子，所述抗体分子包含选自以下的可变重链CDR3序列：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：51、SEQ IDNO：67和SEQ ID NO：85；以及它们的保守性修饰；抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制的具体实施方式。具体实施方式提供分离的拮抗剂，其包含重链可变区，其中CDR1、CDR2和/或CDR3序列包含：(i)分别地，SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15和/或SEQ ID NO：17；(ii)分别地，SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：31和/或SEQ ID NO：33；(iii)分别地，SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49和/或SEQ ID NO：51；(iv)分别地，SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65和/或SEQ ID NO：67；(v)分别地，SEQ ID NO：81、SEQ IDNO：83和/或SEQ ID NO：85；或它们的等同物(其特征在于在任何一个或多个CDR序列中具有一个或多个保守性氨基酸取代)。
具体实施方式中，本发明提供分离的PCSK9特异性拮抗剂，更具体的实施方式中为抗体分子，所述抗体分子包含选自以下的可变轻链CDR3序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：75；以及它们的保守性修饰；抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制的具体实施方式。具体实施方式提供分离的拮抗剂，其包含轻链可变区，其中CDR1、CDR2和/或CDR3序列包含：(i)分别地，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5，和/或SEQ ID NO：7；(ii)分别地，SEQ ID NO：21、SEQID NO：5和/或SEQ ID NO：23；(iii)分别地，SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39和/或SEQ ID NO：41；(iv)分别地，SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：39和/或SEQ ID NO：57；(v)分别地，SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73和/或SEQID NO：75；或它们的等同物(其特征在于在任何一个或多个CDR序列中具有一个或多个保守性氨基酸取代)。
具体实施方式中，本发明提供分离的PCSK9特异性拮抗剂，更具体的实施方式中为抗体分子，所述抗体分子包含重链可变区CDR3序列和轻链可变区CDR3序列，其包含：(i)分别地，SEQ ID NOs：17和7；(ii)分别地，SEQ ID NOs：33和23；(iii)分别地，SEQ ID NOs：51和41；(iV)分别地，SEQ ID NOs：67和57；和(v)分别地，SEQ ID NOs：85和75；或它们在任何一个或多个CDR3序列中的保守性修饰；抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制的具体实施方式。
具体实施方式提供分离的PCSK9特异性拮抗剂，更具体的实施方式中，提供抗体分子，所述抗体分子包含的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列以及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，其含有：(i)分别地，SEQID NOs：13、15、17、3、5和7，(ii)分别地，SEQ ID NOs：29、31、33、21、5和23，(iii)分别地，SEQ ID NOs：47、49、51、37、39和41，(iv)分别地，SEQ ID NOs：63、65、67、55、39和57，和(v)分别地，SEQ IDNOs：81、83、85、71、73和75；和它们的等同物(其特征在于在任何一个或多个CDR序列中具有一个或多个保守性氨基酸取代)；抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制的具体实施方式。
本领域技术人员将理解，保守性氨基酸取代是用一个可带来类似或更好的(对预期的目的而言)功能特性和/或化学特性的氨基酸残基来取代氨基酸残基的置换。例如，保守性氨基酸取代常常是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域中已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。
这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。此类修饰不是用来显著降低或改变PCSK9特异性拮抗剂的结合或功能性抑制特征，虽然它们可能改善这些特性。进行取代的目的不重要，可包括但绝不限于，用能够更好地维持或增强分子结构、分子的电荷或疏水性、或分子的大小的残基替代某一残基。例如，可希望用一种具有同样极性或电荷的残基取代一种不太理想的残基。可用本领域已知的标准技术(例如定位诱变和PCR介导的诱变)来引入此类修饰。本领域技术人员实现保守性氨基酸取代的一种具体方式是丙氨酸扫描诱变，描述于例如，MacLennan等，1998Acta Physiol.Scand.Suppl.643：55-67，和Sasaki等，1998 Adv.Biophys.35：1-24中。然后用本领域可利用的或本文所述的功能性试验测试经改变的拮抗剂是否保留了功能或具有更好的功能。本文中将具有以下特征的PCSK9特异性拮抗剂称为本文公开的拮抗剂的“功能性等同物”并构成本发明的具体实施方式：具有一个或多个上述保守性氨基酸取代，保留了选择性结合于人PCSK9的能力，并且相对于不具有上述氨基酸变化的分子，拮抗PCSK9功能的水平相同或更佳。
另一方面，本发明提供分离的PCSK9特异性拮抗剂，更具体的实施方式中提供抗体分子，其包含重链和/或轻链可变区，所述重链和/或轻链可变区包含与本文公开的抗体的相应氨基酸序列同源的氨基酸序列，其中所述抗体分子抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制。具体实施方式是拮抗剂，其包含重链和/或轻链可变区，所述重链和/或轻链可变区分别与本文公开的重链和/或轻链可变区至少90％同源。提到“至少90％同源”包括至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％同源的序列。
通常制备具有与本文所述的拮抗剂的氨基酸序列同源的氨基酸序列的PCSK9特异性拮抗剂来改善所述拮抗剂的一种或多种特性而不改变其对PCSK9的特异性。获得此类序列的一种方法(并非本领域技术人员可用的唯一方法)是使编码PCSK9特异性拮抗剂或其特异性决定区域的序列突变，表达包含这些突变序列的拮抗剂，使用可利用的功能性试验(包括本文所述的那些试验)来测试这些编码的拮抗剂是否保留了功能。可以通过定位诱变或随机诱变来突变。然而，本领域技术人员将理解，其他诱变方法可以容易地实现相同的效果。例如，某些方法中，用基于氨基酸的化学特性或者结构特性的非随机靶向保守取代或者用蛋白结构方面的考虑来限制突变体谱(spectrum)。在亲和力成熟实验中，单个经选择的分子(经随机或非随机选择)中可发现几个此类突变。对于亲和力成熟，还有各种基于结构的方法，描述于例如美国专利7,117,096、PCT公开号：WO 02/084277和WO03/099999。
如本文所用，两个氨基酸序列之间的百分比同源性等于两个序列之间的百分比同一性(identity)。两个序列之间的序列百分比同一性是序列共享的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/位置总数目X100)，其中考虑缺口(gap)的数目和每一缺口的长度，需要将其引入用于两个序列的最优对比。可用本领域通常所知的方法进行序列比较和确定序列间的百分比同一性，可用数学算法实现这种序列比较和百分比同一性的确定。例如，可用Meyers和Miller，1988 Comput.Appl.Biosci.4：11-17的算法(已整合入ALIGN程序(版本2.0))来确定氨基酸序列之间和/或核苷酸序列之间的百分比同一性。此外，可用从Accelrys在线获得的GCG软件包中的GAP程序(使用其缺省参数)来确定氨基酸序列之间或核苷酸序列之间的百分比同一性。
一方面中，本发明提供针对人PCSK9的分离的PCSK9特异性抗体分子，该抗体分子具有至少一个轻链可变结构域和至少一个重链可变结构域(分别是VL和VH)。
对蛋白特异性分子进行操作以产生具有相似或更佳特异性的其他结合分子在本领域技术人员的技能范围内。可例如使用重组DNA技术来实现这种操作。其中一个具体例子包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或一个或多个CDR的DNA适当地引入不同的免疫球蛋白的可变区、恒定区或恒定区加构架区。此类分子形成本发明的重要方面。可将本文具体公开的序列插入其中的具体免疫球蛋白或者本文具体公开的序列可形成其重要部分的具体免疫球蛋白包括但不限于以下抗体分子(形成本发明的具体实施方式)：Fab(具有可变轻链(VL)、可变重链(VH)、恒定轻链(CL)和恒定重链1(CH1)结构域的单价片段)、F(ab’)2(包含由二硫桥键(disulfide bridge)连接或者在绞链区连接的两个Fab片段的二价片段)、Fd(VH和CH1结构域)、Fv(VL和VH结构域)、scFv(单链Fv，其中VL和VH通过接头(例如肽接头)连接，参见例如Bird等，1988 Science 242：423-426，Huston等，1988 PNAS USA 85：5879-5883)、双特异性抗体分子(含有本文公开的PCSK9特异性抗体或抗原结合片段的抗体分子，所述PCSK9特异性抗体或抗原结合片段与具有与该抗体不同的结合特异性的第二功能性部分相连，所述笫二功能性部分包括但不限于另一种肽或者蛋白(例如抗体或受体配体))、双特异性单链Fv二聚体(参见例如PCT/US92/09965)、分离的CDR3、小体(单链-CH3融合物，自装配成约80kDa的二价二聚体)、‘scAb’(含有VH和VL以及CL或CH1的抗体片段)、dAb片段(VH结构域，参见例如Ward等，1989 Nature 341：544-546，和McCafferty等，1990Nature 348：552-554；或VL结构域，Holt等，2003 Trends in Biotechnology21：484-489)、双链抗体(参见例如Holliger等，1993 PNAS USA90：6444-6448和国际申请号WO 94/13804)、三链抗体、四链抗体、小体(连接于CH3的scFv；参见例如Hu等，1996 Cancer Res.56：3055-3061)、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgA、IgE或它们的任何衍生物，以及基于蛋白支架的人造抗体，其包括但不限于纤连蛋白III型多肽抗体(参见例如美国专利6,703,199和国际申请号WO 02/32925)或细胞色素B(参见例如Koide等，1998 J.Molec.Biol.284：1141-1151，和Nygren等，1997Current Opinion in Structural Biology 7：463-469)。某些抗体分子(包括但不限于Fv、scFv、双链抗体分子或结构域抗体(Domantis))可通过引入二硫桥键线性化(line)VH和VL结构域来使其稳定。参见例如Reiter等，1996 Nature Biotech.14：1239-1245。可以用常规技术(参见例如Holliger &Winter，1993 Current Opinion Biotechnol.4：446-449，其中的具体方法包括化学制备或用杂合杂交瘤制备)和其他技术产生双特异性抗体，所述其它技术包括但不限于BiTETM技术(带有肽接头的、具有不同特异性的抗原结合区域的分子)和孔中圆丘(knobs-into-holes)工程(参见例如Ridgeway等，1996 Protein Eng.9：616-621)。可在大肠杆菌中生产双特异性双链抗体，本领域技术人员将理解，可用噬菌体展示技术在合适的文库中选择这些分子及其他PCSK9特异性拮抗剂(参见，例如国际申请号WO 94/13804)。
可从任何种系(germ-line)或重排的人可变结构域中获得可变结构域，在该可变结构域中插入感兴趣的CDR。也可合成制备可变结构域。可用重组DNA技术将CDR区域引入各个可变结构域。可实现上述引入的一种方式描述于Marks等，1992 Bio/Technology 10：779-783中。可变重链结构域可与可变轻链结构域配对以提供抗原结合位点。此外，可用独立的区域(例如，单独的可变重链结构域)结合抗原。本领域技术人员还意识到，可用重组方法通过合成接头连接Fv片段的两个结构域VL和VH(它们可能由分开的基因编码)，所述合成接头可使VL和VH成为单一蛋白链，在该单一蛋白链中VL和VH区域配对形成单价分子(scFvs)。
具体实施方式提供位于种系构架区中的CDR。本文的具体实施方式提供选自SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：85的重链CDR，它们插入VH3替代有关的CDR。本文的具体实施方式提供选自SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：51和SEQ ID NO：67的重链CDR，它们插入VH5替代有关的CDR。本文的具体实施方式提供选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：23和SEQ IDNO：75的轻链CDR，它们插入VH3替代有关的CDR。本文的具体实施方式提供选自SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：57的轻链CDR，它们插入VK1替代有关的CDR。
具体实施方式提供本文定义的抗体分子，其包含含有选自以下的序列的轻链区域：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：69。另外的实施方式提供抗体分子，其包含本文所述的轻链区域和含有选自以下的序列的重链区域：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：77。
本发明涵盖人抗体分子、人源化抗体分子、去免疫化(deimmunized)抗体分子、嵌合抗体分子和灵长化(primatized)抗体分子。本发明还涵盖由镶饰(veneering)工艺制备的抗体分子；参见例如Mark等，1994实验药理学手册(Handbook of Experimental Pharmacology)，第113卷：单克隆抗体的药理学(The pharmacology of monoclonal Antibodies)Springer-Verlag，pp.105-134。提及″人″时所说的本文公开的抗体分子具体指具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和/或恒定区的抗体分子，其中所述序列可以但不是必须被修饰/改变以具有不是由人种系免疫球蛋白序列编码的某些氨基酸取代或残基。可通过包括但不限于随机的或位点特异性体外诱变的方法或通过体内体细胞突变来引入此类突变。文献中讨论的突变技术的具体例子公开于Gram等，1992 PNAS USA 89：3576-3580；Barbas等，1994 PNAS USA 91：3809-3813，和Schier等，1996 J.Mol.Biol.263：551-567。这些只是具体的例子并不代表唯一可用的技术。科学文献中有很多本领域技术人员可以使用并可以充分理解的突变技术。提及“人源化”所说的本文公开的抗体分子具体指其中衍生自另一种哺乳动物种类(例如小鼠)的CDR序列嫁接(grafted)到人构架序列上的抗体分子。提及“灵长化”时所说的本文公开的抗体分子指其中的非灵长类动物的CDR序列插入灵长类动物构架序列中的抗体分子。参见，例如WO 93/02108和WO99/55369。
本发明的具体抗体是单克隆抗体，具体实施方式中，本发明的具体抗体是以下抗体形式的一种：IgD、IgA、IgE、IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或任何前述抗体形式的任何衍生物。在这方面，术语“其衍生物”或“衍生物”具体包括：(i)在一个或两个可变区(即VH和/或VL)具有修饰的抗体和抗体分子；(ii)在VH和/或VL的恒定区进行了操作的抗体和抗体分子；和(iii)抗体和抗体分子，它们含有另外的、正常情况下并非免疫球蛋白分子的一部分的化学部分(例如，聚乙二醇化)。
可变区的操作可以在VH和/或VL CDR区域中的一个或多个内。可使用定位诱变、随机诱变或产生序列或分子多样性的其它方法来产生突变体，然后用现有的体外或体内试验(包括本文所述的那些)来测试这些突变体的感兴趣的具体功能性质。
本发明的抗体还包括那些抗体：其中已对VH和/或VL中的构架残基进行了修饰以改善感兴趣抗体的一种或多种特性。通常，进行此类构架修饰来减少抗体的免疫原性。例如，一种方法是对相应的种系序列进行一个或多个构架残基的“向后突变(backmutate)”。更具体地说，已经受体细胞突变的抗体可含有与衍生该抗体的种系序列不同的构架残基。可通过比较抗体构架序列与衍生该抗体的种系序列来鉴定此类残基。此类“向后突变”抗体也有意涵盖在本发明中。另一种类型的构架修饰包括使构架区或甚至一个或多个CDR区域中的一个或多个残基突变，以除去T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。这种方法也称为“去免疫化”，在Carr等的美国专利公开号20030153043中有更详细的描述。
除在构架区或CDR区内进行修饰之外，或者另外可选的，可将本发明抗体工程化(engineered)，以在Fc区(当该区存在时)中包含修饰，通常用来改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。
产生包括多种抗体同种型的“杂合子”或“组合的”IgG形式以引入(honein)所需的效应子功能性这一概念已有广泛描述；参见，例如Tao等，1991J.Exp.Med.173：1025-1028。本发明的具体实施方式涵盖在Fc区具有具体操作的抗体分子，已发现该操作导致对一部分抗体上的FcγR受体或Clq的结合降低。因此，本发明涵盖根据本说明书所述的抗体，所述抗体不引起(或以较小程度引起)抗体依赖性细胞毒性(“ADCC”)、补体介导的细胞毒性(“CMC”)，或形成免疫复合物，同时保留正常的药代动力学(“PK”)特性。本发明的具体实施方式提供根据本发明定义的抗体分子，其含有SEQID NO：87作为其免疫球蛋白结构的一部分。图6说明含有SEQ ID NO：87的序列(具体是IgG2m4)与IgG1、IgG2和IgG4的比较。
具体的PCSK9特异性拮抗剂可携带可检测标记或可缀合于毒素(例如，细胞毒素)、放射性同位素、放射性核素、脂质体、靶部分、生物传感器、阳离子尾或酶(例如，通过肽键或接头)。此类PCSK9特异性拮抗剂组合物形成本发明的另外的方面。
另一方面中，本发明提供编码公开的PCSK9特异性拮抗剂的分离核酸。所述核酸可存在于完整细胞、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本纯化的形式存在。当使用例如标准技术将核酸从其它细胞组分或其它污染物(例如其它细胞核酸或蛋白)中纯化出来时，称该核酸是“分离的”或“被基本纯化的(rendered substantially pure)”，所述标准技术非限制性包括碱/SDS处理、CsCl条带、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳及本领域已知的其他合适方法，该核酸可包括DNA(包括cDNA在内)和/或RNA。可用标准的分子生物学技术获得本发明的核酸。对于杂交瘤(例如，从带有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体而言，可通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术获得杂交瘤所产生的抗体的轻链和重链的编码cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库中(例如，利用噬菌体展示技术)获得的抗体而言，可从文库中回收(recover)编码抗体的核酸。
本发明涵盖编码本文公开的可变重链和/或轻链及它们的所选组分(特别是公开的各自的CDR3区)的分离的核酸。在本文的具体实施方式中，在抗体构架区内提供CDR。具体实施方式提供分离的核酸，其编码进入种系构架区内的CDR。本文的具体实施方式提供分离的核酸，其编码重链CDRSEQ ID NO：18或SEQ ID NO：86，它们插入VH3替代编码有关的CDR的核酸。本文的具体实施方式提供分离的核酸，其编码重链CDR SEQ IDNO：34、52或68，它们插入VH5替代编码有关的CDR的核酸。本文的具体实施方式提供分离的核酸，其编码轻链CDR SEQ ID NO：8、24或76，它们插入VL3替代编码有关的CDR的核酸。本文的具体实施方式提供分离的核酸，其编码轻链CDR SEQ ID NO：42或58，它们插入VK1替代编码有关的CDR的核酸。编码可变区的分离的核酸可以任何所需的抗体分子形式提供，包括但不限于一下形式：F(ab’)2、Fab、Fv、scFv、双特异性抗体分子(含有本文公开的PCSK9特异性抗体或抗原结合片段，所述PCSK9特异性抗体或抗原结合片段与具有和该抗体不同结合特异性的第二功能性部分相连，所述第二功能性部分包括但不限于另一种肽或者蛋白例如抗体或受体配体)、双特异性单链Fv二聚体、小体、dAb片段、双链抗体、三链抗体或四链抗体、小体、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgA、IgE、或它们的任何衍生物。
具体实施方式提供分离的核酸，其编码本文所定义的抗体分子，该抗体分子包含含有选自以下的序列的轻链区：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：69。具体实施方式包括选自以下的核酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：54和SEQ ID NO：70。另外的实施方式提供抗体分子，其包含本文所述的轻链区和含有选自以下的序列的重链区：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：77。在具体实施方式中，编码重链区的核酸序列可包括选自如下的序列：SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：78。
具体实施方式提供分离的核酸，其编码含有选自如下的重链可变结构域的抗体分子：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：79；具体实施方式分别包括核酸序列SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：80。本发明具体实施方式提供编码抗体分子的分离的核酸，其包含：(i)重链CDR1核苷酸序列SEQ ID NO：14；(ii)重链CDR2核苷酸序列SEQ ID NO：16；和/或(iii)重链CDR3核苷酸序列SEQ ID NO：18。本发明具体实施方式提供编码抗体分子的分离的核酸，其包含：(i)重链CDR1核苷酸序列SEQ ID NO：30；(ii)重链CDR2核苷酸序列SEQ ID NO：32；和/或(iii)重链CDR3核苷酸序列SEQ ID NO：34。本发明具体实施方式提供编码抗体分子的分离的核酸，其包含：(i)重链CDR1核苷酸序列SEQ ID NO：48；(ii)重链CDR2核苷酸序列SEQ ID NO：50；和/或(iii)重链CDR3核苷酸序列SEQ ID NO：52。本发明具体实施方式提供编码抗体分子的分离的核酸，其包含：(i)重链CDR1核苷酸序列SEQ ID NO：64；(ii)重链CDR2核苷酸序列SEQ ID NO：66；和/或(iii)重链CDR3核苷酸序列SEQ ID NO：68。本发明具体实施方式提供编码抗体分子的分离的核酸，其包含：(i)重链CDR1核苷酸序列SEQ IDNO：82；(ii)重链CDR2核苷酸序列SEQ ID NO：84；和/或(iii)重链CDR3核苷酸序列SEQ ID NO：86。具体实施方式提供分离的核酸，其编码含有选自如下的轻链可变结构域的抗体分子：SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：101；具体实施方式分别包括核酸序列SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：102。本发明的具体实施方式提供编码抗体分子的分离的核酸，其包含：(i)轻链CDR1核苷酸序列SEQ ID NO：4；(ii)轻链CDR2核苷酸序列SEQ ID NO：6；和/或(iii)轻链CDR3核苷酸序列SEQ ID NO：8。本发明具体实施方式提供编码抗体分子的分离的核酸，其包含：(i)轻链CDR1核苷酸序列SEQ ID NO：22；(ii)轻链CDR2核苷酸序列SEQ ID NO：6；和/或(iii)轻链CDR3核苷酸序列SEQ ID NO：24。本发明具体实施方式提供编码抗体分子的分离的核酸，其包含：(i)轻链CDR1核苷酸序列SEQID NO：38，(ii)轻链CDR2核苷酸序列SEQ ID NO：40；和/或(iii)轻链CDR3核苷酸序列SEQ ID NO：42。本发明具体实施方式提供编码抗体分子的分离的核酸，其包含：(i)轻链CDR1核苷酸序列SEQ ID NO：56；(ii)轻链CDR2核苷酸序列SEQ ID NO：40；和/或(iii)轻链CDR3核苷酸序列SEQ ID NO：58。本发明具体实施方式提供编码抗体分子的分离的核酸，其包含：(i)轻链CDR1核苷酸序列SEQ ID NO：72；(ii)轻链CDR2核苷酸序列SEQ ID NO：74；和/或(iii)轻链CDR3核苷酸序列SEQ ID NO：76。本发明的具体实施方式涵盖编码抗体分子的核酸，所述抗体分子的Fc区经具体操作导致对一部分抗体上的FcγR受体或C1q的结合降低。本发明的一种具体实施方式是含有SEQ ID NO：88的分离的核酸。在具体实施方式中，可通过表达从寡聚核苷酸合成产生并在合适的表达载体内装配的核酸来制备合成的PCSK9特异性拮抗剂；参见例如Knappick等，2000 J.Mol.Biol.296：57-86，以及Krebs等，2001 J.Immunol.Methods 254：67-84。
本发明还包括分离的核酸，其包含与本文所述的核苷酸序列至少约90％相同，更优选至少约95％相同的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制的PCSK9特异性拮抗剂。确定同一性的序列比较方法是本领域技术人员已知的，包括以前描述的那些方法。提到“至少约90％相同”包括至少约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100％相同。
本发明还提供分离的核酸，其在特定的杂交条件下与本文公开的核酸的互补链杂交，该核酸特异性结合PCSK9并拮抗PCSK9功能。核酸杂交方法是本领域熟知的；参见例如Ausubel，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.，6.3.1-6.3.6，1989。如本文所定义，中等严格的杂交条件可使用含有5X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5％w/v SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的预洗涤溶液，约50％v/v甲酰胺、6xSSC的杂交缓冲液，杂交温度为55℃(或其他类似的杂交溶液，例如含有约50％v/v甲酰胺，杂交温度为42℃)，洗涤条件为60℃，在0.5xSSC、0.1％w/v SDS中。严格的杂交条件可以是6xSSC，45℃下，然后在0.1xSSC、0.2％SDS中，于68℃洗涤一次或多次。此外，本领域技术人员可控制杂交和/或洗涤条件，以增加或减少杂交的严格度，从而含有彼此至少65、70、75、80、85、90、95、98或99％相同的核苷酸序列的核酸通常保持彼此杂交。影响杂交条件选择的基本参数和设计合适条件的指导参见Sambrook等，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，第9和11章，1989和Ausubel等(主编)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，Inc.，笫2.10和6.3-6.4节，1995，本领域普通技术人员可基于例如DNA的长度和/或碱基组成容易地确定这些参数。
另一方面，本发明提供包含所述核酸的载体。本发明载体包括但不限于针对预期目的而言适于在合适水平表达所需抗体分子的质粒及其他表达构建物(例如可适宜地为，噬菌体或噬菌粒(phagemid))；参见，例如Sambrook& Russell，分子克隆；实验手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)：第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press。对于大多数克隆目的而言，可使用DNA载体。典型的载体包括质粒、修饰的病毒、噬菌体、粘粒、酵母人工染色体、及其他游离(episomal)DNA或整合(integrated)DNA。针对具体的基因转移、产生重组PCSK9特异性拮抗剂或其他用途，确定合适的载体在本领域技术人员的能力范围内。在具体实施方式中，除重组基因之外，载体还可含有用于宿主细胞自主复制的复制起点，合适的调控序列例如启动子、终止序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、选择性标记、有限数目的有用的限制性内切酶位点、其它合适序列以及高拷贝数的潜在性。用于生产蛋白特异性拮抗剂的表达载体的例子是本领域公知的；参见例如Persic等，1997 Gene 187：9-18；Boel等，2000 J.Immunol.Methods239：153-166，和Liang等，2001 J.Immunol.Methods 247：119-130。如果需要，可用本领域公知技术将编码拮抗剂的核酸整合到宿主染色体中；参见例如Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，1999，和Marks等，国际申请号WO 95/17516。核酸还可在维持游离(episomally)或整合入人工染色体的质粒上表达；参见例如Csonka等，2000 J.Cell Science 113：3207-3216；Vanderbyl等，2002 Molecular Therapy5：10。具体对于抗体分子而言，可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入独立的载体中，或更典型地，可将两个基因插入相同的表达载体中。可用标准方法(例如，连接核酸片段和载体上的互补限制性位点，或如果不存在限制性位点则进行平端连接)将编码任何PCSK9特异性拮抗剂的核酸插入表达载体中。在这方面的另一个具体例子是通过使用重组方法，例如Clontech的“InFusion″系统或Invitrogen的“TOPO”系统(二者均为体外系统)，或胞内进行(例如，Cre-Lox系统)。具体对抗体分子而言，可通过以下方式使用轻链和重链可变区产生任何抗体同种型的全长抗体基因：将轻链和重链可变区插入已编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体，从而使VH区段操作性连接于载体内的CH区段，且使VL区段操作性连接于载体内的CL区段。此外或或者，含有编码PCSK9特异性拮抗剂的核酸的重组表达载体可编码信号肽，从而有助于从宿主细胞分泌拮抗剂。可将核酸克隆入载体中，从而使编码信号肽的核酸与PCSK9特异性拮抗剂的编码核酸毗邻并框内连接(linked in-frame adjacent to)。信号肽可以是免疫球蛋白或非免疫球蛋白信号肽。本领域技术人员可利用的任何技术都可用于将核酸引入宿主细胞中；参见例如Morrison，1985 Science，229：1202。将感兴趣的核酸分子亚克隆入表达载体的方法、转化或转染含有载体的宿主细胞的方法、生产基本纯的蛋白的方法(包括将各表达载体引入宿主细胞的步骤)、以及在合适条件下培养宿主细胞的方法都是众所周知的。可用常规方法从宿主细胞中收获用上述方式产生的PCSK9特异性拮抗剂。适于将核酸引入感兴趣细胞的技术将取决于所使用细胞的类型。一般的技术包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染以及使用对感兴趣的细胞系合适的病毒(例如逆转录病毒、痘苗病毒、杆状病毒或噬菌体)转导。
另一方面，本发明提供分离的细胞，其包含编码本文公开的PCSK9特异性拮抗剂的核酸。可用多种不同的细胞系进行PCSK9特异性拮抗剂的重组生产，所述细胞系包括但不限于原核生物(例如大肠杆菌、芽孢杆菌属(Bacillus)和链霉菌属)细胞系和真核生物(例如酵母、杆状病毒和哺乳动物)细胞系；参见例如Breitling等，重组抗体(Recombinant antibodies)，John Wiley & Sons，Inc.and Spektrum Akademischer Verlag，1999。包含本文公开的核酸或拮抗剂的植物细胞(包括转基因植物)和动物细胞(包括转基因动物(除人以外))也考虑为本发明的一部分。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于源自以下的细胞系：中国仓鼠卵巢(CHO细胞，包括但不限于DHFR-CHO细胞(描述于Urlaub和Chasin，1980 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220)，其与例如DHFR选择性标记(例如，描述于Kaufman和Sharp，1982 Mol.Biol.159：601-621)一起使用；NS0骨髓瘤细胞(其中可使用如WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841所述的GS表达系统)；COS细胞；SP2细胞；HeLa细胞；幼仓鼠(baby hamster)肾细胞；YB2/0大鼠骨髓瘤细胞；人胚肾细胞；人胚胎视网膜细胞；及其他包含本文公开的核酸或拮抗剂的细胞，它们形成了本发明另外的实施方式。本发明具体实施方式可使用大肠杆菌，参见例如Plückthun，1991 Bio/Technology9：545-551；或酵母(例如毕赤氏酵母)；和它们的重组衍生物(参见例如Li等，2006 Nat.Biotechnol.24：210-215)。本发明另外的具体实施方式可使用真核细胞生产PCSK9特异性拮抗剂，参见Chadd & Chamow，2001 CurrentOpinion in Biotechnology 12：188-194，Andersen & Krummen，2002 CurrentOpinion in Biotechnology 13：117，Larrick & Thomas，2001 Current Opinionin Biotechnology 12：411-418。本发明具体实施方式可使用能够产生带有适当的翻译后修饰的PCSK9特异性拮抗剂的哺乳动物细胞。翻译后修饰包括但绝不限于形成二硫键和糖基化作用。另一种类型的翻译后修饰是信号肽断裂。本文的优选实施方式具有合适的糖基化作用；参见例如，Yoo等，2002J.Immunol.Methods 261：1-20。天然存在的抗体含有附着于重链的至少一个N连接的碳水化合物。同上(Id.)。不同类型的哺乳动物宿主细胞可用于提供有效的翻译后修饰。此类宿主细胞的例子包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、HeLa细胞、C6细胞、PC12细胞和骨髓瘤细胞；参见Yoo等，2002J.Immunol.Methods 261：1-20，和Persic等，1997 Gene 187：9-18。
另一方面，本发明提供包含本发明多肽的分离的细胞。
另一方面，本发明提供制备本发明的PCSK9特异性拮抗剂的方法，其包括：在允许表达PCSK9特异性拮抗剂或表达并装配所述重链和/或轻链成为PCSK9特异性拮抗剂的条件下培养细胞，所述细胞包含编码对人PCSK9有特异性的PCSK9特异性拮抗剂或所需的PCSK9特异性拮抗剂的重链和/或轻链的核酸；以及从所述细胞分离所述PCSK9特异性拮抗剂。产生具体的所需重链和/或轻链序列的一个例子是首先使用PCR扩增(和修饰)种系重链和/或轻链可变序列。本领域技术人员可容易地获得人重链和/或轻链可变区的种系序列，参见例如“Vbase”人种系序列数据库，和Kabat，E.A.等，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国健康和公共事业部(Department of Health and Human Services)，NIH出版号91-3242；Tomlinson，I.M.等，1992“The Repertoire of Human Germline VHSequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with DifferentHypervariable Loops”J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.等，1994“A Directory of Human Germ-line VκSegments Reveals a Strong Bias intheir Usage”Eur.J.Immunol.24：827-836。可用标准方法，例如PCR介导的诱变(其中突变被掺入到PCR引物中)或定位诱变来实施种系序列的诱变。如果需要全长抗体，则用于人重链恒定区基因的序列是可获得的；参见例如Kabat.E.A.等，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国健康和公共事业部，NIH出版号91-3242。可通过例如标准的PCR扩增来获得含有这些区域的片段。或者，本领域技术人员可利用已编码重链和/或轻链恒定区的载体。
存在可利用技术来重组产生保留原始抗体的特异性的其它抗体分子。这方面的具体例子是，将编码免疫球蛋白可变区或CDR的DNA引入另一种抗体分子的恒定区、或恒定区和构架区；参见例如EP-184,187、GB 2188638和EP-239400。抗体分子(包括嵌合抗体)的克隆和表达描述在文献中；参见例如EP 0120694和EP 0125023。
一种情况中，可产生本发明的抗体分子，然后用已知技术就本文所确定的(identified)特征进行筛选。制备单克隆抗体的基本技术描述在文献中，参见例如Kohler和Milstein(1975，Nature 256：495-497)。可通过现有方法制备完全人源化的(Fully human)单克隆抗体。这些方法包括但绝不限于，使用遗传工程小鼠株系，其具有这样的免疫系统：其中小鼠抗体基因已被灭活并替换为一套(repertoire)功能性人抗体基，同时该小鼠免疫系统的其它组分保持不变。此类遗传工程小鼠允许天然的体内免疫反应和亲和力成熟过程，从而产生高亲和性、完全人源化的单克隆抗体。这种技术是本领域熟知的，并详细描述于各种出版物，包括但不限于美国专利5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299、5,770,249(转让至GenPharm International，可通过Medarex获得，在“超级单抗人抗体发展系统”(“UltraMab Human AntibodyDevelopment System”)保护下)；以及美国专利5,939,598、6,075,181、6,114,598、6,150,584和相关专利族成员(转让至Abgenix，公开了他们的Xeno
Figure G2007800494419D00311
技术)。还参见Kellerman和Green的综述，2002 Curr.Opinionin Biotechnology 13：593-597，以及Kontermann & Stefan，2001 AntibodyEngineering，Springer Laboratory Manuals。
或者，可将根据本发明的PCSK9特异性拮抗剂文库与PCSK9接触，选择能够显示特异性结合的那些PCSK9特异性拮抗剂。然后可进行功能研究以确保适当的功能性，即，抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制。本领域技术人员可利用多种技术，使用富集技术从文库中选择蛋白特异性分子，所述技术包括但不限于噬菌体展示(例如参见美国专利5,565,332、5,733,743、5,871,907、5,872,215、5,885,793、5,962,255、6,140,471、6,225,447、6,291,650、6,492,160、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081，以及其他美国专利族成员和/或申请(优先权文件是1992年5月24日提交的GB 9206318)中公开的剑桥抗体技术(Cambridge Antibody Technology)(“CAT”)；还参见Vaughn等，1996，Nature Biotechnology 14：309-314)、核糖体展示(参见例如Hanes和Pluckthün，1997 Proc.Natl.Acad.Sci.94：4937-4942)、细菌展示(参见例如Georgiou等，1997，Nature Biotechnology15：29-34)和/或酵母展示(参见例如Kieke等，1997，Protein Engineering10：1303-1310)。文库例如可展示在噬菌体颗粒的表面上，其中编码PCSK9特异性拮抗剂的核酸表达并展示在其表面上。然后可从显示所需活性水平的噬菌体颗粒中分离核酸，将该核酸用于开发所需的拮抗剂。噬菌体展示已充分描述在文献中；参见例如Kontermann & Stefan(见上文)；和国际中请号WO 92/01047。具体关于抗体分子而言，根据本发明的单独的重链克隆或轻链克隆也可分别用来筛选能够与其相互作用并形成联合的(combined)重链和轻链分子的互补重链或轻链；参见例如国际申请号WO 92/01047。可用本领域技术人员可获得的任何淘选(panning)方法来鉴定PCSK9特异性拮抗剂。用于实现该目的的另一种具体方法是针对溶液中的靶抗原(例如生物素化的可溶性PCSK9)进行淘选，然后在涂覆有链霉抗生物素蛋白的磁珠上捕获PCSK9特异性拮抗剂-噬菌体复合物，之后洗涤除去非特异性结合的噬菌体。然后，可从所述珠回收捕获的噬菌体，回收方法与本文所述从板(例如DTT)的表面回收噬菌体的方法相同。
可通过本领域技术人员可利用的方法来纯化PCSK9特异性拮抗剂。可通过各种血清学或免疫学测定(包括但不限于沉淀、被动凝集、酶连免疫吸附抗体(“ELISA”)技术和放射免疫测定(“RIA”)技术)来测定有关的拮抗剂制剂(preparation)、腹水、杂交瘤培养液、或有关的样品的滴度。
另一方面，本发明提供拮抗PCSK9活性的方法，其包括：使通常受PCSK9影响(即，含有LDL受体)的细胞或组织样品与本文公开的PCSK9特异性拮抗剂在允许所述拮抗剂结合PCSK9(当PCSK9存在时)并抑制PCSK9对细胞LDL摄取的抑制的条件下接触。本发明具体实施方式包括此类方法，其中所述细胞是人细胞。另一方面，本发明提供在对象中拮抗PCSK9活性的方法，其包括给予所述对象治疗有效量的本发明PCSK9特异性拮抗剂。使用的术语“拮抗”指对抗、抵消、中和或削减PCSK9的一种或多种功能。按照本领域已知方法(参见例如Barak & Webb，1981 J.CellBiol.90：595-604；Stephan & Yurachek，1993 J.Lipid Res.34：325330；和McNamara等，2006 Clinica Chimica Acta 369：158-167)以及本文所述的那些方法可容易地测定对一种或多种相关的PCSK9功能特性的抑制或拮抗。相对于没有拮抗剂或例如当存在具有不相关特异性的对照拮抗剂的情况，抑制或拮抗将实现降低PCSK9活性。优选地，根据本发明的PCSK9特异性拮抗剂拮抗PCSK9功能的程度是使所测定的参数减少至少10％，更优选，使所测定的参数减少至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和95％。此类对PCSK9功能的抑制/拮抗在其中PCSK9的功能至少部分导致对对象产生负面影响的特定表型、疾病、紊乱或病症的那些情况下特别有效。还考虑使用本文公开的拮抗剂制备药物的方法，所述药物用于治疗PCSK9相关疾病、紊乱或病症，或者用于治疗可从PCSK9拮抗剂作用中受益的疾病、紊乱或病症。本文公开的PCSK9特异性拮抗剂可用于具体个体(人或灵长类动物)的治疗或诊断方法中。所述治疗方法在性质上可以是预防性或治疗性的。另一方面，本发明提供药学上可接受的组合物，其包含本发明的PCSK9特异性拮抗剂和药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、稳定剂、缓冲剂或用来便于将所需形式和数量的拮抗剂给予受治疗个体的可选物质。根据本发明的治疗方法包括给予个体治疗(或预防)有效量的本发明PCSK9特异性拮抗剂。提及量时，使用术语“治疗有效”或“预防有效”指预定剂量(intended dosage)下达到所需治疗/预防效果并持续所需时间段所必需的量。所需效果可以是例如，改善与所治疗病症相关的至少一种症状。如本领域技术人员将理解，这些量将根据各种因素而变化，所述因素包括但不限于疾病状况、个体年龄、性别和体重、PCSK9特异性拮抗剂在个体中引发所需效果的能力。可通过体外试验、体内非人动物研究和/或来自临床试验的其它支持来记录(治疗)反应。可用本领域已知的任意数目的策略来配制本发明的基于拮抗剂的药物组合物，参见例如McGoff和Scher，2000 Solution Formulation of Proteins/Peptides：In-McNally，E.J.，ed.Protein Formulation and Delivery.New York，NY：Marcel Dekker；pp.139-158；Akers & Defilippis，2000，Peptides and Proteins as ParenteralSolutions.In-Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins.Philadelphia，PA：Taylor和Francis；pp.145-177；Akers等，2002，Pharm.Biotechnol.14：47-127。适于对患者施用的药学上可接受的组合物将含有处于制剂中的有效量的PCSK9特异性拮抗剂，所述制剂既保留生物活性，同时还促进在可接受的温度范围内存储期间的最大稳定性。
基于拮抗剂的药学上可接受的组合物可以是液体或固体形式。可采用可用于制备液体或固体剂型的任何技术。此类技术在本领域技术人员的能力范围内。可通过任何可利用方法(包括但不限于冻干、喷雾干燥或用超临界流体技术干燥)，来制备固体剂型。用于口服的固体剂型可以是能够使患者在规定的时间段内获得规定数量的拮抗剂的任何形式。口服配方制剂可以采取很多固体制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊或散剂。或者固体剂型可以是冻干的并在给药前溶解于溶液中，用于单剂或多剂给药。拮抗剂组合物通常应配制在生物学上相应(biologically relevant)的pH范围内，可经过缓冲以在存储期间维持适当的pH范围。液体和固体剂型通常都要求在较低温度下(例如2-8℃)下存储，以使稳定性保持较长的时间。配制的(formulated)拮抗剂组合物(特别是液体制剂)可含有抑菌剂以防止存储期间发生蛋白水解或使蛋白水解最小化，所述抑菌剂包括但不限于有效浓度(例如≤1％w/v)的苄醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。抑菌剂可能对一些患者是禁忌的。因此，可在含有或不含这种组分的溶液中重建冻干的制剂。另外的组分可加到缓冲的液体或固体拮抗剂制剂中，所述另外的组分包括但不限于糖作为防冻剂(包括但不限于多羟基碳氢化合物，如山梨糖醇、甘露糖醇、甘油，以及卫矛醇和/或二糖如蔗糖、乳糖、麦芽糖或海藻糖)，以及在有些情况下包括有关的盐(包括但不限于NaCl、KCl或LiCl)。此类拮抗剂制剂，特别是计划要长期储存的液体制剂，依靠总同渗浓度(total osmolarity)的有效范围(useful range)来促进在例如2-8℃或更高温度下的长期稳定性，同时还使制剂用于胃肠外注射。适当时，可包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。制剂可含有二阶阳离子(包括但不限于MgCl2、CaCl2和MnCl2)；和/或非离子表面活性剂(包括但不限于聚山梨酯-80(Tween 80TM)、聚山梨酯-60(Tween 60TM)、聚山梨酯-40(Tween 40TM)和聚山梨酯-20(Tween 20TM)；聚氧乙烯烷基醚，包括但不限于Brij 58TM、Brij35TM；及其他例如Triton X-100TM、TritonX-114TM、NP40TM、Span 85和普卢兰尼克(Pluronic)系列的非离子表面活性剂(例如Pluronic 121))。此类组分的任何组合形成本发明的具体实施方式。
液体形式的药物组合物可包含液体载体，例如水、石油(petroleum)、动物油、植物油、矿物油或合成油。液体形式还可包含生理盐水、右旋糖或其它糖类溶液或二醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
优选地，药物组合物的形式是胃肠外可接受的水溶液，其无热原，具有合适的pH、张力和稳定性。药物组合物可配制成用于在等渗载体中稀释之后给药，所述等渗载体例如为氯化钠注射液、林格氏(Ringer’s)注射液或乳酸盐(Lactated)林格氏注射液。
拮抗剂治疗的剂量给药(dosing)在本领域技术人员的能力范围内，参见例如Lederman等，1991 Int.J.Cancer 47：659-664；Bagshawe等，1991Antibody，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4：915-922，并基于很多因素而变化，所述因素包括但不限于所用的具体PCSK9特异性拮抗剂、治疗的患者、患者状况、治疗的面积、给药途径和所需的治疗。具有一般技能的医师或兽医能够容易地确定拮抗剂的治疗有效量并开具处方。剂量范围可以是主体体重的约0.01-100mg/kg，更通常为0.05-25mg/kg。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg体重范围内。出于说明而非限制的目的，在具体实施方式中，可使用5mg-2.0g的剂量全身递送拮抗剂。实现最精确地使拮抗剂浓度在产生效力但无毒性的范围内，需要有基于药物对于靶位点的可用性的动力学的给药方案。这涉及考虑PCSK9特异性拮抗剂的分布、平衡和消除。本文所述的拮抗剂可以合适的剂量单独使用。或者，与其他物质共同给药或顺序给药可能是合意的。有可能提供供本发明PCSK9特异性拮抗剂和可选治疗方案联用的治疗剂量方案。例如，PCSK9特异性拮抗剂可与其它降胆固醇药(包括但不限于胆固醇吸收抑制剂(例如ZetiaTM)和胆固醇合成抑制剂(例如ZocorTM和VytorinTM))联用或并用。能够治疗的个体(对象)包括灵长类动物，人和非人，并包括具有商业或家庭兽医(domestic veterinary)重要性的任何非人哺乳动物或脊椎动物。
可通过本领域公知的任何给药途径将PCSK9特异性拮抗剂给予个体，所述给药途径包括但不限于口服、注射给药(具体实施方式包括静脉内、皮下、腹膜内或肌肉注射)、吸入给药、鼻内给药或局部给药，单独给药或与有助于治疗个体的其他药剂联合给药。应根据本领域技术人员公知的多种考虑来确定给药途径，所述考虑包括但不限于治疗所需的生理化学特征。可以每日、每周、每两周或每月为基础，或以能够在规定的时间向个体递送合适量的PCSK9特异性拮抗剂从而实现并维持所需治疗的任何其他方案来提供治疗。可单剂量给予制剂或者分次(at separate times)给予多剂。
具体实施方式中，治疗的病症选自：高胆固醇血症、冠心病、代谢综合征、急性冠状动脉综合征和相关病症。PCSK9特异性拮抗剂在制备药物中的用途形成本发明的重要实施方式，所述药物用于治疗PSCK9相关病症或者能够受益于PCSK9拮抗剂的病症，包括上述那些病症。
本发明还提供给予本文公开的抗PCSK9拮抗剂用于基因治疗的目的。通过这些方法，用编码本发明PCSK9特异性拮抗剂的核酸转化对象的细胞。然后，含有这些核酸的对象内源性产生PCSK9特异性拮抗剂。以前，Alvarez等(Clinical Cancer Research 6：3081-3087，2000)用基因治疗方法将单链抗ErbB2抗体引入对象中。可容易地使Alvarez等(见上文)公开的方法适于将编码本发明抗PCSK9抗体的核酸引入对象中。
可将编码任何PCSK9特异性拮抗剂的核酸引入对象中。
可用本领域已知的任何方法将核酸引入对象的细胞中。优选的实施方式中，将核酸作为病毒载体的一部分引入。可衍生载体的优选病毒的例子包括慢病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒、杆状病毒、甲病毒属、流感病毒、及其他具有合适的细胞向性的重组病毒。
多家公司商业化生产病毒载体，包括但决不限于Avigen，Inc.(Alameda，Calif.；AAV载体)、Cell Genesys(Foster City，Calif.；逆转录病毒、腺病毒、AAV载体和慢病毒载体)、Clontech(逆转录病毒和杆状病毒载体)、Genovo，Inc.(Sharon Hill，Pa.；腺病毒和AAV载体)、Genvec(腺病毒载体)，IntroGene(Leiden，荷兰；腺病毒载体)、Molecular Medicine(逆转录病毒、腺病毒、AAV和疱疹病毒载体)、Norgen(腺病毒载体)、Oxford BioMedica(牛津，英国；慢病毒载体)和Transgene(斯特拉斯堡，法国；腺病毒、痘苗病毒、逆转录病毒和慢病毒载体)。
构建和使用病毒载体的方法是本领域已知的(参见例如Miller等，BioTechniques 7：980-990，1992)。优选地，病毒载体是复制缺陷型的，即，它们不能自主复制，因此在靶细胞中不具感染性。优选地，复制缺陷型病毒是最小病毒，即，它仅保留了其基因组中包裹基因组以产生病毒颗粒所必需的序列。优选完全或几乎完全缺少病毒基因的缺陷型病毒。缺陷型病毒载体的使用允许对具体的、局部区域内的细胞给药，而不用担心载体会感染其他细胞。因此，可特异性靶向具体的组织。
含有弱化的或缺陷型DNA病毒序列的载体的例子包括但不限于缺陷型疱疹病毒载体(Kanno等，Cancer Gen.Ther 6：147-154，1999；Kaplitt等，J.Neurosci.Meth.71：125-132，1997和Kaplitt等，J.Neuro Onc.19：137-147，1994)。
腺病毒是真核DNA病毒，其可经修饰以有效递送本发明的核酸至多种细胞类型。弱化的腺病毒载体，例如Strafford-Perricaudet等(J.Ciin.Invest.90：626-630，1992)描述的载体在有些情况下是合意的。已描述了多种复制缺陷型腺病毒和最小腺病毒载体(PCT公开号WO94/26914、WO94/28938、WO94/28152、WO94/12649、WO95/02697和WO96/22378)。可用本领域技术人员已知的任何技术来制备根据本发明的复制缺陷型重组腺病毒。(Levrero等，Gene 101：195，1991；EP 185573；Graham，EMBO J.3：2917，1984；Graham等，J.Gen.Virol.36：59，1977)。
腺伴随病毒(AAV)是相对小尺寸的DNA病毒，其能够以稳定的和位点特异性的方式整合入被它们感染的细胞的基因组中。它们能够感染广谱细胞(a wide spectrum of cells)而不诱发对细胞生长、形态学或分化的任何影响，它们似乎不牵涉人病理学。衍生自AAVs的载体在体外和体内转移基因中的用途已有描述(参见Daly等，Gene Ther.8：1343-1346，2001，Larson等，Adv.Exp.Med.Bio.489：45-57，2001；PCT公开号WO 91/18088和WO93/09239；美国专利号4,797,368和5,139,941；以及EP 488528B1)。
另一种实施方式中，可将基因引入逆转录病毒载体中，如以下文献所述：美国专利5,399,346、4,650,764、4,980,289和5,124,263；Mann等，Cell 33：153，1983；Markowitz等，J.Virol.，62：1120，1988；EP 453242和EP178220。逆转录病毒是整合病毒，其感染分裂中的细胞。
慢病毒载体可用作药剂用于在几种组织类型(包括脑、视网膜、肌肉、肝脏和血液)中直接递送和持续表达本发明编码PCSK9特异性拮抗剂的核酸。这些载体可有效转导这些组织中的分裂中的细胞和未在分裂中的细胞，并维持PCSK9特异性拮抗剂的长期表达。综述参见Zufferey等，J.Virol.72：9873-80，1998和Kafri等，Curr.Opin.Mol.Ther.3：316-326，2001。慢病毒包装细胞系是可得的并且是本领域公知的。它们促进产生高滴度慢病毒载体用于基因治疗。一个例子是四环素可诱导的VSV-G假型慢病毒包装细胞系，其可产生滴度大于106IU/ml的病毒颗粒至少3-4天；参见Kafri等，J.Virol.73：576-584，1999。由可诱导的细胞系产生的载体可根据需要浓缩以有效地体外和体外转导未在分裂中的细胞。
辛德毕斯病毒是甲病毒属的成员，从1953年开始在世界各地被发现以来，已对其进行了广泛研究。基于甲病毒属(尤其辛德毕斯病毒)的基因转导已在体外进行了充分研究(参见Straus等，Microbiol.Rev.，58：491-562，1994；Bredenbeek等，J.Virol.，67：6439-6446，1993；Ijima等，Int.J.Cancer80：110-118，1999和Sawai等，Biochim.Biophyr.Res.Comm.248：315-323，1998)。甲病毒属载体的多种特性使它们成为研发中的、其他病毒衍生的载体系统的合适备选，所述特性包括表达构建物的快速工程化(rapidengineering)、高滴度传染性颗粒贮液(stocks)的产生、未在分裂中的细胞的感染、和高水平表达。(Strauss等，1994，见上文)。已描述了辛德毕斯病毒在基因治疗中的用途。(Wahlfors等，Gene.Ther.7：472-480，2000和Lundstrom，J.Recep.Sig.Transduct.Res.19(1-4)：673-686，1999)。
另一种实施方式中，可通过脂质转染或用其他转染促进物质(肽、聚合物等)将载体引入细胞。合成的阳离子脂质可用于制备脂质体，用于编码标记物的基因的体内和体外转染(Feigner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：7413-7417，1987和Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7851-7855.1987)。用于转移核酸的合适的脂质化合物和组合物描述于PCT公开号WO95/18863和WO 96/17823，以及美国专利No.5,459,127中。
还可能将载体引入体内作为裸DNA质粒。通过本领域已知方法将用于基因治疗的裸DNA载体引入所需的宿主细胞，所述方法例如电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、使用基因枪或使用DNA载体转运蛋白(参见例如Wilson等，J.Biol.Chem.267：963-967，1992；Williams等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：2726-2730，1991)。其他常用于质粒转染的试剂包括但绝不限于FuGene、Lipofectin和Lipofectamine。还可使用受体介导的DNA递送方法(Wu等，J.Biol.Chem.263：14621-14624，1988)。美国专利5,580,859和5,589,466公开了无转染促进物质存在下在哺乳动物中递送外源DNA序列。最近，记载了相对低电压、高效的体内DNA转移技术，称为电转移(Vilquin等，Gene Ther.8：1097，2001；Payen等，Exp.Hematol.29：295-300，2001；Mir，Bioelectrochemistry 53：1-10，2001；PCT公开号WO99/01157、WO 99/01158和WO 99/01175)。
适于此类基因治疗方法并包含编码本发明抗PCSK9拮抗剂的核酸的药物组合物包括在本发明的范围内。
另一方面，本发明提供使用本发明的PCSK9特异性拮抗剂来鉴定、分离、定量或拮抗感兴趣样品中的PCSK9的方法。所述PCSK9特异性拮抗剂可在免疫化学检测或各种纯化方法中用作研究工具，所述免疫化学检测例如蛋白印迹、ELISA、放射免疫测定、免疫组化检测、免疫沉淀或本领域已知的其它免疫化学检测(参见例如Immunological Techniques LaboratoryManual，Goers，J.编，1993，Academic Press)。这些拮抗剂可具有掺入其中的标记物或其上附着有标记物，以使与其相关的活性鉴定或检测容易。本领域技术人员对各种类型的可检测标记物(例如酶、染料或能够容易地被检测或引起一些容易检测的活性/结果的其他合适分子)非常熟悉，所述可检测标记物用于或者可能用于上述规程中。
本发明的另一方面是包含本文公开的PCSK9特异性拮抗剂或药物组合物以及使用说明书的试剂盒。试剂盒通常但不一定包括标签，其说明试剂盒的内容物的预定用途。术语标签包括试剂盒上提供、或与试剂盒一起提供、或者其他形式伴随试剂盒的任何书写或记录材料。
本发明还涉及在细胞样品中鉴定PCSK9特异性拮抗剂的方法，其包括向细胞样品提供纯化的PCSK9(或功能等同物)和标记的LDL颗粒；向细胞样品提供怀疑是PCSK9拮抗剂的分子；培养该细胞样品一段时间，所述时间足以允许细胞摄取LDL颗粒；定量掺入到细胞中的标记物的量；以及鉴定导致定量的标记物的量相对单独给予PCSK9(或功能等同物)时观察到的标记物的量有所增加的那些候选拮抗剂。本发明还涉及在细胞样品中鉴定PCSK9特异性拮抗剂的方法，其包括向细胞样品提供纯化的PCSK9(或功能等同物)和标记的LDL颗粒；向该细胞样品提供怀疑是PCSK9拮抗剂的分子；培养该细胞样品一段时间，所述时间足以允许细胞摄取LDL颗粒；通过除去上清液来分离细胞样品中的细胞；减少(reducing)标记的LDL颗粒的非特异性结合(不管是结合于板、细胞或除LDL受体之外的任何物质)；裂解细胞；定量细胞裂解物中保留的标记物的量；以及鉴定导致定量的标记物的量相比于单独给予PCSK9时观察到的标记物的量有所增加的那些候选拮抗剂。导致定量的标记物的量增加的候选拮抗剂是PCSK9拮抗剂。已证明该方法是用于鉴定PCSK9特异性拮抗剂的有效手段，因此形成了本发明的重要方面。带有LDL受体的任何类型的细胞都可用于本发明公开的方法中，所述细胞包括但不限于HEK细胞、HepG2细胞和CHO细胞。PCSK9的“功能等同物”在本文定义为在氨基酸水平上与PCSK9至少80％同源、在PCSK9中具有保守性氨基酸取代或者修饰的蛋白；所述蛋白显示对LDL受体的LDL摄取的可检测性抑制。编码所述蛋白的核酸可在严格杂交条件下与编码PCSK9的核酸的互补链杂交。可接种任何数目的细胞。作为例子，本发明方法在96孔板中接种30,000细胞/孔。优选实施方式中，当添加PCSK9(或功能等同物)时，细胞在无血清培养基中。在具体实施方式中，在有血清的培养基中培养细胞一段时间(例如约24小时)，然后接种在无血清培养基(已除去含有血清的培养基)中培养一段时间(例如，约24小时)；然后添加纯化的PCSK9(或功能等同物)和标记的LDL颗粒。本领域技术人员知晓，减少标记的LDL颗粒的非特异性结合这一步骤通常通过洗涤/冲洗步骤进行，但也可使用能够减少非特异性结合的任何技术。衍生自任何来源的LDL颗粒均可用于上述检测中。优选实施方式中，LDL颗粒是源自血液的新鲜颗粒。这可通过本领域技术人员可利用的任何方法来实现，包括但不限于Havel等，1955 J.Clin.Invest.34：1345-1353所述的方法。在具体实施方式中，用荧光标记LDL颗粒。具体实施方式中，标记的LDL颗粒具有掺入其中的被可见光波长激发的荧光团3，3′-二(十八)烷基吲哚碳菁碘化物(dioctadecylindocarbocyanine iodide)(dil(3))，以形成高度荧光的LDL衍生物dil(3)-LDL。如本领域技术人员所认可，可用允许本领域技术人员检测细胞裂解物中的LDL的任何标记物来实施本发明。在具体实施方式中，可使用LDL类似物，该类似物仅在胞内代谢时或例如在内化过程中与其他分子缔合(associate)(或解离(dissociate))时(例如，在FRET试验中，其中LDL类似物与次生的(secondary)氟缔合或者从猝灭剂解离)才变为可检测的(例如，变为发荧光或在不同的波长发荧光等)。本发明中可使用本领域可得的用于检测标记的LDL颗粒内化的任何方法。LDL颗粒和PCSK9与细胞的孵育时间是足以允许细胞摄取LDL颗粒的时间量。在具体实施方式中，所述时间在5分钟-360分钟范围内。在具体实施方式中，添加到细胞中的PCSK9或功能等同物的浓度在1nM-5μM范围内。更具体的实施方式中，添加到细胞中的PCSK9或功能等同物的浓度在0.1nM-3μM范围内。本领域技术人员可用于确定具体的PCSK9蛋白的浓度范围的一种具体方法是建立LDL摄取试验的剂量反应曲线。可以选择促进接近于LDL摄取的最大损失但仍在剂量反应曲线线性范围内的PCSK9浓度。通常，该浓度是得自剂量反应曲线的蛋白EC-50的约5倍。该浓度可随蛋白改变。举例而言，实施例5中所用野生型PCSK9的量是约320nM，而在使用“功能获得性(gain of function)”PCSK9(例如S127R和D374Y)进行的等同物试验中，以较低浓度添加所述突变体(例如6-50nM)。在所述试验中，细胞通常维持在适于它们的维持和/或生长的温度。在具体实施方式中，该温度维持在约37℃。
提供以下实施例来阐释而非限制本发明：
实施例1
重组Fab展示噬菌体的分离
针对固定的重组人PCSK9淘选重组Fab噬菌体展示文库(参见例如Knappik等，2000 J.Mol.Biol.296：57-86)，所用方法简述如下：首先将噬菌体Fab展示文库分成3个库(pool)：一个库是VH2+VH4+VH5，另一个库是VH1+VH6，第三个库是VH3。用脱脂奶粉(nonfat dry milk)封闭(block)噬菌体库和固定的PCSK9蛋白。
对于第一轮淘选，将各噬菌体库独立地结合于固定在Nunc Maxisorp板上的孔内的V5-、组氨酸标记的PCSK9蛋白。固定的噬菌体-PCSK9复合物用以下试剂顺序洗涤：(1)PBS/0.5％TweenTM 20(三次快速洗涤)；(2)PBS/0.5％TweenTM 20(一次5分钟孵育，适度摇动)；(3)PBS(三次快速洗涤)；和(4)PBS(两次5分钟孵育，适度摇动)。用20mM DTT洗脱结合的噬菌体，将所有三次洗脱的噬菌体悬浮液合并到一试管中。用洗脱的噬菌体感染大肠杆菌TG1。培养带有噬菌粒的细胞(氯霉素抗性)的汇集培养物(Pooled culture)，制备带有噬菌粒的培养物冷冻贮液。通过用辅助噬菌体共转染从培养物中拯救噬菌体，制备用于下一轮淘选的噬菌体贮液。
对于第二轮淘选，将第一轮获得的噬菌体与固定的、经封闭的V5-、组氨酸标记的PCSK9蛋白结合。固定的噬菌体-PCSK9复合物用以下试剂顺序洗涤：(1)PBS/0.05％TweenTM 20(一次快速洗涤)；(2)PBS/0.05％TweenTM20(四次5分钟孵育，适度摇动)；(3)PBS(一次快速洗涤)；和(4)PBS(四次5分钟孵育，适度摇动)。洗脱结合的噬菌体，感染大肠杆菌TG1细胞，如第一轮中拯救噬菌体。
对于第三轮淘选，将第2轮获得的噬菌体与固定的、经封闭的V5-组氨酸标记的PCSK9蛋白结合。固定的噬菌体-PCSK9复合物用以下试剂顺序洗涤：(1)PBS/0.05％TweenTM 20(十次快速洗涤)；(2)PBS/0.05％TweenTM20(五次5分钟孵育，适度摇动)；(3)PBS(十次快速洗涤)；和(4)PBS(五次5分钟孵育，适度摇动)。如第一轮中洗脱结合的噬菌体，并感染大肠杆菌TG1细胞。使噬菌粒感染的细胞生长过夜，制备噬菌粒DNA。
将第三轮噬菌粒DNA中的XbaI-EcoRI插入物亚克隆入Morphosys Fab表达载体pMORPH_x9_MH(参见例如图1)，在大肠杆菌TG1F-中产生Fab表达克隆的文库。将转化体涂布在LB+氯霉素+葡萄糖平板上，生长过夜以产生菌落。挑取各转化体菌落，置于两个96孔板的孔中，生长并筛选Fab表达。
实施例2
ELISA筛选细菌表达的FABS
各转化体的培养物用IPTG诱导，生长过夜以表达Fab。将培养物上清液(候选Fabs)与纯化的、固定在96孔Nunc Maxisorp板的孔中的V5-、组氨酸标记的PCSK9蛋白一起孵育，用洗板机(plate washer)以配制在PBS中的0.1％Tween20TM洗涤，与HRP-偶联的抗Fab抗体一起孵育，再次用PBS/Tween20TM洗涤。通过加入TMP底物来检测结合的HRP，用读板仪读取各孔的A450值。
包括如下阴性对照：
用于(检测)各板上的非特异性Fab结合的对照与平行表达的抗EsB(一种不相关的Fab)制剂一起孵育。
仅有生长培养基。
包括如下用于ELISA和Fab表达的阳性对照；
使EsB抗原结合于板的三个孔，然后与抗EsB Fab一起孵育。对于Fab与重组PCSK9抗原的V5或组氨酸标记反应的对照，使用在与表达原始PCSK9抗原相同的细胞中表达的并经类似纯化的V5-、组氨酸标记的分泌性碱性磷酸酶蛋白(SEAP)进行平行的ELISA。将推定的PCSK9反应性Fab鉴定为：当与PCSK9抗原一起孵育时产率(yielding)＞3X背景值，但与SEAP一起孵育时为阴性。将第一轮筛选中评价为PCSK9反应性的克隆实变(consolidated)到单个平板上，一式三份(in triplicate)再培养，再用IPTG诱导，再用平行ELISA检测对PCSK9和SEAP(的结合)。如上所述包括阳性和阴性对照。对3个重复实验(replicates)中的至少2个评价为阳性的克隆进行后续鉴定。对于已知或怀疑的混合初步克隆，在含氯霉素的2xYT平板上划线以获得单克隆，以此再纯化培养物，再如上所述一式三份进行ELISA来检测三个或更多个独立克隆的液体培养物。
实施例3
PCSK9ELISA-阳性FAB克隆的DNA序列测定
通过接种阳性Fab的总(master)甘油贮液中的1.2ml含有氯霉素的2xYT液体培养基并培养过夜，来获得用于制备DNA的细菌培养物。用在BioRobot 9600上进行的Qiagen Turbo Mini制备步骤从过夜培养物中离心获得细胞沉淀物，从中制备DNA。用Morphosys确定的测序引物在ABI 3100基因分析仪(Genetic Analyzer)上对DNA进行ABI染料终止子(DyeTerminator)循环测序，以获得Fab克隆的DNA序列。将DNA序列彼此比较以确定独特的克隆序列并确定Fab克隆的轻链和重链亚型。
实施例4
表达和纯化来自于独特的PCSK9 ELISA-阳性克隆的FAB
来自ELISA阳性克隆的Fab(1CX1G08、3BX5C01、3CX2A06、3CX3D02和3CX4B08)以及EsB(阴性对照)Fab通过IPTG诱导在大肠杆菌TG1F-细胞中表达。裂解培养物，通过固定化金属离子亲和层析(IMAC)纯化组氨酸标记的Fab，通过离心渗滤将蛋白交换到25mM HEPES pH 7.3/150mMNaCl中。在Caliper Lab-Chip 90和常规的SDS-PAGE上电泳分析蛋白，用Bradford蛋白测定法定量。系列稀释的纯化的Fab蛋白用ELISA再测定，以证实纯化的Fab的活性。如上所述进行阳性和阴性对照。用如下所述的外极(EXOPOLAR)(胆固醇摄取)试验分析纯化的Fab制剂。
实施例5
外极试验：外源PCSK9对细胞LDL摄取的影响
第1天，将30,000细胞/孔接种在polyD-赖氨酸涂覆的96孔板中。第2天，将培养基更换为不含血清的DMEM培养基。第3天，除去培养基，用OptiMEM洗涤细胞。将纯化的PCSK9加入到含有LPDS和dI-LDL的100μl DMEM培养基中。37℃孵育板6.5小时。在含有2mg/ml BSA的TBS中迅速洗涤细胞；然后在TBS-BSA中洗涤2分钟；然后用TBS(但快速)洗涤两次。在100μl RIPA缓冲液中裂解细胞。然后用Ex 520、Em 580nm检测板中的荧光。用BCA蛋白测定法检测各孔中的总细胞蛋白，并将荧光单位(fluorescence units)归一化至总蛋白。
外极试验有效鉴定对LDL摄取的各种效果；参见图2，图2说明了在外极试验中PCSK9突变体的效力如何与血浆LDL-胆固醇相关。数据如下表所示：
表2
Figure G2007800494419D00431
结果：五种抗体分子(1CX1G08；3BX5C01；3CX2A06；3CX3D02；和3CX4B08)剂量依赖性抑制PCSK9对LDL摄取的影响；可再现性地观察到这种效果。加入细胞中的PCSK9的量是约320nM。抗体分子包含：(a)1CX1G08，SEQ ID NO：1(含有SEQ ID NO：93的VL)轻链(“LC”)，和SEQ ID NO：9(含有SEQ ID NO：11的VH)Fd链；(b)3BX5C01，SEQ ID NO：19(含有SEQ ID NO：95的VL)LC链，和SEQ ID NO：25(含有SEQ ID NO：27的VH)Fd链；(c)3CX2A06，SEQ ID NO：35(含有SEQ ID NO：97的VL)LC链，和SEQ ID NO：43(含有SEQ ID NO：45的VH)Fd链；(d)3CX3D02，SEQ ID NO：53(含有SEQ ID NO：99的VL)LC链，和SEQ ID NO：59(含有SEQ ID NO：61的VH)Fd链；和(e)3CX4B08，SEQ ID NO：69(含有SEQID NO：101的VL)LC链，和SEQ ID NO：77(含有SEQ ID NO：79的VH)Fd链。图3A-3D说明了1CX1G08和3cx4b08对LDL摄取的PSCK9依赖性影响的剂量依赖性抑制。图3B和3D有两个对照：(i)仅有细胞的对照，显示细胞LDL摄取的基线水平，和(ii)细胞+PCSK9(25/ml)对照，显示LDL摄取的PCSK9依赖性损失水平。在图表中所示PCSK9固定浓度(25/ml)和Fab递增浓度下进行包括Fab和PCSK9的滴定试验。图3A和3C显示IC-50的计算。1CX1G08显示对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制具有53％的抑制，而3CX4B08显示61％的抑制。图4A-4D说明了3BX5C01和3CX2A06对LDL摄取的PSCK9依赖性影响的剂量依赖性抑制。图4B和4D有两个对照：(i)仅有细胞的对照，显示细胞LDL摄取的基线水平，和(ii)细胞+PCSK9(25/ml)对照，显示LDL摄取的PCSK9依赖性损失水平。在图表中所示PCSK9固定浓度(25/ml)和Fab递增浓度下进行包括Fab和PCSK9的滴定试验。图4A和4C显示IC-50的计算。3BX5C01显示对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制具有25％的抑制，而3CX2A06显示23％的抑制。图5A-5B说明了3CX3D02对LDL摄取的PSCK9依赖性影响的剂量依赖性抑制。图5B有两个对照：(i)仅有细胞的对照，显示细胞LDL摄取的基线水平，(ii)细胞+PCSK9(25/ml)对照，显示LDL摄取的PCSK9依赖性损失水平。在图表中所示PCSK9固定浓度(25/ml)和Fab递增浓度下进行包括Fab和PCSK9的滴定试验。图5A显示IC-50的计算。3CX3D02显示对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制具有23％的抑制。
实施例6
用表面等离子共振(“SPR”)评估FAB：PCSK9相互作用的动力学
用BiacoreTM(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，瑞典)2000系统进行SPR检测。传感器芯片CM5和用于固定的胺偶联试剂盒购自BiacoreTM。
使用“immobilization wizard”，选择“目的是固定(Aim forimmobilization)”，经由伯胺基团将抗Fab IgG(人特异性)共价偶联于传感器芯片CM5的表面1和2上。指定目标固定为5000RU。“wizard”使用100mM NHS和400mM EDC的1∶1混合物活化7分钟；分几次脉冲注射配体以达到所需浓度，然后用7分钟的乙醇胺脉冲将剩余的表面去活化(deactivate)。
抗PCSK9 Fab被捕获在捕获表面2上，表面1用作Fab:PCSK9相互作用动力学研究的参照。通过使500ng/ml的溶液以5μl/min流动，持续1-1.5分钟，以获得反应的R最大为100-150RU的目标RL，从而捕获Fab。使5-10浓度的hPCSK9v5His或mPCSK9v5His抗原以30μl/分钟流过表面，持续3-4分钟。在用10mM甘氨酸pH 2.0的30秒脉冲重新产生抗Fab表面之前，允许有15-60的解离时间。
用BiaEvaluation软件评价用各Fab分析的多种浓度的PCSK9抗原的sensograms，以评估Fab:PCSK9相互作用的动力学常数。
表3说明了检测到的本文公开的抗PCSK9Fab的动力学参数：
表3
＊″直接″＝共价固定PCSK9；从流动相中结合Fab。
″Ab捕获″＝共价固定抗-Fab抗体；捕获测试抗体，然后从流动相中结合PCSK9。
CPCH0961268P序列表.txt
序列表
<110>默克公司(Merck&Co.，Inc.)
     C.P.斯帕罗(Sparrow，Carl P.)
     A.西特拉尼(Sitlani，Ayesha)
     S.潘迪特(Pandit，Shilpa)
     J.H.康德拉(Condra，Jon H.)
     H.A.哈蒙(Hammond，Holly A.)
<120>PCSK9拮抗剂
<130>22308Y
<150>60/857,320
<151>2006-11-07
<160>102
<170>FastSEQ for Windows Vers ion 4.0
<210>1
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>LC；1CX1G08
<400>1
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
 1               5                  10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Thr Tyr Tyr Val
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Asn Thr Ser Phe Asn
                85                  90                  95
Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
            100                 105                 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
        115                 120                 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
    130                 135                 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
                165                 170                 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
            180                 185                 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
        195                 200                 205
Ala Pro Thr Glu Ala
    210
<210>2
<211>639
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LC；1CX1G08
<400>2
gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc  60
tcgtgtagcg gcgataatat tggtacttat tatgttcatt ggtaccagca gaaacccggg 120
caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat tctaatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180
tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240
gacgaagcgg attattattg cggtacttgg gataatactt cttttaatct tgtgtttggc 300
ggcggcacga agttaaccgt tcttggccag ccgaaagccg caccgagtgt gacgctgttt 360
ccgccgagca gcgaagaatt gcaggcgaac aaagcgaccc tggtgtgcct gattagcgac 420
ttttatccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 480
gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 540
agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgag 600
gggagcaccg tggaaaaaac cgttgcgccg actgaggcc                        639
<210>3
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR1；1CX1G08
<400>3
Ser Gly Asp Asn Ile Gly Thr Tyr Tyr Val His
 1               5                  10
<210>4
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR1；1CX1G08
<400>4
agcggcgata atattggtac ttattatgtt cat    33
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR2；1CX1G08；3BX5C01
<400>5
Asp Asp Ser Asn Arg Pro Ser
 1               5
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR2；1CX1G08；3BX5C01
<400>6
gatgattcta atcgtccctc a                     21
<210>7
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR3；1CX1G08
<400>7
Gly Thr Trp Asp Asn Thr Ser Phe Asn Leu Val
 1               5                  10
<210>8
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR3；1CX1G08
<400>8
ggtacttggg ataatacttc ttttaatctt gtg        33
<210>9
<211>241
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Fd链；1CX1G08
<400>9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Trp Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Thr Tyr Phe Glu Gly Val Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
        115                 120                 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
    130                 135                 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
            180                 185                 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
        195                 200                 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Glu Phe Glu Gln Lys
    210                 215                 220
Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Pro His His His His His
225                 230                 235                 240
His
<210>10
<211>723
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Fd链；1CX1G08
<400>10
caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cctccggatt taccttttct gattattggg tttcttgggt gcgccaagcc 120
cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcttt atctcttatg atggtagctc tacctattat 180
gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtacttat 300
tttgagggtg ttgatgtttg gggccaaggc accctggtga cggttagctc agcgtcgacc 360
aaaggtccaa gcgtgtttcc gctggctccg agcagcaaaa gcaccagcgg cggcacggct 420
gccctgggct gcctggttaa agattatttc ccggaaccag tcaccgtgag ctggaacagc 480
ggggcgctga ccagcggcgt gcataccttt ccggcggtgc tgcaaagcag cggcctgtat 540
agcctgagca gcgttgtgac cgtgccgagc agcagcttag gcactcagac ctatatttgc 600
aacgtgaacc ataaaccgag caacaccaaa gtggataaaa aagtggaacc gaaaagcgaa 660
ttcgagcaga agctgatctc tgaggaggat ctgaacggcg cgccgcacca tcatcaccat 720
cac                                                               723
<210>11
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH；1CX1G08
<400>11
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Trp Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Thr Tyr Phe Glu Gly Val Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>12
<211>351
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH；1CX1G08
<400>12
caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cctccggatt taccttttct gattattggg tttcttgggt gcgccaagcc 120
cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcttt atctcttatg atggtagctc tacctattat 180
gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtacttat 300
tttgagggtg ttgatgtttg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a          351
<210>13
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR1；1CX1G08
<400>13
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Val Ser
 1               5                  10
<210>14
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR1；1CX1G08
<400>14
ggatttacct tttctgatta ttgggtttct                              30
<210>15
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR2；1CX1G08
<400>15
Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
 1               5                  10                  15
Gly
<210>16
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR2；1CX1G08
<400>16
tttatc tctt atgatggtag ctctacctat tatgcggata gcgtgaaagg c    51
<210>17
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR3；1CX1G08
<400>17
Thr Tyr Phe Glu Gly Val Asp Val
 1               5
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR3；1CX1G08
<400>18
acttattttg agggtgttga tgtt                                   24
<210>19
<211>212
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>LC；3BX5C01
<400>19
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
 1               5                  10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Asp Tyr Ile Val
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Phe Asp Asn Gly Gly Asp Ile Asp
                85                  90                  95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala
            100                 105                 110
Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala
        115                 120                 125
Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala
    130                 135                 140
Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val
145                 150                 155                 160
Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser
                165                 170                 175
Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr
            180                 185                 190
Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala
        195                 200                 205
Pro Thr Glu Ala
    210
<210>20
<211>636
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LC；3BX5C01
<400>20
gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60
tcgtgtagcg gcgataatct tcgtgattat attgttcatt ggtaccagca gaaacccggg 120
caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat tctaatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180
tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240
gacgaagcgg attattattg cggttttgat aatggtggtg atattgatgt gtttggcggc 300
ggcacgaagt taaccgttct tggccagccg aaagccgcac cgagtgtgac gctgtttccg 360
ccgagcagcg aagaattgca ggcgaacaaa gcgaccctgg tgtgcctgat tagcgacttt 420
tatccgggag ccgtgacagt ggcctggaag gcagatagca gccccgtcaa ggcgggagtg 480
gagaccacca caccctccaa acaaagcaac aacaagtacg cggccagcag ctatctgagc 540
ctgacgcctg agcagtggaa gtcccacaga agctacagct gccaggtcac gcatgagggg 600
agcaccgtgg aaaaaaccgt tgcgccgact gaggcc                           636
<210>21
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR1；3BX5C01
<400>21
Ser Gly Asp Asn Leu Arg Asp Tyr Ile Val His
 1               5                  10
<210>22
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR1；3BX5C01
<400>22
agcggcgata atcttcgtga ttatattgtt cat    33
<210>23
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR3；3BX5C01
<400>23
Gly Phe Asp Asn Gly Gly Asp Ile Asp Val
 1               5                  10
<210>24
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR3；3BX5C01
<400>24
ggttttgata atggtggtga tattgatgtg        30
<210>25
<211>246
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Fd链；3BX5C01
<400>25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Phe Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Tyr Tyr Phe Thr Tyr Ala Leu Gln Pro Met Asp His Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
        115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
    130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
                165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
            180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
        195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
    210                 215                 220
Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Pro
225                 230                 235                 240
His His His His His His
                245
<210>26
<211>738
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Fd链；3BX5C01
<400>26
caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60
agctgcaaag gttccggata ttcctttact tcttatggta tttcttgggt gcgccagatg 120
cctgggaagg gtctcgagtg gatgggcatg atcgatccgt ctgatagctt taccacttat 180
tctccgagct ttcagggcca ggtgaccatt agcgcggata aaagcattag caccgcgtat 240
cttcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat acggccatgt attattgcgc gcgtggttat 300
tattttactt atgctcttca gcctatggat cattggggcc aaggcaccct ggtgacggtt 360
agctcagcgt cgaccaaagg tccaagcgtg tttccgctgg ctccgagcag caaaagcacc 420
agcggcggca cggctgccct gggctgcctg gttaaagatt atttcccgga accagtcacc 480
gtgagctgga acagcggggc gctgaccagc ggcgtgcata cctttccggc ggtgctgcaa 540
agcagcggcc tgtatagcct gagcagcgtt gtgaccgtgc cgagcagcag cttaggcact 600
cagacctata tttgcaacgt gaaccataaa ccgagcaaca ccaaagtgga taaaaaagtg 660
gaaccgaaaa gcgaattcga gcagaagctg atctctgagg aggatctgaa cggcgcgccg 720
caccatcatc accatcac                                               738
<210>27
<211>122
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH；3BX5C01
<400>27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Phe Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Tyr Tyr Phe Thr Tyr Ala Leu Gln Pro Met Asp His Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>28
<211>366
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH；3BX5C01
<400>28
caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60
agctgcaaag gttccggata ttcctttact tcttatggta tttcttgggt gcgccagatg 120
cctgggaagg gtctcgagtg gatgggcatg atcgatccgt ctgatagctt taccacttat 180
tctccgagct ttcagggcca ggtgaccatt agcgcggata aaagcattag caccgcgtat 240
cttcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat acggccatgt attattgcgc gcgtggttat 300
tattttactt atgctcttca gcctatggat cattggggcc aaggcaccct ggtgacggtt 360
agctca                                                            366
<210>29
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR1；3BX5C01
<400>29
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser
 1               5                  10
<210>30
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR1；3BX5C01
<400>30
ggatattcctttacttctta tggtatttct                           30
<210>31
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR2；3BX5C01
<400>31
Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Phe Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
 1               5                  10                  15
Gly
<210>32
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR2；3BX5C01
<400>32
atgatcgatc cgtctgatag ctttaccact tattctccga gctttcaggg c    51
<210>33
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR3；3BX5C01
<400>33
Gly Tyr Tyr Phe Thr Tyr Ala Leu Gln Pro Met Asp His
 1               5                  10
<210>34
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR3；3BX5C01
<400>34
ggttattatt ttacttatgc tcttcagcct atggatcat                   39
<210>35
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL；3CX2A06
<400>35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Tyr Asp Leu Pro Asn
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Ala
    210
<210>36
<211>642
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LC；3CX2A06
<400>36
gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60
attacctgca gagcgagcca gaatattaat tcttatctga attggtacca gcagaaacca 120
ggtaaagcac cgaaactatt aatttatgct gcttcttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180
cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240
gaagactttg cggtttatta ttgccttcag aattatgatc ttcctaatac ctttggccag 300
ggtacgaaag ttgaaattaa acgtacggtg gctgctccga gcgtgtttat ttttccgccg 360
agcgatgaac aactgaaaag cggcacggcg agcgtggtgt gcctgctgaa caacttttat 420
ccgcgtgaag cgaaagttca gtggaaagta gacaacgcgc tgcaaagcgg caacagccag 480
gaaagcgtga ccgaacagga tagcaaagat agcacctatt ctctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaaag cggattatga aaaacataaa gtgtatgcgt gcgaagtgac ccatcaaggt 600
ctgagcagcc cggtgactaa atcttttaat cgtggcgagg cc                    642
<210>37
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR1；3CX2A06
<400>37
Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Ser Tyr Leu Asn
 1               5                  10
<210>38
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR1；3CX2A06
<400>38
agagcgagcc agaatattaa ttcttatctg aat                              33
<210>39
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR2；3CX2A06；3CX3D02
<400>39
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
 1               5
<210>40
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR2；3CX2A06；3CX3D02
<400>40
gctgcttctt ctttgcaaag c                      21
<210>41
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR3；3CX2A06
<400>41
Leu Gln Asn Tyr Asp Leu Pro Asn Thr
 1               5
<210>42
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR3；3CX2A06
<400>42
cttcagaatt atgatcttcc taatacc                27
<210>43
<211>241
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Fd链；3CX2A06
<400>43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Phe
            20                  25                  30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser Trp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Asp Gly Gln Asp Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
        115                 120                 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
    130                 135                 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
            180                 185                 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
        195                 200                 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Glu Phe Glu Gln Lys
    210                 215                 220
Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Pro His His His His His
225                 230                 235                 240
His
<210>44
<211>723
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Fd链；3CX2A06
<400>44
caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60
agctgcaaag gttccggata ttccttttct aatttttgga ttgcttgggt gcgccagatg 120
cctgggaagg gtctcgagtg gatgggcatt atcgatccgt ctgatagctg gacccgttat 180
tctccgagct ttcagggcca ggtgaccatt agcgcggata aaagcattag caccgcgtat 240
cttcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat acggccatgt attattgcgc gcgtggtgat 300
ggtcaggatt ttgataattg gggccaaggc accctggtga cggttagctc agcgtcgacc 360
aaaggtccaa gcgtgtttcc gctggctccg agcagcaaaa gcaccagcgg cggcacggct 420
gccctgggct gcctggttaa agattatttc ccggaaccag tcaccgtgag ctggaacagc 480
ggggcgctga ccagcggcgt gcataccttt ccggcggtgc tgcaaagcag cggcctgtat 540
agcctgagca gcgttgtgac cgtgccgagc agcagcttag gcactcagac ctatatttgc 600
aacgtgaacc ataaaccgag caacaccaaa gtggataaaa aagtggaacc gaaaagcgaa 660
ttcgagcaga agctgatctc tgaggaggat ctgaacggcg cgccgcacca tcatcaccat 720
cac                                                               723
<210>45
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH；3CX2A06
<400>45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Phe
            20                  25                  30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser Trp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Asp Gly Gln Asp Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>46
<211>351
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH；3CX2A06
<400>46
caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60
agctgcaaag gttccggata ttccttttct aatttttgga ttgcttgggt gcgccagatg 120
cctgggaagg gtctcgagtg gatgggcatt atcgatccgt ctgatagctg gacccgttat 180
tctccgagct ttcagggcca ggtgaccatt agcgcggata aaagcattag caccgcgtat 240
cttcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat acggccatgt attattgcgc gcgtggtgat 300
ggtcaggatt ttgataattg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a          351
<210>47
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR1；3CX2A06
<400>47
Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Phe Trp Ile Ala
 1               5                  10
<210>48
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR1；3CX2A06
<400>48
ggatattcct tttctaattt ttggattgct    30
<210>49
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR2；3CX2A06
<400>49
Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser Trp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
 1               5                  10                  15
Gly
<210>50
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR2；3CX2A06
<400>50
attatcgatc cgtctgatag ctggacccgt tattctccga gctttcaggg c    51
<210>51
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR3；3CX2A06
<400>51
Gly Asp Gly Gln Asp Phe Asp Asn
 1               5
<210>52
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR3；3CX2A06
<400>52
ggtgatggtc aggattttga taat                                 24
<210>53
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>LC；3CX3D02
<400>53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Thr Trp
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Ser Ser Leu Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Ala
    210
<210>54
<211>642
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LC；3CX3D02
<400>54
gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60
attacctgca gagcgagcca gactatttct acttggctga attggtacca gcagaaacca 120
ggtaaagcac cgaaactatt aatttatgct gcttcttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180
cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240
gaagactttg cgacttatta ttgccttcag gattcttctc ttcctcttac ctttggccag 300
ggtacgaaag ttgaaattaa acgtacggtg gctgctccga gcgtgtttat ttttccgccg 360
agcgatgaac aactgaaaag cggcacggcg agcgtggtgt gcctgctgaa caacttttat 420
ccgcgtgaag cgaaagttca gtggaaagta gacaacgcgc tgcaaagcgg caacagccag 480
gaaagcgtga ccgaacagga tagcaaagat agcacctatt ctctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaaag cggattatga aaaacataaa gtgtatgcgt gcgaagtgac ccatcaaggt 600
ctgagcagcc cggtgactaa atcttttaat cgtggcgagg cc                    642
<210>55
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR1；3CX3D02
<400>55
Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Thr Trp Leu Asn
 1               5                  10
<210>56
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR1；3CX3D02
<400>56
agagcgagcc agactatttc tacttggctg aat    33
<210>57
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR3；3CX3D02
<400>57
Leu Gln Asp Ser Ser Leu Pro Leu Thr
 1               5
<210>58
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR3；3CX3D02
<400>58
cttcaggatt cttctcttcc tcttacc           27
<210>59
<211>244
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Fd链；3CX3D02
<400>59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Ser
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ala Leu Met Asp Val Trp Ala Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Glu Phe
    210                 215                 220
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Pro His His
225                 230                 235                 240
His His His His
<210>60
<211>732
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Fd链；3CX3D02
<400>60
caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60
agctgcaaag gttccggata ttcctttact aattcttgga ttggttgggt gcgccagatg 120
cctgggaagg gtctcgagtg gatgggcatt atctatccgt ctgatagcta taccatttat 180
tctccgagct ttcagggcca ggtgaccatt agcgcggata aaagcattag caccgcgtat 240
cttcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat acggccatgt attattgcgc gcgtggtggt 300
ggttattatt atgctcttat ggatgtttgg gcccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360
gcgtcgacca aaggtccaag cgtgtttccg ctggctccga gcagcaaaag caccagcggc 420
ggcacggctg ccctgggctg cctggttaaa gattatttcc cggaaccagt caccgtgagc 480
tggaacagcg gggcgctgac cagcggcgtg catacctttc cggcggtgct gcaaagcagc 540
ggcctgtata gcctgagcag cgttgtgacc gtgccgagca gcagcttagg cactcagacc 600
tatatttgca acgtgaacca taaaccgagc aacaccaaag tggataaaaa agtggaaccg 660
aaaagcgaat tcgagcagaa gctgatctct gaggaggatc tgaacggcgc gccgcaccat 720
catcaccatc ac                                                     732
<210>61
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH；3CX3D02
<400>61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Ser
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ala Leu Met Asp Val Trp Ala Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>62
<211>360
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH；3CX3D02
<400>62
caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60
agctgcaaag gttccggata ttcctttact aattcttgga ttggttgggt gcgccagatg 120
cctgggaagg gtctcgagtg gatgggcatt atctatccgt ctgatagcta taccatttat 180
tctccgagct ttcagggcca ggtgaccatt agcgcggata aaagcattag caccgcgtat 240
cttcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat acggccatgt attattgcgc gcgtggtggt 300
ggttattatt atgctcttat ggatgtttgg gcccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360
<210>63
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR1；3CX3D02
<400>63
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Ser Trp Ile Gly
 1               5                  10
<210>64
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR1；3CX3D02
<400>64
ggatattcct ttactaattc ttggattggt                        30
<210>65
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR2；3CX3D02
<400>65
Ile Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
 1               5                  10                  15
<210>66
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR2；3CX3D02
<400>66
attatctatc cgtctgatag ctataccatt tattctccga gctttcag    48
<210>67
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR3；3CX3D02
<400>67
Gly Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ala Leu Met Asp Val
 1               5                  10
<210>68
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR3；3CX3D02
<400>68
ggtggtggtt attattatgc tcttatggat gtt                    33
<210>69
<211>212
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>LC；3CX4B08
<400>69
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
 1               5                  10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Pro Thr Tyr Tyr Val
            20                  25                  30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Ser Asp Thr Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Asn His Gly Tyr His
                85                  90                  95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala
            100                 105                 110
Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala
        115                 120                 125
Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala
    130                 135                 140
Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val
145                 150                 155                 160
Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser
                165                 170                 175
Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr
            180                 185                 190
Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala
        195                 200                 205
Pro Thr Glu Ala
    210
<210>70
<211>636
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LC；3CX4B08
<400>70
gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60
tcgtgtagcg gcgattctat tcctacttat tatgttgctt ggtaccagca gaaacccggg 120
caggcgccag ttcttgtgat ttattctgat actgatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180
tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240
gacgaagcgg attattattg ccagtctttt gataatcatg gttatcatgt gtttggcgga 300
ggcacgaagt taaccgttct tggccagccg aaagccgcac cgagtgtgac gctgtttccg 360
ccgagcagcg aagaattgca ggcgaacaaa gcgaccctgg tgtgcctgat tagcgacttt 420
tatccgggag ccgtgacagt ggcctggaag gcagatagca gccccgtcaa ggcgggagtg 480
gagaccacca caccctccaa acaaagcaac aacaagtacg cggccagcag ctatctgagc 540
ctgacgcctg agcagtggaa gtcccacaga agctacagct gccaggtcac gcatgagggg 600
agcaccgtgg aaaaaaccgt tgcgccgact gaggcc                           636
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<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR1；3CX4B08
<400>71
Ser Gly Asp Ser Ile Pro Thr Tyr Tyr Val Ala
 1               5                  10
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<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR1；3CX4B08
<400>72
agcggcgatt ctattcctac ttattatgtt gct    33
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR2；3CX4B08
<400>73
Ser Asp Thr Asp Arg Pro Ser
 1               5
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR2；3CX4B08
<400>74
tctgatactg atcgtccctc a                 21
<210>75
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR3；3CX4B08
<400>75
Gln Ser Phe Asp Asn His Gly Tyr His Val
 1               5                  10
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<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR3；3CX4B08
<400>76
cagtcttttg ataatcatgg ttatcatgtg                               30
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<211>241
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Fd链；3CX4B08
<400>77
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Phe Ile Ser Ser Ser Ser Ser Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Tyr Gly Asp Met Val Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
        115                 120                 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
    130                 135                 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
            180                 185                 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
        195                 200                 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Glu Phe Glu Gln Lys
    210                 215                 220
Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Pro His His His His His
225                 230                 235                 240
His
<210>78
<211>723
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Fd链；3CX4B08
<400>78
caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cctccggatt taccttttct aattatacta tgaattgggt gcgccaagcc 120
cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcttt atctcttctt cttctagcga gacctattat 180
gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtggttat 300
ggtgatatgg ttgatctttg gggccaaggc accctggtga cggttagctc agcgtcgacc 360
aaaggtccaa gcgtgtttcc gctggctccg agcagcaaaa gcaccagcgg cggcacggct 420
gccctgggct gcctggttaa agattatttc ccggaaccag tcaccgtgag ctggaacagc 480
ggggcgctga ccagcggcgt gcataccttt ccggcggtgc tgcaaagcag cggcctgtat 540
agcctgagca gcgttgtgac cgtgccgagc agcagcttag gcactcagac ctatatttgc 600
aacgtgaacc ataaaccgag caacaccaaa gtggataaaa aagtggaacc gaaaagcgaa 660
ttcgagcaga agctgatctc tgaggaggat ctgaacggcg cgccgcacca tcatcaccat 720
cac                                                               723
<210>79
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH；3CX4B08
<400>79
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1                5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Phe Ile Ser Ser Ser Ser Ser Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Tyr Gly Asp Met Val Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>80
<211>351
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH；3CX4B08
<400>80
caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cctccggatt taccttttct aattatacta tgaattgggt gcgccaagcc 120
cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcttt atctcttctt cttctagcga gacctattat 180
gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtggttat 300
ggtgatatgg ttgatctttg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a          351
<210>81
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR1；3CX4B08
<400>81
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Thr Met Asn
1                5                  10
<210>82
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR1；3CX4B08
<400>82
ggatttacct tttctaatta tactatgaat    30
<210>83
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR2；3CX4B08
<400>83
Phe Ile Ser Ser Ser Ser Ser Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
 1               5                  10                  15
Gly
<210>84
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR2；3CX4B08
<400>84
tttatctctt cttcttctag cgagacctat tatgcggata gcgtgaaagg c    51
<210>85
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR3；3CX4B08
<400>85
Gly Tyr Gly Asp Met Val Asp Leu
 1               5
<210>86
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR3；3CX4B08
<400>86
ggttatggtg atatggttga tctt                                 24
<210>87
<211>326
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IgG2m4的Fc结构域
<400>87
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
 1               5                  10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val  Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser ger Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325
<210>88
<211>978
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IgG2m4的恒定区
<400>88
gcctccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgacctcca gcaactttgg cacgcagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgg 300
aaatgctgcg tggagtgccc accatgccca gcacctccag tggccggacc atcagtcttc 360
ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420
gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc 480
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600
aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660
cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccatgct ggactccgac 840
ggctccttct tcctctacag caagctaacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaat 900
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 960
tccctgtctc ctggtaaa                                               978
<210>89
<211>330
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有(contains)IgG1 Fc结构域
<400>89
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
 1               5                  10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>90
<211>326
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有IgG2 Fc结构域
<400>90
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
 1               5                  10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
3053                 10                 315                 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325
<210>91
<211>327
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有IgG4Fc结构域
<400>91
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
 1               5                  10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>92
<211>326
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有IgG2m4 Fc结构域
<400>92
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
 1               5                  10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
         35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325
<210>93
<211>109
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL；1CX1G08
<400>93
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
 1               5                  10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Thr Tyr Tyr Val
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Asn Thr Ser Phe Asn
                85                  90                  95
Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            100                 105
<210>94
<211>327
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VL；1CX1G08
<400>94
gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60
tcgtgtagcg gcgataatat tggtacttat tatgttcatt ggtaccagca gaaacccggg 120
caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat tctaatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180
tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240
gacgaagcgg attattattg cggtacttgg gataatactt cttttaatct tgtgtttggc 300
ggcggcacga agttaaccgt tcttggc                                     327
<210>95
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL；3BX5C01
<400>95
Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr
 1               5                  10                  15
Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Asp Tyr Ile Val His
            20                  25                  30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Asp
        35                  40                  45
Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn
    50                  55                  60
Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu Asp
65                  70                  75                  80
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Phe Asp Asn Gly Gly Asp Ile Asp Val
                85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            100                 105
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tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240
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ggcacgaagt taaccgttct tggc                                        324
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Thr Trp
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Ser Ser Leu Pro Leu
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Thr Trp
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Ser Ser Leu Pro Leu
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
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ggtacgaaag ttgaaattaa acgt                                        324
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Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
 1               5                  10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Pro Thr Tyr Tyr Val
            20                  25                  30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Ser Asp Thr Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Asn His Gly Tyr His
                85                  90                  95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            100                 105
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gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60
tcgtgtagcg gcgattctat tcctacttat tatgttgctt ggtaccagca gaaacccggg 120
caggcgccag ttcttgtgat ttattctgat actgatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180
tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240
gacgaagcgg attattattg ccagtctttt gataatcatg gttatcatgt gtttggcgga 300
ggcacgaagt taaccgttct tggc                                        324
1

Claims (14)

1.分离的PCSK9特异性拮抗剂，其拮抗PCSK9对细胞LDL摄取的抑制，其中所述PCSK9特异性拮抗剂是抗体或其抗原结合片段，并且其中所述抗体选自：
i)抗体，其中重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别如SEQ IDNO：13、15和17所示并且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别如SEQ ID NO：3、5和7所示；
ii)抗体，其中重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别如SEQ IDNO：29、31和33所示并且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别如SEQ ID NO：21、5和23所示；
iii)抗体，其中重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别如SEQ IDNO：47、49和51所示并且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别如SEQ ID NO：37、39和41所示；
iv)抗体，其中重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别如SEQ IDNO：63、65和67所示并且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别如SEQ ID NO：55、39和57所示；和
v)抗体，其中重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别如SEQ IDNO：81、83和85所示并且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别如SEQ ID NO：71、73和75所示。
2.如权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其中所述抗体的重链可变区如SEQ ID NO：79所示和/或所述抗体的轻链可变区如SEQ ID NO：101所示。
3.如权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其中所述抗体的重链区如SEQ ID NO：77所示和/或所述抗体的轻链区如SEQ ID NO：69所示。
4.如权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其中所述抗体的重链恒定序列如SEQ ID NO：87所示。
5.组合物，其包含权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂和药学上可接受的载体。
6.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂在制备用于拮抗PCSK9功能的药物中的用途。
7.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂在制备药物中的用途，所述药物用于改善由PCSK9功能引起和/或加剧的紊乱、病症或疾病。
8.编码权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂的重链可变区和轻链可变区的分离的核酸。
9.如权利要求8所述的分离的核酸，其编码抗体分子，其中：
(a)所述抗体分子的重链可变区由SEQ ID NO：80所示的核酸序列编码；和/或
(b)所述抗体分子的轻链可变区由SEQ ID NO：102所示的核酸序列编码。
10.如权利要求8所述的分离的核酸，其编码抗体分子，其中：
(a)所述抗体分子的重链区由SEQ ID NO：78所示的核酸序列编码；和/或
(b)所述抗体分子的轻链区由SEQ ID NO：70所示的核酸序列编码。
11.包含权利要求8所述的核酸的载体。
12.体外或原位的分离的宿主细胞或宿主细胞群体，其包含权利要求8所述的核酸。
13.产生PCSK9特异性拮抗剂的方法，其包括：
(a)在适于产生PCSK9特异性拮抗剂的条件下培养权利要求12所述的细胞或细胞群体；和
(b)分离所产生的PCSK9特异性拮抗剂。
14.体外或原位的分离的宿主细胞或宿主细胞群体，其包含权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂。
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