CN113876955B

CN113876955B - Pcsk9抑制剂在制备促进毛发生长产品中的应用

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Publication number: CN113876955B
Application number: CN202110681800.4A
Authority: CN
Inventors: 陈敏; 请求不公布姓名
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Priority date: 2020-07-01
Filing date: 2021-06-19
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2041-06-19
Also published as: CN113876955A

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及前蛋白转化酶枯草杆菌转化酶（PCSK9）在促进毛发生长中的作用，以及PCSK9抑制剂在制备治疗脱发性疾病的产品中的应用。其特征在于所述PCSK9抑制剂为PCSK9小分子化合物或PCSK9干扰RNA或PCSK9单克隆抗体或PCSK9模拟肽或PCSK9模拟抗体蛋白或PCSK9反义寡核苷酸或PCSK9疫苗，在制备治疗脱发性疾病的产品中的应用。可进一步开发出系统或外用的PCSK9抑制剂产品，用于治疗脱发性疾病。这些产品疗效显著，不良反应小。

Description

PCSK9抑制剂在制备促进毛发生长产品中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及PCSK9在促进毛发生长中的作用，以及 PCSK9抑制剂在制备治疗脱发性疾病的产品中的应用。

背景技术

斑秃(alopecia areata，AA)是一种非瘢痕性脱发，局部皮肤大体正常。通常情况下为突发的脱发斑，严重时可累及整个头皮，此时称为全秃(alopecia totalis， AT)，当累及包括腋毛、阴毛在内的全身所有毛发时，称为普秃(alopecia universalis，AU)，容易给患者的容貌和心理带来严重的影响。斑秃的病程较长，但预后较好，越早介入治疗，治愈几率越高。目前病因尚未完全明了，自身免疫功能异常或不稳定、神经精神因素被认为是重要相关因素。不少病例发病前有神经精神创伤，如长期焦急、忧虑、悲伤、精神紧张和情绪不安等现象。有时病人在病程中，这些精神因素可使病情迅速加重。斑秃的治愈机率较高，但不同病因引起的斑秃，治愈概率有很大区别。部分斑秃患者，即便没有采取任何治疗措施，也可以自然痊愈，还有部分斑秃患者持续数年的治疗，也仅能维持病情不再发展。米诺地尔是一种治疗斑秃常见的外用药物，可促进皮肤血管扩张、改善局部血液循环、促进毛发生长。严重斑秃常用的糖皮质激素，主要包括泼尼松龙、复方倍他米松等等，可以口服、外用或皮内注射。对于不适用糖皮质激素类药物的患者，可采用免疫抑制剂治疗，常见的药物有环孢素、甲氨蝶呤。糖皮质激素和免疫抑制剂副作用多。

雄激素源性秃发(AGA)是一种雄激素依赖性的遗传性毛发脱落，是常见病、多发病。多为20～30岁左右的男性发病。脱发主要在头顶部，多先从前额两侧发际开始，也有自顶部开始者。脱发区逐渐向上扩延，头发也渐变得稀少纤细，终而头顶部头发大部或全部脱落，但枕后及双侧颞上方头发依存，呈马蹄形外观，此带形区内头发保持正常。脱发处皮肤光亮，毛孔缩小或残留少许细软毳毛。脱发的速度、范围和严重程度，受遗传和个体影响。一般30岁左右发展最快，严重全秃者少见。女性多为发生于头顶的弥漫性脱发，头顶头发变稀疏。我国流行病学调查显示男性雄激素性脱发患病率为21.3％，女性为6.0％。雄激素性脱发的病因及发病机制尚不明确，一般认为雄激素及其受体在本病的发生中起关键作用，Ⅱ型5a-还原酶是其发病的重要因素。正常生理状态下，雄激素在体内对毛发的生长发育起一定的刺激促进作用，但在某些特定部位能诱导毛发脱失；睾酮是体内主要的雄激素，它经5a-还原酶转化为二氢睾酮，后者可引起终毛向毳毛转变，最终导致脱发。目前尚无理想治疗方法，全身及局部治疗可参照其他脱发性疾病处理。雄激素性秃发是脱发性疾病难治的类型，该病的动物模型通常作为脱发性疾病的代表模型。由于雄激素在发病中起很大作用，因而近年来的新治疗方法企图通过抗雄激素的效应来终止毛囊的变小。米诺地尔是一种非特异性治疗脱发的药物，是FDA批准用于治疗脱发的一线外用药物，但使用过程中可能引起面部和四肢多毛症，停用后治疗效果逐渐消失。非那雄胺是一种Ⅱ型 5a-还原酶选择性抑制剂，FDA批准口服非那雄胺用于治疗雄激素性脱发，可持续改善头发的生长情况，但非那雄胺存在引起性功能异常，精子一过性减少和男性乳房发育异常等不良反应，在动物实验中发现有致畸作用，故不宜用于小儿和育龄妇女。西咪替丁需连服5个月或更久，副作用为男性乳房发育、阳痿、性欲降低等。口服避孕药：主要有的索高诺酮、左炔诺孕酮(左旋甲基炔诺孕酮)、炔诺孕酮、炔诺酮、诺孕酯(肟炔诺酯)、双酯炔诺醇和醋炔诺酮等。常用来治疗女性AGA，治疗6～12个月后头发会有所改善。

抗肿瘤药物引起的脱发是最常见的生长期秃发，抗肿瘤药物在消除迅速分裂的癌细胞的同时，也攻击毛囊四周迅速分裂的细胞引起脱发。

脱发治疗较困难，容易反复。米诺地尔是一种非特异性的治疗脱发药物，是FDA批准用于治疗脱发的一线外用药物，但使用过程中可能引起面部和四肢多毛症，停用后治疗效果逐渐消失。非那雄胺是一种Ⅱ型5a-还原酶选择性抑制剂，FDA批准用于治疗SA，可持续改善头发的生长情况，但存在引起性功能异常，精子一过性减少和男性乳房发育异常等不良反应。因此，需要寻找更多安全、有效的治疗脱发的药物和产品。

前蛋白转化酶枯草杆菌转化酶(proprotein convertase subtilisin/kexintype 9, PCSK9)是前蛋白转换酶家族中的一员，前蛋白转换酶在肝脏内作为一种不活跃酶原分泌。PCSK9基因cDNA的大小为3617bp，编码692个氨基酸组成的PCSK9 蛋白。PCSK9前体在内质网内经过分子内自动催化分离其N-末端前肽，分离后的N-末端前区与催化区相连，允许成熟的PCSK9蛋白离开内质网并进入分泌途径。PCSK9分泌至细胞外后，在细胞表面的第一表皮生长因子样区域与低密度脂蛋白(LDL)受体结合，PCSK9-LDL受体复合体可进入溶酶体降解，从而导致细胞表面LDL受体下降，即PCSK9水平与LDL受体成负相关关系。而多项研究显示，PCSK9基因的突变功能丧失可使不同人种的LDL-C水平及冠心病发生率明显下降。鉴于抑制PCSK9对降低LDL-C及冠心病发生率的显著作用，已有多项治疗方案正在研发阻断PCSK9的药物，用于降低LDL-C及冠心病的发生率。

PCSK9抑制剂包括两大类：1、阻止PCSK9与LDL-R的结合，如单抗、模拟肽(多肽抑制剂)、模拟抗体蛋白药；2、抑制PCSK9分子的表达或干扰PCSK9 分泌，如小分子干扰RNA、反义寡核苷酸、小分子化合物抑制剂等。单克隆抗体由于阻断效率高、靶位准确和稳定性好而成为新药研究的热点。目前，全球上市的PCSK9靶向单抗药物，均为阻止PCSK9与LDL-R结合的药物。包括安进 (Amgen)和安斯泰来(Astellas)联合开发的的evolocumab(依洛尤单抗)，商品名 Repatha(瑞百安)；赛诺菲(Sanofi)和再生元(Regeneron)联合开发的alirocumab(阿利西尤单抗，阿利珠单抗)，商品名Praluent(波立达)，以及Eli lilly公司的LY3015014，君实生物的重组人源化抗PCSK9单克隆抗体(JS002)，和信立泰药业的重组全人源抗PCSK9单克隆抗体注射液。临床研究发现，以上药物治疗高胆固醇血症耐受性良好，安慰剂组与积极治疗组不良反应的发生率无明显区别。此外，Inclisiran是一款siRNA(小干扰RNA)药物，不同于直接与PCSK9分子结合的单抗，它可以抑制PCSK9基因的表达，使LDL受体不会因PCSK9而被降解，从而改善肝细胞对LDL颗粒的摄取，降低血液中的LDL水平。Alnylam 公司的Inclisiran采用专有技术，由脂质纳米颗粒与GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)结合而成，而GalNAc可与肝细胞表面表达的唾液酸糖蛋白受体ASGR1和ASGR2 结合。该技术允许皮下给药并靶向肝脏。Affiris公司的ALN-PCS和ALN-PCSsc 也属于siRNA(小干扰RNA)药物。PCSK9干扰RNAI抑制剂药物还有Alnylam 公司的Inclisran，Affiris公司的ALN-PCS和ALN-PCSsc。辉瑞公司设计的一种相关的疫苗药物，以及Affiris公司的AT04A和AT06A疫苗，患者只需每年接受一次疫苗即可达到长期降低LDL的效果，可以减少使用频率。PCSK9模拟肽和 PCSK9模拟抗体蛋白药药物研发包括Pieris公司的DS9001和Merck公司的1G08 等。PCSK9反义寡核苷酸药物包括Santaris Pharma公司的SPC5001。

到目前为止，尚未见到应用PCSK9抑制剂治疗脱发的相关文献、专利和产品。我们首次发现敲出PCSK9基因能够明显促进毛发生长，PCSK9抑制剂能够治疗各种原因导致的脱发，促进毛发生长作用明显。

发明内容

本发明需要解决的问题是：明确PCSK9基因在脱发发病机制中的作用，以及 PCSK9抑制剂在制备治疗脱发的产品中的应用。本发明通过斑秃或雄激素性脱发动物模型实验研究，发现了PCSK9在脱发发病机制中的关键作用，以及PCSK9 抑制剂在制备促进毛发生长产品中的应用。

本发明的技术方案

C57BL/6小鼠是目前国内外广泛应用的研究毛发周期的动物模型：人类各个毛囊的毛发周期不同步，而该小鼠可表现出独特的毛发周期同步性，故它常用来作为毛发研究模型。该小鼠躯干皮肤的黑素细胞只存在于毛囊中，而且仅在生长期时合成黑色素；在毛发的生长期，由于毛球部黑素细胞不断产生黑素，并传递给毛囊角质形成细胞，使皮肤外观呈现黑色；退行期时，黑素生成减少，皮肤呈灰黑色；在休止期由于毛球部微缩消失，毛囊停止生成黑素，皮肤变为粉红色。休止期的毛发经拔除后局部可被诱导出高度同步的新毛发周期，组织学上同该鼠自然周期变化一致。故可从皮肤颜色的变化来推断毛发周期的改变。

本发明采用了皮下注射丙酸睾酮注射液造成实验性雄激素性脱发模型，发现PCSK9基因敲出能明显促进雄激素性脱发模型小鼠毛发生长，减轻对皮下毛囊和皮脂腺的损伤。本发明采用石蜡脱毛建立小鼠非特异性脱发模型，证实 PCSK9抑制剂对毛发生长具有非常明显的促进作用。本发明又通过雄激素性脱发模型实验，发现PCSK9抑制剂组小鼠毛发生长速度明显快于模型对照组。以上实验证实PCSK9抑制剂在治疗脱发性疾病中的作用和机制。

本发明在能够明显阻断PCSK9的制剂中，分别选取了具有代表性的单克隆抗体、多肽抑制剂、小分子化合物抑制剂和PCSK9小干扰RNA，通过皮下注射或者皮肤外用治疗小鼠脱发模型，与空白对照组比较。结果发现，PCSK9抑制剂组疗效均明显优于模型对照组，各组均未出现明显不良反应。实验证实，系统或外用PCSK9抑制剂对毛发生长具有明显的促进作用。

基于上述研究，本发明涉及了PCSK9抑制剂(阻断剂)在制备治疗脱发性疾病的产品中的应用，其中所述PCSK9属前蛋白转换酶家族(genebank序列号：255738)；所述脱发性疾病包括雄激素性脱发或斑秃或抗肿瘤治疗引起的脱发等。

本发明所述的PCSK9抑制剂可以为常规的任何的分子生物学或者药物化学手段能够抑制PCSK9基因表达或者分泌作用的产品或方法，例如但不限于通过现有分子生物学技术对PCSK9基因进行敲除或者沉默；在一些实施例中，还可以为或者采用PCSK9抑制剂，优选的，上述PCSK9抑制剂(阻断剂)为PCSK9 小分子化合物或PCSK9干扰RNAI抑制剂或PCSK9单克隆抗体或PCSK9模拟肽或PCSK9模拟抗体蛋白或PCSK9反义寡核苷酸或PCSK9疫苗。

在一些实例中，本发明所述的PCSK9小分子化合物抑制剂包括但不限于 Selleck公司产品R-IMPP，化学式：C₂₄H₂₇N₃O₂，分子量：389.49，结构式：

或Selleck公司产品PF-06446846，化学式： C₂₂H₂₁N₇O，分子量：434.5，结构式：

或Selleck公司产品 SBC-115076，化学式：C₃₁H₃₃N₃O₅，分子量：527.61，结构式：

或Selleck公司产品SBC-110736，化学式：C₂₆H₂₇N₃O₂，分子量：413.51，结构式：

在一些实例中，本发明所述的PCSK9单克隆抗体抑制剂包括但不限于 Abcam公司ab84041，或安进(Amgen)和安斯泰来(Astellas)联合开发的 evolocumab(依洛尤单抗)，或赛诺菲(Sanofi)和再生元(Regeneron)联合开发的 alirocumab(阿利西尤单抗，阿利珠单抗)，或君实生物的重组人源化抗PCSK9单克隆抗体(JS002)，或信立泰药业的重组全人源抗PCSK9单克隆抗体注射液，或Eli lilly公司的LY3015014。

在一些实例中，本发明所述的PCSK9干扰RNAi抑制剂包括但不限于 Alnylam公司的Inclisran，Affiris公司的ALN-PCS和ALN-PCSsc。

在一些实例中，本发明所述的PCSK9模拟肽抑制剂和PCSK9模拟抗体蛋白抑制剂包括但不限于Pieris公司的DS9001和Merck公司的1G08等。

在一些实例中，本发明所述的PCSK9反义寡核苷酸抑制剂包括但不限于 SantarisPharma公司的SPC5001。

在一些实例中，本发明所述的PCSK9疫苗抑制剂包括但不限于Affiris公司的AT04A和AT06A。

本领域技术人员公知，基于以上PCSK9的作用机制，PCSK9抑制剂对其他脱发性疾病也具有治疗作用。PCSK9抑制剂可以单独使用，也可以联合其他药物或者治疗方法一起使用，包括传统药物和其他靶向生物制剂。

本发明还提供一种药物组合物，以本发明所述化合物或其药学上可接受的盐为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体组成。

本发明所述的化合物或组合物可制备为药学上允许的任何剂型，例如为适于口服、肠胃外、腹膜内、静脉内、动脉内、透皮、舌下、肌内、直肠、透颊、鼻内、吸入、阴道、眼内、局部、皮下、脂肪内、关节内、腹膜内或鞘内任意给药方式的制剂。

在一种优选的实施方式中，本发明所述的剂型为膏剂、片剂、冲剂、口服液剂、胶囊剂、滴丸剂、灌肠剂、膜剂或注射剂。

本发明所述的“产品”，可以为任何适合于根据药学领域中常用的方法施用至患者的制剂，例如药品。

本发明所述的产品可以施用于哺乳动物，例如大鼠、小鼠、家畜、人等；在一些具体实例中为人。

本发明与现有技术相比其有益效果是：本发明为脱发性疾病的治疗提供了新的、更好的治疗方法，通过本发明的揭示可进一步制备系统或外用的PCSK9 抑制剂(阻断剂)产品，进而开发出包含各类PCSK9抑制剂的单体新药或复方制剂，用于治疗各类型脱发性疾病，包括雄激素性脱发或斑秃。已经有的临床实验证明此类包含PCSK9抑制剂的药物疗效显著、不良反应小、患者耐受性好，尤其是仅仅外用也能明显改善脱发症状，非常适宜于实际临床需求。可为市场提供一系列价格较低，疗效好，安全的新产品。

具体实施方式：

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明，均属于本发明的保护范围。

实施例1 PCSK9基因敲出对雄性激素性脱发(SA)的影响

1.实验方法

1.1动物分组与造模

实验动物：SPF级C57BL/6(B6)小鼠，C57BL/6-PCSK9-/-小鼠(利用CRISPR基因编辑技术，敲除Pcsk9基因exon 2-3，建立Pcsk9基因敲除小鼠模型)，小鼠来源于南模生物。

将不同基因型小鼠分三组：C57BL/6小鼠阴性对照组、C57BL/6小鼠模型组和C57BL/6-PCSK9-/-小鼠模型组，每组6只，雌雄各3只。每只小鼠背部进行脱毛处理，作为观察区。除阴性对照组外，其他组小鼠颈后皮下注射丙酸睾酮注射液[8ml/(kg·d)]，每天1次，连续60d，建立SA模型。连续皮下注射丙酸睾丸酮30天后小鼠逐渐出现毛发脱落，证明雄性激素性脱发模型成功建立。观察毛发生长情况。

1.2观察指标及测试方法

每10天于每只小鼠背部观察区拔取10根毛发，用游标卡尺测量毛发长度。实验结束后，取实验观察区皮肤，进行常规组织脱水、石蜡包埋、HE染色，光镜镜检，观察小鼠皮肤毛囊和皮脂腺组织病理学改变。对各组病变进行半定量分析。分级标准如下：皮肤真皮组织细胞和皮下毛囊、皮脂腺结构正常记为“一”：皮肤真皮未见有增生，毛囊、皮脂腺病变局限，皮下未见有炎症记为“±”：皮肤真皮组织未见有明显增生，毛囊明显囊性变.皮脂腺未见有明显增生，皮下未见有炎症记为“+”：皮肤真皮组织有节段性增生，不明显，少部分毛囊有囊性变，皮脂腺有轻度增生肥大.皮下未见有明显炎症记为“++”：皮肤真皮组织细胞有不同程度节段性增生，部分毛囊囊性变，表现毛囊大小不均匀，周边部无细胞。皮脂腺有增生，增生腺体内细胞核较少，个别小鼠皮下有轻度炎性增生记为“+++”。

2.实验结果

2.1对小鼠毛发生长的影响

C57BL/6-PCSK9-/-小鼠模型组在建模第10、20、30天的毛发长度均长于C57BL/6(B6)小鼠模型组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1

表1各组小鼠毛发生长长度

*为与C57BL/6(B6)小鼠组模型组比较P<0.01

2.2对小鼠观察区皮肤组织真皮浅层毛囊形态的影响

C57BL/6(B6)小鼠模型组部分皮肤真皮组织细胞有不同程度节段性增厚，皮下有轻度淋巴细胞增生；部分小鼠皮下毛囊有明显囊性变，毛囊大小不等，周边有轻度纤维化，毛囊周边细胞消失或细胞层次明显减少，皮脂腺数目增多，部分腺体有肥大，肥大腺体细胞核明显减少，正常毛囊数减少。C57BL/6-PCSK9-/-小鼠模型组皮肤真皮组织细胞及皮下毛囊、皮脂腺病变与C57BL/6小鼠模型组比较有不同程度减轻，皮肤损伤毛囊数明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2各组对小鼠皮肤毛囊和皮脂腺的影响(只)

*为与C57BL/6(B6)小鼠组模型组比较P<0.01

3.实验结论

PCSK9基因敲出能明显促进雄性激素性脱发模型小鼠毛发生长，减轻对皮下毛囊和皮脂腺的损伤。

实施例2 PCSK9抑制剂对小鼠毛发生长的影响

1.实验方法

1.1材料

(1)PCSK9干扰RNAI抑制剂-1序列及修饰

基因	5'-3'Sense	5'-3'Antisense
			siPCSK9-1	GccuGGAGuuuAuucGGAAdT*dT	UUCCgAAuAAACUCcAGGCdT*dT
siPCSK9-2	AGGuGuAucuccuAGAcAcdT*dT	GUGUCuAGGAGAuAcACCUdT*dT

将siPcsk9-1和2等量混合后用生理盐水稀释至20μM，取稀释后siRNA与润肤液均匀混合。

PCSK9干扰RNAi抑制剂-2：RNA序列与Alnylam公司的Inclisran相同； PCSK9干扰RNAi抑制剂-3：RNA序列与Affiris公司的ALN-PCS相同。

(2)PCSK9小分子化合物抑制剂1：Selleck公司产品R-IMPP，化学式： C₂₄H₂₇N₃O₂，分子量：389.49，结构式：

PCSK9小分子化合物抑制剂2：Selleck公司产品PF-06446846，化学式：C₂₂H₂₁N₇O，分子量： 434.5，结构式：

PCSK9小分子化合物抑制剂3：Selleck公司产品SBC-115076，化学式：C₃₁H₃₃N₃O₅，分子量：527.61，结构式：

PCSK9小分子化合物抑制剂4：Selleck公司产品SBC-110736，化学式：C₂₆H₂₇N₃O₂，分子量：413.51，结构式：

(3)PCSK9单克隆抗体1：购于Abcam公司(ab84041)；PCSK9单克隆抗体2：安进(Amgen)和安斯泰来(Astellas)联合开发的evolocumab(依洛尤单抗)，商品名Repatha(瑞百安)；PCSK9单克隆抗体3：赛诺菲(Sanofi)和再生元 (Regeneron)联合开发的alirocumab(阿利西尤单抗，阿利珠单抗)，商品名 Praluent(波立达)。

(4)PCSK9多肽购于Abcam公司(ab32727)。

治疗溶液制备方法：60％乙醇分别与适量以上PCSK9抑制剂混匀配制成不同浓度溶液。

1.2动物分组与造模

选取SPF级C57BL/6小鼠，按体重编号，采用随机排列表法分为化合物组1(皮肤涂抹2％R-IMPP溶液)、化合物组2(皮肤涂抹2％PF-06446846溶液)、化合物组3(皮肤涂抹2％SBC-115076溶液)、化合物组4(皮肤涂抹2％SBC-110736 溶液)、单抗1组(皮下注射PCSK9单克隆抗体ab84041，5mg/kg.d)、单抗2 组(皮下注射evolocumab，5mg/kg.d)、单抗3组(皮下注射alirocumab，5mg/kg.d)、 PCSK9干扰RNAi抑制剂组-1(皮肤涂抹2％PCSK9小干扰RNA-1溶液)、PCSK9 干扰RNAi抑制剂组-2(皮肤涂抹2％PCSK9小干扰RNA-2溶液)、PCSK9干扰RNAI抑制剂组-3(皮肤涂抹2％PCSK9小干扰RNA-3溶液)、多肽组(皮下注射Abcam公司ab32727,3mg/kg.d)、阳性对照组(皮肤涂抹2％米诺地尔溶液)、阴性对照组(皮肤涂抹60％乙醇)、模型对照组(皮肤涂抹60％乙醇)，每组10 只，雌雄各半。小鼠经乙醚麻醉后用松香/石蜡混合物(1:1)热融化后涂于背部，待凝固变硬后揭去，以小鼠背部光滑，无伤无毛根为净，脱毛面积约3cm×4cm。脱毛后第2日起分别于脱毛区涂抹相应药物，每日2次，每次0.5mL/只。

1.3观察指标及测试方法

1.3.1肉眼观察

涂药后第2天起，观察小鼠背部拔毛部位皮肤每天颜色的变化确定毛囊的生长状态以及肉眼直观观察脱毛区毛发生长情况，每日对每鼠脱毛区新毛生长状况评分 1次。各组预留5只小鼠肉眼观察40天，并记录背部毛发生长情况。

1.3.2组织学观察实验

第17天各组分别颈椎脱臼处死5只小鼠，背部平行脊柱相同部位取材，10％甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，中性树胶封片，光镜下观察毛囊组织学变化并对毛囊进行形态学分期。依据国际毛发周期评分法，对各期毛囊作以下评分：生长Ⅵ期为100分，退行早期为200分，退行中期为300分，退行晚期为400分。每只小鼠随机选择50个毛囊，确定各组毛囊所处的周期，计算平均毛发周期评分及生长期VI期、退行早期、退行中期、退行晚期毛囊所占百分比。

1.4统计学方法实验数据采用SPSS 16.0系统软件进行统计学处理。实验数据统计变量以(x±s) 表示，采用χ2检验和t检验，α值取双侧，P>0.05表示差异无显著性，P<0.05表示差异有显著性，P<0.01为差异有显著性。

2.实验结果

2.1肉眼观察小鼠拔毛部位的变化

C57BL/6小鼠在拔毛后，造模局部可被诱导出高度同步的新生毛发周期，即在拔毛后第1～5天虽然拔毛局部仍然为粉红色，但组织学上毛囊已呈现出生长Ⅰ～Ⅲ期的表现；第7天皮肤颜色变为黑色，组织学上毛囊已经进入生长Ⅳ期；第9～ 10天拔毛区组织学上毛囊为生长Ⅵ期，至拔毛后第18天局部皮肤变为灰黑色，组织学毛囊已呈退行期改变，到拔毛后第20天以后拔毛局部又变为粉红色，组织学毛囊则进入休止期。

在本实验中，阴性对照组与模型对照组小鼠于拔毛后第7天背部皮肤由粉红色变为黑色，拔毛后第17天左右背部皮肤颜色又由黑色变为灰黑色。而抑制剂组与阳性对照组小鼠于拔毛后第6天左右背部皮肤由粉红色变为黑色，拔毛后第20天左右背部皮肤颜色又由黑色变为灰黑色。具体变化时间见如表3。由表3可见，各抑制剂组小鼠拔毛区皮肤颜色变黑、变灰黑时间及黑色持续时间与阳性对照组相比，无显著性差异(P均＞0.05)，与阴性对照组、模型对照组相比均有极显著性差异(P均＜0.01)。提示PCSK9抑制剂有明显的延长毛囊生长期的作用。

表3各组小鼠背部拔毛区皮肤颜色变化时间(天)

注：*与阴性对照组、模型对照组比较，P＜0.01。

2.2小鼠背部拔毛区毛发的生长情况

阴性对照组与模型对照组小鼠拔毛后第11天左右背部拔毛区出现新生毛发，第37天左右拔毛区毛发与非实验区毛发长度一致。抑制剂组与阳性对照组小鼠拔毛后第7天左右背部拔毛区出现新生毛发，第19天左右拔毛区毛发与非实验区毛发长度一致。具体毛发生长时间见表4。由表4可见，抑制剂组小鼠新毛发生长速度与阳性对照组相比，无显著性差异(P均＞0.05)，抑制剂组与阴性对照组、模型对照组相比均有显著性差异(P均＜0.01)。提示抑制剂有明显的促毛发生长的作用。

表4各组小鼠背部拔毛区毛发生长时间(天)

注：*与阴性对照组、模型对照组比较均有显著性差异(P均＜0.01)

2.3毛囊组织学观察

拔毛后第17天可见阴性对照组与模型对照组毛囊基底变细，颜色变淡，毛囊下段退化，毛乳头变圆、致密，毛乳头和囊胚间上皮索形成，内毛根鞘部分消失，毛发呈杆状末端。而PCSK9抑制剂组与阳性对照组毛囊较大，较长，多数仍为生长VI期和退行早期毛囊。拔毛后第17天，PCSK9抑制剂组(单抗组、多肽组、化合物组、siPcsk9组)与阳性对照组平均毛发周期评分分别为158、167、165、168、172分、185分，提示生长VI期和退行早期毛囊。而阴性对照组与模型对照组平均毛发周期评分分别为306分、345分，对应于毛囊处于退行中晚期。抑制剂组(单抗组、多肽组、化合物组、siPcsk9组)、阳性对照组、阴性对照组和模型对照组生长Ⅵ期毛囊所占百分比分别为56％、52％、53％、47％、42％、13％和11％，抑制剂组与模型对照组生长Ⅵ期毛囊所占百分比比较均有显著性差异(P＜0.01)；抑制剂组与与阳性对照组生长Ⅵ期毛囊所占百分比均无显著性差异(P＞0.05)。提示PCSK9抑制剂有明显延长毛囊生长期、促进毛发生长的作用。

实施例3各种PCSK9抑制剂对雄性激素性脱发(SA)大鼠模型的影响

1.实验方法

1.1材料

(1)PCSK9干扰RNAi抑制剂-1序列及修饰

将siPcsk9-1和2等量混合后用生理盐水稀释至20μM，取稀释后siRNA与润肤液均匀混合。PCSK9干扰RNAi抑制剂-2：RNA与Alnylam公司的Inclisran同序列；PCSK9干扰RNAi抑制剂-3：RNA与Affiris公司的ALN-PCS同序列。

(2)PCSK9小分子化合物抑制剂1(Selleck公司产品R-IMPP)，化学式：C₂₄H₂₇N₃O₂，分子量：389.49，结构式：

PCSK9 小分子化合物抑制剂2(Selleck公司产品PF-06446846)，化学式：C₂₂H₂₁N₇O，分子量：434.5，结构式：

PCSK9小分子化合物抑制剂 3(Selleck公司产品SBC-115076)，化学式：C₃₁H₃₃N₃O₅，分子量：527.61，结构式：

PCSK9小分子化合物抑制剂4 (Selleck公司产品SBC-110736)，化学式：C₂₆H₂₇N₃O₂，分子量：413.51，结构式：

(4)PCSK9多肽购于Abcam公司(ab32727)。

治疗溶液制备方法：75％乙醇分别与适量以上抑制剂混匀配制成不同浓度溶液。

1.2动物分组与造模

选取SPF级Wistar大鼠，采用随机排列表法分为化合物组1(皮肤涂抹5％R-IMPP溶液)、化合物组2(皮肤涂抹5％PF-06446846溶液)、化合物组3(皮肤涂抹 5％SBC-115076溶液)、化合物组4(皮肤涂抹5％SBC-110736溶液)、单抗1组 (皮下注射PCSK9单克隆抗体ab84041，5mg/kg.d)、单抗2组(皮下注射evolocumab，5mg/kg.d)、单抗3组(皮下注射alirocumab，5mg/kg.d)、PCSK9 干扰RNAi抑制剂组-1(皮肤涂抹5％PCSK9小干扰RNA-1溶液)、PCSK9干扰 RNAi抑制剂组-2(皮肤涂抹5％PCSK9小干扰RNA-2溶液)、PCSK9干扰RNAI抑制剂组-3(皮肤涂抹5％PCSK9小干扰RNA-3溶液)、多肽组(皮下注射Abcam 公司ab32727,3mg/kg.d)、

阳性对照组(皮肤涂抹5％米诺地尔酊)、阴性对照组(涂抹75％乙醇)、模型对照组(涂抹75％乙醇)，每组10只，雌雄各半。

实验前每只大鼠选取背部4cmx5cm面积的区域将毛脱去作为观察区。除阴性对照组外，大鼠颈后皮下注射丙酸睾酮注射液[5ml/(kg·d)]，每天1次，连续60d，建立SA模型。连续皮下注射丙酸睾丸酮4周后大鼠逐渐出现毛发脱落.残存毛发变得纤细、质脆，证明雄性激素性脱发模型成功建立。造模同时于对应药物组大鼠背部观察区皮肤涂抹或皮下注射给药，涂抹1mL/(只·次)，每日2次，给药间隔8h，皮下注射给药，每天1次。阴性对照组和模型对照组涂抹赋型剂(75％乙醇溶液)，1mL/(只·次)，每日2次，连续60d。

1.3观察指标及测试方法

给药每15天于每只大鼠背部观察区拔取10根毛发，用游标卡尺测量毛发长度。给药60d后，取实验观察区皮肤，进行常规组织脱水、石蜡包埋、HE染色，光镜镜检，观察大鼠皮肤毛囊和皮脂腺组织病理学改变。对各组病变进行半定量分析。分级标准如下：皮肤真皮组织细胞和皮下毛囊、皮脂腺结构正常记为“一”：皮肤真皮未见有增生，毛囊、皮脂腺病变局限，皮下未见有炎症记为“±”：皮肤真皮组织未见有明显增生，毛囊明显囊性变.皮脂腺未见有明显增生，皮下未见有炎症记为“+”：皮肤真皮组织有节段性增生，不明显，少部分毛囊有囊性变，皮脂腺有轻度增生肥大.皮下未见有明显炎症记为“++”：皮肤真皮组织细胞有不同程度节段性增生，部分毛囊囊性变，表现毛囊大小不均匀，周边部无细胞。皮脂腺有增生，增生腺体内细胞核较少，个别大鼠皮下有轻度炎性增生记为“+++”。

2.实验结果

2.1对大鼠毛发生长的影响

PCSK9抑制剂组大鼠在给药第15、30、45、60天的毛发长度均长于模型对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表5

表5各组对大鼠毛发生长长度的影响

*与模型对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.01)

2.2对大鼠观察区皮肤组织真皮浅层毛囊形态的影响

模型组大鼠部分皮肤真皮组织细胞有不同程度节段性增厚，大鼠皮下有轻度淋巴细胞增生；部分大鼠皮下毛囊有明显囊性变，毛囊大小不等，增大毛囊腔内有脱落角化物.周边有轻度纤维化，毛囊周边细胞消失或细胞层次明显减少，腔内似有钙化物染成蓝色，皮脂腺数目增多，部分腺体有肥大，肥大腺体细胞核明显减少，正常毛囊数减少。PCSK9抑制剂组和米诺地尔酊组大鼠皮肤真皮组织细胞及皮下毛囊、皮脂腺病变与模型组比较有不同程度减轻。PCSK9抑制剂组大鼠皮肤损伤毛囊数与模型对照组比较明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组比较，PCSK9抑制剂组和米诺地尔酊组大鼠皮肤真皮组织细胞及皮下毛囊、皮脂腺病变明显减轻，差异有统计学意义(P<0.01)。见表6。

表6各组对大鼠皮肤毛囊和皮脂腺的影响(只)

注：*为与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

序列表

<110> 陈敏

<120> PCSK9抑制剂在制备促进毛发生长产品中的应用

<150> 2020106238451

<151> 2020-07-01

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 692

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu

35 40 45

Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe

50 55 60

His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val

65 70 75 80

Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg

85 90 95

Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu

100 105 110

His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly

115 120 125

Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu

130 135 140

Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg

145 150 155 160

Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp

180 185 190

His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val

195 200 205

Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp

210 215 220

Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly

225 230 235 240

Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln

245 250 255

Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg

260 265 270

Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro

275 280 285

Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu

290 295 300

Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp

305 310 315 320

Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val

325 330 335

Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly

340 345 350

Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile

355 360 365

Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly

370 375 380

Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu

385 390 395 400

Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile

405 410 415

His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp

420 425 430

Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr

435 440 445

His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His

450 455 460

Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp

465 470 475 480

Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg

485 490 495

Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His

500 505 510

Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu

515 520 525

Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala

530 535 540

Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr

545 550 555 560

Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro

565 570 575

Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg

580 585 590

Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys

595 600 605

Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val

610 615 620

Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly

625 630 635 640

Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val

645 650 655

Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val

660 665 670

Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser

675 680 685

Gln Glu Leu Gln

690

Claims

1.PCSK9抑制剂在制备治疗脱发性疾病产品中的应用，其特征在于所述PCSK9是前蛋白转化酶枯草杆菌转化酶/kexin9型，属前蛋白转换酶家族，所述PCSK9抑制剂为PCSK9小分子化合物抑制剂、PCSK9干扰RNAi抑制剂、PCSK9单克隆抗体抑制剂、PCSK9模拟肽抑制剂。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述脱发性疾病包括但不限于雄激素性脱发或斑秃或抗肿瘤治疗引起的脱发。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PCSK9小分子化合物抑制剂包括但不限于结构式如式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ或式Ⅳ所示的化合物；

；

式Ⅰ 式Ⅱ 式Ⅲ 式Ⅳ。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PCSK9单克隆抗体抑制剂包括但不限于Abcam公司的抗体ab84041，或依洛尤单抗，或阿利西尤单抗，或重组人源化抗PCSK9单克隆抗体JS002，或重组全人源抗PCSK9单克隆抗体，或PCSK9单克隆抗体LY3015014。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的PCSK9干扰RNAi抑制剂包括但不限于Inclisran注射剂、ALN-PCS注射剂或ALN-PCSsc注射剂。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的PCSK9模拟肽抑制剂包括但不限于Abcam公司的ab32727，或PCSK9模拟抗体蛋白DS9001，或PCSK9人抗体-抗原结合片段1G08。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于PCSK9抑制剂可单独使用，也可以联合其他治疗方法或药物治疗脱发性疾病。