CN108066763A - Pcsk9抑制剂在制备治疗t细胞介导的炎症免疫性疾病药中的应用 - Google Patents

Pcsk9抑制剂在制备治疗t细胞介导的炎症免疫性疾病药中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药生物技术领域，涉及PCSK9在T细胞介导的炎症免疫性疾病中的作用和机制，以及PCSK9抑制剂在制备治疗T细胞介导的炎症免疫性疾病药中的应用，尤其是PCSK9小分子干扰RNA或PCSK9小分子抑制剂在制备系统或者皮肤外用治疗银屑病、特应性皮炎或荨麻疹药中的应用。以银屑病作为炎症免疫性疾病研究的试验床，证实PCSK9小分子抑制剂或小分子干扰RNA治疗银屑病样炎症的疗效明显优于PCSK9单克隆抗体。本发明PCSK9小分子干扰RNA或PCSK9小分子抑制剂可进一步开发治疗炎症免疫性疾病，如银屑病的新药，副作用小，成本低，疗效显著。

Description

PCSK9抑制剂在制备治疗T细胞介导的炎症免疫性疾病药中的 应用
一、技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及PCSK9在T细胞介导的炎症免疫性疾病中的作用和机制，以及PCSK9抑制剂在制备治疗T细胞介导的炎症免疫性疾病药物中的应用。
二、背景技术
炎症免疫性疾病发病率高，全世界至少有数亿患者，其中包括多种难治性疾病，如银屑病、湿疹(特应性皮炎)、红斑狼疮、类风湿性关节炎、皮肌炎、硬皮病、克隆病等，由于这类疾病可以累及多器官，从而导致心、肝、肾、血管、肺、关节和脑等器官损伤，其死亡率仅次于恶性肿瘤。鉴于该类疾病的病因和发病机制相当复杂，目前仍无法根治，临床常用的治疗药物主要是糖皮质激素和免疫抑制剂，这些药物的有效率仅为50％左右，并且由于其不良反应大，包括骨髓抑制、肝肾功能损伤、骨质疏松、易诱发感染和肿瘤等，大大限制了长期应用。近年来，针对疾病发病机制中的关键靶位研发的生物制剂由于治疗靶位准确，副反应小而逐渐成为今后药物研发的主要方向，但目前已获得显著疗效的此类药物还很少，同时因价格昂贵又限制了其广泛应用。
前蛋白转化酶枯草杆菌转化酶(PCSK9)是前蛋白转换酶家族中的一员，前蛋白转换酶在肝脏内作为一种不活跃酶原分泌。PCSK9基因cDNA的大小为3617bp，编码692个氨基酸组成的PCSK9蛋白。PCSK9前体在内质网内经过分子内自动催化分离其N-末端前肽，分离后的N-末端前区与催化区相连，允许成熟的PCSK9蛋白离开内质网并进入分泌途径。PCSK9分泌至细胞外后，在细胞表面的第一表皮生长因子样区域与低密度脂蛋白(LDL)受体结合，PCSK9-LDL受体复合体可进入溶酶体降解，从而导致细胞表面LDL受体下降，即PCSK9水平与LDL受体成负相关关系。而多项研究显示，PCSK9基因的突变功能丧失可使不同人种的LDL-C水平及冠心病发生率明显下降。
鉴于抑制PCSK9对降低LDL-C及冠心病发生率的显著作用，已有多项治疗方案正在研发阻断PCSK9的药物，用于降低LDL-C及冠心病的发生率。单克隆抗体由于阻断效率高、靶位准确和稳定性好而成为新药研究的热点。最近两种PCSK9单克隆抗体已被FDA及欧盟委员会批准上市，用于控制某些目前治疗手段仍不能使LDL降低的高胆固醇血症患者。已经上市用于治疗高胆固醇血症的PCSK9单克隆抗体有：Alirocumab(即SAR236553/REGN727，赛诺菲及Regeneron制药公司合作研发)和Evolocumab(AMG 145，安进公司)。其它PCSK9单克隆抗体的临床前试验也已经完成，如辉瑞公司的bococizumab(as RN316/PF 04950615)和礼来公司的LY3015014。临床研究发现，以上药物治疗高胆固醇血症患者耐受性良好，安慰剂组与积极治疗组不良反应的发生率无明显区别。此外，辉瑞公司正在设计一种相关的疫苗药物，患者只需每年接受一次疫苗即可达到长期降低LDL的效果。
然而，到目前为止，所有有关PCSK9抑制剂的研究及新药开发项目均立足于其对降低LDL-C及冠心病发生率方面的作用，尚未见到应用PCSK9抑制剂治疗炎症免疫性疾病的相关文献、专利和产品。
另一方面，目前还没有针对PCSK9的小分子干扰RNA和PCSK9小分子抑制剂的药物上市，其前景普遍不被看好。业内公认，像PCSK9这类靶点不适合开发小分子抑制剂药物，因为它没有像酪氨酸激酶那样的天然口袋，结合界面相对来说比较开放、平坦，小分子接触面积有限，产生的疏水作用力也不会太强，即使结合上去了，被天然的大分子配体一碰可能就掉了。Genentech公司筛选到了一段13个氨基酸长度的多肽Prp2-8，这是迄今为止已公开的、机制明确的小分子PCSK9抑制剂。遗憾的是Kd值只达到了0.7μM，没有成为临床候选物继续开发的潜力。Genentech具有业内公认世界顶级的研发能力，他们尚且只做到这种程度，小分子PCSK9抑制剂药物的研发难度可想而知。小分子RNA干扰是源自细胞的内在的基因沉默机制，抑制基因表达具有广泛、高效和特异等优点，但由于其作用时间短暂、在体内极易被降解，被认为并不适合用于慢性炎症性疾病的治疗。虽然研究者发现阻断PCSK9能够显著降低LDL-C已经有20余年，但目前还没有降低LDL-C的PCSK9小分子干扰RNA和PCSK9小分子抑制剂的药物上市。业内普遍认为，PCSK9小分子干扰RNA和PCSK9小分子抑制剂的药物与PCSK9单抗比较并无优势，因为PCSK9单抗的半衰期很长，一个月用一次非常方便。在以上共识的基础上，很少有研究者会对PCSK9小分子干扰RNA和PCSK9小分子抑制剂治疗慢性炎症免疫性疾病感兴趣，这也许也是到目前为止还没有应用PCSK9小分子干扰RNA和PCSK9小分子抑制剂治疗炎症免疫性疾病的研究文献、专利和产品的重要原因。
众所周知，炎症免疫性疾病发病率高、发病机制复杂且病种众多，然而，各种不同的炎症免疫性疾病之间往往存在着相似的病因学或病理学基础，因此，在临床中通常会使用同一类药物治疗不同类型的炎症免疫性疾病，目前使用最多的是糖皮质激素和免疫抑制剂。就新药开发而言，由于各类型炎症免疫性疾病的治疗用药所显示出的高度同一性，在针对各种炎症免疫性疾病进行新药开发时，通常会选择治疗结果易于观察和分析的疾病模型来开展前期研究，目前来说，由于银屑病皮损的治疗效果易于观察，使之成为研究药物治疗炎症免疫性疾病的实验床。银屑病是具有多基因遗传背景，T细胞介导的免疫异常性炎症性疾病，易伴发代谢综合征(高血压、高血脂、高血糖和肥胖)和心血管疾病，目前还没有根治方法，该病容易反复发作，需要终生治疗。银屑病主要包括4种类型：寻常型银屑病、脓疱型银屑病、红皮病型银屑病、银屑病关节炎(PsA)；根据严重程度又分为轻、中、重度。目前常用来治疗严重银屑病的药物主要有免疫抑制剂和维甲酸类，不良反应常见，包括骨髓抑制、肝肾功能损伤和血脂升高等。其中PsA是第二常见的炎性关节疾病，进展可导致残疾。相对于类风湿关节炎(RA)来说，PsA在治疗上缺乏相应的治疗药物。缺乏随机实验证据的甲氨蝶呤、来氟米特等改变病情的抗风湿药一直是治疗PsA的一线用药。随着对其发病机制研究的进展，针对疾病发病机制关键靶位的生物制剂被逐渐用于临床治疗。目前上市应用治疗银屑病和PsA的生物制剂主要有针对免疫发病机制通路的靶点TNF-a的单克隆抗体(简称：单抗)类药物，包括英夫利西单抗(商品名：类克)、阿达木单抗注射液(商品名：修美乐)和注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(商品名：依赛普)等，以及针对IL-12、IL-23共同亚单位P40的乌司奴单抗。然而，约有30％的患者可能表现为对以上药物反应不佳或根本无效，长期使用还具有诱发感染(包括结核)和肿瘤的风险。欧洲药品管理局(EMA)和美国食品药品管理局(FDA)均发现对于那些治疗失败的患者似乎没有更好的治疗方法。综上，目前上市的药物均不能有效改善银屑病患者代谢紊乱的问题。到目前为止，也还没有找到能够同时治疗银屑病皮损和伴发代谢异常的治疗靶位。
三、发明内容
本发明需要解决的问题是：PCSK9在治疗炎症免疫性疾病中的作用和机制，以及PCSK9抑制剂在制备治疗T细胞介导的炎症免疫性疾病的药物中的应用，尤其是PCSK9小分子干扰RNA和PCSK9小分子抑制剂在制备治疗T细胞介导的炎症免疫性疾病药物中的应用。本发明以银屑病作为炎症免疫性疾病研究的试验床，发现PCSK9在治疗多种炎症免疫性疾病中发挥了重要作用。
本发明的技术方案
本发明发明人在已授权专利《PCSK9单克隆抗体在制备治疗炎症免疫性疾病药物中的应用》中，已经阐述了发明人首次发现PCSK9单克隆抗体在治疗多种炎症免疫性疾病中发挥重要作用。用PCSK9敲除转基因小鼠建立咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病样炎症模型，证实抑制PCSK9后对银屑病样炎症皮损具有非常明显的治疗作用。通过培养人角质形成细胞(KC)研究抑制PCSK9治疗炎症免疫性疾病的机制，发现用小RNA干扰PCSK9表达能够通过NFkb途径明显抑制KC的异常增生，促进其凋亡(详细内容见以上发明专利申请书)。目前尚未见研究报道和发明专利涉及PCSK9抑制剂的类似作用。
为了进一步证实PCSK9在银屑病患者发病机制中的作用，本发明收集30名银屑病患者皮损(PP)和非皮损(PN)，以及30名正常人的皮肤(NN)样本，免疫组化检测结果显示：银屑病患者皮损组较非皮损组及正常人组PCSK9的表达均高(p<0.05)；PCSK9阳性表达细胞主要分布于表皮和真皮近表皮处的细胞，在真皮血管中的细胞中均未见表达。实时荧光定量核酸扩增检测系统(Q-PCR)检测发现患者和正常人皮肤中均见PCSK9表达，但患者中明显高于正常人(P<0.01)。Q-PCR检测发现PCSK9在银屑病、湿疹、荨麻疹患者和正常人外周血单一核细胞(PBMC)中均无表达。而ELISA检测发现PCSK9在银屑病、湿疹、荨麻疹患者血浆中表达较正常人明显增高(P<0.05)。接下来，我们从活动期银屑病、湿疹、荨麻疹患者外周血中分离出CD4+T细胞进行研究，发现PCSK9蛋白能够明显促进患者CD4+T细胞分泌IL-17、IL-2和IFN-Gamma，同时显著增加NFkb的表达，其中在银屑病患者中最明显。
以专业常识推测，单克隆抗体由于阻断效率高、靶位准确，疗效最佳。我们通过以下的研究却意外发现，PCSK9小分子干扰RNA和PCSK9小分子抑制剂治疗银屑病样炎症的疗效均明显优于PCSK9单克隆抗体。
本发明在能够明显阻断PCSK9的制剂中，分别选取了具有代表性的单克隆抗体和小分子抑制剂，通过皮下注射治疗银屑病样小鼠模型(剂量同已知降LDL-C实验)与空白对照组比较。结果发现，PCSK9小分子抑制剂组疗效明显优于PCSK9单克隆抗体组，两组均未出现明显不良反应。该实验证实，系统使用PCSK9小分子抑制剂对银屑病样炎症具有明显的治疗作用，疗效明显优于PCSK9单克隆抗体。
本发明又选取了具有代表性的PCSK9小分子抑制剂和PCSK9单克隆抗体，分别配制成外用药膏(药物浓度0.001～0.05％)，外涂于IMQ诱导的小鼠炎症性皮损，每天1次，与外用药膏基质比较，药物组皮损均有好转，其中PCSK9小分子抑制剂组明显优于PCSK9单克隆抗体组，两组均未出现明显不良反应。证实外用PCSK9小分子抑制剂治疗银屑病样炎症皮损疗效明显优于PCSK9单克隆抗体。
另外，本发明选取具有代表性的PCSK9小分子干扰RNA(siPcsk9)和PCSK9单克隆抗体，分别外涂于IMQ诱导的小鼠炎症性皮损，每天1次，与空白组siCon比较，药物组皮损均有好转，但siPcsk9组明显优于PCSK9单克隆抗体组，两组均未出现明显不良反应。证实外用siPcsk9治疗银屑病样炎症皮损疗效明显优于PCSK9单克隆抗体。
本发明首次发现：1、无论是系统应用还是外用，PCSK9小分子抑制剂(阻断剂)对银屑病样炎症的治疗作用均明显优于PCSK9单克隆抗体；2、外用PCSK9小分子干扰RNA治疗银屑病样炎症的疗效也明显优于PCSK9单克隆抗体。
虽然单克隆抗体由于阻断效率高、靶位准确、疗效佳，目前被广泛应用于新药研究，但我们的研究发现，针对PCSK9，小分子抑制剂和小分子干扰RNA治疗银屑病样炎症的疗效明显优于单克隆抗体。通常来说，单克隆抗体在副作用方面优于小分子抑制剂，在稳定性方面优于小分子干扰RNA制剂，但从我们的研究数据看，针对PCSK9而言，小分子抑制剂和小分子干扰RNA治疗银屑病样炎症不仅疗效好，而且毒副作用轻微。
本领域技术人员公知，基于以上PCSK9的作用机制，PCSK9抑制剂(阻断剂)对其他T细胞介导的慢性免疫异常性疾病，包括但不限于银屑病、银屑病性关节炎、湿疹(特应性皮炎)、荨麻疹、激素依赖性皮炎、类风湿性关节炎、硬皮病、糖尿病、慢性肝病和淋巴瘤等均具有治疗作用。
PCSK9抑制剂(阻断剂)，尤其是PCSK9小分子抑制剂和PCSK9小分子干扰RNA可以单独使用，也可以联合其他药物一起使用，包括传统药物和其他新型生物制剂。
基于上述研究，本发明涉及了PCSK9抑制剂(阻断剂)在制备治疗T细胞介导的炎症免疫性疾病的药物中的应用，其中所述PCSK9属前蛋白转换酶家族；所述T细胞介导的炎症免疫性疾病包括银屑病、银屑病性关节炎、湿疹、特应性皮炎、荨麻疹、激素依赖性皮炎、类风湿性关节炎、硬皮病、糖尿病、慢性肝病和淋巴瘤。
优选的，上述PCSK9抑制剂(阻断剂)为PCSK9小分子干扰RNA和PCSK9小分子抑制剂。
进一步地，所述PCSK9小分子干扰RNA和PCSK9小分子抑制剂在制备系统或者皮肤外用治疗银屑病、特应性皮炎或荨麻疹药物中的应用。
进一步地，所述PCSK9小分子干扰RNA干扰PCSK9表达能够通过NFkb途径明显抑制人角质形成细胞的异常增生，促进其凋亡。
作为另一种优选，所述PCSK9抑制剂为PCSK9疫苗。
本发明与现有技术相比其有益效果是：本发明为T细胞介导的炎症免疫性疾病的治疗提供了新的、更好的治疗方法，通过本发明的揭示可进一步制备系统或外用的PCSK9抑制剂(阻断剂)，进而开发出包含各类PCSK9抑制剂的单体新药或复方制剂，用于治疗各类型炎症免疫性疾病，尤其是银屑病、湿疹和荨麻疹。已经有的临床试验证明此类包含PCSK9抑制剂的药物疗效显著、副作用小、患者耐受性好，尤其是仅仅外用也能明显改善银屑病等炎症免疫性疾病的皮损，非常适宜于目前的临床需求。众所周知，PCSK9单克隆抗体药物生产成本非常高，目前都是系统应用于治疗严重患者。但以上疾病严重患者毕竟占的百分比较小，数量庞大的轻中度皮肤病患者更适合外用药物，而目前市场上能够替代糖皮质激素，且疗效显著的外用药物非常少。如果本发明药物进入市场后，将大大降低生产成本，为广大炎症免疫性疾病患者带来更具优势的治疗体验，为市场提供一种价格较低，付作用小，疗效好的新药。
四、附图说明
图1 PCSK9基因敲除小鼠IMQ处理区仅见皮肤轻微炎症；连续涂药5天后，C57BL/6小鼠的背部涂药区域出现明显红斑、鳞屑及皮损增厚，而PCSK9基因敲除小鼠的背部涂药区域仅出现轻微的红斑、鳞屑及皮损增厚。
图2 PCSK9基因敲除小鼠IMQ处理区皮肤炎症评分(红斑+鳞屑+浸润)明显低于对照组(P<0.05)；每天对小鼠背部涂药区域皮损进行评分，C57BL/6小鼠的红斑、鳞屑、皮损增厚及总分(红斑+鳞屑+皮损增厚)均明显高于PCSK9基因敲除小鼠的评分(P<0.05)。
图3 PCSK9基因敲除小鼠IMQ处理区皮肤组织病理改变更接近于正常；涂药5天后，取小鼠背部皮肤组织(处理区及非处理区)，进行HE染色。C57BL/6小鼠的IMQ处理区皮肤可见表皮增厚，皮突延长，棘层增厚，角化过度伴角化不全，Kogoj脓疡及Munro脓疡等典型银屑病病理变化，而PCSK9基因敲除小鼠的IMQ处理区皮肤可见轻度表皮增厚及角化过度，未见皮突延长，棘层增厚，角化过度伴角化不全，Kogoj脓疡及Munro脓疡等典型银屑病病理变化；两组小鼠的未处理区皮肤均表现为正常皮肤组织结构。
图4免疫荧光法检测显示：与PCSK9基因敲除小鼠比较，对照组的PCSK9表达在炎症明显区皮肤明显上调；C57BL/6小鼠的IMQ处理区皮肤PCSK9表达较未处理区明显上调，而PCSK9基因敲除小鼠的IMQ处理区皮肤及未处理区皮肤均未见PCSK9表达。
图5 PCSK9基因敲除小鼠皮肤中的NF-kB的表达较对照组明显降低；C57BL/6小鼠及PCSK9基因敲除小鼠的IMQ处理区皮肤NF-kB的表达较之各自的未处理区均明显上调，但PCSK9基因敲除小鼠的IMQ处理区皮肤的NF-kB的表达较之C57BL/6小鼠明显降低。
图6 si-PCSK9转染显著抑制人角质形成细胞的活性；si-PCSK9转染后的人原代角质形成细胞的存活数较之si-Con转染后细胞明显降低(P<0.001)。
图7 si-PCSK9转染显著促进人角质形成细胞的凋亡，抑制其增殖；si-PCSK9转染后的人原代角质形成细胞凋亡明显增加(P<0.05)，而增殖(S+G2/M期细胞比例)则明显降低(P<0.05)。
图8免疫组化显示银屑病患者皮损中PCSK9表达明显高于非皮损和正常人对照；PCSK9阳性表达细胞主要分布于表皮和真皮近表皮处的细胞，在真皮血管中的细胞中均未见表达。
图9 Q-PCR结果显示银屑病患者皮损组较非皮损组和正常人对照组PCSK9的表达均显著增高(P<0.001)。
图10银屑病、湿疹和荨麻疹患者外周血血浆中PCSK9表达均较正常人对照组明显增加(P<0.05)。
图11 PCSK9蛋白能明显促进银屑病、湿疹和荨麻疹患者外周血分离的CD4+T细胞分泌IL-17、IL-2和IFN-Gamma(P<0.01)。
图12皮下注射PCSK9小分子抑制剂和PCSK9单克隆抗体均可以降低IMQ诱导的小鼠皮肤红斑、鳞屑、浸润评分，但PCSK9小分子抑制剂组疗效明显优于PCSK9单克隆抗体组,小鼠皮肤红斑、鳞屑、浸润评分均明显低于PCSK9单克隆抗体组(p均<0.01)。
图13外用PCSK9小分子抑制剂能够显著减轻IMQ诱导的小鼠皮肤红斑、鳞屑、浸润评分，疗效明显优于外用PCSK9单克隆抗体(p均<0.01)。
图14与对照siRNA(siCon)相比，针对Pcsk9的siRNA(siPcsk9)涂抹于皮肤后一天即可显著降低小鼠皮肤中Pcsk9的表达(p<0.01)，抑制率超过80％。
图15 siPcsk9处理皮肤1天后，可抑制NFκB、IL-17、IL-22、IL-23等炎性因子的表达水平。
图16 IMQ诱导后，外涂siPcsk9能够显著抑制小鼠皮肤银屑病样炎症反应，红斑、鳞屑、浸润评分明显低于Pcsk9单克隆抗体(p均<0.01)。
五、具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明，均属于本发明的保护范围。
实施例1
PCSK9敲除后明显减轻IMQ诱导的小鼠银屑病样炎症反应
主要试剂：5％咪喹莫特乳膏(IMQ)，PCSK9一抗(abcam公司)，NF-kB一抗(abcam公司)
实验动物：C57BL/6(B6)小鼠，雄性，7只；C57BL/6-PCSK9-/-小鼠，雌雄各5只。这些小鼠均购于美国缅因州杰克森研究所(The Jackson Laboratory)。
实验方法：
(1)将两组不同基因型小鼠背部脱毛处理后，每天涂抹62.5mg的5％咪喹莫特乳膏，连续5天。
(2)涂药前及开始涂药后每天做评分(红斑，鳞屑，皮损增厚及总分)并拍照存档(评分为两名研究者分别打分后取平均值)。
(3)实验最后一天，处死所有小鼠，并取背部皮肤组织(处理区及非处理区)。
(4)HE染色观察各组皮损形态，免疫荧光法测PCSK9及NF-kB在4组小鼠皮损中的表达和分布。
实验结果：
(1)连续涂药5天后，7只C57BL/6小鼠的背部涂药区域均出现明显红斑、鳞屑及浸润，符合银屑病样皮损外观，而10只PCSK9基因敲除小鼠的背部涂药区域仅出现轻微的红斑、鳞屑及浸润(见图1)。
(2)每天对小鼠背部涂药区域皮损进行评分，C57BL/6小鼠的红斑、鳞屑、浸润及总分(红斑+鳞屑+浸润)均明显高于PCSK9基因敲除小鼠的评分(P<0.05)。
(3)涂药5天后，取小鼠背部皮肤组织(处理区及非处理区)，进行HE染色并观察病理变化，C57BL/6小鼠的IMQ处理区皮肤可见表皮增厚，皮突延长，棘层增厚，角化过度伴角化不全，Kogoj脓疡及Munro脓疡等典型银屑病病理变化，而PCSK9基因敲除小鼠的IMQ处理区皮肤可见轻度表皮增厚及角化过度，未见皮突延长，棘层增厚，角化过度伴角化不全，Kogoj脓疡及Munro脓疡等典型银屑病病理变化；两组小鼠的未处理区皮肤均表现为正常皮肤组织结构(见图3)。
(4)对小鼠背部皮肤组织(处理区及非处理区)进行免疫荧光法检测PCSK9及NF-kB表达情况：1)C57BL/6小鼠的IMQ处理区皮肤PCSK9表达较未处理区明显上调，而PCSK9基因敲除小鼠的IMQ处理区皮肤及未处理区皮肤均未见PCSK9表达(见图4)；2)C57BL/6小鼠及PCSK9基因敲除小鼠的IMQ处理区皮肤NF-kB的表达较之各自的未处理区均明显上调，但PCSK9基因敲除小鼠的IMQ处理区皮肤的NF-kB的表达较之C57BL/6小鼠明显降低(见图5)。
实施例2
si-PCSK9转染可增强人角质形成细胞的凋亡并抑制其增殖
实验材料及试剂：
(1)人原代角质形成细胞(Lifeline Cell Technology,FC-0064)；
(2)DermaLife角质形成细胞培养液(Lifeline Cell Technology,LL-0007),si-PCSK9(Santa Cruz,sc-45482),Lipofectamine 3000转染试剂(ThermalFisher，L-3000001)，AnnexinV(BD)，PI(BD)。
实验方法：
(1)培养人原代角质形成细胞，种植于6孔板，当细胞密度为60-70％时，进行si-RNA(si-Con&si-PCSK9)转染，转染后24h/48h/72h分别用MTT法测每孔细胞活性，两组细胞每个时间点各计数3个孔，取平均值，绘制细胞活性曲线；
(2)培养人原代角质形成细胞，种植于6孔板，当细胞密度为60-70％时，进行si-RNA(si-Con&si-PCSK9)转染，转染后24h/48h/72h分别取细胞进行AnnexinV及PI染色监测细胞凋亡及细胞周期，两组细胞每个时间点各计数3个孔，取平均值。
实验结果：
(1)si-PCSK9转染后的人原代角质形成细胞的存活数较之si-Con转染后细胞明显降低(P<0.05，见图6)；
(2)si-PCSK9转染后的人原代角质形成细胞凋亡较之si-Con转染后细胞凋亡明显增加(P<0.05)，而增殖(S+G2/M期细胞比例)则明显降低(P<0.05)(见图7)。
实施例3.
银屑病患者皮损中PCSK9表达明显高于非皮损和正常人对照
实验材料：30例银屑病患者皮损、非皮损和30例正常人皮肤，PCSK9抗体(abcam公司)。
实验方法：免疫组化、实时定量-PCR。
实验结果：用钻孔法取患者皮损和非皮损处皮肤，正常人皮肤来源于美容手术多余的皮肤。免疫组化检测结果显示银屑病患者皮损中PCSK9表达明显高于非皮损和正常人对照；PCSK9阳性表达细胞主要分布于表皮和真皮近表皮处的细胞，在真皮血管中的细胞中均未见表达(见图8)。皮肤匀浆后提取RNA，Q-PCR检测结果显示银屑病患者皮损组(PP)较非皮损组(PN)和正常人对照组(NN)PCSK9的表达均高(P<0.05)(见图9)。免疫组化和Q-PCR检测结果一致。
实施例4.
银屑病、湿疹和荨麻疹患者外周血单一核细胞(PBMC)和血浆中PCSK9的表达
实验材料：收集30例银屑病、30例湿疹、30例荨麻疹患者和30例正常人外周血5ml。
实验方法：
(1)分离血浆，用密度梯度法分离外周PBMC；
(2)实时定量Q-PCR法检测PBMC中PCSK9的表达；
(3)酶联免疫吸附测定法(ELISA)(PCSK9Quantikine ELISAKit，美国R&D)法检测血浆中PCSK9的表达。
实验结果：
(1)银屑病、湿疹和荨麻疹患者和正常人外周血PBMC中均未检测到PCSK9表达。
(2)银屑病、湿疹和荨麻疹患者外周血血浆中PCSK9表达均较正常人对照组显著增加，其中银屑病组增加最显著(图10)。
实施例5
PCSK9蛋白对银屑病、湿疹和荨麻疹患者外周血CD4+T细胞分泌IL-17和IL-2的影响
实验材料：10例银屑病、10例湿疹、10例荨麻疹患者和10例正常人外周血，ELISA试剂盒均购自美国Raybiotech公司。
实验方法：
(1)外周血CD4+T细胞的分离：
Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血PBMC后，加入10倍体积1xBD磁珠缓冲液洗涤，然后每107细胞加入50ul BD IMag TM CD4+磁珠，充分混匀，室温孵育30分钟后，加入1ml 1xBD磁珠缓冲液，将细胞转移至圆底检测管中，置于磁力架8-10min。之后弃上清，将检测管移出磁场，用1ml 1xBD磁珠缓冲液重悬附于管壁的细胞后，重新置入磁场2-4min,弃上清，移出磁场，再次重悬后置入磁场2-4min，弃上清后所得细胞可用于后续实验。实验所用BD IMag TM CD4+分离系统购于美国BD Biosciences公司。
(2)外周血CD4+T细胞分泌细胞因子的测定
细胞在不同条件培养后收集上清液，其中以IFN-Gamma代表TH1型细胞因子，以IL-4代表TH2型细胞因子，以IL-17代表TH17型细胞因子酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测上清液中IFN-Gamma，IL-4，IL-17水平。
实验结果：
与正常人对照组比较，PCSK9蛋白显著促进银屑病、湿疹和荨麻疹患者外周血分离的CD4+T细胞分泌IL-17、IL-2和IFN-Gamma(P均<0.01)(图11)。
实施例6
皮下注射PCSK9小分子抑制剂能够显著减轻IMQ诱导的小鼠全身炎症和皮损，疗效明显优于皮下注射PCSK9单克隆抗体。
(1)SPF级雌性BALB/c小鼠6-8周龄40只，随机分为正常对照组、模型组、PCSK9抑制剂组和PCSK9单抗组各10只。戊巴比妥钠80mg/kg腹腔注射麻醉后，背部剃毛，面积约为2cm×3cm，单笼饲养1天。
(2)正常对照组局部涂抹凡士林，模型组、抑制剂组和单抗组背部每日定时涂抹5％咪喹莫特乳膏62.5mg，连续6天，每天拍照，进行PASI评分。
(3)在造模第1天，正常对照组和模型组皮下注射生理盐水，抑制剂组注射PCSK9小分子抑制剂(8mg/kg，购于美国Selleck公司)，单抗组皮下注射PCSK9单克隆抗体(10mg/kg，购于abcam公司)。
实验结果：
(1)连续涂药6天后，模型组小鼠的背部涂药区域均出现明显红斑、鳞屑及浸润，而PCSK9小分子抑制剂组和PCSK9单抗组小鼠的背部涂药区域仅出现轻微的红斑、鳞屑和浸润，PCSK9小分子抑制剂组疗效明显好于PCSK9单抗组。凡士林组未出现任何皮损(见图12)。
(2)每天对小鼠背部涂药区域皮损进行评分，PCSK9抑制剂组的红斑、鳞屑、浸润及总分(红斑+鳞屑+浸润)均明显低于PCSK9单抗组(P均<0.01)。
实施例7
外用PCSK9小分子抑制剂显著减轻IMQ诱导的小鼠皮肤炎症皮损，疗效明显优于外用PCSK9单克隆抗体。
(1)购SPF级雌性BALB/c小鼠6-8周龄40只，随机分为正常对照组、模型组、PCSK9抑制剂组和PCSK9单抗组各10只。戊巴比妥钠80mg/kg腹腔注射麻醉后，背部剃毛，面积约为2cm×3cm，单笼饲养1天。
(2)正常对照组局部涂抹凡士林，模型组、抑制剂组和单抗组背部每日定时涂抹5％咪喹莫特乳膏62.5mg造模，连续6天，每天拍照，进行PASI评分。
(3)从造模前1周起，在正常对照组和模型组小鼠背部皮肤上涂抹凡士林，抑制剂组小鼠背部皮肤上涂抹PCSK9小分子抑制剂乳膏(浓度0.01％)，每天1次。PCSK9单克隆抗体组小鼠背部皮肤上涂抹PCSK9单抗乳膏(浓度0.01％)，每天1次。
(4)预处理7天后，同时于正常对照组小鼠背部涂抹凡士林，模型组、抑制剂组和单抗组于背部每日定时涂抹5％咪喹莫特乳膏62.5mg，一小时后涂抹PCSK9抑制剂乳膏或PCSK9单抗乳膏，连续6天，每天拍照，进行PASI评分。
实验结果：
(1)连续涂药6天后，模型组小鼠的背部涂药区域均出现明显红斑、鳞屑及浸润，而外用PCSK9抑制剂组和外用PCSK9单抗组小鼠的背部涂药区域仅出现轻微的红斑、鳞屑和浸润，PCSK9抑制剂组疗效明显好于PCSK9单抗组。凡士林组未出现任何皮损(见图13)。
(2)每天对小鼠背部涂药区域皮损进行评分，PCSK9抑制剂组的红斑、鳞屑、浸润及总分(红斑+鳞屑+浸润)均明显低于PCSK9单抗组(P均<0.01)。
实施例8
外用针对Pcsk9的siRNA(siPcsk9)能够显著减轻IMQ诱导的小鼠皮肤炎症皮损，疗效明显优于外用PCSK9单克隆抗体。
材料和方法：
(1)动物模型：本实验使用了两种小鼠模型C57BL/6J(B6)和Balb/cByJ(BALB)。这些小鼠均购于美国缅因州杰克森研究所(The Jackson Laboratory)。品系号分别为000664和001026(www.jax.org)。本实验所用小鼠均为雌性，年龄3-8月，每实验组5只。
(2)IMQ诱导的银屑病样皮损：实验前一天剔去B6小鼠背部毛发。实验中，每只小鼠背部2cm2的皮肤上涂抹62.5mg Imiquimod(IMQ,3M Pharmaceuticals)。部分小鼠右耳外廓也涂以5mg IMQ用来直观地检测皮肤增厚情况。24小时后针对皮肤颜色、厚度及鳞屑程度打分。上述步骤连续重复5天。
(3)应用siRNA抑制Pcsk9并检测其对IMQ诱导的银屑病样皮损的影响：针对Pcsk9的两种siRNA(siPcsk9－1，2)及用作对照实验的随机序列siRNA(siCon)由Sigma-Aldrich公司(Sigma-Aldrich，USA)合成，序列见表1。将siPcsk9-1和2等量混合后用生理盐水稀释至20μM。取12.5μl稀释后siRNA与7.5μl润肤液(CVS pharmacy，Baby Lotion)均匀混合。siCon同样处理。在涂抹IMQ之前1小时将20μl siRNA与润肤液混合物涂抹在所需处理的皮肤上。PCSK9单克隆抗体购于abcam公司，与润肤液(CVS pharmacy，Baby Lotion)均匀混合配制成与siPcsk9乳液等浓度制剂。
(4)从造模第一天起，在模型组B6小鼠背部皮肤上涂抹凡士林1小时后涂抹siCON，siPcsk9组B6小鼠背部皮肤上涂抹5％咪喹莫特乳膏1小时后涂抹siPcsk9，每天1次。PCSK9单克隆抗体组在B6小鼠背部皮肤上涂抹5％咪喹莫特乳膏1小时后涂抹PCSK9单抗，每天1次。
(5)半定量基因表达检测(realtime PCR)：引物序列见表2。
表1:siRNA序列及修饰
基因 5'-3'Sense 5'-3'Antisense
siPCSK9-1 GccuGGAGuuuAuucGGAAdT*dT UUCCgAAuAAACUCcAGGCdT*dT
siPCSK9-2 AGGuGuAucuccuAGAcAcdT*dT GUGUCuAGGAGAuAcACCUdT*dT
siCON cuuAcGcuGAGuAcuucGAdT*dT UCGAAGuACUcAGCGuAAGdT*dT
注：小写字母表示2’-OMe修饰。所有序列末尾均加以硫代磷酸酯连接。
实验结果：
(1)siPcsk9涂抹于皮肤后一天即可显著降低B6小鼠皮肤中Pcsk9的表达(p<0.05)，抑制率超过80％(图14)。siPcsk9处理皮肤一天后，可抑制NFκB、IL-17、IL-22、IL-23等炎性因子的表达水平(图15)。这些炎症因子的表达与银屑病的发病及病情严重程度密切相关，提示siPcsk9可抑制银屑病的发生并减轻病理反应。
(2)连续涂药6天后，模型组小鼠的背部涂药区域均出现明显红斑、鳞屑及浸润，而涂抹siPcsk9组小鼠的背部涂药区域仅出现轻微的红斑、鳞屑和浸润(见图16)。siPcsk9组治疗小鼠银屑病样皮肤的疗效明显优于PCSK9单抗组(P<0.01)，凡士林组未出现任何皮损。
(3)每天对B6小鼠背部涂药区域皮损进行评分，siPcsk9组的红斑、鳞屑、浸润及总分(红斑+鳞屑+浸润)均明显好于PCSK9单抗组(P均<0.01)(见图16)。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。
序列表
<110>陈敏
<120>PCSK9抑制剂在制备治疗T细胞介导的炎症免疫性疾病药中的应用
<160>3
<210>1
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>1
gccuggaguu uauucggaad t 21
uuccgaauaa acuccaggcd t 21
<210>2
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>2
agguguaucu ccuagacacd t 21
gugucuagga gauacaccud t 21
<210>3
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>3
cuuacgcuga guacuucgad t 21
ucgaaguacu cagcguaagd t 21

Claims (6)

1.PCSK9抑制剂在制备治疗T细胞介导的炎症免疫性疾病药物中的应用，其特征在于所述PCSK9属前蛋白转换酶家族,所述T细胞介导的炎症免疫性疾病为银屑病或银屑病性关节炎或湿疹或特应性皮炎或荨麻疹或激素依赖性皮炎或类风湿性关节炎或硬皮病或糖尿病或慢性肝病或淋巴瘤。
2.根据权利要求1所述PCSK9抑制剂在制备治疗T细胞介导的炎症免疫性疾病的药物中的应用，其特征在于所述PCSK9抑制剂为PCSK9小分子干扰RNA或PCSK9小分子抑制剂。
3.根据权利要求2所述PCSK9抑制剂在制备治疗T细胞介导的炎症免疫性疾病的药物中的应用，其特征在于所述PCSK9小分子干扰RNA或PCSK9小分子抑制剂在制备系统或者皮肤外用治疗银屑病药物中的应用。
4.根据权利要求2所述PCSK9抑制剂在制备治疗T细胞介导的炎症免疫性疾病的药物中的应用，其特征在于所述PCSK9小分子干扰RNA或PCSK9小分子抑制剂在制备特应性皮炎或荨麻疹药物中的应用。
5.根据权利要求2所述PCSK9抑制剂在制备治疗T细胞介导的炎症免疫性疾病的药物中的应用，其特征在于所述PCSK9小分子干扰RNA干扰PCSK9表达能够通过NFkb途径明显抑制人角质形成细胞的异常增生，促进其凋亡。
6.根据权利要求1所述PCSK9抑制剂在制备治疗T细胞介导的炎症免疫性疾病的药物中的应用，其特征在于：所述PCSK9抑制剂为PCSK9疫苗。
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