CN113876956A - Pcsk9抑制剂在制备促进皮肤色素生成产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及前蛋白转化酶枯草杆菌转化酶（PCSK9）在促进色素生成中的作用，以及PCSK9抑制剂在制备治疗色素脱失性疾病的产品中的应用。其特征在于所述PCSK9抑制剂为PCSK9小分子化合物或PCSK9干扰RNA或PCSK9单克隆抗体或PCSK9模拟肽或PCSK9模拟抗体蛋白或PCSK9反义寡核苷酸或PCSK9疫苗，在制备治疗白癜风等皮肤色素脱失性疾病的产品中的应用。可进一步开发出系统或外用的PCSK9抑制剂产品，用于治疗皮肤色素脱失性疾病。这些产品疗效显著，不良反应小。

Description

PCSK9抑制剂在制备促进皮肤色素生成产品中的应用

一、技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及前蛋白转化酶枯草杆菌转化酶(PCSK9)在促进色素生成中的作用，以及PCSK9抑制剂在制备治疗色素脱失性疾病的产品中的应用。

二、背景技术

白癜风是一种常见的后天性限局性或泛发性皮肤色素脱失病，全世界白癜风患病率为1％～2％。由黑素细胞受损而引起皮肤或者黏膜的色素脱失，以出现褪色的白斑为主要特征，全身各部位可发生，常见于指背、腕、前臂、颜面、颈项及生殖器周围等。白斑多数对称分布，初期多为指甲至钱币大，近似圆形、椭圆形或不规则形。也有起病时，即为点状减色斑，境界多明显，有的边缘绕以色素带。病因尚不清楚。目前多考虑与以下因素有关，包括自身免疫因素、遗传因素、神经精神因素等。白癜风可以合并自身免疫病，血清中还可以检出多种器官的特异性抗体，如抗甲状腺抗体、抗胃壁细胞抗体、抗肾上腺抗体、抗甲状旁腺抗体、抗平滑肌抗体、抗黑素细胞抗体等。白癜风患者体内可以产生抗体和T淋巴细胞，免疫反应可能导致黑素细胞被破坏。而细胞本身合成的毒性黑素前身物及某些导致皮肤脱色的化学物质对黑素细胞也可能有选择性的破坏作用。本病好出现在暴露及色素加深的部位，表皮黑色素细胞功能亢进，使其耗损而衰退，并可能是因为黑色素细胞合成黑色素的中间产物过量或积聚引起。约2/3的患者起病与皮损发展、精神创伤、过度劳累以及焦虑有关，有些白瘢风损害对称或沿神经节段分布。白癜风是难治性疾病，系统治疗主要适用于泛发型进展期白癜风患者，口服或肌内注射激素可以使进展期白癜风尽快趋于稳定。外用糖皮质激素对于局限型白癜风的治疗有效，但长期使用糖皮质激素引起的不良反应多。对于不适于使用激素的部位，或为避免长期应用激素产生不良反应，外用钙调神经磷酸抑制药(他克莫司、吡美莫司)具有一定的效果。维生素D₃衍生物可与NB-UVB、PUVA等联合治疗，也可以与外用激素和钙调神经磷酸酶抑制药联合治疗。窄波紫外线(NB-UVB)治疗局限型或泛发性白癜风有一定效果。目前的治疗方法还不能满足临床需求。

前蛋白转化酶枯草杆菌转化酶(PCSK9)是前蛋白转换酶家族中的一员，前蛋白转换酶在肝脏内作为一种不活跃酶原分泌。PCSK9基因cDNA的大小为3617bp，编码692个氨基酸组成的PCSK9蛋白。PCSK9前体在内质网内经过分子内自动催化分离其N-末端前肽，分离后的N-末端前区与催化区相连，允许成熟的PCSK9蛋白离开内质网并进入分泌途径。PCSK9分泌至细胞外后，在细胞表面的第一表皮生长因子样区域与低密度脂蛋白(LDL)受体结合，PCSK9-LDL受体复合体可进入溶酶体降解，从而导致细胞表面LDL受体下降，即PCSK9水平与LDL受体成负相关关系。而多项研究显示，PCSK9基因的突变功能丧失可使不同人种的LDL-C水平及冠心病发生率明显下降。鉴于抑制PCSK9对降低LDL-C及冠心病发生率的显著作用，已有多项治疗方案正在研发阻断PCSK9的药物，用于降低LDL-C及冠心病的发生率。

PCSK9抑制剂包括两大类：1、阻止PCSK9与LDL-R的结合，如单抗、模拟肽(多肽抑制剂)、模拟抗体蛋白药；2、抑制PCSK9分子的表达或干扰PCSK9分泌，如小分子干扰RNA、反义寡核苷酸、小分子化合物抑制剂等。单克隆抗体由于阻断效率高、靶位准确和稳定性好而成为新药研究的热点。目前，全球上市的PCSK9靶向单抗药物，均为阻止PCSK9与LDL-R结合的药物。包括安进(Amgen)和安斯泰来(Astellas)联合开发的的evolocumab(依洛尤单抗)，商品名Repatha(瑞百安)；赛诺菲(Sanofi)和再生元(Regeneron)联合开发的alirocumab(阿利西尤单抗，阿利珠单抗)，商品名Praluent(波立达)，以及Eli lilly公司的LY3015014，君实生物的重组人源化抗PCSK9单克隆抗体(JS002)，和信立泰药业的重组全人源抗PCSK9单克隆抗体注射液。临床研究发现，以上药物治疗高胆固醇血症耐受性良好，安慰剂组与积极治疗组不良反应的发生率无明显区别。此外，Inclisiran是一款siRNA(小干扰RNA)药物，不同于直接与PCSK9分子结合的单抗，它可以抑制PCSK9基因的表达，使LDL受体不会因PCSK9而被降解，从而改善肝细胞对LDL颗粒的摄取，降低血液中的LDL水平。Alnylam公司的Inclisiran采用专有技术，由脂质纳米颗粒与GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)结合而成，而GalNAc可与肝细胞表面表达的唾液酸糖蛋白受体ASGR1和ASGR2结合。该技术允许皮下给药并靶向肝脏。Affiris公司的ALN-PCS和ALN-PCSsc也属于siRNA(小干扰RNA)药物。PCSK9干扰RNAI抑制剂药物还有Alnylam公司的Inclisran，Affiris公司的ALN-PCS和ALN-PCSsc。辉瑞公司设计的一种相关的疫苗药物，以及Affiris公司的AT04A和AT06A疫苗，患者只需每年接受一次疫苗即可达到长期降低LDL的效果，可以减少使用频率。PCSK9模拟肽和PCSK9模拟抗体蛋白药药物研发包括Pieris公司的DS9001和Merck公司的1G08等。PCSK9反义寡核苷酸药物包括Santaris Pharma公司的SPC5001等。

到目前为止，尚未见到有关PCSK9对黑素细胞的作用的研究报道，也未见应用PCSK9抑制剂治疗色素脱失性疾病的相关文献、专利和产品。我们首次发现PCSK9抑制剂在促进皮肤色素生成中发挥重要作用。

三、发明内容

本发明需要解决的问题是：PCSK9在促进皮肤色素生成中的作用，以及PCSK9抑制剂在制备治疗色素脱失性疾病的产品中的应用。本发明通过建立代表性的色素脱失性疾病白癜风动物模型，发现了PCSK9基因在促进皮肤色素生成中的重要作用。本发明在能够明显阻断PCSK9的制剂中，分别选取了具有代表性的单克隆抗体、多肽抑制剂、小分子化合物抑制剂和小干扰RNA，通过皮下注射或者外用治疗豚鼠皮肤脱色模型。结果发现，PCSK9抑制剂组疗效均明显优于模型对照组，各组均未出现明显不良反应。实验证实，无论系统或外用PCSK9抑制剂均对皮肤色素生成具有明显的促进作用。

基于上述研究，本发明涉及了PCSK9抑制剂(阻断剂)在制备治疗和/或预防色素脱失性疾病的产品中的应用，其中所述PCSK9属前蛋白转换酶家族(genebank序列号：255738)；所述色素脱失性疾病包括但不限于白癜风。

本发明所述的PCSK9抑制剂可以为常规的任何的分子生物学或者药物化学手段能够抑制PCSK9基因表达或者分泌作用的产品或方法，例如但不限于通过现有分子生物学技术对PCSK9基因进行敲除或者沉默；在一些实施例中，还可以为或者采用PCSK9抑制剂，优选的，上述PCSK9抑制剂(阻断剂)为PCSK9小分子化合物或PCSK9干扰RNAI抑制剂或PCSK9单克隆抗体或PCSK9模拟肽或PCSK9模拟抗体蛋白或PCSK9反义寡核苷酸或PCSK9疫苗。

优选的，上述PCSK9抑制剂(阻断剂)为PCSK9小分子化合物或PCSK9干扰RNA或PCSK9单克隆抗体或PCSK9模拟肽或PCSK9模拟抗体蛋白或PCSK9反义寡核苷酸或PCSK9疫苗。

在一些实例中，本发明所述的PCSK9小分子化合物包括但不限于Selleck公司产品R-IMPP，化学式：C₂₄H₂₇N₃O₂，分子量：389.49，结构式：

或Selleck公司产品PF-06446846，化学式：C₂₂H₂₀N₇O，分子量：434.04，其盐酸盐结构式：

或Selleck公司产品SBC-115076，化学式：C₃₁H₃₃N₃O₅，分子量：527.61，结构式：

或Selleck公司产品SBC-110736，化学式：C₂₆H₂₇N₃O₂，分子量：413.51，结构式：

在一些实例中，本发明所述的PCSK9单克隆抗体抑制剂包括但不限于Abcam公司ab81041，或安进(Amgen)和安斯泰来(Astellas)联合开发的evolocumab(依洛尤单抗)，或赛诺菲(Sanofi)和再生元(Regeneron)联合开发的alirocumab(阿利西尤单抗，阿利珠单抗)，或君实生物的重组人源化抗PCSK9单克隆抗体(JS002)，或信立泰药业的重组全人源抗PCSK9单克隆抗体注射液，或Eli lilly公司的LY3015014，或Merck公司的1G08。

在一些实例中，本发明所述的PCSK9干扰RNAI抑制剂包括但不限于Alnylam公司的Inclisran，Affiris公司的ALN-PCS和ALN-PCSsc。

在一些实例中，本发明所述的PCSK9模拟肽抑制剂和PCSK9模拟抗体蛋白抑制剂包括但不限于Pieris公司的DS9001和Merck公司的1G08等。

在一些实例中，本发明所述的PCSK9反义寡核苷酸抑制剂包括但不限于SantarisPharma公司的SPC5001。

在一些实例中，本发明所述的PCSK9疫苗抑制剂包括但不限于Affiris公司的AT04A和AT06A。

本领域技术人员公知，基于以上PCSK9的作用机制，PCSK9抑制剂(阻断剂)对其他脱色性疾病均具有治疗作用。

PCSK9抑制剂(阻断剂)可以单独使用，也可以联合其他药物或者治疗方法一起使用，包括传统药物和其他靶向生物制剂。

本发明还提供一种药物组合物，以本发明所述化合物或其药学上可接受的盐为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体组成。

本发明所述的化合物或组合物可制备为药学上允许的任何剂型，例如为适于口服、肠胃外、腹膜内、静脉内、动脉内、透皮、舌下、肌内、直肠、透颊、鼻内、吸入、阴道、眼内、局部、皮下、脂肪内、关节内、腹膜内或鞘内任意给药方式的制剂。

在一种优选的实施方式中，本发明所述的剂型为膏剂、片剂、冲剂、口服液剂、胶囊剂、滴丸剂、灌肠剂、膜剂或注射剂。

本发明与现有技术相比其有益效果是：本发明为脱色性疾病的治疗提供了新的、更好的治疗方法，通过本发明的揭示可进一步制备系统或外用的PCSK9抑制剂(阻断剂)产品，进而开发出包含各类PCSK9抑制剂的单体新药或复方制剂，用于治疗各类型色素脱失性疾病，包括但不限于白癜风。已经有的临床试验证明此类包含PCSK9抑制剂的药物疗效显著、副作用小、耐受性好。可为市场提供一系列价格较低，不良反应小，疗效好的新产品。

四、具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明，均属于本发明的保护范围。

实施例1PCSK9基因敲出对小鼠色素生长的影响

1.实验方法

1.1实验动物：

SPF级C57BL/6(B6)小鼠，C57BL/6-PCSK9-/-小鼠(利用CRISPR基因编辑技术，敲除Pcsk9基因exon 2-3，建立Pcsk9基因敲除小鼠模型)，体质量(20±4.6)g，来源于南模生物。

1.2动物分组与造模

将不同基因型小鼠分三组：C57BL/6小鼠空白对照组、C57BL/6小鼠模型组和C57BL/6-PCSK9-/-小鼠模型组，每组6只，雌雄各3只。脱去背部2cm×2cm面积黑色毛发，除空白对照组外，其余各组均在脱毛区涂抹5％氢醌脱色，每次0.5mL，每天2次，空白对照组动物每天涂抹等量生理盐水。连续涂抹30d，模型组出现明显白斑表明模型成功。造模结束后，观察涂抹5％氢醌脱色部位色素情况。

1.3观察指标及测试方法

1.3.1组织学观察实验

观察结束后，处死小鼠后，剪取背部涂抹5％氢醌部位的皮肤组织约1cm×1cm，做组织病理学检查。

1.3.2白癜风动物模型表皮黑素细胞(MC)计数

将剪取的小鼠皮肤组织置10％福尔马林中固定1h，后流水冲洗3～4min，放入含0.1％二羟基苯丙氨酸的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，于37℃静置1h。然后换入新鲜的Dopa试剂中，37℃静置12h。流水冲洗，用Bouin氏液继续固定24h。将标本取出后流水冲洗4h后脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，脱蜡至水，用苏木素-伊红对比染色。脱水，常规封固。Dopa-氧化酶染色后，棕黑色染色为MC阳性。分别于光镜下测定每个高倍镜视野内各组MC数量，每个标本观察10个高倍镜视野，计算每100个表皮基底细胞中MC的平均数量。

1.3.3白癜风小鼠模型表皮含黑素颗粒基底细胞计数将剪取的小鼠皮肤组织置10％福尔马林中固定，脱水，用二甲苯透明，石蜡包埋，制切片，脱蜡至水，蒸馏水洗涤数次后进行Lillie染色，用氯化铁和铁氰化钾混合液浸染15～20min，再以1％醋酸水溶液分化数分钟，蒸馏水洗涤数次，然后用95％乙醇及无水乙醇迅速脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。Lillie染色后，黑色素呈暗绿色为阳性，分别于光镜下测定各组含黑素颗粒的基底细胞数量，每个标本观察10个高倍镜视野，计算每100个表皮基底细胞中含黑素颗粒的基底细胞的平均数量。

1.3.4白癜风小鼠模型皮肤组织酪氨酸酶活性的检查将剪取的小鼠皮肤组织置10％福尔马林中固定。然后脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制切片，脱蜡至水后，每张切片加过氧化酶阻断剂(3％H2O2)50μL，10min，阻断内源性过氧化物酶活性。切片浸入0.01mol·L-1PBS缓冲液中，微波处理10min。加鼠抗人酪氨酸酶单克隆抗体50μL，37℃、60min。加Elivision试剂50μL，37℃30min。然后将切片置新鲜配制的DAB-H2O2显色液中显色，蒸馏水冲洗，苏木素对比染色1min，中性树胶固封。酪氨酸酶阳性产物定位于细胞的细胞质内，显镜下细胞内出现黄色或棕黄色颗粒、或团块状为阳性表达。用二级计分法判定结果，阳性细胞计数<5％为0分；5％～25％为1分；25％～50％为2分；50％～75％为3分；>75％为4分。按染色强度分类:淡黄色1分；黄或深黄2分；褐或棕黄色3分。两者相加小于2分为阴性(-)；2～3分为阳性(+)；4～5分为中等阳性(2+)；6～7分为强阳性(3+)。

1.4统计学方法

实验数据采用SPSS 13.0系统软件进行统计学处理。实验数据统计变量以(x±s)表示，采用χ2检验和t检验，动物皮肤组织酪氨酸酶强度比较均用Wilcoxon秩和检验。α值取双侧，P>0.05表示差异无显著性，P<0.05表示差异有显著性，P<0.01为差异有极显著性。

2.实验结果

2.1 PCSK9基因敲出对氢醌脱色所致白癜风小鼠模型表皮MC、含黑素颗粒基底细胞计数的影响经氢醌脱色后，与C57BL/6-PCSK9-/-小鼠模型组比较，C57BL/6小鼠模型组皮肤组织中表皮MC含量降低(P<0.01)，含黑素颗粒基底细胞计数降低(P<0.01)。见表1。

表1各组小鼠表皮MC、含黑素颗粒基底细胞计数情况(n＝6,x±s)

注：*与C57BL/6小鼠模型组比较，P＜0.01。

2.2 PCSK9基因敲出对氢醌脱色所致白癜风鼠模型皮肤组织酪氨酸酶强度的影响

经氢醌脱色后，C57BL/6小鼠模型组皮肤组织中酪氨酸酶强度与空白对照组比较明显降低(P<0.01)。与C57BL/6小鼠模型组比较，C57BL/6-PCSK9-/-小鼠模型组可提高白癜风鼠模型皮肤组织中酪氨酸酶的强度(P<0.01)。见表2

表2各组氢醌脱色所致小鼠皮肤组织酪氨酸酶的强度(n＝6)

注：*与C57BL/6小鼠模型组比较，P＜0.01。

3.实验结论

PCSK9基因敲出可增加白癜风模型皮肤组织中表皮MC和含黑素颗粒基底细胞数量，提高皮肤组织酪氨酸酶强度。

实施例2 PCSK9抑制剂对小鼠色素生长的影响

1.实验方法

1.1材料

(1)PCSK9干扰RNA-1序列及修饰

基因	5'-3'Snese	5'-3'Antisense
			siPCSK9-1	GccuGGAGuuuAuucGGAAdT*dT	UUCCgAAuAAACUCcAGGCdT*dT
siPCSK9-2	AGGuGuAucuccuAGAcAcdT*dT	GUGUCuAGGAGAuAcACCUdT*dT

将siPcsk9-1和2等量混合后用生理盐水稀释至20μM，取稀释后siRNA与润肤液均匀混合。

PCSK9干扰RNAi抑制剂-2：RNA与Alnylam公司的Inclisran同序列；PCSK9干扰RNAi抑制剂-3：RNA与Affiris公司的ALN-PCS同序列。

(2)PCSK9小分子化合物抑制剂1：Selleck公司产品R-IMPP，化学式：C₂₄H₂₇N₃O₂，分子量：389.49，结构式：

PCSK9小分子化合物抑制剂2：Selleck公司产品PF-06446846，化学式：C₂₂H₂₁N₇O，分子量：434.5，结构式：

PCSK9小分子化合物抑制剂3：Selleck公司产品SBC-115076，化学式：C₃₁H₃₃N₃O₅，分子量：527.61，结构式：

PCSK9小分子化合物抑制剂4：Selleck公司产品SBC-110736，化学式：C₂₆H₂₇N₃O₂，分子量：413.51，结构式：

(3)PCSK9单克隆抗体1：购于Abcam公司(ab84041)；PCSK9单克隆抗体2：evolocumab(依洛尤单抗)；PCSK9单克隆抗体3：alirocumab(阿利西尤单抗)。

(4)PCSK9多肽：Abcam公司的ab32727。

(5)阳性治疗药：糠酸莫米松乳膏(商品名：艾洛松，先灵葆雅中国有限公司生产)

(6)实验动物：SPF级黑色豚鼠，体质量(252±18)g，雌雄各半。

(7)治疗乳膏制备方法：赋形剂基质组成成分包括甲基硅油(15％)、硬脂酸(6％)、白凡士林(5％)、液体石蜡(5％)、十八醇(5％)、甘油(20％)、烷基芳基聚乙醇醚(1％)、脂肪醇聚氧乙烯醚(1％)、吐温-807(1％)、尼泊金乙酯(0.1％)、蒸馏水(约31-55％)，分别与适量以上PCSK9抑制剂混匀形成混合乳剂。本实施例所用的乳膏基质是指乳膏除去活性成分的基质成分。

1.2动物分组与造模

选取SPF级黑色豚鼠，体质量(252±18)g，按体质量编号，采用随机排列表法分为化合物组1(皮肤涂抹0.1％R-IMPP乳膏)、化合物组2(皮肤涂抹0.1％PF-06446846乳膏)、化合物组3(皮肤涂抹0.1％SBC-115076乳膏)、化合物组4(皮肤涂抹0.1％SBC-110736乳膏)、单抗1组(皮下注射PCSK9单克隆抗体ab81041，1mg/kg.d)、单抗2组(皮下注射evolocumab，1mg/kg.d)、单抗3组(皮下注射alirocumab，1mg/kg.d)、PCSK9干扰RNA组-1(皮肤涂抹0.1％PCSK9小干扰RNA-1乳膏)、PCSK9干扰RNA组-2(皮肤涂抹0.1％PCSK9小干扰RNA-2乳膏)、PCSK9干扰RNA组-3(皮肤涂抹0.1％PCSK9小干扰RNA-3乳膏)、多肽组(皮下注射Abcam公司ab32727,0.5mg/kg.d)、阳性治疗组(皮肤涂抹艾洛松)、空白对照组(涂抹凡士林)、模型对照组(涂抹凡士林)，每组10只，雌雄各半。除空白对照组外，其余各组均在脱毛区涂抹5％氢醌脱色，每次0.5mL，每天2次，空白对照组动物每天涂抹等量生理盐水。连续涂抹30d，出现明显白斑表明模型成功。造模结束后，按照以上方式进行给药，每天一次，连续30d。

1.3观察指标及测试方法

1.3.1组织学观察实验

给药结束后，处死豚鼠后，剪取背部给药部位的皮肤组织约3cm×3cm，用于做组织病理学检查。

1.3.2白癜风动物模型表皮黑素细胞(MC)计数

将剪取的豚鼠皮肤组织置10％福尔马林中固定1h，后流水冲洗3～4min，放入含0.1％二羟基苯丙氨酸的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，于37℃静置1h。然后换入新鲜的Dopa试剂中，37℃静置12h。流水冲洗，用Bouin氏液继续固定24h。将标本取出后流水冲洗4h后脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，脱蜡至水，用苏木素-伊红对比染色。脱水，常规封固。Dopa-氧化酶染色后，棕黑色染色为MC阳性。分别于光镜下测定每个高倍镜视野内各组MC数量，每个标本观察10个高倍镜视野，计算每100个表皮基底细胞中MC的平均数量。

1.3.3白癜风豚鼠模型表皮含黑素颗粒基底细胞计数将剪取的豚鼠皮肤组织置10％福尔马林中固定，脱水，用二甲苯透明，石蜡包埋，制切片，脱蜡至水，蒸馏水洗涤数次后进行Lillie染色，用氯化铁和铁氰化钾混合液浸染15～20min，再以1％醋酸水溶液分化数分钟，蒸馏水洗涤数次，然后用95％乙醇及无水乙醇迅速脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。Lillie染色后，黑色素呈暗绿色为阳性，分别于光镜下测定各组含黑素颗粒的基底细胞数量，每个标本观察10个高倍镜视野，计算每100个表皮基底细胞中含黑素颗粒的基底细胞的平均数量。

1.3.4白癜风豚鼠模型皮肤组织酪氨酸酶活性的检查将剪取的豚鼠皮肤组织置10％福尔马林中固定。然后脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制切片，脱蜡至水后，每张切片加过氧化酶阻断剂(3％H2O2)50μL，10min，阻断内源性过氧化物酶活性。切片浸入0.01mol·L-1PBS缓冲液中，微波处理10min。加鼠抗人酪氨酸酶单克隆抗体50μL，37℃、60min。加Elivision试剂50μL，37℃30min。然后将切片置新鲜配制的DAB-H2O2显色液中显色，蒸馏水冲洗，苏木素对比染色1min，中性树胶固封。酪氨酸酶阳性产物定位于细胞的细胞质内，显镜下细胞内出现黄色或棕黄色颗粒、或团块状为阳性表达。用二级计分法判定结果，阳性细胞计数<5％为0分；5％～25％为1分；25％～50％为2分；50％～75％为3分；>75％为4分。按染色强度分类:淡黄色1分；黄或深黄2分；褐或棕黄色3分。两者相加小于2分为阴性(-)；2～3分为阳性(+)；4～5分为中等阳性(2+)；6～7分为强阳性(3+)。

1.4统计学方法

实验数据采用SPSS 16.0系统软件进行统计学处理。实验数据统计变量以(x±s)表示，采用χ2检验和t检验，动物皮肤组织酪氨酸酶强度比较均用Wilcoxon秩和检验。α值取双侧，P>0.05表示差异无显著性，P<0.05表示差异有显著性，P<0.01为差异有极显著性。

2.实验结果

2.1各种PCSK9抑制剂对氢醌脱色所致白癜风豚鼠模型表皮MC、含黑素颗粒基底细胞计数的影响经氢醌脱色后，与空白对照组比较，模型组豚鼠皮肤组织中表皮MC含量降低(P<0.01)，含黑素颗粒基底细胞计数降低(P<0.01)。各组PCSK9抑制剂分别作用于氢醌脱色所致的白癜风豚鼠模型后，PCSK9抑制剂各给药组均可提高白癜风模型动物皮肤组织中表皮MC计数(P<0.01)；各PCSK9抑制剂组均可提高白癜风豚鼠模型动物皮肤组织中含黑素颗粒基底细胞计数(P<0.01)。见表3。

表3各组对氢醌脱色所致豚鼠表皮MC、含黑素颗粒基底细胞计数的影响(n＝10,x±s)

注：*与模型对照组比较，P＜0.01。

2.2各种PCSK9抑制剂对氢醌脱色所致白癜风豚鼠模型皮肤组织酪氨酸酶强度的影响经氢醌脱色后，模型组豚鼠皮肤组织中酪氨酸酶强度与空白对照组比较明显降低(P<0.01)。将各种PCSK9抑制剂分别作用于氢醌脱色所致的白癜风豚鼠模型后，各种PCSK9抑制剂组均可提高白癜风豚鼠模型动物皮肤组织中酪氨酸酶的强度(P<0.01)。见表4

表4各组对氢醌脱色所致豚鼠皮肤组织酪氨酸酶强度的影响(n＝10)

组别	阳性细胞数(个)	颜色(个)	总数(个)	强度
					模型对照组	10％(1)	黄色(1)	2	+
空白对照组	40％(4)	棕黄色(3)	7	+++
					阳性治疗组	30％(3)	棕黄色(3)	6	+++*
单抗组1	30％(3)	棕黄色(3)	6	+++*
					单抗组2	40％(4)	棕黄色(4)	7	+++*
单抗组3	30％(3)	棕黄色(4)	7	+++*
					多肽组	20％(2)	黄色(2)	4	++*
化合物组1	30％(3)	棕黄色(2)	5	+++*
					化合物组2	40％(4)	棕黄色(3)	7	+++*
化合物组3	30％(3)	棕黄色(3)	6	+++*
					化合物组4	30％(3)	棕黄色(3)	6	+++*
干扰RNA组1	20％(2)	黄色(2)	4	++*
					干扰RNA组2	30％(3)	黄色(2)	5	+++*
干扰RNA组3	30％(3)	黄色(2)	5	+++*

注：*与模型对照组比较，P＜0.01。

3.实验结论

各种PCSK9抑制剂可通过增加白癜风模型皮肤组织中表皮MC和含黑素颗粒基底细胞数量，提高皮肤组织酪氨酸酶强度来治疗色素脱失性疾病。

序列表

<110> 陈敏

<120> PCSK9抑制剂在制备促进皮肤色素生成产品中的应用

<150> 2020106239045

<151> 2020-07-01

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 692

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu

35 40 45

Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe

50 55 60

His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val

65 70 75 80

Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg

85 90 95

Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu

100 105 110

His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly

115 120 125

Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu

130 135 140

Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg

145 150 155 160

Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp

180 185 190

His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val

195 200 205

Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp

210 215 220

Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly

225 230 235 240

Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln

245 250 255

Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg

260 265 270

Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro

275 280 285

Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu

290 295 300

Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp

305 310 315 320

Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val

325 330 335

Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly

340 345 350

Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile

355 360 365

Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly

370 375 380

Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu

385 390 395 400

Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile

405 410 415

His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp

420 425 430

Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr

435 440 445

His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His

450 455 460

Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp

465 470 475 480

Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg

485 490 495

Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His

500 505 510

Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu

515 520 525

Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala

530 535 540

Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr

545 550 555 560

Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro

565 570 575

Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg

580 585 590

Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys

595 600 605

Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val

610 615 620

Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly

625 630 635 640

Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val

645 650 655

Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val

660 665 670

Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser

675 680 685

Gln Glu Leu Gln

690

Claims (11)

1.PCSK9抑制剂在制备治疗色素脱失性疾病的产品中的应用，其特征在于所述PCSK9是前蛋白转化酶枯草杆菌转化酶/kexin9型，属前蛋白转换酶家族。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述色素脱失性疾病为白癜风。

3.根据权利要求1和2所述的应用，其特征在于，所述PCSK9抑制剂包括但不限于PCSK9小分子化合物抑制剂、PCSK9干扰RNAi抑制剂、PCSK9单克隆抗体抑制剂、PCSK9模拟肽抑制剂、PCSK9模拟抗体蛋白抑制剂、PCSK9反义寡核苷酸抑制剂或PCSK9疫苗抑制剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCSK9抑制剂为PCSK9小分子化合物抑制剂、PCSK9干扰RNAi抑制剂、PCSK9单克隆抗体抑制剂。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCSK9小分子化合物抑制剂包括但不限于如式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ或式Ⅳ所示的化合物，

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCSK9单克隆抗体抑制剂包括但不限于Abcam公司的抗体ab84041，或依洛尤单抗，或阿利西尤单抗，或重组人源化抗PCSK9单克隆抗体JS002，或重组全人源抗PCSK9单克隆抗体，或PCSK9单克隆抗体LY3015014。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PCSK9干扰RNAi抑制剂包括但不限于Inclisran注射剂、ALN-PCS注射剂或ALN-PCSsc注射剂。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PCSK9模拟肽抑制剂和PCSK9模拟抗体蛋白抑制剂包括但不限于Abcam公司的多肽ab32727，或模拟抗体蛋白DS9001，或PCSK9人抗体-抗原结合片段1G08。

9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCSK9反义寡核苷酸抑制剂包括但不限于Santaris Pharma公司的SPC5001；所述PCSK9疫苗抑制剂包括但不限于PCSK9疫苗AT04A或PCSK9疫苗AT06A。

10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于PCSK9抑制剂可单独使用，也可以联合其他治疗方法或药物治疗色素脱失性疾病。

11.根据权利要求10所述的产品，其特征在于，所述PCSK9抑制剂选自PCSK9小分子化合物抑制剂、PCSK9干扰RNAi抑制剂、PCSK9单克隆抗体抑制剂、PCSK9模拟肽抑制剂、PCSK9模拟抗体蛋白抑制剂、PCSK9反义寡核苷酸抑制剂或PCSK9疫苗抑制剂。