CN116077503A - Mettl3酶抑制剂在制备白癜风药物中的应用及其药物 - Google Patents

Mettl3酶抑制剂在制备白癜风药物中的应用及其药物 Download PDF

Info

Publication number
CN116077503A
CN116077503A CN202211584464.2A CN202211584464A CN116077503A CN 116077503 A CN116077503 A CN 116077503A CN 202211584464 A CN202211584464 A CN 202211584464A CN 116077503 A CN116077503 A CN 116077503A
Authority
CN
China
Prior art keywords
vitiligo
mettl3
expression
skin
medicament
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211584464.2A
Other languages
English (en)
Inventor
李春英
李舒丽
张喆
陈佳希
郭森
易秀莉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Air Force Medical University of PLA
Original Assignee
Air Force Medical University of PLA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Air Force Medical University of PLA filed Critical Air Force Medical University of PLA
Priority to CN202211584464.2A priority Critical patent/CN116077503A/zh
Publication of CN116077503A publication Critical patent/CN116077503A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了METTL3酶抑制剂在制备白癜风药物中的应用及其药物，属于白癜风治疗技术领域，本发明公开了METTL3酶抑制剂在制备白癜风药物中的应用，及其METTL3酶抑制剂用于制备治疗白癜风的药物中的用途，寻找了一种新的治疗白癜风的治疗途径及药物，进而延缓白癜风白斑进展进而治疗白癜风。

Description

METTL3酶抑制剂在制备白癜风药物中的应用及其药物
技术领域
本发明涉及白癜风治疗技术领域，尤其涉及METTL3酶抑制剂在制备白癜风药物中的应用及其药物。
背景技术
白癜风是由于表皮和粘膜黑素细胞被破坏所导致的一种色素脱失性皮肤病，对患者的容貌和心理健康造成严重影响。近些年国内外研究证实环境因素中由氧化应激启动的皮肤局部免疫微环境紊乱，从而介导CD8+T细胞分泌穿孔素、IFN-γ、颗粒酶B等毒性物质杀伤黑素细胞是白癜风发病的关键环节。在氧化应激启动自身免疫的过程中，皮肤局部其他常驻细胞，如角质形成细胞、成纤维细胞也发挥重要作用。但是当各种因素引起角质形成细胞功能异常时，其通过旁分泌多种促炎因子打破免疫稳态，造成表皮局部免疫微环境紊乱，进而参与白癜风等多种皮肤疾病发生和进展，然而，外界环境有害刺激作用下角质形成细胞功能异常，进而参与白癜风的具体发病机制尚不完全清楚。
在外界氧化应激等长期有害刺激作用下，细胞内部遗传物质发生表观遗传重编程，能够通过调控基因产物表达而影响细胞功能，参与各种疾病发生和发展，如白血病、黑色瘤、肺癌、银屑病等。表观遗传学修饰产生的表型不依赖于DNA序列，过程可逆并且易被重塑，在不同外界刺激、疾病状态、发育过程等生理病理状态下具有重要作用。目前已知发生于真核生物表观遗传修饰方式主要包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化及泛素化等。METTL3酶属于甲基转移酶，目前STM2457通过结合METTL3的SAM(S-adenosyl methionine，腺苷甲硫氨酸)结合位点可抑制METTL3的甲基转移酶的活性，进而显著降低了来自白血病患者的细胞系的生长和增殖，并诱发细胞凋亡以杀死癌细胞。但是目前尚未发现该抑制剂在白癜风治疗上的应用。因此，通过研究表观遗传修饰在氧化应激介导白癜风异常免疫应答的具体作用机制以及结合METTL3酶抑制白癜风是有望成为白癜风治疗的新前景，为白癜风未来靶向治疗提供新策略。
发明内容
因此，本发明的目的是寻找一种新的治疗白癜风的治疗途径及药物，通过抑制METTL3酶来抑制白癜风的病发，进而延缓白癜风白斑进展进而治疗白癜风。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
METTL3酶抑制剂在制备白癜风药物中的应用。
进一步，所述METTL3酶抑制剂为STM2457。
进一步，所述METTL3酶抑制剂通过抑制METTL3酶和YTHDC1的联合表达进而降低S100A9表达的来治疗白癜风。
实验验证了白癜风患者不同皮肤受累部位的METTL3表达较健康人皮肤显著上调，且主要表达于角质形成细胞，同时角质形成细胞通过旁分泌S100A9增强白癜风CD8+T细胞杀伤效应功能并促进DC细胞成熟，进而促进白癜风的发病。本发明发现了STM2457抑制剂的新用途，可以抑制METTL3酶和YTHDC1的联合表达进而降低S100A9表达的来治疗白癜风。
本发明还公开了一种治疗白癜风的药物，所述药物包括METTL3酶抑制剂。
进一步，所述METTL3酶抑制剂为STM2457。
进一步，所述药物可以制成注射液、乳膏、软膏、擦剂使用。
进一步，所述STM2457与医学上可接受的辅料一起制成药物使用，当制成乳膏时，所述STM2457可与硬脂酸、十八醇、液体石蜡、三乙醇胺、甘油、乙二胺四乙酸二钠、凡士林联合使用。
进一步，所述STM2457在药物中的浓度为0.01-0.1％。
有益效果：
本发明发现了STM2457抑制剂的新用途，可以抑制METTL3酶和YTHDC1的联合表达进而降低S100A9表达的来治疗白癜风，且通过小鼠实验可知，将STM2457抑制剂制成乳膏后可抑制白癜风的病发，进而延缓白癜风白斑进展进而治疗白癜风。
附图说明
图1：白癜风患者皮损及健康人表皮中METTL3表达及统计图(A.免疫荧光检测白癜风患者皮损及健康人表皮中METTL3表达；B.免疫荧光强度统计分析)；
图2：白癜风皮损与正常疱皮中METTL3表达统计图(A.qRT-PCR检测白癜风皮损及正常皮肤疱皮中METTL3 mRNA表达水平；B.Western-blot检测白癜风皮损(L)及正常皮肤(N)疱皮中METTL3蛋白表达水平)；
图3：过氧化氢刺激下角质形成细胞中METTL3表达统计图(A.qRT-PCR检测METTL3mRNA表达水平；B.Westernblot检测METTL3蛋白表达水平)；
图4：氧化应激诱导角质形成细胞m6A整体水平图(比色法检测m6A整体修饰水平)；
图5：氧化应激下干涉METTL3下调角质形成细胞中整体m6A修饰水平图(A-B.Western blot检测METTL3蛋白表达水平；C.qRT-PCR检测METTL3mRNA表达水平；D.比色法检测HaCaT中m6A修饰整体水平)；
图6：白癜风患者血清中S100A9、CCL5与健康人表达对比图(A-D.ELISA检测快速进期白癜风患者血清和健康对照血清中SAA1、S100A9、CCL5、LCN2表达)；
图7：白癜风皮损疱液中S100A9、SAA1、CCL5与正常皮肤表达对比图(A-D.ELISA检测白癜风患者皮损和正常皮肤庖液中SAA1、CCL5、S100A9、LCN2表达)；
图8：白癜风皮损疱皮中S100A9、SAA1 mRNA与正常皮肤表达对比图(A-D.qRT-PCR检测白癜风患者皮损和正常皮肤疱皮中SAA1、CCL5、S100A9、LCN2 mRNA表达)；
图9：氧化应激下干涉METTL3下调HaCaT细胞中SAA1、S100A9表达图(A C qRt-PCR检测SAA1、S100A9 mRNA表达水平；B D.Western blot检测SAA1、S100A9蛋白表达水平)；
图10：METTL3过表达慢病毒稳转HaCaT细胞系构建(Western blot检测METTL3蛋白表达水平)；
图11：氧化应激下METTL3协同YTHDC1促进S100A9表达图(A C.qRT-PCR检测SAA1和S100A9 mRNA表达水平；B D.Western blot检测SAA1和S100A9蛋白表达水平)；
图12：YTHDC1提高S100A9 mRNA稳定性图(A B.qRT-PCR检测SAA1、S100A9 mRNA表达水平)；
图13：S100A9显著提高细胞毒性CD8+T细胞效应功能(A B.流式细胞分析术检测IFN-γ+CD8+T细胞，Perforin+CD8+T细胞比例，ns无显著差异)；
图14：角质形成细胞中METTL3促进细胞毒性CD8+T细胞杀伤功能图(A B.流式细胞分析术检测IFN-γ+CD8+T细胞，Perforin+CD8+T细胞比例)；
图15：S100A9显著促进白癜风患者DC细胞成熟(流式细胞分析术检测CD80+CD11C+、CD86+CD11C+、HLA-DR+CD11C+细胞比例)
图16：角质形成细胞中METTL3促进DC细胞成熟(流式细胞分析术检测CD80+CD11C+、CD86+CD11C+、HLA-DR+CD11C+细胞比例)；
图17：白癜风小鼠实验图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明：
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：METTL3酶在白癜风皮损处表达
为了明确METTL3酶在白癜风皮损中表达较健康人是否存在异常，应先获取白癜风皮损样本。
进展期白癜风入组条件：1)非曝光部位皮损；2)不合并其他自身免疫性疾病。于白癜风专病门诊收集8例进展期白癜风患者皮损，排除伴有其他自身免疫疾病；同时于本院整形外科收集年龄及性别相匹配的8例胸腹部整形手术患者皮肤组织。白癜风和健康对照皮肤组织获得后进行石蜡包埋，用于后续免疫荧光实验。入组白癜风患者及健康志愿者均予以告知实验目的，并且通过本院伦理委员会认证。
取健康人皮肤组织(n＝8)和进展期白癜风患者皮损组织(n＝8)石蜡切片，进行METTL3免疫荧光染色。结果显示，同健康人相比，进展期白癜风患者表皮角质形成细胞中METTL3表达上调2.625±0.873倍(P＝0.0037，n＝8，vs healthy controls)(得到的结果如图1-A)，每张组织切片选取10个视野图片，荧光强度分析结果显示，白癜风患者表皮中METTL3表达显著高于健康对照组，且主要表达于角质形成细胞(图1-B)。
由此可知，白癜风皮损中METTL3表达显著高于健康对照。
实施例2：白癜风白斑疱皮中METTL3表达
由于不同个体之间m6A甲基化修饰差异较大，因此我们进一步白癜风表皮移植手术中取12例稳定期白癜风患者皮损和自身正常皮肤负压吸引疱皮进行分析，应先获取白癜风疱皮样本。
稳定期白癜风入组条件：1)原白斑面积近1年无扩大或出现新发皮损；2)并且未出现同型反应；3)白癜风疾病活动评分(VIDA)为0分。于皮肤外科收集接受自体表皮移植手术治疗稳定期白癜风患者皮损和非皮损疱皮各18例。收集自体表皮移植手术中自身正常皮肤和皮损负压吸引疱皮组织，放入含有组织冻存液的1.5mL EP管中，后冻存于-80℃用于后续实验。入组白癜风患者均予以告知实验目的，并且通过本院伦理委员会认证。
样本收集后分别提取疱皮中蛋白及总RNA，通过qRT-PCR检测METTL3mRNA表达水平；通过Westernblot检测METTL3蛋白表达水平。
结果显示：(1)白癜风患者皮损疱皮中METTL3 mRNA较正常皮肤表达水平显著上调1.805±0.5007倍(P＝0.0022，n＝12，vs Non-Lesional skins，图2-A)；(2)Western blot同样显示，白癜风患者皮损疱皮中METTL3较正常皮肤蛋白表达水平显著升高(图2-B)。
实施例3：氧化应激对角质形成细胞METTL3和m6A整体水平的影响
HaCaT细胞(人永生化角质形成细胞)培养于DMEM培养基，培养基中加入10％胎牛血清，于细胞孵箱(5％CO2，37℃)进行常规细胞培养，细胞刺激处理时换用含血清新鲜培养基。
1、体外给予HaCaT细胞H2O2处理，模拟并构建白癜风氧化应激模型。用不同浓度H2O2(100μM、200μM、300μM)处理HaCaT细胞24h后，提取细胞总RNA及蛋白，通过qRT-PCR检测METTL3 mRNA表达水平；通过Westernblot检测METTL3蛋白表达水平。
结果显示：(1)不同浓度H2O2处理后，HaCaT细胞中METTL3 mRNA表达水平显著上调(图3-A)；(2)Western blot结果显示，不同浓度H2O2处理后HaCaT细胞中METTL3蛋白表达水平显著上调，且与mRNA变化趋势一致(图3-B)。(*P＜0.05，***P＜0.001，vs Control)
2、用不同浓度H2O2(100μM、200μM、300μM)处理HaCaT细胞24h后，通过比色法测定m6A整体修饰水平。结果显示，在100μM和200μM H2O2处理HaCaT细胞m6A整体修饰水平轻度升高，并且在300μM H2O2处理条件下升高最显著(图4)(***P＜0.001，****P＜0.0001，vsControl)。因此，在300μM H2O2处理HaCaT细胞条件下，METTL3和m6A整体修饰水平显著升高，此浓度可继续用于后续实验。
3、转染五条不同序列的METTL3-siRNA干涉片段和一条对照NC-siRNA干涉片段至HaCaT细胞，通过Western blot检测METTL3-siRNA干涉效率，后续实验采用干涉效率最好的两条干涉片段进行。将METTL3-siRNA和NC-siRNA干涉片段转染至HaCaT细胞，48h后用300μMH2O2继续处理HaCaT细胞24h，通过qRT-PCR和Western blot分别检测METTL3蛋白和mRNA表达水平；通过比色法测定m6A整体修饰水平。其中，五条METTL3-siRNA和两条YTHDC1-siRNA委托苏州吉玛生物科技公司设计并合成，序列如表1所示：
表1siRNA(干涉片段)序列
结果显示：(1)与NC-siRNA组相比，五条不同METTL3-siRNA干涉组HaCaT细胞中METTL3蛋白水平表达均显著降低，说明干涉效率较好(图5-A)；(2)H2O2处理条件下，METTL3-siRNA干涉组METTL3蛋白及mRNA水平均显著降低(图5-B-C)；(3)在H2O2处理条件下，m6A整体修饰水平升高，且METTL3-siRNA干涉组m6A整体修饰水平下降(图5-D)。(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001，vs Control)。
实施例4：白癜风患者的蛋白表达水平变化
1、血清中S100A9和CCL5表达水平变化
收集血清样本：进展期白癜风入组条件：1)原白斑面积近3月以内扩大；2)或者有新发白斑出现；3)白癜风疾病活动评分(VIDA)≥4分。于白癜风专病门诊收集快速进展期白癜风患者和健康人血液各20例。黄色促凝管收集上述快速进展期白癜风患者及健康对照者静脉血各4mL，1300rpm离心5mins后取上清血浆至1.5mL EP管冻存至-80℃备用；另用EDTA抗凝紫管收集白癜风患者外周静脉血20mL，分离外周血单个核细胞(PBMCs)，随后立刻给予不同处理进行后续实验。入组白癜风患者及健康志愿者均予以告知实验目的，并且通过本院伦理委员会认证。
分别取健康人(n＝20)和快速进展期白癜风患者(n＝20)血清，通过ELISA检测SAA1、S100A9、LCN2、CCL5四个分泌型蛋白表达水平。
结果显示：(1)同健康人相比，快速进展期白癜风患者血清中SAA1、LCN2表达水平无差异(ns无显著差异，P＝0.5570or 0.9828，图6-A-C)；(2)同健康人相比，快速进展期白癜风患者血清中S100A9、CCL5表达水平显著升高(*P＜0.05，**P＜0.01，vs HealthyControls，图6-B-D)。上述结果提示，快速进展期白癜风患者血清中S100A9和SAA1表达显著高于正常人健康对照。
2、庖液中S100A9、SAA1、CCL5表达水平变化
白癜风庖液样本收集：稳定期白癜风入组条件：1)原白斑面积近1年无扩大或出现新发皮损；2)并且未出现同型反应；3)白癜风疾病活动评分(VIDA)为0分。于皮肤外科收集接受自体表皮移植手术治疗稳定期白癜风患者皮损和正常皮肤庖液各20例。10mL一次性针管抽取自体表皮移植手术中自身正常皮肤和皮损负压吸引庖液，1000rpm离心20mins去除杂质后存于1.5mL EP管中，冻存于-80℃用于后续实验。入组白癜风患者均予以告知实验目的，并且通过本院伦理委员会认证。
由于不同个体之间甲基化差异较大，因此我们进一步取白癜风患者表皮移植手术中20例皮损和20例正常皮肤负压吸引庖液进行ELISA检测。结果显示：(1)同自身正常皮肤相比，白癜风皮损庖液中LCN2表达水平无差异(ns无显著差异，P＝0.8022，vs Non-Lesional skins，图7-B)；(2)同自身正常皮肤相比，白癜风皮损庖液中SAA1、S100A9、CCL5表达水平显著升高(图7-A-C-D)(**P＜0.01，****P＜0.0001，vs Non-Lesional skins)。上述结果证实，快速进展期白癜风患者皮损庖液中S100A9和SAA1表达显著高于自身正常皮肤。
3、疱皮中SAA1、S100A9 mRNA表达升高
通过qRT-PCR检测了12对白癜风患者表皮移植手术中皮损和正常皮肤疱皮中四种细胞因子的mRNA表达水平。结果显示：(1)同自身正常皮肤相比，白癜风皮损庖皮中SAA1、S100A9 mRNA表达显著升高(图8-A-B)；(2)同自身正常皮肤庖皮相比，白癜风皮损庖皮中LCN2 mRNA表达水平无差异(ns无显著差异，P＝0.9060，vs Non-Lesional skins，图8-D)，CCL5 mRNA疱皮中表达过低无法检测出(图8-C)(**P＜0.01，***P＜0.001，vs Non-Lesional skins)。上述结果证实，快速进展期白癜风患者皮损疱皮中S100A9和SAA1mRNA表达显著高于自身正常皮肤。
4、干涉角质形成细胞中METTL3抑制SAA1、S100A9表达
通过实验1-3发现METTL3下游靶基因SAA1、S100A9在白癜风患者血清、庖液、疱皮中升高。为了验证METTL3对SAA1和S100A9的调控作用，转染METTL3-siRNA和NC-siRNA至HaCaT细胞，48h后给予300μM H2O2继续处理24h，通过qRT-PCR和Western blot检测过氧化氢条件下SAA1和S100A9表达情况。结果显示，METTL3-siRNA干涉组中，SAA1、S100A9mRNA水平显著下降、且蛋白水平也显著下降(图9)(*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.0001，vsControl)。
实施例5：METTL3协同YTHDC1调控对S100A9表达影响
1、转染METTL3-LV慢病毒至HaCaT细胞，给予5ug/ml嘌呤霉素筛选后得到METTL3过表达慢病毒稳转HaCaT细胞系。通过Western blot验证了METTL3-LV慢病毒过表达效率(图10)，结果显示，METTL3-LV转染后HaCaT细胞中METTL3表达显著升高，说明过表达效率较好，可继续用于后续实验。
在METTL3-LV慢病毒稳转细胞系中转染YTHDC1-siRNA和NC-siRNA干涉片段，48h后继续给予300μM H2O2培养24h，通过qRT-PCR和Western blot分别检测SAA1、S100A9 mRNA和蛋白水平表达。结果显示：(1)在OE-NC和OE-METTL3转染组，干涉YTHDC1均能够降低SAA1、S100A9 mRNA表达(图11-A-C)；(2)在OE-NC转染组，干涉YTHDC1能够降低SAA1、S100A9蛋白水平表达，但在OE-METTL3组，干涉YTHDC1降低S100A9表达但并不降低SAA1表达(图11-B-D)(*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.0001，vs Control)。以上结果证实，METTL3对S100A9的调控依赖于YTHDC1，而对SAA1的调控不依赖于YTHDC1。
2、转染NC-siRNA、METTL3-siRNA、YTHDC1-siRNA干涉片段至HaCaT细胞，48h，继续给予5ug/ml放线菌素D分别刺激0、3、6、9h后收取总RNA，通过qRT-PCR检测不同时间段SAA1、S100A9剩余mRNA相对含量，以mRNA降解速率来表示其稳定性。结果显示：(1)METTL3-siRNA转染组SAA1、S100A9 mRNA稳定性均下降；(2)YTHDC1-siRNA转染组S100A9mRNA稳定性下降，但SAA1 mRNA稳定性上升(图12-A-B)(**P＜0.01，***P＜0.001，vs Control)。以上结果证实，METTL3对SAA1、S100A9 mRNA进行m6A修饰后，能够提高其mRNA稳定性，并且YTHDC1能够参与调控S100A9 mRNA稳定性，但不影响SAA1 mRNA稳定性。
实施例6：S100A9对白癜风患者CD8+T细胞表达穿孔素的影响
CD8+T分泌IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素等毒型物质能够引起黑素细胞被特异性杀伤，进而引发白癜风，前期验证了白癜风角质形成细胞中METTL3联合YTHDC1通过影响S100A9mRNA稳定性来促进其表达。为了明确S100A9对CD8+T细胞杀伤功能影响，接下来抽取白癜风患者外周血，分离PBMCs后给予CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激，同时给予0、5、10、15μg/ml不同浓度重组人S100A9蛋白共刺24h，通过流式细胞分析术检测IFN-γ+CD8+T细胞、Perforin+CD8+T细胞的所占PBMCs中的比例。结果显示，10、15μg/ml重组人S100A9蛋白能够显著降低Perforin+CD8+T细胞在PBMCs中所占比例，而对IFN-γ+CD8+T细胞比例无影响，说明METTL3下游靶基因S100A9影响CD8+T细胞表达穿孔素(图13-A-B)(ns无显著差异，**P＜0.01，vsControl)。
实施例7：角质形成细胞METTL3高表达促进CD8+T细胞杀伤功能
上述实验证实了METTL3下游靶基因S100A9能够刺激CD8+T细胞分泌穿孔素，为了探究角质形成细胞中METTL3异常是否直接影响CD8+T细胞杀伤功能，我们在HaCaT细胞中转染NC-siRNA和NC-siMETTL3干涉片段，48h后给予300μM H2O2继续培养24h并收集上清。接下来抽取白癜风患者外周血并分离PBMCs，将PBMCs与上步收集的上清共培养，并用CD3/CD28抗体偶联磁珠进行刺激，24h后通过流式细胞分析术检测IFN-γ+CD8+T细胞、Perforin+CD8+T细胞的所占PBMCs中的比例。结果显示，较NC-siRNA组相比，HaCaT细胞中干涉METTL3后Perforin+CD8+T细胞比例显著降低，而IFN-γ+CD8+T细胞比例表达无显著改变。结合以上实验进一步证实了角质形成细胞中METTL3异常能够通过调控S100A9分泌来调控细胞毒性CD8+T细胞杀伤效应。(图14-A-B)(ns无显著差异，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，vsControl)。
实施例8：S100A9促进白癜风DC细胞成熟
S100A9作为一种DAMPs，能够通过与TLR4结合激活固有免疫应答，参与多种免疫炎症过程。为了进一步明确S100A9对DC成熟及抗原提呈作用影响，抽取白癜风患者外周血，分离PBMCs后与氧化应激状态下角质形成细胞上清共孵育24h，并给予S100A9抑制剂Paquinimode刺激24h，通过流式细胞分析术检测CD80+CD11C+、CD86+CD11C+、HLA-DR+CD11C+细胞所占PBMCs中的比例。结果显示，氧化应激下S100A9抑制剂Paquinimode能够显著降低CD80+CD11C+、CD86+CD11C+细胞在PBMCs中所占比例，而对HLA-DR+CD11C+细胞比例无影响，说明METTL3下游靶基因S100A9影响DC细胞成熟过程(图15)(ns无显著差异，*P＜0.05vsControl)。
实施例9：角质形成细胞METTL3高表达促进DC细胞成熟
上述实验证实了METTL3下游靶基因S100A9能够促进DC细胞成熟，为了探究角质形成细胞中METTL3异常是否直接影响DC细胞成熟过程，我们在HaCaT细胞中转染NC-siRNA和NC-siMETTL3干涉片段，48h后给予300μM H2O2继续培养24h并收集上清。接下来我们抽取白癜风患者外周血并分离PBMCs，将PBMCs与上步收集的上清共培养，24h后通过流式细胞分析术检测CD80+CD11C+、CD86+CD11C+、HLA-DR+CD11C+细胞所占PBMCs中的比例。结果显示，较NC-siRNA组相比，HaCaT细胞中干涉METTL3后CD80+CD11C+、CD86+CD11C+细胞、HLA-DR+CD11C+细胞比例均显著降低。以上实验证实角质形成细胞中METTL3异常能够调控DC成熟，进而参与固有免疫应答。(图16)(**P＜0.01vs Control)。
综合分析，由以上实施例可知：
1、氧化应激下白癜风患者角质形成细胞中METTL3酶介导的m6A甲基化修饰异常能够调控S100A9、SAA1等促炎因子表达，角质形成细胞通过旁分泌S100A9增强白癜风CD8+T细胞杀伤效应功能并促进DC细胞成熟。
2、白癜风患者皮损表皮、白斑疱皮中METTL3表达较健康人皮肤显著上调，且主要表达于角质形成细胞，提示酶METTL3在同一个体不同皮肤受累部位表达水平存在差异，即氧化应激通过介导甲基转移酶METTL3表达来调控白癜风角质形成细胞功能。
3、对METTL3下游靶基因在白癜风中的表达进行分析，结果发现急性进展期白癜风血清中S100A9、CCL5分泌较健康人显著升高，并且皮损庖液中CCL5、S100A9、SAA1显著升高，但仅有S100A9、SAA1在皮损疱皮中表达升高，而CCL5在表皮中表达量过低无法被检测，因此，证实白癜风皮损局部角质形成细胞SAA1、S100A9表达升高，主要受到METTL3调控，并且氧化应激是介导这一结果的始动因素。
4、氧化应激诱导角质形成细胞中METTL3异常表达，通过联合YTHDC1共同促进S100A9 mRNA表达。
5、白癜风白斑S100A9调控CD8+T细胞免疫应答这一白癜风发病关键效应环节，即S100A9通过调控表皮局部免疫微环境来参与白癜风发病和发展。氧化应激下白癜风皮损表皮角质形成细胞中m6A修饰酶METTL3表达显著升高，通过促进S100A9表达调控CD8+T细胞杀伤效应功能和DC成熟过程，进而参与白癜风发生发展。
基于上述结论，本发明对METTL3抑制剂STM2457用于白癜风治疗进行实验。
实施例10：STM2457乳膏制备
取100mg STM2457抑制剂，36g硬脂酸、36g十八醇、72g液体石蜡、28g三乙醇胺、100g甘油、0.4g乙二胺四乙酸二钠、36g凡士林、600g蒸馏水，其中STM2457抑制剂的浓度约为0.011％；
将STM2457抑制剂溶于适量的二甲基亚砜待用；
将乙二胺四乙酸二钠、三乙醇胺、甘油、蒸馏水混合，加热至70℃融化，融化后制成水相，将凡士林、十八醇、硬脂酸、液体石蜡加热至80℃，搅拌均匀后制成油相；
将溶解的STM2457抑制剂、水相缓慢加入油相中，停止加热，超声搅拌均匀得到STM2457乳膏。
实施例11：METTL3酶抑制剂在治疗白癜风小鼠上的应用
1、实验材料
1.1白癜风小鼠：C57BL/6小鼠，雌性，在常规实验室条件下饲养；
1.1试剂：实施例10制备的STM2457乳膏；
1.3建立白癜风样模型：
以8-10周龄、体重20g左右的野生型C57BL/6J鼠为背景鼠诱导白癜风小鼠模型。
第0天，向剃毛后的小鼠背部皮内注射接种体外培养的活性良好的小鼠黑素瘤细胞系B16F10，每只小鼠注射2×105个B16F10细胞。
第4天观察接种处是否形成米粒大的肿瘤。并给予小鼠腹腔注射CD4中和抗体，每克小鼠注射10μg CD4中和抗体。
第10天再次给予小鼠腹腔注射相同剂量的CD4中和抗体。
第12天手术彻底切除皮内肿瘤组织，并进行皮肤缝合。每日观察小鼠肿瘤切除后状态，将切除肿瘤后出现复发性黑素瘤的小鼠剔除出组。
白癜风小鼠诱导第30天，给予白癜风小鼠尾部表皮whole-mount染色，检验白癜风小鼠CD8+T细胞浸润，判断白癜风小鼠成模情况。
1.4用药：白癜风小鼠诱导第35天，将白癜风小鼠尾部表皮CD8+T细胞浸润程度一致的小鼠随机分组至阴性对照组、实验组，每组各10只。
阴性对照组：每天涂抹凡士林50mg 1次；实验组：每天涂抹STM2457乳膏50mg 1次。各组小鼠全身涂抹，连续用药40天，停药15天后观察小鼠尾部毛发颜色和脱色面积变化。
1.5评估标准：每日肉眼观察毛发脱色情况，并记录积分。将脱色部位分为用药部位和非用药部位，每个部位总分为5分，每只小鼠共10分。
小鼠毛发脱色评分标准：
0分为毛发无脱色；
1分为毛发脱色面积0-10％；
2分为毛发脱色面积11％-25％；
3分为毛发脱色面积26％-50％；
4分为毛发脱色面积51％-75％；
5分为毛发脱色面积76％-100％。
1.6结果与分析：
得到的结果如表1和图17所示：
表1
组别 发生率 出现脱色时间 平均脱色时间 平均积分
阴性对照组 100％ 40天 44.1天 4.5
实验组 62％ 65天 68.3天 3.1
分析：
阴性对照组：在实验第40天开始出现点状脱色，第44天全部小鼠出现脱色且脱色斑逐渐扩大，用凡士林40天时，皮损扩大并部分融合；脱色部位平均积分为4.5分。
实验组：在实验第65天开始出现点状脱色，第67天全部小鼠出现脱色且脱色斑逐渐扩大，用STM2457乳膏40天时，皮损稍扩大并部分融合；脱色部位平均积分为3.1分。
由上述结果可知，STM2457乳膏可以延缓白癜风白斑进展进而治疗白癜风。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (8)

1.METTL3酶抑制剂在制备白癜风药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述METTL3酶抑制剂为STM2457。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述METTL3酶抑制剂通过抑制METTL3酶和YTHDC1的联合表达进而降低S100A9表达的来治疗白癜风。
4.一种治疗白癜风的药物，其特征在于，所述药物包括METTL3酶抑制剂。
5.根据权利要求4所述的一种治疗白癜风的药物，其特征在于，所述METTL3酶抑制剂为STM2457。
6.根据权利要求5所述的一种治疗白癜风的药物，其特征在于，所述STM2457与医学上可接受的辅料一起制成药物使用。
7.根据权利要求6所述的一种治疗白癜风的药物，其特征在于，所述药物制成乳膏、软膏、擦剂、注射液中的一种进行使用。
8.根据权利要求7所述的一种治疗白癜风的药物，其特征在于，所述制成乳膏的辅料包括硬脂酸、十八醇、液体石蜡、三乙醇胺、甘油、乙二胺四乙酸二钠、凡士林。
CN202211584464.2A 2022-12-09 2022-12-09 Mettl3酶抑制剂在制备白癜风药物中的应用及其药物 Pending CN116077503A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211584464.2A CN116077503A (zh) 2022-12-09 2022-12-09 Mettl3酶抑制剂在制备白癜风药物中的应用及其药物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211584464.2A CN116077503A (zh) 2022-12-09 2022-12-09 Mettl3酶抑制剂在制备白癜风药物中的应用及其药物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116077503A true CN116077503A (zh) 2023-05-09

Family

ID=86207218

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211584464.2A Pending CN116077503A (zh) 2022-12-09 2022-12-09 Mettl3酶抑制剂在制备白癜风药物中的应用及其药物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116077503A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2015296412B2 (en) Applications of surfactin in cosmetic products and thereof
KR101723265B1 (ko) mTOR/STAT3 신호억제제 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포 및 이를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물
Guo et al. Emerging roles of adipose tissue in the pathogenesis of psoriasis and atopic dermatitis in obesity
AU2010258358A1 (en) Compositions and methods for increasing lifespan and health span
CN113846047A (zh) 一种肾靶向载药外泌体及应用和治疗肾脏疾病药物
EP2788016A1 (en) Compositions for preventing or treating adverse reactions of egfr inhibition
US20170204151A1 (en) Mesenchymal Stem Cells Expressing Biomarkers that Predict the Effectiveness of Mesenchymal Stem Cells for Treating Diseases and Disorders
US20230193276A1 (en) Composition of drug targets and method of using thereof
EP3682889B1 (en) Modulating inflammasome activation of myeloid-derived suppressor cells for treating gvhd
CN116077503A (zh) Mettl3酶抑制剂在制备白癜风药物中的应用及其药物
Wang et al. Suppressive effect of β, β-dimethylacryloyl alkannin on activated dendritic cells in psoriasis by the TLR7/8 pathway
KR20160122094A (ko) 알러지 유발 물질을 저감시킨 정제 봉독을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물
He et al. Amygdalin ameliorates alopecia areata on C3H/HeJ mice by inhibiting inflammation through JAK2/STAT3 pathway
EP3400937B1 (en) Use of butylidenephthalide
CN114533877B (zh) Bag3抑制剂在制备治疗瘢痕产品中的用途
CN113876956B (zh) Pcsk9抑制剂在制备促进皮肤色素生成产品中的应用
CN112569338B (zh) Tdfa在制备预防和/或治疗眼表炎症疾病的药物中的应用
CN116251100B (zh) Tpen在制备抗皮肤衰老或抗皮炎的组合物产品中的应用
Huang et al. The Reactive Astrocytes After Surgical Brain Injury Potentiates the Migration, Invasion, and Angiogenesis of C6 Glioma
EP4022039B1 (en) Activated mesenchymal stem cells for use in treating limb ischemia
US11413313B2 (en) Pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising clonal stem cells
CN116059200A (zh) 一种钩吻绿碱在制备治疗关节炎的药物中的应用
CN117904277A (zh) 一种神经损伤标志物atf3及其应用
CN115120730A (zh) Pcsk9抑制剂在制备预防和治疗疤痕产品中的应用
WO2023277730A1 (ru) Лекарственное средство для профилактики заражения sars-cov-2

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination