CN116251100B - Tpen在制备抗皮肤衰老或抗皮炎的组合物产品中的应用 - Google Patents

Tpen在制备抗皮肤衰老或抗皮炎的组合物产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了四(2‑吡啶甲基)乙二胺(TPEN)或其药学或化妆品学上可接受的衍生物在制备用于抗皮肤衰老和/或抗皮炎的组合物产品中的用途，以及一种含四(2‑吡啶甲基)乙二胺或其药学或化妆品学上可接受的衍生物的外用制剂。本发明首次发现，TPEN或其药学或化妆品学上可接受的衍生物可用于对抗皮肤衰老迹象，并可用于治疗皮炎，特别是老年性无菌性皮炎，在药学或化妆品学领域均具有较大的应用前景。

Description

TPEN在制备抗皮肤衰老或抗皮炎的组合物产品中的应用
技术领域
本发明涉及日用化妆品技术领域，具体涉及TPEN在制备抗皮肤衰老或抗皮炎的组合物产品中的应用。
背景技术
人类皮肤分为表皮和真皮两部分。表皮在皮肤表面，又可分成角质层和生发层两部分；已经角质化的细胞组成角质层，脱落后就成为皮屑；生发层细胞不断分裂，能补充脱落的角质层。真皮为表皮提供坚实的支撑，它也是表皮的滋养元素；真皮主要由成纤维细胞和细胞外基质组成，所述细胞外基质主要由胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和氨基聚糖五类物质组成，这些物质是由成纤维细胞合成的，这些物质中，弹性蛋白是在皮肤的弹性和柔软性中起重要作用的蛋白质。
皮肤衰老主要是由于氧自由基对其的攻击。氧自由基的化学活性特别强，易发生失去或得到电子，使自身稳定，而使其它分子变成活跃游离基。皮肤中氧自由基的产生机制主要包括以下两个方面：一、外界高温、辐射及光照等导致共价键断裂，从而产生外源性自由基；二、体内代谢过程中产生的内源性氧自由基，如慢性疾病、营养失衡、内分泌失调等。氧自由基对皮肤的损害包括：在氧自由基的作用下，蛋白细胞被纤维化，导致皮肤失去弹性，产生皱纹；脂肪细胞发生过氧化反应，令皮肤变得暗沉，逐渐形成色斑；等等。
老年性皮炎一般是指老年性的皮肤瘙痒，患者多为中老年人，其症状主要表现为周身的剧烈瘙痒感，可影响患者睡眠，尤其好发于冬季。老年人的皮下脂肪减少、皮肤变薄、皮脂腺分泌减少等共同作用，导致老年人常出现皮肤瘙痒。患者在感受到冷热变化后尤其容易诱发此症状，多先发作于双下肢，逐渐蔓延至全身。此病刚发作时一般没有皮肤症状，但越是搔抓，痒感越剧烈，所以患者周身常伴有搔抓而来的继发性的皮肤损害，比如苔藓样变、抓痕、湿疹样变等。此病的严重程度和瘙痒程度存在个体差异，多数为阵发性瘙痒，部分严重患者可出现持续性的剧烈痒感，难以忍受。
TPEN，又称TPEDA，全称N,N,N',N'-四(2-吡啶甲基)乙二胺，是一种特定的细胞可渗透的重金属螯合剂。资料显示，TPEN对Zn2+具有高亲和力，对Mg2+和Ca2+等二价离子则具有较低的亲和力。研究表明，TPEN可以诱导多种癌细胞死亡，例如通过活性氧(ROS)信号机制选择性诱导急性白血病细胞凋亡；通过氧化应激抑制自噬诱导胰腺癌细胞死亡；通过螯合铜离子选择性地杀死结肠癌细胞。另外，有研究指出，TPEN能抑制缺氧缺血诱导的神经元死亡。
此外，美国专利No.5,082,851教导，TPEN能够保护心脏组织免受缺血-再灌注伤害，其认为，这种高特异性重金属螯合剂通过在复氧开始之前将氧化还原活性金属(过渡金属)的氧化还原电势改变成非活性形式，并且因此防止有害活性氧类(ROS)的产生和释放而起作用；国际专利申请WO2013/003445教导了TPEN能够为心脏细胞提供高达，但不高于，70％的保护免受缺氧应激损伤。
然而，TPEN对于皮肤衰老的影响或其与老年性皮炎的关系等未见报道。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于提供四(2-吡啶甲基)乙二胺(TPEN)或其药学或化妆品学上可接受的衍生物在制备用于抗皮肤衰老或抗皮炎的组合物产品中的用途，以及一种基于四(2-吡啶甲基)乙二胺(TPEN)或其药学或化妆品学上可接受的衍生物的外用制剂。
解决方案
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了四(2-吡啶甲基)乙二胺(简称TPEN)或其药学或化妆品学上可接受的衍生物在制备用于抗皮肤衰老和/或抗皮炎的组合物产品中的用途。
在可行的实施方案中，所述四(2-吡啶甲基)乙二胺的药学或化妆品学上可接受的衍生物为四(2-吡啶甲基)乙二胺的药学上或化妆品学上可接受的盐。
在具体实施方案中，所述组合物产品被制造成用于在皮肤上施用药学或药妆有效量的四(2-吡啶甲基)乙二胺或其药学或化妆品学上可接受的衍生物。
作为优选，所述四(2-吡啶甲基)乙二胺或其药学或化妆品学上可接受的衍生物占所述组合物产品总重量的0.00084％～0.00338％，优选为0.0012％～0.0026％，最优选为0.00169％。
可行地，所述皮肤衰老为选自以下的一种或多种：DNA损伤导致的皮肤衰老、辐射性皮肤早衰、皮肤自然衰老和皮肤光老化。
可行地，所述皮炎为老年性皮炎，优选为老年性无菌性皮肤炎症。
可行地，所述抗皮肤衰老包括以下中的至少一项：
1)减少或防止皮肤细纹或皱纹的出现；
2)增强皮肤弹性；
3)提高皮肤细致度和/或紧致度。
可行地，所述抗皮炎为消除或减轻皮炎症状。
上述用途中，所述四(2-吡啶甲基)乙二胺或其药学或化妆品学上可接受的衍生物用于抗皮肤衰老的机制包括以下中的一种或多种：
1)抑制衰老相关分泌表型的表达；
2)增加皮肤中的胶原蛋白和/或弹性蛋白的含量；和
3)使皮肤中的胶原纤维和/或弹性纤维的排列更加紧密、规则。
衰老相关的分泌表型(即，SASP)，是指衰老细胞分泌的蛋白因子，包括炎症因子、趋化因子、生长因子、基质金属蛋白酶等；SASP与衰老相关疾病发生关系密切，其中，基质金属蛋白酶升高可导致皮肤真皮层中的胶原纤维和弹性纤维降解增加，使皮肤失去弹性、松弛垮塌；另外，老年慢性无菌性炎症也与SASP密切相关，如细胞因子和趋化因子IL-1β、IL-8、VEGF、IL-6、CXCL1、CCL2等均参与老年性慢性皮炎的形成。而TPEN可以抑制SASP的表达，因而，可在一定程度上提高皮肤弹性并减轻老年性慢性皮炎的症状。
在具体实施方案中，所述组合物产品为普通化妆品、药用化妆品或药品。
作为优选，所述组合物产品为外用剂型，包括但不限于以下外用剂型：水剂、乳剂、膏剂、霜剂、啫喱、粉剂、油剂。
在优选的具体实施方案中，所述组合物产品包括：
1)四(2-吡啶甲基)乙二胺，或其药学或化妆品学上可接受的衍生物；
2)药学或化妆品学上可接受的辅料，优选选自载体、赋形剂、溶剂和缓冲液中的一种或多种；以及，
任选地，3)其它活性剂。
进一步优选地，所述其它活性剂包括抗氧化剂、细胞活性剂、补水保湿剂、抗衰老剂和抗皮炎剂中的任意一种或多种。
第二方面，本发明提供了一种外用制剂，所述外用制剂包括：四(2-吡啶甲基)乙二胺或其药学或化妆品学上可接受的衍生物，和基质，其中，所述基质包括：角鲨烷、乳化剂、丙二醇、低分子透明质酸或其盐、高分子透明质酸或其盐和水。
在可行的实施方案中，所述低分子透明质酸或其盐的分子量为10kDa～500kDa，优选100kDa～200kDa；
在可行的实施方案中，所述高分子透明质酸或其盐的分子量为2000kDa～10000kDa，优选5000kDa～6000kDa。
在可行的实施方案中，所述乳化剂为可商购获得的305乳化剂，其成分为聚丙稀酰胺(和)脂肪醇聚氧乙烯醚，例如，由广州天赐高新材料股份有限公司提供。
优选地，所述四(2-吡啶甲基)乙二胺或其药学或化妆品学上可接受的衍生物在所述外用制剂中的浓度为20-80μM，优选为30-60μM，最优选为40μM；
优选地，按重量百分比计，所述基质包括：10％-15％角鲨烷，1％-3％305乳化剂，1％-3％丙二醇，8％-12％低分子透明质酸或其盐(分子量为10kDa～500kDa，优选100kDa～200kDa)，8％-12％高分子透明质酸或其盐(分子量为2000kDa～10000kDa，优选5000kDa～6000kDa)，余量为水；
进一步优选地，所述基质包括：13％角鲨烷，2％305乳化剂，2％丙二醇，10％低分子透明质酸或其盐(分子量为10kDa～500kDa，优选100kDa～200kDa)、10％高分子透明质酸或其盐(分子量为2000kDa～10000kDa，优选5000kDa～6000kDa)，余量为水。
本发明所用的术语“有效量”指有效成分经单次或多次施用于受试者而给受试者提供预期效应的量或剂量；“有效量”可由受试者本人或者医师作为本领域技术人员通过已知技术以及在类似情形下所得的观察结果而确定。
本文中使用的短语“药学或化妆品学上可接受的盐”是指母体化合物的带电种类及其抗衡离子，其通常用于改变母体化合物的溶解性特征和/或减少母体化合物对生物体的任何显著刺激，而不破坏所施用的化合物的生物活性和性质。药学上可接受的盐的实例，没有限制，包括包含如羧酸根或硫酸根阴离子等的阴离子，和/或如，但不限于，铵、钠和钾等的阳离子的盐。在例如Birge等人(J.Pharm.Sci.1977,66:1-19)中描述了合适的盐。
有益效果
本申请的发明人首次发现，TPEN或其药学或化妆品学上可接受的衍生物可用于对抗皮肤衰老迹象，并可用于治疗皮炎，特别是老年性无菌性皮炎。
具体地，发明人通过在博来霉素诱导的衰老皮肤成纤维细胞(HDF)模型和射线诱导的衰老HDF细胞模型上进行实验，证实了TPEN能够显著抑制HDF细胞的衰老相关分泌表型SASP的表达(从而可用于增强皮肤弹性、减轻皮炎症状)，并且，提高衰老细胞或其培养上清中的胶原含量；并且，通过在D-半乳糖诱导的小鼠早衰模型上进行实验，证实了TPEN能够显著提高早衰小鼠皮肤中的胶原纤维和弹性纤维的含量，并使得早衰小鼠皮肤中的胶原纤维和弹性纤维的排列更为紧密、规则；此外，发明人还通过动物实验证明了TPEN的抗皮炎功效；这些结果均表明，TPEN或其药学或化妆品学上可接受的衍生物可用于对抗皮肤衰老迹象(包括：减少或防止皮肤细纹或皱纹的出现；增强皮肤弹性；提高皮肤细致度和/或紧致度)，并可消除或减轻皮炎症状(从而可用于治疗老年性皮炎)，在药学或化妆品学领域均具有较大的应用前景。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1显示了TPEN对博来霉素诱导的衰老皮肤成纤维细胞(HDF)的SASP相关基因(IL1β、IL6、IL8、MMP1、MMP3)的mRNA相对表达水平的影响，如本发明实施例1中记载的；其中，“年轻”示年轻的HDF细胞，“博来霉素”表示博来霉素诱导的衰老HDF细胞，“年轻+TPEN”表示TPEN处理的年轻HDF细胞，“博来霉素+TPEN”表示TPEN处理的衰老HDF细胞。
图2显示了TPEN对博来霉素或射线诱导的衰老皮肤成纤维细胞(HDF)及其培养上清中的胶原含量的影响，如本发明实施例2中记载的；其中，GAPDH为内参蛋白，I型胶原(细胞上清)为HDF细胞培养上清中I型胶原蛋白，I型胶原(细胞)为HDF细胞中I型胶原蛋白；并且，其中，NC为年轻的HDF细胞，Bleo为博来霉素诱导的衰老HDF细胞，IR为射线诱导的衰老HDF细胞，DMSO和TPEN分别指示DMSO处理组和TPEN处理组。
图3显示了TPEN对D-半乳糖诱导的早衰小鼠皮肤中的胶原纤维、弹性纤维含量及形态以及胶原生化指标的影响；其中，图3A表示D-半乳糖诱导的早衰小鼠皮肤切片的masson染色结果，其显示了小鼠皮肤中的胶原纤维；图3B为小鼠皮肤真皮层中胶原纤维含量统计图；图3C为D-半乳糖诱导的早衰小鼠皮肤切片的EVG染色结果，其显示皮肤中的弹性纤维；图3D为小鼠皮肤真皮层中弹性纤维含量统计图；图3E显示小鼠皮肤组织中的羟脯氨酸含量；并且，其中，NC表示对照面霜处理组，TPEN表示含TPEN的面霜处理组；*代表NC组与TPEN组之间的差异的显著性(即，P值)，其中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1：TPEN对博来霉素诱导的HDF细胞衰老模型的SASP的影响
本实施例中，通过博来霉素诱导皮肤成纤维细胞(HDF)衰老，构建细胞衰老模型，并在该细胞衰老模型上检测TPEN对衰老相关的分泌表型(即SASP)的影响；其中，博来霉素诱导HDF细胞衰老模型为本领域公认且常见的细胞衰老模型，并且，SASP是衰老细胞分泌的蛋白因子，包括炎症因子，趋化因子，生长因子，基质金属蛋白酶等；本实施例中，选择经典的SASP相关基因进行检测，所选择的SASP相关基因包括IL1β、IL6、IL8、MMP1、MMP3。
1、细胞模型制备：
通过博来霉素诱导皮肤成纤维细胞(HDF)衰老为常见的细胞衰老模型，其具体构建方法如下：
将代龄为20代的皮肤成纤维细胞(HDF，购自丰晖生物)在DMEM完全培养基中，在37℃、5％CO2下培养，待细胞密度为70％左右时，加入博来霉素(购自Selleck)，终浓度为50μg/ml；24小时后，换成普通培养基(即，DMEM完全培养基)，继续培养6天后即为衰老细胞，培养期间，每2天换液一次。
2、实验分组与处理：
实验共分4组，分别为：
1)年轻的HDF细胞(对应于图1的“年轻”组)：指代龄为20代的HDF细胞经DMSO处理组(即，4ml培养液中含4μl DMSO，即，DMSO的体积含量为1/1000)；
2)博来霉素诱导的衰老HDF细胞(对应于图1的“博来霉素”组)：指按上述程序制备的博来霉素诱导的衰老细胞模型；
3)TPEN处理的年轻HDF细胞(对应于图1的“年轻+TPEN”组)：指上述1)的细胞经2μMTPEN(TPEN购自陶素生化，具体使用时，将TPEN溶于DMSO后再加入细胞培养液中，使得加入后TPEN在培养液中的终浓度为2μM，DMSO在培养液中的体积含量为1/1000左右)处理24小时后，获得的细胞；
4)TPEN处理的衰老HDF细胞(对应于图1的“博来霉素+TPEN”组)：指按上述建模程序用博来霉素诱导HDF细胞衰老期间，在博来霉素处理24小时后，更换成含2μM TPEN的细胞培养液(方式同上述步骤3)继续培养，之后，每次换液也均用含2μM TPEN的细胞培养液。
3、检测方法：
对于上述各实验组，在博来霉素处理7天后，收集细胞，进行RNA提取、逆转录，并通过qPCR法检测各组细胞的SASP相关基因的mRNA相对表达量，GAPDH为对照；qPCR所用引物如下：
IL1β-F：ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA(SEQ ID NO:1)；
IL1β-R：GTCGGAGATTCGTAGCTGGA(SEQ ID NO:2)；
IL6-F：ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG(SEQ ID NO:3)；
IL6-R：CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG(SEQ ID NO:4)；
IL8-F：ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC(SEQ ID NO:5)；
IL8-R：AACCCTCTGCACCCAGTTTTC(SEQ ID NO:6)；
MMP1-F：CTCTGGAGTAATGTCACACCTCT(SEQ ID NO:7)；
MMP1-R：TGTTGGTCCACCTTTCATCTTC(SEQ ID NO:8)；
MMP3-F：CGGTTCCGCCTGTCTCAAG(SEQ ID NO:9)；
MMP3-R：CGCCAAAAGTGCCTGTCTT(SEQ ID NO:10)；
GAPDH-R：GTCCTTCCACGATACCAAAGTTGTCA(SEQ ID NO:11)；
GAPDH-F：ACAACAGCCTCAAGATCATCAGCAAT(SEQ ID NO:12)。
逆转录程序及qPCR体系及条件如下：
1)使用TRIzol试剂(购自Invitrogen)，按照说明书，提取细胞总RNA；
2)使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(购自TOYOBO)，将步骤1)提取的细胞总RNA反转录成cDNA；具体步骤简述如下：
i)RNA变性：将RNA置于65℃下5min，然后快速置于冰上冷却；存在于RNA中的二级结构在此步打开，以便后续转录反应形成完整的cDNA；
ii)逆转录反应
逆转录反应体系：4μl 5×RT Master Mix，2μg RNA模板，无核酸酶水补至20μl；
逆转录反应设置：37℃孵育30min，95℃变性5min(失活反转录酶)；所得cDNA一般保存于-20℃备用；
3)取1μL逆转录产物当作qPCR模板，加入10μLGreen Realtime PCRMaster Mix(购自TOYOBO)、1μL上游引物(10μmol/L)、1μL下游引物(10μmol/L)和7μL双蒸水，混匀；每个样品的每个基因设3个复孔；
qPCR反应设置：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火延伸60s，共40个循环，期间采集荧光值。
4.检测结果及结论：
结果如图1所示；由图1可知，相较于年轻的HDF细胞，博来霉素诱导的衰老HDF细胞的SASP(IL1β、IL6、IL8、MMP1、MMP3)表达均显著增高，在使用TPEN处理衰老细胞后(即，TPEN处理的衰老HDF细胞)，其SASP(IL1β、IL6、IL8、MMP1、MMP3)表达显著降低，明显低于衰老细胞。
上述结果表明，TPEN可明显抑制皮肤成纤维细胞(HDF)SASP的表达，由此导致的效应包括：
一方面，如前所述，SASP的高表达(特别是基质金属蛋白酶升高)可导致皮肤真皮层中的胶原纤维和弹性纤维降解增加，使皮肤失去弹性、松弛垮塌，而TPEN可抑制皮肤成纤维细胞(HDF)SASP的表达，因此，预期TPEN可降低胶原纤维和弹性纤维的降解，从而提高其含量，进而提高皮肤弹性、防止皮肤松弛垮塌；
另一方面，老年性无菌性炎症与SASP密切相关(如细胞因子和趋化因子IL1β、IL8、VEGF、IL6、CXCL1、CCL2等均参与老年性慢性皮炎的形成)，而TPEN可以抑制皮肤成纤维细胞(HDF)SASP的表达，因而，预期其可应用于消除或减轻老年性慢性皮炎的症状。
实施例2：TPEN对博来霉素或射线诱导的衰老HDF细胞及其培养上清中的胶原含量的影响
本实施例中，通过博来霉素诱导皮肤成纤维细胞(HDF)衰老，构建博来霉素诱导的细胞衰老模型，并通过射线处理诱导HDF细胞衰老，构建射线诱导的细胞衰老模型；然后，在这两种细胞衰老模型上检测TPEN对衰老细胞和其培养上清中的胶原含量的影响。
注意，博来霉素诱导的HDF细胞衰老模型和射线诱导的HDF细胞衰老模型均为本领域公认且常见的细胞衰老模型。
1、两种细胞衰老模型的制备：
博来霉素诱导HDF细胞衰老模型的构建方法如实施例1中所述。
射线诱导HDF细胞衰老模型的构建方法如下：
将代龄为20代的皮肤成纤维细胞(HDF，购自丰晖生物)在DMEM完全培养基中，在37℃、5％CO2下培养，待细胞密度为70％左右时，使用γ射线辐照，剂量为10Gy；24小时后，换成普通培养基(即，DMEM完全培养基)，继续培养6天后即为衰老细胞，培养期间，每2天换液一次。
2、实验分组与处理：
实验分为两大组，分别为：DMSO处理组(作为对照组)和TPEN处理组(作为实验组)；这两大组又分别涉及三组细胞，其中，NC表示年轻的HDF细胞(代龄为20代)，Bleo表示博来霉素诱导的衰老HDF细胞，IR表示射线诱导的衰老HDF细胞。
具体分组如下：
1)DMSO处理组，具体分为：
1-1)DMSO处理的NC细胞：指代龄为20代的HDF细胞经DMSO处理组(4ml培养液中含4μl DMSO，即，DMSO的体积含量为1/1000)；
1-2)DMSO处理的Bleo细胞：指按上述建模程序用博来霉素诱导HDF细胞衰老期间，在博来霉素处理24小时后，更换成含1/1000DMSO的细胞培养液，并且，之后的维持培养也均采用含1/1000DMSO的细胞培养液；
1-3)DMSO处理的IR细胞：指按上述建模程序用γ射线诱导HDF细胞衰老期间，在γ射线辐照处理24小时后，更换成含1/1000DMSO的细胞培养液，并且，之后的维持培养也均采用含1/1000DMSO的细胞培养液；
2)TPEN处理组，具体分为：
2-1)TPEN处理的NC细胞：指代龄为20代的HDF细胞在含2μM TPEN的细胞培养液中进行培养(方式同实施例1中的，即，将TPEN溶于DMSO后再加入细胞培养液中，使得加入后TPEN在培养液中的终浓度为2μM，DMSO在培养液中的体积含量为1/1000左右)；
2-2)TPEN处理的Bleo细胞：指按上述建模程序用博来霉素诱导HDF细胞衰老期间，在博来霉素处理24小时后，更换成含2μM TPEN的细胞培养液(方式同步骤2-1)中的)，之后的维持培养也采用含2μM TPEN的细胞培养液；
2-3)TPEN处理的IR细胞：指按上述建模程序用γ射线诱导HDF细胞衰老期间，在γ射线辐照处理24小时后，更换成含2μM TPEN的细胞培养液(方式同步骤2-1)中的)，之后的维持培养也采用含2μM TPEN的细胞培养液。
3、检测方法：
对于上述各实验组，在博来霉素或射线处理7天后，收集细胞与细胞培养上清，细胞使用RIPA裂解液(购自碧云天)进行总蛋白提取、加入蛋白上样缓冲液(购自碧云天)后，95℃加热5分钟后备用；细胞培养上清直接加入蛋白上样缓冲液(购自碧云天)，95℃加热5分钟后备用。通过Western blot法检测各组细胞的I型胶原含量，其中，所用一抗包括：抗GAPDH抗体，购自Proteintech公司；抗Collagen I抗体，购自Proteintech公司；所用二抗为HRP标记兔二抗，购自Santa Cruz公司。
4、检测结果：
结果如图2所示；由图2可知，博来霉素或射线所诱导的衰老细胞及其培养上清中的I型胶原含量均降低(特别是，细胞培养上清中的胶原含量显著降低)；在使用TPEN处理后，两种衰老细胞及其培养上清中的胶原含量均显著增加。
上述结果表明，TPEN可增加衰老的皮肤成纤维细胞(HDF)及其培养上清中的胶原含量，由此可预期其可用于逆转或对抗细胞衰老。
实施例3：TPEN对D-半乳糖诱导的早衰小鼠模型的皮肤的影响
本实施例中，通过在小鼠的颈背部皮下注射D-半乳糖诱导小鼠衰老，构建小鼠早衰模型，该模型为本领域公认且常见的早衰动物模型；然后，在该早衰小鼠模型上检测TPEN对其皮肤胶原纤维与弹性纤维的含量、形态以及胶原生化指标的影响。
1、早衰小鼠模型的制备：
采用8周龄雌性C57BL/6J野生型小鼠(购自北京大学医学部动物部)，进行早衰模型制备：
首先，进行小鼠颈背部备皮：使用电动剃毛刀，以脊柱为轴留0.5cm，两耳下方0.5cm处开始备皮，去除左侧1.5cm×3.0cm，右侧1.5cm×3.0cm区域毛发；然后，在其颈背部皮下、按200mg/kg/day的量注射10％D-半乳糖生理盐水溶液(D-半乳糖购自麦克林，下同)，连续注射12周，以诱导小鼠早衰。
2、实验分组与处理：
1)对照组(每组5只)：取8周龄雌性C57BL/6J野生型小鼠，在按上述程序诱导其早衰期间，每日在注射10％D-半乳糖生理盐水溶液后，在小鼠左颈背部皮肤涂抹对照面霜，即为对照组；
2)实验组(每组5只)：取8周龄雌性C57BL/6J野生型小鼠，在按上述程序诱导其早衰期间，每日在注射10％D-半乳糖生理盐水溶液后，在小鼠右颈背部皮肤涂抹含有TPEN的面霜，即为实验组。
对照面霜的配方及制备：
按质量百分比计，所述对照面霜包含：13％角鲨烷(购自日本出光)、2％305乳化剂(购自广州天赐)、2％丙二醇、10％低分子透明质酸(200KDa，购自华溪生物)、10％高分子透明质酸(5000KDa，购自华溪生物)和63％水；按上述配方将各组分混合并搅拌10分钟，至面霜成半固体，没有明显液体成分即可。
含TPEN的面霜的配方及制备：
在上述对照面霜中加入TPEN，使其终浓度为40μM，即得。
3、检测方法：
(1)皮肤胶原纤维与弹性纤维形态学检测：在诱导小鼠衰老及使用面霜12周后，对小鼠实施颈椎脱臼处死；分别分离小鼠左、右侧皮肤，将其固定、包埋、切片，然后，进行masson染色以检测皮肤胶原纤维，进行EVG染色以检测皮肤弹性纤维；观察胶原纤维与弹性纤维的形态、分布情况，并使用QuPath软件(https://qupath.github.io/，具体方法按网站的教程)统计两者在真皮层中的含量；
(3)胶原生化指标检测：即检测羟脯氨酸(hyp)含量，hyp主要存在于胶原中，为胶原中特有的氨基酸，约占胶原氨基酸总量的13％，可反映胶原含量；
羟脯氨酸(hyp)含量检测方法如下：
按上述步骤(1)的方法分离小鼠皮肤组织，使用羟脯氨酸测定试剂盒(碱水解法)(购自南京建成)，按照其说明书中的指导进行检测，具体程序如下：
称取小鼠皮肤组织30-100mg放入试管，加入5M氢氧化钠1ml，混匀，加盖后沸水浴水解20分钟；使用盐酸将pH调整为6.0-6.8，加双蒸水稀释至10ml；取3～4mL稀释的水解液，向其中加适量活性炭(约20～30mg左右，以上清液离心后澄清无色为准)，混匀，3500转/分离心10分钟，小心取1mL上清液进行检测：具体地，向上清液中加入500μL氯胺T溶液，室温孵育10分钟，然后加入500μL高氯酸，室温孵育5分钟，然后加入500μL对二甲氨基苯甲醛(P-DMAB)，65℃孵育10分钟；之后，按200μL/孔，将上述孵育物加至96孔板中，测定样品于550nm的吸光值，利用标准品读数绘制标准曲线，进而，根据标准曲线所得公式求得所测样品羟脯氨酸浓度Cs，并通过如下公式换算为小鼠皮肤所含羟脯氨酸的量：
hyp含量(μg/mg组织)＝Cs×10ml/称取的组织质量。
4、检测结果：
结果如图3所示，其中，图3A表示D-半乳糖诱导的早衰小鼠皮肤切片的masson染色结果，其显示了小鼠皮肤中的胶原纤维；图3B为小鼠皮肤真皮层中胶原纤维含量统计图；图3C为D-半乳糖诱导的早衰小鼠皮肤切片的EVG染色结果，其显示皮肤中的弹性纤维；图3D为小鼠皮肤真皮层中弹性纤维含量统计图；图3E显示小鼠皮肤组织中的羟脯氨酸含量。
由图3可知，使用对照面霜的早衰小鼠皮肤中，胶原纤维和弹性纤维大小不一，长短不一，且排列疏松；相比之下，使用含TPEN面霜的小鼠皮肤中，其胶原纤维和弹性纤维排列紧密、规则，且两种纤维的含量明显增多(P<0.001)，并且，其羟脯氨酸含量也明显增多(P<0.05)，这反映了其总胶原含量的明显增高。
上述结果充分说明，TPEN能够增强皮肤弹性，提高皮肤细致度和/或紧致度，并且减少或防止皮肤细纹或皱纹的出现。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (13)

1.四(2-吡啶甲基)乙二胺在制备用于抗皮炎的组合物产品中的用途，其中，所述皮炎为老年性无菌性皮肤炎症，所述组合物产品为药用化妆品或药品。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述四(2-吡啶甲基)乙二胺占所述组合物产品总重量的0.00084%～0.00338%。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述四(2-吡啶甲基)乙二胺占所述组合物产品总重量的0.0012%～0.0026%。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述四(2-吡啶甲基)乙二胺占所述组合物产品总重量的0.00169%。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗皮炎为消除或减轻皮炎症状。
6.根据权利要求1-5任一项所述的用途，其特征在于，所述组合物产品为外用剂型。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述外用剂型为选自以下的剂型：水剂、乳剂、膏剂、霜剂、啫喱、粉剂、油剂。
8.根据权利要求1-5任一项所述的用途，其特征在于，所述组合物产品包括：
1）四(2-吡啶甲基)乙二胺；
2）药学或化妆品学上可接受的载体和/或赋形剂；以及，
任选地，3）其它活性剂。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述其它活性剂包括抗氧化剂、细胞活性剂、补水保湿剂、抗衰老剂和抗皮炎剂中的任意一种或多种。
10.根据权利要求1-5任一项所述的用途，其特征在于，所述组合物产品为一种外用制剂，所述外用制剂包括：四(2-吡啶甲基)乙二胺和基质，其中，所述基质包括：角鲨烷、乳化剂、丙二醇、低分子透明质酸或其盐、高分子透明质酸或其盐和水；进一步地，其中，所述低分子透明质酸或其盐为分子量在10 kDa～500 kDa的透明质酸或其盐，所述高分子透明质酸或其盐为分子量在2000 kDa～10000 kDa的透明质酸或其盐。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述四(2-吡啶甲基)乙二胺在所述外用制剂中的浓度为20-80 mM；
和/或，所述低分子透明质酸或其盐的分子量为100 kDa～200 kDa；
和/或，所述高分子透明质酸或其盐的分子量为5000 kDa～6000 kDa；
和/或，按重量百分比计，所述基质包括：10%-15%角鲨烷，1%-3% 305乳化剂，1%-3%丙二醇，8%-12%低分子透明质酸或其盐，8%-12%高分子透明质酸或其盐，余量为水。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述四(2-吡啶甲基)乙二胺在所述外用制剂中的浓度为30-60 mM；
和/或，按重量百分比计，所述基质包括：13%角鲨烷，2% 305乳化剂，2%丙二醇，10%低分子透明质酸或其盐，10%高分子透明质酸或其盐，余量为水。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述四(2-吡啶甲基)乙二胺在所述外用制剂中的浓度为40 mM。
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霍佳 ; 肖生祥 ; .细胞凋亡可能是缺锌皮肤病理改变的基础.国外医学(医学地理分册).2007,(第03期), *

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