KR102174194B1 - 플라본-레스베라트롤 접합체 화합물을 포함하는 아토피 피부염 예방, 치료 및 개선용 조성물 - Google Patents
플라본-레스베라트롤 접합체 화합물을 포함하는 아토피 피부염 예방, 치료 및 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 플라본-레스베라트롤 접합체 화합물인 AB1711 또는 이의 염을 포함하는 아토피 피부염에 대한 예방, 치료 및 개선용 조성물로서, 아토피 피부염을 유발하는 다양한 사이토카인, 케모카인과 베타-엔돌핀의 전구체인 POMC의 발현에 관여하는 전사 인자인 EGR-1을 억제함으로써, 아토피 피부염에 대한 예방, 치료 및 개선 효과를 가질 수 있다.
Description
본 발명은 플라본-레스베라트롤 접합체 화합물을 포함하는 아토피 피부염 예방, 치료 및 개선용 조성물에 관한 것이다.
사람의 피부는 표피층(epidermis)과 진피층(dermis) 및 피하지방 조직의 3개 층으로 이우어져 있으며, 유해미생물, 물리적 손상, 자외선 등과 같은 외부환경에 의한 물리적 자극 또는 화학적 자극으로부터 인체를 보호하는 일차적인 보호 장벽의 역할을 한다.
표피층은 외부로부터 각질층(stratum corneum), 과립층(stratum granulosum), 유극층(stratum spinosum) 및 기저층(stratum basale)의 순서로 구분된다. 표피층을 구성하는 세포로는 각질형성세포 (keratinocyte), 랑겔한스 세포, 머켈 세포 등의 다양한 세포들이 있으며, 이 중에서 대부분을 차지하는 세포가 각질형성세포(keratinocyte)이다. 각질형성세포는 기저층에서 세포 증식활동을 하고 분화되면서 각질층으로 올라오면서 각질세포 (Corneocyte)가 되어 피부 각질을 구성함으로써 유해한 외부 환경으로부터 피부를 보호하는 역할을 수행한다.
아토피 피부염(Atopic dermatitis)은 면역과민 반응으로 인한 알레르기 증상이 피부에 발생하여 피부장벽이 약화되고 피부가 건조해지면서 심한 가려움증이 동반되는 만성 재발성 피부 염증 질환이다 (J Clin Invest 2012;122:440-447). 염증 반응으로 인해 피부장벽이 손상되면 다른 항원에 대한 노출이 쉽게 만들어져서 만성 염증반응, 가려움증, 피부건조의 악순환이 반복된다 (N Engl J Med 2008;358:1483-1494). 아토피 피부염의 발병 원인은 아직까지 명확히 규명되어 있지 않으나 유전적, 환경적, 면역학적, 피부 구조적 다양한 원인들이 복합적으로 작용하는 것으로 간주되고 있다 (J Clin Invest 2004;113:651-657).
급성 아토피 피부염 병변 부위에는 각질형성세포에서 분비되는 흉선 기질상 림포포이에틴(Thymic stromal lymphopoietin; TSLP), CD4+helper type 2 T-임파구(Th2)가 분비하는 인터루킨-4(IL-4)와 인터루킨-13(IL-13), 인터루킨-31(IL-31)이 많이 증가되어 있으며, 만성 아토피 피부염 부위에는 Th1-임파구가 분비하는 사이토카인인 인터페론-감마(Interferon-gamma; IFNγ)와 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha; TNFα)가 증가되어 있다 (J Allergy Clin Immunol 2000;105:860-876). IL-4와 IL-33은 단핵구/대식세포, 수지상세포, 각질형성세포, 호산구, 호염기구, 비만세포 등 다양한 염증세포를 활성 시켜서 인터루킨-31(IL-31)을 생성시킨다.
TSLP는 피부 염증환경에서 각질형성세포에서 다량 분비되는 사이토카인으로서, 선천면역(innate immunity) 반응에 중요한 수지상세포(dendric cell)와 CD4+helper type 2 T-임파구(Th2)를 활성시켜 인터루킨-4, 인터루킨-5, 인터루킨-13, TNFα 등의 Th2 사이토카인 생성을 촉진시켜 아토피 피부염을 유발시키고 병적 진행을 촉진하는 대표적 아토피성 사이토카인이다 (Nature Immunol 2010;11:289-293). TSLP는 만성 아토피 피부염 질환자가 복합 천식 질환자로의 진행을 매개하기도 하며, TRPA-1 양성-감각 뉴런을 활성화 시켜 극심한 가려움증을 유발 시킨다 (Cell. 2013;155:285-295). 실제로, 아토피 피부염 환자 피부의 각질형성세포에서 TSLP 발현이 증가되어 있으며, TSLP 과발현되는 transgenic mouse에서 자발적 아토피 유사 피부염이 발생되었다 (J Exp Med 2005:202; 541-549). 각질형성세포에서 TSLP는 전사인자 EGR-1에 의해 발현이 조절된다.
Th2 임파구에서 분비되는 인터루킨-31은 감각신경을 직접적으로 자극하거나 각질형성세포에 작용하여 베타-엔돌핀(β-endorphin) 생성을 촉진시킴으로써 히스타민 비의존적으로 가려움을 느끼게 해주는 대표적 사이토카인이다 (Br J Dermatol 2012;167:794-803). 인터루킨-31은 각질형성세포에서 베타-엔돌핀 전구체인 프로-오피오멜라노코르틴(Ppro-opiomelanocortin; POMC) 유전자 발현을 촉진시킨다.
아토피 피부염은 난치병으로 불릴 정도로, 근본적 치료가 잘 안되는 만성질환이므로, 일단 발병되면 수년에서 수십년 동안 지속적으로 관리하고 치료받아야되는 만성질환이다. 기존의 상용화되고 있는 대부분의 일차 치료제는 극심한 가려움증을 완하시키고 과민면역 반응에 의한 cytokine 생성을 억제 하는 스테로이드 계열의 외용 치료제가 주로 사용되었다. 그러나, 영유아에게 스테로이드 제제를 장기간 사용 할 경우 면역력이 약화되고 피부의 위축이나 성장 지연 등의 여러 가지 부작용이 초래될 수 있다. 또한, 비스테로이드 제제인 calcineurin 억제 cyclosporin 등의 면역 억제제가 개발되어 상용화되고 있으나, 이들 역시 장기간 사용하면 생체 면역력 약화로 인해 암발생 등의 다양한 부작용이 초래되고 있어 근본적인 아토피성 피부염의 치료가 어려운 실정이다 (J Invest Dermatol 2007;127:808-816). 국소적으로는 보습제, 항히스타민제, 비타민 D 유도체를 사용하기도 하지만 개선 효과는 미약한 것으로 알려졌다 (Semin Cutan Med Surg 2011;30:118-126). 따라서 영유아에게 부작용이 많은 스테로이드 제제를 대체하여 상대적으로 안전성이 높고 치료 효과가 우수한 물질을 찾기 위한 연구가 국내외에서 활발히 진행되고 있다.
본 발명자들은 각질형성세포(keratinocyte)에서 발현되는 전사인자인 EGR-1이 아토피 피부염의 과민면역반응을 유도하는 사이토카인 (TSLP, 인터루킨-1β, 인터루킨-6, 인터루킨-17, 인터루킨-23)과 T-임파구, 비만세포(mast cell) 등의 염증세포를 병변 부위로 끌어들이는 케모카인 (CXCL1, CCL5) 생성 및 피부 감각신경을 자극하여 가려움을 뇌로 전달하는 신경전달물질인 베타-엔돌핀의 전구체인 POMC 유전자 발현을 조절하는 핵심 전사 인자임을 발견하였으며, EGR-1의 발현을 조절하여 아토피 피부염의 치료 효과를 가질 수 있는 물질에 대한 연구를 진행하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 아토피 피부염을 유발하는 사이토카인 및 가려움증을 유발하는 유전자의 발현을 억제할 수 있는 EGR-1을 표적으로 하여, 아토피 피부염의 발생 및 증상 완화를 위한 저분자 화합물인 플라본 -레스베라트롤 접합체 화합물 AB1711을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 화학식 1의 화합물은 플라본-레스베라트롤 접합체 화합물로서, 2-(6-(4-methoxystyryl)-2,4-dimethoxyphenyl)-3-hydroxy-6-nitro-4H-chromen-4-one(AB1711)로 명명된다. 상기 물질은 본원 발명의 발명자들로부터 합성되거나, 자연으로부터 유래된 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 본원 발명의 실시예 1에 기재된 합성 방법에 따라 합성된 AB1711 화합물을 사용할 수 있다. 본 발명자들은 상기 AB1711이 전사 인자인 EGR-1에 직접 결합하여 EGR-1의 DNA 결합능을 차단함으로써, 아토피 피부염을 유발하는 다양한 사이토카인과 케모카인의 생성을 억제시키고, 가려움증을 유발하는 물질의 전구체의 발현을 억제하는 기능을 수행하는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 화학식 1의 화합물 AB1711은, EGR-1과 직접 결합하여 EGR-1이 표적유전자의 전사활성 부위(5‘-transcription regulatory region) DNA 서열에 결합하는 능력을 차단함으로써, 아토피 피부염을 유발하는 사이토카인인 TSLP, IL-1β, IL-6, IL-17, IL-23과, 비만세포(mast cell) 등의 염증세포를 병변 부위로 끌어들이는 케모카인 (CXCL1, CCL5), 그리고 가려움증 신호를 뇌로 전달하는 β-엔돌핀의 전구체인 POMC(프로-오피오멜라노코르틴 (Ppro-opiomelanocortin))유전자 발현을 억제하는 효과를 가지므로, 아토피 피부염에 대한 치료 및 증상 완화 효과를 가질 수 있다. 즉, 아토피 피부염의 치료 효과 뿐만 아니라, 이를 예방하고, 나아가 증상을 완화할 수 있는 개선 효과를 모두 가지므로, 아토피 피부염의 치료에 효과적인 약물로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 피부 주름 또는 아토피성 피부염의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 본 발명의 조성물에 의해 피부 주름 또는 아토피성 피부염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 용어, "개선"은 상기 조성물을 이용하여 피부 주름과 아토피성 피부염의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
상기 화학식 1의 AB1711 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
본 발명에 의한 부가염은 통상의 방법, 즉, 상기 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 당량 또는 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조하거나, 또는 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조하거나 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐 아니라 이로부터 제조될 수 있는, 동일한 효능을 나타내는 용매화물, 수화물 및 입체이성질체도 모두 본 발명의 범주 내로 포함할 수 있다.
본 발명의 AB1711 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이 때, 상기 조성물에 포함되는 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 함량은 특별히 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%로 포함될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있다. 또한, 부형제 이외에 통상적으로 사용하는 윤활제들도 포함될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있고, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 의약품 또는 의약외품으로 제제화될 수 있다. “의약품”이란 일반적인 약을 말하는 것으로, 그 제형에 제한되지 않는다. "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 피부 외용제 및 개인위생용품도 포함한다.
또한, 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 용어, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 동시에 혹은 순차적으로 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으나, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
상기 조성물은 아토피 피부염의 예방, 치료 및 증상 완화를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 인간 또는 동물에 모두 적용 가능하다. 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한 없이 포함할 수 있고, 국소 도포, 경구 두여 등을 통한 방식을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물을 건강기능식품에 포함하여 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 바람직하게는 20 중량부 이하, 보다 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있으며, 건강 조절 및 위생을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 조성물을 포함할 수 있는 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 각종 기능성 식품류, 껌, 사탕, 젤리, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료 혹은 사료 첨가제 등을 포함할 수 있다. 이 밖에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 화장품 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 허용되는 성분들을 제한없이 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이 등의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하게 포함될 수 있다.
본 발명의 화합물 AB1711 및 이의 염이 상기 건강기능식품, 의약 외품 및 화장품에 포함되어 아토피 피부염에 대한 예방 또는 증상 완화(개선) 효과를 가지는 경우 그 함량은, 이에 제한되는 것은 아니나, 조성물 총 중량의 0.001 내지 5 중량%의 범위에서 포함될 수 있으며, 아토피 피부염에 대한 효능을 나타내기 위한 최소한의 양 이상으로 포함될 수 있다.
본 발명은 플라본-레스베라트롤 접합체 화합물인 AB1711 화합물 또는 이의 염을 포함하는 아토피 피부염에 대한 예방, 치료 및 개선용 조성물로서, 아토피 피부염을 유발하는 다양한 염증성 사이토카인, 케모카인과 환부에서 가려움증을 유발하는 베타-엔돌핀의 전구체의 발현에 관여하는 전사 인자인 EGR-1의 DNA 결합능을 억제함으로써, 아토피 피부염에 대한 예방, 치료 및 개선 효과를 가질 수 있다.
도 1은 본 발명의 AB1711 화합물의 합성 과정을 도식화 한 것이다.
도 2는 본 발명의 AB1711 화합물과 EGR-1 단백질의 결합 상태를 분자 도킹법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. (A) LigPlot 프로그램을 이용한 EGR-1과 AB1711 화합물의 결합 (B) PyMol 프로그램을 이용한 EGR-1과 AB1711 화합물의 3차원 결합 이미지.
도 3은 본 발명의 AB1711 화합물이 EGR-1 단백질을 표적하여 EGR-1의 DNA 결합능을 차단하는 효과를 EMSA법을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다. (A) AB1711 화합물과 EGR-1 단백질과 결합되었을 때 (EGR1::DNA 복합체)와 결합하지 않았을때 (Free probe)의 EGR-1 결합 DNA 서열위치를 EMSA 법으로 분석한 결과. (B) EGR-1과 DNA가 결합된 복합체 밴드 강도를 ImagJ 프로그램을 이용하여 정량적으로 측정한 결과
도 4는 본 발명의 AB1711 화합물이 비특이적으로 EGR-1 발현을 유도하지 않는다는 사실을 면역블롯법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. (A) 면역블롯법. (B) 면역블롯의 EGR-1 밴드 강도를 ImagJ 프로그램을 이용하여 정량적으로 측정한 결과.
도 5는 전사인자 EGR-1 발현이 knockdown되어 있는 HaCaT 세포를 이용하여, 염증 환경에서 EGR-1이 아토피 피부염을 유발하는 다양한 사이토카인과 케모카인 유전자 발현을 조절하는 역할을 수행하는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다. (A, B) RT-PCR 법을 이용한 mRNA 발현 분석. (C) RT-PCR의 각 유전자 mRNA 밴드 강도를 ImagJ 프로그램을 이용하여 정량적으로 측정한 결과.
도 6은 본 발명의 AB1711 화합물이 EGR-1을 표적하여 EGR-1에 의해 조절되는 아토피 피부염 유발 사이토카인과 케모카인 유전자 발현을 억제하는 효과를 가짐을 확인한 결과를 나타낸 것이다. (A) RT-PCR 법을 이용한 mRNA 발현 분석. (B) RT-PCR의 각 유전자 mRNA 밴드 강도를 ImagJ 프로그램을 이용하여 정량적으로 측정한 결과.
도 7은 본 발명의 AB1711 화합물이 아토피 피부염의 가려움증을 유발하는 EGR-1 조절 POMC 유전자 발현을 억제하는 효과를 가짐을 확인한 결과를 나타낸 것이다. (A, B) 면역블롯법을 이용한 EGR-1 단백질 발현 분석. (C, D) RT-PCR의 POMC mRNA 밴드 강도를 ImagJ 프로그램을 이용하여 정량적으로 측정한 결과. (E) RT-PCR의 도7D의 POMC 유전자 mRNA 밴드 강도를 ImagJ 프로그램을 이용하여 정량적으로 측정한 결과.
도 8은 아토피 유발 약물인 DNCB를 도포하여 아토피 피부염을 유발시킨 생쥐 피부에 본 발명의 AB1711 화합물을 피부에 도포하면 아토피 염증 증상 개선 효과를 가짐을 확인한 결과이다. (A) 실험일정 도식도. (B) AB1711 화합물 도포에 의한 아토피 피부염 증상 개선 효과. (C) AB1711 화합물 도포에 의한 혈중 IgE 감소 효과
도 9는 아토피 유발 약물인 DNCB를 도포하여 아토피 피부염을 유발시킨 생쥐 피부에서 본 발명의 AB1711 화합물이 염증반응으로 증가된 표피와 진피 두께를 감소시키는 효과를 가짐을 확인한 것이다. (A) 생쥐 피부 조직의 H&E 염색. (B) 도A에서 염색된 표피(epidermis)와 진피(dermis)의 두께 측정.
도 10은 아토피 유발 약물인 DNCB를 도포하여 아토피 피부염을 유발시킨 생쥐 피부에서 본 발명의 AB1711 화합물이 염증반응으로 증가된 비만 세포의 침윤을 감소시키는 효과를 가짐을 확인한 것이다. (A) 쥐 피부 조직의 톨루이딘 블루 염색. (B) 도A에서 톨루이딘 블루로 염색된 비만세포 측정.
도 2는 본 발명의 AB1711 화합물과 EGR-1 단백질의 결합 상태를 분자 도킹법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. (A) LigPlot 프로그램을 이용한 EGR-1과 AB1711 화합물의 결합 (B) PyMol 프로그램을 이용한 EGR-1과 AB1711 화합물의 3차원 결합 이미지.
도 3은 본 발명의 AB1711 화합물이 EGR-1 단백질을 표적하여 EGR-1의 DNA 결합능을 차단하는 효과를 EMSA법을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다. (A) AB1711 화합물과 EGR-1 단백질과 결합되었을 때 (EGR1::DNA 복합체)와 결합하지 않았을때 (Free probe)의 EGR-1 결합 DNA 서열위치를 EMSA 법으로 분석한 결과. (B) EGR-1과 DNA가 결합된 복합체 밴드 강도를 ImagJ 프로그램을 이용하여 정량적으로 측정한 결과
도 4는 본 발명의 AB1711 화합물이 비특이적으로 EGR-1 발현을 유도하지 않는다는 사실을 면역블롯법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. (A) 면역블롯법. (B) 면역블롯의 EGR-1 밴드 강도를 ImagJ 프로그램을 이용하여 정량적으로 측정한 결과.
도 5는 전사인자 EGR-1 발현이 knockdown되어 있는 HaCaT 세포를 이용하여, 염증 환경에서 EGR-1이 아토피 피부염을 유발하는 다양한 사이토카인과 케모카인 유전자 발현을 조절하는 역할을 수행하는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다. (A, B) RT-PCR 법을 이용한 mRNA 발현 분석. (C) RT-PCR의 각 유전자 mRNA 밴드 강도를 ImagJ 프로그램을 이용하여 정량적으로 측정한 결과.
도 6은 본 발명의 AB1711 화합물이 EGR-1을 표적하여 EGR-1에 의해 조절되는 아토피 피부염 유발 사이토카인과 케모카인 유전자 발현을 억제하는 효과를 가짐을 확인한 결과를 나타낸 것이다. (A) RT-PCR 법을 이용한 mRNA 발현 분석. (B) RT-PCR의 각 유전자 mRNA 밴드 강도를 ImagJ 프로그램을 이용하여 정량적으로 측정한 결과.
도 7은 본 발명의 AB1711 화합물이 아토피 피부염의 가려움증을 유발하는 EGR-1 조절 POMC 유전자 발현을 억제하는 효과를 가짐을 확인한 결과를 나타낸 것이다. (A, B) 면역블롯법을 이용한 EGR-1 단백질 발현 분석. (C, D) RT-PCR의 POMC mRNA 밴드 강도를 ImagJ 프로그램을 이용하여 정량적으로 측정한 결과. (E) RT-PCR의 도7D의 POMC 유전자 mRNA 밴드 강도를 ImagJ 프로그램을 이용하여 정량적으로 측정한 결과.
도 8은 아토피 유발 약물인 DNCB를 도포하여 아토피 피부염을 유발시킨 생쥐 피부에 본 발명의 AB1711 화합물을 피부에 도포하면 아토피 염증 증상 개선 효과를 가짐을 확인한 결과이다. (A) 실험일정 도식도. (B) AB1711 화합물 도포에 의한 아토피 피부염 증상 개선 효과. (C) AB1711 화합물 도포에 의한 혈중 IgE 감소 효과
도 9는 아토피 유발 약물인 DNCB를 도포하여 아토피 피부염을 유발시킨 생쥐 피부에서 본 발명의 AB1711 화합물이 염증반응으로 증가된 표피와 진피 두께를 감소시키는 효과를 가짐을 확인한 것이다. (A) 생쥐 피부 조직의 H&E 염색. (B) 도A에서 염색된 표피(epidermis)와 진피(dermis)의 두께 측정.
도 10은 아토피 유발 약물인 DNCB를 도포하여 아토피 피부염을 유발시킨 생쥐 피부에서 본 발명의 AB1711 화합물이 염증반응으로 증가된 비만 세포의 침윤을 감소시키는 효과를 가짐을 확인한 것이다. (A) 쥐 피부 조직의 톨루이딘 블루 염색. (B) 도A에서 톨루이딘 블루로 염색된 비만세포 측정.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> AB1711 합성
본 발명의 플라본-레스베라트롤 접합체 화합물 AB1711은 2-(6-(4-methoxystyryl)-2,4-dimethoxyphenyl)-3-hydroxy-6-nitro-4H-chromen-4-one으로 명명되며, 도 1에 기재된 단계에 따라 합성된다. 이하, AB1711의 합성 과정을 단계별로 구체적으로 기재하였다.
1 단계 : 화합물 II 합성
2~4˚C의 온도로 얼음 중탕을 한 10% NaOH 수용액 20mL에 2.24g(20 mmol)의 레스베라트롤(resveratrol)을 천천히 첨가한 후, 교반 하였다. 반응 플라스크 내 시료가 용해되어 녹색의 맑은 용액이 되었을 때 과량의 dimethyl sulfate (10 mL, 140 mmol)를 천천히 첨가하였다. 상기 혼합물을 15시간동안 교반 하고, 반응 혼합물에 에틸아세테이트를 추출하였다. 유기층을 탄산수소나트륨 포화용액(sat’d NaHCO3, 100mL)으로 2번 세척하였다. 유기층을 분리하여 마그네슘설페이트(MgSO4)와 혼합하여 건조한 뒤 여과하였다. 여과액을 감압 상태에서 용매를 제거하였다. 시럽 상태로 얻어진 결과물을 crude 상태로 다음 반응에 사용하였다. 트랜스-트리메톡시스틸벤(trans-Trimethoxystilbene) 2.7g(10 mmol)을 20mL 의 N,N’-dimethylformamide(DMF)에 용해시킨 뒤, 얼음 중탕으로 POCl3 (2mL)를 천천히 첨가하였다. 얼음 중탕을 제거 한 후에 두 시간 정도 50˚C 에서 반응 혼합물을 교반하고, 상온에서 서서히 식혔다. 이후, 400mL의 얼음물을 준비한 뒤 반응 혼합물을 천천히 첨가하며 교반을 진행하였다. 침전물이 형성되면 1~2 시간 정도 더 교반 한 뒤, 침전물을 감압여과 하였다. 물로 충분히 세척한 고체화합물을 뜨거운 에탄올을 첨가하여 재결정시켜 정제하여 화합물 II를 45%의 수율로 확보하였다.
2 단계 : 화합물 III 합성
상기 1 단계에서 합성된 화합물 II 2mmol(596mg)과, 2-히드록시-5-니트로아세토페논(2-hydroxy-5-nitroacetophenone) 2.1mmol(380 mg)을 20 mL의 에탄올에 첨가하고, 2 mL의 aq.KOH (50 w/v%)를 첨가하여 용해시킨 뒤, 환류장치를 이용하여 8시간 동안 가열하면서 교반하였다. 상온으로 식힌 반응 혼합물을 100mL의 얼음물에 첨가하고, 전체 반응혼합물을 3N HCl을 사용하여 pH 3~4 로 산성화 시켜주어 주황색 고체 침전물을 수확하였다. 침전물을 감압여과로 분리하고 증류수로 충분히 세척한 뒤 건조시켜 화합물 III (m.p: 189-192 ˚C)를 90 % 수율로 확보하였다.
3 단계 : 화합물 IV (AB1711) 합성
1 mmol 화합물 III (461 mg)을 3:2 비율의 10 mL 메탄올-테트라하이드로퓨란 (THF) 혼합 용액에서 용해시켰다. 얼음 중탕 장치를 이용하여 반응플라스크 내 온도를 3~4oC로 조정한 뒤, 16% NaOH 1mL를 가하여 화합물을 모두 용해시키고 10분 후에 35% H2O2 2 mL를 첨가하고 pH 8 이상의 염기성 용액이 되도록 유지하였다. 반응혼합물을 상온에서 10 시간 동안 교반한 뒤, 100 mL 얼음물을 첨가하였다. 이후, 3N HCl (pH 3~4)로 산성화시켜 침전물을 수확하였다. 고체 침전물을 감압 여과한 후, 물로 세척하고 메탄올-에틸아세테이트 혼합 용액으로 재결정시킨 후 50% 수율의 화합물 IV (2-(6-(4-methoxystyryl)-2,4-dimethoxyphenyl)-3-hydroxy-6-nitro-4H-chromen-4-one, m.p: 238~240˚C)를 확보하고 AB1711로 명명하였다.
<실시예 2> AB1711 및 EGR-1의 결합 분자 도킹 (Molecular docking)
<2.1> 실험 방법
EGR-1과 AB1711사이의 결합 여부를 판단하기 위하여 Autodock vina 프로그램[J. Comp. Chem. 31: 455 (2010)] 과 Sybyl 프로그램 (Tripos, St. Louis, MO) 을 사용하여 in silico docking 실험을 수행하였다. EGR-1의 3차 구조는 여러 종류가 protein data bank(pdb)에 등록되어 있다. 이들 중 하나인 5n14.pdb는 NMR spectroscopy로 결정한 구조로 25개의 아미노산 잔기만을 포함하고 있다. 4x9j.pdb 와 4r2a.pdb는 X-ray crystallography로 결정한 구조인데 전자보다는 후자가 조금 더 많은 아미노산 잔기를 포함하고 있기 때문에 4r2a.pdb를 본 실험에서 사용하였다 [Genes Dev. 28: 2304 (2014)]. 이 구조는 E335 - D423사이의 아미노산 잔기를 포함하고 있어 E335 - D423사이에 ZnF1 (338 - 362), ZnF2 (368 - 390), ZnF3 (396 - 418)를 모두 포함하고 있다. 4r2a.pdb는 ligand를 포함하고 있지 않기 때문에 Sybyl 프로그램에 포함되어 있는 MOLCAD module을 사용하여 binding site를 결정하였다 : F377, S378, H382, T385, H386, T389, R407. 이와 같이 결정한 binding site를 포함하도록 docking box의 size (62, 56, 70) 와 center (-4.421, -10.84, -19.227)를 결정하여 Autodock vina 프로그램으로 in silico docking 실험을 수행하였다. Sybyl 프로그램은 Flexible docking 방식을 사용하기 때문에 EGR-1과 AB1711사이의 결합 여부를 판단하기 어려웠다. Docking 결과는 European Bioinformatics Institute 에서 제공하는 LigPlot program 을 사용하였고 [Protein. 1999;37:228], 3D images는 PyMOL software (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.0r1, Schr
dinger, LLC)를 사용하여 형성하였다. AB1711, (E)-2-(2-(4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-3-hydroxy-6-nitro-4H-chromen-4-one,은 3-hydroxyflavone 과 resveratrol 의 stilbene moiety를 포함하고 있다. 이 둘을 동시에 포함하는 3차 구조는 알려져 있지 않기 때문에 PubChem에 CID 688713로 등록되어 있는 2',3'-dimethoxy-3-hydroxyflavone의 3차 구조를 template로 사용하여 Sybyl 프로그램에서 energy minimization 방법을 사용하여 3차 구조를 결정하여 본 실험에 사용하였다.
<2.2> 실험 결과
EGR-1의 apo-protein을 얻기 위하여, Sybyl 프로그램을 사용하여4r2a.pdb에 포함된 oligonucleotides를 제거하였다. Autodock vina를 사용한 docking에서 9개의 protein-ligand complexes를 확보하였다. 이 결과 얻은 protein-ligand complexes의 binding energy는 -6.3 ~ -5.0 kcal/mol 사이의 값을 보였다. 가장 낮은 에너지를 가진 complex를 선택하여 LigPlot으로 분석하였다 (도 2A). 그 결과, AB1711 화합물은 10개의 아미노산 잔기 (R357, H358, R360, I361, G364, K366, R375, F377, R379)와 hydrophobic interaction을 보였고, 두개의 아미노산 잔기 (S378, H382)와는 hydrogen-bond (H-bond)를 형성하였다. S378의 hydroxyl group은 flavonol moiety의 1-position 의 oxygen과, 그리고 H382의 imidazole group 의 nitrogen은 6-position의 oxygen과 H-bond)를 형성하였다. PyMOL program을 이용하여 EGR-1과 AB1711 화합물과의 결합 복합체의 삼차원 이미지(3D image)를 확보하고 AB1711 화합물이 EGR-1의 ZnF2 과 ZnF3에 결합하는 결과를 확인하였다 (도 2B).
<실시예 3> AB1711에 의한 EGR-1::DNA 결합 억제 효과 확인
상기 [실시예 2]에서 in silico 분자 모델링법을 이용하여 예측된 AB1711과 EGR-1과의 결합이 실제 단백질 수준에서 EGR-1이 DNA에 결합하는 것을 억제하는지 여부를 확인하기 위하여 EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay) 법을 이용하여 분석하였다.
<3.1> 실험 방법
<3.1.1> Sf21 곤충세포에 사람 EGR-1 단백질 과발현
EMSA 실험에 사용하기 위한 EGR-1 단백질은 Sf21 곤충세포에 사람 EGR-1 단백질을 과 발현시킨 세포추출액을 사용하였다. EGR-1을 발현하는 재조합 배큘로 바이러스(Baculovirus)를 제작하기 위해, flashBAC Baculovirus 발현 시스템 (Mirus Bio, Madison, WI, USA)을 구입하여 사용 하였다. Clontech 회사(Mountain View, CA, USA)에서 구입한 IPLB-Sf21 곤충 세포를 10% 우태아 혈청 (Hyclone 회사, Logan, UT, USA)이 포함 된 Grace 곤충 배지 (Gibco 회사, Grand Island, NY, USA)로 배양하였다. EGR-1 발현 플라스미드(pcDNA3.1zeo/EGR1)에 있는 EGR-1의 코딩 DNA 서열을 HindIII 및 BglII 제한효소로 잘라 분리한 후, pOET1 트랜스퍼 플라스미드 (Mirus Bio 회사; Madison, WI, USA)에 삽입하여 pOET1/EGR1 플라스미드를 제작하였다. 1.5x106 세포/웰의 밀도로 배양된 IPLB-Sf21 세포에 100ng의 트랜스퍼 벡터 (pOET/EGR1), 100 ng 바이러스 DNA (flashBAC™, Mirus Bio) 및 1.2 μl의 TransIT®-Insect Transfection Reagent (Mirus Bio)를 첨가하였다. 세포 배양 플레이트를 28 ℃에서 5일 동안 배양한 후 수확하여, 최종적으로 EGR-1이 대량 생산된 Sf21 세포 추출액을 확보하고, 하기 EMSA 실험에 사용하였다.
<3.1.2> EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)
단백질과 DNA 결합 분석은 ThermoFisher Scientific(Waltham, MA, USA) 회사의 LightShift 화학 발광 EMSA 키트를 사용하였으며, 제조사의 지침에 따라 실험하였다. EGR-1 결합하는 비오틴-뉴클레오타이드 probe(5'-비오틴-AGA GTG TGT CTC CTT CGC ACA CAT C-3'; 이하 ‘EGR-1 결합 probe’로 기술)는 마크로젠 회사 (Macrogen, Seoul, Korea)에서 합성하여 사용하였다.
상기의 재조합 Baculovirus를 이용하여 확보된 EGR-1 함유 Sf21 세포추출액 (3μg)에 11 μg Salmon sperm DNA와 AB1711을 넣고 5 분 동안 반응시켰다. 50 fmol EGR-1 결합 probe를 첨가하고 20 분 동안 반응시켰다. 반응 시료를 비변성 6% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동 한 후, Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell (BIO-RAD, Hercules, CA, USA)을 이용하여 니트로셀루로스막에 단백질을 부착시켰다. 니트로셀루로스막을 blocking한 후, HRP(horseradish peroxidase) 효소가 결합되어있는 스트렙트아비딘(Streptavidin)을 첨가하여 15분 동안 반응시켰다. 니트로셀루로스막에 결합되지 않은 단백질을 세척한 후, 강화 화학 발광 (ECL) 검출 시스템 (ThermoFisher Scientific)을 사용하여 X-ray 필름으로 인화하였다. EGR-1::DNA 복합체의 상대적양은 ImageJ 프로그렘 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)을 이용하여 측정하였다
<3.2> AB1711 화합물의 EGR-1과 EGR-1 결합 probe 결합능 억제 효과
상기 측정 결과, 본 발명의 AB1711 화합물은 농도 의존적으로 EGR-1과 EGR-1 결합 probe의 결합능을 억제하였다 (도 3A). EGR-1과 DNA 결합 복합체양은 ImageJ 프로그램을 이용하여 정량적으로 측정하였다. ImageJ 프로그램으로 정량한 결과, 50mM AB1711 1.5μL 첨가 시, EGR-1과 EGR-1 결합 probe의 복합체 생성을 대조군에 비해 약 51.2% 감소하였으며, 3μL 첨가 시, 복합체 생성은 대조군에 비해 약 96.5% 감소되었다 (도 3B). 따라서, 본 발명의 AB1711 화합물은 EGR-1과 결합하여 EGR-1이 표적 DNA에 결합하는 것을 차단시킨다는 사실을 확인하였다.
<실시예 4> AB1711에 의한 EGR-1 발현에 대한 영향 분석
<4.1> 실험방법
<4.1.1> 세포배양
실험에 사용하기 위한 사람 피부 각질형성세포주인 HaCaT 세포는 Cell Lines Service GmbH (Eppelheim, Germany)에서 구입하여 10% 우태아 혈청 (Gibco BRL, USA)과 항생제가 들어있는 DMEM 배양액 (Gibco BRL, USA)을 사용하여 배양하였다. 배양 용기는 75T-flask와 6-well plate를 사용하였으며 5% CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양액은 3~4일마다 교환해 주며 세포가 과다하게 증식되었을 때는 계대배양 하였다.
<4.1.2> 면역블롯법
EGR-1 발현 변화는 면역블롯법을 이용하였다. 수확된 HaCaT 세포를 세포 용해 완충액 (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1% NP-40, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NP40, 1 mM NaF, 1 mM 페닐 메틸설포닐플루오 라이드)으로 용해시키고, 추출 단백질 샘플 (각각 20μg)을 10% SDS-PAGE로 전기영동 하고, 니트로셀룰로스 막 (Amersham Pharmacia Biotech Inc)으로 옮겼다. EGR-1과 결합하는 1차 항체 (Santa Cruz, CA, USA)를 반응 시킨 후, 양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase; HRP)가 결합되어 있는 2차 항체를 반응시켰다. 항체가 결합된 니트로셀룰로스 막을 세척한 후, LumiGLO 퍼옥시다제 화학발광 기질(SeraCare, Milford, MA, USA)을 사용하여 항체와 반응한 단백질 밴드를 X-ray 필름에 인화하였다.
<4.2> 실험결과
적정한 계대 수의 HaCaT 세포를 6-well plate로 옮기고, 배양용기 면적의 90% 이상 증식되었을 때, 50 μM과 100 μM 농도의 AB1711을 처리하였다. 30분 후에 5 ng/ml 농도의 TNFα를 처리하고, 1시간 더 배양한 후에 세포를 수확하였다. 면역블롯법을 수행하여 EGR-1 발현양을 분석하였다 (도 4A). 이를 ImageJ 프로그램을 이용하여 정량적으로 측정한 결과, 도 4B에서 보듯이, AB1711은 TNFα에 의해 증가되는 EGR-1의 발현을 통계적으로 무의미한 정도로 약간 증가시켰다.
상기 <실시예 3>과 <실시예 4>의 실험 결과로부터, AB1711은 비특이적으로 EGR-1 발현에 영향을 주는 세포 신경 전달계에는 아무런 영향을 주지 않으면서, 특이적으로 EGR-1의 DNA 결합능만을 선택적으로 차단한다는 사실을 확인하였다.
<실시예 5> EGR-1에 의한 아토피 피부염 유발 사이토카인 유전자 발현 조절
피부 염증 환경에서 다양한 기질세포와 염증세포에서 분비되는 TNFα는 각질형성세포를 자극하여 TSLP, IL-1β, IL-6, CXCL1, CCL2, CCL5 등과 같은 염증성 사이토카인과 케모카인을 분비시켜 Th2 임파구를 활성시키고, 각종 염증면역세포를 염증 부위로 끌어들여 아토피 피부염을 악화시킨다.
본 발명의 AB1711의 표적인 EGR-1이 조절하는 아토피 피부염 유발 염증성 사이토카인과 케모카인 유전자 종류를 알아보기 위하여, 역전사중합효소 연쇄반응법(revers transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)을 이용하여 분석하였다.
<5.1> 실험방법
<5.1.1> short hairpin RNA(shRNA)를 이용한 EGR-1 knockdown 세포주
본 실험을 위하여 Scrambled shRNA를 주입한 HaCaT 대조세포 (HaCaT/shCT)와 EGR-1 발현이 knockdown되는 HaCaT 세포 (HaCaT/shEgr1) 세포를 사용하였다 (J Biol Chem 2011; 286:26860-26872).
<5.1.2> 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction; RT-PCR)
유전자 mRNA 양을 측정하기 위한 총 RNA 추출은 TRIzol 라이프테크놀로지스 코리아 회사에서 구입한 TRIzol RNA Isolation Reagents를 이용하여 추출하였다. 총 RNA 0.5μg은 Bio-Rad 회사Hercules, CA, USA)에서 구입한 iScript cDNA synthesis kit를 사용하여 제조회사에서 권장하는 방법에 따라 역전사반응을 이용한 상보적 DNA(cDNA)를 합성하였다. 이중나선 cDNA 0.0125μg 으로 PCR을 수행하였다. 유전자 증폭을 위한 프라이머 염기는 마크로젠 회사(Seoul, Korea)에서 합성하였으며, 프라이머 서열은 하기 <표 1>과 같다. 대조군으로는 항존유전자(housekeeping gene)인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 사용하였다. PCR은 95℃, 5분에서 DNA를 변성시킨 후, 94℃ 에서 1분; 65℃ 에서 2분; 및 70℃ 에서 1분간 반응시키는 사이클을 30회 반복하였다. PCR 최종 산물은 1% 아가로오스 겔에서 전기영동하여 EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다. 각 시료의 PCR 산물은 GAPDH 양을 표준화하여 대조군을 “1”로 정하고 이에 대한 상대적인 변화량을 환산하였다. GAPDH와 유전자 PCR 밴드는 ImageJ 프로그램을 이용하여 정량하였다.
| 유전자 | 프라이머 염기서열 | |
| TSLP | Forward | 5’-TAGCAATCGGCCACATTGCCT-3’ |
| Reverse | 5’-GAAGCGACGCCACAATCCTTG-3’ | |
| IL-1β | Forward | 5’-AAACAGATGAAGTGCTCCTTCCAGG-3’ |
| Reverse | 5’-TGGAGAACACCACTTGTTGCTCCA-3’ | |
| IL-6 | Forward | 5’-GCCTTCGGTCCAGTTGCCTT-3’ |
| Reverse | 5’-AGTGCCTCTTTGCTGCTTTCA C-3’ | |
| CXCL1 | Forward | 5’-CCAGACCCGCCTGCTG-3’ |
| Reverse | 5’-CCTCCTCCCTTCTGGTCAGT-3’ | |
| CXCL10 | Forward | 5’-GCTTAGACATATTCTGAGCCTAC-3’ |
| Reverse | 5’-AGCTGATTTGGTGACCATCATTG-3’ | |
| CCL2 | Forward | 5’-CTTCTGTGCCTGCTGCTCATAG-3’ |
| Reverse | 5’-CTGGACAAGCAAACCCAAAC-3’ | |
| CCL5 | Forward | 5’-ACAGGTACCATGAAGGTCTC-3’ |
| Reverse | 5’-GCAAATTTGTGTAAGTTCAGG-3’ | |
| GAPDH | Forward | 5'-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3' |
| Reverse | 5'-CTCTTGTGCTCTTGCTGGG-3' | |
<5.2> 실험 결과
HaCaT/shCT 대조세포에 TNFα를 처리하면 EGR-1 발현이 증가되었지만, shEgr1을 발현시킨 HaCaT/shEgr1 세포에서는 TNFα에 의한 EGR-1 발현이 대조세포에 비해 EGR-1 발현이 현저히 감소됨을 확인하였다 (도 5A). 그 결과, HaCaT/shEgr1 세포는 EGR-1 발현이 knockdown 되어있음을 확인하였다.
HaCaT/shCT와 HaCaT/shEgr1 세포에 TNFα를 처리한 후, 염증성 사이토카인과 케모카인 mRNA 발현양을 RT-PCR로 분석하였다 (도 5B). ImageJ 프로그램을 이용하여 정량적으로 측정한 결과, 두 세포간에서 CXCL10, CCL2, GAPDH mRNA 발현양은 차이가 없었으나, TSLP, IL-1β, IL-6, CXCL1, CCL5 mRNA 발현양은 대조세포에 비해 HaCaT/shEgr1 세포에서 통계적으로 의미있게 감소되어 있음을 확인하였다 (도 5C). 따라서, EGR-1은 각질형성세포에서 분비되어 아토피 피부염 유발과 병적 진행을 촉진시키는 TSLP, IL-1β, IL-6, CXCL1, CCL5 생성을 촉진하였다.
상기의 실시예 결과를 통해, EGR-1은 염증환경에서 Th2 임파구 활성과 염증세포의 유입에 중요한 역할을 한다는 사실을 확인하였다.
<실시예 6> 본 발명의 AB1711에 의한 EGR-1 조절 아토피 피부염 유발 사이토카인 유전자 발현 억제 효과
<6.1> 실험방법
본 발명의 AB1711 화합물이 EGR-1을 표적하여 EGR-1이 조절하는 아토피 피부염을 유발하는 염증성 사이토카인과 케모카인 유전자 발현을 억제시키는지 여부를 분석하였다. 각질형성세포에서 TNFα를 처리하면 EGR-1 발현이 유도되는 조건에서, 본 발명의 AB1711 화합물이 TNFα에 의해 생성되는 아토피 피부염 유발 사이토카인과 케모카인 유전자 발현을 억제시키는지 확인하기 위하여, [실시예 5]에 기술한 역전사중합효소 연쇄반응법(revers transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)을 이용하여 분석하였다.
<6.2> 실험결과
각질형성세포주인 HaCaT/shCT와 EGR-1 발현을 knockdown 시킨HaCaT/shEgr1 세포에 50μM과 100μM 농도의 AB1711 화합물을 미리 전처리하고 30분 후에 TNFα를 처리하였다. TNFα 자극에 의해 생성되는 EGR-1 타겟인 염증성 사이토카인과 케모카인 유전자 발현이 본 발명의 AB1711에 의해 감소된다는 사실을 확인하였다 (도 6A). ImageJ 프로그램을 이용하여 정량적으로 측정한 결과, GAPDH의 양은 변하지 않았지만, TNFα 자극에 의해 증가되는 TSLP, IL-1β, IL-6, CXCL1, CXCL1 CCL5 mRNA 양은 AB1711 농도 의존적으로 의미 있게 감소되었다 (도 6B).
따라서, 본 발명의 AB1711 화합물은 각질형성세포의 EGR-1을 표적하여, 아토피 피부염 발생과 증상 악화에 관련된 다양한 사이토카인과 케모카인 유전자 발현을 효과적으로 차단할 수 있음을 확인하였다.
<실시예 7> 본 발명의 AB1711에 의한 아토피 피부염 가려움증 억제 효과
베타-엔돌핀은 뇌내에서 분비될 때는 모르핀과 유사하게 정신적 스트레스를 해소 시켜주고, 인체 노화를 막아주며, 암세포 파괴 및 기억력을 강화시켜주는 행복 호르몬으로 잘 알려져 있다. 그러나, 피부의 각질형성세포에서 생성되는 베타-엔돌핀은 피부 감각신경을 자극하여 히스타민 비의존적으로 가려움을 느끼게 해주는 신경전달물질로 작용한다 (J Inv Dermatol 2007;127:2228-2235). 인터루킨-31은 베타-엔돌핀의 전구물질인 POMC의 유전자 발현을 증가시킨다고 알려져 있다 (Br J Dermatol 2012;167:794-803). 본 발명의 AB1711 화합물이 아토피 피부염의 가려움증을 차단하는 효과가 있는지 알아보기 위하여 POMC 유전자 발현 억제 효과를 분석하였다.
<7.1> 실험방법
<7.1.1> RT-PCR
상기 <5.1.2>에서 기술한 바와 같이 RT-PCR을 수행하였다. POMC 프라이머 서열은 하기 표 2와 같다. 대조군으로는 항존 유전자인 GAPDH를 사용하였다.
| 유전자 | 프라이머 염기서열 | |
| POMC | Forward | 5’-CCTGCCTGGAAGATGCCGAGAT-3’ |
| Reverse | 5’-TGCTGCCGCTGCTGCTGCTGT-3’ | |
| GAPDH | Forward | 5'-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3' |
| Reverse | 5'-CTCTTGTGCTCTTGCTGGG-3' | |
<7.2> 실험결과
인터루킨-31로 HaCaT 세포를 자극하면, 처리 40분 후부터 EGR-1 단백질 발현이 점차 증가됨을 확인하였다 (도 7A). 인터루킨-31에 의한 POMC 유전자 발현이 EGR-1에 의해 조절되는지 알아보기 위하여 HaCaT/shCT와 HaCaT/shEgr1 세포를 이용하였다 (도 7B). 인터루킨-31에 의한 POMC mRNA 발현 증가가 HaCaT/shEgr1 세포에서는 관찰되지 않았다 (도 7C). 따라서, EGR-1은 인터루킨-31에 의해 유도되는 POMC mRNA 발현을 조절하는 전사인자임을 확인하였다.
EGR-1을 표적하는 본 발명의 AB1711 화합물이 인터루킨-31에 의한 POMC mRNA 발현을 억제시키는 효과가 있는지 RT-PCR법을 이용하여 분석하였다. 50 μM과 100 μM 농도의 AB1711을 HaCaT 세포에 전처리하고 1시간 후에 인터루킨-31로 자극시킨 후, 처리 24 시간 후에 세포를 수확하여 RT-PCR을 이용하여 POMC mRNA 발현 변화를 분석하였다. 그 결과, AB1711은 통계적으로 유의미하게 인터루킨-31에 의해 증가되는 POMC mRNA 발현을 농도 의존적으로 감소시켰다 (도 7D).
따라서, 본 발명의 AB1711 화합물은 각질형성세포의 EGR-1을 표적하여 아토피 피부염의 가려움을 느끼게하는 POMC 유전자 발현을 효과적으로 차단한다는 사실을 확인하였다.
<실시예 8> 동물모델에서 본 발명의 AB1711에 의한 아토피 피부염 증상 완화 효과
<8.1> 아토피 피부염 동물모델 제작 및 AB1711 도포
생후 7주령의 수컷 BALB/c 마우스를 오리엔트바이오 회사 (Orient Co., Seongnam, Korea)에서 구입하여 온도 20±2℃, 습도 50±10%, 12시간 명암주기가 유지되는 동물실험실에서 1주일간 적응시킨 후, (1) 정상군(n=3), (2) 아토피 피부염 유발 DNCB+Vehicle 처리군(n=3), (3) DNCB+AB1711 처리군(n=7) 등 총 3 그룹으로 구분하여 실험을 진행하였다.
마우스의 등 부위를 깨끗하게 제모한 후, 미세상처가 자연 치유되도록 24시간 동안 방치하였다. 피부 민감도를 높여주기 위하여 4% SDS를 도포하고, 이어서 아세톤과 올리브 오일 (3:1, v/v) 혼합 용액으로 1% DNCB(2,4-dinitrochlorobenzene, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 제조하여, 3일 동안 1일 1회 마우스의 등 부위에 100 μL를 도포하였다. 양성 대조군은 4일 동안의 휴지기 후, 4% SDS와 0.5% DNCB 100 μL를 하루에 1회, 주 5회 동일한 부위에 2주간 도포하여 아토피성 피부염을 유도하였다 (도 8A). 실험군은 대조군과 동일하게 4% SDS와 0.5% DNCB 100 μL를 도포하고, 약 2~3시간 후 동일한 부위에 5% AB1711을 포함하는 연고를 제작하여 증상 완화 효과를 관찰하였다. 대조군은 AB1711을 함유하지 않은 연고(vehicle)만 도포하였다. <표 3>은 실험연고 제작에 사용한 성분이다.
| 연고 성분 | ||
| No. | 원료명 | WT % |
| 1 | 정제수 | 54.80 |
| 2 | 부틸렌글라이콜 | 25.00 |
| 3 | 프로판다이올 | 5.00 |
| 4 | 글리세린 | 2.00 |
| 5 | 트라이에탄올아민 | 1.70 |
| 6 | Carbopol980 | 1.50 |
| 7 | 베타글루칸 | 10.00 |
| 8 | AB1711 | 5.00 |
<8.2> 아토피 유발 마우스에서 AB1711의 피부 조직학적 증상 완화 효과
실험 종료일(Day 22)에 모든 실험 마우스를 희생시키고, 육안적 피부 임상 증세를 관찰하였다. DNCB만 도포한 마우스 피부는 염증 반응으로 인해 부위 전체적으로 각질 피딱지가 많이 생되었으나, 본 발명의 AB1711을 도포한 마우스는 시간 의존적으로 피딱지가 없어지면서, 전반적으로 피부 상태가 대조군에 비해 현저하게 호전되었다 (도 8B).
<8.3> AB1711의 혈중 IgE 함량 감소 효과
실험 종료일(Day 22)에 마우스 안와정맥에서 혈액을 채취하였다. 혈액은 13,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 마우스 혈청 내 Total IgE 함량은 BioLegend 회사 (San Diego, CA, USA)에서 구매한 ELISA kit를 이용하여 회사에서 제공하는 방법에 준하여 측정하고 정량하였다.
아토피성 피부염이 유발된 마우스에서는 알러지성 질환을 매개하는 IgE의 혈중 농도가 상승한다고 알려져 있다 (Journal of Investigative Dermatology 2009;129:31-40). 아토피 피부염이 유발된 DNCB 도포 대조군의 혈중 IgE 농도는 1084±217 ng/mL 였으며, AB1711 함유 연고를 도포한 실험군의 혈중 IgE 농도는 448±188 ng/mL 이었다 (도 8C).
따라서, AB1711은 혈중 IgE 농도를 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다.
<8.4> 피부 조직학적 분석
아토피 피부염에서는 반복되는 염증 반응에 의해 각질형성세포의 증식이 증가되면서 각질로의 분화과정에 불균형이 생겨, 피부의 두께가 증가하고, 주요 면역 세포들이 조직 내로 많이 침윤하여 염증 반응을 촉진한다고 알려져 있다 (Journal of Investigative Dermatology 2009;129:31-40). 따라서 본 발명의 AB1711에 의한 병리조직학적 변화를 관찰하였다.
<8.4.1> H&E 염색
실험 마우스 피부를 적출하여 100% 아세톤(acetone) 용액에 조직을 고정한 후, 파라핀 블록을 제작하였다. 파라핀 블록을 5 μm 두께로 얇게 자른 후, 헤마톡실린/에오신(hematoxylin/eosin) 염색을 수행하였다. 그 결과, 음성대조군(Naive Control)에 비해 아토피 피부염이 유발된 양성대조군(DNCB) 조직에서 현저하게 피부 두께가 증가된 것이 관찰되었으며, AB1711이 함유된 연고(DNCB+AB1711)를 도포한 실험군 조직에서는 양성대조군에 비해 현저하게 피부 조직의 두께가 감소된 것이 관찰되었다 (도 9A).
<8.4.2> AB1711의 표피와 진피 두께 감소 효과 정량적 측정
H&E로 염색된 피부조직을 이용하여 표피와 진피의 두께 변화를 정량적으로 측정하였다. 아무 처리도 하지 않은 음성대조군(Naive Control)조직에서는 피부 두께가 표피층 27.8±2.17 μm, 진피층 314±21.9 μm 였으며, 아토피 피부염이 유발된 양성대조군(DNCB) 조직에서는 표피층 64.6±6.19μm, 진피층 544±94.5μm 였으나, AB1711이 함유된 연고(DNCB+AB1711)를 도포한 실험군 조직에서는 표피층 41.4±6.27μm, 진피층 360±63.2μm인 것을 확인하였다 (도 9B).
상기 결과로 미루어, 본 발명의 AB1711은 피부 각질세포의 증식을 억제하여 피부 염증 증상을 완화시킬 수 있음을 확인하였다.
<8.4.3> AB1711의 비만세포 침윤(mast cell infiltration) 억제 효과
표피에서부터 근육 조직 사이 피부에 존재하는 비만 세포수의 변화를 관찰하기 위하여 파라핀 블록을 톨루이딘 블루(toluidin blue; TB) 염색을 수행하였다. 그 결과, 음성대조군(Naive Control)에 비해 아토피 피부염이 유발된 양성대조군(DNCB) 조직에서 비만세포 침윤이 현저하게 증가된 것이 관찰되었으며, AB1711이 함유된 연고(DNCB+AB1711)를 도포한 실험군 조직에서는 양성대조군에 비해 현저하게 비만세포 침윤이 감소된 것이 관찰되었다 (도 10A).
<8.4.4> AB1711의 비만세포 침윤 억제 효과 정량적 측정
[도 10A]의 TB 염색조직에서 침윤된 비만 세포수를 측정하였다. 그 결과, 아무 처리도 하지 않은 음성대조군(Naive Control) 조직에서 침윤된 비만세포수는 2.5 cm2 당 23±6 개 였으며, 아토피 피부염이 유발된 양성대조군(DNCB) 조직에서는 113±8 개 였다. 이에 비하여, AB1711이 함유된 연고(DNCB+AB1711)를 도포한 실험군 조직에서는 60±9 개로 확인되었다 (도 10B).
즉, 본 발명의 AB1711을 도포하면 피부염증 부위로 침윤되는 비만세포 수를 감소시켜 피부염증 증상을 완화시킬 수 있음을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (10)
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
- 제1항에 있어서,
상기 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염은, EGR-1의 DNA 결합을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 TSLP, IL-1β 및 IL-6을 포함하는 아토피 유발 염증성 사이토카인 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 CXCL1 및 CCL5을 포함하는 아토피 유발 염증성 케모카인 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염은, β-엔돌핀의 전구체인 POMC(Ppro-opiomelanocortin)유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물. - 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 의약품.
- 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 의약외품.
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
[화학식 1]
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
[화학식 1]
- 제1항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 농도는 0.001 내지 5 중량%인 것을 특징으로 하는 조성물.
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| KR20060120101A (ko) * | 2003-10-10 | 2006-11-24 | 리스버로직스 코퍼레이션 | Ｅｇｒ-1 인핸서 요소와 관련된 질환의 치료 |
| KR101640165B1 (ko) * | 2014-10-08 | 2016-07-15 | 한국원자력의학원 | 3-하이드록시-3'',4''-디메톡시플라본을 포함하는 뇌종양 전이 억제용 조성물 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| European Journal of Medicinal chemistry, 175, p114-128 (2019.5.3.) * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021162463A1 (ko) * | 2020-02-14 | 2021-08-19 | 주식회사 아제라바이오텍 | 플라본-레스베라트롤 접합체 화합물을 포함하는 아토피 피부염 예방, 치료 및 개선용 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021162463A1 (ko) | 2021-08-19 |
| WO2021162463A9 (ko) | 2021-09-30 |
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