TW202102242A - 余甘子萃取發酵物及其製備與應用 - Google Patents
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Abstract
Description
本發明係關於一種包含一含有下述式(I)至式(XIV)化合物之至少一者之余甘子萃取發酵物的組成物、以及製備該余甘子萃取發酵物的方法:(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)、(XIV)。本發明亦關於式(I)至式(XIV)化合物及余甘子萃取發酵物之至少一者的應用,尤其是關於彼等於使個體不易形成體脂肪、美白、抗肌膚老化、抑制脂肪細胞的脂肪形成能力、促進脂肪細胞的脂肪降解能力、促進瘦身、幫助代謝、提升粒線體活性、抑制黑色素生成、抑制ROS生成、抑制AGEs生成、提升SOD2
基因表現、提升MPG
基因表現、
及提升ERCC1
基因表現的應用。
肥胖是一種身體脂肪累積過多的狀態。在高油、高糖、高脂的西方飲食文化、現代人普遍缺乏運動、以及遺傳等因素的影響之下,肥胖已然成為世界性的健康問題。國際上通常用身體質量指數(body mass index,BMI)或腰圍作為評估肥胖的指標。在台灣,BMI值大於或等於24且小於27表示體重過重,而BMI值大於或等於27則表示肥胖。
目前常見的抑制肥胖方法包括飲食控制、運動、改變生活型態、藥物治療、及外科手術。除了嚴重肥胖的患者,一般臨床上皆建議採飲食控制與運動的方式進行減脂。然而,對於忙碌且經常外食的現代人而言,仍需要其他更便利的方案。
除了減脂與瘦身,現代人對於皮膚美白及抗皮膚老化亦趨於重視,市面上的美容產品也愈趨多樣化,例如,用於皮膚塗抹的維他命C類衍生物、口服的穀胱甘肽、以及用於施打的美白針等。然而,透過口服或塗抹的方式投予維他命C類衍生物或穀胱甘肽並無法使人體有效吸收,實際的補充效果有限;而施打美白針的效果則僅能短暫維持,必須定期施打、成本高,且可能會引起過敏反應。因此,業界仍致力於皮膚美白及抗皮膚老化之相關產品的研究。
本案發明人研究發現,余甘子萃取發酵物不僅能有效減少脂肪累積,且能達到美白、抗肌膚老化效果,可以符合前述對於減脂、瘦身與美白、抗老化的需求。
因此,本發明之一目的,在於提供一種製備余甘子萃取發酵物的方法,其係包含以下步驟:(a) 萃取余甘子以提供一余甘子萃取物;(b) 使用一釀酒酵母菌與一胚芽乳酸桿菌發酵該萃取物,以獲得一中間發酵物;以及(c) 使用一醋酸菌發酵該中間發酵物,以獲得一余甘子萃取發酵物。較佳地,該釀酒酵母菌係釀酒酵母菌BCRC 20271;該胚芽乳酸桿菌係胚芽乳酸桿菌BCRC 910760;該醋酸菌係醋酸菌BCRC 11688。
本發明之另一目的,在於提供一種組成物,其係包含一余甘子萃取發酵物,該余甘子萃取發酵物係由如上述方法所提供者。較佳地,該余甘子萃取發酵物係含有以下式(I)至式(XIV)化合物之至少一者:(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)、(XIV)。較佳地,該組成物係一醫藥組成物、食品組成物或保養品組成物。
本發明之再一目的,在於提供一種使用一活性成分於使個體不易形成體脂肪、美白、及/或抗肌膚老化的用途,其中該活性成分係上述之式(I)至式(XIV)化合物、以及由如上述方法所提供之余甘子萃取發酵物的至少一者。較佳地,該活性成分係以食品組成物或保養品組成物的形式使用。
本發明之又一目的,在於提供一種使用一活性成分於製備一醫藥組成物的用途,其中該醫藥組成物係用於抑制脂肪細胞的脂肪形成能力、促進脂肪細胞的脂肪降解能力、促進瘦身、幫助代謝、提升粒線體活性、抑制黑色素生成、抑制ROS生成、抑制AGEs生成、提升SOD2
基因表現、提升MPG
基因表現、
及提升ERCC1
基因表現之至少一者,且其中該活性成分係如上述之式(I)至式(XIV)化合物、以及由如上述方法所提供之余甘子萃取發酵物的至少一者。
以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣;惟,在不背離本發明精神下,本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐,不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所具體陳述者或後附申請專利範圍所界定者。
除非文中有另外說明,於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式;所謂「個體」係指人類或非人的哺乳動物(例如:狗、貓)。
余甘子(Phyllanthus emblica
)屬於葉下珠科(Phyllanthaceae
)、葉下珠屬(Phyllanthus
)植物,其果實呈圓球形,可食用。
本文中所述的「釀酒酵母菌」、「胚芽乳酸桿菌」及「醋酸菌」可為任何適用於本發明者,包括一般大眾可自商業獲得之釀酒酵母菌、胚芽乳酸桿菌及醋酸菌菌株(例如可購自國內或國外寄存機構者),以及利用本技術領域所慣用之微生物分離方法從天然來源分離獲得之釀酒酵母菌、胚芽乳酸桿菌及醋酸菌菌株。
已知SOD2
基因(超氧化物歧化酶生成基因)表現量的提升係有助於增強細胞抗氧化能力,而S OD2
基因表現低下或缺失則與皮膚老化有關。前述可參見例如:SOD2 deficiency promotes aging phenotypes in mouse skin.AGING.
4(2): 116-118 (2012),該文獻之全文併於此處以供參考。因此,若可有效提升S OD2
的表現,即可達到抗皮膚老化(例如抗皮膚光老化)的效果。
此外,已知細胞中MPG
基因的表現量提升係有助於強化細胞修復DNA單股斷裂的能力,而ERCC1
基因的表現量提升係有助於提升細胞修復DNA結構損傷的能力。前述可參見例如:Repairing double-strand DNA breaks.Nat Educ
3.9 (2010): 26,該文獻之全文併於此處以供參考。因此,若可有效提升MPG
及/或ERCC1
基因的表現,即可達到抗皮膚老化(例如抗皮膚光老化)的效果。
本案發明人研究發現,余甘子萃取物可有效抑制脂肪細胞的脂肪形成能力、提升粒線體活性、抑制黑色素生成、抑制ROS生成、抑制AGEs生成、提升S OD2
基因表現、提升MPG
基因表現、
及提升ERCC1
基因表現;此外,余甘子萃取物在釀酒酵母菌、胚芽乳酸桿菌及醋酸菌菌株存在下進行發酵所提供的發酵物,係具有更佳之抑制脂肪細胞的脂肪形成、提升粒線體活性、抑制黑色素生成、抑制ROS生成、抑制AGEs生成、提升S OD2
基因表現、提升MPG
基因表現、
及提升ERCC1
基因表現的能力。因此,根據本發明以余甘子萃取物所提供的發酵物,即,余甘子萃取發酵物係可用於促進瘦身、幫助代謝、使個體不易形成體脂肪、美白、及抗肌膚老化。
本案發明人進一步由上述余甘子萃取發酵物得到以下十四個活性成分(即,式(I)至式(XIV)化合物),此等活性成分均具有抑制脂肪細胞的脂肪形成能力、促進脂肪細胞的脂肪降解能力、提升骨骼肌粒線體活性、及抑制黑色素生成的能力:(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)、(XIV)。
因此,本發明係關於一種製備余甘子萃取發酵物的方法、一種包含式(I)至式(XIV)化合物及由前述方法所提供之余甘子萃取發酵物之至少一者的組合物、一種使用式(I)至式(XIV)化合物及前述余甘子萃取發酵物之至少一者於使個體不易形成體脂肪、美白、及/或抗肌膚老化的用途、以及一種使用式(I)至式(XIV)化合物及前述余甘子萃取發酵物之至少一者於製備一醫藥組成物的用途,其中該醫藥組成物係用於抑制脂肪細胞的脂肪形成能力、促進脂肪細胞的脂肪降解能力、促進瘦身、幫助代謝、提升粒線體活性、抑制黑色素生成、抑制ROS生成、抑制AGEs生成、提升S OD2
基因表現、提升MPG
基因表現、
及提升ERCC1
基因表現之至少一者。
根據本發明之製備余甘子萃取發酵物的方法係包含以下步驟:(a) 萃取余甘子以提供一余甘子萃取物;(b) 使用一釀酒酵母菌與一胚芽乳酸桿菌發酵該萃取物,以獲得一中間發酵物;以及(c) 使用一醋酸菌發酵該中間發酵物,以獲得一余甘子萃取發酵物。
於步驟(a)中,可採用極性溶劑來進行萃取,較佳地,該極性溶劑係水、醇(例如C1-C4醇)、或前述之組合。於本發明部分具體實施態樣中,係採用水做為萃取溶劑。一般而言,萃取溶劑的用量可視需要進行調整,並無特殊限制,只要可使原料均勻分散即可。舉例言之,可於步驟(a)採用余甘子與萃取溶劑之重量比為1:5至1:20的用量。此外,亦可視所採用之萃取溶劑來選用合宜的萃取時間、以及萃取溫度。以採用純水作為萃取溶劑且余甘子:萃取溶劑之重量比為1:5至1:20為例,通常係於50˚C至100˚C下,萃取0.5小時至3小時即可。
於步驟(b)中,係將釀酒酵母菌及胚芽乳酸桿菌添加至步驟(a)所提供的萃取物中,以進行第一發酵反應。於本發明部分具體實施態樣中,係以釀酒酵母菌BCRC 20271及胚芽乳酸桿菌BCRC 910760對步驟(a)所提供的萃取物進行發酵。此外,可視所採用之釀酒酵母菌及胚芽乳酸桿菌來選用合宜的發酵時間、以及發酵溫度。以採用釀酒酵母菌BCRC 20271及胚芽乳酸桿菌BCRC 910760為例,通常係於25˚C至35˚C發酵1天至5天。一般而言,釀酒酵母菌及胚芽乳酸桿菌的添加量並無特殊限制。舉例言之,於本發明部分具體實施態樣中,釀酒酵母菌之添加量可為萃取物的0.01重量%至0.5重量%,胚芽乳酸桿菌之添加量可為萃取物的0.01重量%至0.25重量%。
於步驟(c)中,係將醋酸菌添加至步驟(b)所提供的中間發酵物中,以進行第二發酵反應。於本發明部分具體實施態樣中,係以醋酸菌BCRC 11688對步驟(b)所提供的中間發酵物進行發酵。此外,可視所採用之醋酸菌來選用合宜的發酵時間、以及發酵溫度。以採用醋酸菌BCRC 11688為例,通常係於25˚C至35˚C發酵5天至15天。一般而言,醋酸菌之添加量並無特殊限制。舉例言之,於本發明部分具體實施態樣中,醋酸菌之添加量可為中間發酵物的1重量%至15重量%。
於上述步驟完成之後,可視需要進行例如減壓濃縮、過濾、及滅菌操作,以提升余甘子萃取發酵物之使用便利性。舉例言之,可於40˚C至70˚C下對余甘子萃取發酵物進行減壓濃縮,以提供一濃縮發酵物;或者,可以200至400目(mesh)之網篩對余甘子萃取發酵物或濃縮發酵物進行過濾,以移除殘餘固體物。另一方面,可於余甘子萃取發酵物中添加40%至70%(重量/重量)之異麥芽寡糖、並於90˚C至120˚C下,滅菌70分鐘至90分鐘,以提供一飲品。
根據本發明所提供之醫藥組成物可用於全身性或局部性投藥,且可透過各種藥物傳遞系統(drug delivery system,DDS)進行傳遞,包括口服藥物傳遞系統(oral drug delivery system)、經皮藥物傳遞系統(transdermal drug delivery system)、注射藥物傳遞系統(injectable drug delivery system)等。舉例言之,但不以此為限,該根據本發明所提供之醫藥組成物可以藉由微脂體(liposome)、微膠囊(microcapsule)、奈米微粒(nanoparticle)、微針(microneedle)等系統進行傳遞,以達到提高生物利用率、控制藥物釋放速度、針對病灶精準投藥、減少藥物副作用等效果。
該根據本發明所提供之醫藥組成物係可呈任何合宜的型式,並無特殊限制,端視所欲之用途而呈對應之合宜劑型;舉例言之,但不以此為限,該醫藥組成物可以口服、靜脈注射(包含點滴輸注及快速注射)、肌肉注射、皮下注射、動脈注射、腹腔注射、經皮(例如貼片、軟膏等)之投藥方式施用至有需要之個體上。視使用形式及用途而定,可選用醫藥上可接受之載劑以提供該醫藥組成物,其中,該載劑為熟悉製藥技術者所熟知,包括賦形劑、稀釋劑、輔助劑、安定劑、吸收促進劑、崩散劑、增溶劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑等。
以口服劑型為例,可利用任何合宜之方法,將該醫藥組成物以適於口服投藥的劑型提供,其中,適於口服之液態劑型包括糖漿劑、口服液、懸浮液、酏劑等,適於口服之固態劑型則包括粉劑、顆粒劑、口含錠、糖衣錠、腸溶錠、咀嚼錠、發泡錠、膜衣錠、膠囊劑、長效緩釋錠等。於根據本發明所提供之該醫藥組成物中可含有任何不會不利影響活性成分(即,式(I)至式(XIV)化合物及余甘子萃取發酵物之至少一者)之所欲效益的醫藥上可接受之載劑。舉例言之,但不以此為限,前述液態劑型之醫藥上可接受之載劑的例子包括:水、食鹽水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其類似物、油(例如橄欖油、蓖麻油、棉籽油、花生油、玉米油、及胚芽油)、甘油、聚乙二醇、及前述之組合;前述固態劑型之醫藥上可接受之載劑的例子則包括:纖維素、澱粉、高嶺土(kaolinite)、膨潤土(bentonite)、檸檬酸鈉、明膠、瓊脂、羧甲基纖維素、阿拉伯膠、海藻膠、單硬脂酸甘油酯(glyceryl monostearate)、硬脂酸鈣(calcium stearate)、及前述之組合。
亦可於適於經皮投藥之劑型中含有任何不會不利影響活性成分(即,式(I)至式(XIV)化合物及余甘子萃取發酵物之至少一者)之所欲效益的醫藥上可接受之載劑,例如:水、礦物油、丙二醇、聚氧化乙烯、液體石蠟脂、去水山梨醇單硬脂酸酯、及聚山梨醇酯60。可利用任何合宜之方法,將該醫藥組成物以適於經皮投藥的劑型提供,例如以乳液、乳霜、油狀物、凝膠(例如水凝膠)、膏狀物(例如分散膏、軟膏)、洗劑、噴霧劑、及貼片(例如微針貼片)等形式提供,但不以此為限。
至於適於注射之針劑或點滴劑,則可於根據本發明所提供之醫藥組成物中含有一或多種例如等張溶液、鹽類緩衝液(如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液)、增溶劑、乳化劑、5%糖溶液、以及其他載劑等成分,以靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等劑型提供該醫藥組成物。或者,可將該醫藥組成物製備成一注射前固體,並於投予至有需要之個體之前,將該注射前固體溶於其他溶液或懸浮液中或將其乳化,以提供所欲之注射劑。
根據本發明所提供之食品組成物可為飲品、固態食品、或半固態食品,且可以健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品或特殊營養食品的形式提供。舉例言之,但不以此為限,該食品組成物可為乳製品、肉類加工品、麵包類、麵食品、餅乾、冰品、口含錠、膠囊、果汁類、茶類、氣泡水、酒精飲料、運動飲料、營養飲料、嬰幼兒離乳食品等產品。較佳地,該食品組成物係以健康食品或保健食品的形式提供。
此外,視使用形式及需求而定,可於根據本發明所提供之食品組成物中含有任何適宜之食品添加物。舉例言之,包括但不限於,防腐劑、殺菌劑、抗氧化劑、漂白劑、保色劑、膨脹劑、營養添加劑、著色劑、調味劑(例如:甜味劑)、黏稠劑、結著劑、食品工業用化學藥品、乳化劑、以及品質改良用、釀造用及食品製造用劑。
可於根據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品或特殊營養食品的外包裝上標示建議使用量、使用標準及條件、或與其他食品或醫藥共同服用的建議事項,以利使用者在無醫師、藥師或相關執事人員指導下自行服用而無安全疑慮。
可將根據本發明所提供之保養品組成物調配成任何合宜之產品形式。舉例言之,但不以此為限,該保養品組成物可為柔膚化妝水、收斂化妝水、營養化妝水、營養霜、按摩霜、精華液、眼霜、眼部精華液、面膜、貼片、噴霧、身體乳液、身體霜、身體油、及身體精華液等護理產品;妝前乳、粉底、蜜粉,腮紅、眼影、眉粉、睫毛膏、口紅等彩妝產品;或潔膚油、潔膚霜、潔膚水、眼唇卸妝液、香皂、沐浴露等清潔產品。此外,該保養品組成物還可以泡沫(foam)形態或進一步含有壓縮推進劑的氣霧(aerosol)形態來使用。
視產品的形式及需求而定,可於根據本發明所提供之保養品組成物中含有任何不會不利影響活性成分(即,式(I)至式(XIV)化合物及余甘子萃取發酵物之至少一者)之所欲效益的化妝品學或皮膚科學上可接受的媒劑。舉例言之,但不以此為限,當該保養品組合物為一乳液狀、霜狀或凝膠狀產品時,可使用蠟、石蠟、澱粉、黃耆膠、纖維素衍生物、動物油、植物油、礦物油、聚乙二醇、膨潤土、氧化矽、滑石、氧化鋅等成分作為媒劑;當該保養品組成物為一粉狀或氣霧產品時,可使用例如乳糖、滑石、氧化矽、氫氧化鋁、矽酸鈣、聚醯胺等成分作為媒劑;當該保養品組成物為一溶液或乳濁液狀產品時,則可使用例如水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、聚乙二醇等成分作為媒劑。
當該保養品組成物以清潔產品的形式提供時,可進一步包含任何不會不利地影響活性成分(即,式(I)至式(XIV)化合物及余甘子萃取發酵物之至少一者)之所欲效益的界面活性劑作為媒劑。其中,該界面活性劑的例子包括,但不限於:脂肪酸鹽、烷基苯磺酸鹽(alkylbenzene sulfonate,ABS)、脂肪醇硫酸鹽(fatty alcohol sulfate,FAS)、脂肪醇聚氧乙烯硫酸鹽(alcohol ether sulfate,AES)、脂肪醇聚氧乙烯羧酸鹽(fatty alcohol polyoxyethylene ether carboxylate,AEC)、脂肪酸甲酯磺酸鹽(fatty acid methyl ester sulfonate,MES)、脂肪醇聚氧乙烯醚(fatty alcohol ethoxylates,AE)、烷基糖苷(alkyl polyglycoside,APG)、甜菜鹼型界面活性劑(Betaine type surfactant)、及前述之組合。
視需要地,亦可於根據本發明所提供之醫藥組成物、食品組成物或保養品組成物中進一步含有合宜用量之添加物,例如可提高該組成物於使用時感受之調色劑、著色劑等,以及可改善該組成物的穩定性及儲存性之緩衝劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。
根據本發明所提供之醫藥組成物、食品組成物或保養品組成物可視需要另含一或多種其他活性成分(例如:維他命C、麴酸、熊果素、傳明酸、穀胱甘肽、綠原酸、膳食纖維、兒茶素、β-聚葡萄糖),以進一步加強該組成物之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度,只要該其他活性成分對本發明活性成分(即,式(I)至式(XIV)化合物及余甘子萃取發酵物之至少一者)之效益沒有不利的影響即可。
根據本發明所提供之醫藥組成物、食品組成物或保養品組成物中係含有以該組成物之總重量計,至少約0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.001、0.0015、0.002、0.0025、0.003、0.0035、0.004、0.0045、0.005、0.0055、0.006、0.0065、0.007、0.0075、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100重量%之活性成分(即,式(I)至式(XIV)化合物及余甘子萃取發酵物之至少一者),且可自前述數值之任意二者選擇有用的範圍,例如:約0.0001重量%至約90重量%、約0.001重量%至約25重量%、約0.01重量%至約10重量%、約0.01重量%至約5重量%、約0.05重量%至約1重量%、及約0.05重量%至約0.5重量%。
根據本發明所提供之醫藥組成物、食品組成物或保養品組成物係可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率施用,端視投與個體之需求、年齡、體重、及健康況狀及施用目的而異。亦可視實際應用需求調整根據本發明所提供之醫藥組成物、食品組成物或保養品組成物中余甘子萃取發酵物及式(I)至式(XIV)化合物的含量,例如:調整至每日應服用或外用的量。一般而言,當以食品組成物之形式使用時,建議服用量為每日0.8克(或8毫升)之余甘子萃取發酵物。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明,而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
實施例
[
製備實施例
]
於以下製備實施例中,所使用的物料及器材如下:
1. 核磁共振光譜儀(Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer,NMR),1D與2D光譜使用Ascend 400 MHz(Bruker Co., Germany),以δ表示化學位移(chemical shift)。
2. 質譜儀(Mass Spectrometer,MS)串聯質譜-二維離子阱串聯傅立葉轉換質譜及ESI-MS/MS:使用Bruker amaZon SL system測定,單位為 m/z。
3. 中壓液相層析儀(Medium pressure liquid chromatography,MPLC):購自CombiFlash
® Rf+, Teledyne ISCO, Lincoln, NE。
4. 高效能液相層析儀(High Performance Liquid Chromatography,HPLC;購自Agilent Germany):高效液相層析儀係Agilent 1200系列;脫氣裝置係Agilent 真空脫氣裝置1322A;沖提溶劑輸送係Agilent四元幫浦G1311A;可變波長偵測器(Multiple Wavelength Detector,MWD)係Agilent G1314B;光二極體陣列偵測器(Diode Array Detector,DAD)係Agilent 1260 Infinity DAD VL G1315D,偵測波長為210 nm、280 nm、320 nm、365 nm。
5. 分析管柱: Luna® 5μm C18(2) 100 Å(250 x 10 mm,購自Phenomenex, USA)。
6. 管柱層析(Column Chromatography)填充材料:
Sephadex LH-20(Pharmacia, Piscataway, NJ, USA.);
Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical Co., Japan);
Merck Kieselgel 60(40-63 μm, Art. 9385);
Merck LiChroprep® RP-18(40-63 μm, Art. 0250)。
7. 薄層色層分析(Thin-Layer Chromatography)
TLC aluminium sheets(Silica gel 60 F254
, 0.25 mm,購自Merck, Germany);
TLC aluminium sheets(RP-18 F254
-S, 0.25 mm,購自Merck, Germany)。
8. 紫外光燈(UV Lamp):UVP UVGL-25,波長為 254 nm及365 nm。
9. 溶劑(採購自默克台灣):正己烷(n-hexane)、乙酸乙酯(ethyl acetate)、丙酮(acetone)、甲醇(methanol)、乙醇(ethanol)、乙腈(acetonitrile)、氯仿-d1
(deuteration degree 99.5%)、甲醇-d4
(deuteration degree 99.5%)、重水(deuterium oxide,deuteration degree > 99.8%)、二甲基亞碸-d6
(Dimethyl sulfoxide-d6
,deuteration degree > 99.9%)。
A.
余甘子萃取發酵物的製備
A-1.
取余甘子(來源:中國)之果實(經清洗),並以1:10(余甘子:水)之重量比將余甘子與水混合,以提供一混合物。將前述混合物置於95℃下進行萃取,歷時1小時,以提供一余甘子萃取物。將余甘子萃取物冷卻至室溫,待後續之發酵步驟使用。
A-2.
取A-1所提供之余甘子萃取物,於其中添加釀酒酵母菌BCRC 20271及胚芽乳酸桿菌BCRC 910760,並置於25˚C至35˚C下發酵72小時,以提供一中間發酵物。其中,該釀酒酵母菌的添加量為該余甘子萃取物重量的0.1重量%,且該胚芽乳酸桿菌的添加量為該余甘子萃取物重量的0.05重量%。
A-3.
取A-2所提供之中間發酵物,於其中添加醋酸菌BCRC 11688,並置於25˚C至35˚C下發酵96小時,以提供一余甘子萃取發酵物。其中,該醋酸菌的添加量為該中間發酵物重量的5重量%。
A-4.
取A-3所提供之余甘子萃取發酵物,置於60℃下進行減壓濃縮,以提供一濃縮發酵物。接著,將該濃縮發酵物以200目之網篩過濾,以移除殘餘固體物。最後,添加60%(重量/重量)的異麥芽寡糖至經該前述處理的發酵物中,並於100℃下滅菌70分鐘,以提供一包含余甘子萃取發酵物的飲品。
B.
式(
I
)至式(
XIV
)化合物的製備
B-1.
取10公升A-3所提供之余甘子萃取發酵物,以乙酸乙酯與正丁醇作為溶劑,接續進行液相-液相分配萃取,得到乙酸乙酯可溶部26.3克(EAF,12.4%)、正丁醇可溶部53.8克(BUF,24.4%)、以及水可溶部131.3克(WF,63.2%)。
B-2.
取B-1所提供之乙酸乙酯可溶部(EAF),以甲醇作為沖提液進行葡聚糖凝膠管柱層析(Sephadex LH-20 column chromatography)。接著,以薄層色層進行分析,並將結果相似的沖提物合併,得到8個分離部(EAF1至EAF8)。取EAF1至EAF7,分別進行以下純化分離:
I. EAF1經逆向-HPLC純化(以甲醇與水作為溶劑,甲醇:水=1:9),得到式(III)化合物。經氫-核磁共振光譜(1
H-NMR)與電噴灑離子化質譜(ESIMS)分析其化學結構後,確認式(III)化合物為葡糖倍甙(Glucogallin)。
II. EAF2經逆向-HPLC純化(以甲醇與水作為溶劑,甲醇:水=1:9),得到式(VII)化合物,經1
H-NMR與ESIMS分析其化學結構後,確認式(VII)化合物為沒食子酸(Gallic acid)。
III. EAF3經逆向-HPLC純化(以甲醇與水作為溶劑,甲醇:水=1:4),得到式(IV)化合物與式(VI)化合物,經1
H-NMR與ESIMS分析其化學結構後,確認式(IV)化合物為沒食子酸甲酯(Methyl gallate)、式(VI)化合物為酪醇(Tyrosol)。
IV. EAF4經逆向-HPLC純化(以甲醇與水作為溶劑,甲醇:水=1:3),得到式(I)化合物與式(XIII)化合物,經1
H-NMR與ESIMS分析其化學結構後,確認式(I)化合物為訶子鞣酸(Chebulagic acid);式(XIII)化合物為1,6-二沒食子醯基葡萄醣(1,6-Di-O-galloylglucose)。
V. EAF5經逆向-HPLC純化(以甲醇與水作為溶劑,甲醇:水=3:7),得到化合物式(II)化合物、式(XII)化合物、與式(XIV)化合物,經1
H-NMR與ESIMS分析其化學結構後,確認式(II)化合物為鞣料雲實素(Corilagin)、式(XII)化合物為1,4-雙-氧-沒食子醯基-3,6六羥聯苯二甲醯葡萄醣(1,4-Di-O-galloyl-3,6-hexahydroxydiphenoylglucose)、式(XIV)化合物為1,2-雙-氧-沒食子醯基-3,6六羥聯苯二甲醯葡萄醣(1,2-Di-O-galloyl-3,6-hexahydroxydiphenoylglucose)。
VI. EAF6經逆向-HPLC純化(以甲醇與水作為溶劑,甲醇:水=2:3),得到式(IX)化合物與式(X)化合物,經1
H-NMR與ESIMS分析其化學結構後,確認式(IX)化合物為槲皮素-7-鼠李糖苷(Quercetin-7-O-rhamnoside);式(X)化合物為槲皮苷(Quercitrin)。
VII. EAF7經逆向-HPLC純化(以甲醇與水作為溶劑,甲醇:水=1:1),得到化合物式(V)化合物、式(VIII)化合物、與式(XI)化合物,經1
H-NMR與ESIMS分析其化學結構後,確認化合物式(V)為鞣花酸(Ellagic acid)、式(VIII)化合物為槲皮素(Quercetin)、式(XI)化合物為3,4,8,9,10-五羥-二苯並吡喃-6-酮(3,4,8,9,10-Pentahydroxy-dibenzopyran-6-one)。
實施例
1
:余甘子萃取發酵物於抑制脂肪細胞之脂肪形成能力的效果
於本實施例中,所使用的物料及器材如下:
1. 細胞株:OP9(購自ATCC®CRL-2749™)。
2. 前脂肪細胞擴充培養基(Pre-adipocyte Expansion Medium):
90% MEM-α培養基(Minimum Essential Medium Alpha Medium,購自Gibco);
20% 胎牛血清(Fetal Bovine Serum,購自Gibco);
1% 青黴素-鏈黴素(Penicillin-streptomycin,購自Gibco)。
3. 脂肪細胞分化培養基(Differentiation Medium):
90% MEM-α培養基(Minimum Essential Medium Alpha Medium,購自Gibco);
20% 胎牛血清(Fetal Bovine Serum,購自Gibco);
1% 青黴素-鏈黴素(Penicillin-streptomycin,購自Gibco)。
4. 磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline,PBS):購自Gibco
5. 油紅O染劑(Oil-red O staining reagent,購自Sigma):儲存溶液:3 毫克/毫升溶於100%異丙醇中;工作溶液(Working solution):60%儲存溶液,以ddH2
O進行製備。
6. ELISA讀盤機:購自BioTek。
7. 10%甲醛:購自ECHO。
8. 100%異丙醇:購自ECHO。
9. DPBS(Dulbecco’s phosphate buffered saline):購自Gibco。
10. 顯微鏡:購自ZEISS。
將OP9細胞(8x104
個細胞/孔)接種於一24孔培養盤,各孔含有500微升的前脂肪細胞擴充培養基。將前述培養盤置於37˚C下培養7天,在培養期間每3天更新一次培養基,其中,用於更新的培養基為脂肪細胞分化培養基。7天後,以顯微鏡觀察細胞,確認細胞內油滴的形成(表示OP9細胞已分化為脂肪細胞)。
取上述脂肪細胞置於24孔培養盤中,分成三組(每組有6孔)後,分別以如下培養基進行培養,於37˚C下歷時7天,期間每3天更新培養基:
1. 控制組:脂肪細胞分化培養基(共500微升)。
2. 萃取物組:含有2.5毫克/毫升[製備實施例A-1]所提供之余甘子萃取物的脂肪細胞分化培養基(共500微升);以及
3. 發酵物組:含有2.5毫克/毫升[製備實施例A-3]所提供之余甘子萃取發酵物的脂肪細胞分化培養基(共500微升)。
接著,對上述各組所提供之細胞進行以下處理:移除培養基並以1毫升PBS潤洗各孔細胞二次,接著在室溫下以1毫升10%甲醛固定各孔細胞30分鐘。移除甲醛後,以1毫升PBS潤洗各孔細胞二次。於各孔中添加1毫升之60%異丙醇,靜置1分鐘。其後,移除異丙醇,並於各孔中添加1毫升之油紅O染劑以進行染色,歷時1小時。移除油紅O染劑後,於各孔中添加1毫升之60%異丙醇退染5秒。最後,以顯微鏡觀察脂肪細胞之油滴狀況並拍照記錄,結果顯示於圖2。
完成上述顯微鏡觀察與拍照後,於24孔培養盤之各孔中添加100%之異丙醇,並將24孔培養盤置於震盪器培養10分鐘,以將細胞內的染劑溶出。接著,取100微升溶有染劑的異丙醇溶液移入96孔盤中,以ELISA讀盤機測量於波長510奈米下的吸光值,以定量所溶解出的染劑,藉此檢測各組細胞之脂肪含量。最後,以「控制組」的結果為基準(即,將控制組的脂肪含量設定為100%),計算其他各組的相對脂肪含量。數據使用Excel軟體進行統計分析,以學生t(student’s t-test)檢驗是否達到統計學上的顯著性。結果示於圖3。
由圖2可知,無論是相較於「控制組」或「萃取物組」,「發酵物組」之脂肪細胞被油紅染劑染色之區域皆明顯減少(代表油滴明顯縮小)。此外,由圖3可知,相較於「控制組」,「萃取物組」之脂肪細胞的脂質含量下降約40%,「發酵物組」之脂肪細胞的脂肪含量則下降約55%。前述結果顯示,本發明余甘子萃取發酵物可有效降低脂肪細胞中的脂肪含量,達到抑制脂肪細胞之脂肪形成能力、使個體不易形成體脂肪、及促進瘦身的效果。
實施例
2
:余甘子萃取發酵物於提升粒線體活性的效果
粒線體係細胞中產生能量的主要場所,並與細胞訊息傳遞及細胞活性息息相關,粒線體活性越高,越可促進細胞的整體生理活動。已知,可透過粒線體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)的測量反映粒線體活性。為了解本發明余甘子萃取發酵物於提升粒線體活性的效果,本實施例係利用JC-1粒線體染劑檢測粒線體膜電位,其中,當粒線體膜電位增高時,JC-1粒線體染劑會從原本具綠色螢光訊號的單體(monomer)變成具紅色螢光訊號的聚合體(dimer)。藉由流式細胞儀來偵測細胞中單體及聚合體的占比,即可得知細胞的粒線體活性。
於本實施例中,所使用的物料及器材如下:
1. 細胞株:骨骼肌細胞C2C12(購自ATCC® CRL-1772™)。
2. 骨骼肌細胞培養基:含有1%青黴素-鏈黴素(購自Gibco)與10%胎牛血清(購自Gibco)之DMEM培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium)。
3. PBS:購自Gibco。
4. 工作溶液:一方面,將10x檢測液(assay buffer)置於37˚C預熱,並以滅菌後之1x PBS稀釋為1x檢測液,攪拌均勻後保存於37˚C;另一方面,於凍乾的JC-1粒線體染劑中添加130微升之DMSO,以提供一JC-1粒線體染劑儲存液(該儲存液可在-20˚C下保存6個月);將前述所提供之JC-1粒線體染劑儲存液與1x檢測液混和(JC-1粒線體染劑儲存液:1x檢測液=1:100),以提供一工作溶液。
5. 流式細胞儀粒線體膜電位偵測套組(Flow cytometry Mitochrondrial membrane potential detection kit):購自BD。
6. 流式細胞儀:購自Beckman。
將C2C12細胞(1x105
個細胞/孔)接種於6孔培養盤,分成三組(每組有2孔)後,分別以如下培養基進行培養(37˚C、歷時24小時):
1. 控制組:骨骼肌細胞培養基(共2毫升)。
2. 萃取物組:含有0.156毫克/毫升[製備實施例A-1]所提供之余甘子萃取物的骨骼肌細胞培養基(共2毫升);以及
3. 發酵物組:含有0.156毫克/毫升[製備實施例A-3]所提供之余甘子萃取發酵物的骨骼肌細胞培養基(共2毫升)。
接著,對上述各組所提供之細胞進行以下處理:移除培養基並以1xPBS潤洗各孔細胞二次後,以胰蛋白酶處理各孔細胞,以將各孔細胞分別收集於1.5毫升之微離心管中。以400xg離心5分鐘後,移除上清液並於各孔添加100微升之工作溶液,再以漩渦震盪混和均勻,於避光狀態下靜置15分鐘。接著,以400xg離心5分鐘。以1毫升之1x清洗液(wash buffer)潤洗各管細胞後,再以400xg離心5分鐘(重複兩次)。最後,將各管細胞重新懸浮於500微升之含有2%FBS的1xPBS中,並以流式細胞儀進行分析。數據使用Excel軟體進行統計分析,以學生t(student’s t-test)檢驗是否達到統計學上的顯著性。結果顯示於圖4。
由圖4可知,無論是相較於「控制組」或「萃取物組」,「發酵物組」之骨骼肌細胞的JC-1聚合體占比皆明顯較高。前述結果顯示,本發明余甘子萃取發酵物可有效提升粒線體活性,可幫助代謝。
實施例
3
:余甘子萃取發酵物於抑制黑色素生成的效果
陽光中的紫外線(320 nm至400 nm)可以直接穿越表皮層到達表皮基底層內的黑色素細胞,導致黑色素增加,使得皮膚變黑。為了解本發明余甘子萃取發酵物於抑制黑色素生成的效果,係進行以下實驗。
於本實施例中,所使用的物料及器材如下:
1. 細胞株:黑色素瘤細胞B16F10(CRL:6475,購自ATCC)。
2. 黑色素瘤細胞培養基:含有1%青黴素-鏈黴素(購自Gibco)與10%胎牛血清(購自Gibco)之DMEM培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium)。
3. PBS:購自Gibco。
4. 1N NaOH:以ddH2
O製備。
5. ELISA讀盤機:購自BioTek。
6. 紫外線艙(Ultraviolet radiation chamber):購自Vilber。
將B16F10細胞(1.5x105
個細胞/孔)接種於6孔培養盤,於37˚C下培養24小時。接著,將細胞分成五組,並將各組細胞分別培養於以下培養基中(37˚C下、歷時48小時,其中,控制組細胞於培養過程中不以UVA照射,控制組以外的四組細胞於培養過程中則皆置於紫外線艙中以10 J/cm2
強度的UVA照射):
1. 控制組:黑色素瘤細胞培養基(共3毫升)。
2. UVA組:黑色素瘤細胞培養基(共3毫升)。
3. 正控制組:含有250微克/毫升麴酸(kojic acid)的培養基(共3毫升);
4. 萃取物組:含有2.5毫克/毫升[製備實施例A-1]所提供之余甘子萃取物的黑色素瘤細胞培養基(共3毫升);以及
5. 發酵物組:含有2.5毫克/毫升[製備實施例A-3]所提供之余甘子萃取發酵物的黑色素瘤細胞培養基(共3毫升)。
其後,對上述各組所提供之細胞進行以下處理:移除培養基,並以1xPBS潤洗細胞二次。以胰蛋白酶處理細胞,歷時3分鐘,並將各組細胞分別收集於15毫升之離心管中,400xg離心5分鐘以沉澱細胞。接著,以1xPBS潤洗細胞二次,再將細胞沉澱物重新懸浮在200微升之1xPBS中。將完成前述處理的細胞溶液於液態氮中保存10分鐘後,再置於室溫下30分鐘以將細胞溶液解凍。
待細胞溶液完全解凍後,以12,000xg離心30分鐘。移除上清液後,於各組加入120微升之1N NaOH。混和均勻後,置於60˚C之乾浴槽中,歷時1小時。分別取100微升之得自各組的細胞溶液置於96孔盤中,並讀取其在450 nm波長下的OD值。最後,以控制組作為基準(即,將控制組的黑色素含量設定為100%)計算其餘各組的相對黑色素含量。數據使用Excel軟體進行統計分析,以學生t(student’s t-test)檢驗是否達到統計學上的顯著性。結果示於圖5。
由圖5可知,「UVA組」細胞中的黑色素含量明顯高於「控制組」,顯示UVA確實會誘導黑色素生成。另一方面,「正控制組」、「萃取物組」及「發酵物組」細胞中的黑色素含量皆低於「UVA組」,其中,「發酵物組」的效果不僅優於「正控制組」,甚至較「萃取物組」為佳。前述結果顯示,本發明余甘子萃取發酵物可有效抑制黑色素生成,可用於美白。
實施例
4
:余甘子萃取發酵物於提升
SOD2
、
MPG
及
ERCC1
基因表現的效果
於本實施例中,所使用的物料及器材如下:
1. RNA萃取套組(RNA Extraction Kit):購自Geneaid。
2. 反轉錄酶(SuperScript® III Reverse Transcriptase):購自Invitrogen。
3. 引子:如下表,GAPDH
係作為內控制。
4. KAPA CYBR FAST qPCR Kits (2x):購自KAPA Biosystems。
5. Step One Plus:購自ABI。
MPG-F | TCCGGCGACTTCCTAATGG | 19 | 201bp |
MPG-R | CCCCCTGGCTGGAGATGT | 18 | |
ERCC1-F | GGAAGCTGGGCGGTACCT | 18 | 150bp |
ERCC1-R | AGGGTCTGACTGTCCGTTTTGTT | 23 | |
SOD2-F | GGAAGCCATCAAACGTGACTT | 21 | 116bp |
SOD2-R | CCCGTTCCTTATTGAAACCAAGC | 23 | |
GAPDH-F | CTGGGCTACACTGAGCACC | 19 | 101bp |
GAPDH-R | AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG | 21 |
於MEM培養基中培養人類皮膚纖維母細胞歷時24小時,接著,將細胞分成三組,並進行以下處理:
1. 控制組:將細胞置於MEM培養基中培養24小時,再以UVA照射細胞(5焦耳/平方公分),歷時1小時;
2. 萃取物組:將細胞置於含有2.5毫克/毫升[製備實施例A-1]所提供之余甘子萃取物的MEM培養基(共2毫升)中培養24小時,再以UVA照射細胞(5焦耳/平方公分),歷時1小時;
3. 發酵物組:將細胞置於含有2.5毫克/毫升[製備實施例A-3]所提供之余甘子萃取發酵物的MEM培養基(共2毫升)中培養24小時,再以UVA照射細胞(5焦耳/平方公分),歷時1小時。
接著,對上述各組所提供之細胞進行以下處理:以RNA萃取套組進行RNA萃取,再以反轉錄酶將該RNA反轉錄為cDNA。接著,使用ABI Step One Plus儀器及KAPA SYBR FAST qPCR套組對前述所提供之cDNA進行qPCR(quantitative polymerase chain reaction),以檢測各組細胞之SOD2
、MPG
及ERCC1
的基因表現量。最後,以控制組作為基準(即,將控制組的基因表現設定為1倍)計算其餘各組的基因相對表現量。數據使用Excel軟體進行統計分析,以學生t(student’s t-test)檢驗是否達到統計學上的顯著性。結果示於圖6及圖7。
由圖6至圖7可知,相較於「控制組」,「萃取物組」及「發酵物組」之細胞的SOD2
、MPG
及ERCC1
基因表現量皆較高,其中,「發酵物組」細胞的SOD2
、MPG
及ERCC1
基因表現量又高於「萃取物組」。前述結果顯示,本發明余甘子萃取發酵物確實具有提升細胞抗氧化能力、及提升細胞修復DNA能力的效果,可用於抗皮膚老化(例如抗皮膚光老化)。
實施例
5
:余甘子萃取發酵物於抗氧化的效果
已知,當皮膚細胞中的活性氧化物質(Reactive Oxygen Species,ROS)含量過高,會造成細胞組織被破壞與DNA受損,導致皮膚老化。為了解本發明余甘子萃取發酵物於抑制皮膚細胞中ROS生成的效果,係進行以下實驗。
於本實施例中,所使用的物料及器材如下:
1. 細胞株:人類皮膚纖維母細胞(Human skin fibroblast,CCD-966sk,BCRC No. 60153)。
2. 培養基:90%Earle's平衡鹽溶液中的MEM培養基(Minimum essential medium (Eagle) in Earle's BSS),含0.1 mM非必要胺基酸(non-essential amino acids)、1.5克/升碳酸氫鈉及1 mM丙酮酸鈉、以及10%胎牛血清;購自Gibco。
3. PBS:購自Gibco。
4. DCFH-DA:購自Sigma,型號SI-D6883-50MG,儲存溶液:5 毫克/毫升,溶於DMSO中。
5. H2O2:購自Sigma。
6. 流式細胞儀:購自BD Accuri。
將人類皮膚纖維母細胞(2x105
個細胞/孔)接種於6孔培養盤,於37˚C下培養24小時。接著,移除培養基,並將細胞分成三組(每組有2孔),分別以如下培養基進行培養,歷時1小時:
1. 控制組:含有1 mM H2
O2
的MEM培養基。
2. 萃取物組:含有1 mM H2
O2
及5毫克/毫升[製備實施例A-1]所提供之余甘子萃取物的MEM培養基(共2毫升)。
3. 發酵物組:含有1 mM H2
O2
及5毫克/毫升[製備實施例A-3]所提供之余甘子萃取發酵物的MEM培養基(共2毫升)。
其後,對上述各組所提供之細胞進行以下處理:在37˚C下以5微克/毫升之DCFH-DA染劑處理15分鐘後,在37˚C下再以H2
O2
在處理1小時。以1毫升1xPBS潤洗細胞二次,接著,於各孔細胞添加200微升之胰蛋白酶,並於暗處反應5分鐘。將各組細胞與培養基收集於1.5毫升之離心管中,並以400xg離心10分鐘。移除上清液後,以1xPBS潤洗細胞一次。接著,再以400xg離心10分鐘,移除上清液後,將各組細胞沉澱物重新懸浮於1毫升1xPBS中。最後,以流式細胞儀偵測各組於激發光波長450-490 nm及放射光波長510-550nm之螢光強度。其中,由於ROS可將DCFH-DA(不具螢光)轉變為DCF(具有螢光),故所測得之螢光強度可代表細胞中的ROS含量,螢光強度越高表示細胞中的ROS含量越高。最後,以「控制組」的結果為基準(即,將控制組的ROS含量設定為1倍),計算其他各組細胞中的ROS含量。數據使用Excel軟體進行統計分析,以學生t(student’s t-test)檢驗是否達到統計學上的顯著性。結果示於圖8。
由圖8可知,「萃取物組」及「發酵物組」的相對ROS含量皆低於1倍,且「發酵物組」又低於「萃取物組」。前述結果顯示,本發明余甘子萃取發酵物具有優異之抑制皮膚細胞中ROS生成的效果,可有效抗皮膚老化。
實施例
6
:余甘子萃取發酵物於抑制
AGEs
生成的效果
醣化反應(glycosylation)係指葡萄糖附著到蛋白質的化學反應過程,此反應會產生最終醣化終產物(advanced glycation end product,AGEs)。堆積於皮膚細胞中的最終醣化終產物不僅容易引起蛋白質的變性,導致皮膚皺紋產生、鬆弛等老化現象,亦會引起活性氧化物的生成、造成氧化壓力,致使皮膚細胞DNA損傷、影響皮膚細胞DNA正常功能,甚至誘發皮膚疾病。為確認本發明余甘子萃取發酵物於抑制AGEs生成的效果,係進行以下實驗。
於本實施例中,所使用的物料及器材如下:
1. 磷酸氫二鈉(Na2
HPO4
)
2. 磷酸二氫鈉(NaH2
PO4
)
3. 牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)
4. D-(-)-果糖(D-(-)-Fructose,C6
H12
O6
)
5. 疊氮化鈉(Sodium azide,NaN3
)
6. 200 mM磷酸鹽緩衝液(Sodium phosphate buffer,pH 7.4)
7. 以200 mM磷酸鹽緩衝液配置含有0.06% NaN3
之60毫克/毫升之牛血清蛋白(BSA)
8. 以200 mM磷酸鹽緩衝液配置1.5 M D-果糖
實驗組:取0.25毫升[製備實施例A-3]提供之余甘子萃取發酵物,與0.25毫升之牛血清蛋白(BSA)溶液及0.25毫升之果糖溶液均勻混合,以提供一混合溶液。取0.1毫升之前述混合溶液,並偵測其於激發光波長360 nm及放射光波長460 nm之螢光強度(此稱為「實驗組0小時之螢光值」)。接著,將該混合溶液置於50℃下反應24小時,使溶液中的蛋白發生醣化反應,以提供一醣化反應溶液。取0.1毫升之前述醣化反應溶液,並偵測其於激發光波長360 nm及放射光波長460 nm之螢光強度(此稱為「實驗組24小時之螢光值」)。
控制組:取0.25毫升的水,與0.25毫升之牛血清蛋白(BSA)溶液及0.25毫升之果糖溶液均勻混合,以提供一混合溶液。取0.1毫升之前述混合溶液,並偵測其於激發光波長360 nm及放射光波長460 nm之螢光強度(此稱為「控制組0小時之螢光值」)。接著,將該混合溶液置於50℃下反應24小時,使溶液中的蛋白發生醣化反應,以提供一醣化反應溶液。取0.1毫升之前述醣化反應溶液,並偵測其於激發光波長360 nm及放射光波長460 nm之螢光強度(此稱為「控制組24小時之螢光值」)。
最後,以如下公式計算控制組與實驗組之AGEs生成量(%)(其中,AGEs生成量越低表示抗醣化活性越高)。最後,以「控制組」的結果為基準(即,將控制組的AGEs生成量設定為100%),計算實驗組的AGEs生成量,結果示於圖9。
由圖9可知,相較於「控制組」,「實驗組」具有較低的AGEs生成量,此說明本發明余甘子萃取發酵物確實可有效抗醣化(抑制蛋白質的醣化反應),可達到抗皮膚老化的效果。
實施例
7
:余甘子萃取發酵物之各級分於抑制脂肪細胞之脂肪形成能力的效果
於本實施例中,所使用的物料及器材如下:
1. 細胞株:OP9(購自ATCC®CRL-2749™)。
2. 前脂肪細胞擴充培養基(Pre-adipocyte Expansion Medium):
90% MEM-α培養基(Minimum Essential Medium Alpha Medium,購自Gibco);
20% 胎牛血清(Fetal Bovine Serum,購自Gibco);
1% 青黴素-鏈黴素(Penicillin-streptomycin,購自Gibco)。
3. 脂肪細胞分化培養基(Differentiation Medium):
90% MEM-α培養基(Minimum Essential Medium Alpha Medium,購自Gibco);
20% 胎牛血清(Fetal Bovine Serum,購自Gibco);
1% 青黴素-鏈黴素(Penicillin-streptomycin,購自Gibco)。
4. 細胞甘油基測定試劑盒(Glycerol cell-based assay kit):購自Cayman。
5. ELISA讀盤機:購自BioTek。
將OP9細胞(8x104
個細胞/孔)接種於24孔培養盤,各孔含有500微升的前脂肪細胞擴充培養基。將前述培養盤置於37˚C下培養7天,在培養期間每3天更新一次培養基,其中,用於更新的培養基為脂肪細胞分化培養基。7天後,以顯微鏡觀察細胞,確認細胞內油滴的形成(表示OP9細胞已分化為脂肪細胞)。
取上述脂肪細胞置於24孔培養盤中,將其分成四組後,分別以如下培養基進行培養(37˚C下,歷時7天,期間每3天更新一次培養基):
1. 「控制組」:脂肪細胞分化培養基(共500微升)。
2. 「EAF組」:含有62.5微克/毫升[製備實施例B-1]所提供之乙酸乙酯可溶部的脂肪細胞分化培養基(共500微升)。
3. 「BUF組」:含有62.5微克/毫升[製備實施例B-1]所提供之正丁醇可溶部的脂肪細胞分化培養基(共500微升)。
4. 「WF組」:含有62.5微克/毫升[製備實施例B-1]所提供之水可溶部的脂肪細胞分化培養基(共500微升)。
為了解本發明余甘子發酵物之各級分(包括乙酸乙酯可溶部、正丁醇可溶部、及水可溶部)於抑制脂肪細胞之脂肪形成能力的效果,係對上述各組所提供之細胞進行以下處理:移除培養基並以1毫升PBS潤洗各孔細胞二次,接著在室溫下以1毫升10%甲醛固定各孔細胞30分鐘。移除甲醛後,以1毫升PBS潤洗各孔細胞二次。於各孔中添加1毫升之60%異丙醇,靜置1分鐘。其後,移除異丙醇,並於各孔中添加1毫升之油紅O染劑以進行染色,歷時1小時。移除油紅O染劑後,於24孔培養盤之各孔中添加100%之異丙醇,並將24孔培養盤置於震盪器培養10分鐘,以將細胞內的染劑溶出。接著,取100微升溶有染劑的異丙醇溶液移入96孔盤中,以ELISA讀盤機測量於波長510奈米下的吸光值,以定量所溶解出的染劑,藉此檢測各組細胞之脂肪含量。最後,以「控制組」的結果為基準,計算其他各組的相對脂肪含量。數據使用Excel軟體進行統計分析,以學生t(student’s t-test)檢驗是否達到統計學上的顯著性。結果示於圖10。
由圖10可知,相較於「控制組」,僅「EAF組」之細胞的脂肪含量顯著降低(降低22.9%)。前述結果顯示,本發明余甘子萃取發酵物之抑制脂肪形成的效果主要是來自乙酸乙酯可溶部(EAF)。
實施例
8
:余甘子萃取發酵物之各級分於促進脂肪細胞的脂肪降解能力的效果
為了解本發明余甘子發酵物之各級分(包括乙酸乙酯可溶部、正丁醇可溶部、及水可溶部)於促進脂肪細胞的脂肪降解的效果,係於實施例7中之各組細胞完成培養後,對各組上清液進行以下處理:自各孔中分別取25微升之細胞培養上清液,分別置於一新的96孔盤中。於各孔添加100微升之重組游離甘油測定試劑(reconstituted Free Glycerol Assay Reagent)後,置於室溫下培養15分鐘。接著,使用ELISA讀盤機,測量540奈米的吸光值。最後,以「控制組」的結果為基準,計算其他各組的相對脂肪分解量,結果示於圖11。數據使用Excel軟體進行統計分析,以學生t(student’s t-test)檢驗是否達到統計學上的顯著性。
由圖11可知,相較於「控制組」,「EAF組」之細胞、及「BUF組」之細胞的脂肪分解量皆顯著提升(分別提升4.0%及5.1%)。前述結果顯示,本發明余甘子萃取發酵物之促進脂肪降解的效果主要是來自乙酸乙酯可溶部(EAF)、以及正丁醇可溶部(BUF)。
實施例
9
:余甘子萃取發酵物之各級分於提升粒線體活性的效果
為本發明余甘子萃取發酵物於提升粒線體活性的效果,本實施例係比照實施例2之方法步驟、物料及器材進行,其中,僅細胞之分組及細胞之處理與實施例2不同。本實施例係將C2C12細胞分成四組,並分別以如下培養基於37˚C下培養24小時,以檢測及計算余甘子發酵物之各級分(包括乙酸乙酯可溶部、正丁醇可溶部、及水可溶部)於提升粒線體活性的效果:
1. 「控制組」:骨骼肌細胞培養基(共2毫升)。
2. 「EAF組」:含有31.25微克/毫升[製備實施例B-1]所提供之乙酸乙酯可溶部的骨骼肌細胞培養基(共2毫升)。
3. 「BUF組」:含有31.25微克/毫升[製備實施例B-1]所提供之正丁醇可溶部的骨骼肌細胞培養基(共2毫升)。
4. 「WF組」:含有31.25微克/毫升[製備實施例B-1]所提供之水可溶部的骨骼肌細胞培養基(共2毫升)。
以「控制組」的結果為基準,計算其他各組的相對粒線體活性。數據使用Excel軟體進行統計分析,以學生t(student’s t-test)檢驗是否達到統計學上的顯著性。結果示於圖12。
由圖12可知,相較於「控制組」,「BUF組」及「WF組」之粒線體活性較低,「EAF組」之細胞的粒線體活性則提升14.9%,此說明本發明余甘子萃取發酵物於提升粒線體活性的效果主要是來自乙酸乙酯可溶部。
上述實施例7至9之結果顯示,本發明余甘子萃取發酵物的乙酸乙酯可溶部具有抑制脂肪形成、促進脂肪降解、提升粒線體活性等效果,故以下實施例將針對分離自乙酸乙酯可溶部的式(I)至式(XIV)化合物的效果進行測試。
實施例
10
:本發明化合物於抑制脂肪細胞之脂肪形成能力的效果
為了解本發明化合物於抑制脂肪形成的效果,本實施例係比照實施例1之方法步驟、物料及器材進行,其中,僅脂肪細胞之分組及處理與實施例1不同。本實施例係將分化自OP9細胞之脂肪細胞分成十五組,並分別以如下培養基進行培養(於37˚C下歷時7天,期間每3天更新一次培養基),以檢測及計算各化合物於抑制脂肪細胞之脂肪形成能力的效果:
1. 控制組:脂肪細胞分化培養基(共500微升)。
2. 實驗組(共十四組):分別含有20微克/毫升[製備實施例B-2]所提供之式(I)至式(XIV)化合物的脂肪細胞分化培養基(共500微升)。
對上述各組所提供之脂肪細胞進行油紅O染色,並以顯微鏡觀察脂肪細胞之油滴狀況並拍照記錄,結果顯示於圖13。此外,以「控制組」的結果為基準,計算其他各組的相對脂肪含量,結果示於圖14。數據使用Excel軟體進行統計分析,以學生t(student’s t-test)檢驗是否達到統計學上的顯著性。
由圖13及圖14可知,相較於「控制組」,經本發明式(I)、式(II)、式(VI)及式(X)至式(XIV)化合物處理之細胞被油紅染劑染色之區域顯著減少、且脂肪含量顯著降低(分別降低55.8%、36.3%、16.2%、12.0%、25.7%、27.9%、22.4%、及23.5%)。前述結果顯示,本發明式(I)、式(II)、式(VI)及式(X)至式(XIV)化合物可有效減少脂肪細胞之脂肪含量,故可用於抑制脂肪細胞之脂肪形成能力、使個體不易形成體脂肪、及促進瘦身。
實施例
11
:本發明化合物於促進脂肪細胞的脂肪降解能力的效果
為了解本發明化合物於促進脂肪細胞的脂肪降解的效果,係於實施例10中之各組細胞完成培養後,對各組上清液進行以下處理:自各孔中分別取25微升之細胞培養上清液,分別置於一新的96孔盤中。於各孔添加100微升之重組游離甘油測定試劑(reconstituted Free Glycerol Assay Reagent)後,置於室溫下培養15分鐘。接著,使用ELISA讀盤機,測量540奈米的吸光值。最後,以「控制組」的結果為基準,計算其他各組的相對脂肪分解量,結果示於圖15。數據使用Excel軟體進行統計分析,以學生t(student’s t-test)檢驗是否達到統計學上的顯著性。
由圖15可知,相較於「控制組」,經本發明式(II)、式(III)及式(VII)化合物處理之脂肪細胞的脂肪分解量係分別提升14.2%、20.4%、及34.5%。前述結果顯示,本發明式(II)、式(III)及式(VII)化合物可有效促進脂肪細胞分解脂肪,故可用於促進脂肪細胞的脂肪降解能力、使個體不易形成體脂肪、及促進瘦身。
實施例
12
:本發明化合物於提升粒線體活性的效果
為了解本發明化合物於提升粒線體活性的效果,本實施例係比照實施例2之方法步驟、物料及器材,其中,僅細胞之分組及細胞之處理與實施例2不同。本實施例係將C2C12細胞分成十五組,並分別以如下培養基於37˚C下培養24小時,以檢測及計算各化合物於提升粒線體活性的效果:
1. 「控制組」:骨骼肌細胞培養基(共2毫升)。
2. 「實驗組」(共十四組):分別含有10微克/毫升[製備實施例B-2]所提供之式(I)至式(XIV)化合物的骨骼肌細胞培養基(共2毫升)。
以「控制組」的結果為基準,計算其他各組的相對粒線體活性。數據使用Excel軟體進行統計分析,以學生t(student’s t-test)檢驗是否達到統計學上的顯著性。結果示於圖16。
由圖16可知,相較於「控制組」,經本發明式(I)、式(IV)、及式(VI)至式(XIV)化合物處理之骨骼肌細胞的粒線體活性係分別提升27.1%、40.5%、53.3%、45.1%、76.8%、27.2%、44.1%、27.2%、57.3%、45.0%、及41.8%。前述結果顯示,本發明式(I)、式(IV)、及式(VI)至式(XIV)化合物可有效提升粒線體活性,可幫助代謝。
實施例
13
:本發明化合物於抑制黑色素生成的效果
為了解本發明化合物於抑制黑色素生成的效果,本實施例係比照實施例3之方法步驟、物料及器材,其中,僅細胞之分組及細胞之處理與實施例3不同。本實施例係將細胞分成十六組,並將各組細胞分別培養於以下培養基中(37˚C下、歷時48小時,其中,控制組細胞於培養過程中不以UVA照射,控制組以外的十五組細胞於培養過程中則皆置於紫外線艙中以10 J/cm2
強度的UVA照射):
1. 「控制組」:黑色素瘤細胞培養基(共3毫升)。
2. 「UVA組」:黑色素瘤細胞培養基(共3毫升)。
3. 「實驗組」(共十四組):分別含有10微克/毫升[製備實施例B-2]所提供之式(I)至式(XIV)化合物的黑色素瘤細胞培養基(共3毫升)。
以「控制組」的結果為基準,計算其他各組的相對黑色素含量。數據使用Excel軟體進行統計分析,以學生t(student’s t-test)檢驗是否達到統計學上的顯著性。結果示於圖17。
由圖17可知,「UVA組」細胞中的黑色素含量明顯高於「控制組」,顯示UVA確實會誘導黑色素生成。另一方面,經本發明式(II)至式(XIV)化合物處理之細胞的黑色素含量皆低於「UVA組」,此顯示本發明式(II)至式(XIV)化合物皆可有效抑制黑色素生成,可用於美白。
實施例
14
:余甘子萃取物發酵前後,本發明化合物的含量變化
取[製備實施例A-1]所提供之余甘子萃取物、以及[製備實施例A-3]所提供之余甘子萃取發酵物,分別配置成濃度為10毫克/毫升之樣品溶液。接著,各取10微升之樣品溶液,並以HPLC對其成分進行分析。其中,HPLC所使用的分析管柱為Mightysil RP-18 GP 250(250 x 10毫米,5微米),偵測波長為250奈米,以1.0毫升/分鐘之流速沖提,沖提液之組成係如下表2所示:
表2:
*A:0.1%甲酸之甲醇溶液;B:0.1%甲酸之水溶液。
時間(分鐘) | 流動相A(%) | 流動相B(%) |
0 | 2 | 98 |
10 | 2 | 98 |
40 | 70 | 30 |
50 | 100 | 0 |
60 | 100 | 0 |
經上述步驟分析所得之HPLC指紋圖譜示於圖18,其中,上方圖係顯示余甘子萃取物的HPLC指紋圖譜、下方圖係顯示余甘子萃取發酵物的HPLC指紋圖譜。由圖18可知,相較於余甘子萃取物,以本發明發酵方法製得之余甘子萃取發酵物具有較高之式(I)及式(II)化合物含量(分別提升25%及31%)。前述結果顯示,本發明製備余甘子萃取發酵物的方法確實可以有效提升余甘子萃取物中活性成分的含量。
如上述實施例所示,本發明余甘子萃取發酵物、以及式(I)至式(XIV)化合物確實可有效抑制脂肪細胞的脂肪形成能力、促進脂肪細胞的脂肪降解能力、提升粒線體活性、抑制黑色素生成、抑制ROS生成、抑制AGEs生成、提升SOD2
基因表現、
提升MPG
基因表現、
及提升ERCC1
基因表現,故可用於使個體不易形成體脂肪、促進瘦身、幫助代謝、美白、及抗肌膚老化。此外,本發明製備余甘子萃取發酵物的方法確實可以有效提升余甘子萃取物中活性成分的含量。
圖1A至圖1N所示分別為式(I)至式(XIV)化合物之NMR圖譜;
圖2所示為於顯微鏡下所拍攝之經油紅O染劑染色的脂肪細胞,包括「控制組」、「萃取物組」、及「發酵物組」的結果,其中「控制組」之脂肪細胞係培養於不含余甘子萃取物及余甘子萃取發酵物之培養基,「萃取物組」之脂肪細胞係培養於含有余甘子萃取物之培養基,「發酵物組」之脂肪細胞則係培養於含有余甘子萃取發酵物之培養基;
圖3所示為以上述「控制組」為基準,上述「萃取物組」及「發酵物組」之脂肪細胞的相對脂肪含量(***表示相較於控制組的p值<0.001);
圖4所示為「控制組」、「萃取物組」、及「發酵物組」之骨骼肌細胞的JC-1聚合體占比,代表各組骨骼肌細胞的粒線體活性,其中「控制組」之骨骼肌細胞係培養於不含余甘子萃取物及余甘子萃取發酵物之培養基,「萃取物組」之骨骼肌細胞係培養於含有余甘子萃取物之培養基,「發酵物組」之骨骼肌細胞則係培養於含有余甘子萃取發酵物之培養基(**係表示相較於控制組的p值<0.01;***係表示相較於控制組的p值<0.001)。;
圖5所示為「控制組」、「UVA組」、「正控制組」、「萃取物組」及「發酵物組」之黑色素瘤細胞的相對黑色素含量,其中「控制組」之黑色素瘤細胞係未照射UVA、且培養於不含余甘子萃取物及余甘子萃取發酵物之培養基,「UVA組」之黑色素瘤細胞係經照射UVA、但培養於不含余甘子萃取物及余甘子萃取發酵物之培養基,「正控制組」之黑色素瘤細胞係經照射UVA、但培養於含有麴酸(kojic acid)之培養基,「萃取物組」之黑色素瘤細胞係經照射UVA、但培養於含有余甘子萃取物之培養基,「發酵物組」之黑色素瘤細胞則係經照射UVA、但培養於含有余甘子萃取發酵物之培養基(**係表示相較於UVA組的p值<0.01;***係表示相較於UVA組的p值<0.001;###係表示相較於控制組的p值<0.001;▲係表示相較於萃取物組的p值<0.05);
圖6所示為「控制組」、「萃取物組」及「發酵物組」之人類皮膚纖維母細胞經UVA照射後的相對SOD2
表現量,其中「控制組」之人類皮膚纖維母細胞係於照射UVA之前先培養於不含余甘子萃取物及余甘子萃取發酵物之培養基,「萃取物組」之人類皮膚纖維母細胞係於照射UVA之前先培養於含有余甘子萃取物之培養基,「發酵物組」之人類皮膚纖維母細胞則係於照射UVA之前先培養於含有余甘子萃取發酵物之培養基(***係表示相較於控制組的p值<0.001);
圖7所示為「控制組」、「萃取物組」及「發酵物組」之人類皮膚纖維母細胞經UVA照射後的相對MPG
及ERCC1
表現量,其中「控制組」之人類皮膚纖維母細胞係於照射UVA之前先培養於不含余甘子萃取物及余甘子萃取發酵物之培養基,「萃取物組」之人類皮膚纖維母細胞係於照射UVA之前先培養於含有余甘子萃取物之培養基,「發酵物組」之人類皮膚纖維母細胞則係於照射UVA之前先培養於含有余甘子萃取發酵物之培養基(***係表示相較於控制組的p值<0.001);
圖8所示為「萃取物組」及「發酵物組」之人類皮膚纖維母細胞的相對ROS含量,其中「萃取物組」用於培養人類皮膚纖維母細胞之培養基係含有余甘子萃取物,「發酵物組」用於培養人類皮膚纖維母細胞之培養基則含有余甘子萃取發酵物(*係表示相較於萃取物組的p值<0.05);
圖9所示為「控制組」及「實驗組」之相對AGEs(最終醣化終產物)生成量,其中「控制組」之反應溶液係不含余甘子萃取發酵物,「實驗組」之反應溶液則含有余甘子萃取發酵物;
圖10所示為「控制組」、「EAF組」、「BUF組」及「WF組」之脂肪細胞的相對脂肪含量,其中「控制組」之脂肪細胞係培養於不含余甘子萃取發酵物、EAF、BUF及WF級分之培養基,「EAF組」之脂肪細胞係培養於含有余甘子萃取發酵物之乙酸乙酯可溶部的培養基,「BUF組」之脂肪細胞係培養於含有余甘子萃取發酵物之正丁醇可溶部的培養基,「WF組」之脂肪細胞則係培養於含有余甘子萃取發酵物之水可溶部的培養基(***係表示相較於控制組的p值<0.001);
圖11所示為上述「控制組」、「發酵物組」、「EAF組」、「BUF組」及「WF組」之脂肪細胞的相對脂肪分解量(*係表示相較於控制組的p值<0.05);
圖12所示為「控制組」、「EAF組」、「BUF組」及「WF組」之骨骼肌細胞的相對骨骼肌粒線體活性,其中「控制組」之骨骼肌細胞係培養於不含余甘子萃取發酵物、EAF、BUF及WF級分之培養基,「EAF組」之骨骼肌細胞係培養於含有余甘子萃取發酵物之乙酸乙酯可溶部的培養基,「BUF組」之骨骼肌細胞係培養於含有余甘子萃取發酵物之正丁醇可溶部的培養基,「WF組」之骨骼肌細胞則係培養於含有余甘子萃取發酵物之水可溶部的培養基(*係表示相較於控制組的p值<0.05);
圖13所示為於顯微鏡下所拍攝之經油紅O染劑染色的脂肪細胞,包括「控制組」及「實驗組」的結果,其中「控制組」之脂肪細胞係培養於不含本發明化合物之培養基,「實驗組」之脂肪細胞則係分別培養於含有式(I)、式(II)、式(VI)及式(X)至式(XIV)化合物之培養基;
圖14所示為以「控制組」為基準,「實驗組」之脂肪細胞的相對脂肪含量,其中「控制組」之脂肪細胞係培養於不含本發明化合物之培養基,「實驗組」之脂肪細胞則係分別培養於含有式(I)、式(II)、式(VI)及式(X)至式(XIV)化合物之培養基(*係表示相較於控制組的p值<0.05;**係表示相較於控制組的p值<0.01;***係表示相較於控制組的p值<0.001);
圖15所示為「控制組」及「實驗組」之脂肪細胞的相對脂肪分解量,其中「控制組」之脂肪細胞係培養於不含本發明化合物之培養基,「實驗組」之脂肪細胞則係分別培養於含有式(II)、式(III)及式(VII)化合物之培養基(*係表示相較於控制組的p值<0.05;**係表示相較於控制組的p值<0.01);
圖16所示為「控制組」及「實驗組」之骨骼肌細胞的相對骨骼肌粒線體活性,其中「控制組」之骨骼肌細胞係培養於不含本發明化合物的培養基,「實驗組」之骨骼肌細胞則係分別培養於含有式(I)、式(IV)、及式(VI)至式(XIV)化合物之培養基(**係表示相較於控制組的p值<0.01;***係表示相較於控制組的p值<0.001);
圖17所示為「控制組」、「UVA組」及「實驗組」之黑色素瘤細胞的相對黑色素含量,其中「控制組」之黑色素瘤細胞係未經照射UVA,且係培養於不含本發明化合物之培養基,「UVA組」之黑色素瘤細胞係經照射UVA,且係培養於不含本發明化合物之培養基,「實驗組」之黑色素瘤細胞則係經照射UVA,且係分別培養於含有式(II)至式(XIV)化合物之培養基(*係表示相較於控制組的p值<0.05;**係表示相較於控制組的p值<0.01;***係表示相較於控制組的p值<0.001);
圖18所示為「余甘子萃取物」及「余甘子萃取發酵物」的HPLC指紋圖譜,其中,上方圖係顯示余甘子萃取物的結果、下方圖係顯示余甘子萃取發酵物的結果。
Claims (10)
- 一種製備余甘子萃取發酵物的方法,其係包含以下步驟: (a) 萃取余甘子以提供一余甘子萃取物; (b) 使用一釀酒酵母菌與一胚芽乳酸桿菌發酵該萃取物,以獲得一中間發酵物;以及 (c) 使用一醋酸菌發酵該中間發酵物,以獲得一余甘子萃取發酵物。
- 如請求項1之方法,其中該釀酒酵母菌係釀酒酵母菌BCRC 20271。
- 如請求項1之方法,其中該胚芽乳酸桿菌係胚芽乳酸桿菌BCRC 910760。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中該醋酸菌係醋酸菌BCRC 11688。
- 一種組成物,其係包含一余甘子萃取發酵物,該余甘子萃取發酵物係由如請求項1至4中任一項之方法所提供者。
- 如請求項5之組成物,其係一醫藥組成物、食品組成物或保養品組成物。
- 如請求項8之用途,其中該活性成分係以食品組成物或保養品組成物的形式使用。
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