CN107303290B - 芳香环丙基胺类化合物的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种芳香环丙基胺类化合物的新用途。本发明提供一种芳香环丙基胺类化合物的用途，作为有效成分用于制备防治周围神经性病变的药物。本发明以感音神经性聋中的耳蜗螺旋神经元的损伤保护为例，以小鼠为模式动物，建立耳蜗螺旋神经元体外损伤及保护研究的动物模型，结果表明体外给予芳香环丙基胺类化合物，能明显上调二甲基化的组蛋白H3K4表达水平，显著降低耳蜗螺旋神经元Cleaved Caspase‑3表达，表明芳香环丙基胺类化合物对周围神经细胞特别是感音神经性聋患者耳蜗螺旋神经元具有保护作用。本发明为寻找、防治周围神经性病变的防治提供了理论基础和新的途径，具有临床应用价值。

Description

芳香环丙基胺类化合物的新用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种芳香环丙基胺类化合物的新用途，具体涉及芳香环丙基胺类化合物用于制备预防和/或治疗周围神经性病变的药物的用途。

背景技术

周围神经可根据连于中枢的部位不同分为连于脑的脑神经和连于脊髓的脊神经。周围神经的损伤和破坏可以导致多种疾病发生，这些疾病统称为周围神经性病变。脑神经疾病有多种，其中常见的包括：三叉神经痛、特发性面神经麻痹、面肌痉挛、多发性脑神经损害、感音神经性聋等；而常见的脊神经疾病包括：单神经病及神经痛、多发性神经病、急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病等。听神经(前庭神经)，即螺旋神经节神经元之所在，属于周围神经中的脑神经。感音神经性聋是耳鼻咽喉科的常见病和多发病，近年来发病呈上升趋势，它不仅给患者及其家庭带来生理上和心理上的痛苦，而且给社会和经济发展造成严重影响。我国卫生部2000年公布的调查结果显示，感音神经性聋约占耳聋患者的63％，绝对数量超过8千万。感音神经性聋是一个医学难题，其病变基础之一即螺旋神经元的损伤所导致的听功能下降或丧失(Lee,J.E.,et al.2003.A novelmodel for rapid induction of apoptosis in spiral ganglions ofmice.Laryngoscope 113,994-999)。螺旋神经元的存活状态和数量决定着听力功能的维持水平。因此，早期的螺旋神经元保护策略在感音神经性聋的防治工作中尤为重要。

近年来表观遗传学调控在胚胎发育、细胞周期、肿瘤发生等过程中的调控机制逐渐被人们所认识和关注。目前认为，组蛋白甲基化异常与肿瘤的发生、发展、预后有着密切的关系。研究发现，二甲基化的组蛋白H3K4在机体分布广泛，它对于基因的转录和沉默基因的激活具有重要作用。LSD1(lysine-specific demethylase1，LSD1)是最早发现的组蛋白去甲基化酶(Shi,Y.,et al.2004.Histone demethylation mediated by the nuclearamine oxidase homolog LSD1.Cell119,941-953)。它可以特异地抑制组蛋白H3K4的二甲基化水平。作为LSD1特异性抑制剂，S2101和CBB1007等小分子药物具有特异性高、能够通过血脑屏障等优点，其在抑制肿瘤发生及精神类疾病领域的调控机制逐渐被人们所认识和关注(Wang,J.,et al.2011.Novel histone demethylase LSD1inhibitors selectivelytarget cancer cells with pluripotent stem cell properties.Cancer research 71,7238-7249)。同时其对内耳毛细胞及螺旋神经元的保护作用及机制也于近期被证实(He,Y.,et al.2015.Inhibition of H3K4me2Demethylation Protects Auditory Hair Cellsfrom Neomycin-Induced Apoptosis.Molecular neurobiology 52,196-205；Li,A.,He,Y.,Sun,S.,Cai,C.&Li,H.2015.Lysine-specific demethylase 1inhibitors protectcochlear spiral ganglion neurons against cisplatin-induced damage.NeuroReport26,539-547)。

但是关于芳香环丙基胺类化合物在周围神经性病变中神经细胞的保护作用仍然未知。因此，仍需要探索预防和治疗周围神经性病变方面的药物化合物。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供芳香环丙基胺类化合物的新用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明的第一方面提供一种芳香环丙基胺类化合物的用途，作为有效成分用于制备防治周围神经性病变的药物。

优选地，所述周围神经性病变选自感音神经性聋、听神经病、三叉神经痛、面瘫、神经炎、急性感染性多发性神经根神经炎、臂丛神经损伤、尺神经损伤、桡神经损伤、正中神经损伤、胫神经损伤、腓总神经损伤、股外侧皮神经炎、坐骨神经痛、肋间神经痛等中的任意一种。

更优选地，所述周围神经性病变为感音神经性聋。

所述感音神经性聋是由于周围神经损伤所引发的病变。所述感音神经性聋是指周围神经受到损伤或退变所导致的听力下降。所述感音神经性聋中的所述周围神经为属于12对脑神经之一的听神经(前庭神经)的耳蜗螺旋神经元。

所述防治是指预防和/或治疗。

优选地，所述芳香环丙基胺类化合物能够起到保护周围神经性病变患者的神经细胞的作用。

更优选地，所述芳香环丙基胺类化合物能够起到保护感音神经性聋患者的周围神经细胞的作用。

进一步优选地，所述芳香环丙基胺类化合物能够起到保护感音神经性聋患者的耳蜗螺旋神经元的作用。

优选地，所述芳香环丙基胺类化合物能够起到保护感音神经性聋患者听力的作用。

优选地，所述感音神经性聋为氨基糖苷类药物致感音神经性聋。所述氨基糖苷类药物在临床上可以通过损伤耳蜗螺旋神经元使得细胞凋亡或退变，从而导致感音神经性聋的发生。

更优选地，所述氨基糖苷类药物为庆大霉素。

优选地，所述芳香环丙基胺类化合物用于提高周围神经中的二甲基化的组蛋白H3K4表达水平。

更优选地，所述芳香环丙基胺类化合物用于提高耳蜗螺旋神经元中的二甲基化的组蛋白H3K4表达水平。所述耳蜗螺旋神经元是指具有双极神经元的胞体，在蜗轴内聚集成蜗神经节(蜗螺旋神经节)，其周围突分布至内耳螺旋器上的毛细胞，中枢突组成蜗神经，经内耳门入颅腔，于脑桥延髓沟人脑，终于脑干蜗神经前、后核。

进一步地，所述二甲基化的组蛋白H3K4是指组蛋白修饰的一种类型，即组蛋白3第4位赖氨酸的二甲基化，是一种甲基化转录信号。

优选地，所述芳香环丙基胺类化合物用于降低周围神经中凋亡标志物CleavedCaspase-3表达水平。

更优选地，所述芳香环丙基胺类化合物用于降低耳蜗螺旋神经节神经元中凋亡标志物Cleaved Caspase-3表达水平。

进一步地，所述凋亡标志物Cleaved Caspase-3是Caspase3的活化形式。所述Caspase3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。

根据本发明，所述防治周围神经性病变是指提高周围神经中的二甲基化的组蛋白H3K4表达水平和/或降低周围神经中凋亡标志物Cleaved Caspase-3表达水平，从而达到防治周围神经性病变的目的。

其中，所述防治感音神经性聋是指提高耳蜗螺旋神经元中的二甲基化的组蛋白H3K4表达水平和/或降低耳蜗螺旋神经元中凋亡标志物Cleaved Caspase-3表达水平，从而达到防治感音神经性聋的目的。

根据本发明，所述保护感音神经性聋患者听力是指提高耳蜗螺旋神经元中的二甲基化的组蛋白H3K4表达水平和/或降低耳蜗螺旋神经元凋亡标志物Cleaved Caspase-3表达水平，从而达到保护感音神经性聋患者听力的目的。

优选地，所述用途为芳香环丙基胺类化合物作为有效成分之一或唯一有效成分用于制备防治周围神经性病变的药物中的用途。

更优选地，所述用途为芳香环丙基胺类化合物作为有效成分之一或唯一有效成分用于制备防治感音神经性聋的药物中的用途。

本发明的第二方面提供一种芳香环丙基胺类化合物的用途，作为有效成分用于制备提高周围神经中的二甲基化的组蛋白H3K4表达水平的化学产品。

优选地，所述芳香环丙基胺类化合物的用途，作为有效成分用于制备提高耳蜗螺旋神经元中的二甲基化的组蛋白H3K4表达水平的化学产品。

更优选地，所述芳香环丙基胺类化合物的用途为在制备提高耳蜗螺旋神经元中的二甲基化的组蛋白H3K4表达水平的药物中的用途。

本发明的第三方面提供一种芳香环丙基胺类化合物的用途，作为有效成分用于制备降低周围神经中凋亡标志物Cleaved Caspase-3表达水平的化学产品。

优选地，所述芳香环丙基胺类化合物的用途，作为有效成分用于制备降低耳蜗螺旋神经元中凋亡标志物Cleaved Caspase-3表达水平的化学产品。

更优选地，所述芳香环丙基胺类化合物的用途为在制备降低耳蜗螺旋神经元中凋亡标志物Cleaved Caspase-3表达水平的药物中的用途。

所述化学产品必然包含芳香环丙基胺类化合物，并以芳香环丙基胺类化合物作为前述功用的有效成分。所述化学产品中，发挥前述功用的有效成分可仅为芳香环丙基胺类化合物，亦可包含其他可起到类似功用的化学品。所述化学产品可以为单成分物质，亦可为多成分物质。所述化学产品的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。所述化学产品所使用的领域可以为药品领域、保健品领域、食品领域等。

优选地，所述芳香环丙基胺类化合物为化学结构式如式(I)所示的化合物及其药学上可接受的盐为：

其中：

R1、R2、R3和R4选自氢、C1-C6烷基或卤素中的任意一种；

R₅选自直链或支链的C_1-10烃基、C_3-10环烃基、C_6-20芳基或C_6-20苄基中的任意一种。

更优选地，所述R₅为直链或支链的C_1-10的烃基，在一些实施例中，所述R₅为直链或支链的C_1-6的烃基。

所述药学上可接受的盐是如式(I)所示的化合物与盐酸、氢溴酸、硫酸、甲磺酸、甲酸、乙酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、扁桃酸、富马酸、乳酸或柠檬酸形成的那些盐中的任意一种。

更优选地，所述芳香环丙基胺类化合物选自化学结构式为A、B、C、D、E、F、G或H的化合物中的任意一种。

进一步优选地，所述芳香环丙基胺类化合物选自化学结构式为A、B的化合物中的任意一种。

所述化学结构式为A的化合物为：

所述化学结构式为B的化合物为：

所述化学结构式为C的化合物为：

所述化学结构式为D的化合物为：

所述化学结构式为E的化合物为：

所述化学结构式为F的化合物为：

所述化学结构式为G的化合物为：

所述化学结构式为H的化合物为：

上述化学结构式为A、B、C、D、E、F、G或H的化合物均为易溶于纯水的白色粉末。

本发明的第四方面提供一种药物，含有治疗有效量的前述芳香环丙基胺类化合物。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体。

术语含有”X”的组合物可以完全由X构成，或者可以含有X之外的物质，例如X-Y。本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果例如可通过化学标记或抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减轻。对于某一对象的精确有效剂量取决于该对象的体型和健康状况，病症的性质或程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的症状而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。“药学上可接受的载体”是用于将本发明的芳香环丙基胺类化合物传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。

药学上可接受的载体为各种药学上常用的辅料和/或赋形剂，包括(但不限于)糖类(如乳糖、葡萄糖和蔗糖)，淀粉(如玉米淀粉和土豆淀粉)，纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素)，黄蓍胶粉末，麦芽，明胶，滑石，固体润滑剂(如硬脂酸和硬脂酸镁)，硫酸钙，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油，多元醇(如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇)，海藻酸，乳化剂(如Tween、聚氧乙烯蓖麻油)，润湿剂(如月桂基硫酸钠)，着色剂，调味剂，压片剂、稳定剂，抗氧化剂，防腐剂，无热原水，等渗盐溶液和磷酸盐缓冲液等；该载体可根据需要提高配方的稳定性、活性及生物有效性等。

本发明药物使用时，所述芳香环丙基胺类化合物作为唯一有效成分，或者所述芳香环丙基胺类化合物作为有效成分之一，可与一种或多种药学上可接受的载体混合制成不同给药途径的药物剂型。所述芳香环丙基胺类化合物可以通过市购途径获得。

优选地，所述药物的形式为片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、口服液、醑剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、注射剂、注射用无菌粉末，或者栓剂。上述药物的制剂类型可以按照药剂学(第六版，人民卫生出版社，崔福德)中的相关定义理解，上述药物的制备可以按照药剂学(第六版，人民卫生出版社，崔福德)中的相关制剂的方法配制。

优选地，本发明所述药物可经过口服、静脉内、肌内或皮下途径给药。

如上所述，本发明的芳香环丙基胺类化合物的新用途，涉及其在制备防治周围神经性病变特别是感音神经性聋的药物中的用途，以涉及在制备防治氨基糖苷类药物致感音神经性聋的药物中的用途为例，从而保护周围神经性病变患者的神经细胞及感音神经性聋患者听力。

本发明以周围神经性病变中临床常见的感音神经性聋为例，从新的研究领域——表观遗传学入手，以小鼠为模式动物，建立耳蜗螺旋神经元体外损伤及保护研究的动物模型，结果表明体外给予芳香环丙基胺类化合物，能明显上调二甲基化的组蛋白H3K4表达水平，显著降低耳蜗螺旋神经元Cleaved Caspase-3表达，减轻耳蜗螺旋神经元损伤，实现耳蜗螺旋神经元保护的目的，为临床工作中感音神经性聋防治进而为周围神经性病变防治提供新的途径，为寻找预防感音神经性聋及周围神经性病变提供了依据；也为进一步分析芳香环丙基胺类化合物在抑制螺旋神经元凋亡的作用机制奠定了基础，具有临床应用价值。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示为庆大霉素体外损伤小鼠螺旋神经元模型的建立及芳香环丙基胺类化合物对庆大霉素致小鼠螺旋神经元的体外保护作用图1A、1B、1C。

图1A中a1-a4分别是正常耳蜗螺旋神经元体外培养组、庆大霉素损伤组、A处理组和B处理组的神经纤维存活情况。图中神经纤维是小鼠耳蜗螺旋神经元中圈的典型图片。图1A中b1-b4分别是正常耳蜗螺旋神经元体外培养组、庆大霉素损伤48小时组、A处理组和B处理组的神经细胞胞体存活情况。图中神经细胞胞体是小鼠耳蜗螺旋神经元中圈的典型图片。其中绿色代表神经纤维和神经细胞胞体。

图1B进行神经胞体计数，图1B示实验组(A处理组和B处理组)明显多于对照组(庆大霉素损伤组)。每组标本数n＝12.*P<0.05。Scale bar＝25μm。

图1C进行神经细胞纤维计数，图1C示实验组(A处理组和B处理组)明显多于对照组(庆大霉素损伤组)。每组标本数n＝12.*P<0.05。Scale bar＝25μm。

图2显示为芳香环丙基胺类化合物抑制螺旋神经元损伤过程中二甲基化的组蛋白H3K4表达水平下调图2A、2B、2C。

图2A中，a1-a4：正常耳蜗螺旋神经元中二甲基化的组蛋白H3K4的免疫荧光强度。b1-b4：庆大霉素损伤12小时二甲基化的组蛋白H3K4的免疫荧光强度变化。庆大霉素处理后螺旋神经元H3K4me2荧光强度明显降低。c1-c4，d1-d4分别代表A处理组和B处理组二甲基化的组蛋白H3K4的免疫荧光强度变化。A、B化合物处理后H3K4me2荧光强度加强。其中绿色代表H3K4me2，红色代表TUJ1标记的螺旋神经元，蓝色代表DAPI标记的细胞核。Scale bar＝25μm。

图2B中，正常组、庆大霉素损伤组、A处理组和B处理组H3K4me2表达的Westernblotting结果图。

图2C中，正常组、庆大霉素损伤组、A处理组和B处理组H3K4me2表达的灰度分析结果(柱状图)。*P<0.05。

图3显示为芳香环丙基胺类化合物致螺旋神经节神经元中凋亡标记物CleavedCaspase-3表达下调图3A、3B。

图3A中，正常组、庆大霉素损伤组、A处理组和B处理组Cleaved Caspase-3蛋白表达的Western blotting结果图。

图3B中，正常组、庆大霉素损伤组、A处理组和B处理组Cleaved Caspase-3表达的灰度分析结果(柱状图)。*P<0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

本发明以小鼠为模式动物，利用氨基糖苷类药物损伤体外培养的小鼠耳蜗毛螺旋神经元，建立体外耳蜗螺旋神经元损伤及保护研究的体外动物损伤模型，定量研究芳香环丙基胺类化合物能够有效的降低耳蜗螺旋神经元Cleaved Caspase-3表达，从而抑制螺旋神经元凋亡，实现对细胞的保护，从而为感音神经性聋的听力保护及周围神经性病变的神经细胞保护提供临床应用理论基础。

首先建立小鼠螺旋神经元药物损伤模型，体外应用芳香环丙基胺类化合物促使H3K4me2水平上调，利用免疫荧光化学技术和蛋白质免疫印迹实验(Western blot)证实小鼠内耳H3K4二甲基化及凋亡标志物Cleaved Caspase-3表达水平；利用免疫荧光化学和耳蜗螺旋神经元计数的方法对耳蜗存活螺旋神经元进行定量研究；结果表明，通过自身对照比较，芳香环丙基胺类化合物促使二甲基化的组蛋白H3K4表达水平明显上调，CleavedCaspase-3表达明显下调，凋亡活动明显减少，耳蜗螺旋神经元数量明显多于庆大霉素单独损伤组，差异具有统计学意义。因此证实芳香环丙基胺类化合物可减轻神经细胞损伤，达到细胞保护的目的，从而为感音神经性聋及周围神经性病变的防治提供实验和理论基础。

本发明以下实施例中所采用的实验动物和材料，其中：

本研究采用的C57BL/6J小鼠购自中国科学院上海实验动物中心；啮齿类动物普通饲料(复旦大学实验动物部)。蛋白提取试剂盒(AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit)购于德国QIAGEN公司；庆大霉素均购于Sigma-Aldrich公司；化合物A、B、C、D、E、F、G或H来源于龙翔生物公司(溶于纯水，储存浓度为20mM)；H3K4me2抗体购于Abcam公司；Cleaved caspase-3抗体购于Cell Signaling Technology公司；TUJ1抗体购于Invitrogen公司。

磷酸缓冲盐溶液(PBS)、缓冲液Buffer APP、缓冲液buffer ALO、DAPI、DMEM/F12培养液、巯基乙醇、无水乙醇、甲醇、甘氨酸(Glycine)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、BCA蛋白浓度测定试剂盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、脱脂奶粉、化学发光试剂(ECL)等均购自Invitrogen公司。

下述实施例中所述正常组为未经氨基糖苷类药物损伤处理的动物模型。所述对照组(即损伤组)为未添加芳香环丙基胺类化合物的经氨基糖苷类药物损伤处理的动物模型。处理组为添加芳香环丙基胺类化合物的经氨基糖苷类药物损伤处理的动物模型。

实施例1

建立小鼠耳蜗螺旋神经元体外损伤模型。选取中圈耳蜗螺旋神经元组织，庆大霉素损伤48小时，然后洗脱12小时后就能在体外培养的螺旋神经元检测到神经细胞的缺失。本发明选用庆大霉素损伤模型来进一步研究螺旋神经元损伤和保护。

首先将新生小鼠耳蜗听觉上皮进行分离，小心剪下组织中圈，贴壁4小时，标本贴壁后，加入实验组(化合物A、B、C、D、E、F、G或H处理组)或对照组药物的无血清DMEM/F12培养液共培养24小时，再加入含1mM庆大霉素的无血清DMEM/F12培养液共培养48小时。最后加入无血清培养液共培养12小时，观察芳香环丙基胺类化合物对庆大霉素致小鼠螺旋神经元的体外保护作用。其中，与对照组相比，A处理组和B处理组的神经细胞胞体存活情况见图1A、1B、1C。

由图1A、1B、1C可知，从免疫荧光染色结果提示，化合物A处理组和B处理组螺旋神经元数量明显多于对照组，图示结果以中圈为例。计数结果也表明化合物A处理组和B处理组的螺旋神经元存活情况明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05，two-wayANOVA)。同理，化合物C、D、E、F、G或H处理组的螺旋神经元存活情况也明显高于相应的对照组。

实施例2

二甲基化的组蛋白H3K4表达水平检测。按照体外培养方案进行小鼠耳蜗螺旋神经元培养。取对照组、化合物A、B、C、D、E、F、G或H处理组处理耳蜗螺旋神经元，对其用庆大霉素损伤处理24小时，采用免疫荧光染色检测组蛋白表达水平，并采用蛋白质免疫印迹实验(Western blot)进行半定量检测。其中，与对照组相比，化合物A、化合物B处理组的处理情况见图2A、2B、2C。

由图2A、2B、2C可知，正常组螺旋神经元组蛋白H3K4me2有一定强度表达，庆大霉素损伤后螺旋神经元中H3K4me2表达强度明显下调。为了半定量验证庆大霉素损伤对H3K4me2表达的影响，Western blot及灰度分析结果发现，对照组组蛋白H3K4me2(17kDa)表达强度明显减弱，差异具有明显统计学意义(P<0.05)。

由图2A、2B、2C可知，和对照组相比，化合物A和B处理后螺旋神经元H3K4me2荧光强度明显增强。为了半定量验证化合物A和B处理对H3K4me2表达的影响，Western blot结果及其灰度分析发现化合物A和B处理后螺旋神经元中组蛋白H3K4me2(17kDa)表达强度明显上调，差异具有明显统计学意义(P<0.05)。同理，在化合物C、D、E、F、G或H处理后螺旋神经元中组蛋白H3K4me2(17kDa)表达强度明显上调。

实施例3

螺旋神经元凋亡检测。按照体外培养方案进行小鼠耳蜗螺旋神经元培养，分别取损伤组、化合物A、B、C、D、E、F、G或H处理组处理耳蜗基底膜或螺旋神经元，庆大霉素损伤24小时后，采用Western blot进行半定量检测Cleaved Caspase-3表达水平。

具体步骤如下(Western blot定量检测Cleaved Caspase-3表达)：(图3A、3B)；

①总蛋白提取(AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit,QIAGEN,Hilden,Germany)

a.每组12个基底膜或12个螺旋神经元组织，用超声匀浆器在冰上将组织充分研磨(350μl RLT+3.5μlβ巯基乙醇)，4℃，1200rpm，离心3min。

b.上清液加入Allprep DNA spin column收集管(紫色柱子)中。10000rpm离心30s。

c.滤过液加入250ml无水乙醇，充分混匀，加入到RNeasy spin column中，10000rpm离心15s。

d.滤过液中加入常规缓冲液Buffer APP 600μl。用力混匀，室温中静置10min，以使蛋白沉淀。10000rpm离心10min。丢弃上清液。

e.在蛋白颗粒中加入500μl 70％的乙醇，最大速度离心1min，移除上清液。室温放置5至10min。

f.加入100μl常规缓冲液buffer ALO，充分混匀溶解。

g.95℃加热5min以使蛋白完全溶解及变性。随后冷却样本。最大速度离心1min。取上层-20℃保存。

h.用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。

②蛋白质免疫印迹实验

a.制备分离胶和浓缩胶。

b.调整蛋白浓度，加入上样PBS缓冲液，100℃水浴5min；将蛋白质用微量加样器在加样孔内加样。

c.盖好保护罩，接通电源，以80V的电压电泳至溴酚蓝前沿进入分离胶后，提高电压为110V，直至溴酚蓝电泳至胶底。

d.电泳结束后，切下目的蛋白所处凝胶区域，将其用转膜缓冲液(2.9g Glycine+5.8g Tris+800ml H₂O+200ml甲醇)漂洗；按“三明治法”装好转膜装置，100V，2h。

f.转膜后取下PVDF膜，在盛有封闭液(5％脱脂奶粉)的玻璃皿中室温平缓摇动1-2h。

g.用封闭液将兔抗一抗1：1500稀释成1.5ml，加入塑料袋，放入PVDF膜，赶走气泡，用封口机封口，4℃过夜。二抗(1:2000)室温孵育1h，PBS漂洗4×15min；

h.将PVDF在事先混合好的ECL试剂中孵育5min，然后将PVDF膜置于显色暗盒，进入暗室用X光胶片曝光、显影，调节显、定影时间以使显影效果最佳。其中，与损伤组相比，化合物A、化合物B处理组的处理情况见图3A、3B。

由图3A、3B可知，Western blot及灰度分析结果显示，实验组(化合物A-庆大霉素处理组和化合物B-庆大霉素处理组)和对照组(庆大霉素单独处理)均有Cleaved Caspase-3表达，对照组高于实验组，差异有统计学意义(P<0.05)。小鼠螺旋神经元损伤后，CleavedCaspase-3表达显著升高，并且在化合物A和化合物B处理后Cleaved Caspase-3表达显著降低，表明芳香环丙基胺类化合物对耳蜗螺旋神经元的保护作用可能通过Capase-3经典内源性凋亡通路来实现的。同理，在化合物C、D、E、F、G或H处理后Cleaved Caspase-3表达显著降低，表明芳香环丙基胺类化合物对耳蜗螺旋神经元的保护作用可能通过Capase-3经典内源性凋亡通路来实现的。

综上所述，本发明提供一种芳香环丙基胺类化合物的用途，作为有效成分用于制备防治周围神经性病变的药物。本发明以感音神经性聋中的耳蜗螺旋神经元的损伤保护为例，以小鼠为模式动物，建立耳蜗螺旋神经元体外损伤及保护研究的动物模型，结果表明体外给予芳香环丙基胺类化合物，能明显上调二甲基化的组蛋白H3K4表达水平，显著降低耳蜗螺旋神经元Cleaved Caspase-3表达，表明芳香环丙基胺类化合物对周围神经细胞特别是感音神经性聋患者耳蜗螺旋神经元具有保护作用。本发明为寻找、防治周围神经性病变的防治提供了理论基础和新的途径，具有临床应用价值。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (3)

1.一种芳香环丙基胺类化合物在制备防治感音神经性聋的药物中的用途；

所述芳香环丙基胺类化合物选自化学结构式为A或B的化合物中的任意一种；

其中，所述化学结构式为A的化合物为：

所述化学结构式为B的化合物为：

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述芳香环丙基胺类化合物用于提高感音神经性聋的周围神经中的二甲基化的组蛋白H3K4表达水平。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述芳香环丙基胺类化合物用于降低感音神经性聋的周围神经中凋亡标志物Cleaved Caspase-3表达水平。

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