CN112076193B - 甲氧喹酸在制备用于治疗和/或预防以t-型钙通道为治疗靶点的疾病的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甲氧喹酸在制备用于治疗和/或预防以T‑型钙通道为治疗靶点的疾病的药物中的应用。本发明公开了甲氧喹酸的新用途，为开发用于治疗和/或预防以T‑型钙通道为治疗靶点的疾病的药物提供了新的理论和技术支撑，在临床治疗领域具有广泛的应用前景。

Description

甲氧喹酸在制备用于治疗和/或预防以T-型钙通道为治疗靶 点的疾病的药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种甲氧喹酸在制备用于治疗和/或预防以T-型钙通道为治疗靶点的疾病的药物中的应用。
背景技术
离子通道是位于生物膜上的一类可以快速通透离子的蛋白，在感觉信号传导、心脏搏动、平滑肌蠕动和激素分泌等过程中具有重要作用。离子通道特定位点的突变将导致通道功能发生异常，引起细胞功能紊乱，最终导致疾病的发生。而某些疾病又可使离子通道功能、结构发生改变，产生离子通道代偿性疾病如神经病理性疼痛等。
钙离子通道是体内分布最为广泛、数量最多的离子通道。其中，电压门控型钙离子通道非常重要，可分为L-、P/Q-、N-、R-和T-型。T-型钙通道为低电压门控型钙通道，又称Cav3钙通道，包括Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3亚型。T-型钙通道的激活阈值较低、失活速度较快，在静息状态下的神经元兴奋调节中起重要作用，成为药物作用和研发的一个重要靶标。T-型钙通道的三个亚型结构相似，但在电流特征、分布以及生理功能上具有不同特征(Catterall WA等，Pharmacol Rev，2005，57，411-425)，这些不同特征决定了T-型钙通道作为药物靶点具有多样性。
一方面，T-型钙通道可作为疼痛治疗的药物靶点，主要包括以下证据和优势：首先，神经T-型钙通道尤其是Cav3.2亚型在整个疼痛感觉传导和感受通路都有表达和分布，影响感觉的传导(Zamponi，GW等，Brain Res Rev，2009，60，84-89)。对神经T-型钙通道Cav3.2亚型进行基因敲减或基因敲除，会导致动物对伤害性刺激感觉敏感性降低(Bourinet E等，Pain，2016，157，15-22)。其次，遗传或药理学抑制神经Cav3电流会抑制神经元兴奋性，而增强神经Cav3电流则会增加动作电位发放。以上结果表明，Cav3通道尤其是Cav3.2亚型在疼痛，特别是神经病理性疼痛及炎症痛中发挥重要的生理作用。
另一方面，T-型钙通道还可作为心律失常等疾病治疗的药物靶点(Mesirca P等，Front Physiol，2015，6，19)，分布于心脏浦肯野纤维细胞、窦房结和潜在起搏细胞上的Cav3.1亚型，能够影响膜电位水平、触发细胞内局部钙释放、激活内向钠钙交换电流、控制心脏电信号传导和心脏起搏。研究发现心房起搏细胞上T-型钙通道介导的电流在维持起搏细胞的复极、动作电位始动和窦房结自律性等方面发挥重要的生理意义。
另一方面，T-型钙通道(主要是Cav3.1和Cav3.2亚型)还可作为癫痫等神经精神兴奋性异常疾病治疗的药物靶点(Zamponi GW等，Pflugers Arch，2010，460，395-403)，研究发现Cav3.2亚型基因变异可以使T-型钙通道电流增加，诱导神经元兴奋，导致癫痫发作(Peloquin JB等，Epilepsia，2006，47，655-658)。在WAG/Rij癫痫鼠模型中应用选择性T-型钙通道阻滞剂可以有效控制癫痫发作。
另一方面，T-型钙通道还可作为神经胶质瘤治疗的药物靶点，神经胶质瘤细胞中大量异常高表达Cav3.1亚型(Latour I等，2004，Glia，48,112-119)。研究表明，Cav3通道尤其是Cav3.1亚型对肿瘤，特别是神经胶质瘤的生长、迁移和分化过程具有重要的调节作用，抑制T-型钙通道可显著抑制神经胶质瘤的生长。
甲氧喹酸(Miloxacin)，也称作米洛沙星，属于第二代喹诺酮类药物，广泛用作临床杀菌药物。其化学名为4-二氢-1-乙基-6,7-亚甲氧基-4-喹啉酮-3-羧酸，分子式为C12H9NO6，分子量为263.2，化学结构式如下：
Figure BDA0002722639340000021
甲氧喹酸是一种广泛用作治疗细菌感染的强有效的广谱抗菌药物。先前研究表明，甲氧喹酸可通过抑制细菌DNA回旋酶而影响DNA的合成，进而发挥抗菌消炎作用，可用于治疗前列腺炎、肠炎、菌痢及胆道感染等(Izawa A等，Antimicrob Agents Chemother,1980,18,41-44.)。至今为止，尚无甲氧喹酸在疼痛、心律失常、癫痫和神经胶质瘤等疾病治疗中应用的研究报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种甲氧喹酸在制备用于治疗和/或预防以T-型钙通道为治疗靶点的疾病的药物中的应用。本发明公开了甲氧喹酸的新用途，为开发用于治疗和/或预防以T-型钙通道为治疗靶点的疾病的药物提供了新的理论和技术支撑，在临床治疗领域具有广泛的应用前景。
为了达到上述目的，本发明提供了甲氧喹酸在制备用于治疗和/或预防以T-型钙通道为治疗靶点的疾病的药物中的应用。
进一步地，所述疾病为炎性疼痛。
进一步地，所述疾病为神经病理性疼痛。
进一步地，所述疾病为心律失常。
进一步地，所述疾病为癫痫。
进一步地，所述疾病为神经胶质瘤。
进一步地，所述T-型钙通道为Cav3.1亚型或Cav3.2亚型。
进一步地，所述甲氧喹酸用于抑制T-型钙通道。
进一步地，所述药物以甲氧喹酸为活性成分，还包括药学上可接受的载体。
进一步地，所述药物的给药剂量为40-50nmol/kg体重。
与现有技术相比，本发明的优点和效果：
1、本发明通过研究甲氧喹酸对T-型钙通道的影响，发现甲氧喹酸可以显著抑制T-型钙通道特别是Cav3.1亚型和Cav3.2亚型的电流以及神经元动作电位的发放。本发明还通过动物实验证明了甲氧喹酸可以通过抑制T-型钙通道来缓解炎性疼痛和神经病理性疼痛的疼痛反应，具有良好的镇痛作用。利用甲氧喹酸对T-型钙通道的抑制作用，可以将甲氧喹酸应用在制备用于治疗和/或预防以T-型钙通道为治疗靶点的疾病的药物中，这些疾病还包括心律失常、癫痫和神经胶质瘤等。
2、本发明公开了甲氧喹酸在制备用于治疗和/或预防以T-型钙通道为治疗靶点的疾病的药物中的应用，所述疾病包括炎性疼痛、神经病理性疼痛、心律失常、癫痫和神经胶质瘤等，还公开了其作用机制为甲氧喹酸对T-型钙通道特别是Cav3.1亚型和Cav3.2亚型电流的抑制作用，还公开了所述药物的给药剂量。
附图说明
图1为本发明实施例1中甲氧喹酸对T-型钙通道Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3亚型电流的影响。其中：
图1A为对照组和给药组的Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3亚型电流示意图；
图1B为对照组和给药组的Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3亚型电流的统计图；
图1C为对照组和给药组的Cav3.1亚型电流的激活曲线和失活曲线；
图1D为对照组和给药组的Cav3.2亚型电流的激活曲线和失活曲线；
图1E为甲氧喹酸对Cav3.1和Cav3.2亚型电流抑制的剂量效应曲线。
图2为本发明实施例2中甲氧喹酸对T-型钙通道电流的影响。其中：
图2A为对照组、洗脱组和给药组的T-型钙通道电流示意图；
图2B为对照组、洗脱组和给药组的T-型钙通道电流密度的统计图；
图2C为甲氧喹酸对T-型钙通道电流抑制的剂量效应曲线。
图3为本发明实施例3中甲氧喹酸对神经元动作电位发放的影响。其中：
图3A为对照组和给药组的1秒刺激时程神经元放电示意图；
图3B为对照组和给药组的1秒刺激时程神经元动作电位频率的统计图。
图4为本发明实施例4中甲氧喹酸对CFA诱导的炎症性疼痛模型大鼠的疼痛行为学的影响。其中：
图4A为溶剂组和给药组的面部痛阈值随时间变化的统计图；
图4B为生理盐水组和CFA模型组的面部痛阈值随时间变化的统计图；
图4C为10nmol甲氧喹酸给药组、5nmol甲氧喹酸给药组和溶剂组对CFA诱导第2天的炎症性疼痛模型大鼠的面部痛阈值的影响；
图4D为溶剂组和TTA-P2组分别在30min后给药甲氧喹酸对CFA诱导第2天的炎症性疼痛模型大鼠的面部痛阈值的影响。
图5为本发明实施例5中甲氧喹酸对三叉神经病理性痛模型大鼠的疼痛行为学的影响。其中：
图5A为假手术组和CCI-ION模型组的面部痛阈值随时间变化的统计图；
图5B为10nmol甲氧喹酸给药组、5nmol甲氧喹酸给药组和溶剂组对CCI-ION模型建立第14天的三叉神经病理性痛模型大鼠的面部痛阈值的影响；
图5C为溶剂组和TTA-P2组分别在30min后给药甲氧喹酸对CCI-ION模型建立第14天的三叉神经病理性痛模型大鼠的面部痛阈值的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
以下所涉及的英文代号的中文含义为：DMSO为二甲基亚砜，HEK293细胞为人胚胎肾细胞293，CFA为完全弗氏佐剂，von Frey filament为纤维丝测痛仪，DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，HEPES为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，EGTA为乙二醇二乙醚二胺四乙酸，TTA-P2为3,5-二氯-N-[[4-氟-1-[[(4S)-四氢-2,2-二甲基-2H-吡喃-4-基]甲基]-4-哌啶]甲基]苯甲酰胺。
以下实施例中，甲氧喹酸的溶剂为DMSO。
实施例1甲氧喹酸对HEK293细胞体外转染的T-型钙通道Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3亚型电流的影响
(1)细胞转染
1、转染前准备：取一瓶培养的HEK293细胞，弃去培养液，加入磷酸盐缓冲液3ml轻洗两遍。然后，加入1ml的0.25％胰酶进行消化，3-5分钟后加入DMEM培养液进行吹打，收集细胞；以1000rpm离心5分钟，弃去上清液后，加入5-10ml的DMEM培养液，悬浮细胞。再次缓慢吹打，然后传代至铺满玻片的35mm培养皿中，24小时后进行转染。
2、转染过程：采用脂质体转染法进行转染，所用转染试剂为Lipofectamine 3000，所用材料及用量：Cav3质粒1.5μg、转染增强因子(TAG)0.25μg、增强绿色荧光蛋白(EGFP)0.1μg。转染48h-72h后，应用全细胞膜片钳技术记录带有荧光的HEK293细胞，每组记录9-12个细胞。
其中，Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3质粒碱基序列经基因测序和DNA Star序列分析比对软件证明，分别与NCBI数据库中公布的编号为NM_198376.3(Cav3.1)，NM_021098.3(Cav3.2)及NM_021096.4(Cav3.3)序列一致。
(2)电流记录
在室温下，采用Multiclamp700B放大器进行全细胞电压钳记录。玻璃电极为拉制电极，电极内填充细胞内液后的电阻为3–5MΩ。DigiData1322A在pClamp10.2软件中转换为数字信号。串联电阻补偿70-80％。刺激方波采用钳制电压-90mV，除极至-30mV后，再回到钳制电位水平，记录此时的T-型钙通道电流幅度。
记录电极内液：110氯化铯，4镁-ATP，0.3钠-GTP，25HEPES，10EGTA。记录电极外液：5氯化钡，140氯化四乙胺，5氯化铯，0.5氯化镁，5.5葡萄糖，10HEPES。单位为mM，即毫摩尔/升。
(3)甲氧喹酸对T-型钙通道Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3亚型电流的抑制作用
激活曲线(I/Imax)及失活曲线(G/Gmax)是反映电压门控离子通道开放程度的常用指标。剂量依赖性关系是反映化合物是否具有药理学作用的一个重要指标。
将10μM甲氧喹酸直接作用于表达在HEK293细胞上的Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3亚型，作为给药组。甲氧喹酸给药前作为对照组。
如图1A和图1B所示，相比于对照组，给药组的Cav3.1亚型电流降低49.6±2.9％，Cav3.2亚型电流降低57.2±3.3％，而Cav3.3亚型电流仅降低2.1±0.7％。其中，**p<0.01。
如图1C和图1D所示，相比于对照组，给药组的Cav3.1亚型的失活常数V1/2左移6.5±0.7mV，Cav3.2亚型的失活常数V1/2左移8.5±0.3mV。
表明，甲氧喹酸可加速T-型钙通道Cav3.1和Cav3.2亚型的关闭、左移通道电导-电压关系，从而发挥对T-型钙通道Cav3.1和Cav3.2亚型电流的抑制作用。
如图1E所示，甲氧喹酸对Cav3.1和Cav3.2亚型内向电流的抑制作用均具有明显的剂量依赖关系。剂量依赖性关系的测定为常规实验操作。其中，甲氧喹酸对Cav3.1亚型电流的IC50为6.5±0.9μM，甲氧喹酸对Cav3.2亚型的IC50为8.2±0.6μM。IC50为半抑制浓度。
结果表明，甲氧喹酸能显著抑制T-型钙通道Cav3.1亚型和Cav3.2亚型的电流。
实施例2甲氧喹酸对急性分离的原代大鼠三叉神经节神经元中的T-型钙通道电流的影响
(1)三叉神经节神经元的分离
具体方法采用三叉神经节神经元酶解条件(Zhang Y等，J Pineal Res，2018，64，e12476)急性分离成年雄性SD大鼠三叉神经节神经元细胞。
取220克左右的雄性SD大鼠，麻醉后暴露其三叉神经节。利用显微解剖镊取双侧三叉神经节，尽量去除其纤维连接，立即置于冰冷充氧的DMEM培养基中。将培养基中的三叉神经节移入3mg/ml的胶原酶消化液中并用显微剪刀剪碎，37℃消化45分钟，然后在2mg/ml的胰蛋白酶消化液中再消化15分钟。上述操作完毕后，以含有10％胎牛血清的DMEM培养基终止其消化。反复吹打细胞至分散，经过40μm细胞筛滤过，得到的混悬液以800rpm离心3分钟。离心后，弃去上清液，细胞沉淀物用DMEM培养基重悬，重悬后接种于24孔培养板中的预先用多聚赖氨酸包被的盖玻片上，并置于37℃、5％CO2的培养箱中待用。
(2)电流记录
与实施例1中相同。
(3)甲氧喹酸对T-型钙通道电流的抑制作用
将10μM甲氧喹酸直接作用于三叉神经节神经元中的T-型钙通道，作为给药组。甲氧喹酸给药前作为对照组。另有一组在进行电流记录前，先进行药物洗脱，作为洗脱组。
如图2A和图2B所示，相比于对照组，给药组的T-型钙通道电流降低52.7±2.6％。其中，*p<0.05。
如图2C所示，甲氧喹酸对T-型钙通道电流的抑制作用具有明显的剂量依赖关系。剂量依赖性关系的测定为常规实验操作。其中，甲氧喹酸对T-型钙通道电流的IC50为7.7±0.6μM。
结果表明，甲氧喹酸能显著抑制T-型钙通道的电流。
实施例3甲氧喹酸对急性分离的原代大鼠三叉神经节神经元动作电位发放的影响
T-型钙通道电流是神经元中一种低电压门控、快速激活和失活的钙离子电流，在神经元动作电位的反复放电中发挥重要作用。
(1)三叉神经节神经元的分离
与实施例2中相同。
(2)动作电位记录
在室温下，采用Multiclamp 700B放大器进行全细胞式电流钳记录。向细胞内注射180pA持续时间1秒的电流，使细胞稳定在-70mV水平，记录所产生的动作电位频率。
记录电极内液：10氯化钠，110氯化钾，2EGTA，25HEPES，0.5钠-GTP，4镁-ATP。记录电极外液：2氯化钾，128氯化钠，2氯化钙，2氯化镁，30葡萄糖，25HEPES。单位为mM，即毫摩尔/升。
(3)甲氧喹酸对神经元动作电位发放的抑制作用
将10μM甲氧喹酸直接作用于三叉神经节神经元中的T-型钙通道，作为给药组。甲氧喹酸给药前作为对照组。
如图3A和图3B所示，对照组的动作电位为13.3±1.5个，给药组的动作电位为6.1±0.3个。其中，**p<0.01。给予甲氧喹酸后的神经元的动作电位个数出现明显下降。
结果表明，甲氧喹酸能显著抑制神经元动作电位的发放。
实施例4甲氧喹酸对CFA诱导的炎症性疼痛模型大鼠的疼痛行为学的影响
当人体受到痛觉刺激后，由痛觉感受器兴奋产生的神经冲动会经外周感觉神经纤维传至三叉神经节，换元后传至脊髓的背角，然后经一定的上传通路传至大脑中枢部位，从而引起伤害性感受和疼痛。初级传入神经元接受痛觉传入，其胞体聚集构成三叉神经节。因此，三叉神经节神经元广泛用作痛觉相关的离子通道激动剂或抑制剂的研究对象。
CFA诱导的炎症性疼痛模型是常用的持续性炎症性疼痛模型之一，在CFA注射局部产生明显的炎症现象。
(1)CFA诱导的大鼠炎症性疼痛模型的建立
取200-250g的成年健康的雄性SD大鼠。实验前，让动物在饲养环境中适应三天。采用实验室常规做法建立模型：在大鼠面部须垫部皮下注射CFA，剂量为20μl/只。选取注射CFA第2天出现右侧后肢足垫、踝关节肿胀且表现痛觉过敏的个体作为实验对象即实验组大鼠。
(2)大鼠面部痛阈值的测定
在行为学测定之前，首先要将大鼠置于铁丝网架上的有机玻璃箱中适应环境，该过程持续三天，每次1h。测试方法：先用1g的von Frey filament刺激须垫中间部位，若连续刺激5次中出现3次逃避，即为阳性。然后，用低一级强度的von Frey filament继续同样操作，若未出现阳性反应，则用高一级强度的von Frey filament刺激，把出现阳性反应的最小强度计作面部痛阈值即面部机械痛阈值。
(3)甲氧喹酸对CFA诱导的炎症性疼痛模型大鼠的疼痛行为学的影响
1、甲氧喹酸对正常大鼠(无CFA诱导)的面部痛阈值的影响：取正常的大鼠20只，分成二组，每组10只。第一组为溶剂组，第二组为给药组。在第二组大鼠的三叉神经节定位注射10nmol甲氧喹酸，在第一组大鼠的三叉神经节定位注射相应溶剂DMSO。
如图4A所示，溶剂组和给药组的大鼠面部痛阈值相近，没有明显差别。
可知，在三叉神经节定位注射10nmol甲氧喹酸不影响正常大鼠的面部痛阈值。
2、CFA诱导对大鼠的面部痛阈值的影响：取正常的大鼠20只，分成二组，每组10只。第一组为生理盐水组，第二组为CFA模型组。分别经过1d，2d，3d，6d，7d，10d，14d检测各组的面部痛阈值。
如图4B所示，CFA模型组第2天的面部痛阈值为2.1±0.2g，达到最低(*p<0.05，**p<0.01vs.生理盐水组)。而生理盐水组的面部痛阈值没有明显变化。
可知，CFA诱导可以降低大鼠的面部痛阈值。
3、甲氧喹酸对CFA诱导的炎症性疼痛模型大鼠的面部痛阈值的影响：取前述方法得到的CFA诱导的炎性大鼠27只，分成三组，每组9只。在CFA诱导后第2天，在第一组大鼠三叉神经节定位注射10nmol甲氧喹酸，第二组大鼠三叉神经节定位注射5nmol甲氧喹酸，第三组大鼠三叉神经节定位注射相应溶剂DMSO，分别经过1h，3h，6h，12h，18h，24h检测各组的面部痛阈值。
如图4C所示，10nmol甲氧喹酸给药组、5nmol甲氧喹酸给药组的面部痛阈值在甲氧喹酸给药后3h可明显翻转CFA诱导的炎性大鼠的机械痛敏(#p<0.05vs.溶剂组)，即大鼠的面部痛阈值出现上升。
可知，在三叉神经节定位注射甲氧喹酸可以显著缓解CFA诱导的炎症性疼痛模型大鼠的疼痛行为反应，具有镇痛作用。
4、甲氧喹酸对CFA诱导的炎症性疼痛模型大鼠的镇痛作用机制研究：在CFA诱导后第2天，预先对三叉神经节定位注射给药2nmol的TTA-P2，30min后定位注射给药10nmol甲氧喹酸，作为TTA-P2组。另一组预先注射相应溶剂DMSO，30min后定位注射给药10nmol甲氧喹酸，作为溶剂组。TTA-P2为一种T-型钙通道阻滞剂，TTA-P2的溶剂为DMSO。
如图4D所示，定位注射TTA-P2可提高CFA诱导的炎症性疼痛模型大鼠的面部痛阈值，而在定位注射TTA-P2后继续给药甲氧喹酸则对CFA诱导的炎症性疼痛模型大鼠的面部痛阈值没有进一步提高，即没有进一步的镇痛作用。**p<0.01vs.CFA第2天+TTA-P2组；#p<0.05vs.CFA第2天后溶剂组1小时的时间点。可知，甲氧喹酸对CFA诱导的炎症性疼痛模型大鼠的镇痛作用是通过对T-型钙通道的抑制作用实现的。
结果表明，甲氧喹酸对CFA诱导的炎症性疼痛模型大鼠疼痛具有镇痛作用，且镇痛机制是甲氧喹酸对T-型钙通道的抑制作用。
实施例5甲氧喹酸对三叉神经病理性痛模型大鼠的疼痛行为学的影响
三叉神经由三叉神经节(TG)发出的周围突组成，包括三条大的分支，即眼神经、上颌神经及下颌神经，分别分布到头面部的不同区域。本研究中所用的三叉神经病理性痛模型为经口腔行左侧眶下神经(为上颌神经的终末支)慢性压迫性损伤(chronicconstrictive injury to the infraorbital nerve,CCI-ION)模型。
(1)CCI-ION模型的建立
取200-250g的成年健康的雄性SD大鼠。实验前，让动物在饲养环境中适应三天。用4％水合氯醛麻醉大鼠，水合氯醛的注射剂量为1ml/100g体重。将麻醉后的大鼠置于仰卧位，将其舌拉出并牵向右侧，以暴露口内左侧。在左上颌第一磨牙水平，沿龈颊边缘纵向切开约1cm，并将组织进行钝性分离，小心暴露眶下神经。在眶下神经的近、远心端分别用5-0丝线进行疏松结扎，两结扎线间距约2mm，松紧适度。结扎标准：在显微镜下观察到神经的直径略微变细，但不能抑制其外膜的血液循环。
(2)大鼠面部痛阈值的测定
与实施例4中相同。
(3)甲氧喹酸对CCI-ION模型大鼠的疼痛行为学的影响
1、CCI-ION对大鼠的面部痛阈值的影响：取正常的大鼠30只，分成二组，每组15只。第一组为假手术组，第二组为CCI-ION模型组。分别经过7d，14d，21d，28d检测各组的面部痛阈值。
如图5A所示，CCI-ION模型组第14天的面部痛阈值为2.6±0.3g，显著降低(**p<0.01vs.假手术组)。而假手术组的面部痛阈值没有明显变化。
可知，CCI-ION可以降低大鼠的面部痛阈值。
2、甲氧喹酸对CCI-ION模型大鼠的面部痛阈值的影响：取前述方法得到的CCI-ION模型大鼠27只，分成三组，每组9只。在CCI-ION模型建立后第14天，在第一组大鼠三叉神经节定位注射10nmol甲氧喹酸，第二组大鼠三叉神经节定位注射5nmol甲氧喹酸，第三组大鼠三叉神经节定位注射相应溶剂DMSO，分别经过1h，3h，6h，9h，12h，24h检测各组的面部痛阈值。
如图5B所示，10nmol甲氧喹酸给药组、5nmol甲氧喹酸给药组的面部痛阈值在甲氧喹酸给药后3h可明显翻转CCI-ION模型大鼠的机械痛敏(#p<0.05vs.溶剂组)，即大鼠的面部痛阈值出现上升。
可知，在三叉神经节定位注射甲氧喹酸可以显著缓解CCI-ION模型大鼠的疼痛行为反应，具有镇痛作用。
3、甲氧喹酸对CCI-ION模型大鼠的镇痛作用机制研究：在CCI-ION模型建立后第14天，预先对三叉神经节定位注射给药2nmol的TTA-P2，30min后定位注射给药10nmol甲氧喹酸，作为TTA-P2组。另一组预先注射相应溶剂DMSO，30min后定位注射给药10nmol甲氧喹酸，作为溶剂组。
如图5C所示，定位注射TTA-P2可提高CCI-ION模型大鼠的面部痛阈值，而在定位注射TTA-P2后继续给药甲氧喹酸则对CCI-ION大鼠的面部痛阈值没有进一步提高，即没有进一步的镇痛作用。*p<0.05vs.模型14天+TTP-A2组；#p<0.05vs.模型14天后溶剂组1小时的时间点。可知，甲氧喹酸对CCI-ION模型大鼠的镇痛作用是通过对T-型钙通道的抑制作用实现的。
结果表明，甲氧喹酸对CCI-ION模型大鼠疼痛具有镇痛作用，且镇痛机制是甲氧喹酸对T-型钙通道的抑制作用。
本发明利用全细胞电压钳技术和电流钳技术，在实施例1中，研究了甲氧喹酸对HEK293细胞体外转染的T-型钙通道Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3亚型电流的影响，发现甲氧喹酸可以显著抑制T-型钙通道Cav3.1亚型和Cav3.2亚型的电流。在实施例2和3中，本发明还研究了甲氧喹酸对大鼠三叉神经节神经元中的T-型钙通道电流以及神经元动作电位发放的影响，发现甲氧喹酸可以显著抑制T-型钙通道的电流以及神经元动作电位的发放。
本发明通过动物学实验，在实施例4中，研究了甲氧喹酸对CFA诱导的炎症性疼痛模型大鼠的疼痛行为学的影响，发现甲氧喹酸对CFA诱导的炎性疼痛具有镇痛作用，且镇痛机制为甲氧喹酸对T-型钙通道的抑制作用。在实施例5中，本发明还研究了甲氧喹酸对三叉神经病理性痛模型大鼠的疼痛行为学的影响，发现甲氧喹酸对三叉神经病理性疼痛具有镇痛作用，且镇痛机制为甲氧喹酸对T-型钙通道的抑制作用。
本发明发现了甲氧喹酸对T-型钙通道特别是其中的Cav3.1亚型和Cav3.2亚型的电流具有抑制作用，还可以显著抑制神经元动作电位的发放。本发明还发现了甲氧喹酸对炎性疼痛和神经病理性疼痛均具有明显的镇痛作用，且镇痛机制为甲氧喹酸对T-型钙通道的抑制作用。甲氧喹酸对T-型钙通道具有显著的抑制作用，因此，甲氧喹酸可应用在制备用于治疗和/或预防以T-型钙通道为治疗靶点的疾病的药物中，所述疾病还包括心律失常、癫痫和神经胶质瘤等。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (5)

1.甲氧喹酸在制备用于治疗和/或预防以T-型钙通道为治疗靶点的疾病的药物中的应用，所述疾病为炎性疼痛或神经病理性疼痛。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述T-型钙通道为Cav3.1亚型或 Cav3.2亚型。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述甲氧喹酸用于抑制T-型钙通道。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物以甲氧喹酸为活性成分，还包括药学上可接受的载体。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的给药剂量为40-50nmol/kg体重。
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