CN114848800B - 一种tmpf肽在制备治疗和/或预防疼痛疾病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种TMPF肽在制备治疗和/或预防疼痛疾病的药物中的应用，特别是在治疗炎性疼痛、神经病理痛及偏头痛药物方面的应用，所述TMPF肽包含如下所示氨基酸序列：TMPFLFCNVNDVCNFASRNDYSYWL。本发明公开了所述TMPF肽的新用途，所述TMPF肽通过靶向抑制T‑型钙离子通道，对炎性痛、三叉神经痛、坐骨神经痛及偏头痛具有明显的镇痛作用，同时为开发用于治疗和/或预防以T‑型钙离子通道为治疗靶点的疾病的药物提供了新的理论和技术支撑，在临床治疗领域具有广泛的应用前景。

Description

一种TMPF肽在制备治疗和/或预防疼痛疾病药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种TMPF肽在制备治疗和/或预防疼痛疾病药物中的应用，以及在制备治疗和/或预防以T-型钙离子通道为靶点的疾病的药物中的应用。
背景技术
三叉神经痛、坐骨神经痛、偏头痛、癌痛等慢性疼痛是严重危害人类身心健康和生活质量的慢性疾病，被喻为“不死的癌症”，其反复发作、迁延难治会诱发患者焦虑、抑郁和恐惧等恶性情绪或精神异常，甚至会严重危害患者的生命及生活质量。基于目前临床用于缓解疼痛的药物非甾体抗炎药及阿片类镇痛药，均具有较为严重的副作用。因此，寻求新的安全有效的镇痛药物，但又能避免严重副作用的新的制剂显得尤为迫切。为研发可用于治疗上述慢性疼痛的药物，本课题组曾研究发现眼镜蛇长链神经毒素(α-cobratoxin，α-CbTX)、甲氧喹酸、lncRNA XR_595534.2等(CN112076193B、CN102139093A、CN112716971B)对慢性疼痛具有镇痛效果，并进一步探索不同物质产生镇痛效果的作用机理。
生物膜离子通道是生命活动的基础，其特定位点的突变将导致通道激活、失活等特性发生异常，引起细胞功能紊乱，进而导致相关遗传性疾病(即，原发性离子通道病，如家族遗传性偏头痛、小儿失神癫痫等)。同时，某些疾病又可使离子通道功能甚至结构发生改变，产生继发性离子通道代偿性疾病(如，神经病理性疼痛等)。因而，在疾病的治疗过程中，寻求离子通道调控的信号转导机制或探索选择性离子通道调控分子，在疼痛的治疗和研发理想的临床药物方面显得尤为重要。T-型钙通道属于低电压激活钙离子通道，其激活阈值较低、失活速度较快，在静息状态下的神经元兴奋调节中起重要作用，是感觉传导异常及发作性疾病治疗药物研发的重要靶标(Zamponi et al.,Pharmacol Rev,2015)。T-型钙通道可作为慢性疼痛治疗的药物靶点，主要包括以下证据和优势：首先，神经T-型钙通道尤其是Cav3.2亚型在整个疼痛感觉传导和感受通路都有表达和分布，影响感觉的传导(Bourinetet al.,Pain,2016；Snutch and Zamponi,Br J Pharmacol,2018)。对神经T-型钙通道Cav3.2亚型进行基因干扰或基因敲除，会导致动物对伤害性刺激感觉敏感性降低(Bourinet et al.,EMBO J,2005；Todorovic and Jevtovic-Todorovic,Br J Pharmacol,2011)。以上结果表明，T-型钙通道在疼痛，特别是神经病理性疼痛及炎症痛中发挥重要的生理作用。
此外，除了作为疼痛治疗的药物靶点，T-型钙通道还可作为心律失常等疾病治疗的药物靶点(Mesirca et al.,Front Physiol,2015；Weiss and Zamponi,Int JBiochemCell Biol,2019)，分布于心脏浦肯野纤维细胞、窦房结和潜在起搏细胞上的Cav3.1亚型，能够影响膜电位水平，控制心脏电信号传导和心脏起搏。研究发现心房起搏细胞上T-型钙通道介导的电流在维持起搏细胞的复极、动作电位始动和窦房结自律性等方面发挥重要的生理意义。另外，T-型钙通道(主要是Cav3.1和Cav3.2亚型)还可作为癫痫等神经精神兴奋性异常疾病治疗的药物靶点(Zamponi et al.,Pflugers Arch,2010)，研究发现Cav3.2亚型基因变异可以使T-型钙通道电流增加，诱导神经元兴奋，导致癫痫发作(Peloquin etal.,Epilepsia,2006)。在WAG/Rij癫痫鼠模型中应用选择性T-型钙通道阻滞剂可以有效控制癫痫发作(Powell et al.,Br J Clin Pharmacol.2014)。
肿瘤抑素(Tumstatin)来源于胶原蛋白Ⅳα3链非胶原NC1结构域，由244个氨基酸残基组成，是目前已知活性最强的内源性肿瘤血管生成抑制因子，也可以直接促进肿瘤细胞的凋亡，与肿瘤生长、转移有直接关系。而TMPF肽是来源于Tumstatin的第74至98位的一段氨基酸序列Thr-Met-Pro-Phe-Leu-Phe-Cys-Asn-Val-Asn-Asp-Val-Cys-Asn-Phe-Ala-Ser-Arg-Asn-Asp-Tyr-Ser-Tyr-Trp-Leu(TMPFLFCNVNDVCNFASRNDYSYWL)，具有抑制内皮细胞中蛋白合成的作用，参与抗血管生成。相对于Tumstatin而言，TMPF肽分子量较低，免疫原性较低，因此临床用药安全性相对较高。然而，至今为止，无论是TMPF肽，还是Tumstatin，在疼痛、心律失常、及癫痫疾病治疗中作用尚无相关的研究报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种TMPF肽在制备治疗和/或预防疼痛疾病药物中的应用，所述TMPF肽通过靶向抑制T-型钙离子通道，对炎性痛、三叉神经痛、坐骨神经痛及偏头痛具有明显的镇痛作用，为开发用于治疗疼痛疾病的药物以及治疗以T-型钙离子通道为靶点的疾病的药物提供了新的理论和技术支撑，在临床治疗领域具有广泛的应用前景。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种TMPF肽在制备治疗和/或预防疼痛疾病药物中的应用，所述TMPF肽包含以下所示的一段氨基酸序列：TMPFLFCNVNDVCNFASRNDYSYWL。
进一步地，所述疾病为炎性疼痛。
进一步地，所述疾病为三叉神经痛。
进一步地，所述疾病为坐骨神经痛。
进一步地，所述疾病为偏头痛。
进一步地，所述疾病为癌症痛。
进一步地，所述TMPF肽为氨基酸序列TMPFLFCNVNDVCNFASRNDYSYWL。
进一步地，所述药物以TMPF肽为活性成分，还包括药学上可接受的载体。
进一步地，所述药物由0.1-100％的TMPF肽和0-99.9％的药用辅料组成。
本发明第二方面提供了一种TMPF肽在制备治疗和/或预防以T-型钙离子通道为靶点的疾病的药物；所述TMPF肽包含以下所示的一段氨基酸序列：TMPFLFCNVNDVCNFASRNDYSYWL。
进一步地，所述疾病为炎性疼痛、三叉神经痛、坐骨神经痛、偏头痛、癌症痛、心率失常或癫痫。
进一步地，所述TMPF肽为氨基酸序列TMPFLFCNVNDVCNFASRNDYSYWL。
进一步地，所述TMPF肽用于抑制T-型钙离子通道，以降低T-型钙离子通道电流。
进一步地，所述药物以TMPF肽为活性成分，还包括药学上可接受的载体。
进一步地，所述药物由0.1-100％的TMPF肽和0-99.9％的药用辅料组成。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明通过研究TMPF肽对T-型钙离子通道的影响，发现TMPF肽可以显著抑制T-型钙离子通道电流。此外，通过动物实验证明了TMPF肽可以通过抑制T-型钙离子通道来缓解炎性疼痛、三叉神经痛、坐骨神经痛及偏头痛的疼痛反应，具有良好的镇痛作用。利用TMPF肽对T-型钙离子通道的抑制作用，可以将TMPF肽应用在制备用于治疗和/或预防以T-型钙离子通道为治疗靶点的疾病的药物中，包括炎性疼痛，三叉神经痛、坐骨神经痛、偏头痛、癌症痛、心率失常及癫痫等疾病。
2.本发明通过动物行为学实验证实了TMPF肽对炎性痛、三叉神经痛、坐骨神经痛及偏头痛具有明显的镇痛作用，且其作用机制为TMPF肽对T-型钙离子通道电流的抑制作用，为开发用于治疗疼痛疾病的药物以及治疗以T-型钙离子通道为靶点的疾病的药物提供了新的理论和技术支撑。
附图说明
图1为本发明实施例1中TMPF肽对TG神经元各型电压门控离子通道电流的影响，其中：
图1A为对照组和TMPF肽给药组的高电压门控钙通道电流示意图；
图1B为对照组和TMPF肽给药组的低电压门控T-型钙通道电流示意图；
图1C为对照组和TMPF肽给药组的电压门控钠通道电流示意图；
图1D为对照组和TMPF肽给药组的A-型钾通道电流示意图；
图1E为对照组和TMPF肽给药组的延迟整流钾通道电流示意图；
图1F为TMPF肽对上述各电流作用的统计图。
图2为本发明实施例2中TMPF肽对三叉神经节神经元T-型钙通道电流影响的量效关系、激活及失活曲线关系图，其中：
图2A为TMPF肽对三叉神经节神经元T-型钙通道电流影响的量效关系；
图2B为对照组和TMPF肽给药组的T-型钙通道激活曲线图；
图2C为对照组和TMPF肽给药组的T-型钙通道失活曲线图。
图3为本发明实施例3中TMPF肽对CFA诱导的炎性痛模型大鼠疼痛行为学的影响，其中：
图3A为1nmol TMPF肽给药组、5nmol TMPF肽给药组和溶剂组对CFA诱导第2天的炎性痛模型大鼠的面部痛阈值的影响；
图3B为溶剂组和NNC 55-0396组分别在30min后给药TMPF肽对CFA诱导第2天的炎性痛模型大鼠的面部痛阈值的影响。
图4为本发明实施例4中TMPF肽对三叉神经病理性痛模型大鼠的疼痛行为学的影响，其中：
图4A为CCI-ION模型大鼠面部机械痛阈值时程曲线图；
图4B为1nmol TMPF肽给药组、5nmol TMPF肽给药组和溶剂组对CCI-ION模型建立第14天的三叉神经病理性痛模型大鼠的面部痛阈值的影响；
图4C为溶剂组和NNC 55-0396组分别在30min后给药TMPF肽对CCI-ION模型建立第14天的三叉神经病理性痛模型大鼠的面部痛阈值的影响。
图5为本发明实施例5中TMPF肽对坐骨神经痛SNI模型大鼠的疼痛行为学的影响，其中：
图5A为SNI模型大鼠面部机械痛阈值时程曲线图；
图5B为1nmol TMPF肽给药组、5nmol TMPF肽给药组和溶剂组对SNI模型机械痛阈值的影响；
图5C为溶剂组和NNC 55-0396组分别在30min后给药TMPF肽对SNI模型大鼠机械痛阈值的影响。
图6为本发明实施例6中TMPF肽对偏头痛模型大鼠的疼痛行为学的影响，其中：
图6A为1nmol TMPF肽给药组、5nmol TMPF肽给药组和溶剂组对偏头痛面部机械痛阈值的影响；
图6B为溶剂组和NNC 55-0396组分别在30min后给药TMPF肽对偏头痛模型大鼠痛阈值的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下实施例中采用的TMPF肽的氨基酸序列均为：TMPFLFCNVNDVCNFASRNDYSYWL。
实施例1：TMPF肽对三叉神经节神经元各型电压门控离子通道的影响
本实施例中，所选的实验材料如下：成年雄性健康的Sprague-Dawley大鼠，体重180-220克，由苏州大学实验动物中心提供。动物中心的卫生级核定文件编号：SYXK(苏)2007-0035。电生理试剂均购自Sigma公司。
(1)三叉神经元分离：具体方法采用三叉神经节神经元酶解法Zhang Y等，JPineal Res，2018，64，e12476)急性分离成年雄性SD大鼠三叉神经节(trigeminalganglion,TG)神经元细胞。雄性SD大鼠麻醉后暴露其三叉神经节。利用显微解剖镊取双侧三叉神经节，尽量去除其纤维连接，立即置于冰冷充氧的DMEM培养基中。将培养基中的三叉神经节移入3毫克/毫升的胶原酶消化液中并用显微剪刀剪碎，37℃消化45分钟，然后在2毫克/毫升的胰蛋白酶消化液中再消化15分钟。上述操作完毕后，以含有10％胎牛血清的DMEM培养基终止其消化。反复吹打细胞至分散，经过40微米细胞筛滤过，得到的混悬液以800rpm离心3分钟，离心后弃去上清液，细胞沉淀物用DMEM培养基重悬，重悬后接种于24孔培养板中的预先用多聚赖氨酸包被的盖玻片上，并置于37℃、5％CO2的培养箱中待用。
(2)全细胞膜片钳记录电流：应用全细胞膜片钳记录小直径TG神经元电压门控型离子通道电流(高电压型钙通道电流、T-型钙通道电流、电压门控钠通道电流、钾通道电流)，每组记录7-9个细胞。具体操作如下：
在室温下，采用Multiclamp 700B放大器进行全细胞电压钳记录。玻璃电极为拉制电极，电极内填充细胞内液后的电阻为3-5MΩ。DigiData1322A在pClamp10.2软件中转换为数字信号，串联电阻补偿70-80％。
记录高电压型钙通道电流时，细胞钳制在-60mV，刺激方波至0mV。
记录T-型钙通道电流时，细胞钳制在-110mV，刺激方波至-40mV，刺激时程为40ms。
记录电压门控钠通道电流时，细胞钳制在-60mV，刺激方波至0mV，刺激时程为200ms。
记录钾通道电流时，细胞钳制在-80mV，去极化至+40mV可记录到总得钾通道电流，随后给予一个-10mV的前置脉冲，失活所有的A-型钾通道电流，得到延迟整流钾通道电流。用总得钾通道电流减去延迟整流型电流即为A-型钾通道电流。
本实施例通过上述方法检测了TMPF肽对SD大鼠TG神经元电压门控高电压门控钙通道电流、低电压门控T-型钙通道电流、电压门控钠通道电流、A-型钾通道电流及延迟整流钾通道电流的影响。结果如图1所示：由图1A可知，相比于对照组，1μM TMPF肽给药组的高电压门控钙通道电流没有明显变化(n＝7)；由图1B可知，相比于对照组，1μM TMPF肽给药组可显著抑制低电压门控T-型钙通道电流，抑制率达到57.2±7.5％(n＝9)，其中，*p<0.05；由图1C-1E可知，相比于对照组，TMPF肽给药组对电压门控钠通道电流(图1C，n＝7)、电压门控A-型钾通道(图1D，n＝7)及延迟整流钾通道(图1E，n＝6)没有明显改变；将1μM TMPF肽对不同离子通道电流的影响归纳于图1F中，结果表明TMPF肽能显著选择性抑制T-型钙离子通道电流，
实施例2：TMPF肽对TG神经元低电压门控T-型钙通道电流及通道动力学的影响
(1)三叉神经节神经元的分离：方法与实施例1相同。
(2)全细胞膜片钳记录电流：T-型钙通道电流的测试方法与实施例1相同，激活曲线通道动力学检测：细胞钳制在-110mV电压，随后给与40ms的去极化刺激，电压从-80mV至+10mV，复极化至-110mV后，获得尾电流；失活曲线通道动力学检测：细胞钳制在-110mV电压，给与-120mV至-20mV的刺激电压，步进为+10mV，复极至-110mV后，再次去极化至-40mV，获得失活电流。
(3)TMPF肽对TG神经元T-型钙通道电流的抑制作用：
将不同浓度(10nM、100nM、500nM、1μM、10μM)的TMPF肽作用TG神经元，研究TMPF肽浓度对抑制低电压门控T-型钙通道电流的影响，结果如图2A所示(图中括号内数字为各浓度TMPF肽所记录的细胞个数)，在10nM～10μM的浓度范围内，TMPF肽对低电压门控T-型钙通道电流的抑制率随浓度的增大而增大。应用sigmoidal Hill方程[Y＝1/(1+10(log IC50-X)nH]拟合，X是浓度的对数值，IC50是半数有效剂量，经Prism 5.0(Graph-Pad Software Inc)软件拟合，结果显示其最大抑制率为71.5％(n＝8)，半数有效量(IC50)为0.79μM。
TMPF肽对T-型钙通道激活及失活动力学影响如图2B、2C所示，相对于对照组，1μMTMPF肽给药组激活曲线及失活曲线没有发生明显偏移及变化，表明TMPF肽与T-型钙通道直接结合并阻断时，没有引起通道动力学发生改变。
由上述实验结果可知，TMPF肽剂量依赖性抑制T-型钙离子通道电流，但不影响其通道电生理特性。
实施例3：TMPF肽对CFA诱导的炎性疼痛模型大鼠的疼痛行为的影响
(1)完全氟氏佐剂(CFA)炎性疼痛模型建立：取成年健康的雄性SD大鼠(180-220克)，面部须垫部皮下注射CFA，剂量为20微升/只。选取注射CFA第2天出现痛觉过敏的个体作为实验对象即实验组大鼠。
(2)面部机械痛阈测定：用von Frey细丝(Stoelting公司，型号NC12775)刺激大鼠须垫部，直至大鼠出现逃避行为视为阳性反应。从1克开始，连续刺激大鼠须垫部5次，若有三次出现阳性反应，则给予小一级的机械刺激；若未能出现阳性反应，则给予大一级的机械刺激。设定15克为最大的机械刺激强度，并且在双盲的条件下进行，将实验动物出现阳性反应的最小强度视为大鼠的机械痛阈值。
(3)TMPF肽显著翻转CFA模型大鼠的炎症性疼痛：
取正常大鼠24只，分成3组，每组8只。在CFA皮下注射后第2天，在大鼠三叉神经节定位注射不同浓度TMPF肽(1nmol及5nmol)，对照组大鼠三叉神经节定位注射相应生理盐水。如图3A所示，5nmol及1nmol TMPF肽给药组大鼠面部痛阈值在给药后3小时明显翻转CFA诱导的机械痛敏(#p<0.05vs.溶剂组；双因素方差分析)。由此可知，TMPF肽可以显著缓解CFA诱导的炎症性疼痛模型的疼痛行为反应，具有镇痛作用，且镇痛效果与TMPF肽的注射浓度成正相关。
另取正常大鼠16只，分成2组，每组8只。在CFA皮下注射后第2天，一组预先给药T-型钙通道阻断剂NNC 55-0396(2nmol)，30分钟后三叉神经节定位注射给药5nmol TMPF肽。另一组预先注射相应溶剂，30分钟后定位注射给药5nmol TMPF肽。NNC 55-0396(2nmol)可翻转CFA诱导的炎症性疼痛，随后继续给药5nmol TMPF肽则对面部痛阈值没有明显改变；而在对照组注射溶剂后，继续给药5nmol TMPF肽仍可显著升高面部痛阈值(**p<0.01vs.NNC55-0396组+CFA 2天；#p<0.05vs.溶剂组1小时；双因素方差分析)。
以上结果表明，TMPF肽通过抑制T-型钙通道对CFA诱导的炎症性疼痛模型大鼠疼痛具有镇痛作用。
实施例4：TMPF肽对三叉神经痛模型大鼠的疼痛行为的影响
(1)眶下神经慢性压迫性损伤(CCI-ION)模型：选取成年雄性健康的Sprague-Dawley大鼠(180–220克)，采用4％水合氯醛按照1毫升/100克的剂量以腹腔注射方式对大鼠进行麻醉，大鼠仰卧位固定在手术台上，于左上颌第一磨牙水平用无菌刀片划开，采用钝性弯曲的玻璃棒小心分离周围组织，直至暴露眶下神经。在其两端分别用5.0丝线进行结扎，间距为2毫米。手术结束后，用棉球擦拭血迹并涂抹青霉素钠防止感染。假手术组只需按上述方法钝性分离眶下神经，无需结扎。
(2)面部痛阈值测定：采用与实施例3相同的方法进行痛阈值测定。
(3)TMPF肽显著翻转三叉神经痛模型大鼠疼痛行为学：
取正常的大鼠20只，分成二组，每组10只。第一组为假手术组(sham)，第二组为三叉神经病理性痛(CCI-ION)模型组。分别经过7天、14天、21天、28天检测各组的面部痛阈值。检测结果如图4A所示，假手术组的面部痛阈值没有明显变化，CCI-ION模型组第14天的面部痛阈值显著降低，并可持续至少28天(*p<0.05，**p<0.01vs.假手术组；双因素方差分析)。
取前述方法得到的CCI-ION模型大鼠27只，每组9只大鼠。在CCI-ION模型建立后第14天，在第一组大鼠三叉神经节定位注射1nmol的TMPF肽，第一组大鼠三叉神经节定位注射5nmol的TMPF肽，对照组定位注射相应溶剂，分别经过1小时、3小时、6小时、12小时检测各组的面部痛阈值。检测结果如图4B所示，5nmol及1nmol TMPF肽给药后3小时后，大鼠的面部痛阈值明显上升，即可明显翻转CCI-ION模型大鼠的机械痛敏(*p<0.05vs.溶剂组；双因素方差分析)。由此可知，TMPF肽可以显著翻转CCI-ION神经病理痛模型大鼠的疼痛行为反应，具有镇痛作用。
在CCI-ION模型建立后第14天，一组预先对三叉神经节定位注射给药2nmol NNC55-0396，30分钟后定位注射给药5nmol TMPF肽。另一组预先注射相应溶剂，30分钟后定位注射给药5nmol TMPF肽。面部痛阈值的测试结果如图4C所示，定位注射NNC 55-0396可提高CCI-ION模型大鼠的面部痛阈值，但随后继续给药5nmol TMPF肽则对面部痛阈值没有进一步改变；而在对照组注射溶剂后，继续给药5nmol TNP-470仍可显著升高面部痛阈值(*p<0.05vs.CCI-ION模型第14天+NNC 55-0396组，#p<0.05vs.溶剂组+TMPF肽注射1小时；双因素方差分析)。
以上结果表明，TMPF肽对CCI-ION诱导的三叉神经痛模型大鼠疼痛具有显著镇痛作用，结合膜片钳电生理结果可知，TMPF肽通过阻断T-型钙通道对三叉神经痛产生显著的镇痛作用。
实施例5：TMPF肽对坐骨神经痛模型大鼠的疼痛行为的影响
本研究采用经典的坐骨神经分支(胫腓总神经)选择性损伤，建立坐骨神经痛大鼠模型(spared nerve injury,SNI)。
(1)大鼠SNI模型的建立：坐骨神经通过股二头肌切开暴露，然后用5.0丝线结扎胫腓总神经，同时切断。手术结束时，用5.0丝线将肌肉和皮肤分成两层缝合，然后在伤口上涂抹利多卡因凝胶。对于假手术，以上述相同方式暴露坐骨神经，不结扎和切断神经。
(2)足部痛阈值测定：大鼠在行为学测定之前，首先要置于铁丝网架上的有机玻璃箱中适应环境，该过程持续三天，每次1小时。用von Frey纤维丝垂直刺激大鼠右后足，刺激的力度以使探针弯成90度为准，持续时间不大于4秒，当大鼠出现受试足快速抬起、躲避、舔咬等动作时则视为阳性反应，否则视为阴性反应。当出现阳性反应时给予小一级强度的刺激，当出现阴性反应时给予大一级强度的刺激。当出现一次阳性反应和阴性反应的骑跨，再按上述方法测定4次刺激。最终缩腿阈值(PWT)根据公式：50％threshold(克)＝(10[X f +K δ ])/10000计算得到。其中Xf为最后一根用于测定的纤维丝的刺激强度，Kδ：根据阳性反应和阴性反应出现的模式所对应得到的数值。
(3)TMPF肽对SNI模型大鼠的疼痛行为的影响
取正常的大鼠18只,分成二组，每组9只。第一组为假手术组，第二组为坐骨神经痛(SNI)模型组，分别经过3天、7天、10天、14天检测各组的痛阈值。检测结果如图5A所示，SNI模型组在第3天机械痛阈值达到最低3.1±0.6g，并可持续至少14天(***p<0.001vs.假手术组；双因素方差分析)。
取前述方法制备得到的SNI模型大鼠27只，分成三组，每组9只。在SNI模型建立后第7天，在第一组大鼠的鞘内注射5nmol的TMPF肽，第二组大鼠鞘内注射1nmol的TMPF肽，对照组的大鼠鞘内注射相应溶剂，分别经过1小时、3小时、6小时检测各组的缩爪机械痛阈。检测结果如图5B所示，5nmol及1nmol TMPF肽鞘内给药可明显翻转SNI模型大鼠的机械痛敏(*p<0.05vs.溶剂组；双因素方差分析)。由此可知，TMPF肽可以显著翻转SNI神经病理痛模型大鼠的疼痛行为反应，具有镇痛作用。
在SNI模型建立后第7天，预先鞘内给药2nmol NNC 55-0396，30分钟后鞘内注射给药5nmol TMPF肽。另一组鞘内给药预先注射相应溶剂，30分钟后鞘内给药5nmol TMPF肽。机械痛阈值的测试结果如图5C所示，鞘内给药NNC55-0396可显著抑制SNI模型大鼠机械痛阈，但随后继续给药5nmol TMPF肽则对痛阈值没有明显改变；而在对照组注射溶剂后，继续给药5nmol TMPF肽仍可显著升高机械性痛阈值(*p<0.05vs.SNI模型第7天+NNC 55-0396组，#p<0.05vs.溶剂组+TMPF肽注射1小时的时间点；双因素方差分析)。
以上结果表明，TMPF肽对SNI诱导的坐骨神经痛模型大鼠疼痛具有显著镇痛作用，且TMPF肽对SNI模型大鼠的镇痛作用是通过对T-型钙通道的抑制作用实现的。
实施例6：TMPF肽对偏头痛模型大鼠的疼痛行为的影响
本研究采用经典的电刺激上矢状窦硬脑膜方法，建立偏头痛大鼠模型(ES模型)。
(1)大鼠偏头痛模型建立：取成年健康的雄性SD大鼠，麻醉，固定于脑立体定位仪上。在大鼠颅骨表面Bregma点前4mm、后6mm处各钻一个直径约1mm的孔洞，将电极垂直插入至硬脑膜，然后用牙科水泥将其固定在颅骨上。术后3-5天开始连续3天的行为学适应性刺激训练，剔除行为异常大鼠，其余大鼠随机分组。大鼠适应后进行连续7天的电刺激，电刺激参数为：频率20Hz，脉宽0.25ms，电压3-6V，时间10min。电压的确定标准为频率1Hz时电路连通且大鼠出现节律性点头或胡须颤动时的最小电压，随后立即将频率调整至20Hz进行电刺激。假手术组大鼠不进行电刺激，其余操作均相同。
(2)面部机械痛阈测定：采用与实施例3相同的方法进行痛阈值测定。
(3)TMPF肽对偏头痛模型大鼠的疼痛行为的影响
如图6A所示，取大鼠24只，分成3组，每组8只。在偏头痛模型建立后第4天，在第一组为假手术组，第二组为硬脑膜电刺激模型组，第三组为大鼠TG内定位注射5nmol的TMPF肽，分别检测各组的面部痛阈值。TG内定位注射5nmol的TMPF肽可明显翻转硬脑膜电刺激模型组大鼠面部机械痛反应(*p<0.05vs.假手术组；#p<0.05vs.硬脑膜电刺激组；双因素方差分析)，而假手术组的面部痛阈值没有明显变化。由此可知，TMPF肽可以显著翻转硬脑膜电刺激诱导的偏头痛模型大鼠的面部机械疼痛行为反应，具有镇痛作用。
在偏头痛模型建立后第4天，预先TG内定位注射给药1nmol NNC55-0396，30分钟后TG内定位注射5nmol TMPF肽。另一组TG内预先定位注射相应溶剂，30分钟后TG内定位注射5nmol TMPF肽。机械痛阈值的测试结果如图6B所示，NNC 55-0396可显著抑制偏头痛模型大鼠机械痛阈，但随后继续给药5nmol TMPF肽则对痛阈值没有明显改变；而在对照组注射溶剂后，继续给药5nmol TMPF肽仍可显著升高机械性痛阈值(*p<0.05vs.偏头痛模型第4天+NNC 55-0396组，#p<0.05vs.溶剂组+TMPF肽注射1小时的时间点；双因素方差分析)。
以上结果表明，TMPF肽对偏头痛模型大鼠疼痛具有显著镇痛作用，且T-型钙通道的抑制作用参与了TMPF肽对偏头痛模型大鼠的镇痛作用。
本发明通过全细胞膜片钳研究方法，在实施例1及实施例2中，研究了TMPF肽对大鼠TG神经元不同类型电压门控离子通道电流及通道动力学的影响，通过电压钳记录方法，发现TMPF肽可选择性显著抑制大鼠TG神经元低电压门控T-型钙通道电流，该作用具有量效关系，但并不影响通道的生理特性。
此外，本发明通过动物学实验，在实施例3、实施例4、实施例5及实施例6中，研究了TMPF肽对CFA诱导的炎性痛模型、CCI-ION诱导的三叉神经痛模型、SNI诱导的坐骨神经痛模型、及硬脑膜电刺激诱导的偏头痛模型大鼠痛阈值的影响，发现TMPF肽可以显著缓解上述四种疼痛模型大鼠疼痛行为反应，具有镇痛作用。此外，结合上述全细胞膜片钳研究数据，在行为学水平，阐明了TMPF肽的镇痛作用，主要是通过其抑制T-型钙通道而产生。
本发明发现了TMPF肽可显著抑制T-型钙离子通道，显著翻转炎性疼痛，三叉神经痛，坐骨神经痛及偏头痛模型大鼠痛敏反应，具有明显的镇痛作用。因此，TMPF肽还可应用在制备用于治疗和/或预防以T-型钙离子通道为靶点的疾病药物中，所述疾病包括如炎性疼痛，三叉神经痛、坐骨神经痛、偏头痛、癌症痛、心率失常及癫痫等。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (3)

1.一种TMPF肽在制备治疗和/或预防以T-型钙离子通道为治疗靶点的疾病的药物中的应用，其特征在于，TMPF肽的氨基酸序列为Thr-Met-Pro-Phe-Leu-Phe-Cys-Asn-Val-Asn-Asp-Val-Cys-Asn-Phe-Ala-Ser-Arg-Asn-Asp-Tyr-Ser-Tyr-Trp-Leu；所述疾病为炎性疼痛、三叉神经痛、坐骨神经痛或偏头痛。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述TMPF肽用于抑制T-型钙离子通道。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物由0.1-100%的TMPF肽和0-99.9%的药用辅料组成。
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