CN112851785A - 一种具有缓解吗啡在神经病理性疼痛中的镇痛耐受性的短肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有缓解吗啡在神经病理性疼痛中的镇痛耐受性的短肽及其应用，所述短肽为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列多肽，命名为多肽P10581。本发明合成肽P10581是SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽，不仅有一部分镇痛效果，多次使用不产生耐受性，低剂量P10581还能改善/消除吗啡耐受性，为以后临床上治疗吗啡耐受和新药开发提供新的思路。

Description

一种具有缓解吗啡在神经病理性疼痛中的镇痛耐受性的短肽 及其应用

技术领域

本发明属于镇痛药物技术领域，具体涉及到一种具有缓解吗啡在神经病理性疼痛中的镇痛耐受性的短肽及其应用。

背景技术

阿片类药物如吗啡是临床疼痛治疗中重要的选择，但反复使用，会产生生理耐受性和依赖性。其临床表现主要是镇痛耐受性，具体表现为持续给予阿片类药物后镇痛效果逐渐减弱甚至消失，需要增加阿片类药物剂量才能获得同等的镇痛效果。

目前，吗啡是临床上最有效的快速缓解多种类型疼痛的药物之一，但是由于其长期用药产生的严重药物耐受性，往往需要增加剂量，但同时会导致吗啡加量而疼痛却加剧的“矛盾”现象，限制了吗啡的临床应用。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有药物中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有镇痛药物中的不足，提供一种具有缓解吗啡在神经病理性疼痛中的镇痛耐受性的短肽。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种具有缓解吗啡在神经病理性疼痛中的镇痛耐受性的短肽，所述短肽为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列多肽，命名为多肽P10581。

作为本发明所述具有缓解吗啡在神经病理性疼痛中的镇痛耐受性的短肽的一种优选方案，其中：所述多肽P10581，来源于蜘蛛毒素GsMTx4位于loop2和loop3的两个环状结构。

因此，本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种具有缓解吗啡在神经病理性疼痛中的镇痛耐受性的短肽的应用。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述应用，包括，多肽P10581在制备减轻神经病理性疼痛、具有反转吗啡85％镇痛作用耐受性药物中的应用。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述应用，包括低剂量多肽P10581在制备反转吗啡对神经病理性疼痛镇痛作用的耐受性药物中的应用。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述低剂量多肽P10581，包括0.01μg/kg、0.025μg/kg、0.1μg/kg、0.2μg/kg和0.4μg/k。

本发明有益效果：

(1)本发明合成肽P10581是SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽，不仅可以缓解神经病理性疼痛，高剂量(≥7.2μg/kg)多次反复使用不产生耐受性；重要的是低剂量P10581还能改善/缓解吗啡85％耐受性，为以后临床上利用吗啡治疗神经病理性疼痛和新药开发，以及药物组合应用提供新的思路。

(2)本发明合成肽P10581是SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽，能够缓解吗啡对神经病理性疼痛镇痛作用产生的耐受性；通过实验发现P10581对不同疼痛模型下引起的机械性痛觉过敏的镇痛作用较强且不具有耐受性，虽然其镇痛效果不如吗啡那样强烈，本发明意外发现，在吗啡连续注射3天后(每天2次)，吗啡镇痛效果降低到原来的21％，说明吗啡产生镇痛耐受性；但0.4μg/kg P10581能够100％完全反转吗啡对神经病理性疼痛镇痛作用产生的耐受性；吗啡连续给药5天后，其镇痛作用几乎消失，但低剂量多肽0.4μg/kgP10581仍然可以反转吗啡～85％的镇痛作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明反复注射P10581减轻大鼠神经病理性疼痛而不产生镇痛耐受性试验结果图；

图2为本发明反复注射吗啡对大鼠神经病理性疼痛的镇痛作用产生耐受性图；

图3为本发明标准化后的吗啡和合成多肽P10581对大鼠神经病理性疼痛镇痛耐受性的比较图；

图4为本发明合成肽P10581在反复用药8天前和反复用药8天之后多肽对大鼠神经病理性疼痛的剂量依赖性的比较图；

图5为本发明反复注射前和注射后的半数有效量(IC50)差异对比图；

图6为本发明低剂量0.1μg/kg的P10581(i.d.)对大鼠神经病理性疼痛的痛阈值影响对比图；

图7为本发明短肽P10581(0.1μg/kg)缓解吗啡对大鼠神经病理性疼痛的镇痛耐受性对比图；

图8为本发明标准化后不同剂量合成肽P10581对吗啡在神经病理性疼痛镇痛耐受性的影响图；

图9为本发明多肽P10581不同浓度在吗啡连续注射第三天(i.d.每天两次)对吗啡在神经病理性疼痛痛阈值的影响比较图；

图10为本发明吗啡连续注射3天后多肽(0.2μg/kg和0.4μg/kg)缓解吗啡耐受性强度比较图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明实验动物和仪器：

选择健康成年雄性SD大鼠(8周以上)，体重180g-220g，购于徐州医科大学实验动物中心。

38500-PAM压力应用测量系统(Μgo Basile Biological Research Apparatμs,Comerio–Varese,Italy)由两部分组成，一部分为手持单元，另一部分为综合电子单元。手持单元为力传感器，该力传感器是根据Randall-Selitto测痛仪而设计，综合电子单元可自动记录施加在大鼠左侧后足足底最大的机械缩足反射阈值。

本发明大鼠神经病理性疼痛模型的制备：

神经病理性疼痛模型：按照文献(Bennett GJ,et al.Pain,1988)描述的方法制备CCI神经病理性疼痛模型：大鼠经腹腔注射10％水合氯醛(300mg/kg)麻醉，将其置于超净台内，手术区备皮碘伏消毒。在左下肢背肢沿肌肉纹理走行做斜形切口，经股二头肌肌间行钝性分离暴露坐骨神经干中上段，在坐骨神经分叉处用浸泡于无菌水15分钟的4-0丝线做4道结扎(各道间距为1mm)。

结扎线松紧度以引起大鼠手术侧腿部轻微抽搐而不影响神经外膜的血运为宜，然后逐层缝合伤口，术后根据情况用碘伏擦试伤口，待大鼠完全清醒后放回鼠笼中静养。造模后5d测大鼠机械缩足阈值，明显降低者视为CCI模型建模成功，造模不成功的大鼠予以剔除。

实施例1

机械性痛觉过敏检测：测定合成肽P10581和吗啡对大鼠神经病理性疼痛的镇痛效果及镇痛耐受性。

(1)选取180g-220g健康成年雄性SD大鼠，在其尾巴编号后放入同一鼠笼中(共15只)。

(2)在测量房间适应2h，待大鼠安静后用38500-PAM压力应用测量系统(UgoBasile Biological Research Apparatus,Comerio–Varese,Italy)的锥形尖端对准大鼠左后足足底中心部位，以恒定的力率(30gf/s)测量大鼠的机械性缩足阈值，最大测量时间设定为15s(当测量值大于450gf时，会对大鼠造成损伤)。

(3)记录大鼠左后足缩时的机械性缩足阈值，若受试大鼠15s后仍未出现缩足反射，停止测量。每只大鼠重复测量3-5次，每次间隔5-10min，取平均值。测量完毕后让大鼠休息数小时，随后开始制备CCI神经病理性疼痛模型。

(4)造模后第5天及第6天上午测大鼠机械缩足阈值，剔除造模失败大鼠。并且在造模后第6天将造模成功大鼠随机分为3组，A组注射生理盐水，B组注射5mg/Kg吗啡，C组左后足底皮内注射8μg/KgP10581,于上午注射完药物后1h轮流记录各组大鼠左后足缩时的机械性缩足阈值，每只大鼠均重复测试3-5次(每次测试时间间隔为5-10min)，取缩足反射阈值的平均值为该大鼠实际缩足反射阈值(单位为：g)。

各组注射药物时间固定为造模后第6天至第14天上午9：00和下午5：30，并隔天测量上午给药前后各组机械性缩足阈值。造模后第15天，B组注射8μg/kgP10581，C组注射5mg/kg吗啡，记录两组大鼠左后足缩时的机械性缩足阈值。

图1为反复注射P10581减轻大鼠神经病理性疼痛试验对比图，可以看出，反复注射P10581(i.d.8μg/kg，每天2次)可以减轻大鼠神经病理性疼痛，但不产生镇痛耐受。注：第10天，P10581的镇痛效果与吗啡(5mg/kg,i.d.)镇痛效果无显著差异。

图2为反复注射吗啡对大鼠神经病理性疼痛的镇痛作用产生耐受性图，可以看出：反复注射吗啡(i.d.5mg/kg,每天2次)对大鼠神经病理性疼痛的镇痛作用产生耐受性，即：镇痛效果逐渐降低，最后吗啡完全失去镇痛作用；但7.2μg/kg的P10581仍然可以反转大鼠神经病理性疼痛阈值，说明多肽镇痛效果不受吗啡耐受性影响。

图3为标准化后的吗啡和合成多肽P10581对大鼠神经病理性疼痛镇痛作用耐受性的比较图，可以看出，反复注射吗啡对大鼠神经病理性疼痛产生镇痛耐受性，而合成肽不产生镇痛耐受性。本实验中，大鼠神经病理性疼痛由CCI模型诱导。

实施例2

测定合成肽P10581在反复给药前和反复给药9天(每天2次)后，对大鼠神经病理性疼痛的剂量依赖性的比较。

本实施例实验步骤与实施例1中的实验步骤类似，有几点不同的是：

(1)实验二选取共计30只180g-220g健康成年雄性SD大鼠，CCI造模后第8天将造模成功大鼠随机分为6组，A组注射0.45μg/kg P10581,B组注射0.9μg/kgP10581，C组注射1.8μg/kgP10581，D组注射3.6μg/kg P10581，E组注射7.2μg/kg P10581，F组注射8.5μg/kgP10581，1.5h后记录各组大鼠机械性缩足阈值。

(2)造模后第8天下午5：30每组大鼠均注射7.2mg/kg P10581，此后连续注射9天至第14天(各组大鼠均于每天上午9：00及下午5：30注射7.2μg/kg P10581)，并隔天测量上午给药前后大鼠机械性缩足阈值(即：每天自始至终均注射7.2μg/kg P10581)。

(3)造模后第15天再按原先的6个分组分别注射不同剂量的P10581，1.5h后记录各组不同剂量对大鼠机械性缩足阈值的影响。

图4为合成肽P10581在反复用药8天前和反复用药8天之后多肽对大鼠神经病理性疼痛的剂量依赖性的比较图，可以看出，合成肽P10581对大鼠神经病理性疼痛的剂量依赖性，不受反复注射P10581(i.d.7.2μg/kg，每天2次)影响，再次证明P10581对大鼠神经病理性疼痛不产生镇痛耐受。注：剂量7.2μg/kg P10581对大鼠神经病理性疼痛达到最大镇痛效果。此实验从另一个角度证明P10581对大鼠神经病理性疼痛镇痛效果，不受反复用药的影响。

注：P0581剂量依赖性分别在反复注射前(Before)和后(After，第9天)取得。

图5为反复注射8天前和反复注射8天后(即：第9天)的半数有效量(IC50)差异对比图，可以看出，反复注射前和注射后的半数有效量(IC50)没有有意差，进一步验证本实验发明多肽反复用药对大鼠神经病理性疼痛不产生耐受性的特性。

实施例3

测定低剂量(0.01μg/kg～0.4μg/kg)合成肽P10581对吗啡在对神经病理性疼痛的镇痛作用耐受性的影响。

本实施例实验步骤与实施例1中实验步骤类似，但有几点不同：

(1)实验三选取共计15只180g-220g健康成年雄性SD大鼠，CCI造模后第6天将造模成功大鼠随机分为3组，A组注射0.1μg/kg P10581,B组注射5mg/kg吗啡，C组先注射0.1μg/kg P10581，30min后再注射5mg/kg吗啡，1h后记录各组大鼠机械性缩足阈值。

(2)造模后第6天下午按分组注射药物，此后第7天至第12天各组大鼠均于每天上午9：00及下午5：30注射药物，并隔天测量上午给药前后大鼠机械性缩足阈值。

图6为低剂量0.1μg/kg的P10581(i.d.)对大鼠神经病理性疼痛的痛阈值影响对比图。可以看出，低剂量0.1μg/kg的P10581(i.d.)对大鼠神经病理性疼痛的痛阈值不产生影响，说明0.1μg/kg的P10581不具有镇痛作用；

图7为短肽P10581缓解吗啡对大鼠神经病理性疼痛的镇痛耐受性示意图，图中吗啡组(Mor)为阳性对照组。可以看出，0.1μg/kg短肽P10581缓解了吗啡对大鼠神经病理性疼痛的镇痛耐受性(Mor+0.1P10581组)；吗啡每天注射两次(5mg/kg,i.d.)，多肽在吗啡注射半小时前给药(0.1μg/kg,i.d.)

实施例4

测定不同浓度(低剂量)合成肽P10581对吗啡在对神经病理性疼痛的镇痛作用耐受性的影响。

本实施例实验步骤与实施例1中实验步骤类似，不同的是：

(1)实验四选取共计30只180g-220g健康成年雄性SD大鼠，CCI造模后第6天将造模成功大鼠随机分为6组，A组注射生理盐水,B组注射0.01μg/kg P10581，C组注射0.025μg/kgP10581，D组注射0.2μg/kgP10581，E组注射0.4μg/kgP10581，30min后各组均再注射5mg/kg吗啡，1h后记录各组大鼠机械性缩足阈值。

(2)造模后第6天下午按分组注射药物，此后第7天至第10天各组大鼠均于上午9：00及下午5：30注射药物，并隔天测量(除吗啡组外)上午给药前后大鼠机械性缩足阈值。

上述实验设计均遵循随机、双盲的实验设计原则。

数据统计和分析：采用Grapher 5软件进行作图，SPSS16.0软件对实验数据进行统计分析，所有的计量数据均用均数±标准误(Mean±SE)表示。两独立样本均数比较应用t检验，方差不齐则应用t’检验。多组样本同一时间点机械缩足阈值的比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance)的LSD法进行检验，方差不齐选择Tamhane法进行检验，多组样本不同时间点机械缩足阈值的比较采用双因素方差分析(two-way analysis ofvariance)。检验水准α＝0.05，P<0.05认为差异具有统计学意义。

图8为标准化后不同浓度合成肽P10581对吗啡连续注射5天(每天2次)在神经病理性疼痛镇痛耐受性的影响图，图9为吗啡连续注射第三天(i.d.每天两次)不同浓度P10581对吗啡在神经病理性疼痛痛阈值的影响图，△PWT(drug)＝PWT(post-drug)-PWT(pre-drug)；△PWT(Baseline)＝PWT(before CCI)-PWT(after CCI).多肽P10581剂量分别为：0.01μg/kg，0.025μg/kg，0.1μg/kg，0.2μg/kg和0.4μg/kg。其中剂量0.4μg/kg的合成肽可以完全反转吗啡对神经病理性镇痛作用的耐受性。

图10为吗啡连续注射3天和5天后，多肽(0.2μg/kg和0.4μg/kg)缓解吗啡耐受性强度比较图,多肽缓解吗啡耐受性强度用△PWT(drug)/△PWT(Baseline)表示,其中：△PWT(drug)表示当天上午注射Mor+P10581前后大鼠痛阈值之差。可以看出，本发明多肽P10581，在吗啡连续注射第三天(i.d.每天两次)后，0.4μg/kg可以完全反转吗啡在神经病理性疼痛的耐受性；在吗啡连续用药第5天(i.d.每天两次)后，虽然吗啡镇痛效果几乎完全消失，0.4μg/kgP10581任然可以反转吗啡～85％的镇痛效果。合成肽P10581对吗啡在对神经病理性疼痛的镇痛耐受性均有不同程度的缓解作用，因此具有浓度依赖性。注意：和吗啡最初(反复注射之前，图10：Before Rept.Inj.)镇痛效果相比较，剂量0.2μg/kg可以反转90.1％吗啡的镇痛效果，而剂量0.4μg/kg可以完全反转吗啡连续注射3天后对神经病理性疼痛镇痛作用的耐受性。

本发明所使用的神经病理性疼痛模型是目前比较公认的研究疼痛的经典模型，与人体的慢性神经病理性疼痛也比较相符。目前关于吗啡耐受性治疗的基础研究很多，但临床上仍缺乏改善吗啡耐受的有效措施和方法，本发明多肽P10581(7.2～5.4μg/kg)不仅有一部分镇痛效果，多次使用不产生耐受性，低剂量(0.01～0.4μg/kg)P10581还能改善吗啡耐受性，为以后临床上治疗神经病理性疼痛以及，缓解/消除吗啡对神经病理性疼痛的耐受性和新药开发提供新的思路。

本发明合成肽P10581是SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽，能够缓解/消除吗啡对神经病理性疼痛镇痛作用产生的耐受性。本发明通过比较GsMTx4和对MS通道有较弱抑制作用的GsMTx2发现，两者在loop2和loop3上的氨基酸同源性高达50％以上，于是推测loop2和loop3最可能是GsMTx4抑制MS离子通道的关键片段，于是本发明根据loop2和loop3上的氨基酸片段合成了一系列低分子量多肽，通过实验发现P10581对不同疼痛模型下引起的机械性痛觉过敏的镇痛作用较强且不具有耐受性，虽然其镇痛效果不如吗啡强烈，本发明意外发现P10581能够缓解/消除吗啡对神经病理性疼痛镇痛作用产生的耐受性。

目前，临床用于预防和治疗阿片类药物耐受措施主要为阿片类药物减量及阿片类药物替换，许多其他的治疗方法(如合并使用小剂量的阿片受体拮抗剂或使用胆囊收缩素(CCK)和NMDA受体拮抗剂等)仍处于临床前或早期临床研究，还未广泛投入临床使用。关于吗啡耐受机制及其治疗的临床实验较少，临床上仍未有抑制吗啡耐受形成的有效措施和方法，本发明的合成肽P10581可以为以后临床上治疗吗啡耐受和新药开发提供新的思路。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 一种具有缓解吗啡在神经病理性疼痛中的镇痛耐受性的短肽及其应用

<141> 2021-03-15

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> Grammostola spatulata

<400> 1

Trp Lys Cys Asn Pro Asn Asp Asp Lys Cys Cys Arg Pro Lys Leu Lys

1 5 10 15

Cys

Claims (6)

1.一种具有缓解吗啡在神经病理性疼痛中的镇痛耐受性的短肽，其特征在于：

所述短肽为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列多肽，命名为多肽P10581。

2.如权利要求1所述具有缓解吗啡在神经病理性疼痛中的镇痛耐受性的短肽，其特征在于：所述多肽P10581，来源于蜘蛛毒素GsMTx4位于loop2和loop3的两个环状结构。

3.如权利要求1或2所述具有缓解吗啡在神经病理性疼痛中的镇痛耐受性的短肽的应用。

4.如权利要求3所述应用，其特征在于：所述应用，包括，

多肽P10581在制备减轻神经病理性疼痛、具有反转吗啡85％镇痛作用耐受性药物中的应用。

5.如权利要求3所述应用，其特征在于：所述应用，包括，

低剂量多肽P10581在制备反转吗啡对神经病理性疼痛镇痛作用的耐受性药物中的应用。

6.如权利要求5所述应用，其特征在于：所述低剂量多肽P10581，包括0.01μg/kg、0.025μg/kg、0.1μg/kg，0.2μg/kg和0.4μg/kg。

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