CN103721243A

CN103721243A - 一种生物活性多肽在制备镇痛药物中的应用方法

Info

Publication number: CN103721243A
Application number: CN201410035340.8A
Authority: CN
Inventors: 邓梅春; 罗旋; 陈汉春; 王军
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2014-01-24
Filing date: 2014-01-24
Publication date: 2014-04-16

Abstract

本发明公开了一种生物活性多肽在制备镇痛药物中的应用方法，所述的生物活性多肽为虎纹捕鸟蛛毒素-XVI，试验验证该毒素具有明显的镇痛作用，无明显毒副作用，在制备炎性疼痛或热痛镇痛药物时，配制肌肉注射制剂的剂量为112.7nmol/kg。在制备术后疼痛镇痛药物时，配制肌肉注射制剂的剂量为56.3nmol/kg，均明显小于吗啡的用量。HWTX-XVI的半数有效作用剂量EC₅₀为17.7nmol/kg。从作用时间上比较，HWTX-XVI作用时间较吗啡长，持续到给药后3.5h，比吗啡长了至少1h。HWTX-XVI对运动协调机能没有影响。

Description

一种生物活性多肽在制备镇痛药物中的应用方法

技术领域

本发明涉及一种活性多肽在制备药品中的用途，尤其是用化学法制备的虎纹捕鸟蛛毒素提取物-虎纹捕鸟蛛毒素-XVI（简写为HWTX-XVI）在制备镇痛药物中的用途。

背景技术

痛觉是一种与组织损伤或潜在的损伤相关的不愉快的情感体验和主观感觉，它是感觉神经系统的功能，是机体自我保护的一种反射机制。疼痛是多种疾病的症状，它使患者感受痛苦，尤其是剧痛，还可能引起生理功能紊乱，甚至休克。镇痛药主要作用于中枢神经系统，选择性抑制和缓解各种疼痛，减轻疼痛而致恐惧紧张和不安情绪，镇痛同时不影响其它感觉如知觉、听觉，并且能保持意识清醒。目前常用的镇痛药物主要有消炎镇痛药和麻醉性镇痛药两类。

消炎镇痛药以阿司匹林为代表，通过抑制内环氧化酶，使前列腺素生成减少，减少神经末梢对致痛物质的敏感性，达到抗炎镇痛，主要用于接触炎症性疼痛和其它钝痛。后者以吗啡为代表，其作用部位主要在丘脑和大脑皮层，作用于中枢神经系统中的μ型阿片受体，以缓解锐痛、钝痛和内脏绞痛，从而产生镇痛作用，主要用于各种疾病所引起的疼痛和手术后病人的严重疼痛，特别是晚期癌症疼痛。但是目前这种以吗啡为代表的麻醉性镇痛药物存在成瘾性强，戒断症状严重，病人必须不断增加剂量才能维持镇痛效果，而且最终导致对这类药物失效，同时对神经损伤性疼痛无疗效等主要缺点。如何探寻一种能够克服上述缺陷的新的镇痛药物是目前研究的热点和趋势。

发明内容

本发明的目的旨在于提供一种生物活性多肽虎纹捕鸟蛛毒素提取物-虎纹捕鸟蛛毒素-XVI在制备镇痛药物中的应用，经过验证这种镇痛药物能够明显缓解病人的疼痛，且没有类似吗啡等药物的成瘾毒副作用。

一种生物活性多肽在制备镇痛药物中的应用方法，所述的生物活性多肽为虎纹捕鸟蛛毒素-XVI，其氨基酸序列为：

NH₂-Cys Ile Gly Glu Gly Val Pro Cys Asp Glu Asn Asp Pro Arg Cys Cys Ser Gly Leu Val Cys Leu Lys ProThr Leu His Gly Ile Trp Tyr Lys Ser Tyr Tyr Cys Tyr Lys Lys-OH，所述的虎纹捕鸟蛛毒素-XVI用于制备镇痛药物。

所述的虎纹捕鸟蛛毒素-XVI的N端第1位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之间，N端第8位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间，N端第15位半胱氨酸和第36位半胱氨酸之间分别形成二硫键。

该虎纹捕鸟蛛毒素-XVI也可以作为单一有效活性组分用于制备镇痛药物；还可以制备成肌肉注射的镇痛药物。

在制备炎性疼痛或热痛镇痛药物时，配制肌肉注射制剂的剂量为110-115nmol/kg，优选112.7nmol/kg。

在制备术后疼痛镇痛药物时，配制肌肉注射制剂的剂量为55-60nmol/kg，优选56.3nmol/kg。

HWTX-XVI的半数有效作用剂量EC₅₀为17.7nmol/kg。

本发明采用的虎纹捕鸟蛛毒素-XVI是新型哺乳动物神经毒素，现有技术中透露其是一种选择性作用于N-型钙通道的抑制剂，使之有希望成为开发治疗N-型钙通道相关疾病的先导分子，但在医学领域，虎纹捕鸟蛛毒素-XVI是否能够真正的制备相关药物或者该毒素以什么形式治疗相关疾病，都是需要大量探索性试验去验证的。本发明通过大量试验验证该毒素具有明显的镇痛作用，而且没有明显的毒副作用，在制备炎性疼痛或热痛镇痛药物时，配制肌肉注射制剂的剂量为112.7nmol/kg。在制备术后疼痛镇痛药物时，配制肌肉注射制剂的剂量为56.3nmol/kg，均明显小于吗啡的用量。HWTX-XVI的镇痛活性主要体现在第二相痛,而对第一相痛的镇痛效果不明显,提示HWTX-XVI对机械和化学刺激直接引发的疼痛可能没有镇痛作用。发现HWTX-XVI的镇痛作用具有剂量依赖性，呈现明显的正相关。HWTX-XVI的半数有效作用剂量EC₅₀为17.7nmol/kg。从作用时间上比较，HWTX-XVI作用时间较吗啡长，持续到给药后3.5h，比吗啡长了至少1h。HWTX-XVI对运动协调机能没有影响。

附图说明

图1为肌肉注射HWTX-XVI和吗啡对福尔马林所致大鼠炎性疼痛的镇痛作用；

图2为HWTX-XVI对大鼠福尔马林致炎疼痛模型镇痛作用的浓度依赖性；

图3为肌肉注射HWTX-XVI对大鼠手术后疼痛的镇痛作用；

图4为肌肉注射HWTX-XVI对热刺激所致大鼠热痛的镇痛作用；

图5为肌肉注射HWTX-XVI对大鼠平衡协调能力的影响。

具体实施方式

为了更好的理解和更充分公开本发明，下面将通过肌肉注射用药途径，采用福尔马林致炎疼痛实验动物模型与手术后动物疼痛模型来说明HWTX-XVI的镇痛作用。

1、实验材料和方法

1.1实验用主要原料

实验用HWTX-XVI是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化而得到，同时通过RP-HPLC和MALDI-TOF质谱仪鉴定，其纯度为98%以上；SD实验大鼠由中南大学湘雅医学院动物房提供，体重160-210g之间，肌注生理盐水与肌注吗啡均购自中南大学湘雅医院。

1.2肌肉注射给药

首先用75%的酒精对大鼠一侧大腿进行消毒处理，然后用注射器从大腿外侧距膝盖骨2/3处由后向前进针，进针角度以30度为宜，刺入肌肉大约0.5cm即可，注意不要刺入太深，以免伤及骨头。

1.3福尔马林致炎疼痛实验

选取无运动功能障碍的大鼠进行实验。实验时室温24-26℃，湿度40-60%。实验时间9∶00－18∶00，隔绝噪音。大鼠在试验开始前3d被放置在观察室（一个20×20×30有机玻璃盒，并提供足够食物及饮水）中每天至少30min，使其适应实验环境，消除恐惧及不安。大鼠实验前至少在观察室内再适应30min，然后按前述的方法进行给药。给药30min后在大鼠后脚掌皮下注射5%福尔马林液50μl，立即进行测试，记录每个5min内足底皮下注射了福尔马林液的大鼠行为表现的疼痛评分值（S）。福尔马林的致痛定量是以消耗在不同行为状态的总时间来衡量的，不同的行为状态是指动物舔、咬、摇被注射的足或减轻在被注射足上所承受重量的各种行为表现,测定时间持续60min。

1.4术后疼痛实验

大鼠经10%水合氯醛麻醉后，采用Brennan的方法，制作术后疼痛模型，即无菌消毒后在大鼠左后足掌中间距离足跟0.5cm处向脚趾方向纵行切开皮肤、筋膜，长约1.0cm，用眼科镊提起跖肌，纵行切开，但未损伤其起止部位，轻压止血后用5～0尼龙线缝合皮肤，局部给予抗生素软膏预防感染。建立术后疼痛模型的大鼠随机分为3组，每组8只，并于术后1.5h按前述的方法采用肌肉给药的方式分别注射112.7nmol/kg(大鼠体重)HWTX-XVI、16.5mmol/kg盐酸吗啡和100ul生理盐水。各组大鼠分别于给药前(基础痛阈值)、给药后0.5h、1h、1.5h、2.5h、3.5h，按Chaplan法应用von Frey细丝法检测机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)，即将大鼠置于有机玻璃罩内,底为用金属丝制成的网格垫,试验前使之适应30min,用一套（10根）带有不同弯曲压力的von Fre y细丝刺激大鼠造模足掌底部中间靠近切口的区域。从0.06g开始,以up-down法推测阈值,并在阈值上下各刺激5次(每次3-4s)，用内推法算出50%反应阈值(即引起5次试验中出现3-5次反应的值)。最大折力为34.9g,大于此值时记为34.9g。每次试验至少间隔15s,等待刺激引起的行为反应(如舔足等)完全消失后再给予下一次刺激。实验时室温24-26℃，湿度40-60%。实验时间9∶00－18∶00，隔绝噪音。机械刺激棒力度如表4-4所示：共10根，分别代表10种不同的力量。

表1 机械刺激棒力度

编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											力量（g）	34.9	26.2	14.8	8.1	4.85	0.77	0.43	0.25	0.11	0.06

1.5热板实验

选择清醒正常无运动障碍的大鼠进行热板实验。热缩腿阈值的测定参照文献的方法^[151]，在ZH-YLS-6B智能热板测痛仪（淮北正华生物仪器有限公司）上进行。实验前先将热板仪温度调节到48.5℃，待温度稳定后，将大鼠半固定，并使其左后足接触热板表面，同时开始计时，直到大鼠出现缩腿反应停止计时，这段时间即为热缩腿阈值。所有大鼠在给药前均进行3次痛阈的测定，两次测定之间间隔至少5min，取其平均值作为基础痛阈，选择基础痛阈大于3s并小于10s的大鼠进行实验，并随机分为3组，每组8只，采用肌肉给药的方式分别注射112.7nmol/kg HWTX-XVI、16.5mmol/kg盐酸吗啡和100μl生理盐水。分别在给药后0、30、45、60min测定热痛阈值。在测试过程中，痛阈不得超过60s，超过60s的一律记为45s，并立即停止实验，以免烫伤。

1.6转棒实验

转棒实验时选取处于清醒正常状态的动物，对有运动障碍者、双后肢足底均有损伤者予以剔除。转棒实验在自制的Rota-rod上进行(湖大科教器材有限公司)，大鼠从转棒上掉下来的时间阈值的测定参照文献的方法：将大鼠放到转速为2rpm的转棒上，并在2min内将转速缓慢增加到20rpm。从大鼠放上转棒开始计时，一直到大鼠从转棒上掉下来停止计时，该时间间隔即为我们所要测定的时间阈值。在给药前，所有大鼠都要在转棒上训练至少3次，使其适应实验装置，选取合格的大鼠（时间阈值＞150s）并随机分为2组，按前述的方法分别注射112.7nmol/kg HWTX-XVI和生理盐水。给药后30min开始测量大鼠从转棒上掉下来的时间阈值，阈值上限设为300s，超过300s的计为300s。实验于09:00-18:00期间进行，室温保持在24-26℃，湿度40-60%。

2、实验结果与分析

2.1HWTX-XVI对大鼠福尔马林致炎疼痛模型的镇痛作用

我们观察了肌肉注射HWTX-XVI对大鼠福尔马林致炎疼痛模型的镇痛效果。大鼠福尔马林致炎疼痛模型的疼痛评估曲线见图1。图中纵坐标每一个点代表鼠后肢足底皮下注射福尔马林液后，每5min内大鼠疼痛评分值(S)。横坐标每个点代表每5min时间间隔。由图中可见：各组注射福尔马林入实验大鼠足底皮下后，疼痛反应均呈典型双相反应，疼痛分为急性痛和慢性痛。第一相反应（急性痛）在注射后立即开始，持续约5-10min。接着15-20min，大鼠很少有提示伤害性作用的行为。第二相反应（慢性痛）大约在注射福尔马林后20-25min开始，持续到疼痛检测结束。与生理盐水相比，发现112.7nmol/kg HWTX-XVI表现出了明显的镇痛作用；与盐酸吗啡组相比，112.7nmol/kg HWTX-XVI与16.5mmol/kg吗啡组镇痛效果相当（图1）。同时我们可以看到,HWTX-XVI的镇痛活性主要体现在第二相痛,而对第一相痛的镇痛效果不明显,提示HWTX-XVI对机械和化学刺激直接引发的疼痛可能没有镇痛作用。我们进一步检测了不同浓度HWTX-XVI对炎性疼痛模型的镇痛作用，发现HWTX-XVI的镇痛作用具有剂量依赖性，呈现明显的正相关，它的半数有效作用剂量（EC₅₀）是17.7nmol/kg（图2）。所有实验动物用药后，均未呈现任何明显的毒副作用症状，并且全部没有后遗症。

2.2HWTX-XVI对大鼠术后疼痛模型的镇痛作用

我们设计实验检测了肌肉注射HWTX-XVI对大鼠术后疼痛模型的镇痛作用，发现：与生理盐水组相比，56.3nmol/kg HWTX-XVI和16.5mmol/kg吗啡对大鼠术后机械刺激缩爪阈值都有明显影响，给药后HWTX-XVI组和吗啡组都表现出了明显的镇痛作用（图3）。HWTX-XVI对大鼠术后疼痛模型的最大镇痛效应出现在2.5h(8.1±1.2g vs0.6±0.1g,n=8)。从图中我们可以看出在观察的前1h左右，HWTX-XVI的作用强度不如吗啡，这是因为吗啡的给药量本身就比HWTX-XVI大很多。从作用时间上比较，HWTX-XVI作用时间较吗啡长，持续到给药后3.5h，比吗啡长了至少1h。

2.3HWTX-XVI对大鼠热板实验中热痛和大鼠运动协调能力的影响

为了研究HWTX-XVI是否能够调节热痛，我们在热板实验中检测了HWTX-XVI对急性热痛模型的作用。我们发现肌肉注射112.7nmol/kg HWTX-XVI对大鼠热痛能产生镇痛作用，在注射HWTX-XVI后的1h能产生68±7%(4.1±0.3s vs6.9±0.8s,n=8)的最大镇痛作用。作为阳性对照，肌肉注射5mg/kg吗啡同样能够产生明显的(182±11%)镇痛作用(4.1±0.3s vs11.6±1.2s,注射后1h,n=7)（图4）。

因为HWTX-XVI能够抑制N-型钙通道，所以该毒素可能影响动物的运动协同能力，因此我们在滚轮模型上检测了HWTX-XVI对大鼠运动协调机能的影响。结果发现：在注射毒素前，大鼠停留在转棒上的时间为273±15s；肌肉注射500μg/kg HWTX-XVI后，大鼠停留在转棒上的时间为281±12s,表明HWTX-XVI对运动协调机能没有影响（图5）。

Claims

1.一种生物活性多肽在制备镇痛药物中的应用方法，所述的生物活性多肽为虎纹捕鸟蛛毒素-XVI，其氨基酸序列为：

NH₂-Cys Ile Gly Glu Gly Val Pro Cys Asp Glu Asn Asp Pro Arg Cys Cys Ser Gly Leu Val Cys Leu Lys ProThr Leu His Gly Ile Trp Tyr Lys Ser Tyr Tyr Cys Tyr Lys Lys-OH，其特征在于，所述的虎纹捕鸟蛛毒素-XVI用于制备镇痛药物。

2.根据权利要求1所述的生物活性多肽在制备镇痛药物中的应用，其特征在于，所述的虎纹捕鸟蛛毒素-XVI的N端第1位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之间，N端第8位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间，N端第15位半胱氨酸和第36位半胱氨酸之间分别形成二硫键。

3.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于，虎纹捕鸟蛛毒素-XVI作为单一有效活性组分用于制备镇痛药物。

4.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于，虎纹捕鸟蛛毒素-XVI制备成肌肉注射的镇痛药物。

5.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于，在制备炎性疼痛或热痛镇痛药物时，配制肌肉注射制剂的剂量为110-115nmol/kg。

6.根据权利要求5所述的应用方法，其特征在于，在制备炎性疼痛或热痛镇痛药物时，配制肌肉注射制剂的剂量为112.7nmol/kg。

7.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于，在制备术后疼痛镇痛药物时，配制肌肉注射制剂的剂量为55-60nmol/kg。

8.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，在制备术后疼痛镇痛药物时，配制肌肉注射制剂的剂量为56.3nmol/kg。

9.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于，HWTX-XVI的半数有效作用剂量EC₅₀为17.7nmol/kg。