JP6757897B2 - 試験方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物（以下「本抽出物」ということがある。）又は本抽出物を含有する製剤（以下「本製剤」ということがあり、本抽出物と本製剤を併せて「本抽出物等」ということがある。）を用いた新規な試験方法等に関するものである。より具体的には、本抽出物等を、投与量を自動的に制御して連続投与できる装置（以下「連続投与装置」という。）を用いて投与することを特徴とする試験方法、並びに、本抽出物等による治療方法等に関する。
従来、本抽出物又は本製剤を、ヒト又はヒト以外の動物に投与する際の投与方法としては、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与等が知られている。ヒトが本製剤の投与を受ける場合、例えば、注射剤では１日乃至数日に1回の注射を受ける必要があり、錠剤では１日２回の服用をする必要がある。しかしながら、注射剤の投与を受けるために毎回通院することは患者にとって大きな負担であり、継続的な治療がなされにくい原因にもなり得る。また、錠剤を毎日忘れずに決められた回数服用することも遵守が難しい面がある。一方、本抽出物等をヒト以外の動物に継続的に投与して本抽出物等の薬効等を研究する場合、１日１回といった頻度での投与が必要である。しかしながら、動物に本抽出物等を毎日投与する作業は煩雑で、休日も休めないため研究者の負担となっている。また、本抽出物等の連日投与は実験動物にも多大なストレスを与えるため動物愛護の観点からも好ましくない。
ヒトに薬剤を連続的に投与する方法としては、薬剤を充填したバッグから点滴静注する方法等がある。点滴器具も一定の流量で薬剤を一定時間連続的に投与できる方法ではあるが、本人の動きが制限され、また投与時間が限られている。そのため、「インフューザー」という名称の器具も開発されており、これを用いれば携帯した状態で、１週間程の期間、薬剤を連続投与することも可能である。この器具も連続投与装置の一種である。ヒト以外の動物に対して薬剤を長時間にわたり連続投与するには、投与量を自動的に制御する連続投与装置により投与することが便利である。連続投与装置は、動物の体外に装着するものでも体内に埋め込むものでもよい。体外に装着するものとしては、例えば「インフュージョンポンプMRBP-M/R」又は「Infu-Disk（商標）」の名称で販売されている商品がある。この商品は、構造がシンプルではあるが精度が高く、装着と脱着が簡単な点が利点である。他方、体内（通常は皮下）に埋め込む連続投与装置を用いると、体外に装着するタイプに比べて、投与を受ける動物がより自由に動き回れるという利点がある。体内に埋め込む連続投与装置の一種として、浸透圧で作動する連続投与装置（以下「浸透圧ポンプ」という）が挙げられ、例えば「alzet（登録商標）浸透圧ポンプ」の名称で販売されている。浸透圧ポンプは、ポンプ内の浸透圧層と、ポンプが埋め込まれた組織環境の浸透圧の差によって動作するものである。すなわち、ポンプの表面を形成する半透膜を通してポンプ内への水分の流入が生じ、この水分の流入によって、薬剤の充填された柔軟性のあるリザーバーが圧縮され、リザーバー内の薬剤が一定の流量で押し出されるものである。他の体内埋め込みタイプの連続投与装置としては、「iPRECIO（登録商標）SMP/IMS-200」の名称で販売されている商品がある。この商品は、内蔵された電池によりマイクロモーターが駆動し、薬剤を一定の速度で外に連続的に排出するもので、体内に埋め込んだ後でも薬剤を補充することができる。そのため、この商品は、投与が長期間にわたる場合、あるいは、途中から別の濃度や種類の薬剤を投与する場合に便利である。本発明においては、これらいずれのタイプの連続投与装置も使用可能である。
本発明に係る本抽出物又は本製剤を動物又はヒトに投与して各種の作用を試験したことを開示した文献は多数存在する。例えば、特許文献１には、本抽出物の皮下への単回投与で鎮痛作用を示すことが開示されている。特許文献２には、本抽出物のマウスの腹腔内への１日１回、週５回投与により、抗癌作用、肝硬変抑制作用を示すことが開示されている。特許文献３には、本抽出物をラットに経口単回投与することで血流改善作用を示すことが開示されている。特許文献４には、本抽出物をラットに１日１回静脈内投与することにより、末梢循環障害改善作用を示すことが開示されている。しかしながら、本抽出物等を、連続投与装置を用いて投与する試験方法あるいは治療方法等は、これまでに開示された文献等がなく、従って、その効果についても知られていなかった。
特開昭５３−１０１５１５号公報 特開昭５５−８７７２４号公報 特開平２−２８１１９号公報 特開平７−９７３３６号公報
本発明は、本抽出物等を連続投与する試験方法、並びに、本抽出物等による治療方法等を提供するものである。
本発明者らは、本抽出物等を、連続投与装置を用いて持続的に投与することにより、注射や経口投与等、従来知られていた本抽出物等の投与方法と比べて、より低用量で同等又は同等以上の効果を示すこと、並びに、これに基づく本抽出物等による新たな治療方法等を見出し、本発明を完成した。
本発明により、本抽出物等を、連続投与装置を用いて持続的に動物に投与する方法により試験、実験、研究等（以下、本願においては単に「試験」という。）することが有用であることが判明した。これにより、本抽出物等の既知の作用の確認を、従来の投与方法より低用量で実施することができる。また、従来の投与方法では認められていなかった新たな作用を発見する可能性もある。さらに、従来は本抽出物を毎日あるいは一定頻度で投与する作業が必要であったが、本発明によれば、数日乃至数ヶ月間投与作業が不要となる等、研究者の作業量を劇的に軽減できる。また、動物への負荷・ストレスも軽減されることから、動物倫理の点からも有用である。さらに、ヒトでは、連続投与装置による本製剤の投与によって、患者の継続的な治療効果の向上に寄与することが考えられる。本製剤は、長年の使用経験がある安全性の高い薬剤であるため、本発明による治療は極めて実用性の高いものである。
本発明において、「連続投与」とは、薬剤を一定の速度（流速）で一定の時間以上持続的に体内へ投与することを意味し、「連続投与装置」は自動的にこれを可能ならしめる装置をいい、いかなるタイプのものであってもよい。例えば、体外装着タイプの「Infu-Disk（商標）」では、流速0.03〜1.0ｍＬ/時（液量5ｍＬ、使用時間5〜167時間）のものと、流速0.03〜4.0ｍＬ/時（液量10ｍＬ、使用時間2.5〜333時間）の商品が販売されている。一方、体内埋め込みタイプの「alzet（登録商標）浸透圧ポンプ」の場合は、流速0.11〜10.0μＬ/時、使用時間1日〜６週間の１２種類の商品が販売されている。「iPRECIO（登録商標）SMP/IMS-200」の場合は、流速が1.0〜30.0μＬ/時（液量0.9ｍＬ、補充により最大約5ｍＬ）、使用時間１週間〜６ヶ月が可能とされている。これらはいずれも本願発明における連続投与装置として使用できるものである。
図１は、坐骨神経圧挫損傷によって生じる知覚異常（鈍麻）に対する本抽出物の連続投与の効果を調べた結果である。 図２は、坐骨神経圧挫損傷によって生じる感覚神経の機能障害に対する本抽出物の連続投与の効果を調べた結果である。 図３は、リソフォスファチジルコリン（Lysophosphatidyl choline；LPC）投与によって生じる運動機能障害に対する本抽出物の連続投与の効果を調べた結果である。 図４は、LPC投与によって生じる知覚異常（鈍麻）に対する本抽出物の連続投与の効果を調べた結果である。 図５は、LPC投与によって生じる温熱性知覚異常（鈍麻）に対する本抽出物の連続投与の効果を調べた結果である。 図６は、LPC投与によって生じる感覚神経の機能障害に対する本抽出物の連続投与の効果を、神経伝導速度（Nerve conduction velocity；NCV）を指標として調べた結果である。 図７は、LPC投与によって生じる感覚神経の機能障害に対する本抽出物の連続投与の効果を、複合筋活動電位（Compound muscle action potentials；CMAP）を指標として調べた結果である。 図８は、LPC投与によって生じる感覚神経の機能障害に対する本抽出物の連続投与の効果を、終末潜時（Terminal latency；TL）を指標として調べた結果である。 図９は、LPC投与による神経脱髄後の神経軸索の再髄鞘化に対する本抽出物の連続投与の効果を調べた結果である。 図１０は、パクリタキセル投与によって生じる知覚異常（過敏）に対する本抽出物の連続投与の効果を調べた結果である。
本抽出物は、ワクシニアウイルスを接種して発痘した動物の炎症組織から抽出分離した非蛋白性の活性物質を含有する抽出物である。本抽出物は、抽出された状態では液体であるが、乾燥することにより固体にすることもできる。本製剤は、医薬品として非常に有用なものである。本製剤として出願人が日本において製造し販売している具体的な商品に「ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液含有製剤」（商品名：ノイロトロピン／NEUROTROPIN〔登録商標〕）（以下「ノイロトロピン」という。）がある。ノイロトロピンには、注射剤と錠剤があり、いずれも医療用医薬品（ethical drug）である。
ノイロトロピンの注射剤の適応症は、「腰痛症、頸肩腕症候群、症候性神経痛、皮膚疾患（湿疹、皮膚炎、蕁麻疹）に伴う掻痒、アレルギー性鼻炎、スモン（SMON）後遺症状の冷感・異常知覚・痛み」である。ノイロトロピンの錠剤の適応症は、「帯状疱疹後神経痛、腰痛症、頸肩腕症候群、肩関節周囲炎、変形性関節症」である。本製剤は、出願人が創製し、医薬品として開発したものであり、その有効性と安全性における優れた特長が評価され、長年にわたり販売されて、日本の医薬品市場で確固たる地位を確立しているものである。
本発明におけるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物はワクシニアウイルスを接種して発痘した炎症組織を破砕し、抽出溶媒を加えて組織片を除去した後、除蛋白処理を行い、これを吸着剤に吸着させ、次いで有効成分を溶出することによって得ることができる。即ち、例えば、以下のような工程である。
（A）ワクシニアウイルスを接種し発痘させたウサギ、マウス等の皮膚組織等を採取し、発痘組織を破砕し、水、フェノール水、生理食塩液またはフェノール加グリセリン水等の抽出溶媒を加えた後、濾過または遠心分離することによって抽出液（濾液または上清）を得る。
（B）前記抽出液を酸性のpHに調整して加熱し、除蛋白処理する。次いで除蛋白した溶液をアルカリ性に調整して加熱した後に濾過または遠心分離する。
（C）得られた濾液または上清を酸性とし活性炭、カオリン等の吸着剤に吸着させる。
（D）前記吸着剤に水等の抽出溶媒を加え、アルカリ性のpHに調整し、吸着成分を溶出することによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を得ることができる。その後、所望に応じて、適宜溶出液を減圧下に蒸発乾固または凍結乾燥することによって乾固物とすることもできる。
ワクシニアウイルスを接種し炎症組織を得るための動物としては、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、ラット、マウスなどワクシニアウイルスが感染する種々の動物を用いることができ、炎症組織としてはウサギの炎症皮膚組織が好ましい。ウサギはウサギ目に属するものであればいかなるものでもよい。例としては、アナウサギ、カイウサギ（アナウサギを家畜化したもの）、ノウサギ（ニホンノウサギ）、ナキウサギ、ユキウサギ等がある。これらのうち、カイウサギが使用するには好適である。日本では過去から飼育され家畜又は実験用動物として繁用されている家兎（イエウサギ）と呼ばれるものがあるが、これもカイウサギの別称である。カイウサギには、多数の品種（ブリード）が存在するが、日本白色種やニュージーランド白色種（ニュージーランドホワイト）といった品種が好適に用いられ得る。
ワクシニアウイルス（vaccinia virus）は、いかなる株のものであってもよい。例としては、リスター（Lister）株、大連（Dairen）株、池田（Ikeda）株、ＥＭ−６３株、ニューヨーク市公衆衛生局（New York City Board of Health）株等が挙げられる。
上記した本抽出物の基本的な抽出工程（A）〜（D）は、より詳しくは、例えば、以下のようなものとして実施できる。
工程（A）について
ウサギの皮膚にワクシニアウイルスを皮内接種して発痘させた炎症皮膚組織を採取する。採取した皮膚組織はフェノール溶液等で洗浄、消毒を行なう。この炎症皮膚組織を破砕し、その1乃至5倍量の抽出溶媒を加える。ここで、破砕とは、ミンチ機等を使用してミンチ状に細かく砕くことを意味する。また、抽出溶媒としては、蒸留水、生理食塩水、弱酸性乃至弱塩基性の緩衝液などを用いることができ、フェノール等の殺菌・防腐剤、グリセリン等の安定化剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の塩類などを適宜添加してもよい。この時、凍結融解、超音波、細胞膜溶解酵素又は界面活性剤等の処理により細胞組織を破壊して抽出を容易にすることもできる。得られた懸濁液を、5日乃至12日間放置する。その間、適宜攪拌しながら又は攪拌せずに、30乃至45℃に加温してもよい。得られた液を固液分離（濾過又は遠心分離等）によって組織片を除去して粗抽出液（濾液又は上清）を得る。
工程（B）について
工程（A）で得られた粗抽出液について除蛋白処理を行う。除蛋白は、通常行われている公知の方法により実施でき、加熱処理、蛋白質変性剤（例えば、酸、塩基、尿素、グアニジン、アセトン等の有機溶媒など）による処理、等電点沈澱、塩析等の方法を適用することができる。次いで、不溶物を除去する通常の方法、例えば、濾紙（セルロース、ニトロセルロース等）、グラスフィルター、セライト、ザイツ濾過板等を用いた濾過、限外濾過、遠心分離などにより析出してきた不溶蛋白質を除去した濾液又は上清を得る。
工程（C）について
工程（B）で得られた濾液又は上清を、酸性、好ましくはpH3.5乃至5.5に調整し、吸着剤への吸着操作を行う。使用可能な吸着剤としては、活性炭、カオリン等を挙げることができ、抽出液中に吸着剤を添加し撹拌するか、抽出液を吸着剤充填カラムに通過させて、該吸着剤に有効成分を吸着させることができる。抽出液中に吸着剤を添加した場合には、濾過や遠心分離等によって溶液を除去して、活性成分を吸着させた吸着剤を得ることができる。
工程（D）について
工程（C）で得られた吸着剤から活性成分を溶出（脱離）させるには、当該吸着剤に溶出溶媒を加え、塩基性、好ましくはpH9乃至12に調整し、室温又は適宜加熱して或いは撹拌して溶出し、濾過や遠心分離等の通常の方法で吸着剤を除去する。用いられる溶出溶媒としては、塩基性の溶媒、例えば塩基性のpHに調整した水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等又はこれらの適当な混合溶液を用いることができ、好ましくはpH9乃至12に調整した水を使用することができる。溶出溶媒の量は適宜設定することができる。このようにして得られた溶出液を、原薬として用いるために、適宜pHを中性付近に調整するなどして、最終的にワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物（本抽出物）を得ることができる。
本抽出物は、できた時点では液体であるので、適宜濃縮・希釈することによって所望の濃度のものにすることもできる。本抽出物から製剤を製造する場合には、加熱滅菌処理を施すのが好ましい。注射剤にするためには、例えば塩化ナトリウム等を加えて生理食塩液と等張の溶液に調製することができる。また、液体あるいはゲル等の状態で経口投与することも可能であるが、本抽出物に適切な濃縮乾固等の操作を行うことによって、錠剤等の経口用固形製剤を製造することもできる。本抽出物からこのような経口用固形製剤を製造する具体的な方法は、日本特許第3818657号や同第4883798号の明細書に記載されている。こうして得られる注射剤や経口用製剤等が本製剤の例である。また、本製剤のうち、浸透圧ポンプ等の連続投与装置に充填するものとしては、液体のものが適切である。従って、液体の本抽出物や本製剤を充填することができる。
以下に、本抽出物の製造方法の例、並びに本抽出物の新規な試験方法及び該試験方法を用いた薬理試験結果を示すが、本発明はこれらの実施例の記載によって何ら制限されるものではない。
実施例１ 本抽出物の製造
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを皮内接種し、発痘した皮膚を切り取り採取した。採取した皮膚はフェノール溶液で洗浄・消毒を行なった後、余分のフェノール溶液を除去し、破砕して、フェノール溶液を加え混合し、3〜７日間放置した後、さらに3〜4日間攪拌しながら35〜40℃に加温した。その後、固液分離して得た抽出液を塩酸でpH4.5〜5.2に調整し、90〜100℃で30分間、加熱処理した後、濾過して除蛋白した。さらに、濾液を水酸化ナトリウムでpH9.0〜9.5に調整し、90〜100℃で15分間、加熱処理した後、固液分離した。
得られた除蛋白液を塩酸でpH4.0〜4.3に調整し、除蛋白液質量の2％量の活性炭を加えて2時間撹拌した後、固液分離した。採取した活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH9.5〜10とし、60℃で90〜100分間撹拌した後、遠心分離して上清を得た。遠心分離で沈澱した活性炭に再び水を加えた後、水酸化ナトリウムでpH10.5〜11とし、60℃で90〜100分間撹拌した後、遠心分離して上清を得た。両上清を合せて、塩酸で中和し、本抽出物を得た。
実施例２（試験方法と試験結果）
次に、上記実施例１で得られた本抽出物を連続投与装置によって投与する薬理試験の試験方法及び試験結果の一例を示す。
なお、浸透圧ポンプによってラットに投与された体重1 kgあたりの本抽出物の投与量は、試験例１及び２については、投与開始時の体重より算出し、試験例３については、投与期間中の平均体重より算出した。
試験例１ 坐骨神経圧挫損傷モデルにおける評価
物理的作用による末梢神経障害モデルである坐骨神経圧挫損傷モデルを用いて、末梢神経障害による症状である知覚異常（鈍麻）、運動機能障害及び電気生理学的障害並びに神経障害からの神経修復に対する本抽出物の効果を調べた。本抽出物をラットに浸透圧ポンプを用いて連続投与し、フォン・フライ試験及び電気生理学的評価を行った。
（1）坐骨神経圧挫モデルラットの作製及び本抽出物の投与
浸透圧ポンプ（商品名：alzet〔登録商標〕、model：2ML2、DURECT社）内に生理食塩液、本抽出物をそれぞれ注入し、37℃の生理食塩液中で一晩静置した。6週齢雄性Wistar系ラットにミダゾラム（2 mg/kg）、ブトルファノール（2.5 mg/kg）、メデトミジン（0.15 mg/kg）の混合麻酔薬を腹腔内投与して深鎮静をかけた。ラットの左坐骨神経を展開し、坐骨切痕から遠位5mmの位置に鑷子で圧挫損傷を加えた。圧挫時間は10秒間、圧挫回数は3回とし、圧挫操作の間隔は10秒間とした。筋膜及び皮膚を4-0ナイロン縫合糸で縫合した。生理食塩液封入浸透圧ポンプ又は本抽出物封入浸透圧ポンプ（12NU/kg/日）をそれぞれラットの背部皮下に留置した。なお、実験ラットは以下の2群に分類した。
（１）発症対照群：坐骨神経圧挫損傷を加えて生理食塩液を全身投与する群。
（２）本抽出物投与群：坐骨神経圧挫損傷を加えて本抽出物を全身投与する群。
浸透圧ポンプは2週間留置し、浸透圧ポンプを入れ替え、さらに2週間留置して本抽出物又は生理食塩液を4週間連続投与した。
（２）フォン・フライ試験（von Frey test）
感覚機能の評価のため、術後4週時点でフォン・フライフィラメント（0.008 g-26 g、商品名：TouchTest〔登録商標〕、North Coast Medical社）を用いて機械刺激に対する下肢反応閾値（mechanical hind paw withdrawal threshold）を測定した。前記ラットにメッシュ状のフェンスの上を歩かせて、足底部に上記フィラメントで圧を加え逃避行動を起こした値を記録した。評価に際して、健側及び患側それぞれを測定し患側／健側比を算出し評価した。
試験結果
上記試験の結果の一例を図１に示す。
感覚神経の機能評価である機械刺激に対する下肢反応閾値（mechanical hind paw withdrawal threshold）の患側／健側比は、発症対照群と比較して本抽出物投与群では有意に回復し、知覚異常（鈍麻）が改善した。
（３）電気生理学的評価
術後4週経過したラットに麻酔薬で鎮静をかけ、手術台に腹臥位とした。左坐骨神経及び左前脛骨筋を展開した。NCVは坐骨神経圧挫損傷部の近位側及び遠位側をそれぞれ双極電極で刺激して、各測定値から算出した。測定及び評価は、データ収録・解析システムPowerLab 2/26（AD Instruments社）を用いた。
試験結果
上記試験の結果の一例を図２に示す。
発症対照群と比較して、本抽出物投与群では、NCVの有意な回復が認められ、電気生理学的な機能が改善した。
試験例２ ラット坐骨神経局所脱髄モデルにおける評価
脱髄疾患モデルであるLPC誘発脱髄モデルを用いて、末梢神経障害による症状である知覚異常（鈍麻）、温熱刺激に対する知覚異常（鈍麻）、運動機能障害及び電気生理学的障害並びに神経障害からの神経修復に対する本抽出物の効果を調べた。上記試験例１（１）と同様の方法で、本抽出物をラットに浸透圧ポンプを用いて連続投与し、坐骨神経機能指数評価、フォン・フライ試験、ホットプレート試験、電気生理学的評価及び免疫組織学的評価を行った。
（１）坐骨神経局所脱髄モデルラットの作製及び本抽出物の投与
試験例１と同様に、浸透圧ポンプ（商品名：alzet〔登録商標〕、model：2ML1、DURECT社）内に生理食塩液、本抽出物をそれぞれ注入し、37℃の生理食塩液中で一晩静置した。6週齢雄性Wistar系ラットにミダゾラム（2 mg/kg）、ブトルファノール（2.5 mg/kg）、メデトミジン（0.15 mg/kg）の混合麻酔薬を腹腔内投与して深鎮静をかけた。坐骨切痕のレベルで左坐骨神経を露出させ、ハミルトンシリンジを用いて、生理食塩液又は、2% LPC（Sigma-Aldrich社）をそれぞれ5μL 近位坐骨神経に投与した。LPC投与7日後に、生理食塩液封入浸透圧ポンプ又は本抽出物封入浸透圧ポンプ（24 NU/kg/日）を背部皮下に留置し、その後１週間、生理食塩液又は本抽出物を連続投与した。
（２）坐骨神経機能指数評価
運動機能の評価のため、術後２週時点で坐骨神経機能指数（the sciatic function index；SFI）を測定した。SFI測定のため、ラットの後足の裏にインクをつけ40 cm四方の水平台の上に事務用紙（office paper）を敷き、その上を歩行させ足跡を記録した。以下の項目を計測し下記の式でSFIを計算した。SFI=0が正常、SFI=−100が機能全廃を示す。また、術後経過中に足趾の壊死・欠損を生じた個体は除外した。
＜SFI数式＞
SFI=-38.3×((EPL-NPL)/NPL)+109.5×((ETS-NTS)/NTS)+13.3×((EITS-NITS)/NITS)-8.8
＜各項目＞
EPL=experimental print length
NPL=normal print length
ETS=experimental toe spread
NTS=normal toe spread
EITS=experimental intermediary toe spread
NITS=normal intermediary toe spread
試験結果
上記試験の結果の一例を図３に示す。
脱髄対照群と比較して、脱髄本抽出物投与群では、SFIの有意な改善が認められ、運動機能が改善した。
（３）フォン・フライ試験（von Frey test）
感覚機能の評価のため、術後2週時点で上記試験例１（２）と同様にフォン・フライフィラメント（0.008 g-26 g、North Coast Medical社）を用いて健側及び患側それぞれの機械刺激に対する下肢反応閾値（mechanical hind paw withdrawal threshold）を測定し、患側／健側比を算出して評価した。
試験結果
上記試験の結果の一例を図４に示す。
フォン・フライ試験において、脱髄対照群と比較して脱髄本抽出物投与群では、有意な改善が認められ、知覚異常（鈍麻）が改善した。
（４）ホットプレート試験（Hot plate test）
温度刺激に対する評価のため、術後２週時点でホットプレート装置（Ugo basile社）を用いて、患肢の最初の逃避反応（患肢をなめる、上げる）を示すまでの時間（Hot plate latency）を52.5℃の設定で測定した。カットオフタイムは45秒とした。
試験結果
上記試験の結果の一例を図５に示す。
ホットプレート試験において、脱髄対照群と比較して脱髄本抽出物投与群では、有意な改善が認められ、温熱性知覚異常（鈍麻）が改善した。
（５）電気生理学的評価
術後２週経過したラットを麻酔薬で鎮静をかけ、手術台に腹臥位とし、左坐骨神経及び左前脛骨筋を展開した。CMAPとTLは、坐骨神経近位を双極電極で刺激して測定した。NCVは、上記試験例１（３）と同様に、坐骨神経圧挫損傷部の近位側及び遠位側をそれぞれ双極電極で刺激して、各測定値から算出した。測定及び評価は、上記試験例１（３）と同様に、PowerLab 2/26（AD Instruments社）を用いた。
試験結果
上記試験の結果の一例を図６、７及び８に示す。
NCV、CMAP及びTL全てにおいて、脱髄対照群と比較して、脱髄本抽出物投与群では、有意な改善が認められ、電気生理学的な機能が改善した。
（６）免疫組織学的評価
術後２週経過したラットを麻酔薬で鎮静をかけ、坐骨神経を採取した。4% パラホルムアルデヒドで24時間常温にて固定後、20％ スクロース液に浸し、ティシュー・テック（サクラファインテックジャパン社）に包埋、液体窒素で凍結させ、5μmの厚みで横断面の凍結切片を作成した。凍結切片を100%メタノールで−20℃、30分間浸透させ、PBS + 0.2% TritonX + 5% bovine serum albuminでブロッキングした後、一次抗体として抗NF200ウサギ抗体（1：1000；102M4784、Sigma-Aldrich社）及び 抗MBPマウス抗体（1：1000；NE1018、CALBIOCHEM社）を4℃で一晩反応させた。反応後二次抗体としてAlexa 488標識ヤギ抗ウサギIgG抗体（1：1000；Lifetechnologies社）とAlexa 568標識ヤギ抗マウスIgG抗体（1：1000；Lifetechnologies社）を1時間反応させた。二次抗体反応後、核の評価のためDAPI（4'-6-ジアミジノフェニル-2-インドール：和光純薬社）を含有しているマウント剤（商品名：Perma fluor〔登録商標〕、Thermo Fisher Scientific社）に反応させた。NIS Elements BR software（ニコン社）を用いて、MBP陽性軸索数／全軸索数を評価した。
試験結果
上記試験の結果の一例を図９に示す。
脱髄対照群と比較して、脱髄本抽出物投与群では、全軸索数に対するMBP陽性軸索数の有意な上昇が認められ、脱髄症状が改善した。
統計解析
試験例１及び試験例２においては、統計解析は、JMP software version 11（SAS Institute社）を用いてTukey-Kramer HSD検定を行った。p＜0.05であった場合を「有意」とした。
試験例３ パクリタキセル誘発ラット末梢神経障害モデルにおける評価
抗がん剤のパクリタキセルを投与した場合に生じる副作用である末梢神経障害に対する本抽出物の効果を調べた。本抽出物をラットに浸透圧ポンプを用いて連続投与し、フォン・フライ試験を行った。
（１）パクリタキセル誘発末梢神経障害ラットの作製及び本抽出物の投与
試験例１と同様に、浸透圧ポンプ（商品名：alzet〔登録商標〕、model：2ML2、DURECT社）内に生理食塩液、本抽出物をそれぞれ注入し、37℃の生理食塩液中で一晩静置した。６週齢のSD雄性ラットを用い、パクリタキセル（2 mg/kg）を1日おきに計4回腹腔内投与して、パクリタキセル誘発末梢神経障害ラットを作製した。正常対照群には、パクリタキセルの溶媒であるポリオキシエチレンヒマシ油とエタノールを体積比で1:1となるように混合した溶液を更に生理食塩液で3倍に希釈し、パクリタキセルと同様に投与した。パクリタキセル投与開始２週間後に、正常対照群及び発症対照群には生理食塩液封入浸透圧ポンプを、本抽出物の浸透圧ポンプ投与群には本抽出物を封入した浸透圧ポンプ（8.0 NU/kg/日）をそれぞれラットの背部皮下に留置した。２週間留置して生理食塩液又は本抽出物を連続投与した。
（２）本抽出物の反復経口投与
本抽出物の反復経口投与群には、パクリタキセル投与開始14日後から2週間、本抽出物（200 NU/kg/日）を反復経口投与した。
（３）フォン・フライ試験（von Frey test）
底が金網の透明アクリルゲージに、上記（１）のラットを入れ、約3分間馴化させた後に、右後肢の機械刺激に対する50％反応閾値を、フォン・フライフィラメント（0.4 -15.0 g、North Coast Medical社）を用いて測定し、各群の平均値±標準誤差を算出した。パクリタキセル投与開始２５日後（本抽出物投与開始１１日後）に、本抽出物の経口投与（200 NU/kg/日）の開始時並びに投与後１、４及び２４時間後での機械刺激に対する50%反応閾値を測定した。その後引き続いて、残り３群（正常対照群、発症対照群及び本抽出物封入浸透圧ポンプ投与群）の機械刺激に対する50%反応閾値を測定した。
統計解析
試験例３においては、統計解析は、SAS System Version 9.1.3（SAS Institute社）を用いて2群間比較にはF検定を行い、等分散の場合はStudentのt検定を、不等分散の場合はWelchの検定を行った。p＜0.05であった場合を「有意」とした。
試験結果
上記試験の結果の一例を図１０に示す。
パクリタキセル投与開始２５日後において（図１０における横軸０の時点）、本抽出物封入浸透圧ポンプ投与群の機械刺激に対する50%反応閾値は、発症対照群と比較して有意に上昇した。また、本抽出物反復経口投与群の機械刺激に対する50%反応閾値は、パクリタキセル投与開始２５日後において発症対照群と比較して有意に上昇した。本抽出物封入浸透圧ポンプ投与群と本抽出物反復経口投与群における本抽出物の投与量は、それぞれ8.0 NU/kg/日と200 NU/kg/日であるが、両者の効果はほぼ同程度であった。皮下投与と経口投与の相違はあるものの、浸透圧ポンプによる本抽出物の連続投与によって、非常に高い効果が示された。
本製剤を治療の必要な患者（ヒト）に投与する方法としては、注射剤の静脈内、皮下、筋肉内投与や錠剤の経口投与等が挙げられる。投与量は適宜設定することができるが、市販の本製剤（ノイロトロピン〔登録商標〕）で認められている投与量は、標準的には注射剤では1日3.6乃至7.2 NU、経口剤（錠剤）では1日16 NUとなっている。これを、ヒトの体重を60 kgとして計算すると、ヒトでの投与量は、注射剤で0.06乃至0.12 NU/kg/日、経口剤（錠剤）で約0.27 NU/kg/日となる。なお、「NU」は「ノイロトロピン単位」の略であり、「ノイロトロピン単位」とは、疼痛閾値が正常動物より低下した慢性ストレス動物であるSARTストレスマウスを用い、Randall-Selitto変法に準じて試験を行い、鎮痛効力のED50値をもって規定する。1NUはED50値が100 mg/kgであるときのノイロトロピン製剤の鎮痛活性含有成分1mgを示す活性である。ノイロトロピン注射剤の後発品である「ナブトピン」（登録商標）や類似品「Analgecine」（登録商標）では、「単位」が用いられているが、実質的には「ノイロトロピン単位」と同じ意味である。そのため、本願では、「単位」と表記する。
実施例２（試験例１〜３）のラットに連続投与装置を用いて本抽出物を皮下投与した実験結果によると、本抽出物の有効な投与量として、12 NU/kg/日（試験例１）、24 NU/kg/日（試験例２）及び8.0 NU/kg/日（試験例３）が示された。よって、連続投与装置を用いた場合の本抽出物の有効量の範囲として、8.0〜24 NU/kg/日がひとつの目安となり得る。ただし、これはラットにおける目安であるため、動物種が異なればこの範囲も異なることが十分に考えられる。試験例３で行われたラットでの経口投与における有効な投与量は200 NU/kg/日であるが、長年本抽出物等を動物に投与する試験を行っている出願人の経験からすると、本抽出物等を経口で投与する場合は100〜200 NU/kg/日といった量とすることで効果が見られることが多い。これを単純に比較すると、ラットでは、連続投与装置を用いて皮下投与した場合、経口投与に比べて、本抽出物の投与量は、４分の１（24÷100）乃至２４分の１（8.0÷200）で足りることになる。一方、市販の本製剤（ノイロトロピン〔登録商標〕）で認められている投与量は、上記のとおり、経口剤（錠剤）では約0.27NU/kg/日である。そうすると、経口投与の場合、有効投与量はラットの方がヒトより約370（100÷0.27）〜740（200÷0.27）倍高い（ヒトはラットの370〜740分の1で効く）と見積もられる。従って、ヒトに連続投与装置を用いて本抽出物等を投与する場合の投与量としては、ラットで得られた8.0〜24 NU/kg/日を370〜740分の1して、約0.011乃至0.065NU/kg/日という値が算出される。
一方、出願人の経験では、本抽出物等を動物に注射（静脈内、皮下、腹腔内）する場合は5〜100 NU/kg/日といった量で効果が見られることが多い。市販の本製剤（ノイロトロピン〔登録商標〕）の注射剤で認められている投与量は、上記のとおり、0.06乃至0.12 NU/kg/日である。そうすると、注射による投与の場合、有効投与量はラットの方がヒトより約42（5÷0.12）〜1670（100÷0.06）倍高い（ヒトはラットの42〜1670分の1で効く）と見積もられる。従って、ヒトに連続投与装置を用いて本抽出物等を投与する場合の投与量としては、ラットで得られた8.0〜24 NU/kg/日を42〜1670分の1して、約0.005乃至0.57NU/kg/日という値が算出される。
以上のことから、本発明の好ましい実施態様としては以下のようなものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）ワクシニアウイルス接種炎症皮膚組織抽出物又はこれを含有する製剤を、連続投与装置により動物（ヒトを除く。）に持続的に投与することにより、該抽出物又はこれを含有する製剤の作用を試験する方法。
（２）連続投与装置が、動物の体外に装着するもの又は動物の体内に埋め込むものである（１）に記載の試験方法。
（３）連続投与装置が、動物の体内に埋め込むものである（１）に記載の試験方法。
（４）動物の体内に埋め込む連続投与装置が浸透圧ポンプである（２）又は（３）に記載の試験方法。
（５）ワクシニアウイルス接種炎症皮膚組織抽出物又はこれを含有する製剤の投与量が０．２乃至１０００単位／ｋｇ／日である（１）乃至（４）のいずれかに記載の試験方法。
（６）ワクシニアウイルス接種炎症皮膚組織抽出物又はこれを含有する製剤の投与量が５乃至３０単位／ｋｇ／日である（１）乃至（４）のいずれかに記載の試験方法。
（７）ワクシニアウイルス接種炎症皮膚組織抽出物又はこれを含有する製剤の投与量が１０μＬ乃至５０ｍＬ／ｋｇ／日である（１）乃至（４）のいずれかに記載の試験方法。
（８）ワクシニアウイルス接種炎症皮膚組織抽出物又はこれを含有する製剤の投与量が１００乃至３００μＬ／ｋｇ／日である（１）乃至（４）のいずれかに記載の試験方法。
（９）ワクシニアウイルス接種炎症皮膚組織抽出物又はこれを含有する製剤の投与期間が１日乃至６ヶ月である、（１）乃至（８）のいずれかに記載の試験方法。
（１０）ワクシニアウイルス接種炎症皮膚組織抽出物又はこれを含有する製剤の投与期間が３日乃至２ヶ月である、（１）乃至（８）のいずれかに記載の試験方法。
（１１）作用が、感覚機能に対する作用、運動機能に対する作用、電気生理学的機能に対する作用、又は、末梢神経における脱髄症状に対する作用である（１）乃至（１０）のいずれかに記載の試験方法。
（１２）炎症皮膚組織がウサギの炎症皮膚組織である（１）乃至（１１）のいずれかに記載の試験方法。
（１３）ワクシニアウイルス接種炎症皮膚組織抽出物又はこれを含有する製剤の連続投与装置による使用。
（１４）炎症皮膚組織がウサギの炎症皮膚組織である（１３）に記載の使用。
（１５）連続投与されることを特徴とする、ワクシニアウイルス接種炎症皮膚組織抽出物又はこれを含有する製剤
（１６）鎮痛剤である（１５）に記載の製剤。
（１７）末梢神経障害による急性又は慢性の疼痛に対する治療又は軽減剤である（１６）に記載の製剤。
（１８）末梢神経障害の治療又は軽減剤である（１５）に記載の製剤。
（１９）末梢神経障害が抗がん剤によるものである（１８）に記載の製剤。
（２０）抗がん剤による末梢神経障害が急性又は慢性の疼痛、しびれ、知覚異常、知覚過敏又は感覚異常である（１９）に記載の製剤。
（２１）炎症皮膚組織がウサギの炎症皮膚組織である（１５）乃至（２０）のいずれかに記載の製剤。
（２２）連続投与が連続投与装置によるものである（１５）乃至（２１）のいずれかに記載の製剤。
（２３）投与量が０．００１乃至１単位／ｋｇ／日である（１５）乃至（２２）のいずれかに記載の製剤。
（２４）投与量が０．００５乃至０．６単位／ｋｇ／日である（１５）乃至（２２）のいずれかに記載の製剤。
（２５）投与期間が１日乃至６ヶ月である、（１５）乃至（２４）のいずれかに記載の製剤。
（２６）投与期間が３日乃至２ヶ月である、（１５）乃至（２４）のいずれかに記載の製剤。
（２７）ワクシニアウイルス接種炎症皮膚組織抽出物又はこれを含有する製剤を連続投与することを特徴とする疼痛の治療又は軽減方法。
（２８）疼痛が、末梢神経障害による急性又は慢性の疼痛である（２７）に記載の治療又は軽減方法。
（２９）ワクシニアウイルス接種炎症皮膚組織抽出物又はこれを含有する製剤を連続投与することを特徴とする末梢神経障害の治療又は軽減方法。
（３０）末梢神経障害が抗がん剤によるものである（２９）に記載の治療又は軽減方法。
（３１）抗がん剤による末梢神経障害が急性又は慢性の疼痛、しびれ、知覚異常、知覚過敏又は感覚異常である（３０）に記載の治療又は軽減方法。
（３２）炎症皮膚組織がウサギの炎症皮膚組織である（２７）乃至（３１）のいずれかに記載の治療又は軽減方法。
（３３）連続投与が連続投与装置によるものである（２７）乃至（３２）のいずれかに記載の治療又は軽減方法。
（３４）投与量が０．００１乃至１単位／ｋｇ／日である（２７）乃至（３３）のいずれかに記載の治療又は軽減方法。
（３５）投与量が０．００５乃至０．６単位／ｋｇ／日である（２７）乃至（３３）のいずれかに記載の治療又は軽減方法。
（３６）投与期間が１日乃至６ヶ月である、（２７）乃至（３５）のいずれかに記載の治療又は軽減方法。
（３７）投与期間が３日乃至２ヶ月である、（２７）乃至（３５）のいずれかに記載の治療又は軽減方法。
以上のとおり、浸透圧ポンプを用いた連続投与により、従来の投与方法と比較して低用量で優れた作用を発揮することが明らかにされた。この結果から、本抽出物の投与は、投与量及び投与回数を減らすことができ、研究者の作業量を軽減できる効果的な試験方法となり得ると考えられた。また、本抽出物の持続投与製剤は投与量及び投与回数を減らすことができ、患者の服薬コンプライアンスの向上に効果的な製剤になり得ると考えられた。

Claims (10)

  1. ワクシニアウイルス接種炎症皮膚組織抽出物又はこれを含有する製剤を、連続投与装置により動物（ヒトを除く。）に持続的に投与することにより、該抽出物又はこれを含有する製剤の、感覚機能の改善作用、運動機能の改善作用、電気生理学的機能の改善作用、又は末梢神経における脱髄症状の改善作用を試験する方法。
  2. 連続投与装置が、動物の体外に装着するもの又は動物の体内に埋め込むものである請求項１に記載の試験方法。
  3. 連続投与装置が、動物の体内に埋め込むものである請求項１に記載の試験方法。
  4. 動物の体内に埋め込む連続投与装置が浸透圧ポンプである請求項２又は３に記載の試験方法。
  5. ワクシニアウイルス接種炎症皮膚組織抽出物又はこれを含有する製剤の投与量が０．２乃至１０００単位／ｋｇ／日である請求項１乃至４のいずれか一項に記載の試験方法。
  6. 炎症皮膚組織がウサギの炎症皮膚組織である請求項１乃至５のいずれか一項に記載の試験方法。
  7. ワクシニアウイルス接種炎症皮膚抽出物又はこれを含有する製剤の、感覚機能の改善作用、運動機能の改善作用、電気生理学的機能の改善作用、又は末梢神経における脱髄症状の改善作用を試験するための連続投与装置による使用。
  8. 連続投与装置が、浸透圧ポンプである請求項７に記載の使用。
  9. ワクシニアウイルス接種炎症皮膚組織抽出物又はこれを含有する製剤の連続投与装置による投与量が０．２乃至１０００単位／ｋｇ／日である請求項７又は８に記載の使用。
  10. 炎症皮膚組織がウサギの炎症皮膚組織である請求項７乃至９のいずれか一項に記載の使用。
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