CN108738345A

CN108738345A - 试验方法

Info

Publication number: CN108738345A
Application number: CN201780013239.4A
Authority: CN
Inventors: 田中启之; 村濑刚; 吉川秀树; 内木充; 松元智规
Original assignee: Nippon Zoki Pharmaceutical Co Ltd; Osaka University NUC
Current assignee: Nippon Zoki Pharmaceutical Co Ltd; Osaka University NUC
Priority date: 2016-02-24
Filing date: 2017-02-24
Publication date: 2018-11-02
Also published as: EP3421989A4; US20190175894A1; JP6757897B2; EP3421989A1; JPWO2017146230A1; US11129976B2; WO2017146230A1

Abstract

本发明的目的在于提供痘苗病毒接种炎症组织提取物或含有其的制剂的使用新型给药方法的试验方法等。根据本发明，表明通过使用连续给药装置将痘苗病毒接种炎症组织提取物或含有其的制剂持续给药，与口服给药等现有的给药方法相比，以非常低用量的给药量显示同等的效果。因此，本发明提供减轻了研究者的负担的使用动物的试验方法、以低用量的患者的治疗等。

Description

试验方法

技术领域

本发明关于使用痘苗病毒接种炎症组织提取物(以下，有时称为“本发明提取物”。)或含有本发明提取物的制剂(以下，有时称为“本发明制剂”，有时将本发明提取物和本发明制剂一起称为“本发明提取物等”。)的新型的试验方法等。更具体而言，关于以将本发明提取物等使用能够自动控制给药量地连续给药的装置(以下称为“连续给药装置”。)进行给药为特征的试验方法、以及利用本发明提取物等的治疗方法等。

背景技术

以往，作为将本发明提取物或本发明制剂对人或人以外的动物给药时的给药方法，已知有静脉内给药、腹腔内给药、肌肉内给药、皮下给药、口服给药等。在人接受本发明制剂的给药的情况下，例如在注射剂的情况下，需要在1日至数日接受1次注射，在片剂的情况下，需要1日2次服用。然而，为了接受注射剂的给药，每次都要去医院，这对于患者而言是一大负担，也会成为难以进行继续治疗的原因。另外，每日不忘记地以规定次数服用片剂的方式，也有些难以遵守。另一方面，在将本发明提取物等对人以外的动物继续给药来研究本发明提取物等的药效等的情况下，需要以1日1次这样的频度给药。然而，对动物每日投予本发明提取物等的作业繁杂，且在假期也无法休息，因此成为了研究者的负担。另外，本发明提取物等的连日给药对实验动物也造成莫大的应激，从爱护动物的观点来看也并不合适。

作为将药剂对人连续给药的方法，有从填充了药剂的袋进行静脉滴注的方法等。点滴器具也是能够以一定的流量将药剂在一定时间连续给药的方法，但是本人的活动受限，另外给药时间也有限。因此，还开发出了名称为“Infuser(注入器)”的器具，如果使用该器具，则在携带的状态下能够将药剂连续给药1周左右的期间。该器具也是连续给药装置的一种。为了对人以外的动物将药剂长时间连续给药，利用自动控制给药量的连续给药装置进行给药较为便利。连续给药装置既可以装配在动物的体外也可以埋入体内。作为装配在体外的连续给药装置，有例如以“Infusion pump MRBP-M/R”或“Infu-Disk(商标)”的名称销售的商品。该商品的优点为结构简单但精度高，装配和拆卸简单。另一方面，如果使用埋入体内(通常为皮下)的连续给药装置，则与装配在体外的类型相比，具有接受给药的动物能够更自由地运动的优点。作为包埋入体内的连续给药装置的一种，可以列举利用渗透压工作的连续给药装置(以下称为“渗透泵”)，例如以“alzet(注册商标)渗透泵”的名称销售。渗透泵是利用泵内的渗透压层与埋入有泵的组织环境的渗透压之差来工作的泵。即，通过形成泵的表面的半透膜，产生向泵内的水分的流入，通过该水分的流入，填充了药剂的具有柔软性的储存器被压缩，储存器内的药剂以一定的流量被挤出。作为其他的体内包埋型的连续给药装置，有以“iPRECIO(注册商标)SMP/IMS-200”的名称销售的商品。该商品通过内置的电池驱动微型马达，将药剂以一定的速度连续排出到外部，且在埋入体内后也能够补充药剂。因此，该商品在给药为长期间的情况或者从中途以其他浓度或种类的药剂给药的情况下便利。在本发明中，这些任意类型的连续给药装置都能够使用。

存在大量公开了将本发明涉及的本发明提取物或本发明制剂对动物或人给药来测试各种作用的文献。例如，专利文献1公开了本发明提取物通过向皮下的单次给药显示镇痛作用。专利文献2公开了通过本发明提取物向小鼠的腹腔内的1日1次、一周5次给药，显示抗癌作用、肝硬化抑制作用。专利文献3公开了通过将本发明提取物对大鼠口服单次给药，显示血流改善作用。专利文献4公开了通过将本发明提取物对大鼠1日1次静脉内给药，显示末梢循环障碍改善作用。然而，目前为止没有公开将本发明提取物等使用连续给药装置给药的试验方法或者治疗方法等的文献等，因此，其效果也为未知。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开昭53－101515号公报

专利文献2：日本特开昭55－87724号公报

专利文献3：日本特开平2－28119号公报

专利文献4：日本特开平7－97336号公报

发明内容

发明要解决的技术问题

本发明提供将本发明提取物等连续给药的试验方法、以及利用本发明提取物等的治疗方法等。

用于解决技术问题的技术方案

本发明的发明人发现通过将本发明提取物等使用连续给药装置持续性地给药，与注射或口服给药等目前已知的本发明提取物等的给药方法相比，以更低用量显示同等或同等以上的效果，并且根据此发现了利用本发明提取物等的新的治疗方法等，从而完成了本发明。

发明的效果

根据本发明，判明通过将本发明提取物等使用连续给药装置持续性地向动物给药的方法进行试验、实验、研究等(以下，在本申请中仅称为“试验”。)很有用。由此，能够以比现有的给药方法低的用量实施本发明提取物等的已知作用的确认。另外，还有发现用现有的给药方法无法确认的新的作用的可能性。此外，一直以来，需要将本发明提取物以每日或者一定频度给药的作业，但根据本发明，不需要数日乃至数月期间的给药作业等，能够明显减轻研究者的作业量。另外，由于对动物的负荷、应激也被减轻，所以从动物伦理点来看也有用。此外，在人的情况下，可以认为通过利用连续给药装置的本发明制剂的给药，有助于提高患者的持续治疗效果。本发明制剂是具有长年的使用经验的安全性高的药剂，因此，利用本发明的治疗的实用性极高。

在本发明中，“连续给药”是指将药剂以一定的速度(流速)以一定的时间以上持续地向体内给药的意思，“连续给药装置”是指能够自动地进行连续给药的装置，可以为任何类型的装置。例如，在体外装配类型的“Infu-Disk(商标)”时，有流速0.03～1.0mL/小时(液量5mL、使用时间5～167小时)的装置和流速0.03～4.0mL/小时(液量10mL、使用时间2.5～333小时)的商品销售。另一方面，在体内包埋型的“alzet(注册商标)渗透泵”的情况下，有流速0.11～10.0μL/小时、使用时间1日～6周的12种商品销售。“iPRECIO(注册商标)SMP/IMS-200”的情况下，流速为1.0～30.0μL/小时(液量0.9mL、通过补充最大约5mL)，使用时间能够达到1周～6个月。这些都能够作为本申请发明中的连续给药装置使用。

附图说明

图1是调查本发明提取物的连续给药对于由坐骨神经压挫损伤产生的知觉异常(钝麻)的效果的结果。

图2是调查本发明提取物的连续给药对于由坐骨神经压挫损伤产生的感觉神经的功能障碍的效果的结果。

图3是调查本发明提取物的连续给药对于由溶血磷脂酰胆碱(Lysophosphatidylcholine；LPC)给药产生的运动功能障碍的效果的结果。

图4是调查本发明提取物的连续给药对于由LPC给药产生的知觉异常(钝麻)的效果的结果。

图5是调查本发明提取物的连续给药对于由LPC给药产生的温热性知觉异常(钝麻)的效果的结果。

图6是以神经传导速度(Nerve conduction velocity；NCV)作为指标调查本发明提取物的连续给药对于由LPC给药产生的感觉神经的功能障碍的效果的结果。

图7是以复合肌肉动作电位(Compound muscle action potentials；CMAP)作为指标调查本发明提取物的连续给药对于由LPC给药产生的感觉神经的功能障碍的效果的结果。

图8是以终末潜伏期(Terminal latency；TL)作为指标调查本发明提取物的连续给药对于由LPC给药产生的感觉神经的功能障碍的效果的结果。

图9是调查本发明提取物的连续给药对于因LPC给药造成的神经脱髓后的神经轴索的再髓鞘化的效果的结果。

图10是调查本发明提取物的连续给药对于由紫杉醇给药产生的知觉异常(过敏)的效果的结果。

具体实施方式

本发明提取物是含有从接种痘苗病毒并发痘的动物的发炎组织提取和分离的非蛋白质性的活性物质的提取物。本发明提取物在提取状态下是液体，但也能够通过干燥制成固体。本发明制剂作为医药品是非常有用的。作为本发明制剂，在申请人在日本制造并销售的具体的商品中，有“含有接种痘苗病毒的家兔的炎症皮肤的提取液的制剂”(商品名：神经妥乐平/NEUROTROPIN〔注册商标〕)(以下称为“神经妥乐平”。)。神经妥乐平中有注射剂和片剂，都为医疗用医药品(ethical drug)。

神经妥乐平的注射剂的适应症为“腰痛症、颈肩腕综合症、症状性神经痛、伴随皮肤疾病(湿疹、皮炎、荨麻疹)的瘙痒、过敏性鼻炎、亚急性脊髓视神经病(SMON)后遗症状的寒冷感、知觉异常、疼痛”。神经妥乐平的片剂的适应症为“带状疱疹后遗神经痛、腰痛症、颈肩腕综合症、肩周炎、变形性关节症”。本发明制剂是申请人创制并作为医药品开发出来的，其有效性和安全性上的优异特长受到赞赏，已经销售多年，并已经在日本医药品市场中确立了稳固的地位。

本发明中的痘苗病毒接种炎症组织提取物能够通过如下操作得到：接种痘苗病毒，将发痘的炎症组织破碎，加入提取溶剂，除去组织碎片后，进行除蛋白处理，使其吸附于吸附剂，然后将有效成分洗脱。即，例如为如下的工序。

(A)收集接种痘苗病毒并使其发痘的兔、小鼠等的皮肤组织等，将发痘组织破碎，加入水、苯酚水、生理盐水或苯酚加甘油水等提取溶剂后，通过过滤或离心分离，得到提取液(滤液或上清液)。

(B)将上述提取液调整为酸性的pH并加热，进行除蛋白处理。接着，将除蛋白后的溶液调整为碱性并加热后，进行过滤或离心分离。

(C)使所得到的滤液或上清液成为酸性，使其吸附于活性炭、高岭土等吸附剂。

(D)在上述吸附剂中加入水等提取溶剂，调整为碱性的pH，将吸附成分洗脱，由此能够得到痘苗病毒接种炎症组织提取物。然后，也能够根据希望，通过适当将洗脱液在减压下蒸发干燥固化或冻结干燥，得到干燥固化物。

作为用于接种痘苗病毒得到炎症组织的动物，能够使用兔、牛、马、绵羊、山羊、猴、大鼠、小鼠等感染痘苗病毒的各种动物，作为炎症组织，优选兔的炎症皮肤组织。兔只要是属于兔目即可，可以使用任何兔子。作为例子，有：穴兔(Oryctolagus cuniculus)、家兔(驯养的穴兔)、野兔(日本野兔)、鼠兔和雪兔等。其中，适合使用家兔。在日本，有从过去被饲养的作为家畜或实验用动物而频繁使用的称为家养兔(イエウサギ)的兔，这也是家兔的别称。在家兔中存在多个品种(breed)，能够优选使用称为日本白色种和新西兰白色种(新西兰白)的品种。

痘苗病毒(vaccinia virus)可以是任意株的痘苗病毒。作为例子，可以列举李斯特(Lister)株、大连(Dairen)株、池田(Ikeda)株、EM-63株、纽约市公众卫生局(New YorkCity Board of Health)株等。

关于上述本发明提取物的基本的提取工序(A)～(D)，更详细而言，例如，能够作为如下的工序实施。

关于工序(A)

在兔的皮肤中将痘苗病毒进行皮内接种使其发痘，收集炎症皮肤组织。收集的皮肤组织以苯酚溶液等进行清洗、消毒。将该炎症皮肤组织破碎，加入其1至5倍量的提取溶剂。其中，所谓破碎是指使用绞碎机等细细地破碎为肉末状。另外，作为提取溶剂，能够使用蒸馏水、生理盐水、弱酸性至弱碱性的缓冲液等，也可以适当添加苯酚等的杀菌－防腐剂、甘油等的稳定剂、氯化钠、氯化钾、氯化镁等的盐类等。此时，也能够通过冷冻融化、超声波、细胞膜溶解酶或表面活性剂等的处理来破坏细胞组织，使提取变得容易。将得到的悬浮液放置5日至12日。在该期间，可以边适当搅拌或不搅拌边加温到30至45℃。通过对得到的液体进行固液分离(过滤或离心分离等)除去组织碎片，得到粗提取液(滤液或上清液)。

关于工序(B)

对在工序(A)中得到的粗提取液进行除蛋白处理。除蛋白能够由通常进行的公知方法实施，能够应用加热处理、利用蛋白质变性剂(例如酸、碱、脲、胍、丙酮等有机溶剂等)的处理、等电点沉淀、盐析等的方法。接着，利用除去不溶物的通常方法，例如使用滤纸(纤维素、硝酸纤维素等)、玻璃过滤器、硅藻土、塞茨过滤板(Seitz filter)等的过滤、超滤、离心分离等，得到除去了析出的不溶蛋白质的滤液或上清液。

关于工序(C)

将在工序(B)中得到的滤液或上清液调整为酸性、优选调整为pH3.5至5.5，进行向吸附剂的吸附操作。作为能够使用的吸附剂，能够列举活性炭、高岭土等，在提取液中添加吸附剂进行搅拌，或使提取液通过吸附剂填充柱，能够使有效成分吸附于该吸附剂。在提取液中添加吸附剂时，通过过滤或离心分离等除去溶液，能够得到吸附有活性成分的吸附剂。

关于工序(D)

为了使活性成分从工序(C)中得到的吸附剂中洗脱(脱离)，在该吸附剂中加入洗脱溶剂，调整为碱性、优选调整为pH9至12，在室温或适当加热、或者搅拌进行洗脱，以过滤或离心分离等通常的方法除去吸附剂。作为所使用的洗脱溶剂，能够使用碱性溶剂，例如，能够使用调整为碱性pH的水、甲醇、乙醇、异丙醇等或它们的适当的混合溶液，能够优选使用调整为pH9至12的水。洗脱溶剂的量能够适当设定。为了将这样操作得到的洗脱液作为原药使用，能够将pH适当地调整到中性附近等，最终得到接种痘苗病毒的兔炎症皮肤提取物(本发明提取物)。

本发明提取物在制成时为液体，因此也能够通过适当浓缩、稀释制成所希望浓度的提取物。从本发明提取物制造制剂时，优选实施加热灭菌处理。为了制成注射剂，例如，能够加入氯化钠等配制与生理盐水等渗的溶液。另外，也能够通过以液体或凝胶等的状态口服给药，也能够通过对本发明提取物进行适当的浓缩干燥固化等的操作，制造片剂等的口服用固体制剂。从本发明提取物制造这样的口服用固体制剂的具体方法记载于日本专利第3818657号和日本专利第4883798号的说明书中。这样操作得到的注射剂或口服用制剂等是本发明制剂的例子。另外，作为本发明制剂中填充于渗透泵等连续给药装置中的物质，液体的物质是适当的。因此，能够填充液体的本发明提取物或本发明制剂。

以下，表示本发明提取物的制造方法的例子、以及本发明提取物的新型的试验方法和使用该试验方法得到的药理试验结果，但本发明不受这些实施例的记载任何限制。

实施例

实施例1本发明提取物的制造

在健康成年家兔的皮肤中皮内接种痘苗病毒，切下并收集发痘的皮肤。收集的皮肤以苯酚溶液进行清洗、消毒后，除去多余的苯酚溶液，进行破碎，加入苯酚溶液混合，放置3～7日后，接着边搅拌3～4日边在35～40℃加热。然后，用盐酸将固液分离得到的提取液调整到pH4.5～5.2，以90～100℃加热处理30分钟后，过滤除去蛋白。再用氢氧化钠将滤液调整到pH9.0～9.5，以90～100℃加热处理15分钟后，进行固液分离。

用盐酸将得到的除蛋白液调整到pH4.0～4.3，加入除蛋白液质量的2％量的活性炭，搅拌2小时后，进行固液分离。在收集的活性炭中添加水，用氢氧化钠调整到pH9.5～10，以60℃搅拌90～100分钟后，进行离心分离得到上清液。在以离心分离沉淀的活性炭中再添加水后，用氢氧化钠调整到pH10.5～11，以60℃搅拌90～100分钟后，进行离心分离得到上清液。合并两上清液，用盐酸中和，得到本发明提取物。

实施例2(试验方法和试验结果)

接着，表示将上述实施例1中得到的本发明提取物通过连续给药装置给药的药理试验的试验方法和试验结果的一例。

此外，通过渗透泵向大鼠给药的体重每1kg的本发明提取物的给药量，在试验例1和2中，由给药开始时的体重计算，在试验例3中，由给药期间中的平均体重计算。

试验例1坐骨神经压挫损伤模型的评价

使用作为利用物理作用的末梢神经障碍模型的坐骨神经压挫损伤模型，调查本发明提取物对于从作为由末梢神经障碍引起的症状的知觉异常(钝麻)、运动功能障碍和电气生理学的障碍以及神经障碍的神经修复的效果。使用渗透泵将本发明提取物对大鼠连续给药，进行冯-弗雷试验和电气生理学的评价。

(1)坐骨神经压挫模型大鼠的制作和本发明提取物的给药

在渗透泵(商品名：alzet〔注册商标〕、型号：2ML2、DURECT公司)内分别注入生理盐水、本发明提取物，在37℃的生理盐水中静置一晩。对6周龄雄性Wistar系大鼠将咪达唑仑(2mg/kg)、布托啡诺(2.5mg/kg)、美托咪定(0.15mg/kg)的混合麻醉药进行腹腔内给药，实施深度镇静。将大鼠的左坐骨神经展开，在距坐骨切迹的远位5mm的位置，用镊子施加压挫损伤。压挫时间设为10秒钟，压挫次数设为3次，压挫操作的间隔设为10秒钟。将筋膜和皮肤用4-0尼龙缝合线缝合。将生理盐水封入渗透泵或本发明提取物封入渗透泵(12NU/kg/日)分别留置在大鼠的背部皮下。此外，实验大鼠分为以下的2组。

(1)发病对照组：施加坐骨神经压挫损伤，将生理盐水进行全身给药的组。

(2)本发明提取物给药组：施加坐骨神经压挫损伤，将本发明提取物进行全身给药的组。

渗透泵留置2周，更换渗透泵，再留置2周，将本发明提取物或生理盐水连续给药4周。

(2)冯-弗雷试验(von Frey test)

为了评价感觉功能，在术后4周的时刻使用冯-弗雷纤维丝(0.008g-26g、商品名：TouchTest〔注册商标〕、North Coast Medical公司)测定对于机械刺激的下肢反应阈值(mechanical hind paw withdrawal threshold)。使上述大鼠在网状的围栅上行走，记录对足底部用上述纤维丝施压而引起逃避行动的值。在评价时，分别测定健侧和患侧，算出患侧/健侧比进行评价。

试验结果

将上述试验的结果的一例表示于图1。

作为感觉神经的功能评价的对机械刺激的下肢反应阈值(mechanical hind pawwithdrawal threshold)的患侧/健侧比，与发病对照组相比较，在本发明提取物给药组中显著恢复，知觉异常(钝麻)改善。

(3)电气生理学的评价

对术后经过4周的大鼠用麻醉药实施镇静，在手术台使其为腹卧位。将左坐骨神经和左胫骨前肌展开。将坐骨神经压挫损伤部的近位侧和远位侧分别用双极电极刺激，从各测定值计算NCV。测定和评价使用数据收录-解析系统PowerLab 2/26(AD Instruments公司)。

试验结果

将上述试验的结果的一例表示于图2。

与发病对照组比较，在本发明提取物给药组中，确认到NCV的显著恢复，电气生理学的功能改善。

试验例2大鼠坐骨神经局部脱髓模型的评价

使用作为脱髓疾病模型的LPC诱发脱髓模型，调查本发明提取物对于作为由末梢神经障碍引起的症状的知觉异常(钝麻)、对温热刺激的知觉异常(钝麻)、从运动功能障碍和电气生理学的障碍以及神经障碍的神经修复的效果。用与上述试验例1(1)同样的方法，使用渗透泵将本发明提取物对大鼠连续给药，进行坐骨神经功能指数评价、冯-弗雷试验、热板试验、电气生理学的评价和免疫组织学的评价。

(1)坐骨神经局部脱髓模型大鼠的制作和本发明提取物的给药

与试验例1同样，在渗透泵(商品名：alzet〔注册商标〕、型号：2ML1、DURECT公司)内分别注入生理盐水、本发明提取物，在37℃的生理盐水中静置一晩。对6周龄雄性Wistar系大鼠将咪达唑仑(2mg/kg)、布托啡诺(2.5mg/kg)、美托咪定(0.15mg/kg)的混合麻醉药进行腹腔内给药，实施深度镇静。使左坐骨神经露出到坐骨切迹的水平，使用Hamilton注射器，将生理盐水或2％LPC(Sigma-Aldrich公司)分别在近位坐骨神经给药5μL。LPC给药7日后，将生理盐水封入渗透泵或本发明提取物封入渗透泵(24NU/kg/日)留置在背部皮下，之后1周，将生理盐水或本发明提取物连续给药。

(2)坐骨神经功能指数评价

为了评价运动功能，在术后2周的时刻测定坐骨神经功能指数(the sciaticfunction index；SFI)。为了测定SFI，在大鼠的后足的里侧蘸上墨水，在40cm见方的水平台上铺办公用纸(office paper)，在其上使大鼠步行并记录足迹。测量以下的项目，以下述式计算SFI。SFI＝0表示正常，SFI＝－100表示功能全废。另外，在术后经过中发生足趾的坏死、缺损的个体除外。

＜SFI数学式＞

SFI＝-38.3×((EPL-NPL)/NPL)+109.5×((ETS-NTS)/NTS)+13.3×((EITS-NITS)/NITS)-8.8

＜各项目＞

EPL＝experimental print length(实验足印长度)

NPL＝normal print length(正常足印长度)

ETS＝experimental toe spread(实验足印宽度)

NTS＝normal toe spread(正常足印宽度)

EITS＝experimental intermediary toe spread(实验中间足趾宽度)

NITS＝normal intermediary toe spread(正常中间足趾宽度)

试验结果

将上述试验的结果的一例表示于图3。

与脱髓对照组比较，在脱髓本发明提取物给药组中，确认到SFI的显著改善，运动功能改善。

(3)冯-弗雷试验(von Frey test)

为了评价感觉功能，在术后2周时刻，与上述试验例1(2)同样，使用冯-弗雷纤维丝(0.008g-26g、North Coast Medical公司)，测定健侧和患侧各自对机械刺激的下肢反应阈值(mechanical hind paw withdrawal threshold)，算出患侧/健侧比进行评价。

试验结果

将上述试验的结果的一例表示于图4。

在冯-弗雷试验中，与脱髓对照组比较，在脱髓本发明提取物给药组中，确认到显著的改善，知觉异常(钝麻)改善。

(4)热板试验(Hot plate test)

为了进行对温度刺激的评价，在术后2周时刻使用热板装置(Ugo basile公司)，在52.5℃的设定条件下测定显示患肢的最初的逃避反应(舔舐、抬起患肢)的时间(Hot platelatency)。截止时间设为45秒。

试验结果

将上述试验的结果的一例表示于图5。

在热板试验中，与脱髓对照组相比较，在脱髓本发明提取物给药组中，确认到显著的改善，温热性知觉异常(钝麻)改善。

(5)电气生理学的评价

用麻醉药对在术后经过了2周的大鼠实施镇静，使其在手术台为腹卧位，将左坐骨神经和左胫骨前肌展开。CMAP和TL通过用双极电极刺激坐骨神经近位来测定。NCV与上述试验例1(3)同样，分别用双极电极刺激坐骨神经压挫损伤部的近位侧和远位侧，由各测定值算出。测定和评价，与上述试验例1(3)同样，使用PowerLab 2/26(AD Instruments公司)。

试验结果

将上述试验的结果的一例表示于图6、7和8。

在NCV、CMAP和TL所有中，与脱髓对照组比较，在脱髓本发明提取物给药组中，确认到显著的改善，电气生理学的功能改善。

(6)免疫组织学的评价

对术后经过了2周的大鼠用麻醉药实施镇静，收集坐骨神经。用4％多聚甲醛在常温固定24小时后，浸渍于20％蔗糖溶液，包埋于Tissue Tech(Sakura Finetech Japan公司)，用液氮冻结，以5μm的厚度制作横断面的冻结切片。将冻结切片用100％甲醇在－20℃浸透30分钟，用PBS+0.2％TritonX+5％bovine serum albumin(牛血清白蛋白)封闭后，使作为一次抗体的抗NF200兔抗体(1：1000；102M4784、Sigma-Aldrich公司)和抗MBP小鼠抗体(1：1000；NE1018、CALBIOCHEM公司)在4℃反应一晩。反应后使作为二次抗体的Alexa 488标记山羊抗兔IgG抗体(1：1000；Lifetechnologies公司)和Alexa 568标记山羊抗小鼠IgG抗体(1：1000；Lifetechnologies公司)反应1小时。二次抗体反应后，为了评价核，与含有DAPI(4'-6-二脒基苯基-2-吲哚：和光纯药株式会社)的封片剂(商品名：Perma fluor〔注册商标〕、Thermo Fisher Scientific公司)反应。使用NIS Elements BR software(尼康公司)，评价MBP阳性轴索数/全轴索数。

试验结果

将上述试验的结果的一例表示于图9。

与脱髓对照组比较，在脱髓本发明提取物给药组中，确认到MBP阳性轴索数相对于全轴索数的显著上升，脱髓症状改善。

统计解析

在试验例1和试验例2中，统计解析使用JMP software version 11(SASInstitute公司)进行Tukey-Kramer HSD检验。在p＜0.05的情况下评价为有“显著差异”。

试验例3紫杉醇诱发大鼠末梢神经障碍模型的评价

调查本发明提取物对于作为在进行抗癌剂的紫杉醇给药时产生的副作用的末梢神经障碍的效果。使用渗透泵将本发明提取物对大鼠连续给药，进行冯-弗雷试验。

(1)紫杉醇诱发末梢神经障碍大鼠的制作和本发明提取物的给药

与试验例1同样，在渗透泵(商品名：alzet〔注册商标〕、型号：2ML2、DURECT公司)内分别注入生理盐水、本发明提取物，在37℃的生理盐水中静置一晩。使用6周龄的SD雄性大鼠，将紫杉醇(2mg/kg)每1日合计4次进行腹腔内给药，制作紫杉醇诱发末梢神经障碍大鼠。在正常对照组中，将作为紫杉醇的溶剂的聚氧乙烯蓖麻油和乙醇以体积比计1:1的方式混合得到的溶液再用生理盐水稀释3倍，与紫杉醇同样给药。在开始紫杉醇给药2周后，对正常对照组和发病对照组，将封入生理盐水的渗透泵留置在大鼠的背部皮下，对本发明提取物的渗透泵给药组，将封入了本发明提取物的渗透泵(8.0NU/kg/日)留置在大鼠的背部皮下。留置2周并将生理盐水或本发明提取物连续给药。

(2)本发明提取物的反复口服给药

对本发明提取物的反复口服给药组，从紫杉醇给药开始14日后到2周，将本发明提取物(200NU/kg/日)反复口服给药。

(3)冯-弗雷试验(von Frey test)

在底部为金属网的透明丙烯酸笼中，放入上述(1)的大鼠，驯化约3分钟后，使用冯-弗雷纤维丝(0.4-15.0g、North Coast Medical公司)测定右后肢对机械刺激的50％反应阈值，算出各组的平均值±标准误差。紫杉醇给药开始25日后(本发明提取物给药开始11日后)，测定本发明提取物的口服给药(200NU/kg/日)的开始时以及给药后1、4和24小时后对机械刺激的50％反应阈值。然后继续测定剩余3组(正常对照组、发病对照组和封入本发明提取物的渗透泵给药组)对机械刺激的50％反应阈值。

统计解析

在试验例3中，统计解析使用SAS System Version 9.1.3(SAS Institute公司)在2组之间比较中进行F检验，在等分散的情况下，进行Student的t检验，在不等分散的情况下，进行Welch的检验。p＜0.05时评价为有“显著差异”。

试验结果

将上述试验的结果的一例表示于图10。

在紫杉醇给药开始25日后(图10中的横轴0的时刻)、封入本发明提取物的渗透泵给药组对于机械刺激的50％反应阈值，与发病对照组相比较，显著上升。另外，本发明提取物反复口服给药组对于机械刺激的50％反应阈值，在紫杉醇给药开始25日后，与发病对照组相比较，显著上升。封入本发明提取物的渗透泵给药组和本发明提取物反复口服给药组中的本发明提取物的给药量分别为8.0NU/kg/日和200NU/kg/日，但两者的效果基本为相同程度。虽然存在皮下给药和口服给药的差异，但是通过利用渗透泵的本发明提取物的连续给药，显示非常高的效果。

作为将本发明制剂向需要治疗的患者(人)给药的方法，可以列举注射剂的静脉内、皮下、肌肉内给药和片剂的口服给药等。给药量可以适当设定，但由市售的本发明制剂(神经妥乐平〔注册商标〕)所确认的给药量，标准上，在注射剂时为1日3.6至7.2NU，口服剂(片剂)时为1日16NU。将其以人的体重为60kg计算。则对人的给药量，在注射剂时为0.06至0.12NU/kg/日，在口服剂(片剂)时为约0.27NU/kg/日。此外，“NU”是“神经妥乐平单位”的简写，“神经妥乐平单位”是使用疼痛阈值比正常动物低的慢性应激动物即SART应激小鼠，按照改进的Randall-Selitto方法进行试验，基于镇痛效力的ED₅₀值进行规定的。1NU是表示ED₅₀值为100mg/kg时的神经妥乐平制剂的含镇痛活性的成分1mg的活性。在作为神经妥乐平注射剂的仿制药的“NABUTOPIN”(注册商标)和类似品“Analgecine”(注册商标)中，使用“单位”，但实质上与“神经妥乐平单位”的意思相同。因此，在本申请中，记作“单位”。

根据对实施例2(试验例1～3)的大鼠使用连续给药装置将本发明提取物进行皮下给药得到的实验结果，作为本发明提取物的有效的给药量，显示为12NU/kg/日(试验例1)、24NU/kg/日(试验例2)和8.0NU/kg/日(试验例3)。因此，作为使用连续给药装置时的本发明提取物的有效量的范围，8.0～24NU/kg/日可以作为一个大致标准。但是由于这是大鼠的大致标准，所以需要充分考虑如果动物种类不同，则该范围也不同。试验例3中进行的大鼠的口服给药的有效给药量为200NU/kg/日，但根据长年进行将本发明提取物等对动物给药的试验的申请人的经验，在将本发明提取物等用口服进行给药的情况下，往往是通过设为100～200NU/kg/日的量可见效果。如果单纯比较此，则在大鼠的情况下，使用连续给药装置进行皮下给药时，与口服给药相比，本发明提取物的给药量为4分之1(24÷100)至24分之1(8.0÷200)就足够。而以市售的本发明制剂(神经妥乐平〔注册商标〕)所确认的给药量，如上所述，在口服剂(片剂)时约为0.27NU/kg/日。这样来看估计在口服给药的情况下，有效给药量在大鼠时相比于人高约370(100÷0.27)～740(200÷0.27)倍(人在大鼠的370～740分之1起作用)。因此，作为对人使用连续给药装置将本发明提取物等给药时的给药量，为由大鼠得到的8.0～24NU/kg/日的370～740分之1，计算出为约0.011至0.065NU/kg/日的值。

另一方面，根据申请人的经验，在对动物注射(静脉内、皮下、腹腔内)本发明提取物等的情况下，往往以5～100NU/kg/日的量可见效果。以市售的本发明制剂(神经妥乐平〔注册商标〕)的注射剂确认的给药量，如上所述，为0.06至0.12NU/kg/日。这样一来可以估计在利用注射给药的情况下，有效给药量在大鼠时比人高约42(5÷0.12)～1670(100÷0.06)倍(人在大鼠的42～1670分之1起作用)。因此，作为在对人使用连续给药装置将本发明提取物等给药时的给药量，为由大鼠得到的8.0～24NU/kg/日的42～1670分之1，计算出为约0.005乃至0.57NU/kg/日的值。

由上可知，作为本发明的优选实施方式，可以列举以下方式，但并不限定于这些。

(1)一种试验方法，其将痘苗病毒接种炎症皮肤组织提取物或含有其的制剂利用连续给药装置对动物(不包括人)持续给药，由此，对该提取物或含有其的制剂的作用进行试验。

(2)如(1)所述的试验方法，其中，连续给药装置装配在动物的体外或埋入动物的体内。

(3)如(1)所述的试验方法，其中，连续给药装置埋入动物的体内。

(4)如(2)或(3)所述的试验方法，其中，埋入动物的体内的连续给药装置为渗透泵。

(5)如(1)至(4)中任一项所述的试验方法，其中，痘苗病毒接种炎症皮肤组织提取物或含有其的制剂的给药量为0.2至1000单位/kg/日。

(6)如(1)至(4)中任一项所述的试验方法，其中，痘苗病毒接种炎症皮肤组织提取物或含有其的制剂的给药量为5至30单位/kg/日。

(7)如(1)至(4)中任一项所述的试验方法，其中，痘苗病毒接种炎症皮肤组织提取物或含有其的制剂的给药量为10μL至50mL/kg/日。

(8)如(1)至(4)中任一项所述的试验方法，其中，痘苗病毒接种炎症皮肤组织提取物或含有其的制剂的给药量为100至300μL/kg/日。

(9)如(1)至(8)中任一项所述的试验方法，其中，痘苗病毒接种炎症皮肤组织提取物或含有其的制剂的给药期间为1日至6个月。

(10)如(1)至(8)中任一项所述的试验方法，其中，痘苗病毒接种炎症皮肤组织提取物或含有其的制剂的给药期间为3日至2个月。

(11)如(1)至(10)中任一项所述的试验方法，其中，作用为对感觉功能的作用、对运动功能的作用、对电气生理学的功能的作用、或对末梢神经的脱髓症状的作用。

(12)如(1)至(11)中任一项所述的试验方法，其中，炎症皮肤组织为兔的炎症皮肤组织。

(13)痘苗病毒接种炎症皮肤组织提取物或含有其的制剂的通过连续给药装置的使用。

(14)如(13)所述的使用，其中，炎症皮肤组织为兔的炎症皮肤组织。

(15)一种痘苗病毒接种炎症皮肤组织提取物或含有其的制剂，其特征在于，被连续给药。

(16)如(15)所述的制剂，其为镇痛剂。

(17)如(16)所述的制剂，其为对由末梢神经障碍引起的急性或慢性的疼痛的治疗或减轻剂。

(18)如(15)所述的制剂，其为末梢神经障碍的治疗或减轻剂。

(19)如(18)所述的制剂，其中，末梢神经障碍是由抗癌剂引起的。

(20)如(19)所述的制剂，其中，由抗癌剂引起的末梢神经障碍为急性或慢性的疼痛、麻木、知觉异常、知觉过敏或感觉异常。

(21)如(15)至(20)中任一项所述的制剂，其中，炎症皮肤组织为兔的炎症皮肤组织。

(22)如(15)至(21)中任一项所述的制剂，其中，连续给药是通过连续给药装置进行的。

(23)如(15)至(22)中任一项所述的制剂，其中，给药量为0.001至1单位/kg/日。

(24)如(15)至(22)中任一项所述的制剂，其中，给药量为0.005至0.6单位/kg/日。

(25)如(15)至(24)中任一项所述的制剂，其中，给药期间为1日至6个月。

(26)如(15)至(24)中任一项所述的制剂，其中，给药期间为3日至2个月。

(27)一种疼痛的治疗或减轻方法，其特征在于将痘苗病毒接种炎症皮肤组织提取物或含有其的制剂连续给药。

(28)如(27)所述的治疗或减轻方法，其中，疼痛为由末梢神经障碍引起的急性或慢性的疼痛。

(29)一种末梢神经障碍的治疗或减轻方法，其特征在于，将痘苗病毒接种炎症皮肤组织提取物或含有其的制剂连续给药。

(30)如(29)所述的治疗或减轻方法，其中，末梢神经障碍为由抗癌剂引起的。

(31)如(30)所述的治疗或减轻方法，其中，由抗癌剂引起的末梢神经障碍为急性或慢性的疼痛、麻木、知觉异常、知觉过敏或感觉异常。

(32)如(27)至(31)中任一项所述的治疗或减轻方法，其中，炎症皮肤组织为兔的炎症皮肤组织。

(33)如(27)至(32)中任一项所述的治疗或减轻方法，其中，连续给药为利用连续给药装置进行的。

(34)如(27)至(33)中任一项所述的治疗或减轻方法，其中，给药量为0.001至1单位/kg/日。

(35)如(27)至(33)中任一项所述的治疗或减轻方法，其中，给药量为0.005至0.6单位/kg/日。

(36)如(27)至(35)中任一项所述的治疗或减轻方法，其中，给药期间为1日至6个月。

(37)如(27)至(35)中任一项所述的治疗或减轻方法，其中，给药期间为3日至2个月。

产业上的可利用性

如上所述可知，通过利用渗透泵的连续给药，与现有的给药方法相比较，以低用量发挥优异的作用。由该结果可以认为本发明提取物的给药能够减少给药量和给药次数，可以成为能够减轻研究者的作业量的有效的试验方法。另外可以认为本发明提取物的持续给药制剂能够减少给药量和给药次数，可以成为对提高患者的服药依从性有效的制剂。

Claims

1.一种试验方法，其特征在于：

将痘苗病毒接种炎症皮肤组织提取物或含有其的制剂利用连续给药装置对动物持续给药，由此，对该提取物或含有其的制剂的作用进行试验，其中动物不包括人。

2.如权利要求1所述的试验方法，其特征在于：

连续给药装置装配在动物的体外或者埋入动物的体内。

3.如权利要求1所述的试验方法，其特征在于：

连续给药装置埋入动物的体内。

4.如权利要求2或3所述的试验方法，其特征在于：

埋入动物的体内的连续给药装置为渗透泵。

5.如权利要求1～4中任一项所述的试验方法，其特征在于：

痘苗病毒接种炎症皮肤组织提取物或含有其的制剂的给药量为0.2至1000单位/kg/日。

6.如权利要求1～5中任一项所述的试验方法，其特征在于：

炎症皮肤组织为兔的炎症皮肤组织。

7.痘苗病毒接种炎症皮肤提取物或含有其的制剂的通过连续给药装置的使用。

8.如权利要求7所述的使用，其特征在于：

炎症皮肤组织为兔的炎症皮肤组织。