PT1322330E - Modulação de resposta alérgica - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MODULAÇÃO DE RESPOSTA ALÉRGICA"

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito à área das vacinas e dos tratamentos da alergia. Mais especialmente, a presente invenção diz respeito a um método de administração de alergénios.

ANTECEDENTES

Uma alergia é o resultado de uma violenta reacção do sistema imunitário contra uma substância que normalmente deveria ser inofensiva para o hospedeiro. Um estudo recente realizado pelo American College of Allergy, Asthma and Immunology (ACAAI) revela que aproximadamente 38% da população norte-americana sofre de alergias (Immunotherapy Weekly, 29 de Novembro de 1999) . Se a estimativa do ACAAI está correcta, pelo menos 8b milhões de Americanos sofrem de alergias.

As alergias devem-se a um desequilíbrio ou uma hípersensibilidade do sistema imunitário, que leva a uma resposta imunitária mal dirigida. Uma resposta alérgica ocorre quando o sistema imunitário reage inadequadamente a agentes muito específicos que na maioria das pessoas não induzem uma resposta imunitária, como pólenes de árvores e de gramíneas, baratas, ácaros do pó, descamação ("dander") de animais, látex, ou venenos de abelhas, vespas e formigas-de--fogo ("fire ant") . Outros alergénios comuns incluem alimentos como amendoins, frutos secos de árvore ("tree 2 nuts"), leite, peixe, marisco, ovos, soja, trigo, mel, melão cantalupo, morangos e frutas tropicais, fármacos como a penicilina, anestésicos, soro, algumas viroses, bactérias e protozoários, e bolor. Reacções de hipersensibilidade do tipo tardias podem ocorrer em resposta ao urushiol, um óleo encontrado em plantas da espécie Anacardiaceae nos géneros Rhus radicans ("poison ivy") Rhus diversibolum ("poison oak") e sumagre, originando uma grave erupção cutânea que transmite uma desconfortável sensação de irritação e a formação de vesículas exsudativas.

Os alergénios são discutidos nos artigos seguintes, entre outros: Blaauw PJ, Smithuis OL, Elbers AR. The value of na in-hospital insect sting challenge as a criterion for application or omission of venom immunotherapy. J Allergy Clin Immunol. 1996; 98:39-47; Bousquet, J, Lockey, RF, Mailing, H-J. Allergen immunotherapy: therapeutic vaccines for allergic diseases [WHO Position Paper]. World Health Organization, Allergy. 1998; 53 (supl): 12-16; Lack G, Nelson HS, Amran D, et al. Rush immunotherapy results in allergen-specific alterations in lymphocyte function and interferon-γ production in CD4+ T cells. J. Allergy Clin Immunol. 1997; 99:530-538; Miiller U. Diagnosis and treatment of insect sting sensitivity. J. Asthma. Res. 1966; 3: 331-333; Weber, RW. Immunotherapy with allergens. JAMA. 1997; 278: 1881-1887. A primeira exposição a um alergénio efectivo causa apenas uma ligeira resposta imunitária que sensibiliza o sistema imunitário contra a substância. Entretanto, exposições subsequentes ao alergénio originam sintomas alérgicos, caracteristicamente de um modo dependente da dose (isto é, o alergénio tem de atingir um determinado limiar), e podem induzir respostas cada vez mais graves com exposições

J repelidas. Os sintomas alérgicos incluem comichão e tumefacção dos tecidos afectados, erupções cutâneas, espasmos musculares e outros sintomas mais graves. Relativamente à classificação das reacções alérgicas segundo Míiller consultar o seguinte Quadro 1. 0 tipo de sintomas depende do alergénio especifico, da parte do corpo onde ocorre a exposição, e do grau de sensibilização do indivíduo. Os alergénios que são inalados induzem frequentemente congestão nasal, uma desconfortável sensação de irritação no nariz e na garganta, e produção de muco. Em indivíduos muito alérgicos ou com doses elevadas de alergénio, ocorrem tosse, sibilação, ou sintomas similares. Em contraste, os alergénios ingeridos induzem comichão na garganta, vómitos, cãibras estomacais, diarreia, e erupções cutâneas ou choque, em casos de acentuada sensibilidade. 0 eczema está também associado a alergias; um decréscimo nas alergias resulta na melhoria do eczema.

Quadro 1 Classificação das Reacções Alérgicas segundo Míiller

Grandes reacções locais Tumefacção no local da picada com diâmetro >10 cm, duração >24 horas Reacções sistémicas Grau I: Urticáría generalizada, comichão, mal-estar, ansiedade Grau II: Uma qualquer das anteriores, mais duas ou mais das seguintes: angioedema (também grau II quando ocorre isolado), constrição torácica, náuseas, vómitos, diarreia, dor abdominal, tonturas Grau III: Uma qualquer das anteriores, mais duas ou mais das seguintes: dispneia, sibilação, estridor (uma qualquer destas reacções isoladas representam grau III), disfagia, disartria, rouquidão, fraqueza, confusão Grau IV: Uma qualquer das anteriores, mais duas ou mais das seguintes: queda da pressão arterial, colapso, perda de consciência, incontinência (urina, fezes), cianose 4

Os maiores números de doentes alérgicos, aproximadamente 45 milhões de Americanos, são os alérgicos ao pólen e os afectados por doenças respiratórias como rinite alérgica, febre dos fenos e asma. As pessoas com alergias sazonais aos pólenes desenvolvem frequentemente sensibilidade cruzada a outros alergénios que estão presentes todo o ano, como os ácaros do pó. As pessoas com alergias respiratórias crónicas desenvolvem frequentemente asma, o que representa a consequência da activação a longo prazo da resposta alérgica/inflamatória do sistema respiratório. Os sintomas da asma incluem tosse, sibilação, e falta de ar devido à contracção dos canais brônquicos, produção de muco em excesso e inflamação. A asma pode ser incapacitante e por vezes fatal. A alergia às baratas é uma alergia aos excrementos das mesmas, e constitui um agente desencadeante de ataques asmáticos. A alergia aos ácaros do pó é uma alergia aos excrementos de um organismo microscópico que vive no pó em todas as habitações e nos locais de trabalho, e na realidade em todas as roupas de cama. Os ácaros do pó constituem talvez a causa mais comum da rinite alérgica permanente, produtora de sintomas similares aos da alergia aos pólenes e à asma. Aproximadamente metade de todas as pessoas que padecem de alergia é alérgica aos ácaros do pó.

Mais de 10 milhões de Americanos são alérgicos a animais. Os animais domésticos são a fonte mais comum dessas reacções. Muitas pessoas pensam que o pêlo ("fur") dos gatos e dos cães causa as alergias aos animais de estimação. No entanto, os principais alergénios são as proteínas segregadas peias glândulas sebáceas da pele dos animais e espalhadas nas escamas da pele {"dander"); e na saliva, que se liga ao pêlo 5 quando o animal se lambe a si mesmo. Quando a saliva que transporta as proteínas seca, as proteínas flutuam no ar e são inaladas pelas pessoas. Alguns roedores, como cobaias e gerbos, tornaram-se cada vez mais populares como animais domésticos. Eles podem também induzir reacções alérgicas em algumas pessoas, como o fazem murganhos e ratos.

As alergias alimentares afectam entre 6 e 7 milhões de Americanos. As alergias alimentares são diferentes das intolerâncias alimentares, tendo em vista que as intolerâncias alimentares não envolvem o sistema imunitário. Até 3 milhões de Americanos são extremamente alérgicos a amendoins e frutos secos de árvore ("tree nuts") . Oito alimentos são responsáveis por 90% das alergias alimentares: leite, peixe, amendoins, frutos secos de árvore ("tree nuts"), ovos, soja, trigo, e mariscos. Nesses casos, as reacções sistémicas podem ser graves, como o desencadeamento do choque alérgico. Para evitar consequências graves incluindo a morte, as pessoas alérgicas a alimentos trazem consigo potentes anti-histamínicos. Todavia, o tratamento ou as medidas preventivas para as alergias alimentares são frequentemente apenas insignificantemente eficazes. A principal terapia consiste apenas em evitar totalmente o alergénio específico. Injecções para a alergia ou vacinas contra as alergias ("allergy shots") subcutâneas convencionais são ineficazes contra alergias alimentares.

Aproximadamente 5 milhões de pessoas nos Estados Unidos são alérgicas a ferroadas de abelhas ou de vespas, em muitos casos com sintomas capazes de porem a vida em risco. Três de cinco das pessoas alérgicas picadas experimentarão uma grave reacção se picadas de novo. 6

Nos países desenvolvidos, a frequência das reacções alérgicas aumentou dramaticamente nos últimos anos, na medida em que aproximadamente 20% ou mais da população dos Estados Unidos sofrem de alergias a alguma substância comum. Além de tudo, as doenças alérgicas são a 6a causa líder da doença crónica nos Estados Unidos. Hereditariedade, condições ambientais, tipo e número de exposições, e diversos factores fisiológicos como stresse, fadiga e perturbação emocional podem aumentar a sensibilidade do sistema imunitário e predispor a pessoa para alergias. A razão para o aumento do número de doentes alérgicos encontra-se actualmente sob intenso debate científico. Existem algumas explicações possíveis com as quais a maioria dos cientistas está de acordo. A poluição do ar com óxidos de azoto (N0X) pode contribuir para a frequência crescente da doença alérgica das vias respiratórias. Os óxidos de azoto aumentam não apenas a produção das proteínas alérgicas do pólen, mas lesionam também directamente as células sensíveis que revestem as vias aéreas da garganta e dos pulmões. Essa lesão tem o efeito de permitir a entrada de mais alergénios no corpo através das células danificadas que normalmente actuam como um revestimento protector. O problema piora quando partículas de smogue são adsorvídas pelo pólen e actuam como um adjuvante, intensificando os efeitos dos alergénios.

Muitos cientistas acreditam que o fenómeno conhecido por reactividade cruzada ("cross-reactivity") pode também ser a causa do problema das alergias crescentes. A reactividade cruzada ocorre quando uma pessoa, exposta a um alergénio específico, apresenta posteriormente um aumento de sensibilização a um outro tipo de alergénio similar. 7

Frequentemente observa-se que as alergias alimentares estão associadas a doenças alérgicas das vias respiratórias. Por exemplo, se uma pessoa inala o pólen da avelãzeira, pode desenvolver uma alergia a avelãs. A reactividade cruzada entre alergénios provenientes do pólen e alergénios presentes nos alimentos podem constituir de facto uma das principais causas de alergias alimentares em adultos.

Além disso, os cientistas têm em conta que as campanhas de vacinação em larga escala e a utilização amplamente propagada de antibióticos ao longo de apenas as últimas décadas, que reduziram dramaticamente a gravidade das doenças infecciosas, podem também ter alterado o sistema imunitário da população, tornando as pessoas mais susceptíveis a alergias. Embora a medicina contemporânea e as vacinas tenham diminuído a carga da doença infecciosa, a maior prevalência de alergias pode constituir um possível "trade-off" (escolha entre soluções onde a escolha de uma implica a não escolha de outra). A luz do impacto da escalada social e económica das alergias, o combate às mesmas tornou-se um compromisso médico de importância crescente. Os médicos utilizam três abordagens gerais para auxiliar as pessoas com alergias: aconselham os doentes quanto às formas de evitar os alergénios tanto quanto possível, prescrevem medicação para suspender os sintomas alérgicos, e administram uma série de vacinas contra a alergia ("allergy shots"). Actualmente existem diversos potentes fármacos anti-alérgicos. Contudo, esses fármacos tratam simplesmente os sintomas das alergias, e alguns deles acarretam o risco de graves efeitos secundários. Uma outra estratégia consiste em desenvolver formas de condicionar o sistema imunitário para responder "apropriadamente" aos alergénios. Apenas esta última tentativa, vacinas contra a alergia ou imunoterapia, é um tratamento causativo em prol das alergias. A imunoterapia por alergénios ou hipossensibilização consiste na prática de administrar de um modo gradual quantidades crescentes de um alergénio a um indivíduo alérgico para melhorar os sintomas (reacçãc alérgica) associada a uma exposição subsequente ao alergénio causador. A imunoterapia por alergénios foi introduzida em 1911 para tratar a "polinose" e está presentemente estabelecida como o tratamento preferido no caso de alergias graves.

As vacinas contra a alergia têm demonstrado serem úteis em muitos casos para significativamente e permanentemente suspenderem o grau de sofrimento que afecta os indivíduos alérgicos. De facto, o tratamento corrente com uma vacina contra a alergia é o único método que se pode considerar como um meio curativo para inverter o estado da doença. A dessensibilização precoce utilizando o tratamento contra alergénios específicos com uma vacina contra a alergia também tem provado alguma eficácia contra a ocorrência de alergias reactivas cruzadas a outras substâncias. Por exemplo, um doente a que se administram vacinas contra alergias para tratar a febre-dos-fenos por dessensibilização ao pólen apresenta um risco reduzido de se tornar alérgico ao pêlo do gato ou a outros alergénios comuns.

Apesar das vacinas contra a alergia serem presentemente o único meio para tratar a doença em vez de os sintomas, existem óbvias desvantagens em relação a esse tratamento tal como se realiza hoje. A imunoterapia convencional é prolongada, com uma duração de 2 a 5 anos, dispendiosa, e 9 apenas insignificantemente eficaz. Esse tratamento é ineficaz em um terço de todos os doentes alérgicos e apenas temporariamente eficaz em um terço dcs indivíduos alérgicos. A imunoterapia apresenta eficácia a longo prazo em apenas o restante terço da população alérgica. A duração do tratamento por imunoterapia convencional é longa e necessita de tempo, compreendendo normalmente um total de 30 a 100 injecções de alergénios, exigindo cada uma 1 hora ou mais de estrita supervisão médica após a administração da vacina injectável. Para a dessensibilização a determinados alergénios que são conhecidos por originarem graves efeitos secundários, como o veneno de insectos, pêlo de gato ou ácaros do pó, os doentes devem permanecer no consultório do médico durante uma hora após cada injecção para observação. Consequentemente, para esse tipo de tratamento os custos médicos e económicos são muito elevados.

Os modos de tratamento com vacinas injectáveis contra alergias envolvem de um modo característico 2 fases de tratamento. A Ia fase utiliza aproximadamente 20 vacinas injectáveis contra alergias. Durante essa fase aumenta-se em cada dose a quantidade de alergénio ínjectado, iniciando com quantidades mínimas (tão baixas como 0,01 pg) . Mediante um esquema de administração regular, adminístram-se injecções de extractos diluídos do alergénio, habitualmente duas vezes por semana ou primeiramente semanalmente, em doses crescentes até se atingir uma dose de manutenção de aproximadamente 100 pg. Essa dose de manutenção, atingida após aproximadamente 20 semanas, injecta-se em seguida cada uma de 2 a 4 semanas durante um período de 3 ou mais anos. 10

Alcançar uma dose de manutenção consome habitualmente alguns meses e pode ocupar até 3 anos. Os doentes podem sentir algum alívio dentro de um período de 6 meses; contudo, se não se observar benefício dentro de 18 meses, interrompe--se geralmente a administração das vacinas. Após a interrupção da imunoterapia, aproximadamente um terço dos doentes alérgicos não apresenta mais quaisquer sintomas, um terço apresenta sintomas reduzidos, e um terço sofre uma recaída total.

Além disso, durante a fase de dessensibilização, como se administram mais alergénios as injecções originam habitualmente efeitos secundários moderados e algumas vezes graves variando desde a ulceração e a tumefacção local (erupção brilhante e intensa) ou a erupção cutânea (pápula) no local da administração até efeitos alérgicos sistémicos como erupção cutânea generalizada ou urticária, asma, ou mesmo choque alérgico (anafilaxia). Outros efeitos secundários comuns da imunoterapia incluem comichão generalizada (prurido), olhos vermelhos e pressão sanguínea baixa. Os efeitos secundários ocorrem geralmente no período de 20 minutos, embora alguns possam surgir até 2 horas após a administração da vacina injectável antialérgica. O termo anafilaxia refere-se a uma reacção alérgica caracterizada por uma queda acentuada da pressão sanguínea, urticária ou erupções brilhantes e intensas, e dificuldades respiratórias, que ocorrem imediatamente, progridem rapidamente e ameaçam a vida. A anafilaxia é a reacção mais grave que pode provir da imunoterapia convencional. A evolução de uma resposta imunitária específica exige que as células do sisbema imunitário encontrem um antigénio, e que os linfócitos T e B reajam mutuamente e com outras 11 células apresentadoras de antigénios (APC) para eliminar agentes patogénicos extracelulares ou toxinas. Quando uma pessoa alérgica contacta pela primeira vez com um alergénio, o sistema imunitário produz grandes quantidades de um tipo de anticorpos denominado imunoglobulina E, ou IgE. Cada anticorpo IgE liga-se com grande afinidade a uma determinada substância alergénica. No caso de alergia aos pólenes, o anticorpo é especifico para cada tipo de pólen. Por exemplo, produz-se um tipo de anticorpos para reagir contra o pólen de artemísia, e um outro contra o pólen de ambrósia. 0 veneno das abelhas, que contem a proteína PLA2, induz anticorpos anti-PLA2. Durante a fase inicial da resposta imunitária, produzem-se anticorpos IgGl de baixa afinidade específicos de anti-PLA2. Após ferroadas repetidas, os doentes com imunidade normal produzem anticorpos IgG4 de baixa afinidade específicos de anti-PLA2, mas os doentes alérgicos ao veneno de abelhas produzem anticorpos IgE específicos anti-PLA?. Mastócitos estimuladores do sistema imunitário nos tecidos, e basófilos no sangue ligar-se-ão ao anticorpo IgE e libertarão poderosos mediadores inflamatórios (citocinas). Essas citocinas actuam sobre os tecidos em várias partes do corpo, como o sistema respiratório, originando os sintomas de alergia.

Uma imunoterapia bem sucedida é acompanhada por uma diminuição das IgE específicas da PLA2, e um aumento das IgG específicas da PLA2. Os mecanismos precisos por meio dos quais a imunoterapia com alergénios obtém a melhoria clínica dos sintomas dos doentes alérgicos não está ainda totalmente esclarecida, embora pareça como se anticorpos IgGl sejam capazes de proteger contra a reacção alérgica. A imunoterapia está associada a uma redução da secreção das citocinas IL-4 e IL-5 induzida pelo alergénio, e a um aumento simultâneo da 12 secreção do IFN-y por células T específicas do alergénio. 0 Pedido PCT da patente de invenção WO 01/82963 cabe no âmbito dos termos do Artigo 54(3) e diz respeito a métodos e composições para induzir uma célula apresentadora de antigénios a apresentar um determinado epitopo específico da célula alvo promovendo, desse modo, uma resposta eficaz da célula T citotóxica à célula alvo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente descrição diz respeito a um método eficaz de administração de alergénios. A presente descrição também diz respeito a um método de administração de alergénios que utiliza eficazmente uma baixa posologia de alergénios. A presente descrição também diz respeito a um modo de tratamento de alergias que é capaz de modular uma ocorrência alérgica após somente poucas injecções. A presente descrição também diz respeito a um modo de tratamento com alergénios que se caracteriza por reduzidos efeitos secundários.

Descreve-se também um método de modular uma resposta alérgica de um indivíduo que consiste na administração por ínjecção directa de um alergénio em um gânglio linfático do citado indivíduo por meio do que se procede à modulação da resposta alérgica. Em indivíduos que não possuem gânglios linfáticos ou que possuem gânglios linfáticos defeituosos, pode administrár-se o alergénio no tecido linfático ou em uma célula imunitária. A presente invenção proporciona a 13 utilização de um alergénio para a fabricação de um medicamento para o tratamento da alergia por injecção directa desse medicamento em um gânglio linfático de um indivíduo. Em um aspecto específico da presente invenção associa-se o alergénio a um adjuvante, ou precipita-se sobre, ou liga-se a uma substância capaz de proporcionar a libertação ou a um substância incluída em uma fórmula. Descrevem-se ainda outros aspectos da presente invenção na Descrição das Formas de Realização Preferidas da presente invenção. 0 método descrito na presente memória descritiva considera a utilização da administração em gânglios linfáticos de medicamentos preparados a partir de alergénios para reequilibrar o sistema imunitário mais eficazmente do que se conseguiria utilizando imunoterapia convencional. 0 medicamento de acordo com a presente descrição proporciona modulação moderada e eficaz de um grande número de diversas respostas alérgicas e representa uma melhoria importante superior ao tratamento corrente. Por exemplo, a modulação ou a eliminação de uma ocorrência alérgica pode conseguir-se com tão pouco como 1 a 3 injecções. A libertação direccionada para um alvo permite também a utilização das pequenas quantidades de alergénio que se utilizam nas convencionais vacinas injectáveis contra alergias, reduzindo enormemente a possibilidade de efeitos secundários como urticária, dispneia, sincope, hipotensão, incidentes miocárdicos e mesmo a morte.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 representa um diagrama de um gânglio linfático, com as áreas, medular (11) e cortical (12), representa das . 14 Δ FIG. 2 mostra uma imagem ultrassónica de uma agulha (21) inserida em um gânglio linfático inguinal (22). A FIG. 3 mostra uma imagem ultrassónica de um gânglio linfático inguinal antes da administração da vacina nesse gânglio linfático. A FIG. 4 mostra uma imagem ultrassónica de um gânglio linfático inguinal 6 dias após a administração da vacina nesse gânglio linfático. A FIG. 5 mostra os resultados do ensaio ELISA que demonstram os efeitos sobre os títulos da IgG2a no decurso do tempo após injecção da fosfolipase-A2 (PLA2) através de diferentes vias de administração em murganhos CBA/J. FIG. 5A, 0,1 pg de PLA2 injectado intraperitonealmente; FIG. 5B, 10 pg de PLA2 injectados intraperitonealmente; FIG. 5C, 0,1 pg de PLA2 injectado em um gânglio linfático; FIG. 5D, 10 pg de PLA2 injectados em um gânglio linfático; FIG. 5E, 0,1 pg de PLA2 injectado subcutaneamen-te; FIG. 5F, 10 pg de PLA2 injectados subcutaneamente A FIG. 6 mostra os resultados do ensaio ELISA que demonstram os efeitos sobre os títulos da IgE no decurso do tempo após injecção da fosfolipase-A2 (PLA2) através de diferentes vias de administração em murganhos CBA/J. FIG. 6A, 0,1 pg de PLA2 injectado intraperitonealmente; FIG. 6B, 10 pg de PLA2 injectados intraperitonealmente; FIG. 6C, 0,1 pg de PLA2 injectado em um gânglio linfático; FIG. 6D, 10 pg de PLA2 injectados em um gânglio linfático; FIG. 6E, 0,1 pg de PLA2 injectado subcutaneamente; FIG. 6F, 10 pg de PLA2 injectados subcutaneamente. A FIG. 7 mostra as quantidades relativas da IgG2a determinadas em murganhos injectados em gânglios linfáticos e subcutaneamente com PLA2. FIG. 7A, níveis de IgG2a dete-ctados por ELISA às 2, 4, 6 e 8 semanas após administração em um gânglio linfático da PLA2; FIG. 7B, níveis de 15

IgG2a às 2, 4, 6 e 8 semanas após injecção subcutânea da PLA2. A FIG. 8 mostra as quantidades relativas da IgE determinadas em murganhos injectados nos gânglios linfáticos e subcutaneamente com PLA2. FIG. 8A mostra que não há actividade IgE durante as 8 semanas após a administração em gânglios linfáticos da PLA2. FIG. 8B mostra os níveis da actividade IgE 6 semanas e 8 semanas após a injecção subcutânea da PLA2.

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção é útil para qualquer animal com um sistema imunitário que inclua um sistema linfático. Essa área de utilização inclui na generalidade mamíferos incluindo o homem. Embora a utilização principal da presente invenção seja provavelmente no tratamento do homem, será também apropriada para o tratamento de animais, incluindo animais domésticos como cães e gatos. A presente invenção proporciona a utilização de um alergénío na fabricação de um medicamento para o tratamento da alergia mediante injecção directa do medicamento em um gânglio linfático de um indivíduo. A presente invenção proporciona também a utilização de um ácido nucleico que codifica um alergénio na fabricação de um medicamento para o tratamento da alergia mediante injecção directa do medicamento em um gânglio linfático de um indivíduo.

Descreve-se um método que envolve a administração de um medicamento fabricado a partir de um alergénio mediante injecção directa em um gânglio linfático a fim de modular uma resposta alérgica de um indivíduo (por exemplo, para induzir 16 uma resposta de IgG) ma is eficientemente do que é possível por injecção subcutânea. A modulação de uma resposta alérgica inclui, embora sem carácter limitativo, a diminuição ou a eliminação de respostas como as alterações nos níveis específicos das IgG, as alterações nas taxas dad IgG, as alterações nos níveis específicos das IgE, a sensibilidade reduzida ao alergénio ou a um agente alergénico com capacidade de reacção cruzada, as alterações nos basófilos alterados (como a redução da quantidade das IgE à superfície), as alterações nos perfis das citocinas (como aumento das citocinas do tipo 1 como, por exemplo, IL-2 e IFN-γ, versus citocinas do tipo 2 como, por exemplo, IL-4, IL-5), as alterações nos resultados do Teste Radioalergoabsorvente [Radio-Allergosorbent Test (RAST)], ou ensaios cutâneos, bem como a diminuição ou a eliminação de sintomas de uma resposta alérgica, como urticária, comichão, mal-estar, ansiedade, angioedema, constrição torácica, náuseas, vómitos, diarreia, dor abdominal, tonturas, dispneia, sibilação, estridor, disfagia, disartria, rouquidão, fraqueza, confusão, diminuição da pressão sanguínea, colapso, perda de consciência, incontinência, cianose, produção de muco, tosse, choque, cãibras estomacais, rinite, febre do feno, asma, inflamação, e similares. A administração de alergénios em gânglios linfáticos apresenta uma série de vantagens. Devido às doses mínimas do alergénio puderem induzir uma resposta de IgG mais potentemente quando injectadas dírectamente em um gânglio linfático, os efeitos secundários observados são menos do que os observados quando se utiliza o tratamento convencional com vacinas injectáveis contra a alergia. Além disso, a administração do alergénio no gânglio linfático mediante injecção não é maís dolorosa para o doente do que as 17 injecções subcutâneas regulares. Uma vantagem adicional desse método é que apenas dois ou três tratamentos são caracteristicamente necessários para dessensibilizar um indivíduo contra um alergénio. Isso diminui o risco de efeitos secundários ou de reacção à administração, e resulta em uma poupança significativa de custos comparado com tratamentos tradicionais da alergia.

Um "alergénio" de acordo com a presente invenção pode ser uma qualquer substância ou uma porção da mesma que induz uma resposta alérgica. Por exemplo, os alergénios comuns incluem veneno de abelhas, veneno de vespas, veneno de formigas-de-fogo, pólenes, incluindo os pólenes de gramíneas, árvores e ervas, penicilina e outros fármacos, anestésicos, soros, animais, descamação de animais, baratas, ácaros do pó, alergénios alimentares como os encontrados nos amendoins, frutos secos de árvore, leite, peixe, marisco, ovos, soja, trigo, mel, frutos, vírus, bactérias, bolores, protozoários, ou látex. Alergénios podem ser também quaisquer componentes de um alergénio que induz uma resposta alérgica, como a PLA2 no veneno das abelhas, o urushiol na espécie Anacardiaceae, género Rhus radicans ("poisson ivy"). Igualmente, um alergénio pode ser uma mistura de substâncias ou um extracto bruto ou purificado de uma composição geralmente alergénica. Esses alergénios podem recuperar-se a partir de uma fonte natural ou podem ser uma substância sintética ou não natural, como uma proteína recombinante, um péptído de síntese, ou um químico mimético (incluindo um péptido) que induz uma resposta alérgica similar a um alergénio natural. 0 medicamento de acordo com a presente memória descritiva incluí um ou mais alergénio (s) ou uma ou mais construçõe (s) de ácidos nucleicos que codificam o (s) 18 alergénio(s). A construção de ácidc nucleico pode ser, por exemplo, de ARN ou de ADN ou pode ser somente uma construção de um ácido nucleico nu ("nacked") , como um plasmídeo ou um vírus, que codifica o alergénio. 0 alergénio ou a construção de ácido nucleico pode, se pretendido, libertar-se em um tipo específico de célula no interior de um gânglio linfático, como uma célula dendrítica. 0 tipo específico de célula pode, se pretendido, transfectar-se com a construção de ácido nucleico de forma a expressar o alergénio. Eventualmente, a construção de ácido nucleico pode ser direccionada via um vector para o tipo de célula pretendido.

As formas de realização da presente invenção podem adaptar-se para se aplicarem a uma qualquer doença que inclua uma resposta do tipo alérgica. Por exemplo, na população humana existe uma série de doenças virais, bacterianas, protozoárias recém-descobertas e/ou pouco compreendidas, e outras. Na medida em que essas doenças possuem uma componente patogénica que envolve uma resposta alérgica ou uma resposta de IgE, as formas de realização da presente invenção podem utilizar-se para reduzir a virulência dessas doenças e/ou para proteger pessoas contra essas doenças. 0 novo método de administração descrito na presente invenção pode também utilizar-se para aliviar as caracteristicas da asma e do choque anafiláctico associado à hipersensibilidade aos alergénios. 0 alergénio pode encapsular-se em um material polimérico para conseguir uma libertação controlada ou pulsátil. A forma da encapsulação pode ser, por exemplo, nano- ou microesferas, geles injectáveís, ou implantes. Materiais poliméricos apropriados incluem, sem limitação, poliésteres biodegradáveis do PLGA ácido poli(lactido-co-glicolido), 19 poli(anidridos), poli(sacáridos) (por exemplo, quitosano, amido, alginato), derivados da celulose (por exemplo, etilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose), proteínas (por exemplo, colagénio, albumina), ou poli(acrilatos). 0 alergénío administra-se de preferência em um veículo aceitável sob o ponto de vista fisiológico apropriado para injecção. Em geral, qualquer veículo aceitável sob o ponto de vista fisiológico conhecido por se utilizar em vacinas ou injecções para a alergia pode utilizar-se na presente invenção. A escolha de tais veículos inclui, sem limitação, água, soluções padrão de soro fisiológico, soluções de dextrose e de água com albumina, e é fácil no caso de especialistas na arte.

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, o alergénío associa-se a um adjuvante. 0 adjuvante pode ser, sem carácter limitativo, um ou mais dos seguintes: alúmen, BCG, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, fosfato de cálcio, emulsões lipídicas, nano- ou microesferas lipídicas ou poliméricas, micelas, lipossomas, saponina lipido A, ormuramil-dipéptido, produtos bacterianos, quimiocinas, citocinas e. hormonas, quitosano, amido, alginato, derivados da celulose (por exemplo, etilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose), ácidos nucleicos, ou uma construção de ácido nucleico. Um ou mais desses componentes pode(m) adicionar-se para reforçar a resposta imunitária, aumentar a adsorção do alergénio, proporcionar maior conforto ao doente, e/ou tornar mais lenta a libertação do alergénio para prolongar a exposição. Alternativamente, pode administrar-se o alergénio sem adjuvante ou sob uma forma aquosa. 20 O alergénio pode administrar-se em uma dose de aproxímadamente 0,1 pg a 50 pg e maís preferivelmente em uma dose desde aproxímadamente 0,1 pg a aproxímadamente 10 pg, embora a dose óptima possa variar na dependência do alergénio a injectar, do peso do doente, do sistema imunitário do mesmo, e de outros factores. Em muitos casos pode realizar-se o tratamento eficaz com uma administração. Em muitos casos, o tratamento inclui 1 a 15 injecções. Por exemplo, o aumento progressivo convencional após uma dose teste de 0,1 pg implica a administração de 1 pg seguida por 5 pg e 10 pg. O aumento progressivo depende da tolerância do doente à dose anterior. Periodicamente podem administrar-se injecções múltiplas, por exemplo, ao longo de vários dias, uma ou duas vezes por mês, ou algumas vezes por ano. A dose utilizada durante a fase inicial (dessensibilização) pode estar compreendida entre 1 pg e 10 pg administrado(s) através de 1 a 5, preferivelmente de 1 a 3, injecções de 1 pg, 5 pg e 10 pg ao longo de alguns dias até 3 meses. Preferivelmente, administra-se o alergénio 2 a 3 vezes, espaçadas de 1 a 2 semanas. Durante o tratamento de dessensibilização, adminístram-se, directamente em um gânglio linfático, 50 pg a 200 pg de uma composição que contem o alergénio iniciando com doses muito pequenas do alergénio, de 0,1 pg até 10 pg. Essa dose corresponde a um décimo da dose normal para imunoterapia subcutânea, e consequentemente minimiza-se a possibilidade de efeitos secundários. A dose utilizada durante a fase de manutenção pode estar compreendida entre 0,1 pg e 50 pg, preferivelmente 0,1 pg e 20 pg, administrados periodicamente ao longo de alguns meses a alguns anos. Durante o tratamento de manutenção, injecta-se em um gânglio linfático de um doente entre 0,1 pg a 50 pg de 21 um alergénio em injecções de caracteristicamente 50 μΐ a 200 μΐ cada. Um especialista na matéria confirmará que mesmo pequenas quantidades de um veículo são exequíveis.

Eventualmente, pode visualizar-se um gânglio linfático durante a injecção. Para visualizar o gânglio linfático e monitorizar a localização da agulha e alterações no gânglio linfático, como tumefacção, podem utilizar-se meios de visualização ultrassónicos, radiológicos ou outros como tomografia axial computorizada (exploração por TAC). Prefere--se a injecção em gânglios linfáticos das axilas e inguinais para facilitar a localização ultrassónica guiada e a injecção. A FIG. 1 representa um diagrama de um gânglio linfático, com setas que assinalam as áreas medular (11) e cortical (12).

Durante a administração do alergénio, monitorizam-se cuidadosamente especialmente os sinais vitais do doente, e monitoriza-se a reacção do gânglio linfático, por exemplo, por métodos de visualização ultrassónicos ou outros. A FIG. 2 representa uma imagem ultrassónica de uma agulha (21) inserida em um gânglio linfático inguinal (22). A FIG. 3 mostra uma imagem ultrassónica de um gânglio linfático captada antes da terapia aplicada nos gânglios linfáticos. A FIG. 4 mostra uma imagem ultrassónica do mesmo gânglio linfático após a terapia aplicada nos gânglios linfáticos. A técnica utilizada para injectar está de acordo com a prática da arte. Um método destina-se a utilizar uma seringa de câmara dupla na qual se incluiu o alergénio em uma das câmaras e um veículo líquido na outra, para se misturar antes da injecção. 22

Preferivelmente, o alergénio admínistra-se directamente em um gânglio linfático durante ambos os tratamentos de dessensibilização e de manutenção. Alternativamente, o alergénio pode administrar-se directamente em um gânglio linfático durante a fase de dessensibilização e subcutaneamente durante a fase de manutenção. Embora menos preferida, a utilização da terapia aplicada nos gãnglios linfáticos durante a dessensibilização pode conferir alguns benefícios enquanto se utiliza a aplicação da terapia subcutânea durante a manutenção.

Para determinar a eficácia da administração do alergénio, pode submeter-se o doente a ensaios tendo em vista reacções no estado basal antes de iniciar a administração, utilizando ensaios como os da determinação dos níveis das IgG e das IgE, da estimulação das células T, da activação dos basófilo, e/ou das exposições controladas aos alergénios, como os testes cutâneos, e da provocação através da picada de abelhas. Para determinar se um doente tem sido dessensibilizado, pode(m) comparar-se uma ou mais dessas determinações a outras realizadas após a administração. No Exemplo 14 apresentam-se modelos de ensaios apropriados. A prática da arte abrange perfeitamente a identificação e a utilização de ensaios alternativos. A eficácia da administração nos gâglios linfáticos tem sido demonstrada em modelos murinos. Nesses modelos murinos, a terapia aplicada nos gãnglios linfáticos induz elevados níveis de IgG2a não se detectando resposta de IgE, enquanto a imunização convencional induz elevados níveis de IgE dependentes de TH2 e somente níveis baixos de IgG2a dependentes de TH1. Salvo se especificado de outro modo, a administração de formulações para administração nos gãnglios 23 linfáticos em concentrações diminutas e por outro lado não imunogénicas induz respostas enérgicas de TH1, conduzindo a respostas de IgG2a mais significativas e de duração mais prolongada do que a imunoterapia convencional. 0 facto da administração da PLA2 nos gânglios linfáticos induzir elevadas respostas de IgG2a demonstrou-se quando se administraram quantidades diferentes de PLA2 em murganhos por injecção directa em um gãnglio linfático inguinal e se compararam com injecções subcutâneas de PLA2 (FIG. 5). Tendo em vista as respostas dos anticorpos IgG2a, recolheram-se amostras de sangue às 2, 4, 6, 8 e 10 semanas. Contrariamente aos resultados convencionais respeitantes à indução de IgG2a, a terapia que aplica doses baixas da PLA2 nos gânglios linfáticos é suficiente para induzir uma enérgica resposta de IgG2a, mas induz apenas uma resposta fraca de IgE (FIG. 6) . Com essas injecções de doses fracas, não se induziram títulos significativos de IgE por qualquer das administrações. A terapia de administração nos gânglios linfáticos, utilizando aproximadamente 1/1000 dos antigénios necessários em uma fórmula convencional, induziu os títulos de IgG2a em todos os murganhos de um grupo de cinco com um título médio de 1:1000, enquanto a terapia convencional com a mesma dose não induziu títulos quantificáveis de IgG2a. Uma resposta enérgica de IgG2a foi induzida em dois de três murganhos por injecção em gânglios linfáticos de apenas 0,1 pg de PLA2. Em contraste, o tratamento convencional com a mesma dose não induziu qualquer resposta significativa de IgG2a. Para induzir mesmo uma muito diminuta resposta de IgG2a contra PLA2 utilizando a terapia convencional, devem utilizar-se na imunização 10 pg do alergénio. 24 A FIG. 7 mostra a resposta em IgG2a 2, 4, 6, e 8 semanas após a terapia administrada nos gânglios linfáticos e a subcutânea. A injecção de PLA2 utilizando a administração nos gânglios linfáticos activa as IgG2a em uma dose (0,1 pg) que é ineficaz na administração subcutânea. Na FIG. 8 estão representados os níveis de actividade das IgE decorridas 2, 4, 6 e 8 semanas de terapia. A injecção de PLA2 utilizando a administração em gânglios linfáticos não activa a produção de IgE.

Esses resultados confirmam a superioridade, em forma e extensão, da resposta proveniente da terapia administrada nos gânglios linfáticos. As titulações mostram que a injecção administrada em gânglios linfáticos equivale a um aumento de 1000 vezes da dose subcutânea convencional, sem aumentar os efeitos secundários. Os exemplos seguintes revelam diversas preparações que contêm alergénios, diferentes vias de administração para a PLA? dos alergénios exemplificativos, o alergénio principal do veneno das abelhas, e alguns meios para determinar a eficácia dessa estratégia. Demonstra-se que a administração directa em gânglios linfáticos inguinais induz títulos de IgG2a específicos de alergénios superiores a 100 vezes mais eficazes do que uma injecção intraperitoneal ou subcutânea. Entre as subclasses de IgG, a IgG2a é conhecida por ser a subclasse mais estritamente dependente de Tul, indicando assim uma enérgica resposta de TH1 contra 0 alergénio. Uma tal resposta em TH1 é pretendida, uma vez que a mesma contraria a resposta em TH2, que é responsável pela produção de IgE em indivíduos alérgicos. Os exemplos incluem--se apenas com objectivos ilustrativos e não com o objectivo de limitar o âmbito da presente invenção, que é definida pelas reivindicações anexas. 25

EXEMPLOS

Exemplo 1. Preparação do alerqénio do veneno de abelhas

Capturaram-se as abelhas e congelaram-se .imediatamente para armazenagem. Descongelaram-se depois os insectos, e dissecaram-se os sacos do veneno e colocaram-se em uma solução de sacarose a 5% (pH 4,5-5,5). Lavaram-se os sacos algumas vezes, homogeneizaram-se seguidamente, e separaram-se os fragmentos insolúveis por filtração utilizando uma membrana de 0,22 pm.

Utilizando um ensaio de ligação ao corante Coomassie determinou-se a concentração proteica da solução filtrada que continha o veneno e diluiu-se até à concentração pretendida utilizando uma solução de sacarose a 5%. Adicionou-se à solução resultante 0,01% de Tween 80 e 0,01% de Pluronic F68. Esterilizou-se a solução por filtração através de uma membrana de 0,22 μπι, acondicionou-se em frascos para injectáveis e liofilizou-se. Concluído o ciclo da liofilização, taparam-se os frascos sob vazio. Antes da administração, reconstituiu-se a vacina utilizando Água para Injectáveis USP.

Exemplo 2 Preparação do alerqénio do veneno de "yellow jacket", vespão ou vespa

Capturam-se as "yellow jacket", vespões ou vespas amarelos(as) e congelam-se imediatamente para armazenagem. Descongelam-se depois os insectos e dissecam-se os sacos do veneno e colocam-se em tampão 0,025 M beta alanina/ácido acético (pH 4,8) em cloreto de sódio a 0,54%. Homogeneízam- 26 -se seguidamente os sacos, e separam-se os fragmentos insolúveis por centrifugação. Utilizando uma membrana 0,22 pm filtra-se o sobrenadante contendo o veneno, mistura-se com agentes diluentes como o manitol, acondiciona-se em frascos para injectáveis, e liofiliza-se. Tapam-se depois os frascos sob vazio. Na altura da administração, reconstitui-se a vacina utilizando uma solução aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, como o soro fisiológico normal, ou a dextrose a 5%. A preparação desses venenos vespideos pode também ser igual à preparação do veneno das abelhas do Exemplo 1 anterior.

Exemplo 3. Preparação de uma vacina microencapsulada contra o veneno das abelhas

Dissolve-se 1 mg da proteína do veneno das abelhas em 100 μΐ de água ou de uma solução aquosa. Dissolvem-se 100 mg de PLGA, um polímero biodegradável, em 1 ml de cloreto de metileno. Adiciona-se a solução do veneno das abelhas à solução do PLGA e homogeneíza-se, originando uma emulsão água-em-óleo. Verte-se a emulsão água-em-óleo sobre 10 ml de uma solução aquosa de PVA a 5% e agita-se para se obter uma emulsão água-em-óleo-em-água. Essa emulsão adiciona-se a 100 ml de uma solução a 1% de PVA para extrair o cloreto de metileno. Separam-se as microesferas por centrifugação, lavam-se 3 vezes com água destilada, e liofilizam-se.

Exemplo 4. Purificação de uma vacina contra um alergénio peptídico A proteína PLA2 é um polipéptido (PM 19000) e constitui o principal alergénio do veneno das abelhas. Pode purificar- 27 -se por HPLC de fase reversa. Dissolve-se o veneno de abelhas bruto em água em uma concentração de 10% e filtra-se através de uma membrana de 0,22 μπ\. Injectam-se 500 μΐ da solução filtrada do veneno das abelhas em uma coluna Brownlee Aquapore RP300 CB equilibrada com ácido trifluoroacético (TFA)com uma velocidade de 1 ml/minuto. Procede-se à eluição da coluna com um gradiente de acetonitrilo de 0 a 60% durante 45 minutos a 1 ml/minuto. Recolhem-se fracçôes de 1 ml e analisam-se utilizando a absorvância no UV a 280 nua. Analisam-se a identidade e a pureza das fracçôes recolhidas utilizando SDS-PAGE. Reúnem-se as fracçôes puras da PLA2 e liofilizam-se. Purificam-se as fracçôes da PLA2 que contêm impurezas e purificam-se novamente utilizando a HPLC de fase reversa.

Exemplo 5 Preparação de uma vacina contra um alergénio a partir de um extracto purificado A proteína PLA2/ o componente alergénico principal do veneno das abelhas, purifica-se utilizando uma cromatografia e pode adquirir-se no comércio a empresas como SIGMA. A PLA2 dissolve-se em uma solução injectável aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, como a água, o soro fisiológico normal, a água com dextrose a 5%, ou a solução de Ringer. A solução de PLA2 utíliza-se na administração intralinfática.

Exemplo 6 Preparação de uma vacina contra um alergénio a partir de um extracto bruto

O veneno das abelhas pode recolher-se a partir de ferroadas das mesmas através de electroestimulação. 0 veneno das abelhas pode secar ao ar para armazenagem. Para preparar a vacina, dissolve-se o veneno das abelhas em tampão 0,025 M 28 beta alanina/ácido acético (pH 4,8) em cloreto de sódio a 0,54%. Separa-se a matéria insolúvel utilizando um filtro estéril de 0,22 μπι. Ajusta-se o pH da solução até à neutralidade utilizando tampão fosfato e utiliza-se a solução directamente como vacina contra o veneno das abelhas. Alternativamente, pode liofilizar-se a solução que contem o veneno das abelhas tendo em vista a estabilidade durante a armazenagem.

Exemplo 7 Preparação de uma vacina contra alerqénios a partir de células transfectadas

Transfectam-se células humanas 293 HEK utilizando pIND/V5~His (Invitrogen) que contem um clone de cADN completo da fosfolipase A2 (PLA2) proveniente das abelhas. Submete-se a PLA2 a técnicas de engenharia genética de modo a mesma conter uma "tag" (cauda) de 6-hist.idina no seu N-terminal. Transfectam-se para frascos T-175 que contêm aproximadamente 5xl06 células 15 pg de plasmídeo utilizando Reagente LípofectACE™ (GIBCO BRL). Quarenta e oito horas após a indução, recolhem-se as células, dissolvem-se em tampão de lise NP40, e provoca-se a sua passagem através de uma coluna Ni. A PLA2 recombinante é eluída com 200 mM de imidazole e analisa-se a proteína através de SDS-PAGE, técnicas de coloração de proteínas, e "western blot".

Exemplo 8 Preparação de uma vacina contra alergénios a partir de uma mistura de múltiplos alergénios

Em tampão beta alanina/ácido acético dissolve-se veneno de várias espécies de vespões e vespas "yellow" em proporções apropriadas. Liofiliza-se a solução na presença de agentes de 29 diluição como manitol e sacarose, e reconstitui-se antes da administração.

Exemplo 9 Preparação de uma vacina contra alergénios a partir de um ácido nucleico

Utilizando uma RT-PCR ("Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction") e iniciadores ("primers") específicos, amplifica-se a PLA2 de abelhas em mARN preparado a partir de glândulas recentes de veneno. 0 produto amplificado é seguidamente subclonado no interior de pcDNAl.l/Amp (Invitrogen). Por análise de restrição seleccionam-se os plasmídeos que contêm o "inseri" (fragmento de ADN introduzido na molécula vectora), depois do que se sequenciam na totalidade. A expressão da PLA2 monitoriza-se como descrito no Exemplo 6. Amplifica-se o plasmídeo em células E. coli DH5a e purifica-se utilizando o sistema de purificação de plasmídeos da Qiagen.

Exemplo 10 Preparação de uma vacina com um adjuvante

Uma vacina com adjuvante pode preparar-se mediante adsorção da vacina em um adjuvante ou encapsulação da mesma vacina em um material transportador como um polímero ou um lipido. A adsorção realiza-se através de uma simples mistura da vacina com o adjuvante sob condições apropriadas. Por exemplo, adiciona-se a solução da vacina contra veneno das abelhas a uma suspensão de alúmen a pH > 5. De um modo similar, o veneno das abelhas pode adicionar-se a uma emulsão óleo-em-água, a uma solução tensioactiva de pluronic, ou a uma suspensão de microesferas de PLGA para estimular a resposta imunológica. A encapsulação da vacina realiza-se utilizando diversos procedimentos como secagem por 30 atomização, evaporação do solvente, coacervação, precipitação, ou mistura. O processo de encapsulação do veneno das abelhas está descrito no Exemplo 3.

Exemplo 11 Utilização de ultra-sons para localizar o gânglio linfático O gânglio linfático localiza-se sob orientação de ultra-sons. Os gânglios linfáticos inguinais apresentam um fluxo linfático relativamente baixo e localizam-se longe dos principais vasos sanguíneos. De modo a seleccionar um gânglio linfático para administração da vacina obtém-se uma visão geral da área inguinal. Para facilitar a colocação da agulha selecciona-se o gânglio linfático com o maior eixo longitudinal (aproximadamente 1-1,5 cm). Para orientar a agulha e para monitorizar o gânglio linfático utilizam-se ultra-sons, garantindo a administração do alergénio no interior do gânglio linfático.

Exemplo 12 Administração de uma vacina contra alergénios em um gânglio linfático

Sob orientação ultrassónica localiza-se o gânglio linfático. Depila-se o doente no local da injecção. Calçando luvas cirúrgicas, o operador do equipamento de ultra-sons desinfecta o local. Reveste-se a sonda ultrassónica com um gel de contacto esterilizado. Introduz-se a agulha no córtex do gânglio linfático, e avalia-se a posição do bico da seringa deslocando-o levemente e monitorizando a sua posição através de um equipamento de ultra-sons. Quando a posição se afigura correcta, administra-se a vacina directamente no gânglio linfático iniciando com doses muito pequenas. Aumenta-se a dose similarmente ao protocolo convencional 31 utilizado para dessensibilização subcutânea. Monitorizam-se rigorosamente todos os parâmetros vitais do doente e monitoriza-se a reacção do gânglio linfático por ultra-sons. A subsequente monitorização ultrassónica do gânglio linfático mostra o aumento do volume da área paracortical. Porque esta representa a localização no gânglio linfático dos linfócitos T, este aumento do diâmetro indica provavelmente actividade especifica das células T, já que oposto à tumefacção da área medular, o que poderá sugerir ausência de inflamação ou de edema especifico. Esse aumento diminui até ao final do tratamento, indicando evidentemente que o gânglio linfático conserva não apenas a sua morfologia normal mas também a sua função normal.

Exemplo 13 Esquema de administração do alergénio

Em um espaço de 1 a 2 semanas, administram-se três injecções de 100 ml contendo cada uma entre 0,1 pg e 10 pg de alergénio, utilizando possíveis injecções ou reforços ("boosters") de manutenção subsequentes de cerca de 0,1 pg a 50 pg de alergénio em injecções de 100 ml, administradas regularmente durante um período de cerca de algumas semanas a alguns anos.

Exemplo 14 Teste de eficácia de uma vacina contra a alergia

Para demonstrar que a terapia no gânglio linfático resulta em modulação, diminuição ou eliminação da reacção alérgica, ou sensibilidade reduzida a um alergénio, relataram-se indicadores correlativos que incluem determinação dos níveis de IgG e de IgE, alterações no equilíbrio ΤΗ1/ΤΜ2 utilizando a determinação de citocinas ou 32 de quimiocinas, bem como alterações na activação dos basófllos. Alternativamente, para determinar qualquer alteração na reacção podem executar-se ensaios que utilizam os testes ELISPOT (enzyme linked immunospot) ou RAST (teste de radioalergoabsorção), e testes de exposição como os testes cutâneos ou a picada de uma abelha.

De acordo com os dados provenientes de um estudo piloto continuo, em doentes vacinados com uma vacina contra o veneno de abelhas não se observou um grande aumento dos níveis de IgE específicas do alergénio. Aos doentes desse estudo administraram-se 3 tratamentos, em um espaço de 2 semanas. Na visita para o primeiro tratamento, injectaram-se nos doentes 0,1 pg, 1 pg, 5 pg, e 5 pg. Nos tratamentos 2 e 3, administrou-se aos doentes uma injecção de 10 pg. Além dos níveis das IgE, determinou-se, antes da injecção, 2 semanas mais tarde, e 4 semanas mais tarde, o total das IgG e IgG4 específicas do veneno de abelhas. No total das IgG específicas do veneno de abelhas não se observou aumento significativo. Contudo, após a vacinação os níveis das IgG4 dos doentes aumentaram 50 a 160% acima dos valores basais, o que é similar ao aumento observado na imunoterapia pelos métodos "rush" e "ultrarush". Esse aumento nas IgG4 deu origem a uma alteração na proporção das IgG do indivíduo. No âmbito dessa forma de realização da presente invenção, não ocorre a desgranulação sistémica dos mastócitos, como se evidenciou pelo aumento na triptase sérica.

A. Indução de uma resposta em IgG

Em um murganho injectaram-se duas doses da PLA2, o alergénio do veneno de abelhas, e no decurso do tempo quantificou-se o título das IgG2a. Injectou-se a PLA2 com o 33 adjuvante alúmen. Escolheram-se três sítios de administração diferentes: em um gânglio linfático, subcutânea e intraperitoneal.

Uma injecção com 0,1 pg de PLA2 no gânglio linfático inguinal induziu títulos de IgG2a em todos os murganhos de um grupo de cinco, com um título médio de aproximadamente 1:1000 (FIG. 5C) . O aumento da posologia não intensificou essa resposta (FIG. 5D). A injecção subcutânea da mesma dose induziu títulos de IgG2a não quantificáveis (FIG.5E). Ά injecção intraperitoneal de 0,1 pg induziu títulos reduzidos de IgG2a (aproximadamente 1:16) em apenas 2 de 5 murganhos (FIG. 5A).

Para induzir IgG2a específicas contra a PLA2 através da via intraperitoneal ou subcutânea, foram necessários 10 pg do alergénio (FIG. 5B+F). Contudo, os títulos induzidos foram apenas aproximadamente 1:50 (FIG. 5B+F) e corresponderam assim apenas a um nível de 5% dos títulos induzidos pela dose mínima da PLA2 injectada em gânglios linfáticos (FIG. 5C).

Consequentemente, a administração em gânglios linfáticos induziu respostas em anticorpos IgG2a específicas de alergénios que são 20 vezes mais significativas utilizando apenas 1% da dose do alergénio. Uma vez que os efeitos secundários são directamente proporcionais à dose do alergénio, a vacinação nos gânglios linfáticos com alergénios não dessensibiliza apenas mais eficazmente, mas produz também igualmente menos efeitos secundários.

B Resposta diminuída em IgE

Em um murganho injectaram-se duas doses de PLA2, o alergénio do veneno das abelhas, e quantificou-se o título 34 das IgE no decurso do tempo. Injectou-se a proteína PLA2 com o adjuvante alúmen. Para a injecção escolheram-se três sítios diferentes: em um gânglio linfático, subcutânea, e intraperitoneal. A injecção do alergénio PLA2 em um gânglio linfático, embora induza títulos de IgG mais eficientemente, não induziu títulos de IgE mais eficazmente. A injecção em um gânglio linfático da proteína PLA2 induziu menos IgE do que a injecção intraperitoneal ou subcutânea (FIG. 6). C. Estimulação in vitro das células T de um doente com antigénio de veneno de abelhas

Em doentes tratados com veneno de abelhas por via intralinfática analisam-se respostas de células T da subpopulação CD4 ao alergénio. Antes e depois da injecção, extrai-se sangue completo e isolam-se PBMC [(Peripheral Blood Mononuclear Cells) células mononucleares do sangue periférico] mediante sedimentação por gradiente de densidade de Ficoll-Hypaque. Coloca-se um milhão de PBMC em tubos de 12x75 mm em poli(estireno) para cultura de tecidos que contêm 2 ml de um meio completo. Cultivam-se as PBMC com veneno de abelhas, PHA [poli(hidroxialcanoatos)] , ou controlos negativos durante 6 horas com as 5 horas finais incluindo 10pg/ml de Brefeldina A (Sigma). Após incubação, colhem-se as células mediante uma lavagem em PBS arrefecido com gelo, suspendem-se novamente em PBS com 0,02% de EDTA, incubam-se à temperatura de 37 °C durante 15 minutos, e lavam-se uma vez mais em PBS arrefecido com gelo. Colhem-se as células mediante uma nova suspensão quer em PBS para análise imediata quer em aldeído fórmico polimerizado a 4% em PBS para 35 utilização posterior. Congelam-se depois as células para coloração das citocinas intracelulares.

Os ensaios podem realizar-se também directamente em sangue completo, utilizando um sistema de activação de sangue completo, como o Fastimmune Cytokine System de Becton Dickinson, para detectar a actividade das citocinas. D Análise da produção de citocinas pelas células T da subpopulação CD4 por citometria de fluxo

À temperatura de 37 °C descongelam-se rapidamente células congeladas e lavam-se depois uma vez em PBS arrefecido em gelo/azida sódica a 1%/ FCS a 1% antes de se suspenderem novamente em uma solução de fixação/permeabilizaçâo. As células fixam-se e permeabilizam--se durante 10 minutos. As citocinas intracelulares detectam--se por incubação com anticorpos anti-citocinas (IL-2, IL-4, IL-5, 11-13, IFN-y, e TNF-α) durante 30 minutos. Durante 3

minutos bloqueiam-se as células com receptores anti-FC, depois do que se lavam. Os marcadores superficiais detectam--se por incubação com anti-CD4, anti-CD8 e anti-CD69 durante 20 minutos sobre gelo. Lavam-se depois as células novamente. Incubam-se as células fixadas e permeabilizadas sobre gelo com Mab directamente marcado para CD4, lFN-γ, IL-2, e CD69 ou CD4, IL-4, IL-5 e CD6.9 durante 30 minutos, seguidamente lavam-se e suspendem-se novamente em aldeído fórmico polimerizado a 1%. Além disso, o número de células coradas com citocinas associadas aos TH1 e citocinas associadas aos Th2 comparam-se directa e reciprocamente, por exemplo IFN-γ e IL-4 com CD4 e CD69. A citometria de fluxo realiza-se com um FACScan ("citómetro de fluxo") utilizando 4 canais com FITC (Isotiocianato de fluoresceína), PE (uma ficoeritrina), PerCP 36 (peridin-clorophyll-protein), ou AP como fluorocromos. Todas as análises incluem uma avaliação mínima de CD4 + , CD69+ contra cítocinas, ou controlos correspondentes aos isotipos, para pesquisar cítocinas associadas às células T (IL-2, IL-4, IL-5, 11-13, IFN-γ, e TNF-α). Relativamente a cada análise 50000 casos são adquiridos c retidos na expressão de CD4. Além disso utiliza-se uma porta ("gate") para incluir apenas pequenos linfócitos viáveis através de detectores "Forward Scatter" (FSC) e detectores "Side Scatter" (SSC). Para análise dos dados utilizou-se o programa de software "CellQuest". E Análise da resposta em basófilos por citometria de fluxo

Estimula-se sangue completo com um alergénio, cora-se mediante separação de células activadas por fluorescência (FACS), e retém-se sobre CD123+, população de HLA-DR com baixo "Síde Scatter" (parâmetro citofluorométrico indicativo de granulosidade) (basófilos). A detecção é mediada por CD63 (um antigénio com grânulos alfa). A expressão de CD63 aumenta em indivíduos alérgicos após estimulação com o antigénio. F Método ELISPOT para IFN-y

Revestem-se placas HA em formato de 96 cavidades (wells} com 100 pl de anti-IFN-γ (5 pg/ml em tampão de revestimento para ELISA, pH 9,6, filtro esterilizado) e incubam-se à temperatura de 4 °C durante a noite. Lavam-se as placas 4 vezes com PBS (Phosphate Buffered Saline) estéril, bloqueiam--se seguidamente com 200 μΐ/cavidade do meio RPMI 1640/10% de FCS (Fetal Calf Serum)/2% de penicilina (v/v/v), estreptomicina, glutamina, durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente. Rejeita-se a solução de bloqueamento e 37 lavam-se as placas 3 vezes com PBS estéril. Adicionam-se células na proporção de 5xl05/cavidade em 100 μΐ e preparam--se 4 diluições em duplicado. As cavidade de controlo não contêm células.

Incubam-se as placas à temperatura de 37 °C/em atmosfera de CO2 a 5% durante 20 horas. Lavam-se as placas 3 vezes com PBS, depois 3 vezes com tampão de lavagem. Adiciona-se coelho-a-murganho IFN-γ políclonal [diluição 100:1 1/1000 (v/v) em RPMI/FCS a 10%/PSG a 2%], e incubam-se as placas durante a noite à temperatura de 4 °C. Lavam-se as placas 3 vezes com PBS. Adiciona-se um conjugado α-coelho IgG fosfatase alcalina (Sigma) em uma diluição de 1/20000 (v/v) em 100 μΐ de PBS/0,05% de Tween (v/v) contendo 1% (p/v) de BSA (BDH). Incubam-se as placas durante a noite à temperatura de 4 °C.

Lavam-se as placas 4 vezes com PBS. Utilizando fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (Sigma Fast Tablets de BCIP/NBT, Sigma) (1 comprimido em 10 ml de água destilada) durante 30 minutos à temperatura de 37 °C, revelam-se manchas por incubação. Lavam-se as placas com água e secam-se ao ar durante 2 horas. Contam-se as manchas utilizando um microscópio de dissecção.

Quantificação de células produtoras de citocinas por ELISPOT

Revestem-se placas HA em formato de 96 cavidades (wells) com anticorpos anti-citocinas e incubam-se à temperatura de 4 °C durante a noite. Lavam-se as placas 4 vezes em PBS estéril e bloqueiam-se para minimizar qualquer ligação não específica. Rejeita-se a solução de bloqueamento e lavam-se as placas 3 vezes com PBS estéril. Adicionam-se células na 38 proporção de 5xl05/cavidade em 100 μΐ, e procede-se a 4 diluições duplas. As cavidades de controlo não contêm células.

Incubam-se as placas à temperatura de 37 °C/ em atmosfera de CO2 a 5% durante 20 horas. Lavam-se as placas 3 vezes com PBS, depois 3 vezes com tampão de lavagem. Adiciona-se um anticorpo secundário anti-citocinas e incubam--se as placas durante a noite à temperatura de 4 °C. Lavam-se depois as placas 3 vezes em PBS. Adiciona-se um anticorpo conjugado com fosfatase alcalina que reconhece o anticorpo secundário em 100 μΐ de PBS/0,05% de Tween (v/v) contendo 1% de BSA (p/v), e incubaram-se as placas durante a noite à temperatura de 4 °C.

Lavam-se as placas 4 vezes com PBS. Revelam-se as manchas por incubação com fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indo-lilo (Sigma Fast Tablets de BCIP/NBT, Sigma) (1 comprimido em 10 ml de água destilada) durante 30 minutos à temperatura de 37 °C. Lavam-se as placas com água e secam-se ao ar durante 2 horas, após o que se contam as manchas.

G A prova cutânea RAST O Teste de Radioalergoabsorção é um teste sanguíneo utilizado para monitorizar a resposta à imunoterapia. Colhe--se sangue de uma veia, um dedo, um calcanhar, ou o lóbulo de uma orelha, transfere-se para tubos estéreis, e trata-se com anticoagulante. Avalia-se depois o sangue completo por radioimunodoseamento relativamente aos anticorpos IgE, cuja detecção indicará resposta alérgica. O facto de não se detectarem níveis de IgE indica ausência de hipersensibilidade. 39 H. Prova cutânea

Uma prova cutânea pode realizar-se por picada com uma agulha ("prick") ou por métodos intradérmicos. A punctura feita com uma agulha ("prick-puncture") efectua-se colocando sobre o braço uma gota de um alergénio e uma gota de uma solução controlo afastadas 2 cm. Uma agulha hipodérmica descartável atravessa a gota e penetra a superfície da pele. Ergue-se o bico da agulha, elevando a epiderme sem originar hemorragia, e retira-se seguidamente, e 1 minuto depois limpa-se a solução enxugando. As provas intradérmicas efectuam-se injectando aproximadamente 0,01 a 0,05 ml do alergénio nas camadas superficiais da pele, evitando o leito capilar subepidérmico. Essa acção concorre para a formação de uma pequena bolha com um diâmetro aproximado de 2 a 3 mm. Uma área irritada de 3 mm acompanhada por uma pápula de 10 mm e comichão podem representar uma reacção imunológica positiva e indicar a presença de anticorpos IgE. I Provocação ("challenqe") por picada de abelha A provocação por picada de abelha efectua-se utilizando uma abelha viva no antebraço do doente, permitindo-lhe picar o doente. Essa constitui uma prova geral convencional para avaliar a eficácia conhecida na arte. Essa provocação produz apenas uma reacção mínima local em um doente que tenha sido dessensibilizado.

Lisboa, 4 de Abril de 2007

Claims (43)

1 Reivindicações 1. Utilização de um alergénio para a preparação de um medicamento para o tratamento da alergia por injecção directa desse medicamento em um gânglio linfático de um indivíduo.

2. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual o citado gânglio linfático é um gânglio linfático axilar.

3. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual o citado gânglio linfático é um gânglio linfático inguinal.

4. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual se administra o alergénio a uma célula apresentadora de antigénios no interior do gânglio- linfático.

5. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual se administra o alergénio a uma célula imunitária no interior do gânglio linfático.

6. Utilização de acordo com a reivindicação 1., utilizando um dispositivo de ultra-sons para monitorizar a localização de uma agulha de injecção.

7. Utilização de acordo com a reivindicação 1., utilizando um radiológico para monitorizar a localização de uma agulha de injecção.

8. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual o gânglio linfático é um gânglio linfático defeituoso.

9. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual o alergénio é um extracto ou uma substancia purificada. 2

10. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual se escolhe o alergénio no grupo constituído por veneno de abelha, veneno de vespa, veneno de formiga-de-fogc, pólen, bolor, anestésicos, soro, fármacos, animais, películas de animais, baratas, ácaros do pó, alergénios alimentares, sumagres venenosos ("poison ivy", "poison oak" "poison sumac"), vírus, bactérias, protozoários, e látex

11. Utilização de acordo com a reivindicação 10., na qual o alergénio é um alergénio alimentar que se escolhe no grupo constituído por leite, peixe, mariscos, amendoins, frutos secos de árvore, mel, frutos, ovos, soja, e trigo.

12. Utilização de acordo com a reivindicação 10., na qual o alergénio é um pólen sendo esse pólen escolhido entre o grupo constituído por pólen de gramíneas, pólen de árvores, e pólen de ervas.

13. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual se escolhe o alergénio no grupo constituído por películas de animais, excrementos de baratas, e ácaros do pó.

14. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual se escolhe o alergénio no grupo constituído por uma proteína recombinante e um péptido de síntese.

15. Utilização de um ácido nucleico que codifica um alergénio na preparação de um medicamento para o tratamento da alergia mediante injecção directa desse medicamento em um gânglio linfático de um indivíduo.

16. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual se acondiciona o alergénio em um material de encapsulaçâo. 3

17. Utilização de acordo com a reivindicação 16., na qual se escolhe o material de encapsulação no grupo constituído por um material polímérico, um gele injectável, um implante injectável, um poliéster biodegradável do ácido poli(lactido--ooglicolido) (PLGA), um poli(anidrido), um poli(sacárido), um derivado da celulose, uma proteína, e um poli(acrilato).

18. Utilização de acordo com a reivindicação 16., na qual o material de encapsulação se encontra sob a forma de uma microesfera ou de uma nanoesfera.

19. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual o alergénio consiste em uma substância de tratamento.

20. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual o medicamento consiste em um adjuvante.

21. Utilização de acordo com a reivindicação 20., na qual se escolhe o adjuvante no grupo constituído por alúmen, BCG, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, fosfato de cálcio, agente tensioactivo, micropartículas tensioactivas, um produto bacteriano, uma quimiocina, citocinas, uma hormona, quitosano, amido, alginato, um derivado da celulose, uma proteína, água, uma solução de soro fisiológico, uma solução de dextrose, albumina, ou um ácido nucleico.

22. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual o medicamento contem uma dose de cerca de aproximadamente 0,01 pg até aproximadamente 10 pg de alergénio.

23. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual o medicamento contem uma dose de cerca de aproximadamente 0,1 pg até aproximadamente 50 pg de alergénio. 4

24. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual a administração do medicamento origina uma reacção associada à modulação da resposta alérgica.

25. Utilização de acordo com a reivindicação 24., na qual se pode detectar a reacção por meio de uma prova cutânea.

26. Utilização de acordo com a reivindicação 24., na qual se pode detectar a reacção por meio de uma exposição controlada a um alergénio.

27. Utilização de acordo com a reivindicação 24., na qual o alergénio é veneno de abelha e na qual se pode detectar a reacção por meio de uma prova de provocação por picadas de abelhas.

28. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual a administração do medicamento modula uma propriedade associada à modulação da resposta alérgica.

29. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual a administração do medicamento elimina uma resposta alérgica detectável.

30. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual a administração do medicamento diminui uma resposta alérgica detectável.

31. Utilização de acordo com a reivindicação 28., na qual a propriedade consiste em sensibilidade diminuída ao alergénio ou a um agente alergénico de reacção cruzada. 5

32. Utilização de acordo com a reivindicação 28., na qual a propriedade consiste em um aumento do nível das IgG4 específicas do indivíduo de aproximadamente 50 até aproximadamente 500 %.

33. Utilização de acordo com a reivindicação 28., na qual a propriedade consiste em uma diminuição do nível das TgG4 específicas do indivíduo.

34. Utilização de acordo com a reivindicação 28., na qual a propriedade consiste em uma alteração na proporção das IgG do indivíduo.

35. Utilização de acordo com a reivindicação 28., na qual a propriedade consiste na ausência de um aumento significativo no nível das IgE específicas do indivíduo.

36. Util ização de acordo com a reivindicação 28., na qual a propriedade consiste em uma diminuição do nível das IgE específicas do indivíduo.

37. Utilização de acordo com a reivindicação 28., na qual a propriedade consiste em uma alteração nos basófilos activados do indivíduo.

38. Utilização de acordo com a reivindicação 28., na qual a propriedade consiste em uma alteração do perfil de citocinas do indivíduo.

39. Utilização de acordo com a reivindicação 28., na qual a propriedade consiste em uma alteração do teste de radioalergoabsorção ("RAST") do indivíduo. 6

40. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual o alergénio é pólen.

41. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual o alergénio é veneno de abelha, vespa ou formiga-de-fogo.

42. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual o alergénio consiste em películas de animais.

43. Utilização de acordo com a reivindicação 1., na qual o alergénio é um componente alérgico de um ácaro do pó. Lisboa, k de Abril de 2007