DE69838324T2 - Ph-sensitive liposomen und andere typen immunomodulatoren enthaltender gekapselter impfstoffe sowie herstellungs- und anwendungsverfahren dafür - Google Patents

Ph-sensitive liposomen und andere typen immunomodulatoren enthaltender gekapselter impfstoffe sowie herstellungs- und anwendungsverfahren dafür Download PDF

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Description

  • Diese Anmeldung beansprucht Priorität der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 60/037.217 , eingereicht am 5. Februar 1997.
  • HINTERGRUND
  • Viele Vakzinen stellen nicht wie gewünscht vollständig und wirkungsvoll eine Immunreaktion bereit. Dies trifft insbesondere auf Krebsvakzinen und Vakzinen für gewisse Infektionskrankheiten zu. Ein Grund ist das Versagen, CD8+-T-Zellen zu stimulieren, ein anderer Grund ist, dass die Immunreaktionen, die induziert werden, oft schwach sind.
  • CD8+-Zellen sind zytolytische T-Lymphozyten (auch als CTLs bekannt) und in der Lage, andere Zellen zu zerstören. Sie sind die Hauptvermittler von schützender Immunität sowohl gegen Krebs als auch gegen bestimmte intrazelluläre Pathogene. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass Vakzinen in der Lage sind, CD8+- oder zytolytische T-Zellen zu stimulieren, die spezifisch auf das/die Antigen(e) in der Vakzine reagieren, um die klinische Wirksamkeit der Vakzinen zu maximieren.
  • Jedoch sind exogene Antigene, d.h. Antigene, die von außerhalb des Körpers eingeführt werden, wie z.B. jene in Vakzinen, nicht in der Lage, eine wirksame CD8+-T-Zellreaktion zu provozieren, weil exogene Antigene nicht durch den Weg verarbeitet werden und präsentiert werden, der notwendig ist, um diese Zellen zu stimulieren (obwohl solche Antigene andere Formen von Immunreaktionen stimulieren).
  • Exogene Antigene werden durch die antigenpräsentierenden Zellen des Immunsystems aufgenommen und letztlich auf diesen Zelloberflächen präsentiert, wo sie von Immunzellen „gesehen" werden, die dadurch lernen, auf diese Antigene zu reagieren. Jedoch werden exogene Antigene, wie jene in Vakzinen, über einen Weg verarbeitet, der zu deren Präsentation gemeinsam mit Klasse-II-Histokompatibilitäts(HLA-)Zelloberflächenmolekülen führt. CD8+-T-Zellen reagieren nicht auf Antigene, die mit Klasse-II-Molekülen präsentiert werden. CD8+-T-Zellen reagieren nicht auf Antigene, die durch einen anderen Typ von HLA-Molekülen, den Klasse-I-HLA- Molekülen, präsentiert werden, die auch auf der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen gegenwärtig sind. Jedoch treten nur Antigene, die durch die Zellen selbst synthetisiert werden und in das Cytosol (Zellinnere) freigesetzt werden, in den Weg ein, der zur Präsentation durch Klasse-I-HLA-Moleküle führt [Bevan, Nature 325, 192, (1987); Davis und Bjorlunan, Nature 334, 395 (1988); Moore et al., Cell 54, 777 (1988)].
  • Jedoch ist es durch die Verwendung spezialisierter Träger oder Moleküle möglich, den Körper dazu zu bringen, eine CD8+- oder zytolytische T-Zellreaktion auf exogene Antigene zu erzielen. Diese Träger bringen exogene Antigene dazu, in das Cytosol einzutreten und durch den Klasse-I-Weg von Antigenverarbeitung präsentiert zu werden [Moore et al., Cell 54, 777 (1988); Reddy et al., J. Immunol. Methods 141, 157 (1991); Nair et al., J. Immunol. Methods 152, 237 (1992)], sodass sie nun CD8+-T-Zellreaktionen stimulieren können. Diese spezialisierten Träger umfassen Liposomen (pH-empfindliches oder lipophiles Polylysin [Nair et al., J. Immunol. Methods 152, 237 (1992)], Virosome [Manning und Gould-Fogerite; Biotechniques 6, 682 (1988)], Teilchenkügelchen oder Teilchen, die aus Glas, Eisen, bioabbaubaren oder anderen Materialien bestehen), Hitzeschockproteine, bestimmte Toxine und bestimmte andere Moleküle.
  • Ein besonderes Mittel, von dem bekannt ist, dass es eine CD8+-T-Zell- oder zytolytische T-Zellreaktion auf ein bestimmtes Antigen entstehen lässt, ist die Verkapselung des Antigens in pH-empfindliche Liposomen [Reddy et al., J. Immunol. Methods 141, 157 (1991); Straubinger, Methods Enzymol. 221, 301 (1993); Martin et al., Immunology Letters 37, 97 (1993); Collings et al., J. Immunol. 148, 3336 (1992)], die spezialisierte Liposomen sind, die mit Zellmembranen bei einem sauren pH fusionieren, und für die Verwendung beim Menschen sicher sind [Patel, in: Lipsosomes as Drug Carriers: Recent Trends in Progress, Hrsg. Gregoriadis (John Wiley, Chichester, 51–62 (1988); Tan und Gregoriadis, Biochem. Soc. Transactions 17, 693 (1989); Abraham und Shah, J. Immunol. 149, 3719 (1992)]. Wenn ein pH-empfindliches Liposom in eine antigenpräsentierende Zelle aufgenommen wird, protoniert der saure pH von endozytischen Vakuolen das pH-empfindliche Lipid des Liposoms, das dann mit der Membran der Vakuole fusioniert [Reddy et al., J. Immunol. Methods 141, 157 (1991); Bllens et al., Biochemistry 23, 1532 (1984)]. Die Inhalte der Liposomen [z.B. das/die eingekapselte(n) Antigen(e)] werden dann in das Cytosol freigesetzt, können in den Klasse-I-Weg von Antigenverarbeitung eintreten und durch HLA-Klasse-I-Moleküle repräsentiert werden und CD8+-T-Zellreaktionen stimulieren. Hingegen sind herkömmliche (nicht-pH-empfindliche) Liposomen nicht in der Lage, dies zu erreichen [Moore et al., Cell 54, 777 (1988); Nair et al., J. Exp. Med. 175, 609 (1992); Harding et al., J. Immunol. 147, 2860 (1991); Straubinger et al., FEBS Lett. 179, 148 (1985); Chu et al., Pharm. Res. 7, 824 (1990)], und sind keine wirkungsvollen Träger zur Stimulation von CD8+- oder zytolytischen Zellreaktionen. Andere Formen von Trägern und Molekülen können exogene(s) Antigen(e) durch andere Mechanismen als oben angeführt in den endozytischen Weg der Antigenverarbeitung und -präsentation abgeben.
  • Obwohl es möglich ist, CD8+-T-Zellen mit einem spezialisierten Träger, wie z.B. einem pH-empfindlichen Liposom, zu stimulieren, bleiben viele antigen- oder vakzineninduzierte Immunreaktionen zu schwach, um wirkungsvoll zu sein. Daher ist es nicht nur wichtig, eine CD8+-T-Zellreaktion zu induzieren, sondern auch einen Weg zu finden, das Ausmaß an CD8+-T-Zellreaktionen und anderen Formen von Immunreaktionen zu verstärken, die eine Rolle in der Vermittlung schützender Immunität spielen. Ein Weg, dies zu tun, ist es, einen oder mehrere Immunmodulatoren gemeinsam mit der Vakzine zu verabreichen.
  • Immunmodulatoren sind spezialisierte Proteine, die Immunreaktionen, die durch Antigene induziert sind, verstärken und amplifizieren. Solche Immunmodulatoren umfassen Cytokine, wie z.B. IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, GM-CSF und andere, die erst entdeckt werden müssen. Interleukin-2 (IL-2) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulationsfaktoren (GM-CSF) sind insbesondere aufgrund ihrer Rollen bei der Stimulierung von T-Zellen bzw. antigenpräsentierende Zellen interessant. IL-2 stimuliert die Entwicklung von T-Zellen, die durch ein Antigen aktiviert worden sind, und tragen dazu bei, Klone von T-Zellen zu erzeugen, die für ein bestimmtes Antigen spezifisch sind. GM-CSF aktiviert und stimuliert antigenpräsentierende Zellen [Taglietti, in: Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology, Band 2, Hrsg. Banchereati und Schmitt, Plenum Press, New York, 565–569 (1995); Fischer et al., Bur. J. Immunol. 18, 1151 (1988)], die Antigene im Wesentlichen immunogener machen. Jedoch können diese Immunmodulatoren eine CD8+- oder eine andere Form von T-Zellreaktion auf Antigene, die andererseits eine solche Reaktion nicht verursachen würden, nicht stimulieren. Sie verstärken nur die Stärke der Reaktion(en), die induziert wird.
  • Immunmodulatoren sind zuvor gemeinsam mit herkömmlichen Liposomen in Vakzinen verwendet worden. Diese Verwendung hat nichts mit der Induktion einer CD8+-T-Zellreaktion zu tun, soll aber den Nachteil aus der Welt schaffen, dass Immunmodulatoren eine kurze Halbwertszeit im Kreislauf haben. Es ist festgestellt worden, dass herkömmliche Liposomen als langsam freisetzende Vehikel wirken können, um die Halbwertszeit der eingekapselten Immunmodulatoren an der Injektionsstelle und im Kreislauf zu verlängern und hohe und toxische Dosierungsausmaße zu vermeiden, die andererseits erforderlich wären, um dieselben Blutspiegel aufrechtzuerhalten (Patel, in: Liposomes as Drug Carriers: „Recent Trends in Progress", Hrsg. Gregoriadis, John Wiley, Chichester, 51–62 (1988); Tan und Gregoriadis, Biochem. Soc. Transactions 17, 693 (1989); Abraham und Shah, J. Immunol. 149, 3719 (1992); Mbawuike et al., Vaccine 8, 347 (1990); Talmadge et al., Cancer Res. 47, 5725 (1987); Gershman et al., Vaccine Res. 3(2), 83–92 (1994)].
  • Einkapselung einer Vakzine und eines Immunmodulators in einem langsam freisetzenden Vehikel, wie einem herkömmlichen Liposom, führt nicht zu einer CD8+-T-Zell-Reaktion, aber einer völlig anderen Reaktion, einer CD4+-Reaktion, vermittelt durch eine andere Klasse von T-Zellen, die auf Antigen reagieren, die an Klasse-II-HLA-Moleküle gebunden sind, nicht an Klasse-I-HLA-Moleküle.
  • Das Erhalten einer starken CD8+-T-Zell- oder CTL-Reaktion auf ein Antigen ist besonders im Bereich von Krebsvakzinen und Vakzinen für einige Infektionskrankheiten wie AIDS wichtig. Melanom ist ein Beispiel für ein wichtiges Target für Vakzinenbe handlung, aufgrund seiner zunehmenden Prävalenz und schlechten Prognose und der Tatsache, dass Melanom auf Vakzinenbehandlung anzusprechen scheint.
  • Vakzinen sind vielversprechende Behandlungen für Melanom. Sie verhindern Melanome bei Tieren und verlangsamen ihr Fortschreiten bei Menschen. Die vorteilhaften Wirkungen von Vakzinenbehandlung werden durch die Stimulation von Antitumorimmunreaktionen vermittelt. Unglücklicherweise sind Melanomvakzinen kaum immunogen. Eine große Herausforderung in der Herstellung einer wirksamen Vakzine für Melanom ist es, Verfahren zu entwickeln, die Vakzinenimmunogenität boosten, insbesondere ihre Fähigkeit, eine starke CD8+-T-Zell- oder CTL-Reaktion zu stimulieren [American Cancer Society: Cancer Statistics (1990), CA 40, 9 (1990); Bystryn et al., in: Biologic Therapy of Cancer, 2. Auflage (Hrsg. DeVita et al.), J.B. Lippincott, Philadelphia, PA, 668–679 (1995); Bystryn, J. Immunol. 120, 96 (1978); Hersey et al., Cancer Immunol. Immunother. 25, 257 (1987); Livingston et al., PNAS (USA) 84, 2911 (1987); Mitchell et al., Cancer Res. 48, 5883 (1988)].
  • Bystryn et al., J. Invest. Dermatology 106, 845 (1996), offenbaren, dass ein IL-2- Liposom ein sicheres und wirkungsvolles Verfahren zur Verstärkung der Immunogenität von Melanomvakzine bereitstellt.
  • Adler et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Research 84, 493 (1993), beurteilen die biologischen Wirkungen von allogener liposom-eingebetteter menschlicher Melanomvakzine kombiniert mit IL-2 und Cimetidin in metastatischen Melanompatienten.
  • Oratz et al., Proc. Am. Assoc. Clin. Oncology 15, 436 (1996), berichten, dass IL-2-Liposomen sicher sind, insbesondere die Immunogenität einer Melanomvakzine verstärken und bedeutungsvolle klinische Reaktionen auslösen können.
  • Bis zu dieser Erfindung war es möglich, eine starke Reaktion auf ein Antigen durch Paarung einer Vakzine und eines Immunmodulators zu erhalten, und es war möglich, eine CD8+-T-Zell- oder CTL-Reaktion auf ein Antigen zu erhalten, indem es in pH-empfindliche Liposomen oder andere spezialisierte Träger eingekapselt wurde. Je doch wurde das Problem der Induktion einer Immunreaktion, die die wünschenswerte CT8+-T-Zell- oder TCL-Reaktion ist und zur selben Zeit diese Reaktion auf ein wirksames Ausmaß steigert, nicht gelöst worden.
  • Bis zu dieser Erfindung hat niemand versucht, das Problem der gleichzeitigen Induktion und Potenzierung einer besonderen und wünschenswerten Immunreaktion (die CD8+T-Zell- oder CTL-Reaktion) zu potenzieren, indem ein pH-empfindliches Liposom oder ein anderer spezialisierter Träger verwendet wurden, um dem Antigen zu ermöglichen, durch die HLA-Klasse-I-Moleküle präsentiert zu werden, und gleichzeitig einen Immunmodulator mit dem Antigen zu verabreichen, sodass der Immunmodulator an der Stelle gegenwärtig ist, wo er nötig ist, um seine Wirkung auszuüben.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Vakzinenzusammensetzung bereit, die Folgendes umfasst: zumindest ein Krebsantigen, das aus von einer Krebszelle abgespaltenen Antigenen hergestellt ist, zumindest einen aus IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12 und GM-CSF ausgewählten Immunmodulator und einen Träger, bei dem es sich um ein chloroformfreies, pH-empfindliches Liposom handelt, das Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und Cholesterylhemisuccinat (CHEMS) umfasst, die bei einem pH von 8,5–9,5 gebildet werden, um das Krebsantigen und den Immunmodulator zu verkapseln und sie bei Verabreichung an einen Menschen zusammen zu Immunzellen zuzuführen, sodass das Antigen eine CD8+-T-Zell-Reaktion induziert.
  • In einem Aspekt werden die Liposomen mit der höchstmöglichen Lipidkonzentration gebildet, um die Menge an Antigenen und Immunmodulatoren, die verkapselt werden kann, zu maximieren.
  • In einem anderen Aspekt wird das Gemisch aus Antigen(en), Immunmodulator(en) und Träger verwendet, ohne dass das/die Antigen(e) und der/die Immunmodulator(en) entfernt werden, die nicht gebunden oder in den Träger inkorporiert werden.
  • Die Vakzinenzusammensetzung der Erfindung kann auch in einem Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers verwendet werden. Die Erfindung stellt auch die Verwendung einer Vakzinenzusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zur Induktion einer Immunantwort gegen einen Krebs und so zur Behandlung oder Vorbeugung des Krebses bereit.
  • Eine besondere Anwendung dieser Erfindung liegt im Bereich von Melanomvakzinen und einer verbesserten Behandlung für die primäre und sekundäre Prävention dieses Krebses.
  • Ein besonderes Ziel dieser Erfindung ist ein Impfstoff in Form einer polyvalenten Vakzine für Melanom, der mehrere Melanomantigene umfasst, die in pH-empfindliche Liposomen mit einem oder allen von IL-2, IL-12 und GM-CSF eingekapselt sind, was insbesondere wünschenswert ist, um eine starke CD8+-T-Zell- oder CTL-Reaktion gegen Melanom zu erhalten.
  • Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten Krebsantigene, die von Krebszellen, die krebsassoziierte Antigene exprimieren und abspalten oder freisetzen, in Kulturmedium abgespalten oder freigesetzt werden.
  • Die Immunmodulatoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, verstärken das Ausmaß und die Häufigkeit der Immunreaktionen, die von den Antigenen der Vakzinen der vorliegenden Erfindungen induziert werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine verbesserte Verwendung von Vakzinen bereit, da die Vakzine der vorliegenden Erfindung den Träger, der CD8+-T-Zellreaktionen ermöglicht, induziert zu werden, einen Immunmodulator, der diese Reaktionen vergrößert, und ein Antigen, das die Reaktionen gemeinsam stimuliert, zusammen bereitstellt anstatt separat verabreicht zu werden, wie es vor der vorliegenden Erfindung bereitgestellt worden war. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Verabreichung von geringeren Dosen der individuellen Komponenten, um eine größere Wirkung zu erzielen.
  • Viele vakzineninduzierte Immunreaktionen haben sich als schwach und daher unwirksam erwiesen. Dies trifft insbesondere auf Krebs- und Infektionskrankheiten-Vakzinen zu, die auf reinen Proteinen oder Peptiden basieren. Ein Verfahren zur Verstärkung der Immunreaktion auf diese Vakzinen ist es gewesen, die Immunmodulatoren als Vakzinenadjuvanzien zu verwenden, um antigengesteuerte Immunreaktionen zu erleichtern oder zu amplifizieren. Beispiele für Immunmodulatoren umfassen IL-1, IL-4, IL-2, IL-6, IL-12 und GM-CSF. Zwei wichtige Einschränkungen der Verwendung von Immunmodulatoren als Vakzinenadjuvanzien sind 1) ihre kurze Halbwertszeit im Kreislauf oder an der Injektionsstelle (IL-2 hat z.B. eine Halbwertszeit von weniger als einer halben Stunde) und 2) die normale Ausführung der Verabreichung des Immunmodulators getrennt von der Vakzine.
  • Verabreichung des Immunmodulators in einem Träger, der das Antigen enthält, verlängert seine Halbwertszeit und führt es in enger Nähe zu der Vakzine oder dem Antigen zu. Diese Träger werden durch das lymphatische System nach subkutaner Injektion aufgenommen und führen daher inkorporierte Antigene und Immunmodulatoren direkt dränierenden Lymphknoten zu, wo sie notwendig sind, um Immunreaktionen zu stimulieren. Weiters ist gezeigt worden, dass z.B. Liposomen ein Vehikel zur langsamen Freisetzung von IL-2 sind. Nach subkutaner Injektion in Tiere blieben 50% von liposom-eingekapseltem IL-2 an der Injektionsstelle 24 Stunden lang bestehen, im Vergleich zu weniger als 2% für freies IL-2; und biologisch aktives IL-2 war im Kreislauf über 72 Stunden lang gegenwärtig, während nach 6 Stunden keines gegenwärtig war, wenn es in freier Form vorlag. P.M. Anderson, E. Katsanis, S.F. Spencer, D. Hasz, A.C. Ochoa, B. Bostrom, Depot characteristics und biodistribution of interleukin-2 liposomes: Importance of route of administration, J. Immunother. 12, 19–36 (1992).
  • Vorklinische Studien haben auch gezeigt, dass Antikörper- und zelluläre Reaktionen auf bakterielle und virale Vakzinen und zelluläre und schützende Immunreaktionen auf Krebsvakzinen, die in herkömmliche Liposomen inkorporiert waren, die IL-2 enthielten, größer sind und länger anhalten als wenn die Vakzinen mit freiem IL-2 verab reicht werden. L. Tan, G. Gregoriadis, Effect of interleukin-2 an the immunoadjuvant action of liposomes, Biochem. Soc. Transactions 17, 693–694 (1989); I.N. Mbawuike, P.R. Wyde, P.A. Anderson, Enhancement of the protective efficacy of inactivated influenza A virus in aged mice by IL-2 liposomes, Vaccine 8, 347–352 (1990); P. Anderson, E. Katsanis, A. Leonard, D. Show, C. Loeffler, M. Goldstein, A. Ochoa, Increased local antitumor effects of interleukin 2 liposomes in mice with MCA-106 sarcoma pulmonary metastases, Cancer Res. 50, 1853–1856 (1990); E. Abraham, S. Shah, Intranasal Immunization with liposomes containing IL-2 enhances bacterial polysaccharide antigen-specific pulmonary secretory antibody response, J. Immunol. 149, 3719–26 (1992). Melanomvakzinen, die z.B. in herkömmliche IL-2- (nicht-pH-empfindliche) Liposomen eingekapselt sind, stimulierten zytolytische Antimelanomantikörper, Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ und tumorschützende Immunreaktionen wirkungsvoller als eine Vakzine, die in Liposomen eingekapselt ist, denen IL-2 fehlt, oder die mit freiem IL-2 bereitgestellt sind. N. Gershman, D. Johnston, J.C. Bystryn, Potentiation of B16 melanoma vaccine immunogenicity by IL-2 liposomes, Vaccine Res. 3(2), 83–92 (1994). Während diese Studien zeigen, dass die Einkapselung von Immunmodulatoren in herkömmliche Liposomen die Adjuvanzienaktivität des Immunmodulators und der Liposomen verstärkt, hat die Substitution herkömmlicher Liposomen durch spezielle oder pH-empfindliche Liposomen oder andere Vehikel, die Stimulation von CD8+-T-Zellen ermöglichen, einen zuvor unbekannten und unerwarteten Vorteil in der Verbesserung der Immunogenität der Vakzinen gezeigt.
  • Antigene, die in herkömmliche Liposomen eingekapselt sind, werden ganz anders als Antigene verarbeitet, die in pH-empfindliche Liposomen eingekapselt sind. Die Antigene in herkömmlichen Liposomen werden gemeinsam mit Klasse-II-Histokompatibilitätsmolekülen präsentiert und stimulieren als Ergebnis CD4+-T-Zellen. Hingegen können Antigene in pH-empfindlichen Liposomen gemeinsam mit Klasse-I-Histokompatibilitätsmolekülen präsentiert werden, die eine andere Klasse von Zellen, CD8+-T-Zellen, stimulieren. Die Wirkung solcher Unterschiede auf die Aktivität eines Immunmodulators ist unbekannt. Deshalb sind Ergebnisse der Einkapselung von Antigen(en) gemeinsam mit einem Immunmodulator in ein pH- empfindliches Liposom oder einen anderen Träger oder ein Molekül, das dem/den Antigen(en) ermöglicht, in den endozytischen Weg der Antigenverarbeitung und -präsentation einzutreten, schwierig vorherzusagen.
  • Die vorliegende Erfindung verwendet ein verbessertes pH-empfindliches Liposom, das aus Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und Cholesterylhemisuccinat (CHEMS) hergestellt worden ist, vorzugsweise als einzige liposombildende Lipide, die durch Lösung der Lipide in Methanol in Abwesenheit von Chloroform in einem bevorzugten Verhältnis von 6:4 und bei einem bevorzugten pH von etwa 8,5 bis etwa 9,5 hergestellt werden und die aus einer Menge an Lipiden im Bereich von 8 bis 80 mg Lipid pro 0,4 ml Vakzinendosis hergestellt werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein verbessertes Verfahren zur Verwendung von pH-empfindlichen Liposomen bereit. Die Verbesserung ist es, sie in einer hohen Konzentration von Lipid pro Vakzinendosis zu verwenden, da dies zu einer größeren Inkorporation von Antigen oder Vakzine in das Liposom und zu erhöhter Fähigkeit führt, zelluläre Immunreaktionen im Allgemeinen und insbesondere CD8+-T-Zellreaktionen zu simulieren.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Zusammensetzung der Erfindung zusätzliche Inhaltsstoffe beinhalten, wie z.B. pharmazeutische oder therapeutisch annehmbare Träger oder Verdünnungsmittel und zusätzliche Adjuvanzien, nicht-verkapselte oder ungebundene Immunmodulatoren, Antigen oder Träger.
  • Bevorzugte Antigene der vorliegenden Erfindung umfassen Antigene, die durch Melanomzellen in Kultur abgespalten werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Prävention von Melanom, Krebs, z.B. von Brust, Lunge, Colon, Prostata, Magen, Gastrointestinaltrakt, Gehirn, Blutzellen; wobei das Verfahren die Verabreichung einer präventiv wirksamen Menge der Vakzine der vorliegenden Erfindung an ein Säugetier, wie z.B. einen Menschen, umfasst, worin das Antigen der Vakzine eine CD8+-T-Zellimmunreaktion induziert. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung dieser Erkrankungen, worin der Impfstoff der Erfindung an ein Säugetier verabreicht wird, wie z.B. einen Menschen, in einer ausreichenden Menge, um die Schwere der Erkrankung zu eliminieren oder zu reduzieren oder die Erkrankung zu behandeln. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Induktion von CD8+-T-Zellreaktion oder Verstärkung der CD8+-T-Zellreaktion auf ein Antigen. Ein Verfahren zur Herstellung solcher Zusammensetzungen ist auch Teil dieser Erfindung.
  • Ein verbesserter Test zur Detektion und Quantifizierung von antigenspezifischen CD8+-T-Zellen ist auch Teil dieser Erfindung. Dieser Test ist eine grundlegende Modifikation eines zuvor beschriebenen ELISPOT-Tests. C.L. King, G. Thyrbronitis, T.B. Nutman, J. Immunol. Methods 132, 37–43 (1970). Er kann verwendet werden, um die Fähigkeit von Vakzinen zu messen, wie z.B. Vakzinen, die wie in der Erfindung beschrieben hergestellt werden können, um antigenspezifische CD8+-T-Zell-Reaktionen zu stimulieren. Der Test quantifiziert in einer Blut- oder einer anderen Probe die Anzahl an CD8+-T-Zellen, die auf ein Antigen von Interesse reagieren, wie z.B. ein Antigen, das an einen Patienten in einer Zusammensetzung dieser Erfindung bereitgestellt wird. Die Vorteile dieses Tests sind, dass er ein direkter Test ist, der keine verlängerte In-vitro-Stimulation mit Antigen erfordert und die Artefakte davon vermeidet, die in derzeit verfügbaren Tests, wie z.B. In-vitro-Stimulation und Grenzverdünnungsanalysetests, erforderlich ist. Zusätzlich dazu ist dieser neue Test empfindlicher und rascher als herkömmliche zytolytische oder Cytokinfreisetzungstests. Er misst die tatsächliche Anzahl an CD8+-T-Zellen anstelle anderer Vorläuferzellen, erfordert nicht, dass die CD8+-T-Zellen vor diesem Test gereinigt oder kloniert werden, und ist empfindlich genug, um in peripherem Blut die geringe Anzahl an antigenspezifischen CD8+-T-Zellen, die durch Vakzinenimmunisierung induziert werden, zu quantifizieren. Er kann verwendet werden, um Reaktionen auf ganze Zellen oder auf individuelle Antigene, wie z.B. Peptide, zu messen.
  • Der Test basiert auf der Messung der Anzahl an CD8+-T-Zellen, die durch ein Target-Antigen stimuliert worden sind, wie durch deren Sekretion bestimmter Cytokine belegt ist. In einem bevorzugten Aspekt dieses Verfahrens wird/werden das/die Cytokin/e, das/die durch antigenstimulierte CD8+-T-Zellen sekretiert wird/werden, gefangen und durch Durchführung des Tests in einem Gefäß immobilisiert, das eine Membran enthält, die mit einem Antikörper beschichtet ist, der gegen das Cytokin gerichtet ist, dessen Sekretion gemessen wird, und dann Visualisieren des gefangenen Cytokins durch auf dem Fachgebiet der Immuntests bekannte Mittel. Das bevorzugte Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst die Bereitstellung eines Behälters, der eine Membran mit Anticytokin-beschichtetem Antikörper enthält, zu welchem eine Testprobe hinzugefügt wird, die monozyten-abgereicherte Effektorzellen, wie z.B. menschliche periphere Blutlymphozyten, die mit Targetzellen gemischt werden, die ein Target-Antigen von Interesse, gebunden an Klasse-I-HLA-Moleküle, präsentieren, und Antikörper, die Klasse-II-HLA-Moleküle blockieren, enthält. Cytosinsekretierende antigenaktivierte CD8+-T-Zellen werden dann durch Hinzufügung eines anderen Cytokin-Antikörpers detektiert, der auf eine Art und Weise markiert worden ist, um mit einem ELISA-Verfahren visualisiert zu werden. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens ist der erste Anti-Cytokinantikörper an eine PDVF-Membran auf der unteren Fläche des Behälters gebunden. Die Messung oder Detektion von Cytokin, das durch aktivierte CD8+-T-Zellen freigesetzt wird, sowie Blockade von Klasse-II-HLA-Molekülen und Monozytenabbau der lymphozytenangereicherten Patienten-Probe sichert, dass die gemessenen oder detektierten Effektorzellen CD8+-T-Zellen sind. Ein Fachmann versteht, dass geeignete Kontrollen notwendig sind, um die Gültigkeit einer beliebigen Messung zu sichern. Solche Kontrollen umfassen die Fähigkeit, die Reaktion mit Antikörpern auf CD8+-T-Zellen aber nicht CD4+-T-Zellen oder andere Formen von Lymphozyten zu blockieren, die Fähigkeit, die Reaktion mit Antikörper auf Klasse-I-HLA aber nicht auf Anti-HLA-Klasse-I-Antikörper zu blockieren, und das Testen von Testproben auf Targetzellen, die ein anderes Antigen als das Testantigen präsentieren.
  • Mehrere kritische Modifikationen des zuvor beschriebenen ELISPOT-Tests sind eingeführt worden, um den Test empfindlicher und verlässlicher zu machen. Diese um fassen die Durchführung des Tests mit einer großen Anzahl (etwa 10-mal höheren Anzahl), d.h. 500.000 Zellen/Testprobe anstelle der üblichen Anzahl von 50.000 Zellen/Testprobe, von Effektorlymphozyten, um die sehr geringe Anzahl von vakzineninduzierten CD8+-T-Zellen zu detektieren, die innerhalb der Effektorzellpopulation gegenwärtig sind. Eine andere Modifikation ist die Durchführung des Tests in Gegenwart von Antikörpern zu Klasse-II-HLA-Molekülen, um zu vermeiden, dass bestimmte Populationen von Zellen, die nicht mit CD8+-T-Zellen verwandt sind, irrtümlicherweise als CD8+-T-Zellen gezählt werden. Andere Modifikationen umfassen den Abbau von Monozyten aus der Effektorlymphozytenpopulation, um Hintergrundinterferenz mit den Ergebnissen des Tests zu reduzieren und die Anzahl an Zellen, die CD8+-T-Zellen sind, genauer zu messen, das Durchführen des Tests in der kontinuierlichen Gegenwart von Testpeptid, anstatt das Testpeptid zu entfernen, das vor dem Test nicht an Targetzellen gebunden ist, das Vorbehandeln der Targetzellen mit Interferon vor der Verwendung 2 Tage lang, um deren Expression von Klasse-I-HLA und daher die Menge des Testpeptids, die sie präsentieren können, zu steigern, und die Herstellung blockierender Antikörper, die im Test durch ihre Konzentration durch Dialyse verwendet werden, um Denaturierung zu minimieren und kontaminierende Unreinheiten zu entfernen, wodurch ihre Aktivität verbessert wird.
  • Der Test wird durch Isolation von Lymphozyten aus einer Blutprobe durchgeführt, die von einem Subjekt erhalten wurde, dessen Immunstatus von Interesse ist, zum Beispiel ein Subjekt, das auf (ein) Targetgen(e) immunisiert ist oder ein Leiden, wie z.B. Krebs oder eine Infektion, aufweist, gegen welches eine Immunreaktion auftreten kann. Die Isolation von Lymphozyten aus dem gesamten Blut mit FicoII-Hypaque ist ein bekanntes Verfahren. Die Probe kann frisch oder rekonstituiert sein, zum Beispiel aus einer gefrorenen oder auf andere Art konservierten Probe. Die Anzahl an Lymphozyten in der Probe muss ausreichend groß sein, um die sehr geringe Anzahl in peripherem Blut zu detektieren, das durch Vakzinenbehandlung induziert wird. Diese Anzahl sollte im Bereich von 500.000 oder mehr Lymphozyten/Well liegen. Die Lymphozyten umfassen verschiedene Typen von Immunzellen, einschließlich CD8+-T-Zellen, sind aber künstlich von Monozyten abgereichert, die eine Aktivität haben, welche die Identifikation von CD8+-T-Zellen durch Blockieren von Antikörpern später im Test verhindert. Die Lymphozyten (Effektorzellen) werden auf einer geeigneten Fläche, wie z.B. einer Membran oder Platte, inkubiert, welche das/die Cytokin(e) fangen kann, die sie freisetzen, sobald sie durch Antigen aktiviert sind. Eine bevorzugte Membran ist PDVF-Membran, und ein herkömmlicher Typ von Platte ist eine Multiwell-Mikrotiter-Platte. Die Oberfläche wird mit Anticytokin-Antikörpern vorbeschichtet, um Cytokine zu fangen, die durch einzelne CD8+-T-Zellen sekretiert werden, die durch Antigen stimuliert worden sind, und um durch dieses Mittel die aktivierten CD8+-T-Zellen zu visualieren. Das Cytokin, das gemessen wird, kann ein beliebiges produziertes Cytokin sein, das durch eine antigenaktivierte CD8+-T-Zelle produziert und sekretiert wird. Interferon, insbesondere Interferon-gamma, ist ein bevorzugtes Cytokin. Die Effektorzellen werden mit Zellen inkubiert, die das Targetantigen auf ihren Oberflächen präsentieren.
  • Die Targetzellen können Tumorzellen oder infektiöse Organismen, die schon ein Targetantigen tragen, oder antigenpräsentierende Zellen sein, die mit einem sekretierten Targetantigen, wie z.B. einem isolierten Peptid, inkubiert worden sind, unter Bedingungen, sodass das Targetantigen auf die Zelloberfläche transferiert wird. Um den wirkungsvollsten Test bereitzustellen, sollen die Zellen, die Targetantigen präsentieren, das Antigen gemeinsam mit Klasse-I-HLA-Molekülen aufweisen, die jene Form von HLA-Molekülen sind, auf welche CD8+-T-Zellen reagieren. Wenn die gewünschten Targetzellen keine Klasse-I-HLA-Moleküle aufweisen, kann DNA, die für solche Moleküle kodiert, durch bekannte Verfahren in die Zellen insertiert werden, um zu veranlassen, dass die Zellen Klasse-I-HLA-Moleküle exprimieren. Ein bevorzugtes Klasse-I-HLA-Molekül ist das bekannte Allel HLA-A2. Um außerdem sicherzustellen, dass die reagierenden Zellen im Test CD8+-T-Zellen sind, die auf Antigen reagieren, das im Kontext von Klasse-I-HLA-Molekülen vorliegt, werden Antikörper gegen HLA-Klasse-II-Antigene zu den gemeinsam inkubierten Effektor- und Targetzellen hinzugegeben, um ein beliebiges Targetantigen davon abzuhalten, gemeinsam mit HLA-Klasse-II-Molekülen durch Blockade der Moleküle mit den Antikörpern präsentiert zu werden. Letztlich wird die Art von stimulierten Zellen und deren HLA-Restriktion durch Hinzufügung von Antikörpern gegen Antigene, die auf CD8+-T- und CD4+-T-Zellen erscheinen, und gegen Klasse-I- und -II-HLA-Moleküle zu einer be stimmten Anzahl von Wells und Bestimmung, ob CD8+-T-Zellreaktion durch Antikörper gegen CD8 und Klasse-I-HLA blockiert worden ist, aber nicht durch Antikörper gegen CD4 und Klasse-II-HLA, nachgewiesen. Zur Bereitstellung des wirkungsvollsten Tests können die Targetzellen mit Interferon-gamma 2 Tage lang vor der Verwendung vorinkubiert werden, um die Menge von Klasse-I-HLA-Molekülen zu erhöhen, die auf der Oberfläche vorliegen, und daher die Menge von Testantigen oder Peptid, die präsentiert werden kann. Zur Bereitstellung des wirkungsvollsten Tests sollten Testpeptid oder Antigen aus Targetzellen vor Inkubation von Effektorzellen mit Targetzellen nicht abgewaschen werden oder aus andere Weise davon entfernt werden.
  • Nachdem die Proben einen geeigneten Zeitraum lang und unter geeigneten Bedingungen für beliebige CD8+-T-Zellen inkubiert worden sind, um durch das Targetantigen stimuliert zu werden und Cytokin als Reaktion zu sekretieren, werden die Zellen, die Cytokin sekretierten, sichtbar gemacht und durch herkömmliche Mittel gezählt, zum Beispiel durch die Verwendung eines Doppel-Sandwich-ELISA [siehe Taguchi et al. (1990)]. Jeder „Punkt", der auf ELISA erscheint, entspricht spezifisch einer einzelnen Zelle, die Cytokin als Reaktion auf Stimulation sekretiert hatte. Eine positive CD8+-T-Zell-Reaktion wurde durch die Gewinnung von Zellen beobachtet, von denen bestimmt worden ist, dass sie CD8+-T-Zellen sind, da sie CD8-Antigen aufweisen und auf Klasse-I-HLA-Moleküe auf den antigenpräsentierenden Zellen reagiert haben. Dass die CD8+-T-Zellen für das Target-Antigen spezifisch sind, wird durch ihre fehlende Reaktion auf Targetzellen beobachtet, die Kontrollantigene enthalten, die durch CD8 erkannt werden können und dieselbe HLA-Restriktion wie das Targetantigen aufweisen, aber mit dem Targetantigen nicht verwandt sind. Durch ihre Sekretion des Cytokins ist auch zu sehen, dass diese CD8+-T-Zellen aktiviert werden. Der Test ist sehr empfindlich und in der Lage, 0,001% von CD8+-T-Zellen zu detektieren, die in der Effektorzellformulierung gegenwärtig sind. Fünf oder mehr CD8+-T-Zellen von 500.000 Effektorzellen können als positives Ergebnis in diesem Test angesehen werden. Die allgemeinen Verfahren und Materialien, die verwendet werden, um den Test durchzuführen, sind nachstehend beschrieben.
  • Dementsprechend ist hierin ein Test zur Bestimmung bereitgestellt, ob eine CD8+-T-Zellreaktion auf ein Targetantigen in einem Subjekt aufgetreten ist, indem folgende Schritte durchgeführt werden: Beschichtung einer PDVF-(Polyvinylidenfluorid-)Membranoberfläche mit Anticytokinantikörpern, Hinzufügung von Targetzellen, die das Targetantigen auf ihren Oberflächen tragen, zu der beschichteten Membran, Gewinnung einer Probe von peripheren Blutzellen aus dem Subjekt und Abreichern der Probe an Monozyten, um Effektorzellen bereitzustellen, Hinzufügung von Effektorzellen zur Zellsuspension, um Testproben zu erhalten, Hinzufügung von Antikörpern, die Klasse-II-HLA-Moleküle blockieren, zu den Testproben, Hinzufügung von Antikörpern, die sich an CD8+-T-Zelloberflächenantigen binden, zu einigen Testproben, Inkubation der resultierenden Testproben für einen ausreichenden Zeitraum, um beliebigen CD8+-T-Zellen in den Testproben, die das Antigen erkennen, zu ermöglichen, auf das Antigen durch Sekretion von Cytokin zu reagieren, Messung der Gesamtzahl von Zellen, die das Antigen erkennen, durch Zählen der Anzahl an Zellen, die mit Anticytokinantikörpern reagieren, und Bestimmung der Anzahl von cytokinsekretierenden Zellen, die CD8+ sind, durch Subtraktion der Anzahl an reagierenden Zellen in Wells, die Anti-CD8-Antikörper enthalten, von jenen, die in Wells vorliegen, die einen Kontrollantikörper enthalten. Ein wesentliches Element des Tests ist es, dass die Targetzellen und die Zellen in der Testprobe das HLA-Allel teilen, an welches sich das Testantigen binden kann.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1: Verbessertes Überleben von Mäusen, die mit einer Vakzine immunisiert worden sind, die in pH-empfindliche Liposomen eingekapselt ist, die IL-2 enthalten. Gruppen von 10 Mäusen wurden wöchentlich 4-mal mit einer Melanomvakzine immunisiert, die in pH-empfindliche Liposomen eingekapselt worden ist
    Figure 00160001
    vakzine, die zusammen mit 10.000 internationalen Einheiten IL-2 in pH-empfindliche Liposomen eingekapselt ist (∇), Vakzine, die zusammen mit IL-2 in herkömmliche (nicht pH-empfindliche) Liposomen (☐) oder PBS (∎) eingekapselt ist. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden alle Mäuse einer tödlichen Anzahl an Melanomzellen ausgesetzt. Es ist anzumerken, dass die beste Überlebensrate jene von Mäusen war, die mit Vakzine immunisiert wurde, die zusammen mit IL-2 in pH-empfindliche Liposomen eingekapselt war.
  • 2: Filter-Spot-Test auf vakzineninduzierte CD8+-T-Zellen gegen Melanomantigen MACE-3. Monozytenabgereicherte PBL aus einem HLA-A2-positiven Patienten, die vor (prä-) und nach vier Melanomvakzinenimmunisierungen erhalten wurden, wurden auf Reaktivität auf eine HLA-A2-positive Targetzelllinie getestet, die mit A2.1-restringierten Peptiden pulsiert worden waren, die aus MAGE-3 oder CSP stammten (einem A2.1-restringierten Kontrollpeptid). Es ist anzumerken, dass es eine erhöhte Anzahl an Zellen gibt, die auf MAGE-3-Peptid-pulsierte Zellen nach Vakzinenimmunisierung reagieren. Diese Zellen sind CD8+ (da die Reaktivität durch Anti-CD8 aufgehoben wird), HLA-restringiert (da Reaktivität vollständig durch Anti-HLA-Klasse-1-Antikörper vollständig aufgehoben wird) und ist peptidspezifisch (da es keinen Anstieg an Reaktivität auf mit CDS-Peptid pulsierte Zellen gibt.
  • 3: Vakzineninduzierte Antikörperreaktion auf individuelle Antigene, die in vivo exprimiert werden. Die Figur veranschaulicht die Reaktion von Antikörpern in prä-(Spur A) und post-(Spur B)Vakzinenbehandlungsseren bei 3 Patienten. Die Ergebnisse wurden durch Immunblotting unter Verwendung von frischem, chirurgisch herausgeschnittenem Melanomgewebe als Antigenquelle erhalten. Es ist anzumerken, dass Vakzinenimmunisierung Antikörperreaktionen auf ein oder mehrere Antigene von 45, 59, 68, 79, 89, 95 und/oder 110 kD induzierte.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung ist auf Zusammensetzungen ausgerichtet, welche die immunologische Aktivität von Antigenen und Vakzinen erhöhen. Eine solche Zusammensetzung umfasst ein von einer Krebszelle abgespaltenes Antigen, auf welches eine Immunreaktion gewünscht ist, ein pH-empfindliches Liposom, das wie hierin zuvor definiert vorliegt, um dem Antigen zu ermöglichen, eine CD8+-T-Zell- oder CTL-Reaktion zu ermöglichen, und ein oder mehrere Immunmodulatoren, wie hierin zuvor definiert, um das Ausmaß der Immunreaktionen, die stimuliert werden, zu erhöhen. Das Antigen und der Immunmodulator können zusammen verkapselt werden oder aber in oder mit dem pH-empfindlichen Liposom oder einem anderen Träger auf andere Weise gebunden werden, sodass das/die Antigen(e), der/die Immunmodulator(en) und Träger zusammen den Immunzellen zugeführt werden.
  • Insbesondere ist eine Zusammensetzung dieser Erfindung dazu entworfen, eine besondere und wirkungsvolle Immunreaktion, die CD8+-T-Zell- oder CTL-Reaktionen, welche die Tötung von unerwünschten Targetzellen vermitteln, zu stimulieren. Wenn eine solche Reaktion erwünscht ist, kann jedes Element der Zusammensetzung eine Rolle in der Auslösung der Reaktion in einem gewünschten Ausmaß an Wirksamkeit spielen. Die Zusammensetzung umfasst das/die Antigen(e) der Wahl, bei welchen es gewünscht ist, dass die Immunrekation dagegen ausgelöst wird, den einen oder mehrere Immunmodulatoren, von denen erwartet wird, dass sie das Ausmaß an Immunreaktionsfähigkeit erhöhen, und den Träger, der das Antigen in den Klasse-I-restringierten Weg von Antigenverarbeitung und -präsentation einführt, sodass das Antigen CD8+-Zellen oder CTLs zusammen mit Klasse-I-Histokompatibilitätsantigenen auf der Zelloberfläche präsentiert werden kann, um CD8+-T- oder CTL-Reaktionen auszulösen. Der Träger wirkt auch, um das/die Antigen(e) und die Immunmodulator(en) zusammen Immunzellen zuzuführen, wo beide in enger Nähe zueinander nötig sind, um ihre Funktion auszuüben, und sie können auch als Vehikel zur langsamen Freisetzung wirken, um die Dauer der Wirkung des Antigens/der Antigene und Immunmodulator(en) zu verlängern.
  • Ein Antigen ist eine Einheit, die eine Immunreaktion entweder abhängig von oder zusammen mit einem Träger oder Adjuvans stimuliert. Daher kann das Antigen der Zusammensetzung ein beliebiges von einer Krebszelle abgespaltetes Antigen sein, auf welches eine Immunreaktion gewünscht ist. Antigen wie hierin verwendet kann für ein einzelnes Antigen oder mehr als ein Antigen oder eine Vakzine stehen. Ein beliebiges Antigen kann mehr als eine Antigendeterminante enthalten, auf welche eine spezifische Immunreaktion auftritt.
  • Wie bekannt ist, können Antigene aus vielen Quellen erhalten werden, natürlichen und synthetischen. Zum Beispiel können natürliche Antigene durch Zellen abgespalten werden, insbesondere wenn sie in Kultur gezüchtet werden. Das Antigen kann ein Fragment der Oberfläche oder ein internes Fragment sein, das von einer dieser Quellen abstammt. Solche Antigene sind wahrscheinlich Proteine und Peptide, Polysaccharide, Ganglioside oder Nucleinsäuren. Antigene können auch künstlich durch bekannte Verfahren chemischer Synthese, Proteinsynthese oder Gentechnik produziert werden. Verfahren zur Gewinnung von Antigenmaterialien und Reinigung von Antigenen sind fachbekannt wie Verfahren zum Synthetisieren eines gewünschten Antigens. Zusätzlich dazu sind Tests zur Bestimmung bekannt, ob eine bestimmte Einheit immunogen ist und als Antigen wirkt, und ein verbesserter Test zur Messung einer solchen Reaktion, die CD8+-T-Zellreaktion, ist Teil dieser Erfindung.
  • Die Zusammensetzungen dieser Erfindung können ein einziges Antigen oder mehrere Antigene umfassen. Mehrere Antigene können auf dasselbe Leiden ausgerichtet sein, um die Immunreaktion auf dieses Leiden zu stärken, oder können auf verschiedene Leiden ausgerichtet sein, um eine Immunreaktion auf mehrere Leiden bereitzustellen. Eine Vakzine ist ein oder eine Sammlung von mehreren Antigenen und kann auch ein Medium, ein Konservierungsmittel, ein Adjuvans und eine andere bekannte Vakzinenkomponente umfassen, einschließlich pharmazeutisch annehmbare Träger oder Zusatzstoffe. Eine polyvalente Vakzine kann Antigene aus derselben Quelle enthalten und eine Immunreaktion auf eine einzelne Erkrankung oder Leiden auslösen oder Antigene aus verschiedenen Quellen enthalten und eine Immunreaktion auf mehr als eine Erkrankung oder Leiden auslösen. Zum Beispiel erhöht die Verwendung einer polyvalenten Vakzine, die einen breiten Bereich an Tumorantigenen enthält, die Wahrscheinlichkeit, dass die Vakzine Antigene enthält, die in der Lage sind, schützende Immunität zu stimulieren. Weiters resultieren Immunreaktionen auf mehrere Antigene wahrscheinlicher in der Tötung einer Tumorzelle als Reaktion auf ein einzelnes Antigen. Ein großer Bereich an Antigenen wird wahrscheinlich auch Antigenheterogenität umgehen.
  • Die Fähigkeit, verstärkte Immunreaktionen, insbesondere eine CD8+-T-Zell- oder CTL-Reaktion, gegen Krebszellen zu stimulieren, um dem Immunsystem zu ermöglichen, solche Zellen zu enthalten und zu zerstören, ist ein besonderes Ziel dieser Erfindung. Das betreffende Antigen kann eine gesamte Zelle jeglicher Art sein, die transformiert worden ist und als Folge die Eigenschaften einer Krebs- oder einer erkrankten Zelle aufweist. Oder das Antigen kann eine Zelloberfläche oder ein internes Fragment einer solchen Zelle sein, die durch eine solche Zelle in Körperflüssigkeit oder Kulturmedium abgespalten ist. Ein solches Antigen kann ein Protein oder ein Polysaccharid oder ein Gangliosid oder eine Nucleinsäure oder eine andere Einheit, die in der Lage ist, eine Immunreaktion gegen Krebs auszulösen, sein. Wie oben angeführt können Antigene natürlich oder synthetisch durch bekannte Verfahren produziert werden, zum Beispiel durch Kultivieren von Krebszellen und Isolation gewünschter Antigene daraus, oder durch Isolation gewünschter Antigene aus Krebsgewebe oder durch Synthese oder Gentechnik.
  • Die bevorzugten Immunmodulatoren sind IL-2, IL-12, IL-1 und GM-CSF. IL-2 wird durch Helfer-T-Zellen produziert, und es ist bekannt, dass es verursacht, dass antigenaktivierte T-Zellen klonale Vermehrung durchlaufen (d.h. sich teilen, um mehr T-Zellen zu bilden, die ebenfalls auf das Antigen reagieren). IL-12 verstärkt sowohl antigenspezifische CD8+-CTL-Reaktionen als auch komplementfixierende Antikörper-produktion in vivo. Mäuse, die mit IL-12 plus synthetischem HIV-Peptid in Adjuvans immunisiert sind, zeigen einen signifikanten Anstieg an peptidspezifischer CTL-Induktion. J.D. Ahlers et al., „Cytokine-in-adjuvant steering of the immune response phenotype to HIV-1- vaccine constructs", J. Immunol. 158, 3947–3958 (1997). Ähnlich erhöht IL-12 plus Proteinantigene antigenspezifische IgG2a-, IgG2b- und IgG3-Antikörperproduktion 10- bis 1000fach. T. Germann et al., „Interleukin-12 profoundly up-regulates the synthesis of antigen-specific complement-fixing IgG2a, IgG2b, and IgG3 antibody subclasses in vivo", Eur. J. Immunol. 25, 823–829 (1995). Diese Wirkungen gemeinsam mit der Fähigkeit von IL-12, T-Zellpopulationen in Richtung eines Th1-Phänotyps zu verschieben [H.J. Zeh, III., et al., „Interleukin-12, in: The Cytokine Handbook, 2. Auflage, hrsg. von A. Thomson, Academic Press, New York, NY, 239–256 (1994)] erhöhen die Wahrscheinlichkeit einer wirkungsvollen Zellimmunreaktion. GM-CSF wird durch verschiedene Formen von Zellen produziert und stimuliert antigenpräsentierende Zellen. Diese Proteine sind im Handel erhältlich (zum Beispiel von Chiron (Emeryville, CA) und Immunex (Seattle, WA)) oder können aus den Zellen, die sie produzieren, durch bekannte Verfahren isoliert werden.
  • Der Träger dieser Erfindung ist eine Einheit, die in der Lage ist, zu bewirken, dass das Antigen auf der Zelloberfläche einer antigenpräsentierenden Zelle gemeinsam mit Klasse-I-Histokompatibilitätsmolekülen präsentiert wird, um CD8+-T-Zellen oder CTL und andere Immunzellen zu stimulieren. Wie oben angeführt ist bekannt, dass mehrere Einheiten diese Wirkung zeigen, darunter spezialisierte Liposomen und Virosomen, Moleküle wie z.B. Hitzeschockprotein und Toxine und kleine partikuläre Objekte wie z.B. Glas, Eisen oder bioabbaubare Kügelchen. Die Gewinnung beliebiger solcher Einheiten und Verwendung dieser in einer Zusammensetzung dieser Erfindung ist durch einen Fachmann leicht zu erfüllen. Ein bevorzugter Träger ist eine besondere Form von Liposom – das pH-empfindliche Liposom. Diese Liposomen fusionieren mit Zellmembranen oder Endosomen, um deren Gehalte in das Innere der Zelle freizusetzen. Herstellung von pH-empfindlichen Liposomen ist fachbekannt, und ein verbessertes Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Liposomen ist im Abschnitt „Verfahren" bereitgestellt.
  • Die Zusammensetzungen der Erfindung werden durch Kombination eines oder mehrerer Antigene, auf welche eine Immunreaktion gewünscht ist, einer oder mehrerer Immunmodulatoren und eines oder mehrerer Träger, die in der Lage sind, das Antigen zuzuführen, hergestellt, sodass das Antigen auf der Zelloberfläche gemeinsam mit Klasse-I-Histokompatibilitätsmolekülen vorliegt. Die Mengen jeder Komponente sind jene, die wirkungsvoll sind, um eine Immunrelation auf das Antigen zu induzieren, vorzugsweise eine CD8+-T-Zell- oder CTL-Reaktion. Die Tatsache, dass solche Reaktionen induziert worden sind, kann durch die Verwendung von fachbekannten Tests bestimmt werden. Diese Erfindung stellt auch einen neuen und höheren Test bereit, der verwendet werden kann, um zu bestimmen, ob eine Zusammensetzung dieser Erfindung eine CD8+-T-Zellreaktion induziert. Daher können beliebige Mengen der Komponenten durch beliebige Mittel kombiniert werden, um zur Zusammen setzung dieser Erfindung zu gelangen, die eine Immunreaktion induziert, vorzugsweise eine CD8+-T-Zell- oder CTL-Reaktion. Um als Zusammensetzung dieser Erfindung zu wirken, ist alles, was notwendig ist, dass eine Immunreaktion, vorzugsweise eine CD8+-T-Zell- oder CTL-Reaktion, induziert wird. Jedoch kann eine Zusammensetzung dieser Erfindung durch Linderung und Eliminierung des Leidens, an welchem der Patient erkrankt ist, an welchen die Zusammensetzung verabreicht wurde, als wirkungsvoll eingestuft werden. Jede Komponente in der Zusammensetzung kann an eine oder mehrere andere Komponenten auf beliebige Weise gebunden sein. Zum Beispiel können das Antigen und der Immunmodulator beide molekular an den Träger gebunden sein oder in den Träger eingekapselt sein.
  • Die Zusammensetzung dieser Erfindung verwendet ein pH-empfindliches Liposom als Träger, in welchen (ein) Antigen(e) und Immunmodulator(en) wie hierin oben beschrieben eingekapselt sind. Herstellung von pH-empfindlichen Liposomen und Einkapselung kann durch fachbekannte Verfahren erreicht werden. Jedoch maximieren mehrere neue und insbesondere wichtige Modifikationen der Verfahren die Wirksamkeit und Sicherheit des Verfahrens und sind Teil dieser Erfindung.
  • Es wird versucht, die Verwendung von Chloroform zu vermeiden, eines der Standardmittel, das verwendet wird, um die Lipide, die zur Herstellung von Liposomen verwendet werden, löslich zu machen, da dieses Mittel schwer aus den Liposomen zu entfernen ist und karzinogen ist. Die vorliegende Erfindung umfasst vorzugsweise nicht die Verwendung von Chloroform. Andere potenziell toxische Mittel sollen auch in der Herstellung der Liposomen vermieden werden.
  • Eine zweite Modifikation ist die Verwendung einer neuen Kombination von Lipiden zur Herstellung von pH-empfindlichen Liposomen, welche die Löslichkeit der Lipide und Liposomen verbessert und den Lipiden ermöglicht, ohne Verwendung von Chloroform solubilisiert zu werden. Diese Modifikation besteht aus der Verwendung einer Kombination der Lipide Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und Cholesterylhemisuccinat (CHEMS) zur Herstellung von pH-empfindlichen Liposomen anstelle von DOPE und 1,2-Dioleyl-sn-succinylglycerol (DOSG), welche die herkömmlich verwendeten Lipide sind. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird DOSG nicht zur Herstellung der pH-empfindlichen Liposomen verwendet.
  • Eine dritte Modifikation ist, dass die Menge an Lipiden, die verwendet wird, um die Liposomen herzustellen, so hoch wie möglich sein soll, da dies den Anteil an Vakzinen und Immunodulator(en) erhöhen kann, die in die Liposomen eingekapselt werden können. In dem besonderen Beispiel dieser Erfindung, das nachstehend beschrieben ist, war die Menge des verwendeten Lipids 8 mg pro 0,4-ml-Vakzinendosis. Jedoch können höhere Dosen von 40 bis 80 mg Lipid pro 0,4-ml-Vakzinendosis (oder einer proportional höheren oder niedrigeren Dosis von Lipid basierend auf einem größeren oder kleinerem Vakzinenvolumen) noch wirkungsvoller sein, da wie nachstehend dokumentiert die Inkorporation von Proteinen in Liposomen mit einer zunehmenden Menge an Lipid zunimmt wie die Fähigkeit der resultierenden Liposomenvakzinen, die Zellimmunreaktionen zu stimulieren. Die maximale Menge an Lipiden, die verwendet werden kann, um Liposomen herzustellen, liegt im Bereich von 80 mg pro 0,4-ml-Vakzinendosis (oder einer proportional höheren oder niedrigen Dosis an Lipid, basierend auf einem größeren oder kleinerem Vakzinenvolumen). Höhere Dosen an Lipiden können nicht verwendet werden, da die Liposomen das gesamte verfügbare Volumen ausfüllen.
  • Eine vierte Modifikation ist, dass die Einkapselung bei einem geeigneten pH durchgeführt werden sollte, um Probleme der Unlöslichkeit der Mittel, die verwendet werden, um die Zusammensetzung herzustellen, und des Liposomenabbaus zu minimieren. Ein höherer pH begünstigt Solubilisierung, aber ein zu hoher pH führt zum Abbau von Liposomen und Antigendenaturierung. In der besonderen Anwendung dieser Erfindung liegt der optimale pH zwischen etwa 8,5 bis etwa 9,0.
  • Eine fünfte Modifikation betrifft die Behandlung der Liposomen, die eingekapseltes Material enthalten, die normalerweise gewaschen oder auf andere Weise behandelt werden, um aus der Formulierung ein beliebiges Antigen oder Immunmodulator(en), die nicht in das Liposom eingekapselt sind, zu entfernen. In der in dieser Erfindung beschriebenen Modifikation wird die endgültige Liposomenzusammensetzung ohne Waschung verwendet, sodass sie sowohl eingekapselte als auch nicht-eingekapselte Vakzine und Immunmodulatoren enthält. Dies erleichtert und beschleunigt den Herstellungsprozess und macht es einfacher, die Dosis an Vakzinen, Immunmodulator(en) und Liposomenlipid, das an Patienten verabreicht wird, zu standardisieren, da keine im Waschverfahren verloren geht.
  • Ein Probenprotokoll zur Kombination der Komponenten, sodass das Antigen und der Immunmodulator in das pH-empfindliche Liposom inkorporiert werden, ist im nachstehenden Abschnitt „Verfahren" bereitgestellt. Wie oben angeführt wird die Zusammensetzung dieser Erfindung durch Kombination einer Menge jeder Komponente, die wirkungsvoll ist, um eine CD8+-T-Zellreaktion auf das Antigen bereitzustellen, hergestellt.
  • Eine bevorzugte Menge an pH-empfindlichem Liposom für eine Zusammensetzung dieser Erfindung reicht von etwa 0,1 bis etwa 80,0 mg Lipid/0,4-ml-Vakzinendosis. Eine besonders bevorzugte Menge an pH-empfindlichem Liposom ist etwa 8,0 bis 80,0 mg Lipid/0,4-ml-Vakzinendosis.
  • Bevorzugte Immunmodulatoren sind GM-CSF, IL-2, IL-1 und IL-12. Eine bevorzugte Menge an GM-CSF reicht von etwa 1,0 bis etwa 300 μg/Vakzinendosis. Eine bevorzugte Menge an IL-2 ist etwa 104 bis etwa 6.000.000 Einheiten, und eine besonders bevorzugte Menge ist etwa 2.000.000 internationale Einheiten/Vakzinendosis. Immunmodulatoren können kovalent an Polyalkylenglykole (wie z.B. PEG) für zusätzliche Stabilität gebunden sein.
  • Ein bevorzugtes Antigen ist ein Melanomantigen, das in Form einer Vakzine gegenwärtig sein kann, die aus einem einzelnen oder mehreren Antigenen hergestellt wird. Eine besonders bevorzugte Vakzine ist eine polyvalente Vakzine, die aus Antigenen hergestellt wird, die durch Melanomzellen in Kultur abgespalten werden, und mehrere Melanomantigene enthält (insbesondere beliebige(s) einer oder mehrerer der Melanomantigene MAGE-1, MAGE-3, MART-1/Melan-A, Tyrosinase, gp100 und Antigene, die durch frisches Melanomgewebe exprimiert werden, mit einem Molekularge wicht von etwa 36, 45, 59, 68, 79, 89, 95 und 110 Kilodalton) und anderen Antigenen, die durch Melanomzellen in Gewebskultur abgespalten werden. Eine bevorzugte Menge an Vakzine reicht von etwa 1,0 bis etwa 100 μg/Dosis der Zusammensetzung, und eine besonders bevorzugte Menge ist etwa 40 μg/Dosis der Zusammensetzung.
  • Gemäß des Vorangegangenen umfasst eine Zusammensetzung dieser Erfindung eine Melanomvakzine und IL-2, IL-12 und/oder GM-CSF, eingekapselt in pH-empfindliche Liposomen. Die Komponenten sind in wirkungsvollen Mengen bereitgestellt, um eine Immunreaktion zu induzieren, vorzugsweise eine CD8+-T-Zell- oder CTL-Reaktion auf die Vakzine, die durch bekannte Verfahren bestimmt werden kann (oder noch wirkungsvoller durch den Test dieser Erfindung, der nachstehend beschrieben ist). Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung umfasst etwa 40 μg/Vakzinendosis, etwa 8,0 bis 80,0 mg/Dosis an pH-empfindlichem Liposom und etwa 2 × 108 internationale Einheiten an IL-2 und/oder etwa 250 μg/Dosis an GM-CSF.
  • Verfahren zur Behandlung und Prävention von Leiden durch die Verwendung von Zusammensetzungen dieser Erfindung in wirksamen Mengen, um eine Immunreaktion zu induzieren, die das Leiden behandelt oder vermeidet, sind in dieser Erfindung enthalten. Insbesondere wird die Verwendung von Zusammensetzungen zur Behandlung und Prävention von Melanomen durch die Verabreichung einer Zusammensetzung dieser Erfindung, die ein oder mehrere Melanom-Antigen(e) enthält, an einen Patienten in Betracht gezogen. Andere Leiden, die so behandelt werden sollen, umfassen Infektionskrankheiten, zum Beispiel AIDS, und andere Formen von Krebs. Alles, was notwendig ist, ist, Antigene zu erhalten, die für das Leiden charakteristisch sind, wie z.B. Antigene, die durch kanzeröse Zellen abgespalten werden. Diese Antigene können in Form von natürlich auftretender Zelle oder Organismus oder als solubilisierte, nicht-gereinigte oder teilweise gereinigte Extrakte dieser Zellen oder Organismen verwendet werden oder können durch fachbekannte Verfahren isoliert oder synthetisiert werden, dann werden solche Antigene verwendet, um eine Zusammensetzung dieser Erfindung zu bilden, wie oben beschrieben. Die Verfahren dieser Erfindung sind auf die Induktion einer beliebigen Form von Immunreaktion auf das Targetantigen oder Targetantigene ausgerichtet, die Teil der bestimmten Zusammensetzung sind, zum Beispiel eine beliebige humorale oder zellvermittelte Reaktion. Tests zur Bestimmung der Induktion einer Immunreaktion sind bekannt. Im Allgemeinen kann eine Blutprobe eines immunisierten Patienten auf die Gegenwart von Antikörpern gegen Target-Antigen getestet werden. Die Probe kann auch auf die Gegenwart von Zellen getestet werden, die das Target-Antigen erkennen. Zellimmunreaktionen können ebenfalls durch Überempfindlichkeitsreaktionen (DTH) vom verzögertem Typ auf Hauttests auf die Vakzine oder das Antigen getestet werden. In jedem Fall bedeutet ein positives Ergebnis, das sich eine Immunreaktion entwickelt hat. Ein Filter-Spot-Test dieser Erfindung ist insbesondere in der Bestimmung nützlich, ob eine zelluläre Immunreaktion induziert worden ist. Weiters ist die Linderung oder Eliminierung des betreffenden Leidens auch ein Ziel der Verfahren dieser Erfindung. Jedoch erfordert die Anwendung der Verfahren nur Induktion einer Immunreaktion.
  • Zusammensetzungen dieser Erfindung können in einer wirksamen Menge verabreicht werden, um wie oben beschrieben eine Immunreaktion in einem bestimmten Patienten zu induzieren. Ein Fachmann kann daher basierend auf dem Patienten und der Art von Formulierung, die verwendet wird, einfach geeignete Dosisausmaße bestimmen. Wie angeführt ist eine Dosis wirksam, wenn eine Immunreaktion gegen das Antigen in der Zusammensetzung induziert wird, und Immunreaktionen können unter Verwendung von fachbekannten Tests detektiert werden. Ein Beispiel für die Evaluierung wirksamer Dosen ist nachstehend bereitgestellt.
  • Eine beliebige Formulierung einer Zusammensetzung dieser Erfindung, die eine Immunreaktion wie oben beschrieben induziert, ist Teil dieser Erfindung. Daher können die Zusammensetzungen dieser Erfindung auf herkömmliche Weise in Dosisformen formuliert werden, die für orale Verabreichung (wie z.B. Pillen, Pastillen, Kapseln), Verabreichung durch Inhalation (wie z.B. Aerosol oder Vernebelung), Zäpfchen etc. geeignet sind. Daher kann eine Zusammensetzung dieser Erfindung auch herkömmliche inaktive Inhaltsstoffe, wie Träger, Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Farbstof fe, Geschmackstoffe etc., umfassen. Eine Zusammensetzung dieser Erfindung kann auch andere aktive Inhaltsstoffe umfassen. Jedoch sind bevorzugte Formulierungen jene, die für Injektionszwecke entwickelt worden sind, die zum Beispiel intradermal, subkutan, intramuskulär oder intravenös erfolgen kann.
  • Hinsichtlich einer injizierbaren Formulierung dieser Erfindung besteht ein bevorzugter Dosierungsplan aus intradermalen Injektionen, die alle zwei bis drei Wochen in 4 Dosen verabreicht werden, dann monatlich drei Monate lang oder bis eine gewünschte Immunreaktion erhalten wird und dann alle drei bis sechs Monate über einen Zeitraum von insgesamt zwei bis fünf Jahren.
  • Die folgenden Beispiele, die bereitgestellt sind, um die Erfindung zu illustrieren, sollen die Erfindung in keiner Weise einschränken. Ein Fachmann versteht, dass eine Vielzahl anderer Ausführungsformen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegt.
  • BEISPIELE
  • VERFAHREN: Die nachstehend beschriebenen Verfahren sind in ausreichendem Detail bereitgestellt, sodass ein Fachmann in der Lage ist, die notwendigen Verfahren durchzuführen und beliebige Ausgangsmaterialien zu erhalten, die erforderlich sind, um eine bestimmte Anwendung dieser Erfindung herzustellen, d.h. die Herstellung einer polyvalenten Vakzine für Melanom, eingekapselt in pH-empfindliche Liposomen, die Immunmodulator IL-2 enthalten, und ein Filter-Spot-Test, um CD8+-T-Zellreaktionen zu messen, die es stimuliert.
  • Verfahren zur Herstellung herkömmlicher Liposomen
  • Herkömmliche, pH-unempfindliche Kontrollliposomen wurden wie von Andersen beschrieben [Cancer Res. 50, 1853–1856 (1990)] durch Auflösen von 0,50 g Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) [Avanti Polar Lipids, Alabaster AZ) in 12,5 mol Chloroform:Methanol (2:1) hergestellt. Die Menge an DMPC war ausreichend, um Li posomen für etwa 50 Vakzinendosen (4 Dosen/Phiole bei 40 μg Vakzine/Dosis) bei einer Lipidkonzentration von 8 mg/Dosis herzustellen. Das gelöste DMPC wurde in sterile 2,0-ml-Glasphiolen bei 32,0 mg/Phiole dispensiert (jeweils 1,0 ml); das Lösungsmittel wurde mit Stickstoff entfernt, und die Phiolen wurden bei –80°C aufbewahrt.
  • Verfahren zur Herstellung von pH-empfindlichen Liposomen:
  • pH-empfindliche Liposomen werden durch eine wesentliche Modifikation eines Verfahrens erzeugt, das von Zhou et al. (J. Immunol. Methods 145, 143–152 (1991)] beschrieben wurde, wie folgt. Die Modifikationen, die eingeführt worden sind, sollen die Verwendung von Chloroform vermeiden, um Lipide zu solubilisieren, da dieses Mittel karzinogen ist und es schwierig ist, es vollständig aus gelösten Lipiden zu entfernen; um die Fähigkeit zu verbessern, die Lipide zu solubilisieren und dies ohne Verwendung von Chloroform zu tun; um die Menge an Antigen und Immunmodulatorprotein zu verbessern, die in die Liposomen eingekapselt ist; um den pH zu optimieren, bei welchem die Einkapselung durchgeführt wurde, um Probleme von Lipidunlöslichkeit und Liposomenabbau zu minimieren, und die Verwendung der Zusammensetzung zu vereinfachen, indem sie zusammen mit nicht-eingekapseltem/n Antigen(en) und Immunmodulator(en) verabreicht werden.
  • Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und Cholesterylhemisuccinat (CHEMS) werden in einem molaren Verhältnis von 6:4 in einer Menge gelöst, die erforderlich ist, um die gewünschte Konzentration von 8 mg Lipid pro Dosis des Endprodukts herzustellen. Das Gemisch an Lipiden kann löslich gemacht werden, um pH-empfindliche Liposomen unter Verwendung von nur Methanol herzustellen. Im Gegensatz dazu wurden pH-empfindliche Liposomen zuvor aus DOPE und 1,2-Dioleoyl-sn-succinylglycerin (DOSG) hergestellt; einer Kombination von Lipiden, die Chloroform zur wirkungsvollen Solubilisierung erfordert. Die gewünschte Menge an gelöstem Lipid wird auf sterile Behälter transferiert und die Lösungsmittel unter einem Strom eines steril filtrierten Stickstoffgases entfernt, bis keine Spurenmenge übrig blieb. Lipide, die auf diese Weise hergestellt werden, werden bei –80°C aufbewahrt, bis sie rekonstitutiert wurden. Lipide bleiben bei dieser Temperatur 6 Monate lang stabil [Gregoriadis, Liposomes in Biological Systems, Hrsg. Gregoriadis & Allison, New York, Wiley, 25–96 (1980)]. Willkürliche Phiolen sollten auf aerobe und anaerobe Bakterien, Pilze, Mycoplasma, Pyrogene getestet werden, in Mäuse und Meerschweinchen für allgemeine Sicherheitstests und andere Sicherheitstests, die von der FDA verlangt werden, injiziert werden.
  • In einer besonderen Formulierung werden Stammphiolen, die ausreichend sind, um eine Vakzinendosis pro Phiole herzustellen, wie folgt hergestellt. Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und Cholesterylhemisuccinat (CHEMS) werden in einem molaren Verhältnis 6:4 gemischt, indem 487 mg DOPE und 213 mg CHEMS in 70 ml Methanol gelöst werden. 0,8 ml der Lösung werden dann auf sterile Injektionsphiolen transferiert, sodass jede Phiole die Menge an Lipid enthält, die erforderlich ist, um eine Formulierung von pH-empfindlichen Liposomen herzustellen, die 8,0 mg Liposom pro Vakzinendosis enthält. Das Lösungsmittel wird unter einem Strom von sterilfiltriertem Stickstoffgas entfernt, bis keine Spurenmengen übrig bleiben. Phiolen, die auf diese Weise hergestellt werden, sollen bei –80°C aufbewahrt werden, bis sie rekonstituiert werden. DOPE und CHEMS sind bekannte Verbindungen, die einfach von Anbietern von Chemikalien erhalten werden können, insbesondere Amanita Polar Lipids (Alabaster, Alabama).
  • pH-empfindliche Liposomen, die in der Stimulation von Immunreaktionen sogar noch wirkungsvoller sein können, können durch die Verwendung höherer Dosen an Lipiden bis zu 80 mg Lipid pro 0,4 ml Volumen Vakzine hergestellt werden, da die Menge an Protein, die in das Liposom eingekapselt werden kann, mit der Menge an Lipid zunimmt, das verwendet worden ist, um die Liposomen herzustellen, und da zelluläre und CD8+-T-Zellreaktionen bei Patienten häufiger sind, die auf Vakzinen immunisiert worden sind, die in Liposomen eingekapselt sind, die höhere Mengen an Lipiden enthalten. Die frühere Beziehung ist in Tabelle I veranschaulicht und letztere in Tabelle VI. Tabelle I fasst die Ergebnisse eines Versuches zusammen, in welchem die Menge von radioiodiertem GM-CSF, das in pH-empfindliche Liposomen eingekapselt werden konnte, die mit verschiedenen Mengen an Lipiden gemessen wurden, ge messen wurde. Die Liposomen wurden exakt wie oben beschrieben hergestellt, aber es wurden verschiedene Mengen an Lipiden wie in der Tabelle angegeben hergestellt. Die Menge an untersuchten Lipiden resultierte in pH-empfindlichen Liposomen, die 8 bis 80 mg Lipide pro 0,4 ml enthielt. Die Menge an radioiodiertem GM-CSF, das in die verschiedenen Formulierungen von pH-empfindlichen Liposomen eingekapselt werden konnte, wurde dann gemessen. Die Einkapselung wurde in allen Fällen wie nachstehend beschrieben unter Verwendung einer Standardmenge an radioiodiertem GM-CSF und eines Trägerproteins (40 mg von menschlichem Albumin) durchgeführt. Die Menge an Trägerprotein wurde ausgewählt, um mit jener von Protein in einer Standard-Vakzinendosis übereinzustimmen. Wie in Tabelle I dargestellt wurden nur 7,5% des hinzugefügten GM-CSF in pH-empfindliche Liposomen eingekapselt, die mit 8 mg Lipid hergestellt wurden, im Vergleich zu 89% derselben Dosis von GM-CSF, die in Liposomen eingekapselt wurden, die aus 80 mg Lipiden hergestellt wurden. Es können keine höheren Dosen von Lipiden verwendet werden, weil die Liposomen das gesamte des verfügbaren Volumens in der Lösung besetzen, die verwendet worden ist, um die Lipide zu resuspendieren und die Liposomen herzustellen. TABELLE I. WIRKUNG VON LIPIDDOSIS AUF DIE MENGE AN PROTEIN, DIE IN LIPOSOMEN EINGEKAPSELT WERDEN KANN
    Menge an verwen- detem Lipid(a) zur Herstellung von Li- posomen Menge an Protein(b), das zu Liposomen hinzugefügt wurde Menge an Protein(b), das in Liposomen eingekapselt ist % eingekapselt(c)
    8 mg 134.200 28.300 21%
    20 mg 169.400 64.800 37%
    40 mg 114.400 64.600 56%
    80 mg 152.300 135.400 89%
    a) mg von Protein pro 0,4 ml Lösung
    b) cpm von radioiodiertem GM-CSF
    c) % von hinzugefügtem radioiodiertem GM-CSF, das nach 3 Waschungen mit normaler Kochsalzlösung in Liposomen übrig bleibt
  • Verfahren zur Herstellung einer polyvalenten Melanomantigenvakzine
  • Ein beliebiges Antigen oder eine Kombination von Antigenen, von welchen erwünscht wird, dass sie eine Immunreaktion stimulieren, kann verwendet werden, um Vakzinen herzustellen, die in pH-empfindliche Liposomen eingekapselt sind. In einem bestimmten Beispiel dieser Erfindung ist das bevorzugte Antigen eine polyvalente Melanomantigenvakzine, die aus abgespaltenen Antigenen hergestellt wurde.
  • Die Zusammensetzung dieser Erfindung kann entworfen werden, um eine verstärkte Immunreaktion auszulösen, insbesondere eine CD8+-T-Zellreaktion gegen Melanomzellen, um Melanome zu behandeln oder zu verhindern. Fachleute wissen, dass eine solche Zusammensetzung aus Melanomantigenen hergestellt werden können, die unter Verwendung einer Reihe verschiedener Ansätze hergestellt werden. Diese umfassen die Verwendung eines einzelnen Melanomantigens oder mehrerer Antigene (wie z.B. die polyvalenten, abgespaltenen Antigenvakzinen, die hierin beschrie ben sind), die daher ein Teil der bevorzugten Zusammensetzung sind. Melanomantigene können von Melanomzellen abstammen, die aus dem kanzerösen Wachstum von Melanompatienten erhalten werden, und können frisch verwendet werden oder in Kultur beibehalten werden. Die American Type Culture Collection (Gaithersburg, MD) stellt zahlreiche verfügbare Melanomzelllinien bereit. Antigene können speziell erhalten werden, indem Zellen aufgebrochen werden oder indem Materialien verwendet werden, die in das Zellmedium abgespalten werden, oder können durch biochemische Verfahren aus Melanomzellextrakten gereinigt werden oder durch Gentechnik oder andere Technologien synthetisiert werden. Diese Verfahren sind fachbekannt. Mehr als ein(e) Zelllinie oder Antigen kann verwendet werden, um ein größeres Spektrum an Melanomantigenen und eine umfassendere CD8+- oder CTL-Reaktion zu erhalten. Tests zur Bestimmung, ob eine Einheit eine Melanomeinheit ist, sind fachbekannt.
  • Bevorzugte Markierungen können aus den bekannten Antigenen MAGE-1, MAGE-3, MART-1/Melan-A, Tyrosinase, MART-I, gp100 und/oder aus Antigenen ausgewählt werden, die durch frisches Melanomgewebe exprimiert werden, insbesondere jene Antigene mit einem ungefähren Molekulargewicht von etwa 36, 45, 59, 68, 79, 89, 95 und 110 Kilodalton („etwa” gibt wie hierin und anderswo verwendet einen Bereich an, der für einen Fachmann vernünftig scheint), und/oder aus Antigenen, die durch Melanomzellen in das umgebende Medium abgespalten werden.
  • Melanomvakzine
  • Im besonderen Beispiel für diese hierin beschriebene Erfindung wurde eine lösliche, teilweise gereinigte, polyvalente Melanomantigenvakzine aus dem Material hergestellt, das durch vier Linien von Melanomzellen in Kultur abgespalten wurde, die an langfristiges Wachstum in serumfreiem Medium angepasst waren (hinterlegt bei der ATCC, 12301 Parklaven Drive, Rockville, MD 20852, am 22. April 1993 unter den Nummern SD 1793–1797). Kurz gesagt, die Zellen aus SF-SKMel28, SF-M14, SF-M20 und SF-HM54 wurden bei 2 × 106 Zellen/ml in serumfreiem RPMI 1640 3 h lang bei 37°C inkubiert. Andere Melanomzelllinien, die dieselben melanomassoziierten Antigene exprimieren, können substituiert werden. Nach 3-stündiger Inkubation wurde das verbrauchte Kulturmedium aus jeder Linie gewonnen, bei 1.000 × g 15 min lang zentrifugiert, um Teilchenmaterial zu entfernen, durch Ultrafiltration konzentriert und gleiche Proteinmengen des konzentrierten abgespaltenen Materials aus den vier gepoolten Zelllinien gewonnen. Das nicht-ionische Detergens NP-40 wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5% zum gepoolten abgespaltenen Material hinzugegeben, das dann bei 100.000 g 90 min lang ultrazentrifugiert wurde, um unlösliches Material zu entfernen, gegen normale Kochsalzlösung dialysiert und durch Filtration durch einen 0,22-μm-Filter sterilisiert. Die Proteinkonzentration des Endprodukts wurde auf 0,2 mg/ml angepasst und in pyrogenfreie Glasphiolen abgegeben. Zur Verwendung wurde die Vakzine mit Alaun oder anderen Adjuvanzien gemischt, wie Z.B. IL-2-Liposomen, QS21 oder anderen, wie z.B. den hierin beschriebenen pH-empfindlichen IL-2-Liposomen. Die biochemischen und Antigeneigenschaften der Vakzine sind von Bystryn et al., J. Biol. Responses Modif. 5, 221–224 (1986), und Reynolds et al., Int. J. Cancer 72, 972–976 (1997), beschrieben worden.
  • Patienten und Immunisierungen: Neunundsechzig nacheinander registrierte Patienten (43 Männer und 26 Frauen zwischen 18 und 75 Jahren) mit chirurgisch herausgeschnittenem Melanom (American Joint Commission an Cancer (AJCC) Stadium III) wurden in die Studie aufgenommen, die am NYU Medical Center von 1992 bis 1995 durchgeführt wurde. Andere Kriterien für die Auswahl der Patienten waren: kein Beweis für distale metastatische Erkrankung, keine Krankengeschichte anderer Krebsarten oder anderer ernsthafter systemischer Erkrankungen, positive Hauttestreaktion auf Recall-Antigene oder Fähigkeit, auf Dinitrochlorbenzol (DNCB) sensibilisiert zu werden, keine andere Vorbehandlung von Melanom als Chirurgie oder lokale Radiotherapie. Alle Patienten unterzeichneten Einverständniserklärungen. Die Patienten wurden mit 20 oder 40 μg Vakzinenprotein immunisiert, das üblicherweise mit Alaun als Adjuvans gemischt wurde, das in vier gleiche Aliquoten geteilt wurde, die intradermal alle 3 Wochen viermal in jede Extremität verabreicht wurden, monatlich dreimal und danach in längeren Intervallen. Es wurden keine andere Therapie für Melanom oder Immunsuppressiva verabreicht, während Patienten Vakzinenbehand lung erhielten. Seren wurden vor der ersten Immunisierung und eine Woche lang nach 6–8 Immunisierungen gewonnen. Die Seren wurden bei –80°C aufbewahrt, bis sie verwendet wurden. Siehe Applebaum et al., J. Natl. Cancer Inst., im Druck (1998), für Details.
  • Herstellung von Antigenextrakten für Immun-Blotting: Es wurden zwei Chargen von Melanomantigenextrakten hergestellt, wovon jede aus gleichen Volumina von frischem chirurgisch herausgeschnittenem Tiergewebe stammte, das von zwei separaten Patienten erhalten wurde. Charge Nr. 1 wurde aus Leber-Metastasen hergestellt, die aus einem Patienten herausgeschnitten wurden, und aus Milzmetastasen aus dem zweiten Patienten; Charge Nr. 2 wurde aus Metastasen hergestellt, die aus der Brustwand bzw. dem Dickdarm zweier anderer Patienten herausgeschnitten wurden. Zur Herstellung von Tumorgewebsextrakten wurde das Melanomgewebe aus umgebendem normalen Gewebe getrennt, und nekrotisches Material wurde entfernt. Der Extrakt wurde so hergestellt, dass er in Zellmembranmaterial angereichert wurde, wodurch dieser wahrscheinlicher Tumorantigen enthält, das auf der externen Oberfläche der Zellen exprimiert wird, die wahrscheinlicher biologisch relevant sind. Um dies zu tun, wurde das Tumorgewebe in kleine Würfel geschnitten, homogenisiert und Kern- und andere Zelltrümmer durch drei zehnminütige Zentrifugationszyklen bei 1.000 g entfernt. Die Überstände wurden bei 105.000 g 1 h lang bei 4°C ultrazentrifugiert, die Pellets in Tris-EDTA-Puffer (pH 8,0) resuspendiert und erneut bei 105.000 g 20 min lang bei 4°C ultrazentrifugiert. Die resultierenden Pellets wurden in 6 mM Desoxycholsäure gelöst und bei –80°C aufbewahrt.
  • Ein normaler autologer Gewebsextrakt wurde auf ähnliche Weise aus gleichen Volumina von normaler nicht-involvierter Leber und Milz hergestellt, die vom Patienten erhalten wurde, der verwendet wurde, um Melanomantigenextrakt-Charge Nr. 1 herzustellen. Ein ähnliches Vefahren wurde verwendet, um Antigenextrakte aus einem menschlichen Kontrollparotismischtumor herzustellen. Normales Gewebe aus Patient Nr. 2 war nicht verfügbar. Die gesamte Proteinkonzentration in allen Chargen von Antigenen wurde unter Verwendung eines Bio-Rad-Sets (Bio-Rad Laborstories, Paris, Frankreich) gemessen und auf 240 μg/Gel normalisiert.
  • Test von vakzineninduzierten Melanomantikörpern: Antikörper gegen Melanom und die Identität von Antigenen, gegen welche sie ausgerichtet waren, wurden durch Immunblotting getestet. Antigenextrakte wurden mit Laemmli-Puffer [Nature 227, 680–85 (1970)] und 2-Mercaptoethanol gemischt, 5 min lang gesiedet, bei 6.400 g 2 min lang zentrifugiert, und 240 μg Extrakt/Gel wurden auf 8% SDS-PAGE laufen gelassen [Nature 227, 680–85 (1970)]. Proteine wurden auf PVDF-Membran (Immobilon-P, Millipore, Redford, MA) in 0,192 M Glycin, 0,025 M Tris, pH 8,3 ohne Methanol 3 h lang bei 30 v transferiert, in 5% Magermilch blockiert und 3-mal in 0,05% Tween-20 in PBS gewaschen. Die Membran wurde dann in gleiche Streifen geschnitten, die 10 μg Protein pro Streifen enthielten, und über Nacht in 1:50-Verdünnung von Patientenserum (nicht-adsorbiert) inkubiert. Die Streifen wurden 7-mal mit 0,05% Tween-20 in PBS gewaschen, 4 h lang in einer 1:100-Verdünnung von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Anti-Human-Antikörper (Fab'-Fragment, Sigma Co., St. Louis, MO) in 0,3% Tween 20 in PBS inkubiert, 7-mal mit 0,05% Tween in PBS gewaschen und mit einem Substrat inkubiert, das 0,01% Wasserstoffperoxid und 0,5 mg/ml 4-Chlor-1-naphthol enthielt. Vakzineninduzierte Antikörper wurden durch Banden nachgewiesen, die in Post-Vakzinenbehandlung vorhanden waren, aber in Grundlinienserum, das vom selben Patienten vor Vakzinenbehandlung erhalten wurde, fehlten oder in geringerer Dichte (50% oder größerer Rückgang) vorhanden waren [siehe Applebaum et al., J. Natl. Cancer Inst., im Druck (1998), für Details].
  • Identifikation von melanomassoziierten Antigenen, die bei Menschen immunogen sind und in vivo exprimiert werden. Durch die Verwendung des obigen Verfahrens wurden mehrere Antigene, die mit Melanom assoziiert sind, die sowohl bei Menschen immunogen sind als auch in vivo exprimiert werden, identifiziert. Diese Antigene hatten Molekulargewichte von etwa 36, 45, 59, 68, 79, 85, 89, 95 und 110 kD.
  • Dies wurde durch die Untersuchung der Fähigkeit der Vakzinenbehandlung, Antikörper gegen Melanomantigene zu stimulieren, die in vivo exprimiert wurden, durchgeführt. Das Muster und die Menge an Melanomantikörpern in Seren, die aus 69 Patienten mit chirurgisch herausgeschnittenem malignem Melanom von AJCC Stadium III vor Vakzinenbehandlung und eine Woche nach 6–8 Immunisierungen gewonnen wurden. Dasselbe Melanomantigenextrakt (Charge Nr. 1), aus Metastasen gepoolt, die aus zwei Patienten herausgeschnitten wurden, wurde für alle Tests verwendet. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt und in Tabelle II zusammengefasst. Vakzinenbehandlung induzierte eine neue Antikörperreaktion oder verstärkte eine zuvor bestehende Reaktion auf ein oder mehrere Antigene, die in chirurgisch herausgeschnittenen Melanomgeweben in 35 (51%) der Patienten exprimiert wurden. Die Antikörper wurden auf Antigene mit Molekulargewichten von etwa 45, 59, 68, 79, 89, 95 und/oder 110 kD ausgerichtet. Vakzineninduzierte Immunreaktionen wurden am häufigsten auf das p110 und das p68 ausgerichtet (bei 33% bzw. 25% der Patienten) und weniger häufig auf das p89 und p45 (bei 10% bzw. 15% der Patienten).
  • Die Spezifität der Antigene, die durch vakzineninduzierte Antikörper definiert wurde, wurde durch Messung ihrer Expression in Extrakten von chirurgisch herausgeschnittenem normalem Gewebe und Nicht-Melanom-Tumor unter Verwendung von Post-Vakzinen-Behandlungsseren mit großen Mengen an Antikörpern gegen die Targetantigene als Sonde untersucht. Die Seren, die verwendet wurden, um jedes Antigen zu identifizieren, sind in Tabelle III dargestellt. Die getesteten Gewebe umfassten normale autologe Gewebe, die von Stellen (Leber in einem Patienten, Milz in dem anderen), die an Metastasen angrenzen, die verwendet wurden, um Melanomantigenextrakt Charge Nr. 1 herzustellen, einem anderen Melanomantigenextrakt (Charge Nr. 2), das aus Metastasen hergestellt wurde, die aus zwei anderen Patienten herausgeschnitten wurden, und einem nicht-verwandten Tumor (einem Parotismischtumor) erhalten wurden. Alle Extrakte wurden auf identische Weise hergestellt und bei identischen Proteinkonzentration getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefasst. Keines der Melanomantigene, auf die durch diese Antikörper abgezielt wurde, wurde in autologem normalem Gewebe detektiert. Keines mit Ausnahme von p68 und p89 wurde in Extrakten des Parotistumors detektiert. Die Antigene wurden auf herkömmliche Weise in Melanom den auf herkömmliche Weise in Melanom exprimiert, da alle in einer zweiten Charge von Melanomantigenextrakt (Charge Nr. 2) detektiert wurden, der aus zwei weiteren Patienten hergestellt wurde.
  • In einem nachfolgenden Versuch wurde herausgefunden, dass die Immunisierung auf dieselbe Vakzine Antikörperreaktionen gegen zwei andere Antigene mit Molekulargewichten von 36 kD und 85 kd stimulierte. Die Antigenquelle in diesem Versuch war ein Membranextrakt, der aus frischem Melanomgewebe hergestellt wurde, das von einem eigenen Melanom des Patienten erhalten wurde. Diese Antigene sind für die Herstellung von Vakzine aus jenem Grund insbesondere wichtig, da sie Immunreaktionen gegen einen eigenen Tumor des Patienten induzieren können.
  • Die 36-, 45-, 59-, 68-, 79-, 85-, 89-, 95- und 110-kD-Antigene wurden unter Verwendung von vakzininduzierten Antikörpern als Sonden identifiziert. Die Quelle dieser Antikörper waren einzelne Patienten, die durch Code-Nummern identifiziert werden, die in Tabelle III dargestellt sind. (Die 36-kD- und 85-kD-Antigene wurden unter Verwendung von Serencodenummer 338 identifiziert.) Ein Fachmann erkannte, dass diese Antigene auch mit monoklonalen Antikörpern identifiziert werden können, die gegen das jeweilige Antigen gezüchtet werden.
    TABELLE II Herstellung von vakzineninduzierten Antikörpern, die mit Antigenen reagieren, die in frischem Melanomgewebe vorhanden sind
    Zahl (%) von Patienten mit Antikörperreaktion auf Melanomvakzinenimmunisierung (a) (n=69)
    Melanomantigen (kD) vakzineninduzierte Reaktionen (b) vakzinenverstärkte Reaktionen (c) beliebige Antikörperreaktion auf Immunisierung
    110 9(13%) 14(20%) 23(33%)
    95 10(15%) 5(7%) 15(22%)
    89 2(3%) 5(7%) 7(10%)
    79 9(13%) 2(3%) 11(16%)
    68 10(15%) 7(10%) 17(25%)
    59 9(13%) 6(9%) 15(22%)
    45 8(12%) 2(3%) 10(15%)
    Beliebiges Antigen 23(33%) 24(35%) 35(51%)
    (a) Durch Immuno-Blot-Analyse unter Verwendung einer Membranfraktion von frischem Melanomgewebe als Antigenquelle gemessen (b) Antikörperbande, die in Post- aber nicht Prä-Behandlungsserum im selben Patienten vorhanden ist (c) Dichte von Antikörperbande, die im Post- größer als im Prä-Behandlungsserum ist
    TABELLE III Gewebsverteilung von Melanomantigenendie, durch Antikörper definiert wurden, die durch Vakzinenimmunisierung induziert wurden
    Identifikations-Code von vakzinen-induziertem Antikörper Melanom-antigen (kD) Melanom-antigen Charge Nr. 1 (a) Melanom-antigen Charge Nr. 2 (b) Normales autologes Gewebe (c) nicht-verwandter Tumor (d)
    162 95 + +++ – NT
    68 89 ++ +++ – +
    64 79 ++ ++ – –
    68 68 +++ +++ – +
    108 59 ++ ++ – NT
    108 51 ++ +++ – –
    108 45 +++ +++ – –
    108 110 ++ +4+ –
    (a) Hergestellt aus metastatischen Knötchen, die aus der Leber und Milz von zwei verschiedenen Patienten erhalten wurden (b) Hergestellt aus metastatischen Knötchen, die aus der Brustwand und dem Darm von zwei verschiedenen Patienten erhalten wurden (c) Normales Gewebe, das aus autologer Leber und Milz von Patienten erhalten wurde, das für die Herstellung von Melanompool Nr. 1 verwendet wurde (d) Parotismischtumor
  • Quelle von Interleukin-2 (IL-2)
  • IL-2 kann aus einer im Handel erhältlichen Quelle wie von der Chyron Corporation bezogen werden.
  • Einkapselung von Vakzine und Immunmodulator in pH-empfindliche Liposomen
  • Zur Inkorporation von Antigenen, wie z.B. einer Vakzine, und Immunmodulatoren, wie z.B. IL-2, IL-12, IL-1, GM-CSF oder anderen Immunmodulatoren, in die Liposomen werden Phiolen oder andere Behälter, die getrocknete Lipide enthalten, auf Raumtemperatur aufgewärmt, die gewünschte Vakzinenmenge und IL-2 oder andere Immunmodulatoren werden zu jeder Phiole hinzugegeben und die Lösung rasch mit einem Wirbelapparat gemischt. Ein wichtiger Aspekt dieses Verfahrens, das sich von anderen Ansätzen zur Herstellung von pH-empfindlichen Liposomen unterscheidet, ist, dass der pH der Lösung auf 8,5–9,5 angepasst wird, da sich die Solubilisierung von Lipiden bei höherem pH verbessert, aber Liposomen abgebaut werden, wenn der pH über 10,0 liegt. Dies kann erreicht werden, indem als Verdünnungsmittel für den/die Immunmodulator(en) und Vakzine ein Puffer von geeignetem pH wie im nachstehenden Beispiel beschrieben verwendet wird.
  • Multilamellare Liposomen, die eingekapselte(s) Antigen(e) und Immunmodulator enthalten, werden dann gebildet, indem die Formulierung 3 Zyklen von Gefrieren/Auftauen/Beschallen unterworfen werden. Für jeden Zyklus wird der Behälter schnell in flüssigem Stickstoff gefroren, langsam auf 27°C aufgetaut, gefolgt von 30 s Beschallung (Sonic Needle Sonicator, Sonic Needle Corp., Farmingdale, NY). Die Vakzine kann unmittelbar vor ihrer Verwendung gemeinsam mit einem Immunmodulator in Liposomen inkorporiert werden, um den Verlust an Vakzine und Immunmodulator aufgrund des Entweichens von Liposomen während der langen Aufbewahrung zu minimieren. Zusätzlich dazu können die/der liposomeneingekapselte Vakzine und Immunmodulator ohne Entfernung von Antigenen oder Immunmodulator, die nicht in die Liposomen eingekapselt waren, aus der Zusammensetzung verwendet werden, da dies ein einfacheres und rascheres Verfahren ist und da die Gesamtmenge an Vakzine, Immunmodulator(en) und Liposomenlipid einfacher und genauer kontrolliert werden kann. Alternativ dazu können Vakzine und Immunmodulator zuvor eingepackt werden und über längere Zeiträume vor Verwendung gelagert werden. Dies kann die Menge an Vakzine und Cytokin, die innerhalb gegenwärtig ist, im Vergleich zu außerhalb der Liposomen reduzieren. Jedoch kann der resultierende partielle Verlust an Aktivität durch die bequeme Verwendung des zuvor abgepackten Produkts ausgeglichen werden.
  • In einer besonderen Formulierung, die eine polyvalente abgespaltene Melanomvakzine und IL-2 verwendet, werden Phiolen, die 8 bis 80,0 mg von getrockneten Lipiden enthalten, auf Raumtemperatur aufgewärmt. Zu jeder Phiole werden 0,2 ml Vakzine (200 μg/ml), die auf pH 8,5–9,0 angepasst wurde, und 0,2 ml von 107 U/ml von menschlichem rIL-2 (Proleukin, Chiron Corp., Emeryville, Kalifornien) in steriler Kochsalzlösung, die auf pH 8,5–9,0 angepasst wurde, hinzugefügt. Der gewünschte pH kann durch Verdünnung der Vakzine oder des Immunmodulators mit einem gleichen Volumen eines Puffers erhalten werden, der aus 300 mM NaCl und 40 mM HEPES-Puffer, pH 9,0, besteht. Die Lösung wird rasch mit einem Wirbelapparat gemischt. Multilamellare Liposomen werden gebildet, indem die Formulierung 3 Zyklen von Gefrieren/Auftauen/Beschallen unterworfen wird. Für jeden Zyklus werden die Phiolen in flüssigem Stickstoff eingetaucht und rasch gefroren, langsam bei 27°C aufgetaut, gefolgt von 30 s Badbeschallung (70% Leistungsstufe unter Verwendung eines Sonic Needle Sonicators, Sonic Needle Corp., Farmingdale, NY). Dieses Verfahren resultiert in einer Endformulierung von pH-empfindlichen Liposomen, die 1 Dosis Vakzine pro Phiole enthält, wobei jede Dosis aus 40 μg Vakzine, 2 Millionen U von IL-2 und 8,0 bis 80,0 mg pro 0,4-ml-Vakzinendosis besteht.
  • In einer besonderen Formulierung unter Verwendung einer polyvalenten Melanomvakzine und GM-CSF werden Phiolen, die 8,0 bis 80,0 mg von getrockneten Lipiden enthalten, auf 27°C erwärmt, und zu jeder werden 0,2 ml von Vakzine (200 μg/ml) und 0,2 ml von einer der drei verschiedenen Konzentrationen von GM-CSF (Lucien, Immune, Seattle, Washington) (0,0125 mg/ml, 0,125 mg/ml oder 1,25 mg/ml) hinzugefügt. Alle Lösungen werden unter Verwendung des obigen Puffers auf einen pH 8,5–9 angepasst. Die Lösungen werden rasch mit einem Vortex vermischt, und multilamellare Liposomen werden durch 3 Zyklen von Gefrieren/Auftauen/Beschallen gebildet. Jede Phiole von rekonstituierter Vakzine enthält 1 Vakzinendosis. Jede Dosis besteht aus 40 μg Vakzine und entweder 2,5, 25 oder 250 μg von GM-CSF und 8,0 bis 80,0 mg Lipid in 0,4 ml Vakzine. GM-CSF kann in 500-mg-Phiolen erhalten werden, zu welchen 0,5 ml Verdünnungsmittel (vorzugsweise bakteriostatisches Wasser zur Injektion von USP 9% Benzylalkohol) hinzugegeben wird, um eine Konzentration von 1 mg/ml zu ergeben.
  • Stimulation von Immunreaktionen auf Vakzinenantigene:
  • Eine Vakzine, die gemeinsam mit (einem) Immunmodulator(en) in pH-empfindliche Liposomen eingekapselt ist, kann verwendet werden, um Immunreaktionen zu stimulieren, einschließlich DTH und antigenspezifische CD8+-T-Zellreaktionen, durch Immunisierung von Menschen oder Tieren gegen die Formulierung. Immunisierungen können durchgeführt werden, indem die Zusammensetzung systemisch entweder intradermal, subkutan, intramuskulär, intravenös, intranasal oder durch topische Anwendung verabreicht werden.
  • In einem besonderen Immunisierungsverfahren wurde ein polyvalentes Melanomantigen, eingekapselt in pH-empfindliche Liposomen, gemeinsam mit IL-2 intradermal verabreicht. Die gesamte Vakzinendosis wurde in gleiche Teile geteilt, und jeder Teil wurde in eine der 4 Extremitäten verabreicht, um die Anzahl an stimulierten Lymphdrüsen zu maximieren. Bei Patienten, bei denen regionale Knötchen seziert wurden, wurden keine Immunisierungen in diese Extremität gegeben, um die Möglichkeit einer Infektion zu minimieren und da keine regionale Knötchen gegenwärtig waren, die in dieser Extremität stimuliert werden sollten. Stattdessen wurde eine doppelte Dosis in die kontralaterale Extremität verabreicht. Immunisierungen wurden anfänglich alle 2 bis 3 Wochen 4 Zyklen lang verabreicht. Booster-Dosen wurden dann monatlich 2 Jahre lang verabreicht und in anderen Fällen monatlich 3 Zyklen lang, alle 3 Monate 2 Zyklen lang und dann alle 6 Monate über einen Zeitraum von 5 Jahren.
  • Zur Bestimmung der Wirksamkeit einer Vakzinenzusammensetzung können Tests verwendet werden, um die Fähigkeit der Vakzine zu bestimmen, Antikörper und Zellimmunreaktionen zu stimulieren.
  • Antikörperreaktionen können durch eine Vielzahl an Tests gemessen werden, die Immun-Blotting, ELISA, Immunpräzipitation und SDS-PAGE-Analyse, komplementvermittelte Zytotoxizität und andere umfassen. Verfahren zur Durchführung dieser Tests sind Fachleuten bekannt. Ein Beispiel für die Messung von Antikörperreaktionen durch Immun-Blotting ist in 3 bereitgestellt. Zellreaktionen können auch durch eine Vielzahl an Tests gemessen werden, die Hyperempfindlichkeitstests vom verzögerten Typ, Proliferationstests, zytolytische Tests und Cytokinfreisetzungstests umfassen. CD8+-T-Zellreaktionen können durch In-vitro-Stimulations-Tests gefolgt von Grenzverdünnungstest gemessen werden oder vorzugsweise durch einen empfindlichen und herkömmlichen neuen Filterspottest, der nachstehend beschrieben und Teil dieser Erfindung ist.
  • Test von Hyperempfindlichkeits-Reaktionen vom verzögerten Typ (DTH-Reaktionen)
  • DTH-Reaktionen werden durch Injektion von 10 μg Vakzine intradermal in die Hohlhandoberfläche eines Unterarms gemessen. Die Vakzinenformulierung, die verwendet wurde, enthält keine Adjuvanzien, Liposomen oder Immunmodulatoren. Der größte Durchmesser der Induration wird 24 Stunden später gemessen. Es gibt normalerweise keine Reaktion bei nicht-vakzinenbehandelten Patienten. Induration von 5 mm oder größer wird als positive Reaktion erachtet. Vakzineninduzierte DTH-Reaktionen werden durch Subtraktion von Grundlinieninduration von der vorliegenden Post-Vakzinenimmunisierung berechnet. Vakzineninduzierte Reaktionen von 15 mm oder mehr werden als stark eingestuft und jene von 25 mm oder mehr als sehr stark.
  • Test von vakzineninduzierten CD8+-T-Zellreaktionen:
  • In einem spezifischen Beispiel für den Filter-Spot-Test werden die Effektorzellen, die FicoII-Hypaque-isolierte mononukleare periphere Blutlymphozyten sind (die Blutzellpopulation, die CD8+-T-Zellen umfasst), die frisch, gefroren und aufgetaut sein können, in RPMI-1640-Kulturmedium resuspendiert, das mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt ist, und durch Adhäsion an Kunststoff an Monozyten abgereichert. Eine halbe Million oder mehr Lymphozyten werden dann zu jedem Well von 96-Well-Mikrotiterplatten hinzugegeben, wobei der Boden jedes Wells mit einer PVDF-Membran bedeckt ist. Solche PVDF-Membranfilterplatten können im Handel bezogen werden (Millipore, Redford, MA). Die PVDF-Membran wird zuvor mit monoklonalem Antikörper gegen menschliches IFN-Gamma (Biosource International, Camarillo, CA), einem Cytokin, das durch aktivierte CD8+-T-Zellen sekretiert wird, beschichtet. Monoklonale Antikörper gegen andere Cytokine, die durch antigenaktivierte CD8+-T-Zellen sekretiert werden, können durch IFN-gamma-Antikörper substituiert werden. Die Platten wurden 12.000 bis 20.000 (vorzugsweise 15.000) Targetzellen/Well vorgesät, und wenn gewünscht wurde Targetpeptid bei 10–20 nM hinzugefügt, sodass die Targetzellen es aufnehmen und präsentieren (Lösung des Targetpeptids in DMSO und Verdünnung mit Medium stellt bessere Ergebnisse bereit). Die Targetzellen können auf herkömmliche Weise mit 10–20 nM Targetpeptid zu jedem Zeitpunkt vor Hinzufügung von Effektorzellen pulsiert werden. Es wird jedoch bevorzugt, das Peptid kurz vor der Hinzufügung der Effektorzellen hinzuzufügen und ihm zu ermöglichen, für die Dauer des Tests in den Wells zu bleiben. Targetzellen in diesem Beispiel sind eine HLA-A2.1-positive Variante von SFM20, eine der Melanomzelllinien, die verwendet wird, um die oben beschriebene Vakzine herzustellen. Monoklonaler Antikörper IVAI2 (gegen menschliche Klasse-II-Antigene HLA-DR DP, DQ) wird bei 30 μg/ml nach Hinzufügung von Targetzellen und vor Hinzufügung der Effektorzellen zu allen Wells hinzugegeben, um Melanomtargets davon abzuhalten, Klasse-II-Antigene aufzuweisen. Der Phänotyp und die HLA-Restriktion von reagierenden Zellen wurde durch Hinzufügung von 30 μg/ml der Antikörper Anti-CD4 (OKT4), Anti- CD8 (OKT8), Anti-CD56 oder Anti-HLA-Klasse-I (W6/32) (PharMingen, San Diego, CA) zu einigen der Wells bestimmt. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der blockierenden Antikörper erfolgt durch ihre Reinigung in Dialyseschläuchen, um konzentrierte, nicht-denaturierte Antikörper, nicht-kontaminiert mit Reinigungsmitteln, bereitzustellen. Tests werden vorzugsweise doppelt ausgeführt. Nach 48 h Inkubation bei 37°C und 5% CO2 werden die Platten mit PBS-Tween20 gewaschen, über Nacht mit Ziegen-Anti-IFN-gamma (R & D; Minneapolis, MN) und dann mit biotyniliertem Kaninchen-Anti-Ziegen-Ig (Sigma, St. Louis, MO) 2 h lang, gefolgt von alkakischer Extravidin-Phosphatase (Sigma) 1 h lang inkubiert. Punkte, die individuelle T-Zellen repräsentieren, die durch Antigen stimuliert worden sind und IFN-gamma freisetzen, werden durch BCIP/NBT (KPL, Gaithersburg, MD) sichtbar gemacht und auf einem Präpariermikroskop gezählt. Andere Verfahren zur Visualisierung von sekretiertem Cytokin können substituiert werden. Identifikation von reagierenden Zellen, wie CD8+, und die HLA-Restriktion von Reaktionen können wie folgt oder wie beschrieben bestimmt werden [Van Der Brugge et al., Eur. J. Immunol. 24, 3038 (1994), Kawasaki et al., J. Exp. Meth. 180, 347, 59, 60 (1994)]. Die Zahl der CD8+-T-Zellen wird als Zahl der IFN-gamma-sekretierenden Zellen in Wells ohne Antikörper minus der Zahl an IFN-gamma-sekretierenden Zellen in Wells mit Anti-CD8-Antikörpern berechnet. Ergebnisse sind als Zahl der antigenreaktiven, lymphokinsekretierenden Zellen/500.000 periphere Blutlymphozyten (PBL) ausgedrückt [King et al., J. Immunol. Meth. 132, 37–43 (1990)]. Die Zahl der antigenspezifischen CD8+-T-Zellen wird durch Subtraktion der Zahl der CD8+-T-Zellen, die auf Targetzellen reagieren, die mit einem Kostroll-CD8-Peptidepitop pulsiert werden, das durch dasselbe Klasse-I-HLA-Molekül wie das Testpeptid präsentiert wurde, aber von einem nicht-verwandten Antigen stammt, von der Zahl an CD8+-T-Zellen, die auf das Testantigen reagieren, berechnet. Der Test kann als positiv erachtet werden, wenn es fünf oder mehr antigenspezifische CD8+-T-Zellen pro 500.000 PBL gibt. Es ist ein Vorteil dieses Tests, das er empfindlich genug ist, um weniger als 5 CD8+-T-Zellen pro 500.000 PBL zu detektieren. Die Zahl an vakzineninduzierten, antigenspezifischen CD8+-T-Zellen wird durch Subtraktion der Zahl an antigenspezifischen CD8-T-Zellen, die an der Grundlinie vor Vakzinenbehandlung vorliegen, von jenen, die nach Immunisierung auf die Vakzine gegenwärtig sind, berechnet. Details für dieses Verfahren sind in Reynolds et al., Int. J. Cancer, Jänner 1998, zu finden.
  • Spezifische Melanompeptide, die in diesem Beispiel verwendet werden, sind HLA-A2-restringiertes CD8-Epitop auf den melanomassoziierten Antigenen MAGE-3 (FLWGPRALV) (Seq.-ID Nr. 1), MART-I (AAGIGILTV) (Seq.-ID Nr. 2), Tyrosinase (YMNGTMSQV) (Seq.-ID Nr. 3) und gp-100 (YLKKIKNSL) (Seq.-ID Nr. 4) und als Kontrolle auf (YLKKIKNSL) ein A2-restringiertes CD8-Epitop auf CSP, ein Oberflächenprotein von Falciparum malaria. Diese Peptide werden vom Biopolymers Laboratory (Harvard Medical School, Cambridge, Mass.) erhalten. Die Fähigkeit dieses Tests, eine vakzineninduzierte CD8+-T-Zellreaktion auf ein Peptid des Melanomantigens MAGE-3 zu detektieren und zu quantifizieren, ist in 1 dargestellt. Nach 4 Vakzinenimmunisierungen gibt es einen starken Anstieg der Zahl an T-Zellen, die auf MAGE-3-Peptid-pulsierte HLA-A2+-Targetzellen reagieren. Die T-Zellen sind CD8+, da die Reaktivität durch Antikörper gegen CD8, nicht gedoch gegen Anti-CD4 aufgehoben ist; Klasse-I-HLA-restringiert, da die Reaktivität durch Antikörper gegen HLA-Klasse-I aufgehoben wird, insbesondere auf MAGE-3 ausgerichtet, da es keine Reaktivität auf dieselben Targets gibt, die mit einem Kontroll-HLA-A2-restringiertem Peptid pulsiert werden, das von CD8+-Zellen auf einem Kontrollantigen (dem Malariaprotein CSP) erkannt werden, und vakzineninduziert sind, da Reaktivität vor Vakzinenbehandlung fehlt.
  • Der Test ist reproduzierbar. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, als dieselbe Probe an Blutlymphozyten zu zwei Zeitpunkten bei 3 Patienten (siehe Tabelle IV) getestet wurde. TABELLE IV REPRODUZIERBARKEIT VON FILTER-SPOT-TEST FÜR PEPTID SPEZIFISCHE CD8+-T-ZELLEN IN PERIPHEREM BLUT
    PATIENT ZAHL AN PEPTID-SPEZIFISCHEN CD8+-T-ZELLEN1
    Test 1 Test 2
    Nr. 4052 36±1,3 35,3±2,10
    Nr. 4203 19,3 ± 0,80 20,4 ± 1,10
    Nr. 4283 11,6 ± 0,00 13,6 ± 0,53
    • 1 Zahl an CD8+-T-Zellen/500.000 periphere Blutlymphozyten (± S.E.) nach der 4. Immunisierung
    • 2 CD8+-T-Zellen, die auf Melan-A/MART-1(27.35) reagieren
    • 3 CD8+-T-Zellen, die auf MAGE-3(271.278) reagieren
  • Herstellung von Targetzellen für Filter-Spot-Test von CD8+-T-Zellreaktion
  • Hinsichtlich der Targetzellen, die im oben beschriebenen Filter-Spot-Test verwendet werden, kann eine beliebige Zelle verwendet werden, die ein Targetantigen trägt, nicht notwendigerweise eine antigen-präsentierende Zelle. Eine antigenpräsentierende Zelle, die ein ausgewähltes Target-Antigen präsentiert und die zusätzlich dazu eine spezifische Form von Klasse-I-HLA-Allel exprimiert, ist bevorzugt und kann durch Isolation oder durch Gentechnik erhalten werden, zum Beispiel wie gleich nachstehend beschrieben. Es gibt verschiedene Typen, d.h. Allele, von Klasse-I-HLA-Molekülen. A2 ist das Allel, das für dieses Beispiel verwendet wurde, da es jenes ist, das am häufigsten durch Personen exprimiert wird, die ein hohes Risiko aufweisen, Melanom zu entwickeln. Um CD8+-T-Zellen in Personen verschiedener Klasse-I-HLA-Phänotypen zu messen, müssen Targetzellen verwendet werden, die diese Allele exprimieren. Die SFM20-Targetzelllinie kann im Test verwendet werden, weil sie ein Melanomantigen aus der oben beschriebenen Vakzine exprimiert. SFM20 ist A2-negativ, aber die Variante, die in diesem Beispiel verwendet wird, ist durch bekannte Verfahren mit dem menschlichen HLA-A2.1-Gen oder als Kontrolle mit dem murinen Db-Gen transfiziert worden. Die Zellen, die als Targetzellen im CD8-T-Zellreaktionstest oben verwendet wurden, wurden wie folgt hergestellt: Ein genomisches 5~ 1 kb HLA-A2.1-Fragment, das durch HindIII-Verdau von PuC-Plasmid erhalten wurde, wird in die HindIII-Stelle eines ph~-Apr-neo-Vektors kloniert. Der resultierende Vektor wird mit PvuI linearisiert und in SFM20-Zellen unter Verwendung eines Lipofectin-Reagens (Gibco, Gaithersburg, MD) nach den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Resistente G-41-8-Kolonien werden in Gegenwart von 1 mg/ml G-418 ausgewählt und auf HLA-A2-Expression durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung mit BB7.2-Antikörpern gescreent. Vorbehandlung dieser Targetzellen mit IFN-gamma zwei Tage lang vor Verwendung zur Maximierung von HLA-Molekül-Expression stellt bessere Ergebnisse bereit.
  • Targetzellen werden in der log-Phase geerntet, auf Ausmaß an HLA-Expression durch FACS-Analyse getestet, mit 4.000 Rad bestrahlt und in 10% DMS in fötalem Rinderserum bei 106 Zellen/Phiole in flüssigem Stickstoff gefroren (diese Behandlung stellt höchst konsistente Ergebnisse bereit, da dieselbe Targetzellformulierung verwendet werden kann).
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Verwendung von pH-empfindlichen Liposomenzusammensetzungen
  • a. Verwendung bei Mäusen
  • Eine Studie an Mäusen wurde unter Verwendung einer polyvalenten murinen B16-Melanomvakzine durchgeführt, die gemeinsam mit IL-2 (Gershman et al., Vaccine Res. 3, 83–92 (1994)] in pH-empfindliche Liposomen eingekapselt wurde. Die Melanomvakzine, die für die diese Studien verwendet wurde, wurde aus beschallten Zellen hergestellt, anstatt aus abgespaltenem Material, das zur Formulierung der menschlichen Vakzine verwendet wird.
  • Gruppen von 10 C57B1/6-Mäusen wurden auf Vakzine immunisiert, die in verschiedenen Dosisausmaßen von pH-empfindlichen Liposomen eingekapselt wurden (0,2 bis 18,3 mg Gesamtlipid/Immunisierungen) gemeinsam mit oder ohne menschlichem/s IL-2. Immunisierungen wurden wöchentlich viermal subkutan verabreicht. Als Kontrollen wurden ähnliche Gruppen an Mäusen gegen pH-empfindliche Liposomen immunisiert, die IL-2 enthielten aber keine Vakzine, oder nur gegen Kochsalzlösung. Es gab keine systemische Toxizität wie durch Gewichtsverlust oder Tod beurteilt wurde. Lokale Toxizität war minimal, bestehend aus kleinen lokalen Granulomen, die bei etwa 40% der Mäuse keine Geschwüre bildeten. Vakzineninduzierte tumorschützende Immunität war bei Mäusen am höchsten, die auf Vakzine immunisiert wurden, die gemeinsam mit IL-2 in pH-empfindliche Liposomen eingekapselt war (siehe 1 und Tabelle V). Dies war ein Ergebnis der Kombination von IL-2 und pH-empfindlichen Liposomen, da vakzineninduzierte schützende Immunität in dieser Gruppe höher war als bei Mäusen, die mit Vakzine immunisiert wurden, die in pH-empfindliche Liposomen eingekapselt waren, denen IL-2 fehlt. Zellreaktion (gemessen durch DTH-Reaktionen auf Hauttests zu Melanomzellen) war auch in der Gruppe am höchsten, die Vakzine + IL-2, eingekapselt in pH-empfindliche Liposomen, erhielt. Die pH-empfindlichen Liposomen potenzierten tumorschützende Immunität in allen studierten Dosen. TABELLE V WIRKUNG VON pH-EMPFINDLICHEN LIPOSOMEN AUF DIE IMMUNOGENITÄT EINER MURINEN B16-MELANOMVAKZINE
    MELANOMVAKZINE (a) LIPOSOMENe IL-2 ANTIKÖRPERREAKTION (b) ZELLREAKTION (c) ÜBERLEBEN nach 10 Wochen (d)
    150 μg pH-empfindlich 104 U 41,3 ± 11,2% 0,089 ± 0,021 80%
    150 μg herkömmlich 104 U 35,9 ± 7,2% 0,063 ± 0,020 50%
    0 pH-empfindlich 104 U 7,1 ± 5,8% 0,054 ± 0,030 30%
    0 keine keine 0 ± 6,0% 0,062 ± 0,019 20%
    • a) 10 Mäuse/Gruppe, wöchentlich 4-mal immunisiert
    • b) gemessen durch komplement-vermittelte Zytotoxizität 2 Wochen nach 4 Immunisierungen
    • c) gemessen durch DTH-Reaktion auf Melanomzellen 2 Wochen nach der 4. Immunisierung
    • d)% lebender Mäuse 10 Wochen nach Provokation mit einer tödlichen Zahl an murinen B16-Melanomzellen
    • e) 3,66 mg pro Vakzinendosis
  • b. Verwendung bei Menschen
  • Das folgende klinische Verfahren wurde durchgeführt, um die Fähigkeit einer Melanomvakzine zu untersuchen, die in pH-empfindliche Liposomen eingekapselt ist, zelluläre (DTH) und CD8+-T-Zellreaktionen zu stimulieren, um die Wirkung der Lipiddo sis, die verwendet wurde, um die Liposomen herzustellen, auf die Fähigkeit von Vakzine zu untersuchen, diese Reaktionen zu induzieren, und um die Wirksamkeit von pH-empfindlichen im Gegensatz zu herkömmlichen (nicht-pH-empfindlichen Liposomen) in der Induktion dieser Reaktionen zu vergleichen.
  • Siebzehn Patienten mit chirurgisch herausgeschnittenem malignem Melanom vom Krebsstadium IIB oder III nach der „American Joint Commission an Cancer" wurden willkürlich einer Behandlung mit einer Standarddosis der oben beschriebenen polyvalenten abgespaltenen Melanomvakzine unterworfen, die gemeinsam mit einer Standarddosis von IL-2 (10.000 internationale Einheiten/Vakzinendosis) in eine von 3 verschiedenen Liposomenformulierungen eingekapselt war. Zwei der Formulierungen waren von pH-empfindlichen Liposomen, die entweder 0,4 mg oder 8 mg Lipide pro Vakzinendosis enthielten, wobei die dritte Formulierung herkömmliche Liposomen (nicht pH-empfindlich) waren, die 8 mg Lipide pro Dosis enthielten. Alle Patienten wurden mit derselben Vakzinendosis und IL-2 behandelt. Die IL-2-Dosis, die verwendet wurde, war weniger als optimal, wobei eine wirksamere Dosis im Bereich von 2 Millionen Einheiten/Vakzinendosis liegt.
  • Die Fähigkeit der verschiedenen Formen von Liposomen, Zellimmunreaktionen zu stimulieren, wurde durch die Messung von DTH-Hauttestreaktionen auf die Vakzine und CD8+-T-Zellreaktion auf melanomassoziierte Peptide vor Vakzinenbehandlung und nach 4 Immunisierungen verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefasst. TABELLE VI. WIRKUNG VON VERSCHIEDENEN FORMEN VON LIPOSOMEN AUF DIE FÄHIGKEIT EINER POLYVALENTEN MELANOMVAKZINE ZUR STIMULATION VON ZELLIMMUNREAKTIONEN
    Liposomenformulierung Dosis(a) Lipid Anzahl PTS % von PTS mit DTH(c) Vakzineninduzierte CD8+-T-Zellreaktion(d)
    herkömmlich 8,0 mg 6 17% in 0 von 1 pt
    pH-empfindlich 0,04 mg 5 20% in 0 bis 1 pts
    pH-empfindlich 8,0 mg 6 66% in 2 von 3 pts
    • a) Lipiddosis, die verwendet wird, um Liposom/pro Vakzinendosis herzustellen
    • b) nach 4 Vakzinenimmunisierungen
    • c) vakzineninduzierte DTH-Reaktion 25 mm oder größer als die Grundlinienmessung im selben Patienten
    • d) Zahl an HLA-A2-positiven Patienten mit vakzinen induzierter peptidspezifischer CD8+-T-Zellreaktion, die auf A2-restringierte Peptide auf den melanomassoziierten Antigenen MART-1 oder Tyrosinase ausgerichtet ist.
  • Vakzinenbehandlung stimulierte sehr starke DTH-Reaktionen (25 mm oder größeren Anstieg der Induration über Grundlinienmessung im selben Patienten) in 4 (66%) von 6 pts, die gegen Vakzine + IL-2 in Liposomen immunisiert wurden, die aus einer hohen Dosis Lipid (8 mg Lipid/Dosis Vakzine) hergestellt wird, verglichen mit nur 20% der Patienten, die auf ähnliche Weise auf dieselbe Vakzinendosis und Dosis an IL-2, eingekapselt in pH-empfindliche Liposomen, die aus einer geringen Lipiddosis hergestellt wurden (0,4 mg Lipid/Vakzinendosis), immunisiert werden. Zusätzlich dazu waren starke DTH-Reaktionen bei Patienten weit häufiger, die auf Vakzine in pH-empfindlichen Liposomen immunisiert wurden, als bei jenen, die auf identische Weise auf Vakzine immunisiert wurden, die in herkömmliche Liposomen eingekapselt war, die aus einer identischen Dosis Lipid (8 mg Lipid/Vakzinendosis) hergestellt wurde.
  • Die Zahl an CD8+-T-Zellen in peripherem Blut, die spezifisch auf HLA-A2-restringierte CD8-Peptide auf den Melanomantigenen Tyrosinase und MART-1 reagierte, wurde vor Vakzinenbehandlung und nach vier Immunisierungen der fünf Patienten in dieser Studie, die HLA-A2-positiv und für diese Analyse geeignet waren, gemessen. CD8+-T-Zellen, die für diese Antigene spezifisch sind, waren selten vor Vakzinenbehandlung gegenwärtig. Nach Vakzinenbehandlung wurde das Ausmaß an CD8+-T-Zellen zu dem einen oder anderen dieser zwei Antigene in 2 von 3 HLA-A2-positiven Patienten erhöht, die auf Vakzine in pH-empfindlichen Liposomen immunisiert wurden, die mit einer hohen Dosis an Lipiden hergestellt wurden. Hingegen wurde keine CD8+-T-Zellreaktion auf diese Antigene in dem einen HLA-A2-positiven Melanompatienten induziert, der ähnlich auf Vakzine behandelt wurde, die in herkömmliche Lipide eingekapselt war, oder im anderen HLA-A1-positiven Patienten, der auf Vakzine in pH-empfindlichen Liposomen immunisiert wurde, die aus einer geringen Dosis an Lipiden hergestellt war. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Einkapselung von Vakzine + IL-2 in pH-empfindliche Liposomen in der Stimulation von zellulären (DTH- und CD8+-T-Zell-) Reaktionen auf die Vakzine resultieren können, dass pH-empfindliche Liposomen diese Reaktionen wirkungsvoller als herkömmliche Liposomen stimulieren und dass die pH-empfindlichen Liposomen wirkungsvoller sind, wenn sie aus höheren Dosen an Lipiden hergestellt werden. Das verwendete Verfahren zur Herstellung der herkömmlichen Liposomen ist veröffentlicht worden (Gershmann et al.).
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00540001
  • Figure 00550001

Claims (6)

  1. Vakzinenzusammensetzung, umfassend: zumindest ein Krebsantigen, das aus von einer Krebszelle abgespaltenen Antigenen hergestellt ist; zumindest einen aus IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12 und GM-CSF ausgewählten Immunmodulator; und einen Träger, bei dem es sich um ein chloroformfreies, pH-empfindliches Liposom handelt, das Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und Cholesterylhemisuccinat (CHEMS) umfasst, die bei einem pH von 8,5–9,5 gebildet werden, um das Krebsantigen und den Immunmodulator zu verkapseln und sie bei Verabreichung an einen Menschen zusammen zu Immunzellen zuzuführen, sodass das Antigen eine CD8+-T-Zell-Reaktion induziert.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Liposomen mit der höchstmöglichen Lipidkonzentration gebildet werden, um die Menge an Antigenen und Immunmodulatoren, die verkapselt werden kann, zu maximieren.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Gemisch aus Antigen(en), Immunmodulator(en) und Träger verwendet wird, ohne dass das/die Antigen(e) und der/die Immunmodulator(en) entfernt werden, die nicht gebunden oder in den Träger inkorporiert wurden.
  4. Vakzinenzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers.
  5. Verwendung einer Vakzinenzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 bei der Herstellung eines Medikaments zur Induktion einer Immunantwort gegen einen Krebs und so zur Behandlung oder Vorbeugung des Krebses.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, worin das Medikament zur Induktion einer Immunantwort auf ein Melanom und so zur Behandlung oder Vorbeugung des Melanoms dient.
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