DE69838757T2

DE69838757T2 - Auf gangliosiden basierende, immunstimulierende komplexe und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69838757T2
Application number: DE69838757T
Authority: DE
Inventors: John Cooper Bullengarook COX; Bengt John Ronnberg; Sigrid Elisabet Sjolander
Original assignee: CSL Ltd
Current assignee: CSL Ltd
Priority date: 1997-06-12
Filing date: 1998-06-12
Publication date: 2008-10-30
Anticipated expiration: 2018-06-13
Also published as: ZA985140B; US6814981B1; JP2002504101A; HK1026855A1; EP1019087A1; EP1019087A4; EP1019087B1; AUPO732997A0; NZ501641A; CA2293439A1; WO1998056420A1; DE69838757D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft generell einen immunstimulierenden Komplex, der ein oder mehrere Ganglioside umfasst, und insbesondere einen immunstimulierenden Komplex, der mindestens eines der Ganglioside GMS, GD2, GD3 oder GT3 umfasst. Die folgende Erfindung ist unter anderem als prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel bei der Behandlung von Tumoren und insbesondere Melanomen verwendbar.
Die bibliographischen Details der in dieser Schrift durch den Autor bezeichneten Veröffentlichungen sind am Ende der Beschreibung gesammelt angegeben.
Das Auftreten maligner Melanome hat in den vergangenen zehn Jahren rasch zugenommen, wobei die Überlebensrate von Patienten, für die die Diagnose eines Melanoms gestellt wurde, mit zunehmender Dicke des Primärtumors abnahm (Batch et al., 1982). Patienten mit regionalen Lymphknotenmetastasen weisen generell eine 5-Jahre-Überlebensrate von weniger als 35 nach einer Dissektion auf (Coit et al., 1991).
Die Identifizierung von tumorassoziierten Antigenen ergab weiteren Umfang für tumorbezogene Therapien. Tumorantigene, sowohl solche, die für Tumorzellen singulär sind, als auch solche, die sie mit normalen Zellen gemeinsam haben, ergaben sich als potentielle Ziele für eine aktive Immunisierung. Ein Beispiel für eine Klasse von Tumorantigenen sind die Ganglio side. Ganglioside sind Sialatglykosphingolipide, die aus einem hydrophilen (Zucker) und einem hydrophoben (Ceramid) Teil bestehen. Sie sind im Gehirn und in anderen, von der Neuralleiste abstammenden Zellen vorherrschend und finden sich auch an den von diesen Zellen herrührenden Tumoren – Astrocytomen, Neuroblastomen und Melanomen (Lloyd, 1993). Ihr Muster der Zelloberflächenexpression ändert sich während des Prozesses einer malignen Transformation (Halcomori, 1985). Mehr als 70 Ganglioside wurden identifiziert, obwohl sich nicht alle derselben an Tumoren finden.
In Bezug auf die Entwicklung eines Vaccins erfordert die Induktion einer effektiven Immunantwort auf Kohlehydratantigene die Copräsentation von Kohlehydratepitopen (B-Epitopen) und T-Epitopen, die von einem Protein abgeleitet sind, gegenüber Antigen präsentierenden Zellen. Dies wurde herkömmlicherweise durch chemische Konjugation eines Kohlehydrats mit einem Trägerprotein erreicht, wobei das am besten bekannte Beispiel die Haemophilus influenzae-Typ-b-Vaccine sind, wobei ein Kohlehydratantigen mit entweder einem Diphtheriatoxoid, Tetanustoxoid oder Neisseria meningitidis Major Outer Membrane Protein konjugiert ist. Jedoch ergibt die Verwendung von chemischer Konjugation bei der Herstellung derartiger Vaccine insofern inhärente Probleme, als die Struktur von Konformationsepitopen geändert werden kann, wodurch deren Antigenität verringert oder beseitigt wird. Ferner sind chemische Konjugationsverfahrensmaßnahmen kostenaufwendig, zeitaufwendig, sehr schwierig unter gleichförmigen Bedingungen durchzuführen und sie umfassen generell wesentliche Materialverluste. Ferner werden bei der Stimulation der Immunantwort auf ein derartiges Antigen häufig Adjuvanzien zur Erhöhung der Immunogenität des Antigens verwendet. Eine der mit der Verwendung von Adjuvanzien verbundenen Schwierigkeiten ergibt sich durch die unerwünschte Reaktivität, die sie auch induzieren können.
Dosis-Ort-Reaktivitäten sind ein Hauptproblem für sowohl die veterinärmedizinische als auch humane Verwendung eines Adjuvans bei einer Vaccinzubereitung. Ein Weg zur Vermeidung von Toxizität erfolgt über die Verwendung von immunstimulierenden Komplexen. Immunstimulierende Komplexe sind typischerweise kleine, käfigähnliche Strukturen eines Durchmessers von 30 bis 40 Nanometern, die deren Struktur bei Gefriertrocknen beibehalten. Die Größe kann jedoch in Abhängigkeit von der Zubereitungsweise, der Zusammensetzung und dem zur Messung verwendeten Verfahren variieren. Die Fertigformulierung eines typischen immunstimulierenden Komplexes mit einer optimalen Menge an immunogenem Protein oder Polypeptid ist ein Gewichtsverhältnis von Saponin, Cholesterin, Phospholipiden und Protein oder Polypeptid von 5:1:1:1. Ein derartiger typischer immunstimulierender Komplex sollte etwa 60 Gew.-% an Saponin, etwa 10 an jeweils Cholesterin und Phospholipiden und zum Rest Protein oder Polypeptide enthalten. Proteine oder Polypeptide können in die Matrix eines immunstimulierenden Komplexes entweder direkt oder durch chemische Kopplung an ein Trägerprotein (beispielsweise Influenzahüllprotein) nach Einbau des Trägerproteins in den immunstimulierenden Komplex eingebaut werden.
Die Saponinadjuvanzien, eine Gruppe oberflächenaktiver Glykoside pflanzlicher Herkunft, sind stark wirksame Adjuvanzien. Jedoch zeigen sie trotz ihrer Wirksamkeit keineswegs Toxizität. Eine derartige Toxizität ist durch Einarbeiten eines Saponins in einen immunstimulierenden Komplex verringerbar. Dies beruht auf der Assoziation des Saponinadjuvans mit Cholesterin in dem Komplex, wodurch dessen Fähigkeit zur Bindung an Cholesterin in Zellmembranen verringert wird. Ferner ist eine geringere Saponinmenge zur Erzeugung eines ähnlichen Grades der Adjuvanswirkung erforderlich.
Barr et al. (Immunology & Cell Biology (1996) 74: 8–25) ist ein Übersichtsartikel mit einer Diskussion von immunstimulierenden Komplexen, die die Fähigkeit der Wirkung als Vaccinadjuvanzien aufweisen (iscoms). Livingston et al. (Vaccine (1994) 12: 1275–1280) beschreibt eine klinische Studie der Phase I der Saponinfraktion QS-21 mit dem Gangliosid GM2, das kovalent an das Antigen Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin gebunden ist. Die WO 90/03184 beschreibt eine Iscom-Matrix, die mindestens ein Lipid und mindestens ein Saponin umfasst, für die die Verwendung als immunmodulierendes Mittel vorgeschlagen wird. Die WO 97/309726 berichtet die Produktion von Iscoms, wobei das GM1-Gangliosid in die Matrixstruktur eingebaut ist, wodurch ermöglicht wird, dass die Matrix die Choleratoxin-Teileinheit B bindet. Die Formulierung soll als Choleravaccin dienen.
Bei den zur vorliegenden Erfindung führenden Arbeiten ermittelten die Erfinder, dass die Phospholipidkomponente eines immunstimulierenden Komplexes durch Gangliosidmoleküle ersetzt werden kann, da Ganglioside strukturmäßig mit Phospholipiden verwandt sind. Beide Moleküle weisen zwei Acylketten, die über Glycerin an eine Kopfgruppe gebunden sind, auf. Obwohl die Funktionen der Erfindung nicht auf eine Wirkungsweise beschränkt werden sollen, wird angenommen, dass, da die Natur eines Gangliosidmoleküls eine Fettsäurekette mit einer polaren Kopfgruppe ist, die Fettsäurekette in den immunstimulierenden Komplex eintaucht, wobei die polare Kopfgruppe exponiert zurückbleibt, wodurch die Kopfgruppe als exponiertes B-Zellen-Epitop fungiert. Eine derartige Formulierung kann den Antigenteil des Gangliosids auf der Oberfläche der immunstimulierenden Komplexstruktur präsentieren.
Entsprechend betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung einen immunogenen immunstimulierenden Komplex, der eine Saponinzubereitung, ein Sterol und ein Proteinepitop zusammen mit entweder

(i) einem Phospholipid und mindestens einem Gangliosid oder
(ii) mindestens einem Gangliosid allein umfasst, wobei das Gangliosid nicht GM1 ist und mit dem Proteinepitop nicht chemisch konjugiert ist.

Saponinzubereitungen, Sterole und Phospholipide, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind detailliert in PCT/AU95/00670 beschrieben.
Ein immunogener immunstimulierender Komplex gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch Techniken hergestellt werden, die Fachleuten bekannt sind und detailliert in den Veröffentlichungen von Cox und Coulter, 1992, und Morein et al., australische Patentschriften Nr. 558258 , 589915 , 590904 und 632067 , beschrieben sind. Da die Zubereitung der immunogenen immunstimulierenden Komplexe der vorliegenden Erfindung keine chemische Konjugation umfasst, ist das Risiko einer Veränderung der Konformation des Gangliosids oder Proteinepitops minimiert.
Mehrere Proteine und Ganglioside können in einen einzigen immunstimulierenden Komplex eingearbeitet werden. Dies ermöglicht die Zubereitung immunstimulierender Komplexe, in denen das Verhältnis von Proteinkomponenten zu Gangliosiden zwischen individuellen immunstimulierenden Komplexen variiert.
Hierin betrachtete Homologa von Gangliosiden umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, von verschiedenen Arten stammende Ganglioside.
Vorzugsweise ist das Gangliosid aus GM2, GD2, GD3 und/oder GT3 (Lloyd, 1993) oder Derivaten derselben ausgewählt.
Entsprechend betrifft in dieser bevorzugten Ausführungsform die vorliegende Erfindung einen immunogenen immunstimulierenden Komplex, der eine Saponinzubereitung, ein Sterol, ein Proteinepitop zusammen mit entweder

(i) einem Phospholipid und mindestens einem der Ganglioside GM2, GD2, GD3 und/oder GT3 oder
(ii) mindestens einem der Ganglioside GM2, GD2, GD3 und/oder GT3 allein umfasst.

Das "Protein" in dem Komplex gemäß der Erfindung umfasst ein T-Zellen-Epitop, das zur Präsentation durch eine antigenpräsentierende Zelle geeignet ist. Beispiele umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Melanomantigene, beispielsweise Mel 40, MAGE, GAGE, NY-ESO-1, Melan A, Mage 3 (Stockert et al., 1998), Influenza-Hämagglutinin, Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin oder krebsspezifische Proteine (beispielsweise krebsspezifische Proteine, die für die Krebserkrankung, in Bezug auf welche das therapeutische Vaccin verwendet werden soll, relevant sind). Das Protein kann sowohl als T-Zellen-Epitop zur Unterstützung der Induktion von Antikörperantworten auf Ganglioside als auch als Schutzantigen als solches fungieren. Beispielsweise kann Melan A das T-Zellen-Epitop liefern, das zur Präsentation durch eine antigenpräsentierende Zelle geeignet ist, wodurch die Induktion einer Antikörperantwort auf die Gangliosidkomponente der vorliegenden Erfindung unterstützt wird, es kann jedoch auch eine Immunantwort gegen das Melan-A-Epitop selbst stimulieren. Wenn das Protein ein melanomspezifisches Antigen ist, kann die Induktion einer Immunantwort gegen das Protein therapeutische Wirksamkeit ergeben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform können die Proteine als Schutzantigene als solche fungieren.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bereitstellung eines immunogenen immunstimulieren den Komplexes, der eine Saponinzubereitung, ein Sterol, ein Influenza-Hämagglutinin zusammen mit entweder

In einem weiteren bevorzugten Aspekt ist das Protein ein melanomspezifisches Protein.
Gemäß diesem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bereitstellung eines immunogenen immunstimulierenden Komplexes, der eine Saponinzubereitung, ein Sterol, ein melanomspezifisches Protein zusammen mit entweder

Der Ausdruck "Säuger" umfasst Menschen, Primaten, Nutztiere (beispielsweise Pferde, Rinder, Schafe, Schweine, Esel), Labortesttiere (beispielsweise Mäuse, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen), Begleitertiere (beispielsweise Hunde, Katzen) und Jagdwildtiere (beispielsweise Kängurus, Rotwild, Füchse). Vorzugsweise ist der Säuger ein Mensch oder Labortesttier. Noch besser ist der Säuger ein Mensch.
Die meisten Ganglioside in einer Zelle finden sich in der Plasmamembran, wobei die Kohlehydrateinheit nach außen zeigt. Im Lichte von sowohl diesem als auch der Tatsache, dass Ganglioside in Tumoren vorherrschen, sind sie ideal geeignet, als Zelloberflächenantigenziele zu wirken. Ferner werden mehrere der mehr als 70 Ganglioside, die identifiziert wurden, vorwiegend auf bestimmten Tumorzellen gefunden. Beispielsweise exprimieren Melanomtumore variierende Mengen von GM2 und GD2. Ferner ist das Protein, das in den immunstimulierenden Komplex eingearbeitet ist, ein T-Zellen-Epitop, das zur Präsentation durch eine antigenpräsentierende Zelle geeignet ist. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher die erfindungsgemäße Verwendung zur Induktion einer Immunantwort in einem Säuger, die – ohne hierauf beschränkt zu sein, eine humorale und/oder zellvermittelte Immunantwort umfasst.
Demgemäß betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Komponente einen immunogenen immunstimulierenden Komplex, wie im Vorhergehenden breit beschrieben, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln umfasst.
Die pharmazeutischen Formen, die zur injizierbaren Verwendung geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen (wenn sie wasserlöslich sind) oder Dispersionen und sterile Pulver zur extemporären Zubereitung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen oder sie können in der Form einer Creme oder einer anderen, zur topischen Applikation geeigneten Form sein. Sie muss unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil sein und vor der Kontaminationswirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, geschützt sein. Der Träger kann ein Lösemittel oder ein Dispersionsmedium, die beispielsweise Wasser, Ethanol, ein Polyol (beispielsweise Glycerin, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol und dergleichen) enthalten, geeignete Gemische derselben und pflanzliche Öle sein. Die geeignete Fluidität kann beispielsweise durch die Verwendung einer Beschichtung, wie Lecithin, durch Aufrechterhalten einer erforderlichen Teilchengröße im Falle einer Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln aufrechterhalten werden. Die Verhinderung einer Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene an tibakterielle und antimykotische Mittel, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und dergleichen, beigebracht werden. In vielen Fällen ist es günstig, isotonische Mittel, beispielsweise Zucker oder Natriumchlorid, einzuarbeiten. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von eine Absorption verzögernden Mittel, beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine, in den Zusammensetzungen beigebracht werden.
Sterile injizierbare Lösungen werden durch Einarbeiten der aktiven Verbindungen in der erforderlichen Menge in das geeignete Lösemittel mit verschiedenen der anderen, oben aufgezählten Bestandteile nach Bedarf und anschließende Filtrationssterilisation hergestellt. Generell werden Dispersionen durch Einarbeiten der verschiedenen sterilisierten Wirkstoffe in ein steriles Vehikel, das das Basisdispersionsmedium und die erforderlichen anderen Bestandteile von den oben aufgezählten enthält, hergestellt. Im Falle steriler Pulver zur Zubereitung steriler injizierbarer Lösungen sind die bevorzugten Zubereitungsverfahren Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungstechniken, die ein Pulver von dem Wirkstoff plus einem zusätzlichen gewünschten Bestandteil ausgehend von einer zuvor sterilfiltrierten Lösung derselben ergeben.
Wenn die Wirkstoffe in geeigneter Weise geschützt sind, können sie, beispielsweise mit einem inerten Verdünnungsmittel oder mit einem assimilierbaren essbaren Träger, oral verabreicht werden oder in einer Gelatinekapsel einer harten oder weichen Hülle eingeschlossen werden oder zu Tabletten gepresst werden oder direkt mit den diätetischen Nahrungsmitteln aufgenommen werden. Zur oralen therapeutischen Verabreichung kann die aktive Verbindung mit Streckmitteln eingearbeitet werden und in der Form von einnehmbaren Tabletten, Lutschtabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Oblaten und dergleichen verwendet werden. Derartige Zusammensetzungen und Zubereitungen sollten mindestens 1 Gew.-% an aktiver Verbindung enthalten. Der Prozentgehalt der Zusammensetzungen und Zubereitungen kann natürlich variiert werden und er kann günstigerweise zwischen etwa 5 und etwa 80 Gew.-% der Einheit betragen. Die Menge einer aktiven Verbindung in derartigen, therapeutisch verwendbaren Zusammensetzungen ist derart, dass eine geeignete Dosierung erhalten wird. Bevorzugte Zusammensetzungen oder Zubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung werden so hergestellt, dass eine orale Dosierungseinheitsform zwischen etwa 0,1 μg und 2000 mg aktive Verbindung enthält.
Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und dergleichen können auch die im folgenden aufgelisteten Komponenten enthalten: ein Bindemittel, wie Gummi, Akaziengummi, Maisstärke oder Gelatine; Streckmittel, wie Dicalciumphosphat; ein Desintegrationsmittel, wie Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure und dergleichen; ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat; und ein Süßungsmittel, wie Saccharose, Lactose oder Saccharin, oder ein Aromatisierungsmittel, wie Pfefferminz-, Wintergrünöl- oder Kirscharoma, können zugesetzt werden. Wenn die Dosierungseinheitsform eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu Materialien des obigen Typs einen flüssigen Träger enthalten. Verschiedene andere Materialien können als Beschichtungen oder zur anderweitigen Modifizierung der physischen Form der Dosierungseinheit vorhanden sein. Beispielsweise können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Schellack, Zucker oder beiden beschichtet sein. Ein Sirup oder ein Elixier kann die aktive Verbindung, Saccharose als Süßungsmittel, Methyl- und Propylparabene als Konservierungsmittel, einen Farbstoff und ein Aroma, wie Kirsch- oder Orangenaroma, enthalten. Natürlich sollten alle bei der Herstellung einer Dosierungseinheitsform verwendeten Materialien pharmazeutisch rein und in den verwendeten Mengen im wesentlich nicht to xisch sein. Ferner können die aktive Verbindung bzw. die aktiven Verbindungen in Zubereitungen und Formulierungen mit nachhaltiger Freisetzung eingearbeitet werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der Erfindung in Bezug auf Krankheitszustände. Beispielsweise ist die vorliegende Erfindung besonders günstig, jedoch in keinster Weise beschränkt, auf die Verwendung bei der Behandlung von Tumoren und insbesondere Melanomen.
Demgemäß betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die im Vorhergehenden beschrieben ist, zur Verwendung bei einem Verfahren des Auslösens oder der Induktion einer Immunantwort auf einen Krankheitszustand bei einem Säuger, wobei das Auslösen oder die Induktion der Immunantwort den Ausbruch oder die Weiterentwicklung des Krankheitszustands hemmt, stoppt oder verzögert.
Vorzugsweise ist der Krankheitszustand ein Tumor und noch stärker bevorzugt ein Melanom.
Gemäß diesem bevorzugten Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, wie sie im Vorhergehenden beschrieben ist, zur Verwendung in einem Verfahren zur Auslösung oder Induktion einer Immunantwort auf ein Melanom oder einen anderen Tumor in einem Säuger, wobei die Auslösung oder Induktion der Immunantwort den Ausbruch oder die Weiterentwicklung des Melanoms oder eines anderen Tumors hemmt, stoppt oder verzögert.
Wie oben beschrieben ist, kann der Säuger, der einer Behandlung unterzogen wird, ein Mensch oder ein Tier sein, der/das eine therapeutische oder prophylaktische Behandlung eines Krankheitszustands oder eines potentiellen Krankheitszustands benötigt.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines immunogenen immunstimulierenden Komplexes bei der Herstellung eines Medikaments zum Hemmen, Stoppen oder Verzögern des Ausbruchs oder der Weiterentwicklung eines Krankheitszustands.
Vorzugsweise ist der Krankheitszustand ein Tumor und noch stärker bevorzugt ein Melanom.
Weitere Merkmale der vorliegenden Erfindung sind in den folgenden Figuren und/oder Beispielen vollständiger beschrieben.
Zu den Figuren:
1 ist eine graphische Darstellung der Saccharosegradientenanalyse des immunstimulierenden Komplexes von GM2-A/Texas, die den Gehalt von Saccharosegradientenfraktionen an Cholesterin, Protein und GM2-Monosialogangliosid anzeigt.
2 ist eine graphische Darstellung einer Serumantikörperantwort auf A/Texas. Titermittelwerte +/– Standardabweichung sind nach einer ersten und zweiten Immunisierung von Mäusen mit immunstimulierenden Komplexen von A/Texas oder Monosialogangliosid GM2 enthaltenden immunstimulierenden Komplexen von A/Texas angegeben.
3 ist eine graphische Darstellung von individuellen Serumantikörperspiegeln auf A/Texas von drei Kaninchen, die mit dem immunstimulierenden Komplex von GM2-A/Texas immunisiert wurden. Die Antikörperspiegel sind als die Extinktion von 1:6250 verdünnten Seren angegeben.
4 ist eine graphische Darstellung von individuellen Serumantikörperspiegeln auf das Monogangliosid GM2 von drei Kaninchen, die mit dem immunstimulierenden Komplex von GM2-A/Texas immunisiert wurden. Die Antikörperspiegel sind als die Extinktion von 1:25 verdünnten Seren angegeben.
5 ist eine graphische Darstellung der Saccharosegradientenanalyse des immunstimulierenden Komplexes von GD3-p-OVA, die den Gehalt von Saccharosegradientenfraktionen an Cholesterin, Protein und GD3-Monosialogangliosid anzeigt.
6 ist eine graphische Darstellung von individuellen Serumantikörperspiegeln von Ovalbumin von drei Ratten, die mit dem immunstimulierenden Komplex von GD3-p-OVA immunisiert wurden. Die Antikörperspiegel sind als die Extinktion von 1:640 verdünnten Seren angegeben.
7 ist eine graphische Darstellung individueller Antikörperspiegel auf das Monosialogangliosid GD3 von drei Kaninchen, die mit dem immunstimulierenden Komplex von GD3-p-OVA immunisiert wurden. Die Antikörperspiegel sind als die Extinktion von 1:40 verdünnten Seren angegeben.
Beispiel 1
Herstellung von immunstimulierenden Komplexen, die das Monosialogangliosid GM2 und Influenza-Proteine enthalten
Formulierungen eines immunstimulierenden Komplexes wurden nach dem Verfahren von Morein et al. (1989) hergestellt. Kurz gesagt wurden zu 5,3 mg von durch ein Detergens aufgebrochenem Hämagglutinin (HA) des humanen A/Texas-Stamms in 4,5 ml PBS 1 ml einer Lösung, die 10 mg/ml Cholesterin in 20 MEGA-10-Detergens (Gew/V) enthielt, und 1 ml einer wässrigen Lösung, die 10 mg/ml Monosialogangliosid GM2 (Larodan Fine Chemicals AB, Schweden) enthielt, gegeben. Nach dem Mischen wurden 3,5 ml einer Lösung, die 10 mg/ml ISCOPREP^TM703 in PBS enthielt, zugegeben und die Lösung 1 h unter leichtem Mischen bei 25°C gehalten. Während der anschließenden Dialyse gegen PBS/Azid werden immunstimulierende Komplexe, die Influenza-HA, Cholesterin, ISCOPREP^TM703 und das Monosialogangliosid GM2 enthalten, gebildet. Diese immunstimulierenden Komplexe waren nach Elektronenmikroskopie von typischem Aussehen. In ähnlicher Weise wurden immunstimulierende Komplexe von A/Texas hergestellt, wobei das Monosialogangliosid GM2 durch Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) ersetzt war.
Nach der Dialyse wurden Zubereitungen auf einem Saccharosegradienten (10 bis 50% Saccharose) gereinigt und Fraktionen auf Radioaktivität (zur Detektion von tritiiertem Cholesterin), Protein (zur Detektion von Influenza-Antigenen) und durch HPLC (zur Detektion des Monosialogangliosids GM2) analysiert (1). Die Detektion des Monosialogangliosids GM2 unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC erfolgte gemäß Palestini et al. (1990). Alle drei Basiskomponenten zeigten Spitzenwerte in den Fraktionen, in denen typische immunstimulierende Komplexe durch EM identifiziert wurden, was den Einbau von allen Komponenten in den immunstimulierenden Komplex anzeigt.
Beispiel 2
Immunisierung von Mäusen mit immunstimulierenden Komplexen von A/Texas, die das Monosialogangliosid GM2 oder DPPC enthalten
Zehn gezüchtete Mäuse des NIH-Stamms wurden subkutan am Tag 8, Tag 28 und Tag 110 mit 0,1 ml des immunstimulierenden Komplexes von GM2-A/Texas (Zubereitung gemäß der Beschreibung in Beispiel 1), der 11 μg ISCOPREP^TM703, 1 μg des Influenzapro teins des humanen A/Texas-Stamms und 3 μg Monosialogangliosid GM2 enthielt, immunisiert. Allen Mäusen wurde am Tag 28, 35 und 125 retroorbital Blut entnommen.
Die Induktion von gegen A/Texas gerichteten Serum-IgG-Antikörpern wurde durch Enzymimmunoassay (EIA) ermittelt. F96 MaxiSorp-Platten (Nunc, Dänemark) wurden mit 2,5 μg/Vertiefung von aufgebrochenem A/Texas-Influenzavirus in 0,05 M Carbonatpuffer, pH 9,6, über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet. Die Platten wurden in 0,01 M PBS, pH 7,2, das 0,1% Casein, 0,01% Thiomersal und Stabilisator enthielt, über minimal 1 h bei Raumtemperatur blockiert und unter Vakuum getrocknet. Fünffache Verdünnungen von Mausseren wurden ausgehend von 1 in 1000 in 0,01 M PBS, pH 7,2, das 1% Casein, 0,05% Tween-20 und 0,01% Thiomersal enthielt, (Assaypuffer) hergestellt und 100 μl/Vertiefung wurden 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Jede Platte umfasste ein Standardserum, das ausgehend von 1 in 20 zweifach verdünnt war. Nach fünf Waschvorgängen in 0,01 M PBS, pH 7,2, das 0,05% Tween-20 und 0,0005% Thiomersal enthielt, wurden die Platten 2 h bei Raumtemperatur mit mit Meerrettichperoxidase konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories, USA), das in Assaypuffer auf 0,06 μg/ml verdünnt war, inkubiert. Nach drei zusätzlichen Waschvorgängen wurde Substratlösung (TMB, Microwell Peroxidase Substrate System, Kirkegaard & Perry Laboratories, USA) mit 100 μl/Vertiefung zugegeben und es wurde 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Enzymreaktion wurde durch Zugabe von 50 μl/Vertiefung von 0,5 M H₂SO₄ gestoppt und die Extinktion bei 450 nm wurde abgelesen. Endpunkttiter wurden ausgehend von einer Vier-Parameter-Anpassungsanalyse des linearen Teils der Standardkurve berechnet. Die Immunisierung mit dem immunstimulierenden Komplex von GM2-A/Texas ergab die Bildung von gegen A/Texas gerichteten IgG-Antikörpern (2). Eine signifikante Verstärkungswirkung wurde zwischen der ersten und der zweiten Immunisierung beobachtet (p < 0,05). Die Titer wurden durch den Wilcoxon Signed Rank Test und den Mann-Whitney-U-Test unter Verwendung der Graph Pad Instat v2.03-Computersoftware verglichen.
Die Induktion von Serumantikörpern gegenüber dem Monosialogangliosid GM2 wurde in einem Dot-Blot-Assay unter Verwendung eines immunstimulierenden Komplexes, der das Monosialogangliosid GM2 enthielt (von Larodan Fine Chemicals AB, Schweden), jedoch kein Protein enthielt, als Beschichtungsmaterial (1,7 μg/Dot ISCOPREP^TM703 und 0,25 μg/Dot GM2) ermittelt. Die Zubereitung des immunstimulierenden Komplexes von GM2 war im wesentlichen gleich der für den immunstimulierenden Komplex von GM2-A/Texas in Beispiel 1, wobei die Zugabe des Influenzaproteins weggelassen wurde. Punkte bzw. Dots, die ISCOMATRIX^TM enthielten, wurden als Kontrollmaterial verwendet (1,7 μg/Dot ISCOPREP^TM703). Die Zubereitung von ISCOMATRIX^TM war im wesentlichen gleich der für den immunstimulierenden Komplex von GM2-A/Texas in Beispiel 1, wobei die Zugabe des Influenzaproteins weggelassen wurde und das Monosialogangliosid GM2 durch DPPC ersetzt wurde. Dots, die gereinigtes und aufgebrochenes A/Texas enthielten, wurden als zusätzliches Kontrollmaterial verwendet (etwa 80 ng/Dot Hämagglutinin). Die Dots wurden auf Nitrocelluloselagen aufgebracht (0,5–1 μl/Dot). Nach Trocknen während 10 min bei Raumtemperatur wurden die Nitrocelluloselagen 1 h bei Raumtemperatur in 0,01 M PBS, pH 7,2, das 3 Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, (Blockierungspuffer) inkubiert. Die Blots wurden mit einem Pool von Seren, die am Tag 125 Mäusen entnommen wurden, die mit dem immunstimulierenden Komplex von GM-A/Texas immunisiert waren, einem Pool von Seren von Mäusen, die mit dem immunstimulierenden Komplex von A/Texas immunisiert waren, und Seren von naiven Mäusen inkubiert. Die drei Pools von Seren wurden alle 1 in 1000 in den Blots zugesetztem Blockierungspuffer verdünnt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen während jeweils 10 min in 0,01 M PBS, pH 7,2, das 0,3 BSA enthielt, wurden die Blots mit mit Meerrettichperoxidase konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG, das γ-spezifisch ist (Kirkegaard & Perry Laboratories, USA), das in Blockierungspuffer auf 0,06 μg/ml verdünnt war, 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach drei weiteren Waschvorgängen wurde Substratlösung (4CN Peroxidase Substrate System, Kirkegaard & Perry Laboratories, USA) zugegeben und es wurde etwa 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Blots wurden getrocknet und an einem dunklen Platz gelagert.
Der immunstimulierende Komplex von GM2 wurde durch Seren von den Mäusen, die mit dem immunstimulierenden Komplex von GM2-A/Texas immunisiert waren, jedoch nicht von Kontrollseren, die gegen den immunstimulierenden Komplex von A/Texas gebildet wurden, erkannt (Tabelle 1), was anzeigt, dass eine Population von Antikörpern in den Seren gegen GM2 gerichtet ist. Seren von den Mäusen, die mit dem immunstimulierenden Komplex von GM2-A/Texas immunisiert waren, reagierten auch mit ISCOMATRIX^TM, das kein GM2 enthielt. Die gegen den immunstimulierenden Komplex von A/Texas gebildeten Kontrollseren reagierten mit ISCOMATRIX^TM nicht. Es ist wahrscheinlich, dass die mit dem immunstimulierenden Komplex von GM2-A/Texas immunisierten Mäuse Antikörper produzieren, die die Galactoseeinheit erkennen, die ein konsistentes Kohlehydrat an der C3-Position des Aglykons Quillasäure an den meisten, falls nicht allen Quillaia-Saponinen ist.
Beispiel 3
Immunisierung von Kaninchen mit immunstimulierenden Komplexen von A/Texas, die das Monosialogangliosid GM2 enthalten
Drei Kaninchen wurden subkutan am Tag 0 und am Tag 19 mit 0,5 ml des immunstimulierenden Komplexes von GM-A/Texas (Zubereitung gemäß der Beschreibung in Beispiel 1), der 200 μg ISCOPREP^TM703, 20 μg A/Texas und 50 μg Monosialogangliosid GM2 entielt, immunisiert. Den Kaninchen wurde Blut am Tag 0, Tag 7, Tag 19 und Tag 25 entnommen.
Die Induktion von gegen A/Texas gerichteten Serum-IgG-Antikörpern wurde durch EIA ermittelt. Der Assay war im wesentlichen gleich dem in Beispiel 2 beschriebenen EIA-Verfahren mit der Ausnahme, dass ein mit Meerrettichperoxidase konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG H + L (Kirkegaard & Perry Laboratories, USA), das auf 1 μg/ml in Assaypuffer verdünnt war, anstelle des Mauskonjugats verwendet wurde.
Wie in 3 gezeigt ist, wurden Antikörpertiter gegen A/Texas-Influenzaproteine nach der Immunisierung mit dem immunstimulierenden Komplex von GM2-A/Texas gebildet. Nach der ersten Immunisierung nahmen die Antikörperspiegel etwa vierfach vom Tag 0 bis zum Tag 7 zu, worauf ein weiterer etwa vierfacher Anstieg vom Tag 7 bis zum Tag 19 folgte (p = 0,05). Eine signifikante Verstärkungswirkung wurde zwischen der ersten und der zweiten Immunisierung beobachtet (p = 0,05) und die Antikörperspiegel nahmen etwa 1,5fach zu. Die Antikörperspiegel wurden durch den Wilcoxon Signed Rank Test unter Verwendung der GraphPad Instat v2.03-Computersoftware verglichen.
Die Induktion von gegen das Monosialogangliosid GM2 gerichteten Serum-IgG-Antikörpern wurde durch EIA ermittelt. F96 MaxiSorp-Platten (Nunc, Dänemark) wurden mit dem Monosialogangliosid GM2 (Larodan Fine Chemicals AB, Schweden), das in 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,4, gelöst war, mit 0,1 μg/Vertiefung beschichtet. Die Platten wurden über Nacht bei +4 °C inkubiert und die im folgenden angegebenen Stufen waren im wesentlichen die gleichen wie das in Beispiel 2 beschriebene EIA-Verfahren mit der Ausnahme, dass ein mit Meerrettichperoxidase konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories, USA), das auf 1 μg/ml in Assaypuffer verdünnt war, anstelle des Mauskonjugats verwendet wurde.
4 zeigt, dass die individuellen Antikörperspiegel gegenüber dem Monosialogangliosid GM2 am Tag 7 etwa zweifach höher als am Tag 0 für alle Kaninchen waren, was anzeigt, dass niedrige Antikörperspiegel gegenüber dem Monosialogangliosid GM2 produziert wurden.
Die Induktion von gegen das Monosialogangliosid GM2 gerichteten Serum-IgG-Antikörpern wurde auch unter Verwendung eines Dot-Blot-Assays ermittelt. Das Verfahren war im wesentlichen gleich dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren mit der Ausnahme, dass ein mit Meerrettichperoxidase konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories, USA), das auf 1 μg/ml in Assaypuffer verdünnt war, anstelle des Mauskonjugats verwendet wurde.
Der immunstimulierende Komplexe von GM2 wurde nur von Kaninchenseren erkannt, die 1 Woche nach der zweiten Immunisierung (Tag 25) entnommen wurden, was anzeigt, dass eine Verstärkungsreaktion auf gegen das Monosialogangliosid GM2 gerichtete Antikörper beobachtet wurde (Tabelle 2). Der EIA scheint höhere Empfindlichkeit als der Dot-Blot-Assay aufzuweisen, da eine Reaktion am Tag 7 detektiert wurde. Analog zu Beispiel 2 reagierte das Kaninchenserum vom Tag 25 auch mit ISCOMATRIX^TM, das kein GM2 enthielt. Die früheren Blutentnahmen reagierten mit ISCOMATRIX^TM nicht. Es ist wahrscheinlich, dass auch die Kaninchen, die mit dem immunstimulierenden Komplex von GM2-A/Texas immunisiert wurden, einige Antikörper produzieren, die die Galactoseeinheit erkennen, die wahrscheinlich auf dem Aglykon Quillasäure in ISCOMATRIX^TM vorhanden ist.
Beispiel 4
Zubereitung von immunstimulierenden Komplexen, die das Disialogangliosid GD3 und palmitifiziertes Ovalbumin enthalten Ein immunstimulierender Komplex, der das Disialogangliosid GD3 und palmitifiziertes Ovalbumin (p-OVA) enthielt, wurde im wesentlichen nach dem Verfahren gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 und in Mowat et al. (1991) hergestellt. Das Monosialogangliosid GM2 wurde durch das Disialogangliosid GD3 ersetzt und A/Texas wurde durch p-OVA ersetzt.
Nach der Dialyse wurden Zubereitungen auf einem Saccharosegradienten (10 bis 50 Saccharose) gereinigt und die Fraktionen auf Radioaktivität (zur Detektion von tritiiertem Cholesterin), Protein (zur Detektion von p-OVA) und durch HPLC (zur Detektion von Disialogangliosid GD3) analysiert (5). Die Detektion des Disialogangliosids GD3 unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC erfolgte gemäß Palestini et al. (1990). Alle drei Basiskomponenten zeigten Spitzenwerte in den Fraktionen, in denen typische immunstimulierende Komplexe durch EM identifiziert wurden, was den Einbau aller Komponenten in den immunstimulierenden Komplex anzeigt.
Beispiel 5
Immunisierung von Kaninchen mit immunstimulierenden Komplexen von p-OVA, die das Disialogangliosid GD3 enthalten Drei Kaninchen wurden subkutan am Tag 0 mit 0,5 ml des immunstimulierenden Komplexes von GD3-p-OVA (Zubereitung gemäß der Beschreibung in Beispiel 4), der 200 μg ISCOPREP^TM703, 17 μg p-OVA und 111 μg Disialogangliosid GD3 enthielt, immunisiert. Den Kaninchen wurde Blut am Tag 0 und am Tag 7 entnommen.
Die Induktion von gegen Ovalbumin gerichteten Serum-IgG-Antikörpern wurde durch EIA ermittelt. F96 MaxiSorp-Platten (Nunc, Dänemark) wurden mit Ovalbumin (Sigma, USA), das in 10 mM Acetatpuffer, pH 4,2, gelöst war, mit 5 μg/Vertiefung beschichtet. Die Platten wurden über Nacht bei +4°C inkubiert und die folgenden Stufen waren im wesentlichen gleich dem in Beispiel 2 beschriebenen EIA-Verfahren mit der Ausnahme, dass ein mit Meerrettichperoxidase konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG H + L (Kirkegaard & Perry Laboratories, USA), das auf 1 μg/ml in Assaypuffer verdünnt war, anstelle des Mauskonjugats verwendet wurde.
Wie in 6 angegeben ist, wurden Antkörperspiegel gegen Ovalbumin nach dem Immunisierung mit dem immunstimulierenden Komplex von GD3-p-Ova gebildet. Die Antikörperspiegel nahmen etwa dreifach vom Tag 0 zum Tag 7 zu (p = 0,05). Die Antikörperspiegel wurden durch den Wilcoxon Signed Rank Test unter Verwendung der GraphPad Instat v2.03-Computersoftware verglichen.
Die Induktion von gegen das Disialogangliosid GD3 gerichteten Serum-IgG-Antikörpern wurde durch EIA ermittelt. F96 Maxi-Sorp-Platten (Nunc, Dänemark) wurden mit dem Disialogangliosid GD3 (Larodan Fine Chemicals AB, Schweden), das in 0,1 M PBs, pH 7,2, gelöst war, mit 0,1 μg/Vertiefung beschichtet. Die Platten wurden über Nacht bei +4°C inkubiert und die folgenden Stufen waren im wesentlichen gleich dem in Beispiel 2 beschriebenen EIA-Verfahren, mit den Ausnahmen, dass Tween-20 in dem Waschpuffer und dem Assaypuffer weggelassen wurde und dass ein mit Meerrettichperoxidase konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories, USA), das auf 1 μg/ml in Assaypuffer verdünnt war, anstelle des Mauskonjugats verwendet wurde.
7 zeigt, dass individuelle Antikörperspiegel gegen über dem Disialogangliosid GD3 etwa 1,5-fach vom Tag 7 bis zum Tag 0 für zwei Kaninchen von drei Zunahmen, was anzeigt, dass niedrige Antikörperspiegel gegen das Disialogangliosid GD3 produziert wurden. Das Kaninchen, das keine Reaktion zeigte, wies eine hohe Ablesung am Tag 0 auf, die sich nach der Immunisierung verringerte.

ISCOPREP^TM703 und ISCOMATRIX sind Produkte von Iscotec A. B. – siehe die Internationale Patentanmeldung PCT/AU95/00670 . TABELLE 1. Serumantikörperantwort auf das Monosialogangliosid GM2, die durch einen Dot-Blot-Assay ermittelt wurde. Mäuse wurden mit dem immunstimulierenden Komplex von GM2-A/Texas immunisiert

Antigen in Dot	Detektion mit Seren
Antigen in Dot	Imunstimmulierender Komplex von α-GM2-A/Texas	Imunstimmulierender Komplex von α-A/Texas	Negative Mausseren
ISCOMATRIX^TM	+	–	–
Imunstimmulierender Komplex von GM2	++	–	–
A/Texas	+	+	–

– keine Reaktion zwischen Antigen und Seren
+ klare Reaktion zwischen Antigen und Seren
++ starke Reaktion zwischen Antigen und Seren

Antigen in Dot	Detektion mit Serenvon Kaninchen, die mit dem immunstimulierenden Komplexvon GM2-A/Texas immunisiertwurden
Antigen in Dot	Tag 0	Tag 7	Tag 19	Tag 25
ISCOMATRIX^TM	–	–	–	+
Imunstimmulierender Komplex von GM2	–	–	–	++
A/Texas	–	++	++	++

BIBLIOGRAPHIE:

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Claims

Immunogener immunstimulierender Komplex, der eine Saponinzubereitung, ein Sterol und ein Proteinepitop zusammen mit entweder (i) einem Phospholipid und mindestens einem Gangliosid oder (ii) mindestens einem Gangliosid allein umfasst, wobei das Gangliosid nicht GM1 ist und mit dem Proteinepitop nicht chemisch konjugiert ist.
Komplex nach Anspruch 1, der mindestens einen Bestandteil von GM2, GD2, GD3 und GT3 umfasst.
Komplex nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Protein ein Krebsprotein ist.
Komplex nach Anspruch 3, wobei das Krebsprotein ein melanomspezifisches Protein ist.
Komplex nach Anspruch 4, wobei das Melanomprotein MEL40, MAGE, GAGE, NY-ESO-1 oder Melan A ist.
Komplex nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Protein ein Grippe-Hämagglutinin ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die als die aktive Komponente einen immunogenen immunstimulierenden Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7 zur Verwendung in einem Verfahren zur Auslösung oder Induktion einer Immunantwort auf einen Krankheitszustand in einem Säuger und dadurch zum Hemmen, Stoppen oder Verzögern des Ausbruchs oder der Weiterentwicklung des Krankheitszustands.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei der Krankheitszustand ein Tumor ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei der Tumor ein Melanom ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, 9 oder 10, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Verwendung eines immunogenen immunstimulierenden Komplexes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung eines Medikaments zum Hemmen, Stoppen oder Verzögern des Ausbruchs oder der Weiterentwicklung eines Tumors.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Tumor ein Melanom ist.