DE602004005460T2

DE602004005460T2 - Adjuvanskombinationen von liposomen und mycobakteriellen lipiden für immunisierungszusammensetzungen und impfstoffe

Info

Publication number: DE602004005460T2
Application number: DE602004005460T
Authority: DE
Inventors: Else Marie Agger; Peter Andersen; Anja Olsen; Ida Rosenkrands
Original assignee: Statens Serum Institut SSI
Current assignee: Statens Serum Institut SSI
Priority date: 2003-07-09
Filing date: 2004-07-07
Publication date: 2008-05-08
Anticipated expiration: 2024-07-08
Also published as: WO2005004911A3; US8241610B2; KR20060121128A; AU2004255393A1; CA2531825C; CA2531825A1; ES2285466T3; US20110250224A1; US20060286128A1; KR100992646B1; DE602004005460D1; ATE357254T1; WO2005004911B1; EP1648504B1; WO2005004911A2; DK1648504T3; EP1648504A2; AU2004255393B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Adjuvans, umfassend eine oberflächenaktive Substanz und den gesamten Lipidextrakt des BCG-Mycobacteriums sowie die apolare Fraktion davon, und einen Impfstoff, umfassend dieses Adjuvans und eine antigene Substanz.
Hintergrund der Erfindung
Die ersten Impfstoffe bestanden aus lebenden, abgeschwächten Pathogenen. Die abgeschwächten Formen waren entweder natürlich vorkommende, eng verwandte Organismen oder wurden durch serielle Passagen in Kultur erhalten. Zum Beispiel ist Tuberkulose (TB) im Menschen für viele Jahre durch Impfung mit einem abgeschwächten Stamm von Mycobacterium bovis bekämpft worden, dem M. bovis-BCG-Impfstoff, der vor mehr als 80 Jahren entwickelt wurde. Obwohl jedoch mehr als 3 Milliarden Dosierungen an BOG verabreicht worden sind (mehr als von jedem anderen Impfstoff) (Bloom und Fine, 1994) führt er nicht immer in jeder Bevölkerung zu befriedigender Resistenz gegen menschliche TB.
Heutzutage ist es ein fortschrittlicherer Ansatz, hoch gereinigte Substanzen zu verwenden, z. B. gereinigte rekombinante Proteine. Diese Impfstoffe sind gut definiert und Nebenreaktionen werden vermindert. Leider sind viele hochgereinigte Substanzen nicht sehr immunogen und induzieren keine ausreichende Immunantwort, um Schutz zu verleihen. Um das zu tun, brauchen die Antigene Hilfe aus Immunantwort-verstärkenden Mitteln, die Adjuvantien genannt werden. Abhängig vom Pathogen kann Schutz erfordern, dass entweder eine humorale oder ein Zellvermittelte Reaktion vorherrscht. Die Entwicklung von einer spezifischen Art an Immunreaktion (humoral oder Zell-vermittelt) kann durch die Wahl des Adjuvans bestimmt werden.
Schützende Immunität gegen ein intrazelluläres Pathogen wie M. tuberculosis benötigt eine Zell-vermittelte Immunantwort und ein geeignetes Adjuvans für einen Untereiheiten-Impfstoff, der gegen TB gerichtet ist, sollte eine Th1-Antwort verstärken (Lindblad et al, 1997). Es wird allgemein angenommen, dass Antikörper in der Immunität gegen TB keine wichtige Rolle spielen, wohingegen die Zell-vermittelte Freisetzung von IFN-gamma (Interferon gamma) das wichtigste, am Schutz beteiligte Cytokin ist (Collins & Kaufmann, 2001).
Es existiert eine große Zahl an Adjuvantien, aber die meisten davon weisen zahlreiche Probleme auf, die ihre Verwendung in Menschen ausschließen. Die einzigen, für den Menschen akzeptierten Adjuvantien sind auf Aluminium basierende Adjuvantien (AlOH-Salze) und MF-59, aber beide induzieren auf Th2 gerichtete Reaktionen, die sie für einen TB-Impfstoff ungeeignet machen (Lindblad et al., 1997).
Während der letzten 20-30 Jahre sind etliche neue Adjuvans-Systeme identifiziert worden. Ein Beispiel ist QS-21, das eine hochgereinigte Verbindung ist, die aus der Rinde des Südamerikanischen Baumes Quillaja saponaria isoliert wurde. QS-21 ist ein wirksames Adjuvans mit niedriger Toxizität (Kensil et al, 1991). Die Ermangelung einer einfachen Herstellung und ein hoher Preis können ein wichtiger Punkt für QS-21 und andere neue, viel versprechende Adjuvans-Verbindungen sein. Trotz der Tatsache, dass viele Adjuvans-Systeme entwickelt worden sind, wird ein Bedarf für neue Adjuvans-Systeme noch immer erkannt (Moingeon et al, 2001) und ist am Mangel an Auswahlmöglichkeiten, die für die klinische Verwendung vorhanden sind, erkennbar.
Es ist von verschiedenen Verbindungen aus Mycobakterien berichtet worden, dass sie immunverstärkend sind. Wenn Lipide, die aus M. bovis-BCG extrahiert wurden, als Adjuvans verwendet wurden, wurde eine Hauttestreaktion auf Ovalbumin in Meerschweinchen erhalten (Hiu, 1975). Liposomen, die bei erhöhten Temperaturen aus dem gesamten polaren Lipid von M. bovis BCG gebildet wurden, sind im Stande, eine humorale Reaktion auf Ovalbumin zu erzeugen und ein Impfstoff, der aus diesen polaren Lipiden erzeugt wurde, vermittelte in Mäusen nach Herausforderung mit Tumorzellen Schutz ( WO 03/011336 ). Die Wirkung der gesamten Lipide aus M. tuberculosis H37Rv als ein Antigen in einem experimentellen TB-Impfstoff für Meerschweinchen wurde von Dascher et al (2003) untersucht. In dieser Studie wurden Liposomen, basierend auf Cholesterin und 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3- phospcholine (DSPC) mit einem gesamten Lipidextrakt aus M. tuberculosis H37Rv gemischt. Nach Entfernen des Lösungsmittels wurden die Lipide mit DDA als ein Adjuvans in PBS-Puffer rekonstruiert. Meerschweinchen, die mit diesem Impfstoff immunisiert wurden, zeigten keine wesentliche Reduktion in Bakterien, was darauf hindeutet, dass dieser Rezeptur an Liposomen gemischt mit DDA ein starkes Antigen fehlt oder dass die Rezeptur an mycobakteriellen Lipiden mit Cholesterin:DSPC den helfenden Effekt von DDA verhindert.
Verschiedene gereinigte Komponenten aus Mycobakterien sind auch auf ihre Adjuvans-Aktivität untersucht worden. Gereinigte Proteinderivate (PPD) haben alleine keine Hypersensitivitätsreaktion des verzögerten Typs induziert, aber wenn Wax D (ein mycobakterieller Zellwand-Peptidoglycanfragment-Arabionoglalactan-Mycolsäure-Komplex) als ein Adjuvans hinzugefügt wurde, wurde eine starke Reaktion beobachtet. (Yamazaki, 1969). Der Immunmodulator SSM oder Z-100, ein Lipid-Arabinomannan, das aus M. tuberculosis extrahiert wurde, hat anti-Tumor-Aktivität (Suzuki et al, 1986). Eine andere aus mycobakteriellen Zellen stammende Verbindung ist Trehalose-6,6'-dimycolat („Cord-Faktor"; ein Glycolipid, das Mycolsäure enthält)(Saito et al, 1976). Außerdem weist Trehalose-6,6'-dimycolat (oder synthetische Analoge) immunstimulatorische Effekte auf und ist in verschiedenen Adjuvans-Rezepturen einbezogen worden (McBride et al, 1998; Koike et al, 1998). Zusammenfassend sind verschiedene immunstimulierende Lipidkomponenten aus Mycobakterien isoliert worden, aber die benötigten arbeitsaufwändigen und dadurch teuren Reinigungsschemata machen es unwahrscheinlich, dass sie in einem zukünftigen TB-Impfstoff einbezogen werden.
Adjuvantien bestehen in vielen unterschiedlichen Formen, manche davon sind ähnlich oberflächenaktiven Substanzen und bilden Liposomen, die Vesikel aufgebaut aus Lipiddoppelschichten darstellen. Die Liposomen wirken als Träger des Antigens (entweder innerhalb der Vesikel oder angehaftet an die Oberfläche) und können an der Inokulationsstelle ein Depot bilden, das langsame kontinuierliche Freisetzung des Antigens ermöglicht. Die liposomale Präsentation gewährleistet für einige Zeit nach der Injektion und Phagocytose, dass eine spezifische Menge an Antigen einzelnen Antigen-präsentierenden Zellen zur Verfügung gestellt wird (Glück, 1995). Die Adjuvans-Aktivität von Liposomen gilt für eine große Vielfalt an Pathogenen (Gregoriadis et al., 2000) und vor Kürzerem wurden markante anti-Tumor-Reaktionen, die durch cytotoxische CD8 T-Zellantworten charakterisiert sind, mit therapeutischen Impfstoffen hervorgerufen, die zusätzlich kationische Lipide als Adjuvantien enthalten (Siders et al, 2002).
Dimethyldioctadecylammonium-bromid, -chlorid, -phosphat, -acetat oder andere organische oder anorganische Salze (DDA) sind eine lipophile quaternäre Ammoniumverbindung, die in wässriger Lösung bei Temperaturen über 40°C kationische Liposomen bildet. Sie fördert Zell-vermittelte Immunität (Nilgers & Snippe, 1992). Kombinationen von DDA und anderen immunmodulierenden Mitteln sind beschrieben worden. Die Verabreichung von Arquad 2HT an Menschen, das DDA umfasst, war vielversprechend und hat keine offensichtlichen Nebeneffekte induziert (Stanfield, 1973). Ein experimenteller Impfstoff, basierend auf Kulturfiltrat-Proteinen von M. tuberculosis und DDA, erzeugte eine schützende Immunantwort gegen TB in Mäusen (Andersen, 1994). Impfung von Mäusen mit einem Fusionsprotein der M. tuberculosis-Proteine ESAT-6 und Ag85B und DDA/MPL als einem Adjuvans stellt ähnlichen Schutz wie der bereit, der durch die BCG-Impfung erhalten wurde (Olsen et al, 2001). Diese Studien zeigen, dass im Gegensatz zu z.B. Alaun, DDA-basierende Adjuvantien in der Lage sind, eine schützende Immunantwort gegen TB in Mäusen zu induzieren. Darüber hinaus ist DDA als ein Adjuvans für einen DNA-Impfstoff gegen das Pseudorabies-Virus verwendet worden, was zu verstärkten T-Zell-Reaktionen und antiviraler Immunität führte (van Rooij et al, 2002). DDA ist daher eine vielversprechende Auswahl für die Entwicklung eines Adjuvans-Systems für einen Impfstoff gegen TB und andere intrazelluläre Pathogene.
Wie vorstehend angedeutet, werden eindeutig neue Adjuvans-Systeme benötigt. Das ideale Adjuvans-System, das der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ist preiswert und leicht herzustellen, es erzeugt eine lang anhaltende schützende Immunantwort der richtigen Art (Th1 oder Th2, abhängig von dem Pathogen), es ruft keine inakzeptablen örtlichen Reaktionen hervor, es bietet stabile Langzeit-Präsentation des Antigens (Depoteffekt) und es hilft dabei, Immunzellen anzugehen.
Zusammenfassung der Erfindung
In der vorliegenden Erfindung wird gezeigt, dass eine überraschend hohe schützende Immunantwort erhalten wird, wenn Lipide, die aus M. bovis-BCG extrahiert wurden, gemeinsam mit der kationischen oberflächenaktiven Substanz als ein Adjuvans verwendet werden. Eine stark erhöhte Immunantwort wird erhalten, wenn DDA zu einem Gesamt-Lipidextrakt von M. bovis-BCG hinzugefügt wird, verglichen mit der, die unter Verwendung von einer der Komponenten alleine erhalten wird, was einen synergistischen Adjuvans-Effekt von DDA und des Gesamt-Lipidextrakts zeigt. Die Kombination von DDA und Gesamt-Lipiden, die aus M. bovis BCG extrahiert wurden, ergibt eine noch höhere schützende Immunantwort als DDA/TDB, eine andere Kombination, von welcher vor Kurzem gezeigt wurde, dass sie unerwartet hohe Wirksamkeit zeigt (Holten-Andersen et al, 2004). Darüber hinaus benötigt der Gesamt-Lipidextrakt keine umfangreiche Reinigung, was es preiswert in der Herstellung und daher geeignet für die Einbeziehung in zukünftige Impfstoffe macht, die für die Verwendung überall in der Welt geeignet sind. Es wird ferner gezeigt, dass die apolare Fraktion des Gesamt-Lipidextraktes einen stärkeren Adjuvans-Effekt hat als die polare Fraktion, wenn sie mit DDA gemischt wird.
Lipidextrakte, welche gesamte apolare und polare Lipide von M. bovis BCG umfassen, wurden durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln erhalten. Die Lipidfraktionen wurden durch Dünnschicht-Chromatographie charakterisiert. Der Lipidextrakt wurde in wässrige Suspension eingebracht und mit Liposomen von einer oberflächenaktiven Substanz, z.B. DDA, und einem Antigen gemischt. Es wurde gezeigt, dass die Mehrheit an Antigen an die Adjuvans-Fraktion gebunden war. Mäuse, die mit einem Fusionsprotein von ESAT-6 und Ag85B von M. tuberculosis gemeinsam mit DDA/BCG-Lipiden immunisiert wurden, erzeugten eine starke Immunantwort und, wenn als ein Impfstoff verwendet, wurde eine schützende Immunantwort gegen M. tuberculosis erhalten.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Adjuvans, umfassend eine kationische oberflächenaktive Substanz und einen Lipidextrakt, der die apolare Fraktion oder Teile der apolaren Fraktion des gesamten Lipidextrakts eines Mycobakteriums, z.B. BCG, Mycobacterium microti, M. tuberculosis oder M. vaccae, umfasst. Die Teile der apolaren Fraktion des Lipidextrakts können Phthiocerol-Dimycocerosate, Trehalose-Mycolipenate, glycosylierte Phenol-Phthiocerole (einschließlich phenolische Glycolipide, PGL's), Trehalose-Mycolate, Sulfolipide, Triacylglycerole oder Menaquinone sein.
Die oberflächenaktive Substanz ist vorzugsweise Dimethyldioctadecylammoniumbromid, -chlorid, -phosphat oder -actetat (DDA), Dimethyldioctadecenylammoniumbromid, -chlorid, -phosphat oder -acetat (DODA), N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium-chlorid (DOTAP), Cholesteryl-3b-N-(dimethylaminoethyi)carbamat-Hydrochlorid (DC-Chol), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin und L-Phosphatidylcholin (DOPE/PC) oder DOPE/PC/PG (PG ist L-alpha-Phosphatidyl-DL-glycerin-Natiumsalz).
Die oberflächenaktive Substanz ist am stärksten bevorzugt Dimethyldioctadecylammonium-bromid oder -chlorid (DDA).
Die vorliegende Erfindung offenbart auch einen Impfstoff gegen infektiöse Krankheiten, z.B. intrazelluläre Pathogene wie TB, umfassend das vorstehend erwähnte Adjuvans und eine antigene Substanz, die aus dem infektiösen Erreger stammt, gegen welchen immunisiert werden soll, z.B. ein Peptid, Protein oder Lysat.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Impfstoff, der das Adjuvans der Erfindung gemeinsam mit einem Peptid aus

– einem virulenten Mycobakterium, z.B. Mycobacterium tuberculosis, M. bovis oder M. africanum enthält, wobei das am meisten bevorzugte Antigen das ESAT6-Ag85B-Hybrid oder ein Fragment davon darstellt.

Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Impfstoff, umfassend das Adjuvans der Erfindung zur Behandlung von Krebs.
Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verabreichungssystem, das das Adjuvans umfasst.
Ein allgemeines Verfahren zur Extraktion von Gesamt-Lipiden ist die Extraktion mit Chloroform/Methanol (2:1) gemäß Folch (Folch, 1957). In der vorliegenden Offenbarung wurde dieses Verfahren zur Gesamt-Lipidextraktion verwendet. Polare und apolare Lipide wurden durch die früher zur Analyse von mycobakteriellen Lipiden beschriebenen Verfahren erhalten (Dobson et al, 1985). Ein Gesamt-Lipid, ein apolares Lipid und ein polarer Lipidextrakt von M. bovis BCG wurden erzeugt und durch Dünnschicht-Chromatographie charakterisiert. Die Lipidextrakte wurden in Wasser suspendiert und eine homogene Präparation durch Sonden-Ultraschallbehandlung hergestellt. Danach wird das Antigen der Wahl hinzugefügt und schließlich mit einer oberflächenaktiven Substanz, z.B. DDA, kombiniert.
Die Adjuvans-Aktivität der Lipidfraktionen wurde gemeinsam mit DDA als einem TB-Impfstoff in Mäusen getestet. Die apolare Fraktion zeigte, wenn sie mit der oberflächenaktiven Substanz DDA kombiniert wurde, einen stärkeren Adjuvans-Effekt als die polare Fraktion.
Andere Liposomen-bildende Verbindungen umfassen z.B. Dimethyldioctadecenylammonium-bromid, -chlorid, -phosphat oder acetat (DODA), N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium-chlorid (DOTAP), Cholesteryl-3b-N-(dimethylaminoethyl)carbamat-Hydrochlorid (DC-Chol), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin und L-Phosphatidylcholin (DOPE/PC) oder DOPE/PC/PG (PG ist L-alpha-Phosphatidyl-DL-glycerin).
Das Adjuvans wird zu der antigenen Substanz hinzugefügt und als ein Impfstoff verwendet. Im Prinzip kann die antigene Substanz irgendeine reine chemische Spezies sein, wie zum Beispiel ein Protein oder ein Fragment davon oder künstliche Gemische, die aus solchen Spezies erzeugt werden. Es kann aber auch irgendein natürlich vorkommendes Gemisch von chemischen Spezies sein, wie zum Beispiel ein Zellhomogenisat oder Fraktionen davon, ein Kulturfiltrat aus Mikroorganismen oder Zellgewebe aus multizellulären Organismen, z.B. höheren Tieren.
Insbesondere kann die antigene Substanz aus einer Kultur von metabolisierenden Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis und anderen Mycobakterien aus der Umwelt sein, wie zum Beispiel Mycobacterium avium. Eine besonders interessante Substanz aus dem Filtrat von solchen Mycobakterien ist das ESAT-6-Protein („Early Secretory Antigenic Target"), das ein dominantes Ziel für Zellvermittelte Immunität in der frühen Phase von TB in TB-Patienten ist und in unterschiedlichen Tiermodellen darstellt. Es enthält 95 Aminosäurenreste und hat eine abgeleitete molekulare Masse von ungefähr 10 kDa. Seine Immunogenität als solches ist niedrig, aber in Kombination mit den Adjuvans-Kombinationen der vorliegenden Erfindung hat sich herausgestellt, dass es ein wirksamer Kandidat zum Hervorrufen von hoher, bleibender Immunität gegen TB ist, wie im folgenden genauen Teil dieser Beschreibung gezeigt wird.
ESAT-6 sowie viele andere Antigene, die in Kombination mit den Adjuvans-Kombinationen der vorliegenden Erfindung anwendbar sind, können heute künstlich erzeugt werden, z.B. synthetisch oder durch genetische rekombinante Techniken. Ein bevorzugtes Antigen gegen TB ist das ESAT6-Ag85B-Fusionsprotein.
Das Adjuvans der vorliegenden Erfindung und daher der Impfstoff, umfassend dieses Adjuvans, weist alle Charakteristika auf, die von einem idealen Adjuvans gewünscht werden:

– es ist preisgünstig und leicht herzustellen
– es erzeugt eine lang anhaltende schützende, Zell-vermittelte Immunantwort
– es ruft keine unakzeptablen örtlichen Reaktionen hervor, z.B. Granulome
– es hilft, Immunzellen anzugehen

Darüber hinaus wurde überraschenderweise entdeckt, dass nur das Adjuvans, umfassend DDA und den gesamten Lipidextrakt aus Mycobakterien im Stande war, eine dominante Th1-Immunantwort in einem zu Th2 geneigten Mausstamm zu induzieren, in welchem eine Th1-Antwort nicht leicht erzeugt wird.
Auch die Gedächtnis-Immunität war außergewöhnlich verlängert, wenn ein Impfstoff verwendet wurde, der DDA und den gesamten Lipidextrakt gemeinsam mit einem mycobakteriellen Antigen umfasste. Die Immunität war in Mäusen für mehr als 6 Monate effektiv (in manchen Mäusen für 14 Monate).
Definitionen
Ein Adjuvans wird als eine Substanz definiert, welche die Immunantwort auf ein Antigen erhöht. Abhängig von der Natur des Adjuvans kann es entweder eine Zellvermittelte Immunantwort, eine humorale Immunantwort oder ein Gemisch der beiden begünstigen. Da die Verstärkung der Immunantwort unspezifisch ist, ist im Fachgebiet offensichtlich, dass das gleiche Adjuvans mit unterschiedlichen Antigenen verwendet werden kann, um Antworten gegen unterschiedliche Ziele zu fördern, z.B. mit einem Antigen von M. tuberculosis, um Immunität gegen M. tuberculosis zu begünstigen, oder mit einem Antigen, das aus einem Tumor stammt, um Immunität gegen Tumoren von dieser speziellen Art zu fördern.
Ein gesamter mycobakterieller Lipidextrakt ist eine Gemisch von Lipiden, das aus einem Mycobakterium z.B. BCG, M. microti, M. tuberculosis und M. vaccae, durch einen chemischen oder physikalischen Prozess erhalten wurde. In der vorliegenden Arbeit ist das für die Extraktion verwendete Verfahren die Wirkung von anorganischen Lösungsmitteln (wie nachstehend beschrieben), aber andere Möglichkeiten, die Fachleuten bekannt sind, sind möglich.
Die apolare Lipidfraktion wird als nicht-polare Lipide definiert. Die apolare Lipidfraktion wird durch Behandlung der Mycobakterien mit einem biphasischen Gemisch von Methanol/Salzlösung und Petroleumether erhalten. Der Petroleumether-Extrakt besteht aus apolaren (nicht-polaren) Lipiden. Nachstehend wird die polare Lipidfraktion durch Hinzufügen von Chloroform zu Mycobakterien und der verbleibenden wässrigen Phase erhalten. Der Chloroformextrakt enthält die verbleibenden polaren Lipide. Die Hauptkomponenten in der apolaren Lipidfraktion sind Phthiocerol-Dimycocerosate, Triacylglycerole, Trehalose-Mycolipenate und Menaquinone. Die Hauptkomponenten der polaren Lipidfraktion sind Phospholipide wie zum Beispiel Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylglycerin und Phosphatidylinosit (einschließlich mannosylierten Spezies). Lipide von dazwischenliegender Polarität stellen Suipholipide, Trehalose-Mycolate, glycosylierte Phenolphthiocerole (einschließlich phenolischer Glycolipide, PGL's) und acylierte Trehalosen dar und sie werden normalerweise in der apolaren Lipidfraktion gefunden (Dobson et al, 1985).
Eine oberflächenaktive Substanz (ein oberflächenaktives Mittel) ist eine Verbindung wie zum Beispiel ein Detergens, das die Oberflächenspannung einer Flüssigkeit vermindern kann und es ihr ermöglichen kann, z.B. Lipiddoppelschichtmembranen zu durchdringen. Oberflächenaktive Substanzen sind amphiphile Substanzen, die in ihrem Molekül gleichzeitig ein oder mehrere hydrophile Gruppen und ein oder mehrere hydrophobe Gruppen umfassen. Kationische oberflächenaktive Substanzen sind oft quaternäre Ammoniumsalze und der aktive Teil des Moleküls ist ein positives Ion (Kation).
Liposomen (oder Lipid-Vesikel) sind wässrige Kompartimente, die von einem Lipiddoppelschicht umschlossen sind. Die Lipid-Komponenten stellen üblicherweise Phospholipide oder andere amphiphile Verbindungen wie zum Beispiel oberflächenaktive Substanzen dar, die oft mit Cholesterin und anderen geladenen Lipiden ergänzt sind. Liposomen sind im Stande, Wasser- und Lipid-lösliche Verbindungen einzuschließen und dem Liposom so zu ermöglichen, als ein Träger zu wirken. Liposomen sind als Verabreichungssysteme in der Pharmakologie und der Medizin verwendet worden, wie zum Beispiel Immunadjuvatien, Behandlung von infektiösen Erkrankungen und Entzündungen, Krebstherapie und Gentherapie (Gregoriadis, 1995). Faktoren, die einen Einfluss auf den Adjuvans-Effekt der Liposomen haben können, sind von liposomaler Größe, Lipidzusammensetzung und Oberflächenladung. Darüber hinaus kann die Antigenposition (z.B. ob es adsorbiert oder kovalent mit der Liposomen-Oberfläche verbunden ist oder in liposomale wässrige Kompartimente eingekapselt ist) auch wichtig sein.
Eine antigene Komponente oder Substanz ist ein Molekül, das mit einem vorher gebildeten Antikörper und/oder den spezifischen Rezeptoren auf T- und B-Zellen reagiert. Im Zusammenhang mit der Impfung kann ein Molekül, das die Entwicklung von spezifischen T- oder B-Zellen stimuliert, zur Bildung von einer Gedächtnis-Population an Immunzellen führen, die eine schnellere „Gedächtnis"-Antwort begünstigen werden, wenn das Antigen ein zweites Mal von Immunzellen angetroffen wird. Nachdem Gedächtnis-Populationen selten clonal sind, bedeutet das in der Praxis, dass ein Antigen jedes Molekül oder jede Sammlung von Molekülen ist, das/die eine Zunahme der Immunantworten stimulieren kann, wenn es von Immunzellen aus einer Person noch einmal angetroffen wird, die ihm früher ausgesetzt war.
Die antigene Komponente oder Substanz kann ein Polypeptid oder einen Teil des Polypeptids, das/der eine Immunantwort in einem Tier oder einem Menschen hervorruft, und/oder in einer biologischen Probe sein, die durch irgendeinen der hierin beschriebenen biologischen Tests bestimmt wird. Der immunogene Teil eines Polypeptids kann ein T-Zellepitop oder ein B-Zellepitop sein. Um die relevanten T-Zellepitope zu identifizieren, die während einer Immunantwort erkannt werden, ist es möglich, ein „Brachialgewalt"-Verfahren zu verwenden: Da T-Zellepitope linear sind, werden Deletionsmutanten der Polypeptide, wenn sie systematisch konstruiert werden, offenbaren, welche Regionen des Polypeptids für die Immunerkennung wesentlich sind, z.B. indem diese Deletionsmutanten z.B. dem hierin beschriebenen IFN-Gammatest unterzogen werden. Ein anderes Verfahren nützt überlappende Oligopeptide (vorzugsweise synthetische, welche eine Länge von z.B. 20 Aminosäureresten aufweisen), die von dem Polypeptid abgeleitet wurden. Diese Peptide können in biologischen Tests untersucht werden (z.B. wie in dem hierin beschriebenen IFN-Gamma-Test) und manche davon werden als Beweis für die Anwesenheit eines T-Zell-Epitops in dem Peptid eine positive Reaktion ergeben (und dadurch immunogen sein). B-Zell-Epitope können durch Analysieren der B-Zell- Erkennung von überlappenden Peptiden bestimmt werden, welche die Polypeptide von Interesse abdecken, z.B. wie beschrieben in Harboe et al, 1998.
Obwohl gezeigt wurde, dass die Mindestlänge von einem T-Zellepitop mindestens 6 Aminosäuren lang ist, ist es normal, dass sich solche Epitope aus längeren Abschnitten von Aminosäuren zusammensetzen. Es wird daher bevorzugt, dass das Polypeptidfragment der Erfindung eine Länge von mindestens 7 Aminosäureresten aufweist, wie zum Beispiel mindestens 8, mindestens 9, mindestens 10, mindestens 12, mindestens 14 mindestens 16, mindestens 18, mindestens 20, mindestens 22, mindestens 24 und mindestens 30 Aminosäurereste. In den wichtigen Ausführungsformen des erfinderischen Verfahrens wird daher bevorzugt, dass das Polypeptidfragment eine Länge von höchstens 50 Aminosäureresten aufweist, wie zum Beispiel höchstens 40, 35, 30, 25 und 20 Aminosäurereste. Es wird erwartet, dass sich die Peptide, die eine Länge von zwischen 10 und 20 Aminosäureresten aufweisen, als die effizientesten diagnostischen Werkzeuge herausstellen werden und daher stellen besonders bevorzugte Längen in dem Polypeptidfragment, das in dem erfinderischen Verfahren verwendet wird, 18, wie zum Beispiel 15, 14, 13, 12 oder sogar 11 Aminosäuren dar.
Ein Impfstoff wird definiert als eine Suspension von toten, abgeschwächten oder anders modifizierten Mikroorganismen (Bakterien, Viren oder Rickettsien) oder Teilen davon, für die Inokulation, um Immunität gegen eine Krankheit zu erzeugen. Der Impfstoff kann entweder prophylaktisch, um eine Krankheit zu verhindern, oder als ein therapeutischer Impfstoff, um schon bestehende Krankheiten wie zum Beispiel Krebs oder latente infektiöse Erkrankungen zu bekämpfen, aber auch im Zusammenhang mit Allergie und Autoimmunerkrankungen verabreicht werden. Der Impfstoff kann in einem geeigneten Adjuvans zur Erhöhung der Immunantwort emulgiert werden.
Die Impfstoffe werden in einer Art und Weise verabreicht, die mit der Dosierungsrezeptur kompatibel ist und in einer solchen Menge, wie sie therapeutisch effektiv und immunogen sein wird. Die Quantität, die verabreicht werden soll, hängt von der zu behandelnden Testperson, einschließlich z.B. der Kapazität des Immunsystems der Person ab, eine Immunantwort sowie den erwünschten Schutzgrad aufzubauen. Geeignete Dosierungsbereiche liegen in der Größenordnung von mehreren hundert Mikrogramm an aktivem Inhaltstoff pro Impfung mit einem bevorzugten Bereich von etwa 0,1 μg bis 1000 μg wie zum Beispiel in dem Bereich von etwa 1 μg bis 300 μg und insbesondere dem Bereich von etwa 10 μg bis 50 μg. Geeignete Schemata für die anfängliche Verabreichung und Booster-Impfungen sind auch variabel, werden aber durch eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von anschließenden Inokulationen oder anderen Verabreichungen verkörpert.
Die Art und Weise der Anwendung kann stark variieren. Jedes der herkömmlichen Verfahren zur Verabreichung von einem Impfstoff ist anwendbar. Von diesen wird angenommen, dass sie orale oder mucosale Anwendung auf einer festen physiologisch akzeptablen Basis oder in einer physiologisch verträglichen Dispersion, parenteral, durch Injektion oder ähnliches umfassen. Die Dosierung des Impfstoffs wird vom Verabreichungsweg abhängen und wird gemäß dem Alter der Person, die geimpft werden soll, und zu einem geringeren Ausmaß von der Größe der Person, die geimpft werden soll, variieren.
Die Impfstoffe werden auf herkömmliche Weise parenteral durch Injektion verabreicht, z.B. entweder subkutan oder intramuskulär. Zusätzliche Rezepturen, die für andere Arten der Verabreichung geeignet sind, umfassen Zäpfchen und in manchen Fällen orale oder mucosale Rezepturen. Für Zäpfchen können traditionelle Bindemittel und Träger zum Beispiel Polyalkalenglykole oder Triglyceride umfassen; solche Zäpfchen können aus Gemischen geformt werden, welche die aktive Komponente in dem Bereich von 0,5% bis 10%, vorzugsweise 1-2%, enthalten. Orale Rezepturen umfassen solche normal angewendeten Excipienten wie zum Beispiel pharmazeutische Grade von Mannit, Lactose, Stärke, Magnesium-Stearat, Natrium-Saccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat und ähnlichem. Diese Zusammensetzungen nehmen die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Rezepturen für anhaltende Abgabe oder Pulvern an und enthalten vorteilhafterweise 10-95% des aktiven Bestandteils, vorzugsweise 25-70%.
Der Impfstoff der Wahl kann zum Beispiel sein:
Proteinimpfstoff
Eine Impfstoffzusammensetzung, umfassend ein Polypeptid (oder mindestens einen immunogenen Teil davon) oder ein Fusions-Polypeptid.
DNA-Impfstoff
Die Nucleinsäurefragmente der Erfindung können zur Erzeugung der in vivo-Expression von Antigenen verwendet werden, d.h. die Nucleinsäurefragmente können in so genannten DNA-Impfstoffen verwendet werden.
Lebende rekombinante Impfstoffe
Expression des relevanten Antigens in einem Impfstoff in einem nicht pathogenen Mikroorganismus oder Virus. Gut bekannte Beispiele von solchen Mikroorganismen sind Mycobacterium bovis BCG, Salmonella und Pseudomonas und Beispiele von Viren sind Vaccinavirus und Adenovirus.
Dentritische Zellen als Antigen-Verabreichungsvehikel
Das Beladen von Antigen auf Antigen-präsentierende Zellen wie zum Beispiel dentritische Zellen hat sich als ein effektives Verfahren zur Erzeugung von aktiven T-Zellen mit einer Rolle in der Antitumor-Immunität herausgestellt.
Für alle diese Impfstoffkonstrukte hat das Hinzufügen eines geeigneten Adjuvans zu erhöhten Impfstoffwirksamkeiten geführt (Brandt, 2000; van Rooij, 2001; Wang, 2002; Eriksson, 2003).
Beispiele
Materialien und Verfahren:
EXTRAKTION DER GESAMTEN LIPIDE AUS M. BOVIS BCG
BCG-Gesamtlipide wurden aus 12,7 g (Nassgewicht) M. bovis BCG Dänisch 1331 extrahiert und bei 60°C für 1,5 Stunden hitzeinaktiviert. Die Bakterien wurden mit 30 ml Chloroform/Methanol (2:1) für 15 Minuten bei 55°C extrahiert, gefolgt von Zentrifugation (2.000 g, 10 min). Die wässrige Phase wurde entfernt und die organische Phase wurde gesammelt. Die Extraktion der Bakterien wurde wiederholt und die organische Phase wurde gesammelt. Die organischen Phasen aus beiden Extraktionen wurden mit 5 ml Milli-Q-Wasser gewaschen, gefolgt durch Zentrifugation (2.000 g, 10 min). Das Waschen der organischen Phase wurde einmal wiederholt. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wurde die Menge an trockenem Material gewogen (ungefähr 300 mg), wieder in Chloroform:Methanol (2:1) aufgelöst und in Fläschchen aliquotiert und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde das trockene Material in jedem Fläschchen gewogen und bei –20°C gelagert.
EXTRAKTION VON POLAREN UND APOLAREN LIPIDEN AUS M. BOVIS BCG
12,5 g (Nassgewicht) M. bovis BCG Dänisch 1331 wurde bei 60°C für 1,5 Stunden hitzeinaktiviert und 80 ml an Methanol:0,3% NaCl (10:1) + 40 ml Petroleumether wurden hinzugefügt. Nach starkem Schütteln für 15 Minuten wurde eine Phasentrennung erhalten und die obere organische Phase wurde entfernt. Die untere wässrige Phase wurde mit 30 ml Petroleumether extrahiert und nach der Phasentrennung wurde die obere Phase gesammelt und mit der vorherigen oberen Phase vereinigt. Die vereinigten oberen organischen Phasen enthielten die apolaren Lipide.
Die untere Phase wurde zu 56 ml Chloroform:Methanol:0,3% NaCl (9:10:3) hinzugefügt und durch starkes Schütteln für eine Stunde extrahiert, gefolgt von Zentrifugation (750 g, 15 Minuten), und der Überstand wurde gesammelt. Das Pellet wurde in 5,6 ml Chloroform:Methanol:0,3% NaCl (5:10:4) resuspendiert, für 30 Minuten geschüttelt, gefolgt von Zentrifugation (750 g, 15 min), und der Überstand wurde mit dem vorhergehenden Überstand vereinigt. 19,5 ml Chloroform:0,3% NaCl (50:50) wurden zu den vereinigten Überständen hinzugefügt, gefolgt von Mischen für 5 Minuten und Zentrifugation (750 g, 10 Minuten). Die untere Phase, welche die polaren Lipide enthielt, wurde gesammelt.
Nach Verdampfung des Lösungsmittels aus den Extrakten, die die apolaren bzw. polaren Lipide enthielten, wurde die Menge an trockenem Lipidmaterial gewogen und bei –20°C gelagert.
DÜNNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE VON LIPIDEN AUS M. BOVIS BCG
BCG-Gesamt-Lipidextrakt wurde in Chloroform:Methanol (2:1) aufgelöst und auf 2D-Dünnschicht-Chromatographie (DC)-Platten aufgetupft (0,7 mg Lipid pro Platte für nicht-polare Lipide und 1,4 mg pro Platte für polare Lipide und Lipide von dazwischenliegender Polarität).
Nicht-polare Lipide wurden in dem folgenden System analysiert: 1. Richtung Petroleumether (S.P. 40-60°C):Ethylacetat (98:2, 3 Entwicklungen). 2. Richtung Petroleumether (S.P. 40-60°C):Aceton (98:2). Nicht-polare Lipide wurden mit 20% Molybdophosphorsäure in Ethanol nachgewiesen und bei 120°C erhitzt.
Polare Lipide wurden in dem folgenden System analysiert: 1. Richtung Chloroform:Methanol:Wasser (60:30:6). 2. Richtung Chloroform-Aceton-Methanol-Wasser (47:25:3:5). Polare Lipide wurden mit 20% Molybdophosphorsäure in Ethanol nachgewiesen und bei 120°C erhitzt, Nihydrin-Reagens wurde verwendet, um die Lipide mit freien Aminogruppen nachzuweisen, und Phospray (Supelco) wurde verwendet, um Phospholipide nachzuweisen.
Glykolipide von dazwischenliegender Polarität wurden in dem folgenden System analysiert: 1. Richtung Chloroform:Methanol:Wasser (100:14:0,8). 2. Richtung Chloroform:Aceton:Methanol:Wasser (50:60:2,5:3). Glycolipide wurden durch alpha-Naphtolreagens nachgewiesen und Erhitzen bei 110°C für 5 Minuten.
TIERE
Weibliche BALG/C oder C57BL/6-Mäuse, 8 bis 12 Wochen alt, wurden aus Bomholtgaard (Ry, Dänemark) erhalten. Infizierte Mäuse wurden in Käfigen gehalten, die in einem BL-3 Sicherheitsgehege mit laminarer Strömung eingeschlossen waren.
BAKTERIEN
M. tuberculosis Erdman wurde bei 37°C in einem modifizierten Sauton-Medium gezüchtet, das mit 0,5% Natrium-Pyruvat und 0,5% Glucose ergänzt war. BCG-Dänisch 1331 wurde als ein gefriergetrockneter Impfstoff von dem SSI, Kopenhagen, Dänemark erhalten und wurde mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) rehydratisiert. M. tuberculosis H37Rv, M. bovis BCG Russland und BCG Pasteur wurden aus der mycobakteriellen Stammsammlung am Statens Serum Institut erhalten.
ADJUVANTIEN UND IMPFSTOFFE
Gesamte Lipide, polare und apolare Lipide von M. bovis BCG als Adjuvantien: Gesamte Lipide, gereinigte polare oder apolare Lipide wurden durch nochmaliges Auflösen des trockenen Lipidmaterials mit Milli-Q-Wasser bei 1 oder 5 mg/ml, gefolgt durch Sonden-Ultraschallbehandlung (2 Impulse von 30 sec) erzeugt.
24 Stunden vor der Immunisierung wurde das Antigen mit 0,9% Kochsalzlösung gemischt und zu den gesamten Lipiden, den gereinigten polaren oder apolaren Lipiden hinzugefügt. In manchen Fällen wurde auch Dimethyldioctadecylammoniumbromid hinzugefügt und die endgültige Suspension in einem Vortex-Mischgerät gemischt. Der Impfstoff wurde über Nacht zum Einbau des Antigens stehen gelassen.
Dimethyldioctadecylammonium-Bromid (im Folgenden als DDA abgekürzt, Eastman Kodak, Inc., Rochester, N.Y.):
DDA wurde zu sterilem Wasser hinzugefügt (2,5 mg/ml) und auf 80°C erhitzt, während fortwährend auf einer Heizplatte mit magnetischem Rührer für 20 Minuten gerührt wurde, und man ließ es vor der Verwendung abkühlen. Nur frisch gemachtes DDA wurde für die Immunisierung verwendet. Impfstoffe mit DDA sowie mit gesamten Lipiden, gereinigten polaren oder apolaren Lipiden wurden, wie vorstehend beschrieben, erzeugt. Impfstoffe mit DDA alleine wurden eine Stunde vor der Immunisierung, wie früher beschrieben (Brandt et al, 2000), erzeugt.
Alternativ kann das Antigen der Wahl und die gesamten Lipide, polaren oder apolaren Lipide vor der Erzeugung von DDA-Liposomen mit 0,9% Salzlösung gemischt werden. In diesem Fall wird das Gemisch aus Antigen, gesamten Lipiden und DDA nur auf 40°C erhitzt, um die Denaturierung des Antigens zu vermeiden.
N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium-chlorid (im Folgenden als DOTAP abgekürzt, Sigma Aldrich) wurde in Chloroform aufgelöst, 10 mg/ml, 1250 μg wurden getrocknet und mit 500 μl Wasser von Infektionsgrad hydratisiert und in einem Ultraschallgerät des Bad-Typus für 30 Minuten behandelt. 10 μg des Antigens in 100 μl 50 mM Ammoniumbicarbonatpuffer und 500 μg an Gesamt-Lipiden in 500 μl Wasser von Infektionsgrad wurden hinzugefügt, gefolgt von Lyophilisierung. Das Lipid-Antigengemisch wurde durch Hinzufügen von 1000 μl Salzlösung rehydratisiert. Zur Immunisierung erhielt jede Maus 2 μg Antigen, das in 250 μg an Liposom eingekapselt war.
Cholesteryl-3b-N-(dimethylaminoethyl)carbamat-Hydrochlorid (im Folgenden zu DC-Chol abgekürzt, Sigma Aldrich) wurde in 10 mg/ml Chloroform aufgelöst. 1250 μg wurden getrocknet und mit 500 μl Wasser von Infektionsgrad hydratisiert und in einem Ultraschallgerät des Bad-Typus für 30 Minuten behandelt. Das Antigen wurde, wie vorstehend für DOTAP beschrieben, eingekapselt.
Neutrale Liposomen wurden durch Mischen von L-Phosphatidylcholin (im Folgenden zu PC abgekürzt, Sigma Aldrich), mit 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (im Folgenden zu DOPE abgekürzt, Sigma Aldrich) im molaren Verhältnis von 1:0,5 hergestellt. PC und DOPE wurden in Chloroform aufgelöst (10 mg/ml). 1250 μg des gesamten Lipids wurden getrocknet und mit 500 μl Wasser von Infektionsgrad hydratisiert und in einem Ultraschallgerät des Bad-Typus für 30 Minuten behandelt. Das Antigen wurde, wie vorstehend für DOTAP beschrieben, eingekapselt.
Kationische Liposomen wurden durch Mischen von PC, DOPE und Phosphatidylglycerin (im Folgenden zu PG abgekürzt, Sigma Aldrich) in dem molaren Verhältnis von 1:0,5:0,25 hergestellt. PC, DOPE und PG wurden in Chloroform aufgelöst (10 mg/ml). 1250 μg des gesamten Lipids wurden getrocknet und mit 500 μl Wasser von Infektionsgrad hydratisiert und in einem Ultraschallgerät des Bad-Typus für 30 Minuten behandelt. Das Antigen wurde, wie vorstehend für DOTAP beschrieben, eingekapselt.
D-(+)-Trehalose-6,6'-di-Behenat (im Folgenden zu TDB, Sigma Biochemicals, US abgekürzt):
TDB wurde durch wiederholte Passage durch eine Pipette mit feiner Spitze, gefolgt von 30 Sekunden Vortexbehandlung, in sterilem destilliertem Wasser, das 2% Dimethyl-sulfoxid enthielt, bei einer Konzentration von 5 mg/ml suspendiert. Die Lösung wurde bis zu Verwendung bei –20°C gehalten. Eine Stunde vor der Immunisierung wurde das Antigen mit der Salzlösung gemischt und TDB hinzugefügt. Schließlich wurde DDA hinzugefügt und die endgültige Suspension wurde unter Verwendung eines Vortex-Mischgeräts gemischt.
Alhydrogel 2% (Statens Serum Institut, Kopenhagen, Dänemark):
Unmittelbar vor der Immunisierung wurde das Antigen mit Salzlösung gemischt und zu Alhydrogel hinzugefügt.
Montanid ISA720 (Seppic, France):
Unmittelbar vor der Immunisierung wird das Antigen mit Salzlösung gemischt und anschließend mit 70% Montanid ISA720 unter Verwendung einer mikroemulgierenden Nadel (Fischer Scientific) gemischt, um eine homogene Erzeugung herzustellen.
Das Adenoviruskonstrukt, das Ag85B-ESAT6 exprimierte, wurde durch Amplifizieren des Fusionsproteins durch PCR von einem Expressionsplasmid (pMCT6) als ein 1322 bp-Fragment exprimiert, welches den His-Marker beibehielt. Die Primer (vorwärts:5'-caggatc_ctaGCgaggtttaaatATGg; revers: 5'-catcacagtatcgtgat_CTagaggcaggg) führten NheI- und XbaI-Restriktionsstellen ein.
Rekombinantes, replikationsdefektes Adenovirus wurde in vitro unter Verwendung des Adeno-X-Kits (Clontech) erzeugt. Kurz gesagt wurden PCR-Amplifikate unter der Kontrolle des CMV-Promotors gerichtet in die entsprechenden Stellen im Transfervektor, pShuttle (Clonetech), cloniert. Clone wurden vollständig DNA-sequenziert. Eine Expressionskassette, die das Antigen enthielt, wurde herausgeschnitten und mit dem genomischen adenoviralen Plasmid, pAdeno-X (E1 und E3 deletierter Serotyp Ad5) ligiert. Durchmusterung der Rekombinanten von E. coli wurde durch Restriktionsanalyse und PCR durchgeführt. Korrekte Clone wurden dann unter Verwendung von LipofectAmine Plus-Reagens (Life Technologies) in 293-Zellen (ATCC) transfiziert. Die Expression wurde durch SDS-PAGE auf infizierten Zelllysaten unter Verwendung eines anti-His-Ak bestätigt. Virus wurde isoliert und Stammlösungen mit hohen Titern wurden, wie vorstehend beschrieben, hergestellt [Spector, 1995].
ANTIGENE
Das Fusionsprotein von Ag85B und ESAT-6 (im Folgenden abgekürzt zu Ag85B-ESAT6) und Ag85B wurden rekombinant, wie vorstehend beschrieben (Olsen et al, 2001), hergestellt. Der LPS-Gehalt wurde durch den Limulus amoebocyte-Lysattest gemessen und es wurde gezeigt, dass er unter 0,125 EE/ml lag – eine Konzentration, die keinen Einfluss auf die zelluläre Aktivität hat. Synthese der Peptide, die die ersten 20 Aminosäuren von ESAT-6 abdeckten (im Folgenden abgekürzt zu ESAT6_1-20), wurde, wie vorstehend beschrieben (Chang et al, 1978), in einem Teflonfilter durch Festphasen-Peptidsynthese durchgeführt.
Das Fusionsprotein des Glutamat-reichen Proteins von Plasmodium falciparum und des Merozoiten-Oberflächenproteins (im Folgenden zu GLURP-MSP3 abgekürzt) wurde, wie vorstehend beschrieben, hergestellt (Theisenet al, 2004).
Ovalbumin (im Folgenden abgekürzt zu OVA) wurde bei Sigma Aldrich bezogen.
Tetanus-Toxoid und Diphtherie-Toxoid wurden vom Statens Serum Institut, Kopenhagen bezogen.
Rekombinantes äußeres Haupt-Membranprotein von Chlamydia muridarum (im Folgende abgekürzt zu MOMP) wurde im pDest17-System (Gateway, Invitrogen) exprimiert.
IMMUNISIERUNG
Mäuse wurden subkutan (sc) an der Schwanzwurzel dreimal mit zweiwöchigem Intervall zwischen jeder Immunisierung immunisiert. Die Impfstoffe (0,2 ml/Maus) bestanden aus 1-2 μg des Fusionsproteins Ag85B-ESAT6, emulgiert in 250 μg DDA und entweder 100 μg gesamten Lipiden oder 0,1-100 μg gereinigten polaren oder apolaren Lipiden. Alternativ wurde zu den Impfstoffen, die Fusionsprotein enthielten, Adjuvans in Form von gesamten Lipiden alleine, 500 μg Alhydrogel oder 250 μg DDA hinzugefügt. Als eine positive Kontrolle wurde eine einzelne Dosis an BCG Dänisch 1331 sc an der Schwanzwurzel injiziert. Darüber hinaus wurde Fusionsprotein, das in 250 μg DDA und 100 μg TDB verabreicht wurde, in manchen Experimenten zum Vergleich einbezogen.
Zum Untersuchen von nachteiligen Effekten wurden 2 μg des Fusionsprotein-Antigens 85B und ESAT-6, die in 250 μg DDA emulgiert waren, intramuskulär (i.m.) ohne oder mit zwei unterschiedlichen Dosierungen an Gesamt-Lipiden (einer hohen Dosis von 250 μg sowie einer niedrigen Dosis von 20 μg) injiziert. Zum Vergleich wurde eine Gruppe einbezogen, die Fusionsprotein in 70% Montanid ISA720 erhielt, sowie eine Kontrollgruppe, die keine Immunisierung erhielt. Alle Impfstoffe wurden dreimal in einem Volumen von 50 μl in den rechten und linken Oberschenkelmuskel jedes Beines injiziert. Gewebeschnitte wurden hergestellt und mit Hämatoxylin-Eosin durch IN-Lab Medic A/S gefärbt, das gemäß GLP-Standard durchgeführt wurde. Alle Gewebeschnitte wurden von einem Pathologen untersucht, der nichts über die Natur der Proben wusste.
EXPERIMENTELLE INFEKTIONEN
Zur Beurteilung der Impfstoffwirksamkeit wurden Mäuse 10-25 Wochen nach der ersten Immunisierung über den Aerosolweg in einem Glas-Col-Inhalations-Expositionssystem einer Challenge unterworfen, das so kalibriert war, dass es ungefähr 25 KbE an virulentem M. tuberculosis Erdman in den Lungen ablagerte. Die bakterielle Last in der Milz und den Lungen wurde sechs Wochen später durch Ausplattieren von seriellen Verdünnungen auf Middlebrook 7H11-Agar bestimmt, der mit 2 μl 2-Thiphencarbonsäurehydrazid pro ml ergänzt war, um das Wachstum von BCG zu hemmen. Kolonien wurden nach 2-3 Wochen der Inkubation bei 37°C gezählt.
LYMPHOCYTENKULTUREN
Blutproben wurden von Mäusen sieben Tage nach der letzten Immunisierung entnommen, von 5-6 Mäusen in jeder Gruppe vereinigt und die Blut-Lymphocyten auf einem Dichtegradienten gereinigt. Milz-Lymphocyten wurden, wie vorstehend beschrieben (Andersen et al, 1991), erhalten. Zellkulturen wurden in dreifacher Ausführung in Mikrotitervertiefungen mit rundem Boden durchgeführt, die 2 × 10⁶ Zellen in einem Volumen von 200 μl RPMI enthielten, das mit 2-Mercaptoethanol, Glutamin, Penicillin-Streptomycin, Hepes und 10 % fötalem Kälberserum ergänzt war. Mycobakterielle Antigene (Ag85B-ESAT6, Ag85B, ESAT6_1-20) wurden in Konzentrationen verwendet, die sich von 5 bis 0,08 μg/ml bewegten. Vertiefungen, die nur Medium und 5 μg/ml ConA enthielten, wurden in allen Experimenten als negative bzw. positive Kontrollen einbezogen. Kulturüberstände wurden aus parallelen Kulturen nach 72 Stunden Inkubation in der Anwesenheit des Antigens geerntet und die Menge an IFN-gamma wurde durch Enzym-gekoppelten Immunadsoptionstest (ELISA) bestimmt (Brandt et al, 2000).
FUSIONSPROTEIN-SPEZIFISCHER IqG-ELISA
ELISA-Platten (Nunc, Maxisorp) wurden mit Ag85B-ESAT6, Glurp-MSP3 oder OVA (0,05 μg/Vertiefung) über Nacht bei 4°C beschichtet. Freie Bindungsstellen wurden mit PBS blockiert, das 2% Magermilch enthielt. Vereinigte Mausseren aus 18 Mäusen/Gruppe wurden in zweifacher Ausführung in fünffachen Verdünnungen, mindestens 10-mal in PBS mit 1% Rinderserumalbumin analysiert. Gesamt-IgG-(61-6520, 1/1000 verdünnt, Zymed), IgG1-() oder IgG2a-Antikörper wurde durch TMB-Substrat, wie vom Hersteller beschrieben (Kem-en-tec), nachgewiesen. Antikörpertiter werden als die Mittelwert-Titer ausgedrückt.
STATISTISCHE VERFAHREN
Unterschiede in der Koloniezahl zwischen infizierten Mäusen und Kontrollmäusen wurden durch Analyse der Varianz getestet. Wenn erhebliche Effekte angezeigt wurden, wurden die Unterschiede zwischen den Mitteln durch den Dunnett-Test bewertet.
BEISPIEL 1
DLC VON GESAMTEN, POLAREN UND APOLAREN LIPIDEN AUS M. BOV/S BCG
Die apolaren Lipide, die im Gesamtextrakt identifiziert wurden, waren Phthiocerol-A-Dimycocerosat (A), Phthiocerol-C-Dimycocerosat (C) und kleine Mengen an Phthiocerol-B-Dimycocerosat (B). Große Mengen an Triacylglycerin (TG) wurden auch nachgewiesen. Diese Lipide wurden, wie erwartet, auch im apolaren Extrakt nachgewiesen. Im polaren Extrakt wurden nur Spuren an TG und ein Punkt nachgewiesen, der wahrscheinlich freie Fettsäuren (FFA) darstellt (1).
Der gesamte und polare Extrakt enthielt die folgenden polaren Lipide: Phosphatidylinositmannoside, wahrscheinlich triacylierte (1) und tetraacylierte (2) Pentamannoside und triacylierte (3) und tetraacylierte (4) Dimannoside. Phosphatidylinosit (PI), Phosphatidylethanolamin (PE) und Diphosphatidylglycerin (Cardiolipid, DPG) waren Haupt-Phospholipide. Kleine Mengen an L-alpha-Phosphatidyl-DL-giycerin-Natiumsalz (PG) und einem anderen Phospholipid (7) waren auch vorhanden. Ein Glycolipid (8) wurde im polaren Extrakt auch beobachtet. Nur die häufigeren Lipide konnten in kleinen Mengen in dem apolaren Extrakt nachgewiesen werden (2).
Neun geringfügigere Glycolipide von dazwischenliegender Polarität wurden in dem Gesamtextrakt (markiert 1-9) nachgewiesen, von einem wird angenommen, dass es den „Cord-Faktor" Trehalosedimycolat darstellt, die Identität der anderen Lipide ist nicht bekannt. Zwei zusätzliche Glycolipide (10 und 11) wurden in dem polaren Extrakt identifiziert. Relativ kleine Mengen an Glycolipiden wurden im apolaren bzw. polaren Extrakt nachgewiesen (3).
ADSORPTION VON RINDERSERUMALBUMIN UND DEM REKOMBINANTEN AG85B-ESAT6-FUSIONSPROTEIN AN DDA UND GESAMT-LIPID-ADJUVANS
Zwei identische Röhrchen wurden durch Mischen von 0,5 ml der gesamten Lipidlösung (1 mg/ml) mit Antigen: 100 μg Rinderserumalbumin (BSA) oder 50 μg an Ag85B-ESAT6 erzeugt. Danach wurden 0,5 ml der DDA-Lösung zu dem Lipid/Antigengemisch hinzugefügt. Der Adsorption wurde ermöglicht, über Nacht fortzufahren. Um die Menge an Antigen zu untersuchen, die an DDA/Lipid gebunden war, wurden die Impfstofferzeugungen ultrazentrifugiert (100.000 g, 1 Stunde). Aus dem ersten Röhrchen wurde der Überstand gesammelt und das Pellet wurde im ursprünglichen Volumen (1 ml) resuspendiert und durch SDS-PAGE (4) analysiert. Aus dem zweiten Röhrchen wurde der Überstand entfernt und das Pellet wurde mit 2 ml destilliertem Wasser gewaschen, gefolgt von Ultrazentrifugation (100.000 g, 1 Stunde). Der Überstand und das in 1 ml resuspendierte Pellet wurden durch SDS-PAGE (4) analysiert. Das Meiste des BSA und des Ag85B-ESAT6-Antigens wird in dem Adjuvanspellet (Spur 3, 6) gefunden, wohingegen nur eingeschränkte Mengen in den Überständen beobachtet wurden (Spur 2, 5), was darauf hindeutet, dass die Mehrheit des Antigens an der Adjuvans-Fraktion adsorbiert ist.
BEISPIEL 2
VERWENDUNG VON GESAMTEN LIPIDEN AUS M. BOV/S BCG ZUR IMMUNISIERUNG VON MÄUSEN
In diesem Beispiel der Untersuchung der Adjuvans-Aktivität von M. bovis BCG- Gesamt-Lipiden wurden Mäuse mit experimentellen Impfstoffen immunisiert, die aus 1 μg Fusionsprotein Ag85B-ESAT6 bestanden, emulgiert in DDA, zu dem 100 μg an Gesamt-Lipiden als Adjuvans hinzugefügt wurden. Gruppen von Mäusen erhielten das Ag85B-ESAT6 alleine, das Ag85B-ESAT6 und DDA alleine, das Ag85B-ESAT6 in Kombination mit den Gesamt-Lipiden und es wurde eine Gruppe von naiven Mäusen als negative Kontrolle einbezogen, während Ag85B-ESAT6/DDA/TDB und ein Standard-BCG-Impfstoff als positive Kontrollen hinzugefügt wurden. Dieses Experiment wurde unter Verwendung von zu Th2 geneigten Balb/C-Mäusen durchgeführt (Peltoniemi et al, 2002), da nur bemerkenswert wirksame Th1-induzierende Adjuvantien im Stande sind, die Immunantwort in diesem Mäusstamm zu Gunsten einer Reaktion zu ändern, die durch die Produktion von Th1-Cytokinen wie zum Beispiel IFN-gamma gekennzeichnet ist.
Fünf Wochen nach der ersten Immunisierung wurde die IFN-gamma-Freisetzung nach neuerlicher in vitro-Stimulation von Blut-Lymphocyten mit unterschiedlichen Konzentrationen an Ag85B-ESAT6, Ag85B und dem dominanten ESAT6-Peptid (ESAT6_1-20), das die ersten 20 Aminosäuren des ESAT6-Proteins abdeckt (Brandt et al, 2000), bewertet. Nur die Gruppe an Mäusen, die mit dem Ag85B-ESAT6/DDA/Gesamt-Lipiden geimpft wurde, ergab eine starke Reaktion auf Ag85B-ESAT6, Ag85B und ESAT6_1-20 in Balb/C-Mäusen (5). Es wurde nach der Impfung mit Ag85B-ESAT6 in DDA alleine oder in DDA/TDB in diesem Mausstamm im Gegensatz zu der merklichen IFN-gamma-Sekretion, die in den zu Th1 geneigten C57BI/6-Mäusen (Brandt et al, 2000, Holten-Andersen et al, 2004) beobachtet wurde, keine IFN-gamma Freisetzung beobachtet.

Um den Schutzgrad zu bewerten, wurden Mäuse 10 Wochen nach der ersten Immunisierung über den Aerosolweg einer Challenge unterworfen. Schützende Wirksamkeiten werden als die log₁₀-Reduktion in Bakterienzahlen in immunisierten Mäusen im Vergleich mit einer Gruppe von nicht immunisierten naiven Tieren (Tabelle 1) ausgedrückt. Die in Tabelle 1 präsentierten Ergebnisse demonstrieren, dass Ag85B-ESAT6/DDA/Gesamt-Lipide der einzige Untereinheiten-Impfstoff war, der einen mit BCG vergleichbaren Schutzgrad induzierte. Die Kombination von DDA/Gesamt-Lipiden führte, verglichen mit den Gesamt-Lipiden allein (p < 0,001), zu erheblich besserem Schutz in der Milz. Darüber hinaus war der mit DDA/Gesamt-Lipiden als eine Adjuvans-Rezeptur erhaltene Schutz bemerkenswert besser als DDA (p < 0,05), obwohl von diesem Adjuvans früher gezeigt wurde, dass es im C57B1-Mausstamm (Brandt et al, 2000) Schutz auf dem Niveau von BCG bereitstellte. Tabelle 1. Impfstoff-induzierter Schutz im Maus-Modella.

IMPFSTOFF^B	LUNGEN	MILZ
IMPFSTOFF^B	Log₁₀-Resistenz±SEM	Log₁₀-Resistenz±SEM
Ag85B-ESAT6	0.01 ± 0.08	0.14 ± 0.08
Ag85B-ESAT6/DDA	0.09 ± 0.15	0.28 ± 0.10
Ag85B-ESAT6/DDNTDB	0.53 ± 0.17	0.36 ± 0.19
Gesamt-Lipide	0.32 ± 0.07	0.29 ± 0.10
Ag85B-ESAT6/ Gesamt-Lipide	0.48 ± 0.08	0.47 ± 0.16
Ag85B-ESAT6/DDN Gesamt-Lipide	1.19 ± 0.13	0.97 ± 0.18
BCG	1.10 ± 0.17	1.30 ± 0.25

^a Die schützenden Wirksamkeiten der Impfstoffe werden als die log₁₀-Reduktion der bakteriellen Belastung ausgedrückt (log₁₀-Resistenz).
^B Mäusen (n = 6) wurde eine BCG-Impfung verabreicht oder sie wurden mit den angezeigten experimentellen Impfstoffen sc. immunisiert.

Zum Vergleich wurden C57BI/6-Mäuse mit Ag85B-ESAT6 in DDA/Gesamt-Lipiden sowie auch DDA/TDB immunisiert und Blut-Lymphocyten nochmals in vitro wie vorstehend (6) stimuliert. In diesem Mausstamm haben die beiden Adjuvans-Rezepturen zu vergleichbaren Graden von Immunreaktionen geführt. Gemeinsam zeigen diese Ergebnisse, dass, obwohl beide Adjuvans-Rezepturen zu starken Th1-Reaktionen führen, die durch das Ausscheiden von großen Mengen an IFN-gamma in den zu Th1-geneigten C57BI-Mäusen gekennzeichnet sind, nur das bemerkenswerteste Th1-Adjuvans, die Kombination von DDA/Gesamt-Lipiden, im Stande ist, in zu Th2 geneigten Balb/C-Mäusen eine IFN-gamma-Reaktion hervorzurufen.
DIE LANGLEBIGKEIT DER DURCH M. BOVIS BCG-LIPIDEXTRAKT INDUZIERTEN IMMUNITÄT
Eine abnehmende Immunantwort, die durch mit Adjuvans versetzte Untereinheits-Impfstoffe erzeugt wird, ist als ein Hauptnachteil dieser Impfstofftechnologie erwähnt worden. Im die Langlebigkeit der Immunität zu untersuchen, die durch DDA/Gesamt- Lipide bereitgestellt wird, wurden C57BI/6-Mäuse dreimal mit Ag85B-ESAT6/DDA/Gesamt-Lipiden immunisiert und die Immunantworten wurden zu zwei unterschiedlichen Zeitpunkten nach der ersten Immunisierung gemessen. Milzen wurden 6 und 13 Monate nach der ersten Immunisierung isoliert und Lymphocyten in vitro mit verschiedenen Konzentrationen an Ag85B-ESAT6 sowie Ag85B und ESAT6_1-20 nochmals stimuliert. Zum Vergleich wurden Mäuse, die mit Ag85B-ESAT6 in DDA/TDB immunisiert wurden, sowie ein Impfstoff einbezogen, basierend auf einer Sensibilisierung mit Ag85B-ESAT6 in DDA/TDB, gefolgt von zwei Immunisierungen mit einem nicht-replizierenden Adenovirus-Impfstoff, der Ag85B-ESAT6 exprimiert. Wie in 7 gezeigt wird, führten insbesondere Mäuse, die mit DDA Gesamt-Lipiden immunisiert wurden, zu anhaltenden Immunantworten. Sechs Monate nach der ersten Immunisierung zeigte die Gruppe, die DDA/Gesamt-Lipide erhielt, IFN-gamma-Antworten, die dreimal höher waren als bei Mäusen, welche die zwei anderen Impfstoff-Konstrukte erhielten, und sogar so lange wie 13 Monate nach der Immunisierung sind die IFN-gamma-Mengen zweimal so hoch in der DDA/Gesamt-Lipidgruppe.
Schützende Wirksamkeit von Ag85B-ESAT6/DDA/Gesamt-Lipiden nach einer Aerosol-Challenge wurde 3 und 6 Monate nach der ersten Immunisierung untersucht und mit zwei unterschiedlichen Dosierungen des Standard-BCG-Impfstoffes verglichen. Zu einem frühen Zeitpunkt (3 Monate) führten die hohe Dosierung an BCG und der Untereinheiten-Impfstoff zu signifikanten Schutzgraden in beiden Organen (8, Feld A). Obwohl der Standard-BCG-Impfstoff ein Lebend-Impfstoff ist, der ausgezeichneten Langzeitschutz bereitstellen sollte, resultierte die Impfung mit Ag85B-ESAT6/DDA/Gesamt-Lipiden in anhaltenden Immunantworten, die zu schützenden Mengen führten, die zu diesem späten Zeitpunkt mit der hohen Dosis von BCG vergleichbar waren (8, Feld B). Verglichen mit der niedrigen Dosis von BCG ergibt Ag85B-ESAT6/DDA/Gesamt-Lipide erheblich höhere Schutzgrade in den Lungen (p < 0,05). Diese Daten zeigen, dass Ag85B-ESAT6/DDA/Gesamt-Lipide ein stabiles immunolgisches Gedächtnis induziert, das besser ist als das, welches durch die niedrige Dosis des derzeitigen menschlichen Impfstoffes induziert wird.
INDUKTION VON HUMORALER AKTIVITÄT MIT M. BOV/S BCG-GESAMTLIPIDEN
Obwohl von Antikörpern nicht bekannt ist, dass sie in der Immunität gegen M. tuberculosis eine wichtig Rolle spielen, können sie dennoch als ein nützlicher Marker für Immungenität dienen. Die Fähigkeit von DDA/Gesamt-Lipiden, humorale Aktivität zu erzeugen, wurde daher durch Beobachten der Ag85B-ESAT6-spezifischen IgG-Antikörperantwort fünf Wochen nach der ersten Immunisierung untersucht. Zum Vergleich wurde ein auf Aluminium basierendes Adjuvans (Alhydrogel) und DDA alleine einbezogen. Wie in Tabelle 2 gezeigt wird, waren hohe Titer an spezifischem IgG in Seren aus Mäusen vorhanden, die mit Ag85B-ESAT6 in DDA/Gesamt-Lipiden geimpft wurden. Verglichen mit Titern, die nach der Immunisierung mit Ag85B-ESAT6/DDA oder Ag85B-ESAT6/Alhydrogel erhalten wurden, induzierte die optimierte Adjuvans-Rezeptur, die Gesamtlipide umfasste, höhere Mengen an spezifischen Antikörpern. Tabelle 2. Antigen-spezifische Mittelwert Antikörper-Titer im Serum aus mit Ag85B-ESAT6 immunisierten Balb/c-Mäusen

Gesamt IgG^a

natürliche Kontrolle < 100

BCG < 100

Ag856-ESAT6/Alhyarogel 1100

Ag85B-ESAT6/DDA 1540

Ag856-ESAT6/DDA/Gesamt-Lipide 2200

a Ag85B-ESAT6-spezfische IgG-Mengen 5 Wochen nach der ersten Immunisierung, wie gemessen durch ELISA

NACHTEILIGE EFFEKTE DER IMPFUNG MIT BCG-GESAMTLIPIDEN IN DDA
Zwei unterschiedliche Dosierungen von Lipiden (eine hohe Dosis von 250 μg sowie eine niedrige Dosis von 20 μg) wurden dreimal mit zweiwöchigen Intervallen zwischen jeder Immunisierung in Kombination mit 250 μg an DDA im. in Balb/C- Mäuse verabreicht. Zum Vergleich wurde auch eine Gruppe einbezogen, die keine Immunisierung, 250 μg DDA alleine oder 70% Montanid erhielt. Montanid ist schon für klinische Versuche in Menschen bewilligt und ist in klinischen Studien seit den späten 1990igern weitreichend verwendet worden.
Der Entzündungsgrad oder die Reaktion im Muskelgewebe und dem umliegenden Fettgewebe wurden quantifiziert und die Anzahl der Plasmazellen, Lymphocyten, Makrophagen und neutrophilen Granulocyten wurde bestimmt (Tabelle 3). Die folgenden Parameter sind verwendet worden:

1. Entzündung im Muskelgewebe (Grad 0 bedeutet keine Entzündung, Grad 1 bedeutet schwache Entzündung, Grad 2 bedeutet mittelmäßige Entzündung, Grad 3 bedeutet schwere Entzündung)
2. Entzündung im Fettgewebe (Grad 0 bedeutet keine Entzündung, Grad 1 bedeutet schwache Entzündung, Grad 2 bedeutet mittelmäßige Entzündung, Grad 3 bedeutet schwere Entzündung)
3. Die Menge an nekrotischem Fettgewebe (Grad 0 bedeutet keine Nekrose, Grad 1 bedeutet kleine nekrotische Gebiete, Grad 2 bedeutet etwas Nekrose, Grad 3 bedeutet große Gebiete mit Nekrose)
4. Die Anzahl der Plasmazellen (Grad 0 bedeutet keine Plasmazellen, Grad 1 bedeutet wenige Plasmazellen, Grad 2 bedeutet eine mittelmäßige Zahl an Plasmazellen, Grad 3 bedeutet eine hohe Zahl an Plasmazellen)
5. Die Anzahl der Lymphocyten (Grad 0 bedeutet keine Lymphocyten, Grad 1 bedeutet wenige Lymphocyten, Grad 2 bedeutet eine mittelmäßige Zahl an Lymphocyten, Grad 3 bedeutet eine hohe Zahl an Lymphocyten)
6. Die Anzahl der Makrophagen (Grad 0 bedeutet keine Makrophagen, Grad 1 bedeutet wenige Makrophagen, Grad 2 bedeutet eine mittelmäßige Zahl an Makrophagen, Grad 3 bedeutet eine hohe Zahl an Makrophagen)
7. Die Anzahl an neutrophilen Granulocyten (Grad 0 bedeutet keine Granulocyten, Grad 1 bedeutet wenige Granulocyten, Grad 2 bedeutet eine mittelmäßige Zahl an Granulocyten, Grad 3 bedeutet eine hohe Zahl an Granulocyten)

	1	2	3	4	5	6	7
Kontrolle	0	0	0	0	0	0	0
250 μg DDA	0	3	0	1-1.5	1-1.5	3	1-1.5
250 μg DDA/20 μg gesamte Lipide	0	2-2.5	0	1-1.5	14.5	3	1-1.5
250 μg DDA/250 μg gesamte Lipide	0	3	0	1-1.5.	1-1.5	3	1-1.5
Montanid ISA 720	2-2.5	3	3	2-2.5	1-1.5	3	2-2.5

In Impfstoffen, die DDA enthielten, wurden im Fettgewebe ein oder mehrere Herde mit entzündlicher Aktivität beobachtet. Diese Entzündung war durch eine große Erhöhung in der Zahl der Makrophagen gekennzeichnet, insbesondere in der Nähe der Lymphknoten. Es gab keinen Effekt durch das Hinzufügen von Gesamt-Lipiden, was zeigt, dass die Gesamtlipide trotz starker Adjuvans-Aktivität keinen zusätzlichen Effekt auf nachteilige Reaktionen hatten.
Im Gegensatz dazu resultierte die Injektion mit Montanid ISA720 auch in den Muskeln in schwerer Entzündung und großen Gebieten mit Nekrose im Fettgewebe.
Dieser relative höhere Grad an nachteiligen Effekten spiegelt sich auch in der erhöhten Zahl von Plasmazellen und neutrophilen Granulocyten wider.
Der Dosierungsbereich von BCG-Gesamt-Lipiden und DDA

Verschiedene Dosierungen an Gesamt-Lipiden (siehe Tabelle 4 und 5) wurden dreimal, wie vorher beschrieben, mit 250 μg an DDA sc. in Balb/C sowie in C57BI-Mäuse verabreicht, um das optimale Verhältnis der Gesamt-Lipide zu bestimmen. Immunantworten wurden im Blut 5 und 7 Wochen nach der letzten Immunisierung durch nochmalige Stimulation in vitro mit 5 μg/ml an Ag85B-ESAT6 beobachtet. Tabelle 4. Dosis-Reaktion von Gesamt-Lipiden/DDA in Balb/C-Mäusen

Emulsion	Gesamt-Lipide (μg)	DDA (μg)	Immun-Antwort^a	Immun-Antwort^b
1	250	250	469 ± 164	288 ± 265
2	100	250	1328 ± 216	1194 ± 15
3	20	250	6319 ± 317	217 ± 156
4	5	250	181 ± 113	101 ± 102
5	1	250	254 ± 191	163 ± 6
6	0	250	128 ± 17	0 ± 0

^a Freisetzung von IFN-gamma aus Blut-Lymphocyten, isoliert 5 Wochen nach der ersten Immunisierung
^b Freisetzung von IFN-gamma aus Blut-Lymphocyten, isoliert 7 Wochen nach der ersten Immunisierung

Emulsion	Gesamt-Lipide (μg)	DDA (μg)	Immun-Reaktion^a
1	250	250	57436 ± 3703
2	100	250	48403 ± 5069
3	20	250	1421 ± 197
4	5	250	2206 ± 256
5	1	250	2376 ± 967
6	0	250	881 ± 257

^a Freisetzung von IFN-gamma aus Blut-Lymphocyten, isoliert 5 Wochen nach der ersten Immunisierung

Die stärkste Immunantwort wurde im Bereich von 20-100 μg an Gesamt-Lipiden beobachtet und 100 μg Gesamt-Lipide wurden danach in Kombination mit der Standarddosis von 250 μg DDA verwendet.
Bewertung von Gesamt-Lipiden/DDA als ein Adjuvans für unterschiedliche Antigene
Dass Gesamt-Lipide/DDA nicht nur Immunreaktionen auf TB-Antigen, sondern auch auf Antigene von anderen Quellen verstärken können, wurde durch Immunisieren von 5 μg der Ag85B-ESAT6-Fusion sowie eines Hybridmoleküls, das aus dem GLURP und MSP-3 von Plasmodium falciparum besteht, und von 5 μg Ovalbumin getestet. Zusätzlich wurden auch MOMP, Tetanus-Toxoid und Diphtherie-Toxoid für die Immunisierung einbezogen. Alle Antigene wurden in 100 μg an Gesamt-Lipiden/250 μg DDA emulgiert und dreimal über den sc. Weg verabreicht.
Immunantworten wurden 5 Wochen nach der ersten Immunisierung überwacht (Tabelle 6 und 6A). Tabelle 6. Die Fähigkeit von Gesamt-Lipiden/DDA, die Immunantworten von Antigenen aus verschiedenen Quellen zu verstärken, Auszug 1

Antigen IgG1^B IgG2a^b Immun-Reaktion^c

Ag85B-ESAT6 6670 250 10116 ± 109

Glurp-MSP3 670 < 100 1112 ± 365

OVA 2500 < 100 793 ± 81

kein Antigen^d 119 ± 16

^a Antigen-spezifische IgG1-Mengen (Mittelwert-Titer) 5 Wochen nach der ersten Immunisierung, wie gemessen durch ELISA. ^b Antigen-spezifische IgG2a-Mengen (Mittelwert-Titer) 5 Wochen nach der ersten Immunisierung, wie gemessen durch ELISA. ^c Freisetzung von IFN-gamma aus Blut-Lymphocyten, isoliert 5 Wochen nach der ersten Immunisierung und nochmals in vitro mit dem relevanten Antigen in einer Dosis von 5 μg/ml stimuliert. ^d Blut-Lymphocyten aus nicht immunisierten Mäusen, die mit keinem Antigen stimuliert sind.

Antigen	Immun-Antwort^a
Ag85B-ESAT6	72600 ± 12600
MOMP	168000 ± 6230
Tetanus-Toxoid	52500 ± 13500
Diphterie-Toxoid	29000 ± 6600
kein Antigen	460 ± 300

^a Freisetzung von IFN-gamma aus Blut-Lymphocyten, isoliert 5 Wochen nach der ersten Immunisierung und in vitro nochmals in einer Dosis von 5 μg/ml mit dem relevanten Antigen stimuliert.
^b Blut-Lymphocyten aus nicht immunisierten Mäusen, die mit keinem Antigen stimuliert wurden.

Diese Ergebnisse zeigen, dass Gesamt-Lipide/DDA im Stande sind, eine Immunantwort zu induzieren, die als erhöhte Mengen an Antigen-spezifischen Antikörpern und/oder IFN-gamma gemessen wird, wenn sie, wie in den Tabelle 6 und 6A gezeigt, in Kombination mit Antigenen von unterschiedlichen Quellen verwendet werden. Das unterstreicht, dass Gesamt-Lipide/DDA nicht nur als eine Adjuvans-Rezeptur für TB-Impfstoffe, sondern auch für andere infektiöse Erkrankungen, Allergie, Autoimmunkrankheiten oder Krebs verwendet werden können.
Bewertung der unterschiedlichen Liposomen-bildenden Verbindungen
Die Fähigkeit von unterschiedlichen kationischen Reagenzien, die Immunantworten von Gesamt-Lipiden zu verstärken, wurde in Balb/C-Mäusen überwacht. Außerdem wurde eine neutrale Liposomen-Präparation (bestehend aus PC und DOPE), anionische Liposomen (PC, DOPE und PG) und eine Gruppe an naiven, nicht-immunisierten Mäusen zum Vergleich einbezogen. Alle Impfstoffe enthielten 250 μg an Liposomen und wurden sc. in Kombination mit 100 μg an Gesamt-Lipiden verabreicht und als ein Impfstoffantigen wurden 2 μg des Fusionsproteins Ag85B-ESAT6 verwendet. Wie vorstehend wurden die Immunantworten 5 Wochen nach der ersten Immunisierung durch neuerliche Stimulation von Blut-Lymphocyten in vitro mit unterschiedlichen Konzentrationen an Ag85B-ESAT6 überwacht.
Wie in 9 gezeigt, führten die Gesamt-Lipide, die mit einer kationischen oberflächenaktiven Substanz wie zum Beispiel DDA, DOTAP und DC-Chol verabreicht wurden, zu großen Mengen von IFN-gamma. Insbesondere induzierte die Kombination von Gesamt-Lipiden/DDA erhebliche IFN-gamma-Produktion.
IMMUNOLOGISCHE EIGENSCHAFTEN VON APOLAREN UND POLAREN LIPIDEN, DIE VON M. BOVIS BCG-GESAMTLIPIDEXTRAKT GEREINIGT WURDEN
Um eine genauere Charakterisierung der stimulatorischen Lipide durchzuführen, die für die ausgeprägten Immunantworten verantwortlich sind, die nach der Impfung mit DDA/Gesamt-Lipiden beobachtet werden, wurden die apolaren und polaren Lipide aus dem BCG-Gesamt-Lipidextrakt gereinigt und in mehreren unterschiedlichen Konzentrationen gemeinsam mit 250 μg DDA als ein Impfstoff-Adjuvans getestet.
Mäuse wurden mit dem Adjuvans in Kombination mit 2 μg an Ag85B-ESAT6 immunisiert. Wie in 10 gezeigt, resultierte die Immunisierung mit Ag85B-ESAT6/DDA/apolaren Lipiden sogar mit einer so niedrigen Dosis wie 0,1 μg an apolaren Lipiden zu erheblicher Reduktion der Bakterienzahl in den Lungen. Obwohl die hohe Dosis an polaren Lipiden in Kombination mit DDA zu einem erheblichen Schutz in den Lungen führte, wurden unter Verwendung des Impfstoffes basierend auf den polaren Lipid im Allgemeinen niedrigere Schutzgrade erreicht, was darauf hindeutet, dass die Mehrzahl der Komponenten mit Adjuvans-Aktivität in der apolaren Lipidfraktion liegt.

Von einer Präparation an extrahierbaren gesamten polaren Lipiden von Mycobacterium bovis BCG wurde früher festgestellt, dass sie die Immunantworten auf Antigen in Mäusen fördert (Sprott WO 03/011336 ). Um diese Präparation mit den in dieser Studie beschriebenen Gesamt-Lipiden, polaren und apolaren Lipiden zu vergleichen, wurde eine Präparation von Chloroform-löslichen, Extrahierbaren gesamten polaren Lipiden gemäß dem Protokoll von Sprott et al., durchgeführt. 50 μg dieser Präparation wurden zur Immunisierung von Balb/C-Mäusen mit oder ohne Zugabe von 250 μg an DDA verwendet. Das Fusionsprotein von Ag85B-ESAT6 wurde als ein Impfstoff-Antigen in einer Dosierung von 2 μg verwendet. Immunantworten, die als IFN-γ-Freisetzung gemessen wurden, wurden im Blut fünf Wochen nach der ersten Immunisierung durch nochmalige Stimulation ausschließlich mit Medium (Kontrolle) oder 5 μg/ml an Ag85B-ESAT6 (Tabelle 7) bewertet. Es wurden auch die Fusionsprotein-spezifischen mittleren Antikörper-Titer im Serum von Mäusen bestimmt, die 5 Wochen vorher geimpft worden waren (Tabelle 8). Tabelle 7. Immunogenität von verschiedenen polaren, apolaren und Gesamt-Lipidextrakten

IMPFSTOFF	IFN-γ-Freisetzung (pg/ml)± SEM^a	IFN-γ-Freisetz. (pg/ml) ± SEM^a
IMPFSTOFF	Kontrolle	Ag85B-ESAT6 (5 μg/ml)
DDA/Gesamt-Lipide	19 ± 5	1194 ± 26*
Apolare Lipide	6 ± 2	26 ± 11
DDA/apolare Lipide	37 ± 9	4516 ± 33*
Polare Lipide	0 ± 0	96 ± 43
Polare Lipide/DDA	19 ± 5	745 ± 137*
Polare Lipide ( WO 03/011336 )	21 ± 3	145 ± 20
Polare Lipide ( WO 03/011336 )DDA	7 ± 3	28 ± 3
Naiv	30 ± 10	36 ± 13

^a IFN-gamma wurde nach nochmaliger Stimulation nur mit Medium (Kontrolle) oder Ag856-ESAT6 durch ELISA gemessen.
* Wesentlich unterschiedlich von naiven, nicht immunisierten Mäusen, wie bestimmt durch das Dunnett-Verfahren (p < 0,05)

	igG1^a	IgG2a^b
DDA/Gesamt-Lipide	1,000	286
Apolare Lipide	< 100	< 100
DDA/apolare Lipide	1,250	250
Polare Lipide	155	< 100
Polare Lipide/DDA	20,000	500
Polare Lipide ( WO 03/011336 )	< 100	< 100
Polare Lipide ( WO 03/011336 )/DDA	4,000	333
Natürlich	< 100	< 100

^a Antigen-spezifische IgG1-Mengen (Mittelwert-Titer) 5 Wochen nach der ersten Immunisierung, wie gemesen durch ELISA.
^b Antigen-spezifische IgG2a-Mengen (Mittelwert-Titer) 5 Wochen nach der ersten Immunisierung, wie gemessen durch ELISA.

Wie in Tabelle 7 gezeigt, führt die Kombination von DDA/apolaren Lipiden zur markantesten Immunantwort mit hohen Mengen an IFN-γ-Freisetzung. Außerdem resultiert die Immunisierung mit DDA/Gesamt-Lipiden sowie mit DDA/polaren Lipiden in erheblicher IFN-γ-Produktion. Im Gegensatz dazu konnten die polaren Lipide, die gemäß dem Protokoll von Sprott et al. hergestellt wurden, kein IFN-γ über die Kontrollmengen hinaus hervorrufen und es wird mit der Zugabe von DDA keine Erhöhung der Immunantwort beobachtet. Im Gegensatz dazu führten die polaren Lipide im Kombination mit DDA zu hohen Mengen an Antikörpertitern (Tabelle 8), was darauf hindeutet, dass diese Präparationen zu unterschiedlichen immunologischen Antworten führen, die durch erhöhte Antikörpermengen, aber mit limitierter Fähigkeit, IFN-gamma-Freisetzung zu induzieren, gekennzeichnet sind. Diese ausgeprägte Antikörperproduktion wurde insbesondere in der Gruppe von Mäusen beobachtet, die mit DDA und mit den polaren Lipiden immunisiert wurden, die, wie in dieser Studie beschrieben, erzeugt wurden. Gemeinsam zeigen diese Ergebnisse die einzigartige stimulatorische Wirkung der Kombination von DDA, das mit Gesamt-Lipiden, apolaren und polaren Lipiden verabreicht wird, die in dieser Studie beschrieben werden.
Optimierung des Verfahrens zur Herstellung des DDA/Gesamt-Lipid-Adjuvans
Die BCG-Gesamt-Lipide, die DDA-Vesikel enthalten, wurden unter Verwendung des Lipiddünnfilm-Verfahrens (Bangham et al, 1965) hergestellt. DDA und Gesamt-Lipide wurden getrennt in Chloroform-Methanol (9:1) zu einer Konzentration von 10 mg/ml aufgelöst. Festgelegte Volumina von jeder einzelnen Verbindung wurden entsprechend den Verhältnissen von 250 μg DDA und 50 μg Gesamt-Lipiden oder 250 μg DDA und 100 μg Gesamt-Lipiden in Teströhrchen aus Glas gemischt. Das Lösungsmittel wurde unter Verwendung eines sanften Stroms an N₂ verdampft und die Lipidfilme wurden über Nacht unter niedrigem Druck getrocknet, um Spuren von Lösungsmittel zu entfernen. Die getrockneten Lipidfilme wurden in Tris-Puffer (10 mM, pH-Wert = 7,4) hydratisiert und für 20 Minuten auf ein 70°C-Wasserbad gestellt, die Proben wurden alle 5 Minuten energisch geschüttelt. Die erzeugten DDA/Gesamt-Lipid-Liposomen waren homogen und konnten bei 4°C ohne Änderung im Aussehen gelagert werden.
Die Immunantwort nach Immunisierung mit DDA/Gesamt-Lipiden aus unterschiedlichen mycobakteriellen Spezies
Gesamt-Lipide, extrahiert aus M. bovis BCG Russland, BCG Pasteur, M. tuberculosis H37RV, und BCG 1331, wurden dreimal, wie vorstehend beschrieben, mit 250 μg an DDA und 2 μg an Ag85B-ESAT6 sc. an Balb/C verabreicht. Immunantworten wurden in den Milz-Lymphocyten 5 Wochen nach der letzten Immunisierung durch nochmalige Stimulation in vitro mit 5 μg/ml an Ag85B-ESAT6 (11) überwacht. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die einzigartige stimulatorische Wirkung der Kombination von DDA, das mit Gesamt-Lipiden verabreicht wird, nicht auf BCG 1331 begrenzt ist, sondern auch in anderen BCG-Stämmen sowie im virulenten Stamm M. tuberculosis H37Rv beobachtet wird.
Figurenlegenden
1. 2-D-DC-Analysen von apolaren Lipiden von apolaren, polaren und Gesamt-Lipidextrakten von M. bovis BCG.
2. 2-D-DC-Analysen von polaren Lipiden von apolaren, polaren und Gesamt-Lipidextrakten von M. bovis BCG.
3. 2-D-DC-Analysen von Glycolipiden mit dazwischenliegender Polarität von apolaren, polaren und Gesamt-Lipidextrakten von M. bovis BCG.
4. Antigenadsorption. Sibergefärbtes SDS-PAGE-Gel von M: Markerproteine. 1:5 μl BSA, 100 μg/ml. 2: 5 μl BSA/DDA/Gesamt-Lipidüberstand. 3: 5 μl nochmals aufgelöstes BSA/DDA/Gesamt-Lipidpellet. 4: 5 μl AG85B-ESAT6, 50 μg/ml. 5: 5 μl AG85B-ESAT6/DDA/Gesamt-Lipidüberstand. 6: 5 μl nochmals aufgelöstes AG85B-ESAT6/DDA/Gesamt-Lipidpellet.
5. Freisetzung von IFN-gamma aus Blut-Lymphocyten, die aus naiven Balb/C-Mäusen oder Balb/C-Mäusen isoliert wurden, die mit Ag85B-ESAT6, Ag85B-ESAT6/DDA, Ag85B-ESAT6/DDA/TDB, Ag85B-ESAT6/Gesamt-Lipiden oder Ag85B-ESAT6/DDA/Gesamt-Lipiden immunisiert waren. Blutproben wurden 5 Wochen nach der ersten Immunisierung entnommen und die Lymphocyten wurden mit keinem Antigen (Kontrolle), Ag85B-ESAT6 (5, 2,5, 1,25, oder 0,63 μg/ml), Ag85B (10 und 2,5 μg/ml) und ESAT6_1-20 (10 und 2,5 μg/ml) stimuliert.
6. Freisetzung von IFN-gamma aus Blut-Lymphocyten, die aus C57BL-Mäusen isoliert wurden, die mit Ag85B-ESAT6/DDA/Gesamt-Lipiden und Ag85B-ESAT6/DDA/TDB immunisiert waren. Blutproben wurden 5 Wochen nach der ersten Immunisierung entnommen und die Lymphocyten wurden mit keinem Antigen (Kontrolle), Ag85B-ESAT6 (5 μg/ml), Ag85B (5 μg/ml) und ESAT6_1-20 (5 μg/ml) stimuliert.
7. Freisetzung von IFN-gamma aus Splenocyten, die aus Mäusen gewonnen wurden, die mit Ag85B-ESAT6/DDA/Gesamt-Lipiden, Ag85B-ESAT6/DDA/TDB immunisiert waren oder eine Immunisierung mit Ag85B-ESAT6/DDA/TDB gefolgt von zwei Immunisierungen mit Ag85B-ESAT6 in einem Adenoviruskonstrukt erhielten. Splenocyten wurden 6 Monate (Feld A) und 13 Monate (Feld B) nach der ersten Immunisierung isoliert und in vitro mit keinem Antigen (Kontrolle), Ag85B-ESAT6 (5, 1,25, 0,31 μg/ml), Ag85B (5 μg/ml) und ESAT6_1-20 (5 μg/ml) nochmals stimuliert.
8. Log₁₀-Resistenz in den Lungen und der Milz von Mäusen (n = 5-6), die 3 Monate (Feld A) oder 6 Monate (Feld B) vorher mit Ag85B-ESAT6/DDA/Gesamt-Lipiden oder zwei unterschiedlichen Dosierungen an BCG immunisiert worden waren. * Impfstoffe, die verglichen mit naiven nicht-immunisierten Mäusen (p < 0,05) erheblichen Schutz induzieren.
9. Freisetzung von IFN-gamma aus Blut-Lymphocyten, die aus Mäusen isoliert wurden, die mit 2 μg an Ag85B-ESAT6 in DDA/Gesamt-Lipiden, DOTAP/Gesamt-Lipiden, DC-Chol/Gesamt-Lipiden, neutralen Liposomen/Gesamt-Lipiden, anionischen Liposomen/Gesamt-Lipiden immunisiert wurden, oder aus nichtimmunisierten, naiven Mäusen. Blut-Lymphocyten wurden 5 Wochen nach der ersten Immunisierung isoliert und in vitro nochmals mit keinem Antigen (Kontrolle), Ag85B-ESAT (5, 0,5, 0,05 μg/ml) stimuliert.
10. Log₁₀-Resistenz in den Lungen und der Milz von Mäusen (n = 6), die 3 Monate vorher mit Ag85B-ESAT6/DDA/gereinigten apolaren Lipiden (100, 10, 1 oder 0,1 μg) oder Ag85B-ESAT6/DDA/gereinigten polaren Lipiden (100, 10, oder 1 μg) immunisiert worden waren. * Impfstoffe, die verglichen mit naiven, nicht-immunisierten Mäusen (p < 0,05) erheblichen Schutz induzieren.
11. Freisetzung von IFN-gamma aus Blut-Lymphocyten, die aus naiven Balb/C-Mäusen oder aus Balb/C-Mäusen isoliert wurden, die mit Ag85B-ESAT6/DDA/Gesamt-Lipiden aus M. bovis BCG Russland, BCG Pasteur, M. tuberculosis H37Rv oder BCG1331 immunisiert worden waren. Splenocyten wurden 5 Wochen nach der ersten Immunisierung isoliert und die Lymphocyten wurden mit Ag85B-ESAT6 (5 μg/ml) stimuliert.
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Claims

Adjuvans, umfassend eine kationische oberflächenaktive Substanz und die apolare Fraktion oder einen Teil der apolaren Fraktion des gesamten Lipidextrakts einer Mycobakterie, z.B. den BCG, M.microti, M.tuberculosis oder M.vaccae.
Adjuvans nach Anspruch 1, wo der Teil der apolaren Fraktion des Lipidextrakts Phthiocerol-Dimycocerosate, Trehalose-Mycolipenate, glycosylierte Phenol-Phthiocerole (hierunter phenolische Glycolipide, PGL's), Trehalose-Mycolate, Sulfolipide, Triacylglycerole oder Menaquinone sein kann.
Adjuvans nach Anspruch 1-2, wo die oberflächenaktive Substanz DDA, DODA, DC-chol oder DOTAP ist.
Impfstoff, umfassend ein Adjuvans nach Anspruch 1-3.
Impfstoff nach Anspruch 4 zur parenteralen oder oralen Verabreichung oder Verabreichung über die Schleimhaut.
Impfstoff nach Anspruch 5, wo die antigene Komponente ein antigenes Epitop aus einer virulenten Mycobakterie, z.B. Mycobacterium tuberculosis, M. bovis oder M.africanum umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 6, wo die antigene Komponente ein ESAT6-Ag85B-Hybrid oder ein Fragment hiervon ist.
Impfstoff nach Anspruch 5 zur Behandlung von Krebs, Allergie oder autoimmunen Krankheiten.
Abgabesystem, umfassend ein Adjuvans nach Anspruch 1-3.
Verfahren zur Herstellung eines Adjuvans nach Anspruch 1-3 unter Anwendung Dünn-Lipidfilm-Verfahren.